Полимерный конъюгат биоактивного компонента ( варианты ), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе

013535 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к областям биохимии белков, а также фармакологии и медицине. В частности, изобретение представляет способы получения конъюгатов между водорастворимыми полимерами (например, полиэтиленгликолем и его производными) и ряда биоактивных компонентов, которые имеют повышенную рецептор-связывающую активность по сравнению со стандартными конъюгатами полимер-биоактивного компонента. В частности, изобретение представляет способы получения полимерных конъюгатов ряда рецептор-связывающих белков с необычайно высокой рецептор-связывающей активностью. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие данные конъюгаты, и композиции, а также способы применения конъюгатов и композиций для предупреждения, диагностики и лечения многих медицинских и ветеринарных состояний. Сведения о предшествующем уровне техники Цитокины представляют собой регуляторные белки, которые контролируют выживаемость, рост,дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор Nicola N.А. (1994) в монографии Руководство по цитокинам и их рецепторам (Guidebook to Cytokines and Their Receptors), под ред. Nicola N.A., c.1-7, Oxford University Press, New York). Хемокины представляют собой семейство структурно близких гликопротеинов с сильной активностью активации лейкоцитов и/или хемотактической активностью (см. обзор Oppenheim J.J. и соавт. (1997), Clin.Cancer Res., 3:2682-2686). Подобно их близкородственным соединениям, полипептидные гормоны и факторы роста, цитокины и хемокины инициируют свои регуляторные функции связыванием со специфическими рецепторными белками на поверхности их клеток-мишеней (см. обзоры Kossiakoff A.A. и соавт.(1998), Adv. Protein Chem., 52:67-108; Onuffer J.J. и соавт. (2002), Trends Pharmacol. Sci., 23:459-467). Цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны имеют множество потенциальных вариантов применения в качестве терапевтических агентов вследствие их активности, специфичности, маленького размера и относительной простоты получения в рекобинантных организмах. Два ключевых фактора препятствуют созданию цитокинов, в частности, и рекомбинантных белков в целом как терапевтических агентов - их, как правило, короткие полупериоды существования в системе кровообращения и их потенциальная антигенность и иммуногенность. Как используют в данном контексте и в целом в области техники, термин "антигенность" относится к способности молекулы связываться с ранее существующими антителами, тогда как термин "иммуногенность" относится к способности молекулы вызывать иммунный ответ in vivo, включает ли данный ответ образование антител ("гуморальный ответ") или стимуляцию клеточных иммунных ответов. Для введения рекомбинантных терапевтических белков часто является желательным внутривенное (i.v.) введение с целью достижения наиболее высоких активностей в системе кровообращения и сведения к минимуму проблем биодоступности и распада. Однако полупериоды существования маленьких белков после внутривенного введения обычно являются чрезвычайно короткими (см. примеры в статьях Mordenti J. и соавт. (1991), Pharm. Res., 8:13511359; Kuwabara Т. и соавт. (1995), Pharm. Res., 12:1466-1469). Белки с гидродинамическими радиусами,превышающими радиус сывороточного альбумина, который имеет радиус Стоукса приблизительно 36 и молекулярную массу приблизительно 66000 Да (66 кДа), как правило, задерживаются в кровотоке здоровыми почками. Однако белки меньшего размера, включая цитокины, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF"), интерлейкин-2 ("ИЛ-2"), интерферон-, ("ИФН-") и интерферон- ("ИФН-"), быстро выводятся из кровотока посредством гломерулярной (клубочковой) фильтрации(1998), J. Am. Soc. Nephrol., 9: 2344-2348). В результате поддержание терапевтически эффективных концентраций маленьких рекомбинантных белков в системе кровообращения представляет собой проблему после инъекции. Вследствие этого, как правило, приходится вводить более высокие концентрации таких белков и проводить более частые инъекции. Полученные в результате схемы дозирования повышают стоимость терапии, снижают вероятность соответствия требованиям пациента и повышают риск неблагоприятных событий, например иммунных реакций. Оба, клеточный и гуморальный, иммунные ответы могут снижать циркулирующие в крови концентрации инъецированных рекомбинантных белков до той степени, которая может препятствовать введению эффективной дозы, или может привести к условиям,ограничивающим лечение, включая ускоренный клиренс, нейтрализацию эффективности и анафилаксиюRes. 5:1353-1361; Hjelm Skog A.-L. и соавт. (2001), Clin. Cancer Res., 7:1163-1170; Li J. и соавт. (2001),Blood, 98:3241-3248; Basser R.L. и соавт. (2002), Blood, 99:2599-2602; Schellekens H., (2002), Clin. Ther.,24:1720-1740). Модификация рекомбинантных белков путем ковалентного присоединения полиэтиленгликоля ("ПЭГ") широко исследовалась как средство, направленное на вышеописанные недостатки (см. обзор Sherman M.R. и соавт. (1997) в монографии "Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение" (Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications), под ред. Harris J.M. и соавт. с. 155-1 013535 169, American Chemical Society, Washington, D.С.; статью Roberts M.J. и соавт. (2002), Adv. Drug Deliv.Rev., 54:459-476). Показано, что присоединение ПЭГ к белкам стабилизирует белки, улучшает их биодоступность и/или снижает их иммуногенность in vivo. (Ковалентное присоединение ПЭГ к белку или другой субстанции называют в данном контексте, и оно известно в технике как "ПЭГилирование"). Кроме того,ПЭГилирование может существенно увеличить гидродинамический радиус белков. Когда маленький белок, такой как цитокин, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, связывают с одной длинной цепью ПЭГ (например, имеющей молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 18 кДа), полученный в результате конъюгат имеет гидродинамический радиус, превышающий радиус сывороточного альбумина, и его клиренс из системы кровообращения через почечные клубочки резко замедляется. Комбинированные эффекты ПЭГилирования - пониженный протеолиз, уменьшенное иммунное распознавание и уменьшенные скорости почечного клиренса - обусловливают существенные преимущества ПЭГилированных белков как терапевтических агентов. С 1970-х гг. были сделаны попытки применить ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных белков, предназначенных для фармацевтического применения (см., например, Davis F.F. и соавт., патент США 4179337). Некоторые примеры включают связывание ПЭГ или полиэтиленоксида ("ПЭО") с аденозиндезаминазой (ЕС 3.5.4.4) для применения при лечении тяжелого заболевания, связанного с комбинированным иммунодефицитом (см. статьи Davis S. и соавт. (1981), Clin. Exp. Immunol., 46:649-652; Hershfield M.S. и соавт. (1987), N. Engl. J. Med. 316:589596), с супероксиддисмутазой (ЕС 1.15.1.1) для лечения воспалительных состояний (см. Saifer M. и соавт., патенты США 5006333 и 5080891) и с уратоксидазой (ЕС 1.7.3.3) для выведения избытка мочевой кислоты из крови и мочи (см. статьи Kelly S.J. и соавт. (2001), J. Am. Soc. Nephrol., 12:1001-1009;R. и соавт., публикация РСТWO 01/59078 А 2). ПЭО и ПЭГ представляют собой полимеры, состоящие из ковалентно связанных звеньев этиленоксида. Данные полимеры имеют следующую общую структуру:R1-(OCH2CH2)n-R2,в которой R2 может обозначать гидроксильную группу (или ее реакционное производное) и R1 может представлять собой водород, как в дигидроксиПЭГ ("ПЭГдиол"), метильную группу, как в монометоксиПЭГ ("мПЭГ") или другую группу низшего алкила, например, как в изопропоксиПЭГ или третбутоксиПЭГ. Параметр n в общей структуре ПЭГ показывает число этиленоксидных звеньев в полимере и относится в данном контексте и в области техники к "степени полимеризации". Полимеры такой же общей структуры, в которых R1 представляет собой С 1-7-алкильную группу, были также обозначены как оксирановые производные (см. Yasukohchi Т. и соавт., патент США 6455639). ПЭГ и ПЭО могут быть линейными, разветвленными (см. статью Fuke I. и соавт. (1994), J. Control Release, 30:27-34) или звездообразной формы (см. статью Merrill E.W., (1993), J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 5:1-11). ПЭГ и ПЭО являются амфипатическими, т.е. они растворимы в воде и некоторых органических растворителях и могут прилипать к липидсодержащим материалам, включая вирусы с оболочками и мембраны животных и растительных клеток. Некоторые случайные или блок-, либо чередующиеся сополимеры этиленоксида(ОСН 2 СН 2) и пропиленоксида, которые имеют следующую структуру: обладают свойствами, которые достаточно близки свойствам ПЭГ, что, как полагают, делает данные сополимеры приемлемыми заместителями ПЭГ в ряде вариантов применения (см., например, Hiratani H., патент США 4609546 и Saifer M. и соавт., патент США 5283317). Термин "полиалкиленоксиды" и аббревиатуру "ПАО" используют в данном контексте для обозначения таких сополимеров, а также для ПЭГс или ПЭОс и сополимеров поли(оксиэтиленоксиметилена) (см. Pitt С.G. и соавт., патент США 5476653). Как используют в данном контексте, термин "полиалкиленгликоли" и аббревиатуру"ПАГ используют для родового обозначения полимеров, пригодных для применения в конъюгатах, соответствующих изобретению, в особенности ПЭГ, в частности ПЭГ, содержащего одну реакционную группу ("монофункционально активированный ПЭГ"). Для ковалентного присоединения ПЭГ или других полиалкиленоксидов к белку требуется превращение по меньшей мере одной концевой группы полимера в реакционную функциональную группу. Данный процесс часто называют "активацией" и продукт называют "активированным ПЭГ" или активированным полиалкиленоксидом. МонометоксиПЭГ, в которых кислород на одном конце закрыт нереакционной химически стабильной метильной группой (для образования "метоксильной группы") и на другом конце - функциональной группой, которая реагирует с аминогруппами на молекуле белка, наиболее часто используют в данных подходах. Так называемые "разветвленные" мПЭГ, которые содержат две или более метоксильные группы, дистальные относительно единственной активированной функциональной группы, используют менее часто. Примером разветвленного ПЭГ является ди-мПЭГ-лизин, в котором ПЭГ связан с обеими аминогруппами, и карбоксильная группа лизина наиболее часто активированаR.B. и соавт., патент США 5919455; Harris J.M. и соавт., патент США 5932462). Обычно активированные полимеры реагируют с биоактивным соединением, имеющим нуклеофильные функциональные группы, которые служат центрами присоединения. Одна нуклеофильная функциональная группа, которую обычно используют как центр присоединения, представляет собой-аминогруппу остатков лизина. Доступные для растворителей -аминогруппы, группы карбоновых кислот, гуанидиногруппы, имидазольные группы, подходящим образом активируемые карбонильные группы, окисленные углеводные структуры и тиоловые группы также были использованы в качестве центров присоединения. Гидроксильная группа ПЭГ была активирована цианурхлоридом перед присоединением к белкам(см. статьи Abuchowski А. и соавт. (1977), J. Biol. Chem., 252:3582-3586; Abuchowski А. и соавт. (1981),Cancer Treat. Rep., 65:1077-1081). Однако применение данного способа имеет недостатки, такие как токсичность цианурхлорида и его неспецифическая реакционность в отношении белков, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как доступные для растворителя остатки цистеина или тирозина, которые могут быть основными в осуществлении функции. Для того чтобы преодолеть данные и другие недостатки, вводили альтернативно активированные ПЭГ, такие как сукцинимидилсукцинатные производные ПЭГ ("СС-ПЭГ") (см. статью Abuchowski А. и соавт. (1984), Cancer Biochem. Biophys.,7:175-186), сукцинимидилкарбонатные производные ПАГ("СК-ПАГ") (см. Saifer M. и соавт., патент США 5006333) и альдегидные производные ПЭГ (см. Royer G.P., патент США 4002531). Обычно несколько (например, 5-10) цепей одного или более ПАГ, например одного или более ПЭГ с молекулярной массой от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, связывают с белком-мишенью через первичные аминогруппы (-аминогруппы остатков лизина и, возможно, -аминогруппы аминоконцевой ("N-концевой") аминокислоты). В последнее время были синтезированы конъюгаты, содержащие одну цепь мПЭГ более высокой молекулярной массы, например 12, 20 или 30 кДа. Продемонстрированы прямые корреляции между полупериодами существования конъюгатов в плазме и увеличения молекулярной массы и/или увеличения числа связанных цепей ПЭГ (см. статьи Knauf M.J. и соавт., см. выше;Leong S.R. и соавт. (2001), Cytokine, 16:106-119). С другой стороны, по мере увеличения числа цепей ПЭГ, связанных с каждой молекулой белка, повышается вероятность того, что будет модифицирована аминогруппа на основном участке белка и, следовательно, будет нарушена биологическая функция белка, в особенности, если это белок, связывающий рецептор. Для более крупных белков, которые содержат много аминогрупп, и для ферментов с низкомолекулярными субстратами может быть приемлем компромисс между увеличенной продолжительностью действия и пониженной специфической активностью,поскольку он дает общее повышение биологической активности ПЭГ-содержащих конъюгатов in vivo. Однако для менее крупных белков, которые работают через взаимодействия с клеточными поверхностными рецепторами, таких как цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, было показано, что относительно высокая степень замещения снижает функциональную активность до уровня,аннулирующего преимущество увеличенного полупериода существования в кровотоке (см. статью ClarkR. и соавт., см. выше). Таким образом, конъюгирование полимеров представляет собой хорошо разработанную технологию пролонгирования биоактивности и снижения иммунореактивности терапевтических белков, таких как ферменты (см., например, предварительную заявку США 60/436020, поданную 26 декабря 2002 г. и предварительные заявки США 60/479913 и 60/479914, обе из которых поданы 20 июня 2003 г.,описания которых включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте). Однако конъюгирование полимеров с рецептор-связывающими белками, которые действуют путем связывания специфическим образом клеточных поверхностных рецепторов, обычно (1) нарушает данное связывание; (2) заметно снижает активности сигнальной трансдукции агонистов цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов и (3) заметно снижает конкурентные активности антагонистов цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов. Опубликованные примеры данных коньюгатов с пониженной активностью связывания рецепторов включают конъюгаты полимеров с человеческим гормоном роста ("hGH") (см. статью Clark R. и соавт., см. выше); антагонистами hGH (см. статью Ross R.J.M. и соавт. (2001), J. Clin. Endocrinol. Metab., 86:1716-1723) и ИФН- (см. статьи Bailon P. и соавт. (2001), Bioconjug. Chem. 12:195-202; Wylie D.C. и соавт. (2001), Pharm. Res., 18:1354-1360 и Wang Y.-S. и соавт.(2002), Adv. Drug Deliv. Rev., 54:547-570) и G-CSF (см. Kinstler, О. и соавт., публикация РСТWO 96/11953; статью Bowen S. и соавт. (1999), Exp. Hematol., 27:425-432) в числе прочих. В крайнем случае, связывание полимеров с интерлейкином-15 ("ИЛ-15") превращает данный ИЛ-2-подобный фактор роста в ингибитор клеточной пролиферации (см. статью Pettit D.K. и соавт. (1997), J. Biol. Chem., 272:2312-2318). Не имея в виду быть связанными теорией, механизм данных нежелательных эффектов ПЭГилирования может включать стерические препятствия взаимодействий рецептора с объемными группами ПЭГ, нейтрализацию заряда или оба эффекта. Таким образом, имеется потребность в способах получения ПАГ-содержащих (например,-3 013535 ПЭГ- и/или ПЭО-содержащих) конъюгатах, в особенности в конъюгатах между данными водорастворимыми полимерами и рецептор-связывающими белками при сохранении существенной биоактивности(например, по меньшей мере приблизительно 40%), почти полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 80%) или практически полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 90%). Данные конъюгаты будут иметь обусловленные полимерным компонентом преимущества в виде повышенной растворимости, стабильности, времени полужизни и биодоступности in vivo и будут демонстрировать в значительной мере повышенную активность или применимость по сравнению с обычными полимерными конъюгатами у животных, которым данные конъюгаты введены с профилактическими, терапевтическими или диагностическими целями. Сущность изобретения Данное изобретение направлено на вышеописанные потребности и представляет способы получения конъюгатов водорастворимых полимеров, например полиэтиленгликоля и его производных, с биоактивными компонентами, в особенности рецептор-связывающими белками, в частности терапевтическими или диагностическими биоактивными компонентами, такими как цитокины, хемокины, полипептидные гормоны и полипептидные факторы роста. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами. По сравнению с соответствующими неконъюгированными биоактивные компоненты, конъюгаты, соответствующие изобретению, обладают повышенной стабильностью (т.е. более длительным сроком хранения и более длительными полупериодами существования in vivo). Кроме того, по сравнению с конъюгатами того же самого биоактивного компонента, полученными с использованием полимерных цепей, которые случайным образом присоединены к доступным для растворителя центрам на полипептидных цепях, конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют повышенную рецепторсвязывающую активность, которую можно измерить или использовать in vitro, и повышенную эффективность in vivo. Изобретение представляет также такие усовершенствованные конъюгаты для применения в промышленной клеточной культуре. Более того, изобретение представляет композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие такие конъюгаты, и композиции, и способы применения конъюгатов и композиций во множестве профилактических, диагностических и терапевтических схем. В одном варианте осуществления изобретение представляет способы сохранения рецептор-связывающей активности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, предусматривающие селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров с аминоконцевой аминокислотой цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста,где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина. В близком варианте осуществления изобретение представляет способы сохранения рецептор-связывающей активности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста, предусматривающие селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров в или около центров гликозилирования цитокина, причем один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста. Подходящие полимеры для применения в данных способах, соответствующих изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, один или более полиалкиленгликолей (включая, но без ограничения перечисленным, один или более полиэтиленгликолей, один или более монометоксиполиэтиленгликолей и один или более моногидроксиполиэтиленгликолей, один или более полиалкиленоксидов,один или более полиоксиранов, один или более полиолефиновых спиртов, например поливиниловый спирт, один или более поликарбоксилатов, один или более поливинилпирролидонов, один или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одну или более полиаминокислот, один или более полиакрилоилморфолинов, один или более сополимеров одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, один или более декстранов и одну или более гиалуроновых кислот. Полимеры, подходящие для применения в способах, соответствующих изобретению, как правило, имеют молекулярные массы от приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа включительно или, в частности, молекулярные массы от приблизительно 1 до приблизительно 5 кДа включительно, от приблизительно 10 до приблизительно 20 кДа включительно,от приблизительно 18 до приблизительно 60 кДа включительно, от приблизительно 12 до приблизительно 30 кДа включительно или приблизительно 10 кДа либо приблизительно от 20 до 30 кДа. Множество цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов и аналогов, которые имитируют (т.е. проявляют агонизм) или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, которые опосредуются их специфическими поверхностными клеточными рецепторами, пригодны для применения при получении настоящих конъюгатов. Они включают цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны, имеющие структуру четырехспирального пучка (включая, но без ограничения перечисленным гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор ингибирования лейкоза (LIF), эритропоэтин (Еро), тромбопоэтин (Тро), фактор стволовых клеток(ИФН-) (включая ИФН 1b, консенсусный интерферон, пролактин и гормон роста и их мутеины, варианты, аналоги и производные): цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны,имеющие структуру -складки или -ствола (включая, но без ограничения перечисленным, фактор некроза опухоли(TNF-), ИЛ-1, ИЛ-1, ИЛ-12 (субъединицу р 40), ИЛ-16, эпидермальный фактор роста(EGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор роста основных фибробластов (bFGF), кислыйFGF, FGF-4 и фактор роста кератиноцитов (KGF; FGF-7), и их мутеины, варианты, аналоги и производные), и цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны, имеющие смешанную / структуру (включая, но без ограничения перечисленным, нейтрофил-активирующий пептид-2 (NAP-2),фактор 1 из клеток стромы (SDF-1), ИЛ-8, белок-1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1) МСР-2,МСР-3, эотаксин-1, эотаксин-2, эотаксин-3, RANTES, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), нейротактин, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF) и GRO/активность,стимулирующую рост меланомы (GRO-/MGSA) и их мутеины, варианты, аналоги и производные). Полипептидные гормоны, пригодные для применения в данном изобретении, включают, но без ограничения перечисленным, инсулин и аналоги инсулина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов инсулина, которые опосредуются инсулиновыми рецепторами; пролактин и аналоги пролактина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов пролактина, которые опосредуются пролактиновыми рецепторами, и гормон роста (в особенности человеческий гормон роста) и его аналоги, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов гормона роста, которые опосредуются рецепторами гормона роста. Особенно предпочтительные цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, пригодные для применения согласно данному изобретению, включают ИЛ-2, ИЛ-10, ИФН-, ИФН-,(включая ИФН 1b), TNF-, IGF-1, EGF, bFGF: hGH, пролактин и инсулин. Кроме того, особенно пригодными для применения являются конкурентные антагонисты вышеуказанных цитокинов, хемокины,факторы роста и полипептидные гормоны, например антагонисты TNF-, hGH или пролактина, а также мутеины, варианты и производные данных цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов. В ряде вариантов осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) (в частности, посредством связи вторичного амина) с -аминогруппой аминоконцевой аминокислоты на цитокине, хемокине, факторе роста и полипептидном гормоне. В других вариантах осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) с химически реакционной группой боковой цепи (например, гидроксильной группой, сульфгидрильной группой, гуанидиновой группой, имидазольной группой, аминогруппой,карбоксильной группой или альдегидным производным) аминоконцевой аминокислоты на цитокине,хемокине, факторе роста и полипептидном гормоне. В дополнительных вариантах осуществления связывание полимера с цитокином, хемокином, фактором роста и полипептидным гормоном по аминоконцевой аминокислоте или в либо около одного или более центров гликозилирования имитирует благоприятные эффекты гликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста и полипептидного гормона. В близких вариантах осуществления связывание полимера с цитокином, хемокином, фактором роста и полипептидным гормоном в или около одного или более центров гликозилирования на цитокине, хемокине,факторе роста и полипептидном гормоне имитирует положительные эффекты гипергликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста и полипептидного гормона, где термин "гипергликозилирование" указывает на ковалентное присоединение простых или сложных углеводных молекул, кроме тех, которые присутствуют в нативной структуре. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные способами, соответствующими изобретению. Конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат выбранный цитокин, выбранный хемокин,выбранный фактор роста, выбранный полипептидный гормон или его выбранный антагонист (такой как вышеописанные), связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких как вышеописанные), где один или более полимеров связан/связаны с аминоконцевой аминокислотой цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона и где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов выбранного цитокина, хемокина,фактора роста или полипептидного гормона. Кроме того, конъюгаты, соответствующие изобретению,содержат выбранный цитокин, выбранный хемокин, выбранный фактор роста или выбранный полипептидный гормон или его выбранный антагонист (такой как вышеописанные), связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких как вышеописанные), где один или более полимеров связаны с одним или более центров гликозилирования выбранного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста и где один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста. Для полимерных конъюгатов агонистов, соответствующих изобретению, предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров был отдален от всех рецептор-связывающих доменов. Для полимерных конъюгатов ряда антагонистов,соответствующих изобретению, может быть предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров был отдален от некоторых рецептор-связывающих доменов, которые являются основными для осу-5 013535 ществления связывания, но отдаление от всех рецептор-связывающих доменов, которые важны для сигнальной трансдукции посредством агонистов, не является обязательным. Изобретение представляет также композиции, в особенности фармацевтические композиции, содержащие один или более конъюгатов,соответствующих изобретению, и один или более дополнительных компонентов, таких как один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. Изобретение представляет также наборы, содержащие один или более конъюгатов, композиций и/или фармацевтических композиций, соответствующих изобретению. Изобретение представляет также способы предупреждения, диагностики или лечения физического нарушения у животного (например, млекопитающего, такого как человек), страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению. Данные способы могут содержать, например, введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, композиций или фармацевтических композиций, соответствующих данному изобретению. Физические нарушения, которые надлежащим образом лечат или предупреждают согласно данным способам, соответствующим изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, формы рака (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичников,рак простаты, рак яичка, рак легкого, лейкоз, лимфому, рак толстой кишки, желудочно-кишечный рак,рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки, рак костей, неврологический рак, рак головы и шеи, рак кожи, саркому, аденому, карциному и миелому); инфекционные заболевания (например,бактериальные заболевания, грибковые заболевания, паразитарные заболевания и вирусные заболевания(такие как вирусный гепатит, заболевание, вызываемое кардиотропным вирусом, ВИЧ/СПИД и т.п.); и генетические нарушения (например, анемию, нейтропению, тромбоцитопению, гемофилию, карликовость и заболевание тяжелый комбинированный иммунодефицит ("SCID"); аутоиммунные нарушения(например, псориаз, системную красную волчанку и ревматоидный артрит) и нейродегенеративные нарушения (например, различные формы и стадии рассеянного склероза; болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п.). Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидны обычному специалисту в свете следующих чертежей и описания изобретения и формулы изобретения. Перечень чертежей На фиг. 1-8 представлены молекулярные модели различных цитокинов и факторов роста, созданные с помощью программы RasMol (см. статью Sayle R.А. и соавт. (1995), Trends Biochem. Sci. 20: 374-376) на основе кристаллографических данных. Каждая из моделей представлена в формате "ленты" или "рисунка" за исключением некоторых остатков, представляющих особенный интерес, которые показаны в формате "шариков и стрежней". Данные форматы являются вариантами, выбранными при использовании программы RasMol. Темные части лент представляют домены цитокинов и факторов роста, которые, как описано, участвуют в связывании с их рецепторами. Для каждой структуры указан инвентарный код банка данных по белкам (Protein Data Bank) ("PDB") (см. статьи Laskowski R.A., (2001), Nucleic Acids Res.,29:221-222; Peitsch M.C., (2002), Bioinformatics, 18:934-938; Schein C.H., (2002), Curr. Pharm. Des. 8:21132129). На фиг. 1 а показана модель интерферона 2 а, (SEQ ID NO:1), в которой четыре остатка лизина(Lys 31, Lys 121, Lys 131 и Lys 134), которые, как описано, являются первичными центрами ПЭГилирования в продукте ПЭГ-интерферон Roche, Pegasys, представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данных Bailon P. и соавт., см. выше). Идентифицированы области, участвующие в связывании с его рецепторами ("Связывающие центры 1 и 2"). Все четыре остатка лизина, которые, как описано,ПЭГилированы, в Pegasys находятся в области связывающего центра 1 (код PDB 1ITF). На фиг. 1b показана модель интерферона 2b, (SEQ ID NO:2), в которой остатки, которые, как описано, являются основными центрами ПЭГилирования в PEG-INTRON Schering-Plough (His 34, Lys 31,Lys 121, Tyr 129 и Lys 131) представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данных Wylie D.C. и соавт., см. выше). Данные остатки аминокислот находятся в области связывающего центра 1. На фиг. 1 с показана модель интерферона 2b, в которой аминоконцевой остаток цистеина ("Cys 1"), мишень ПЭГилирования в соответствии с данным изобретением, представлена в формате "шариков и стержней". Cys 1 отдален от связывающих центров 1 и 2. На фиг. 1d показана та же самая модель интерферона 2b, что показана на фиг. 1 с, к N-концевому остатку цистеина ("Cys 1") которой присоединена одна цепь ПЭГ молекулярной массы 20 кДа. Структура ПЭГ получена с помощью адаптации программы, описанной Lee L.S. и соавт. 1999), Bioconjug. Chem.,10:973-981) и сделана в том же масштабе, что белок. На фиг. 2 показана молекулярная модель человеческого интерферона 1 а (см. SEQ ID NO: 3), в которой указано несколько остатков лизина, которые находятся в или вблизи от рецептор-связывающих доменов (Lys 19, Lys 33, Lys 99 и Lys 134). Кроме того, центр гликозилирования (Asn 80) и N-концевой остаток метионина ("Met 1") представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данных Karpusas М. и соавт. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:11813- 11818; Karpusas M. и соавт. (1998), Cell Mol. LifeSci., 54:1203-1216; Runkel L. и соавт. (2000), Biochemistry, 39:2538-2551). Met 1 находится в отдалении от связывающих центров 1 и 2, тогда как некоторые остатки лизина расположены в рецептор-связывающих-6 013535 доменах, (код PDB 1AUI). Структура интерферона 1b отличается от структуры интерферона 1a отсутствием N-концевого остатка метионина и углеводной частью, а также наличием остатка серина, замещенного неспаренным остатком цистеина (Cys 17). На фиг. 3 показана молекулярная модель человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ("GM-CSF", SEQ ID NO:5), в котором три остатка лизина (Lys 72, Lys 107 иLys 111), которые находятся в рецептор-связывающих доменах, а также первый остаток аминокислоты около аминоконца, который визуализируется в кристаллической структуре ("Arg 4"), показаны в формате"шариков и стержней" (на основе данных Rozwarski D.A. и соавт. (1996), Proteins, 26:304-313). Аминоконцевая область GM-CSF отдалена от связывающих центров 1 и 2 (код PDB 2GMF). На фиг. 4 показана молекулярная модель человеческого интерлейкина-2 ("ИЛ-2", SEQ ID NO:6), в которой остатки аминокислот, которые, как описано, включены в каждый из трех рецепторов (,и ),представлены в формате "шариков и стержней", как и несколько остатков лизина, которые находятся в или вблизи от рецептор-связывающих доменов. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре, представляет собой серии 6 ("Ser 6"), который отдален от рецептор-связывающих доменов (на основе данных Bamborough Р. и соавт. (1994), Structure,2:839-851; Pettit D.K. и соавт., см. выше) (код PDB 3INK). На фиг. 5 показана молекулярная модель человеческого эпидермального фактора роста ("EGF",SEQ ID NO:7) в формате "рисунка" за исключением остатков, которые участвуют в связывании рецептора, и двух остатков лизина (Lys 28 и Lys 48), которые прилежат к рецептор-связывающим областям. Дисульфидные связи внутри цепи показаны пунктиром. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты,который визуализируется в кристаллической структуре, на которой базируется данная модель, представляет собой цистеин 6 ("Cys 6") (на основе данных Carpenter G. и соавт. (1990), J. Biol. Chem, 265:77097712; Lu H.-S. и соавт. (2001), J. Biol. Chem., 276:34913-34917). Гибкая часть аминоконца EGF (остатки 15), которая не визуализируется в кристаллической структуре, по-видимому, не находится в рецепторсвязывающей области (код PDB 1JL9). На фиг. 6 показана молекулярная модель фактора роста основных фибробластов ("bFGF", SEQ IDNO:8) в формате "рисунка", на котором остатки, участвующие в связывании с рецепторами и гепарином,идентифицированы представлением в формате "шариков и стержней" (на основе данных Schlessinger J. и соавт. (2000), Mol. Cell, 6:743-750). Первые 12 остатков аминокислот из аминоконца не участвовали в связывании рецептора (код PDB 1FQ9). На фиг. 7 показана молекулярная модель инсулиноподобного фактора роста-1 ("IGF-1", SEQ ID NO:9) в формате "рисунка" за исключением остатков, участвующих в связывании рецептора (23-25 и 28-37), и остатка глутаминовой кислоты 3 ("Glu 3"), который представляет собой ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре. Идентифицировано два из остатков лизина, один из которых (Lys 27) прилежит к рецептор-связывающему домену, а другой отдален от рецептор-связывающего домена (на основе данных Brzozowski A.М. и соавт. (2002), Biochemistry, 41:93899397). Аминоконец IGF-1 отдален от рецептор-связывающих доменов (код PDB 1GZR). На фиг. 8 показана молекулярная модель интерферона- ("ИФН-", SEQ ID NO:4), который представляет собой гомодимер. Для объяснения взаимодействий между двумя полипептидными цепями один из мономеров ("цепь А") показан в формате "ленты", а другой ("цепь В") показан в формате "линии". Остатки лизина (показаны в формате светлых "шариков и стержней") расположены вдоль полипептидной цепи, включая области, которые участвуют в создании области контакта между мономерами или прилежат к остаткам аминокислот, которые участвуют в связывании белка. Аминоконцевая область ИФНотдалена от области контакта при димеризации, но глутамин 1 (Gln 1) участвует в связывании рецептора,(см. статью Thiel D.J. и соавт. (2000), Structure, 8:927-936; код PDB 1FG9). На фиг. 9 показано фракционирование неПЭГилированного интерферона 2b ("ИФН"), моноПЭГилированного интерферона 2b ("ПЭП-ИФН") и диПЭГилированного интерферона 2b ("ПЭГ 2-ИФН") с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИФН, мПЭГ-альдегид молекулярной массы 20 кДа и восстановитель. На фиг. 10 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 9, и выбранных фракций, собранных с ионообменной колонки, результаты относительно которых показаны на фиг. 9. На фиг. 11 показано фракционирование с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИЛ-2 человека, мПЭГ-альдегид молекулярной массы 20 кДа и восстановитель. В указанных условиях элюции остаточный неПЭГилированный ИЛ-2 не элюировался с колонки в отличие от результатов, полученных для интерферона 2b, которые представлены на фиг. 9. На фиг. 12 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 11, и выбранных фракций, элюированных с данной колонки. На фиг. 13 показаны данные электрофоретических анализов реакционной смеси ПЭГилированного интерлейкина-2 ("ПЭГ-ИЛ-2") и фракции из катионообменной колонки, хроматограмма, относящаяся к-7 013535 которой, приведена на фиг. 11. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пока не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном контексте,имеют такие же значения, как обыкновенно имеются в виду обычным специалистом в области, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном контексте, могут быть использованы в практической реализации или тестировании данного изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Определения Приблизительно: как используют в данном контексте, когда обращаются к любому числовому значению, термин "приблизительно" означает величину 10% от указанного значения (например, "приблизительно 50 С охватывает интервал температур от 45 до 55 С включительно; аналогичным образом "приблизительно 100 мМ" охватывает интервал концентраций от 90 до 110 мМ включительно). Остаток аминокислоты: как используют в данном контексте, термин "остаток аминокислоты" относится к конкретной аминокислоте, как правило, дегидратированной в результате ее участия в двух пептидных связях в полипептидном скелете или боковой цепи, но также при включении аминокислоты в одну пептидную связь, как происходит на каждом конце линейной полипептидой цепи. Остатки аминокислот обозначают трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами, которые приняты в области техники. Антагонист: как используют в данном контексте, термин "антагонист" относится к соединению,молекуле, структуре или комплексу, который снижает, значительно снижает или полностью ингибирует биологические и/или физиологические эффекты данного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона на клетку, ткань или организм, которые опосредуются через рецепторы данного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона. Антагонисты могут осуществлять такие эффекты множеством путей, включая, но без ограничения перечисленным, конкуренцию с агонистом за связывающий центр(ы) или рецептор(ы) на клеточной поверхности, взаимодействие с агонистом таким образом, чтобы снизить, значительно снизить или полностью ингибировать способность агониста связываться с клеточными поверхностными рецепторами; связыванием с клеточными поверхностными рецепторами и индукцией в них конформационного изменения, причем рецепторы приобретают структуру, с которой агонист не может более связываться (или может связываться только с пониженной или значительно пониженной аффинностью и/или эффективностью); индукцию физиологического изменения (например, увеличения внутриклеточных комплексов передачи сигнала, повышения уровня ингибиторов транскрипции, снижения экспрессии клеточного поверхностного рецептора лиганда и т.п.) в клетках,тканях или организмах, так что связывание агониста или физиологический сигнал, вызываемый агонистом при связывании с клеткой, снижается, значительно снижается или полностью ингибируется; и другие механизмы, посредством которых антагонисты могут осуществлять свои активности, которые знакомы обычным специалистам. Как будет понятно обычному специалисту, антагонист может иметь структуру, близкую лиганду, относительно которого он оказывает антагонистическое действие (например,антагонист может быть мутеином, вариантом, фрагментом или производным агониста) или может иметь совершенно неродственную структуру. Биоактивный компонент: как используют в данном контексте, термин "биоактивный компонент" относится к соединению, молекуле, структуре или комплексу, которые имеют определенную биологическую активность in vivo, in vitro или ex vivo в отношении клетки, ткани, органа или организма и которые способны связываться с одним или более полиалкиленгликолей с образованием конъюгатов, соответствующих изобретению. Предпочтительные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным, белки и полипептиды, такие как описаны в данном контексте. Связанный: как используют в данном контексте, термин "связанный" относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например, посредством химического связывания, или нековалентным, например, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями, водородными связями и т.п. Ковалентные связи могут быть, например, сложноэфирными, эфирными, фосфоэфирными, сложнотиоэфирными, тиоэфирными, уретановыми, амидными, аминными, пептидными, имидными, гидразоновыми, тидразидными, сероуглеродными связями и фосфоруглеродными связями и т.п. Термин "связанный" включает такие термины, как "спаренный", "конъюгированный" и "присоединенный". Конъюгат/конъюгирование: как используют в данном контексте, термин "конъюгат" относится к продукту ковалентного присоединения полимера, например, ПЭГ или ПЭО, к биоактивному компоненту,например белку или гликопротеину. Термин "конъюгирование" относится к образованию конъюгата, как описано в предыдущем предложении. Любой способ, обычно используемый компетентными специалистами в области конъюгирования полимеров с биологически активными материалами, может быть использован в данном изобретении. Спаренный: термин "спаренный", как используют в данном контексте, относится к присоединению посредством ковалентных связей или сильных нековалентных взаимодействий, обычно и предпочтительно к присоединению посредством ковалентных связей. Любой способ, обычно используемый компе-8 013535 тентными специалистами в области спаривания биологически активных материалов, может быть использован в данном изобретении. Цитокин/хемокин: как используют в данном контексте, термин "цитокин" определяют как секретируемый регуляторный белок, который контролирует выживаемость, рост, дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор в Nicola N.A.,см. выше; статью Kossialcoff A.A. и соавт., см. выше). Аналогично, как используют в данном контексте,термин "хемокин" определяют как представитель семейства структурно близких гликопротеинов с сильными активностями активации лейкоцитов и/или хемотактической активностью (см. обзор OppenheimJ.J. и соавт., см. выше). Согласно данным определениям цитокины и хемокины включают интерлейкины,колониестимулирующие факторы, факторы роста и другие пептидные факторы, продуцируемые множеством клеток, включая, но без ограничения перечисленным, т.е. которые специально описаны или приведены в качестве примеров в данном контексте. Как близкие им соединения, полипептидные гормоны и факторы роста, цитокины и хемоктины инициируют свои регуляторные функции путем связывания со специфическими рецепторными белками на поверхности своих клеток-мишеней. Заболевание, нарушение, состояние: как используют в данном контексте, термины "заболевание" или "нарушение" относятся к любому патологическому состоянию человека или животного, включая опухоли, рак, аллергии, аддикцию (привыкание к употреблению субстанций), аутоиммунитет, инфекцию, отравление или нарушение оптимальной умственной или физической функции. Термин "состояния", как используют в данном контексте, включает заболевания и нарушения, но относится также к физиологическим состояниям. Например, способность к оплодотворению является физиологическим состоянием, но не заболеванием или нарушением. Композиции, соответствующие изобретению, пригодные для предупреждения беременности путем снижения способности к оплодотворению, будут вследствие этого описаны как средство для лечения состояния (способности к оплодотворению), но не как средство для лечения нарушения или заболевания. Другие состояния понятны обычным специалистам в данной области. Эффективное количество: как используют в данном контексте, термин "эффективное количество" относится к количеству определенного конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желательного биологического эффекта. Эффективное количество определенного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, будет составлять количество, которое достигает заданного результата, и такое количество может быть определено рутинным образом компетентным специалистом в данной области при использовании анализов, который известны в области техники и/или описаны в данном контексте без необходимости проведения излишних экспериментов. Например, эффективным количеством для лечения иммунодефицита могло бы быть количество,необходимое, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящее в результате к образованию антигенспецифического иммунного ответа при воздействии антигена. Термин также является синонимом термина "достаточное количество". Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, которое предусматривается лечить, конкретной композиции, предназначенной для введения, способа введения, размера субъекта и/или тяжести заболевания или состояния. Обычный специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество конкретного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, без необходимости проведения излишних экспериментов. Один или какой-либо неопределенный: когда термины "один" или "какой-либо неопределенный" используют в данном описании, они означают "по меньшей мере один" или "один или более", пока не указывается иначе. ПЭГ: как используют в данном контексте, термин "ПЭГ" включает все полимеры этиленоксида, как линейные или разветвленные, либо имеющие множество ветвей, так и блокированные на конце или заканчивающиеся гидроксилом. Термин "ПЭГ" включает те полимеры, которые известны в области техники как полиэтиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль или мПЭГ или полиэтиленгликоль-монометиловый эфир, алкоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленоксид или ПЭО, -метилгидроксиполи(оху 1,2-этандиил) и полиоксиран в числе других названий, которые используют в области техники для полимеров этиленоксида. ПЭГилирование, ПЭГилированный и ложно-ПЭГилированный: как используют в данном контексте, термин "ПЭГилирование" относится к любому процессу ковалентного связывания ПЭГ с биоактивной молекулой-мишенью, особенно рецептор-связывающим белком. Конъюгат, полученный таким образом, определяют как "ПЭГилированный". Как используют в данном контексте, термин "ложноПЭГилированный" относится к части белка или другому биоактивному компоненту в реакционной смеси для ПЭГилирования, к которой не был ковалентно присоединен никакой ПЭГ. Тем не менее, ложноПЭГилированный продукт может быть изменен во время реакции или последующих стадий очистки,например как последствие воздействия восстановителя во время ПЭГилирования путем восстановительного алкилирования и/или посредством одного или более ингибирующих агентов, соединений и т.п.,удален во время стадий обработки и/или очистки. Полипептид: как используют в данном контексте, термин "полипептид" относится к молекуле, со-9 013535 стоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (известными также как пептидные связи). Он обозначает молекулярную цепь аминокислот и не относится к специфической длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин предназначен также для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, например гликозилирования, гипергликозилирования, ацетилирования,фосфорилирования и т.п. Полипептид может быть выделен из естественного биологического источника или получен технологией рекомбинантной ДНК, но необязательно, чтобы он был транслирован со сконструированной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым образом,включая химический синтез. Белок и гликопротеин: как используют в данном контексте, термин "белок" относится к полипептиду, как правило, размером больше приблизительно 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, либо 2000 или более аминокислот. Белки обычно имеют определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют данную структуру, и их часто называют уложенными в противоположность пептидам и полипептидам, которые часто не обладают определенной трехмерной структурой, но могут принимать большое число различных конформаций, и их называют неуложенными. Однако пептиды также могут иметь определенную трехмерную структуру. Как используют в данном контексте, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной молекулой, которая присоединена к белку посредством кислородсодержащей или азотсодержащей боковой цепи остатка аминокислоты, например остатка серина или остатка аспарагина. Отдаленный (в отдалении): как используют в данном контексте, термин "отдаленный" (как в выражении "отдаленная N-концевая аминокислота" или "отдаленный центр гликозилирования") относится к структуре, в которой положение одного или более центров присоединения для одного или более полимеров на белке находится/находятся дистально или пространственно отдалены от одного или более рецептор-связывающих областей или доменов белка, как определяют путем молекулярного моделирования. Конъюгирование полимера с таким отдаленным центром присоединения (как правило, N-концевой аминокислотой (для рецептор-связывающих белков, которые вследствие этого называют рецепторсвязывающие белки с "отдаленным N-концом" или "RN" рецептор-связывающие белки) или одной или более углеводных молекул или центров гликозилирования на гликопротеине (для рецепторсвязывающих белков, которые вследствие этого называют рецептор-связывающие белки с "отдаленным гликозилированием" или "RG" рецептор-связывающие белки не приводит к значительным стерическим препятствиям связывания белка с его рецептором(ами). Следовательно, полагают, что когда аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования на цитокине, хемокине, факторе роста или полипептидном гормоне "находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов" цитокина,хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, то конъюгирование (например, ковалентное присоединение) водорастворимого полимера с аминоконцевой аминокислотой или центром гликозилирования, соответственно, не нарушает существенным образом способности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона связываться с его рецептором(ами), в особенности с клеточными поверхностными рецепторами. Конечно, признают, что данный цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон может содержать более одного рецептор-связывающего домена. В таких ситуациях аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона могут находиться в отдалении от одного такого домена или от более чем одного из таких доменов, и, кроме того, рассматриваются как "расположенные в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов" настолько, что конъюгирование аминоконцевой аминокислоты или центра гликозилирования не нарушает существенным образом связывания цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона с его рецептором(ами) посредством одного или более рецепторсвязывающих доменов. Нарушает или не нарушает существенным образом конъюгирование способность белка связываться с его рецептором(ами), можно легко установить с использованием известных в области техники анализов связывания лиганд-рецептора, которые знакомы обычным специалистам в данной области. Способы оценки связывания лиганд-рецептора включают без ограничения перечисленным анализы конкурентного связывания, анализы связывания радиорецептора, анализы на основе клеток, измерения поверхностного плазменного резонанса, динамическое светорассеяние и ультрацентрифугирование. Как показано на фиг. 1d данного описания, ПЭГ представляет собой высокообъемный и гибкий полимер, который занимает большой объем в растворе относительно белка близкой молекулярной массы. Хотя остаток аминокислоты, к которому присоединен ПЭГ, может находиться в отдалении от одного или более рецептор-связывающих центров, части полимера, тем не менее, могли бы до некоторой степени нарушать связывание рецептора. Вероятность такого нарушения повышается с увеличением молекулярной массы и, следовательно, объема, занимаемого полимером в растворе. Наконец, ПЭГилирование, которое находится в отделении от рецептор-связывающих областей, будет меньше нарушать связывание рецептора, чем случайное ПЭГилирование. Существенный, существенно (в существенной мере): как используют в данном контексте, конъюги- 10013535 рование белка, как считают, не нарушает "в существенной мере" способность белка связываться со своим рецептором(ами), если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с рецептором составляет не меньше чем приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%,приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, который не был конъюгирован. Лечение: как используют в данном контексте, термины "лечение", "лечат", "леченый" или "проходящий лечение" относятся к профилактике и/или терапии. При использовании в отношении инфекционного заболевания, например, термин может относиться к профилактическому лечению, которое повышает резистентность субъекта к инфекции патогена или, другими словами, снижает вероятность того, что субъект будет инфицирован патогеном или продемонстрирует признаки заболевания, присущие инфекции, а также к лечению после инфицирования субъекта с целью борьбы с инфекцией, например для снижения или уничтожения инфекции или для предупреждения ее ухудшения. Общие положения Данное изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецептор-связывающую активность относительно полимерных конъюгатов того же самого рецептор-связывающего белка, к которому один или более полимеров присоединен(ы) случайным образом. При использовании структурных анализов на основе рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса, мутационного анализа и компьютерной программы молекулярного моделирования данные авторы идентифицировали центры-мишени для ПЭГилирования цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов, которые участвуют или не участвуют в связывании со своими рецепторами. Как класс белков, данные агонисты и антагонисты цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов называют в данном контексте рецептор-связывающими белками. Посредством выбора стратегии синтеза, которая направляет присоединение полимера на область(и) рецептор-связывающих белков, которая не участвует во взаимодействиях рецептора, избегают некоторых нежелательных стерических препятствий, и полученные в результате полимерные конъюгаты сохраняют необычайно высокую активность. Данные рецепторсвязывающие белки, которые имеют аминоконцевой остаток, отдаленный от одного или более из их рецептор-связывающих областей или доменов, определены в данном контексте как рецептор-связывающие белки "с отдаленным N-концом" или "RN" рецептор-связывающие белки; они включают все цитокины,хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны или их антагонисты, у которых аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от рецептор-связывающего центра или центров белка. В другом варианте осуществления изобретения получают конъюгаты, содержащие один или более синтетических полимеров (например, один или более полиэтиленгликолей), ковалентно связанных с цитокинами, хемокинами, факторами роста и полипептидными гормонами, которые имеют естественные центры гликозилирования, отдаленные от одного или более их рецептор-связывающих областей или доменов. Согласно данному аспекту изобретения биоактивные компоненты (например, белки) конъюгатов будут проявлять хорошо сохранившиеся рецептор-связывающие активности, когда синтетические полимеры связываются в области центра(ов) гликозилирования. Данную подгруппу рецептор-связывающих белков называют в данном контексте "RG-рецептор-связывающими белками. Когда гидрофильный или амфипатический полимер селективно связаны с или около такого "отдаленного центра гликозилирования", в особенности когда белок-мишень представляет собой негликозилированную форму белка, который в естественных условиях является гликозилированным, полимер может имитировать благоприятные эффекты природного углевода, например, на агрегацию, стабильность и/или растворимость. Таким образом, вследствие этого его присоединение называют в данном контексте "псевдогликозилированием". Таким образом, данное изобретение представляет способы синтеза конъюгатов, в которых центр-селективное связывание синтетического полимера эффективно замещает естественные углеводные молекулы. Полученное в результате псевдогликозилирование способствует улучшенной растворимости, пониженной агрегации и задержанному выведению из кровотока по сравнению с другими негликозилированными формами белка. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в прокариотических клетках-хозяевах (например, бактериях, таких как Escherichia coli), поскольку прокариотические организмы, как правило, не гликозилируют белок, который они экспрессируют. Аналогично селективное ПЭГилирование углеводной части гликопротеина может в результате привести к "псевдогипергликозилированию" гликопротеина. Данный процесс представлен, например,С. Bona и соавт. в публикации РСТWO 96/40731, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в эукариотических клетках-хозяевах (например, дрожжах, клетках растений и клетках животных (вклю- 11013535 чая клетки млекопитающих и насекомых, поскольку эукариотические организмы, как правило, гликозилируют белки, которые они экспрессируют, если данные белки включают естественные сигналы гликозилирования или сигналы гликозилирования, интродуцированные посредством технологии рекомбинантной ДНК. Данные псевдогликозилированные и псевдогипергликозилированные RG рецепторсвязывающие белки входят в объем данного изобретения. Таким образом, изобретение охватывает также полимерные конъюгаты "RN" рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность, и псевдогликозилированных или псевдогипергликозилированных "RG" рецептор-связывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность. Как используют в данном контексте, считают, что цитокин,хемокин, фактор роста или полипептидный гормон "сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность" при конъюгировании с одним или более водорастворимых полимеров, соответствующих данному изобретению, если конъюгирование цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона не нарушает в существенной мере способность белка связываться со своим рецептором(ами), т.е. если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с соответствующим ему рецептором(ами) составляет не меньше чем приблизительно 40%,приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%,приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания неконъюгированной формы соответствующего белка. В объем данного изобретения включены также полимерные конъюгаты данных рецептор-связывающих белков,которые классифицированы как оба, "RN" и "RG", рецептор-связывающие белки. Двумя примерами последних белков являются интерферон- (в частности, интерферон 1b) и ИЛ-2. В дополнительных вариантах осуществления изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецептор-связывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецепторсвязывающую активность относительно полимерных конъюгатов этого же рецептор-связывающего белка, в котором один или более полимеров присоединены случайным образом. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, и композиции, содержащие один или более данных конъюгатов, соответствующих изобретению, которые далее могут содержать один или более дополнительных компонентов или реагентов, таких как одна или более буферных солей, один или более углеводных наполнителей, один или более белков-носителей, один или более ферментов, один или более детергентов, одну или более молекул нуклеиновых кислот, один или более полимеров, таких как неконъюгированный ПЭГ или полиалкиленгликоль, и т.п. Изобретение представляет также наборы, содержащие конъюгаты и/или композиции, соответствующие изобретению. Изобретение представляет также фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие конъюгаты, соответствующие изобретению, и по меньшей мере один наполнитель или носитель, который является приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения. Изобретение представляет также способы лечения или предупреждения множества физических нарушений при использовании данных композиций, предусматривающие введение эффективного количества одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих данному изобретению, животному, страдающему от физического нарушения или состояния или предрасположенному к нему. Кроме того, изобретение представляет стабилизированные рецептор-связывающие белки и способы их получения для применения в промышленной клеточной культуре, причем получают неожиданно высокие активности в результате комбинированных эффектов существенного сохранения биоактивности и повышенной продолжительности действия при промышленном применении. Неожиданно высокие активности конъюгатов, соответствующих данному изобретению, могут отражаться в необыкновенно высокой продукции биомассы, необыкновенно высоких уровнях экспрессии рекомбинантных белков и других усовершенствованиях эффективности биопроцессинга. Способы Авторы обнаружили, что направленность полимеров на аминоконцевую аминокислоту "RN" рецептор-связывающего белка или участок, близкий к центру гликозилирования "RG" рецептор-связывающего белка, обеспечивает то, что полимер присоединяется к центру, который отдален от одного или более рецептор-связывающих областей или доменов белка, таким образом снижая до минимума стерическое препятствие взаимодействиям рецептора, создаваемое присоединенными молекулами полимера. Следовательно, можно сохранить более высокий процент рецептор-связывающей активности посредством конъюгирования белков согласно способам, соответствующим данному изобретению, чем было бы, если бы полимер был присоединен в или проксимально части молекулы, которая включена в связывание со своим рецептором(ами). Данный принцип, который может в результате привести к неожиданно высокому сохранению рецептор-связывающей активности, может быть продемонстрирован для рецепторсвязывающих белков, которые выбраны из фактора роста фибробластов ("bFGF" или "FGF-2"), эпидер- 12013535 мального фактора роста ("EGF"), инсулиноподобного фактора роста-1 ("IGF-1"), интерферона- ("ИФН"), интерферона- ("ИФН-, включая, но без ограничения перечисленным, ИФН 1b), гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора ("GM-CSF"), колониестимулирующего фактора моноцитов ("M-CSF"), лиганда Flt3, фактора стволовых клеток ("SCF"), интерлейкинов 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 и 15, фактора некроза опухоли- ("TNF-"), фактора некроза опухоли- ("TNF-"), трансформирующего фактора роста- ("TGF-"), трансформирующего фактора роста- ("TGF-"), фактора роста кератиноцитов("KGF"), человеческого гормона роста ("hGH"), пролактина, плацентарного лактогенного гормона, цилиарного нейротрофического фактора ("CNTF"), лептина и структурных аналогов данных рецепторсвязывающих белков, которые имитируют действия данных белков или которые являются их рецепторсвязывающими антагонистами. Напротив, не предполагается, что селективное присоединение большого полимера к аминоконцу ИФН- сохранит большую часть активности данного цитокина, поскольку такое связывание, как ожидают, нарушает связывание активного димера с его рецепторами (на основе данныхWalter M.R. и соавт. (1995), Nature, 376:230-235 и Thiel D.J. и соавт., см. выше). В близком данному варианте осуществления изобретения полимеры связаны с аминоконцевым остатком мутеинов рецептор-связывающих белков, которые работают как конкурентные антагонисты природного белка, связывая один или более тех же рецепторов без инициации сигнальной трансдукции. Примерами являются полимерные конъюгаты антагониста hGH, который содержит точечную мутациюG120R (см. статью Sundstrom M. и соавт. (1996), J. Biol. Chem., 271:32197-32203) и антагонист пролактина, который содержит точечную мутацию G129R (см. статьи Goffin V. и соавт. (1997), J. Mammary GlandPCTWO 99/58142 A1). Другие антагонисты рецептор-связывающих белков могут быть получены с помощью селективных точечных мутаций, укорочений или делеций (см. например, статьи Tchelet А. и соавт.(1997), Mol. Cell Endocrinol., 130:141-152; Peterson F.C., (1998). Идентификация мотивов, ассоциированных с лактогенным и соматотропным действием человеческого гормона роста (Identification of Motifs Associated with the Lactogenic и Somatotropic Actions of Human Growth Hormone), материалы диссертации на соискание степени Ph.D. (доктора философских наук), Ohio State University, UMI9822357). В другом варианте осуществления изобретения для "RG" рецептор-связывающих белков способы,соответствующие данному изобретению, приводят в результате к присоединению одного или более синтетических полимеров вблизи естественного центра присоединения углеводных молекул данных рецептор-связывающих белков, которые представляют собой гликопротеины. Это в результате дает "псевдогликозилирование" данных рецептор-связывающих белков (например, когда они экспрессировались с помощью технологий рекомбинантной ДНК в Е. coli или других прокариотических клетках, которые не осуществляют посттрансляционное гликозилирование) или приводит к "псевдогипергликозилированию" из гликопротеиновых форм (например, для продуцируемых в естественных условиях гликопротеинов или для гликопротеинов, продуцируемых эукариотическими клетками-хозяевами (например, дрожжами,клетками растений и клетками животных (включая клетки млекопитающих и насекомых, которые осуществляют посттрансляционное гликозилирование). Примерами являются полимерные конъюгаты интерферонови , а также эритропоэтин ("Еро") и интерлейкин-2. Присоединение синтетических полимеров в или около центров естественного гликозилирования может быть проведено любым способом,который известен в области техники, включая мутационный способ, описанный R.J. Goodson и соавт.(см. Biotechnology, (1990), 8:343-346) и способ, описанный R.S. Larson и соавт. (см. Bioconjug. Chem.,(2001), 12:861-869), который включает предшествующее окисление углевода; описания данных ссылок включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте. Аминоконцевая модификация некоторых белков была описана ранее (см., например, статью DixonH.B.F., (1984), J. Protein Chem., 3:99-108). Например, описано, что N-концевая модификация белков стабилизирует некоторые белки в отношении действия аминопептидаз (см. статью Guerra P.L и соавт.(1998), Pharm. Res., 15:1822-1827), улучшает растворимость белка (см. статью Hinds K. и соавт. (2000),Bioconjug. Chem., 11:195-201), уменьшает заряд на N-концевой аминогруппе или улучшает гомогенность полученных в результате конъюгатов (см. Kinstler О. и соавт., публикация Европейской патентной заявкиЕР 0822199 А 2; статью Kinstler О. и соавт. (2002), Adv. Drug. Deliv. Rev., 54:477-485) в числе прочих. Был описан альтернативный способ связывания полимеров с -аминогруппой N-концевого остатка цистеина или гистидина путем адаптации способа, известного в области техники как "нативное химическое лигирование" (см. Roberts M.J. и соавт., публикация РСТWO 03/031581 А 2 и публикация патентной заявки США 2003/0105224 А 1). Однако существование подклассов "RN" и "RG" рецепторсвязывающих белков не учитывалось или не описывалось ранее в обычно используемых способах отбора представителей данных классов, а также получения и применения полимерных конъюгатов таких рецептор-связывающих белков в качестве пути сохранения неожиданно высокой функциональной активности"RN" рецептор-связывающих белков. Следовательно, существует преимущество в том, чтобы определить, имеет или не имеет конкретный цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон N-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отделаны от рецептор-связывающего центра(ов) лиганда. Возможность предсказать, яв- 13013535 ляется ли данный цитокин, хемокин, фактор роста, полипептид "RN" или "RG" лигандом перед конъюгированием лиганда с полимером, в существенной мере уменьшает необходимость проведения экспериментов для получения конъюгатов полимер-лиганд (например, цитокинов хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов или их антагонистов, конъюгированных с полимерами, например ПЭГ),где антигенность и иммуногенность конъюгата понижена относительно антигенности и иммуногенности неконъюгированного лиганда без существенного снижения рецептор-связывающей и физиологической активности конъюгированного лиганда. Соответственно, в дополнительных вариантах осуществления данное изобретение представляет способы идентификации и отбора лигандов рецептор-связывающих белков (например, цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов и их антагонистов), которые имеют N-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отдалены от рецептор-связывающих центров белковых лигандов(т.е. способы идентификации и отбора "RN" или "RG" белков). В некоторых из данных вариантов осуществления изобретения оптимальное положение для конъюгирования одного или более полимеров (например, одного или более ПЭГ) можно определить с использованием молекулярного моделирования,например, с учетом 3-мерной структуры белка (цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста) при использовании компьютерной программы молекулярного моделирования для предсказания положения(ий), в котором один или более полимеров могут быть присоединены к белку без существенной потери биологической или рецептор-связывающей активности белка (см. такжеSchein C.H., выше). Аналогичный подход был продемонстрирован, например, для конъюгирования ПЭГ с G-CSF в попытке повысить его устойчивость к протеолитическому разложению (см. опубликованную патентную заявку США 2001/0016191 А 1 T.D. Osslund, описание которой включено в виде ссылки в данном контексте во всей ее полноте). Подходящая компьютерная программа молекулярного моделирования для применения в данном изобретении, такая как RASMOL (см. работу Sayle и соавт., см. выше) и другие программы, использованные для создания баз данных макромолекулярных структур, депонированных в Банке данных по белкам (Protein Data Bank) (PDB; см. статью Laskowski R.A., выше), хорошо известны в области техники и должны быть знакомы обычным специалистам в данной области. При использовании такой компьютерной программы молекулярного моделирования можно предсказать или определить трехмерную структуру полипептида, например цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста с высокой степенью надежности, основываясь на кристаллографических анализах лигандов и их рецепторов. Таким образом, обычный специалист может легко определить, какие лиганды являются "RN" или "RG" лигандами, которые пригодны для применения согласно данному изобретению. Для практической реализации данного изобретения одним из удобных способов ковалентного связывания водорастворимого полимера с -аминогруппой N-концевого остатка аминокислоты белка является восстановительное алкилирование оснований Шиффа, образованных с полимерами, несущими одну альдегидную группу, например, как заявлено G.P. Royer (см. патент США 4002531), но не как заявлено J.M. Harris и соавт. (см. патент США 5252714), поскольку последние авторы заявляют только полимеры, дериватизированные по обоим концам альдегидными группами, которые представляют собой перекрестно-сшивающие агенты и вследствие этого неприемлемы для синтеза длительно действующих рецептор-связывающих белков, которые сохраняют существенную рецептор-связывающую активность. Получение направленности восстановительного алкилирования оснований Шиффа ПЭГ-моноальдегидов на -аминогруппу N-концевой аминокислоты рецептор-связывающего белка и от -аминогрупп его остатков лизина можно осуществить множеством способов, основанных на материалах, представленных J.T. Edsall в главах 4 и 5 монографии "Белки, аминокислоты и пептиды как ионы и биполярные ионы" (ProteinsAmino Acids and Peptides as Ions и Dipolar Ions) 1943), с.75-115, 116-139, Reinhold Publishing Corporation,New York), описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Константа кислотной диссоциации ("pKa") -аминогруппы N-концевой аминокислоты полипептида, как ожидают,составляет меньше 7,6, тогда как значения pKa -аминогруппы остатков лизина в полипептидах, как ожидают, составляет приблизительно 9,5. В статье Edsall (см. (1943), см. выше) однозначно установлено, что альдегиды будут связываться с аминогруппой аминокислоты "только в щелочной области ее изоэлектрической точки". Следовательно, основываясь на настоящем описании и информации, которую легко получить в данной области техники, обычный специалист должен учитывать, что (1) селективная реакция альдегидов с -аминогруппой белка будет преобладать в интервале рН ниже 9,5 (приблизительно pKa-аминогрупп в белке); (2) скорость реакции альдегидов с -аминогруппами будет снижаться, если значение рН реакции снижается до 7,6 (приблизительно pKa -аминогруппы белка); (3) скорость реакции альдегидов с -аминогруппами будет снижаться меньше, чем у -аминогруппы при снижении рН реакции до 7,6, и (4) селективность реакции альдегида с -аминогруппой будет повышаться до некоторой степени по мере снижения значения рН до 6,6. Поскольку последнее значение приблизительно на одну единицу рН ниже значения pKa -аминогруппы и на три единицы рН ниже значения pKa -аминогрупп,приблизительно 10% -аминогрупп и приблизительно 0,1% -аминогрупп будут находиться в реакцион- 14013535 ном непротонированном состоянии. Таким образом, при рН 6,6 фракция непротонированных-аминогрупп в 100 раз превышает фракцию непротонированных -аминогрупп. Вследствие этого будет получено очень незначительное повышение селективности при дальнейшем снижении рН реакции, например до 5,6, где теоретически 1% -аминогрупп и 0,01% -аминогрупп могли бы находиться в реакционном непротонированном состоянии. Таким образом, в ряде вариантов осуществления изобретения белковые лиганды (в особенности "RN" или "RG" лиганды, включая цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны и их антагонисты) конъюгируют с одним или более полимеров путем образования смеси между лигандом(ами) и одним или более реакционных полимеров при рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,6; при рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,6; при рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,0 или при рН приблизительно 6,6. Данные способы, таким образом, существенно отличаются от известных в области техники, в которых связывание полимеров с -аминогруппами на N-концевых остатках аминокислот лигандов осуществляют при рН приблизительно 5 (см. статью Kinstler O. и соавт. (2002), Adv. Deliv.Rev., 54:477-485; Европейская патентная заявкаЕР 0822199 А 2; патенты США 5824784 и 5985265; статьи Roberts M.J. и соавт. (2002), см. выше; Delgado С. и соавт., патентная публикация США 2002/0127244 А 1), тогда как связывание полимеров с -аминогруппами остатков лизина в полипептидном скелете лиганда проводят при рН 8,0 (см. статью Kinstler O. и соавт., патентную заявку ЕР 0822199 А 2; патенты США 5824784 и 5985265). Некоторым образом настоящие способы также существенно отличаются от ферментативных способов, которые были использованы для связывания алкиламиновых производных полиэтиленгликоля с рядом белков с помощью трансглутаминазы, которое проводили при значении рН 7,5 (см. статью Sato Н., (2002), Adv. Drug. Deliv. Rev., 54:487-504). Восстановление полученных в результате оснований Шиффа мягкими восстанавливающими агентами, такими как цианоборгидрид натрия или пиридинборан (см. статью Cabacungan J.C. и соавт. (1982),Anal. Biochem., 124:272-278), приводит к образованию вторичных аминных связей, которые сохраняют положительный заряд N-концевой -аминогруппы белка при физиологическом значении рН. Данные связи, которые сохраняют такой же заряд, как у нативного белка, с большей вероятностью сохраняют его биологическую активность, чем альтернативные химические способы связывания, которые нейтрализуют заряд, например, посредством образования амидных связей (см. Burg J. и соавт., публикация РСТWO 02/49673 А 2; Kinstler О. и соавт., Европейская патентная публикацияЕР 0822199 А 2; статьиKinstler O. и соавт. (1996), Pharm. Res., 13:996-1002; Kita Y. и соавт., см. выше) или уретановые связи (см.Gilbert С.W. и соавт., патент США 6042822; статьи Grace М. и соавт. (2001), J. Interferon Cytokine Res.,21:1103-1115; Youngster S. и соавт. (2002), Curr. Pharm. Des., 8:2139-2157). Компетентным специалистам в области техники известны альтернативные подходы к селективному связыванию полимеров с N-концевыми остатками аминокислот. Здесь включены способы связывания гидразид-, гидразин-, семикарбазид- или других аминсодержащих полимеров с N-концевым остатком серина или треонина, которые были окислительно разложены до альдегидов с помощью периодата (см. статью Dixon H.B.F., см. выше; Geoghegan K.F., патент США 5362852; статью Gaertner H.F. и соавт.(1996), Bioconjug. Chem., 7:38-44; Drummond R.J. и соавт., патент США 6423685). Подходящие полимеры В некоторых вариантах осуществления изобретения требуется свести к минимуму образование внутримолекулярных и межмолекулярных перекрестных связей полимерами, такими как ПЭГ во время реакции, в которой полимер связывают с биоактивным компонентом для получения конъюгатов, соответствующих изобретению. Это можно осуществить путем использования полимеров, которые активированы только на одном конце (называемых в данном контексте "монофункционально активированными ПЭГ" или "монофункционально активированными ПАГ) или полимерных препаратов, в которых доля бифункционально активированных (называемых в случае линейных ПЭГ "бис-активированными ПЭГдиолами") или мультифункционально активированных полимеров составляет меньше чем приблизительно 30%, или более предпочтительно меньше чем приблизительно 10%, или наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 2% (мас./мас.). Применение активированных полимеров, которые полностью или почти полностью монофункциональны, может свести к минимуму образование всех следующих вариантов: внутримолекулярных перекрестных связей внутри отдельных молекул белка, "гантелеобразных" структур, в которых одна цепь полимера соединяет две молекулы белка, и более крупных агрегатов или гелей. Активированные формы полимеров, которые пригодны для применения в способах и композициях,соответствующих данному изобретению, могут включать любые линейные или разветвленные монофункционально активированные формы полимеров, которые известны в области техники. Например,включены формы с молекулярной массой (за исключением массы активирующей группы) в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа. Приемлемые интервалы молекулярных масс включают, но без ограничения перечисленным, приблизительно от 5 до приблизительно 30 кДа; приблизительно от 10 до приблизительно 20 кДа; приблизительно от 18 до приблизительно 60 кДа; приблизительно от 12 до- 15013535 приблизительно 30 кДа, приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа. В случае линейного ПЭГ молекулярные массы, составляющие приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа, соответствуют степеням полимеризации (n) приблизительно 230, приблизительно 450 или приблизительно 680 мономерных звеньев этиленоксида соответственно. Для применения in vitro подходящие интервалы молекулярных масс активированных полимеров включают от приблизительно 1 до приблизительно 5 кДа. Следует отметить, что задолго до того, как было признано существование классов "RN" и "RG" рецептор-связывающих белков, были впервые отмечены преимущества связывания терапевтических белков с полимерами, имеющими относительно высокие молекулярные массы (т.е.около 20-30 кДа) (см. Saifer M. и соавт., публикация РСТWO 89/01033 А 1,опубликованная 9 февраля 1989 г., которая включена в данном контексте в виде ссылки во всей полноте). В других вариантах осуществления изобретения конъюгаты рецептор-связывающих белков с необычно высокой долей сохранившейся биоактивности могут быть получены для применения in vitro, например, в клеточной культуре, посредством связывания монофункционально активированных полимеров молекулярной массы приблизительно 1 кДа, приблизительно 2 кДа или приблизительно 5 кДа согласно способам, соответствующим данному изобретению. Для таких применений in vitro данный более низкий интервал молекулярных масс может быть предпочтителен. Необязательно линейный полимер может иметь реакционную группу на одном конце или обоих концах, создавая таким образом "реакционный полимер". В некоторых вариантах осуществления данного изобретения может быть желательным использовать N-гидроксисукцинимидиловый сложный эфир производного монопропионовой кислоты ПЭГ, как описано J.M. Harris и соавт. в патенте США 5672662,который включен в данном контексте полностью в виде ссылки, или другие N-гидроксисукцинимидактивированные ПЭГ-монокарбоновые кислоты. В некоторых других вариантах осуществления может быть желательным применение либо моносукцинимидилкарбонатных производных ПЭГ ("SC-ПЭГ"), как описано М. Saifer и соавт. в патентах США 5006333, 5080891, 5283317 и 5468478, либо моно-рнитрофенилкарбонатного производного ПЭГ, как описано в работах S.J. Kelly и соавт., см. выше; L.D.M.R. Sherman и соавт., публикация РСТWO 01/59078 А 2 и A3. Более того, другие типы реакционных групп могут быть использованы для синтеза полимерных конъюгатов белков. Данные производные включают, но без ограничения перечисленным, моноальдегидные производные ПЭГ (см. Royer G.P., патент США 4002531; Harris J.M. и соавт., патент США 5252714), моноаминовые, монотрибромфенилкарбонатные, монокарбонилимидазоловые, монотрихлорфенилкарбонатные, монотрифторфенилкарбонатные, моногидразидные, моногидразиновые, моносемикарбазидные, монокарбазатные, монотиосемикарбазидные, моноиодацетамидные, мономалеимидные, моноортопиридилдисульфидные, монооксимовые, монофенилглиоксалевые, монотиазолидин-2-тионовые, монотиоэфирные, монотиоловые, монотриазиновые и моновинилсульфоновые производные ПЭГ. В дополнительных вариантах осуществления цитокины, хемокины, факторы роста, полипептидные гормоны и их антагонисты могут быть связаны с одним или более полимеров, как описано в находящейся в общем владении сопутствующей патентной заявке США 10/669597, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Биоактивные компоненты Как отмечено выше, конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат один ПАГ или ПАО и, в частности, одну цепь ПЭГ, ковалентно присоединенную к одному или более биоактивных компонентов. Биоактивные компоненты, к которым ковалентно присоединен один или более полимеров (или их цепей), называют в данном контексте различно и эквивалентно "конъюгированными биоактивными компонентами" или "модифицированными биоактивными компонентами". Данные термины должны быть отделены в данном контексте от терминов "неконъюгированные биоактивные компоненты", "исходные биоактивные компоненты" или "немодифицированные биоактивные компоненты", все из которых относятся к биоактивным компонентам, которые не содержат ковалентно присоединенных к ним полимеров. Однако следует иметь в виду, что "неконъюгированный", "немодифицированный" или "исходный" биоактивный компонент может содержать другие неполимерные конъюгирования или модификации по сравнению с молекулой дикого типа или нативной молекулой и будут, тем не менее, рассматриваться как"неконъюгированные", "немодифицированные" или "исходные" в соответствии с данным изобретением,поскольку биоактивный компонент остается "неконъюгированным", "немодифицированным" или "исходным" в плане присоединения полимеров, как в случае биоактивных компонентов, которые называют в данном контексте "ложноПЭГилированными". Термин "стабилизирующий" биоактивный компонент (или "способы стабилизации" или "стабилизированный биоактивный компонент") указывают на то, что биоактивный компонент был стабилизирован согласно способам, соответствующим данному изобретению (т.е. биоактивный компонент, к которому был ковалентно присоединен полимер согласно способам, соответствующим изобретению). Данные стабилизированные биоактивные компоненты будут проявлять некоторые измененные биохимические и биофизические свойства по сравнению с биоактивным компонентом, который не был стабилизирован(т.е. биоактивным компонентом, к которому не был ковалентно присоединен полимер). В данные изме- 16013535 ненные биохимические и биофизические параметры, в частности, для рецептор-связывающих белков,могут быть включены пониженная чувствительность к протеолитическому разложению и особенно поддержание активности рецептор-связывающего белка во время инкубирования в определенных жестких условиях окружающей среды и эксперимента. В ряде вариантов осуществления изобретения измененные биохимические и биофизические параметры могут включать, например, увеличенный полупериод существования в кровотоке in vivo, повышенную биодоступность, увеличенную продолжительность действияin vitro и т.п. Любой рецептор-связывающий белок (обычно цитокин, хемокин, фактор роста и полипептидный гормон), имеющий биологическую (т.е. физиологическую, биохимическую или фармацевтическую) активность, связанную с частями молекулы, которые отдалены от ее аминоконца или от естественного или мутационным путем интродуцированного центра гликозилирования, можно соответствующим образом использовать в данном изобретении в качестве исходного компонента. Данные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным, пептиды, полипептиды, белки и т.п. Биоактивные компоненты также включают фрагменты, мутеины и производные данных пептидов, полипептидов, белков и т.п., в особенности такие фрагменты, мутеины и производные, обладающие биологической (т.е. физиологической, биохимической или фармацевтической) активностью. Подходящие пептиды, полипептиды и белки, гликопротеины и т.п., которые используют как биоактивные компоненты в данном изобретении включают любой пептид, полипептид или белок и т.п.,имеющий одну или более чем одну доступную аминогруппу, тиоловую группу или другую группу, которая отдалена от рецептор-связывающей области или областей биоактивного компонента и к которой могут быть селективно присоединены полимеры. Данные пептиды, полипептиды, белки, гликопротеины и т.п. включают цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, которые могут иметь любую из множества структур (см. статьи Nicola N.A., см. выше; Schein C.H., см. выше). Например, подходящие пептиды, полипептиды и белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным, класс цитокинов, имеющих структуры, содержащие четыре -спиральных пучка (оба из подклассов с длинной цепью и короткой цепью) (в качестве обзора см. статью Schein C.H.,см. выше). Множество данных белков, имеющих четырехспиральные пучки, пригодны для применения в данном изобретении, включая, но без ограничения перечисленным, интерлейкины, например, ИЛ-2,ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р 35), ИЛ-13, ИЛ-15 и ИЛ-17; колониестимулирующие факторы, например макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF; см. статью RozwarskiD.А. и соавт. (1996), Proteins, 26:304-313); интерфероны, например ИФН-, ИФН- (включая, но без ограничения перечисленным, ИФН 1b) и консенсусный ИФН; фактор ингибирования лейкоза (LIF); эритропоэтин (Еро); тромбопоэтин (Тро); фактор роста и развития мегакариоцитов (MGDF); фактор стволовых клеток (SCF), известный также в области техники как фактор Steel (см. статьи Morrissey P.J. и соавт.(OSM); белок, активирующий фосфолипазу (PLAP); нейротрофические факторы и их пептидомиметики. Хотя пролактин и гормон роста являются классическими гормонами, которые широко циркулируют в организме, в отличие от цитокинов, которые, как правило, образуются около своих клеток-мишеней,пролактин и гормон роста принадлежат к тому же самому структурному классу, что цитокины с четырьмя -спиральными пучками (см. статьи Nicola N.A., см. выше; Goffin V. и соавт., см. выше), и они представляют собой аналогично пригодные мишени для спаривания с полимером и для получения настоящих конъюгатов в соответствии с данным изобретением. Аналоги, мутеины антагонисты, варианты и производные данных пептидов, полипептидов и белков также подходят для применения в изобретении и,вследствие этого, охватываются данным изобретением. Рецептор-связывающие белки из структурных классов -складки или -ствола с длинной цепью (в качестве обзора см. Schein C.H., см. выше) также пригодны для применения при получении конъюгатов и композиций, соответствующих данному изобретению. Они включают, но без ограничения перечисленным: семейство цитокинов фактора некроза опухоли, например TNF-, TNF и лигандов Fas, которые представляют -гелеобразные скрученные структуры; ИЛ-1 (включая ИЛ-1 и ИЛ-1) и семейства FGF(включая фактор роста основных фибробластов (bFGF), кислый FGF, FGF-4 и фактор роста кератиноцитов (KGF; FGF-7, которые демонстрируют укладку в виде -трилистника (см. статьи Schein C.H. и др.,см. выше; Schlessinger J. и соавт., см. выше); ИЛ-12, ИЛ-16, эпидермальный фактор роста (EGF; см. статью Lu H.-S. и соавт., см. выше) и факторы роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующие факторы роста (включая трансформирующий фактор роста- и трансформирующий фактор роста- (TGF- и факторы роста нервов, которые принимают структуры цистинового узла. Аналоги, мутеины антагонисты, варианты и производные данных пептидов, полипептидов и белков также подходят для применения в изобретении и, вследствие этого, охватываются данным изобретением. Дополнительный структурный класс белков, которые эффективно используют в конъюгатах и композициях, соответствующих данному изобретению, представляет собой класс богатых дисульфидом смешанных / цитокинов, хемокинов и факторов роста (в качестве обзора см. статью Schein С.Н., вы- 17013535 ше), включая, но без ограничения перечисленным: семейство EGF, которое имеет структуру -изгиба,ИЛ-8, RANTES, нейтрофил-активирующий пептид-2 (NAP-2), фактор 1 из клеток стромы (SDF-1),белки хемоаттрактантов моноцитов (МСР-1, МСР-2 и МСР-3), эотаксины (например, эотаксин-1, эотаксин-2 и эотаксин-3), фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), нейротактин,фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), онкоген, связанный с ростом/активность, стимулирующую рост меланомы (GRO-/MGSA), соматомедины, а также инсулин и инсулиноподобные факторы роста (например, IGF-1 и IGF-2). Близкий структурный класс белков, пригодных для применения в конъюгатах и композициях, соответствующих данному изобретению, представляет собой цитокины с мозаичными структурами, которые включают факторы роста, такие как ИЛ-12 и фактор роста гепатоцитов (см. статью Nicola N.A., см. выше). Другие белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным: гормоны роста(в особенности человеческий гормон роста (hGH; см. Tchelet А. и соавт. (1997), Mol. Cell Endocrinol., 130:141152) и их антагонисты (см., например, Sundstrom М. и соавт. (1996), J. Biol. Chem., 271:32197-32203), пролактин и его антагонисты, хорионический гонадотропин, фолликул-стимулирующий гормон, тироидстимулирующий гормон, пигментные гормоны, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны и рецептор-связывающие антагонисты цитокинов и факторов роста всех вышеперечисленных структурных классов. Многие такие белки существуют как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах. Негликозилированные формы могут быть результатом их получения с использованием технологий рекомбинантной ДНК в прокариотах или при использовании химического синтеза. Данные негликозилированные продукты находятся в числе пептидов и белков, которые представляют собой подходящие биоактивные компоненты, соответствующие данному изобретению. Наконец, хотя некоторые антитела действуют как рецептор-связывающие агонисты или антагонисты (см., например, статью Morris J.C. и соавт. (2000), Ann. Rheum. Dis., 59 (Suppl I): i109-i114), такие иммуноглобулины не являются подходящими кандидатами на N-концевое связывание с полимером в объеме данного изобретения, т.е. они не являются RN рецептор-связывающими белками, поскольку аминоконцевые области обеих, легкой и тяжелой, цепей участвуют в распознавании антигена. Особенно применимыми в качестве биоактивных компонентов для использования в получении полимерных конъюгатов, соответствующих данному изобретению, являются интерферон-, интерферон(включая ИФН 1b), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, TNF-hGH, пролактин, инсулин, IGF-1, EGF, bFGF и эритропоэтин (Еро). Также особенно применимыми являются мутеины и фрагменты данных биоактивных компонентов, в частности, те, которые способны связываться с рецепторами для соответствующих полипептидов дикого типа и интактных полипептидов, независимо от того, индуцирует или нет данное связывание биологический или физиологический эффект. В ряде данных вариантов осуществления мутеины и фрагменты биоактивных компонентов могут действовать как антагонисты соответствующих лигандов,которые снижают, существенно снижают или полностью ингибируют связывание лигандов со своими рецепторами и/или активность лигандов на их клетках-мишенях, тканях и/или организмах. Другие антагонисты, которые могут быть или могут не быть структурными аналогами, мутеинами, вариантами или производными лигандов, представляющих интерес, также подходят для получения конъюгатов согласно данному изобретению. Для практических целей можно определить, оказывает ли данный мутеин, фрагмент, вариант, производное или антагонист антагонистическое воздействие на биологические и/или физиологические эффекты данного лиганда без проведения излишних экспериментов, используя анализы биологических/физиологических эффектов самого лиганда, множество из которых хорошо известно в области техники и/или описано в данном контексте. Структуры (первичные, вторичные, третичные и, где применимо, четвертичные) данных и других полипептидов, представляющих интерес, которые эффективно используют в соответствии с данным изобретением, хорошо известны в области техники и будут знакомы обычным специалистам, в особенности в свете структур, представленных в данном контексте, и в ссылках, приведенных в данном контексте,которые включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте. Конъюгаты Данное изобретение представляет стабильные конъюгаты биоактивных компонентов, в частности цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов, для применения во множестве приложений. Данные конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют ряд преимуществ относительно тех, которые были ранее известны в области техники, как показано путем следующих неограничивающих и приведенных в качестве примера сравнений известных в области техники конъюгатов: Н. Hiratani(см. Европейский патентЕР 0098110 и патент США 4609546) раскрывают конъюгаты сополимеров этиленоксида и пропиленоксида ("ПЭГ-ППГ", представителя общего класса ПАГ) с белками, включая интерфероны и интерлейкины, где не описано никакого предпочтения в плане избежания областей белков, участвующих в связывании рецептора. В данных ссылках интерфероны ,ирассматривались как эквивалентные мишени для связывания ПАГ в отличие от данного изобретения, в котором не считают,что интерферон- является подходящей мишенью для N-концевого связывания, поскольку аминоконец находится внутри рецептор-связывающей области данного цитокина. Кроме того, Hiratani раскрывает- 18013535 конъюгаты, синтезированные только с ПАГ молекулярной массы от 1 до 10 кДа, тогда как в способах,соответствующих данному изобретению, предпочитают спаривание водорастворимых, синтетических полимеров с молекулярными массами, превышающими 10 кДа, для терапевтического применения. Аналогично N.V. Katre (см. (1990), J. Immunol., 144:209-213) описывает, что связывание большего числа цепей мПЭГ молекулярной массы 5 кДа с человеческим рекомбинантным интерлейкином-2 увеличивает полупериоды существования полученных в результате конъюгатов в кровотоке мышей и кроликов. Однако данная ссылка не раскрывает или не признает перспективности связывания меньшего числа более длинных цепей ПЭГ или связывания одной цепи высокомолекулярного ПЭГ с аминоконцом ИЛ-2, как представлено в данном изобретении.G. Shaw (см. патент США 4904584 и публикацию РСТWO 89/05824 А 2) раскрывает способы индукции селективного в отношении центра присоединения амин-реакционных полимеров путем интродукции, замены или делеции остатков лизина в белке-мишени, в особенности в Epo, G-CSF и ИЛ-2. Однако в отличие от описания данного изобретения эти ссылки не раскрывают, что амин-реакционные полимеры могут реагировать с любым амином в белке-мишени, отличным от -аминогрупп остатков лизина, четко отграничивая данные описания от настоящего изобретения.D.E. Nitecki и соавт. (см. патент США 4902502) раскрывают множество ПЭГилированных конъюгатов ИЛ-2, которые были получены из различных хлорформиатных производных ПЭГ, которые были предназначены для реакции с -аминогруппами остатков лизина. Однако в противоположность настоящим способам, данная ссылка не раскрывает ни способа, как избежать ПЭГилирования остатков лизина в областях белка ИЛ-2, которые участвуют в связывании рецептора, ни какой-либо осведомленности в том,что избежание данных центров является благоприятным.N. Katre и соавт. (см. патент США 5206344) раскрывают конъюгаты ПЭГ-ИЛ-2, в которых ПЭГ связан с -аминогруппами остатков лизина, неспаренной сульфгидрильной группой естественного остатка цистеина в положении 125 (считая от аминоконца) или с сульфгидрильной группой остатка цистеина,который был мутационным путем интродуцирован между первым и двадцатыми остатками от аминоконца ИЛ-2. В группу мутеинов, которые описаны в патенте '344, включен "дез-ala-1" ИЛ-2, т.е. мутеин,в котором аминоконцевой аланин делетирован и который не является ПЭГилированным. Однако в противоположность настоящему описанию, патент '344 не раскрывает ни какого-либо способа избежания спаривания ПЭГ с остатками аминокислот, которые участвуют в связывании с рецепторами, ни какоголибо понимания того, что данный подход мог бы быть перспективным. В соответствии с данным замечанием и в противоположность настоящему изобретению широкий интервал точек присоединения, предложенный в патенте '344 не предполагает, что связывание ПЭГ с аминоконцом ИЛ-2 было бы особенно благоприятным. В материалах S.P. Monkarsh и соавт. (1997), Anal. Biochem., 247:434-440 и S.P. Monkarsh и соавт.(1997), в монографии под ред. Harris J.M. и соавт. "Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение" (Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications), с.207-216, American Chemical Society,Washington D.C. описано, что реакция интерферона 2 а с трехкратным молярным избытком активированного ПЭГ молекулярной массы 5300 Да дает одиннадцать позиционных изомеров моноПЭГинтерферона, соответствующих одиннадцати остаткам лизина в интерфероне 2 а. Не описано никакого ПЭГ-интерферона, в котором ПЭГ связан с -аминогруппой на аминоконце интерферона. Одиннадцать позиционных изомеров, описанных в данных ссылках, проявляли антивирусные активности в клеточных культурах, которые лежали в интервале от 6 до 40% от активности немодифицированного интерферона и антипролиферативные активности в клеточных культурах, которые лежали в интервале от 9 до 29% от активности немодифицированного интерферона. Данные результаты ясно демонстрируют, что случайное ПЭГилирование остатков лизина, практически осуществленное данными исследователями, нарушало функции интерферона 2 а, опосредованные его рецепторами, в противоположность конъюгатам, полученным способами, соответствующими данному изобретению. Кроме того, в отличие от конъюгатов,соответствующих данному изобретению, в конъюгатах, описанных в данных ссылках, отсутствовал интерферон, ПЭГилированный по N-концу. О. Nishimura и соавт. (см. патент США за законодательно установленным регистрационным номером изобретенияH1662) раскрывает конъюгаты интерферона-, интерферона- и ИЛ-2, которые получают путем восстановительного алкилирования активированных "альдегидов метилового эфира полиэтиленгликоля" цианоборгидридом натрия при рН 7,0 (для конъюгатов интерферона) или рН 7,15 (для конъюгатов ИЛ-2). Однако было описано, что конъюгаты, полученные данными способами, теряют до 95% биоактивности немодифицированных белков, вероятно, вследствие присутствия множества центров присоединения полимера, все из которых, как показано, находятся на -аминогруппах остатков лизина(см. фиг. 1 и 4 данного изобретения). В статье D.K. Pettit и соавт. (см. выше) раскрывают полимерные конъюгаты интерлейкина-15("ИЛ-15"). Однако конъюгированный ИЛ-15, описанный в данной ссылке, не только терял свою ИЛ-2 подобную активность стимуляции роста в результате связывания полимеров с остатками лизина в областях белка, которые участвуют в связывании рецептора, но он также демонстрировал антагонизм, а не- 19013535 агонизм. Данные авторы заключают, что селективное ингибирование связывания ИЛ-15 с одним из нескольких клеточных поверхностных рецепторов может быть следствием конъюгирования полимера и что данное ингибирование может не только снизить уровень связывания с рецептором, но может привести к реверсии биологического эффекта белка. Избегая спаривания полимеров с частями рецепторсвязывающего белка, которые участвуют во взаимодействиях со своими рецепторами, в данном изобретении избегают данного нежелательного следствия связывания полимеров.J. Hakimi и соавт. (см. патенты США 5792834 и 5834594) раскрывает уретан-связанные конъюгаты ПЭГ с белками, включая интерферон-, ИЛ-2, интерлейкин-1 ("ИЛ-1") и антагонист рецептора ИЛ-1, которые, как сообщают, были получены с целью снижения иммуногенности, повышения растворимости и увеличения биологического полупериода существования соответствующих белков. В данных ссылках ПЭГ был связан с "различными свободными аминогруппами" без ссылки на N-концевое ПЭГилирование и без описания того, что N-концевые -аминогруппы могут или должны быть ПЭГилированными. Данные патенты устанавливают также, что конъюгат, описанный в данном контексте, "имеет по меньшей мере часть" первоначальной биологической активности исходного белка, указывая, таким образом, на возможную потерю значительной биоактивности. Данный результат согласовывался бы с использованием способов ненаправленного ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте. В противоположность данному изобретению эти патенты не раскрывают никаких попыток улучшить сохранение биоактивности их конъюгатов путем изменения селективности процессов ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте.O.B. Kinstler и соавт. (см. публикация Европейской патентной заявкиЕР 0822199 А 2) раскрывает способ проведения реакции полиэтиленгликоля с -аминогруппой аминокислоты на аминоконце полипептида, в особенности консенсусного интерферона и G-CSF, которые представляют собой два из белков, производимых Amgen, Inc., представителем данной патентной заявки. Данная публикация показывает, что "значение рН, достаточно кислое для селективной активации -аминогруппы" является необходимым признаком описанного способа. Напротив, в настоящем изобретении описано, что снижение рН уменьшает реакционность аминогрупп с альдегидами ПЭГ и что -аминогруппа является более реакционной, когда она непротонирована, т.е. при значении рН выше ее pKa. Так, данные авторы обнаружили,что никакая величина рН не является "достаточно кислой для того, чтобы селективно активироватьJ.T. Edsall (см. выше) и R.S. Larsen и соавт. 2001), Bioconjug. Chem., 12:861-869), более совместимы с опытом настоящих авторов. Более того, Kinstler и соавт. сообщают о применении N-концевого ПЭГилирования полипептидов для получения повышенной гомогенности полученных в результате конъюгатов и защиты аминоконца от разложения протеиназами, но не раскрывает, что N-концевое ПЭГилирование может сохранить более высокую фракцию рецептор-связывающей активности ряда рецептор-связывающих белков (см.,например, публикацию РСТWO 96/11953; Европейский патентЕР 0733067 и патент США 5770577, 5824784 и 5985265, все выданные Kinstler О.В. и соавт.). В Европейской заявке Kinstler и соавт. (ЕР 0822199 А 2) также обобщают преимущества N-концевого ПЭГилирования для всех полипептидов, которые не входят в круг интересов настоящих авторов. В частности, поскольку аминоконцы молекул антител расположены проксимально антиген-связывающему участку белков антител (см. статью Chapman A.P. (2002), Adv. Drug Deliv. Rev., 54:531-545), N-концевое ПЭГилирование антител неожиданно вредно сказывается на биоактивности по сравнению со случайным ПЭГилированием остатков лизина, как раскрывает Larsen R.S. и соавт., см. выше. Аналогично ожидают,что N-концевое ПЭГилирование рецептор-связывающих белков, которые не являются "RN" рецепторсвязывающими белками, например интерферона- (см. фиг. 8), будет больше ингибировать взаимодействия с рецепторами, чем случайное ПЭГилирование остатков лизина таких рецептор-связывающих белков. Таким образом, как отмечено выше, способы, соответствующие данному изобретению, отличаются от тех, которые раскрывают Kinstler и соавт. в публикациях, приведенных в данном контексте, в том плане, что конъюгаты, соответствующие данному изобретению, получают путем конъюгирования одного или более цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов или их антагонистов, которые выбраны как RN рецептор-связывающие белки с одним или более полимеров путем формирования смеси лиганда(ов) и одного или более полимеров при значении рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,6, при значении рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,6, при значении рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,0 или при значении рН приблизительно 6,6. Напротив, способы Kinstler и соавт. основаны на конъюгировании лигандов при рН ниже 5,5, причем настоящие авторы обнаружили, что данный интервал является субоптимальным или худшим для получения препаратов лигандов, селективно конъюгированных с полимерами по отдаленным N-концевым аминокислотам и/или по отдаленным центрам гликозилирования.R.B. Pepinsky В. и соавт. (см. публикацию РСТWO 00/23114 и публикацию патентной заявки США 2003/0021765 А 1) раскрывают полимерные конъюгаты гликозилированного интерферона 1 а,которые более активны, чем негликозилированный интерферон 1b в анализе на антивирусную активность. Данная ссылка раскрывает также, что полиалкиленгликоль может быть связан с интерфероном 1 а через множество связывающих групп в различных положениях, включая аминоконец, карбоксильный конец и углеводную часть гликозилированного белка. Однако в данной публикации не раскрывают, что описанные способы могут быть распространены на другие белки: "данные исследования показывают, что несмотря на сохранение консервативности между последовательностями интерферона 1 а и интерферона 1b,они представляют собой различные биохимические структуры и, вследствие этого, многое из того, что известно об интерфероне 1b, неприменимо к интерферону 1 а, и наоборот". Напротив, данное изобретение раскрывает общие черты, присущие "RN" и "RG" рецептор-связывающим белкам, как определено в данном контексте. Согласно данному изобретению, оба, интерферон 1 а и интерферон 1b, являются "RN" рецептор-связывающими белками. Кроме того, интерферон 1b представляет собой "RG" рецептор-связывающий белок. Соответственно, в противоположность способам, соответствующим заявке WO 00/23114, способы, соответствующие данному изобретению, используют для получения стабильных биоактивных конъюгатов как интерферона 1b, так и интерферона 1 а.Z. Wei и соавт. (см. патент США 6077939) раскрывают способы связывания водорастворимых полимеров (в особенности ПЭГ) с N-концевым -углеродным атомом полипептида (в особенности эритропоэтина), где амин на -углероде N-концевой аминокислоты сначала трансаминируют до получения-карбонильной группы, которая затем реагирует с производным ПЭГ с образованием оксима или гидразоновой связи. Хотя описанным объектом данной ссылки была разработка способа, который был бы применим к белкам в целом, не дается никаких предположений относительно сохранения рецепторсвязывающей активности, которое может быть результатом выбора аминоконца как центра ПЭГилирования ряда рецептор-связывающих белков. Таким образом, в противоположность описанию Wei и соавт. в данном изобретении не требуется отдаления N-концевой -аминогруппы, но, напротив, можно сохранить заряд N-концевой -аминогруппы при нейтральном значении рН посредством формирования вторичной аминной связи между белком и полимером.C.W. Gilbert и соавт. (см. патент США 6042822; Европейский патентЕР 1039922) раскрывают желательность использования смеси позиционных изомеров ПЭГ-интерферон 2b, где особенно желательный изомер содержит ПЭГ, связанный с остатком гистидина интерферона 2b, в особенности гистидина-34, и демонстрируют, что связь ПЭГ с гистидином-34 нестабильна. Поскольку гистидин-34 лежит на поверхности интерферона 2b в области, которая должна находиться в тесном контакте с рецептором интерферона, чтобы включать сигнальную трансдукцию (см. фиг. 1b настоящего описания), нестабильность связи между ПЭГ и гистидином-34, описанная в данных ссылках, по-видимому, является важной для функции описанного в данном контексте конъюгата ПЭГ-интерферон. Практически чистые связанные через гистидин полимерные конъюгаты белков описаны S. Lee и соавт., см. патент США 5985263. Напротив, настоящее изобретение демонстрирует, что одним из предпочтительных конъюгатов является конъюгат ПЭГ-интерферон, где ПЭГ стабильно связан с центром, который отдален от рецепторсвязывающих доменов интерферонового компонента.P. Bailon и соавт. (см. (2001), Bioconjug. Chem., 12:195-202), раскрывает, что интерферон 2 а, который ПЭГилирован одной молекулой ди-мПЭГ-лизина молекулярной массы 40 кДа/молекулу интерферона, состоит из четырех основных позиционных изомеров. В данной ссылке описывают, что почти все из ПЭГ присоединены амидными связями к лизинам 31, 121, 131 или 134, каждый из которых находится в или прилежит к рецептор-связывающим доменам интерферона 2 а (остатки 29-35 и 123-140 согласно данным Bailon и соавт.; см. фиг. 1 а настоящего описания). N-концевое ПЭГилирование не было описаноBailon и соавт. Сообщают, что антивирусная активность выделенной смеси позиционных изомеров ПЭГ-интерферона в отношении инфекции вируса везикулярного стоматита клеток бычьей почки MadinDarby in vitro составляет 7% от уровня неконъюгированного интерферона 2 а, который был тестирован. Существенная потеря биоактивности, которую наблюдают у данных конъюгатов ПЭГ-интерферона, не включает ПЭГилированный по N-концу интерферон, что, таким образом, четко отделяет конъюгаты,предложенные Bailon и соавт., от конъюгатов, соответствующих данному изобретению.R.B. Pepinsky и соавт. (см. (2001), J. Pharmacol. Exp. Ther., 297:1059-1066), раскрывают синтез конъюгата, состоящего из (1) гликозилированного интерферона 1a, имеющего N-концевой остаток метионина и (2) ПЭГ-альдегида молекулярной массы 20 кДа. Конъюгат, который в данной ссылке рассматривают как моноПЭГилированный по N-концевому метионину, как показывают, сохраняет полную биоактивность в анализе на антивирусную активность, тогда как связывание более высокомолекулярного ПЭГ снижает или устраняет антивирусную активность. Хотя данные авторы описывают, что их выборN-концевого центра для ПЭГилирования гликозилированного интерферона 1 а был продиктован доступностью реагентов для центр-селективного ПЭГилирования и молекулярного моделирования, они признают, что "некоторые эффекты являются специфическими для продукта". Более того и в противополож- 21013535 ность данному изобретению, описанные в данном контексте наблюдения не были обобщены так, чтобы включить класс рецептор-связывающих белков, которые определены в данном контексте как "RN" рецептор-связывающие белки.J. Burg и соавт. (см. публикацию РСТWO 01/02017 А 2) раскрывает получение алкоксиПЭГконъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей метоксиПЭГ реагировала/реагировали с сульфгидрильными группами, которые были химически интродуцированы посредством модификации -аминогрупп остатков лизина на поверхности гликопротеина. Однако в противоположность данному изобретению, данная ссылка не раскрывает никаких попыток связать ПЭГ со свободной-аминогруппой N-концевой аминокислоты эритропоэтина или избежать модификации остатков лизина в областях гликопротеина эритропоэтина, которые являются основными во взаимодействиях с эритропоэтиновыми рецепторами.J. Burg и соавт. (см. публикацию РСТWO 02/49673 А 2) раскрывает синтез связанных черезN-концевой амид конъюгатов ПЭГ с природными и мутеиновыми гликопротеинами эритропоэтина способом, в котором используют селективно отщепляемые удлинения N-концевого пептида, которые отщепляют перед ПЭГилированием и после обратимого цитраконилирования всех -аминогрупп остатков лизина гликопротеина. Описанный рациональный момент для многостадийного процесса в данной ссылке состоял в том, чтобы сделать процесс ПЭГилирования селективным в отношении свободных-аминогрупп N-концевой аминокислоты с целью получения гомогенных моноПЭГилированных конъюгатов, избегая таким образом необходимости отделять моноПЭГилированные конъюгаты от множественно ПЭГилированных производных. Данный способ отличается от способа, соответствующего данному изобретению по ряду важных аспектов, включая, но без ограничения перечисленным: (1) подход Burg и соавт. ограничен гликопротеинами эритропоэтина, к которым алкоксиПЭГ присоединен через амидные связи, тогда как данное изобретение применимо к множеству биоактивных компонентов, конъюгированных при использовании множества синтетических полимеров; (2) данное изобретение касается как гликозилированных, так и негликозилированных "RN" и "RG" рецептор-связывающих белков, тогда какBurg и соавт. раскрывают только конъюгирование гликопротеинов; (3) данное изобретение охватывает как алкоксиПЭГ, такие как мПЭГ, так и монофункционально активированные гидроксиПЭГ, тогда какBurg и соавт. раскрывает только применение алкоксиПЭГ; и (4) в данном изобретении вторичные аминные связи между полимером и белком предпочтительны относительно амидных связей, использованныхBurg и соавт., поскольку последние более стабильны и сохраняют положительный заряд на аминогруппе. В аналогичной работе этой же группы J. Burg и соавт. (см. патент США 6340742) раскрывают получение связанных с амидом конъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей алкоксиПЭГ связана/связаны с от одной до трех аминогрупп белка. Однако в противоположность данному изобретению в этой ссылке не сообщают о предпочтительности -аминогрупп N-концевой аминокислоты или аминогрупп, которые не находятся в областях, которые участвуют во взаимодействиях с рецепторами. С. Delgado и соавт. (патент США 6384195) раскрывает конъюгаты гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора, который получают при использовании реакционного полимера, который представлен как трезилмонометоксиПЭГ и обозначен в данном контексте как"ТМПЭГ". Данная ссылка показывает, что, когда ТМПЭГ контактирует с рекомбинантным человеческимGM-CSF, "модифицированный материал содержит молекулы, не обладающие активностью и имеющие более высокую активность, чем немодифицированный материал". Как легко может понять обычный специалист, присутствие молекул, не обладающих активностью, нежелательно в смеси конъюгатов полимер-биоактивный компонент, в особенности в композициях для терапевтического применения, которые содержат такие конъюгаты, поскольку они могут способствовать возникновению риска введения конъюгата нуждающемуся в данном введении пациенту, не участвующего в создании положительных эффектов. Как отмечено в данном контексте, настоящее изобретение преодолевает это ограничение в области техники по меньшей мере в части избежания модификации GM-CSF и других рецептор-связывающих белков в центрах на белках, которые участвуют в их рецептор-связывающей активности, снижая таким образом или устраняя синтез молекул, не обладающих никакой активностью. Данное изобретение представляет также способы фракционирования и очистки конъюгатов, которые имеют различные размеры,разные заряды и/или различные степени защиты зарядов на белке посредством полимера (см. фиг. 9-12). Заслуживает внимания, что в патенте США 6384195 не упоминают N-концевое ПЭГилированиеGM-CSF и, вследствие этого, не признают преимуществ способов, соответствующих данному изобретению. Наконец, патент США 6384195 показывает преимущество конъюгатов, в которых более чем одна молекула ПЭГ связана с каждой молекулой GM-CSF, без какого-либо анализа того, где на молекулеGM-CSF присоединены данные молекулы ПЭГ (отличные от связанных с остатками лизина). Утверждая предпочтительность конъюгатов, содержащих до шести молекул ПЭГ/молекулу GM-CSF, ссылка, таким образом, утверждает предпочтительность конъюгатов, в которых ПЭГ мог быть присоединен ко всем возможным остаткам лизина, обеспечивая тем самым, что ПЭГ будет присоединен в положениях, которые стерически затрудняют близкий подход белка к его клеточным поверхностным рецепторам (см.- 22013535 фиг. 3 данного описания). Напротив, настоящее изобретение показывает нежелательность связывания ПЭГ с остатками лизина, за исключением тех случаев, когда данные остатки лизина отдалены от доменов рецептор-связывающего белка, которые являются основными для взаимодействий с рецепторами и, следовательно, для сигнальной трансдукции (в случае агонистов) или для конкурентного ингибирования сигнальной трансдукции (в случае антагонистов). Т. Nakamura и соавт. (см. публикацию РСТWO 02/32957 А 1) показывает, что увеличение молекулярной массы ПЭГ, который связан с -аминогруппой остатка лизина в положении 52 гликопротеина эритропоэтина, повышает эритропоэтический эффект конъюгата in vivo при снижении аффинности конъюгата в отношении эритропоэтиновых рецепторов. Однако в противоположность данному изобретению данная ссылка не раскрывает связывание ПЭГ на аминоконце или около центра гликозилирования и не признает каких-либо преимуществ осуществления этого. Следовательно, данное изобретение представляет конъюгаты биоактивных компонентов и способы синтеза конъюгатов, связанные с синтетическими полимерами, которые имеют различные структурные и функциональные преимущества относительно тех, которые были описаны ранее. Композиции Изобретение представляет конъюгаты или комплексы, содержащие один или более биоактивных компонентов, соответственно один или более цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов, связанных с одним или более стабилизирующих полимеров, таких как один или более ПЭГ. Как правило, данные конъюгаты получают способами, соответствующими данному изобретению, описанными в данном контексте; однако конъюгаты, имеющие структуры и активности, отличные от тех,что описаны в данном контексте, независимо от способов, использованных для получения данных конъюгатов, считают эквивалентными тем, если они получены данными способами, и вследствие этого они охватываются данным изобретением. В близких аспектах изобретение представляет также композиции,содержащие один или более таких конъюгатов или комплексов. Композиции, соответствующие этому аспекту изобретения, должны содержать один или более (например, один, два, три, четыре, пять, десять и т.п.) вышеописанных конъюгатов или комплексов, соответствующих изобретению. В ряде таких аспектов композиции могут содержать один или более дополнительных компонентов, таких как одна или более буферных солей, один или более хаотропных агентов, один или более детергентов, один или более белков (например, альбумин или один или более ферментов), один или более несвязанных полимеров,один или более осмотически активных агентов и т.п. Композиции, соответствующие данному аспекту изобретения, могут быть в любой форме, включая твердую форму (например, сухой порошок) или раствор (в частности, в форме физиологически совместимого забуференного солевого раствора, содержащего один или более конъюгатов, соответствующих изобретению). А. Фармацевтические композиции. Некоторые композиции, соответствующие изобретению, в частности, приготовлены для применения в качестве фармацевтических композиций для использования в профилактических, диагностических или терапевтических приложениях. Данные композиции, как правило, будут содержать один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Термин "фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель", как используют в данном контексте, относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному составу любого типа, который может переноситься животным-реципиентом, включая человека или другое млекопитающее, которому введена фармацевтическая композиция, без вредных эффектов, происходящих от их добавления. Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены реципиенту посредством любого подходящего способа введения, такого как перорально, ректально, парентерально,внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (как в виде порошков, мазей, капель или чрескожного пластыря), защечно, как пероральный или назальный спрей или путем ингаляции. Термин "парентеральный", как используют в данном контексте, относится к способам введения, которые включают внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Фармацевтические композиции, представленные в данном изобретении для парентеральной инъекции, могут содержать фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления с образованием стерильных инъекционных растворов или дисперсий перед применением. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или инертных наполнителей включают воду, этанол,полиолы (такие как глицерин и т.п., пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), карбоксиметилцеллюлозу и их приемлемые смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую сыпучесть можно поддерживать, например,посредством применения покрывающих материалов, таких как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ. Данные фармацевтические композиции, соответствующие настоящему изобретению, могут также- 23013535 содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение действия микроорганизмов может быть обусловлено включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, бензилового спирта, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Может также потребоваться включение осмотических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть осуществлено включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия, гидрогели и желатин. В ряде случаев для того, чтобы пролонгировать эффект лекарственных препаратов требуется замедлить всасывание из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить посредством применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в водных жидкостях тела. Скорость всасывания лекарственного препарата тогда зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от его физической формы. Альтернативно замедленное всасывание парентерально введенной лекарственной формы можно осуществить путем растворения или суспендирования лекарственного препарата в масляном носителе. Инъекционные депо-формы получают формированием микроинкапсулированных матриц лекарственного препарата в биоразрушаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарства к полимеру-носителю и природы конкретного используемого полимера-носителя можно контролировать скорость высвобождения лекарственного препарата. Примеры других биоразрушаемых полимеров включают биосовместимые полиортоэфиры и полиангидриды. Инъекционные депопрепараты также готовят путем захватывания лекарственного препарата липосомами или микроэмульсиями, которые совместимы с тканями тела. Инъекционные препараты могут быть простерилизованы, например, путем фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, или посредством введения стерилизующих агентов в форме стерильной твердой композиции, которую можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением. Твердые дозированные формы для перорального применения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В данных твердых дозированных формах активные соединения смешивают по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или а) инертными наполнителями, либо агентами для увеличения объема, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связующими агентами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон,сахароза и гуммиарабик, с) увлажнителями, такими как глицерин, d) разрыхлителями, такими как агарагар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, ряд силикатов и карбонат натрия, е) агентами, замедляющими растворение, такими как парафин, f) ускорителями всасывания, такими как соединения четвертичного аммония, g) смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, h) адсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и i) скользящими агентами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый ПЭГ, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции подобного типа могут быть использованы также в качестве наполнителей в мягких и твердых наполненных желатиновых капсулах при использовании таких наполнителей, как лактоза (молочный сахар), а также высокомолекулярный ПЭГ и т.п. Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно приготовить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные и хрономодулирующие покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области приготовления фармацевтических препаратов. Они могут необязательно содержать рентгеноконтрастные агенты и могут также быть такой композиции, при которой они высвобождают активный ингредиент(ы) только или предпочтительно в определенной части желудочнокишечного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры композиций для заключения в них агентов, которые могут быть использованы, включают полимерные субстанции и воска. Активные соединения также могут быть в микроинкапсулированной форме, при необходимости, с одним или более вышеуказанных наполнителей. Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, из проростков растений, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, поли(этиленгликоли) и сорбитановые сложные эфиры жирных кислот и их смеси. Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать вспомогательные агенты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и отдушки.- 24013535 Суспензии, кроме активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, как, например,этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар, трагакант и их смеси. Наружное применение включает нанесение на кожу или слизистую оболочку, включая поверхности легкого и глаза. Композиции для наружного применения, включая предназначенные для ингаляции, могут быть приготовлены в виде сухого порошка, который может находиться под давлением или не находиться под давлением. В композициях порошка, не находящегося под давлением, активные ингредиенты в тонко измельченной форме могут быть использованы в смеси с более крупным по размеру фармацевтически приемлемым инертным носителем, содержащим частицы, имеющие размер, например, до 100 мкм в диаметре. Подходящие инертные носители включают сахара, такие как лактоза и сахароза. Желательно, чтобы по меньшей мере 95 мас.% частиц активного ингредиента имело эффективный размер частиц в интервале от 0,01 до 10 мкм. Альтернативно фармацевтическая композиция может находиться под давлением и содержать сжатый газ, такой как азот, или сжиженный газ-пропеллент. Сжиженная среда пропеллента и вся композиция в целом могут быть предпочтительно такими, что активные ингредиенты не растворяются в ней до любой существенной степени. Композиция, находящаяся под давлением, содержит также поверхностноактивный агент. Поверхностно-активный агент может представлять собой жидкий или твердый неионогенный поверхностно-активный агент или может быть твердым анионогенным поверхностно-активным агентом. Предпочтительно использовать твердый анионогенный поверхностно-активный агент в форме натриевой соли. Следующая форма для наружного применения представляет собой форму для введения в глаз. В данном способе введения конъюгаты или композиции, соответствующие изобретению, доставляют в фармацевтически приемлемом глазном носителе, так что активные соединения находятся в контакте с поверхностью глаза в течение достаточного периода времени, чтобы обеспечить проникновение соединений в конъюнктиву или роговицу и внутренние области глаза, как, например, в переднюю камеру, заднюю камеру, стекловидное тело, водянистую влагу, жидкую часть стекловидного тела, роговицу, радужную оболочку/ресничное тело, хрусталик, сосудистую оболочку/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемый глазной носитель может, например, быть мазью, растительным маслом или инкапсулирующим материалом. Композиции для ректального или вагинального введения представлены предпочтительно суппозиториями, которые могут быть получены при смешивании конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, ПЭГ или воск для суппозиториев, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и вследствие этого плавится в прямой кишке и полости вагины и высвобождает лекарственные препараты. Фармацевтические композиции, используемые в данных терапевтических способах, могут быть также введены в форме липосом. Как известно в области техники, липосомы, как правило, получают из фосфолипидов или других липидных субстанций. Липосомы формируют одно- или многослойные гидратированные жидкие кристаллы, которые диспергированы в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный формировать липосомы. Кроме одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, данные фармацевтические композиции в липосомальной форме могут также содержать один или более стабилизаторов, консервантов, наполнителей и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как естественные, так и синтетические. Способы формирования липосом известны в области техники (см., например, Zalipsky S. и соавт., патент США 5395619). Липосомы,которые содержат фосфолипиды, конъюгированные с ПЭГ, чаще всего фосфатидилэтаноламин, связанный с монометокси-ПЭГ, имеют перспективные свойства, включая пролонгированные периоды существования в системе кровообращения млекопитающих (см. Fisher D., патент США 6132763). В. Применение. Как отмечено в другом месте в данном контексте, способы, конъюгаты и композиции, соответствующие данному изобретению, преимущественно применяют в способах поддержания или повышения биоактивности биологических компонентов, не нарушая способности биологических компонентов связываться со своими рецепторами. Некоторые такие способы, соответствующие изобретению, могут осуществлять доставку одного или более конъюгатов и композиций в клетки, ткани, органы или организмы. В частности, изобретение представляет контролируемую доставку одного или более компонентов, комплексов или композиций в клетки, ткани, органы или организмы, давая тем самым пользователю возможность регулировать во времени и пространстве количество определенного компонента, которое высвобождается для воздействия на клетки, ткани, органы или организмы. В общем, данные способы, соответствующие изобретению, включают одну или более активностей. Например, один из таких способов, соответствующих изобретению, предусматривает (а) получение одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, как детально описано в данном контексте; и (b) контактирование одной или более клеток, тканей, органов или организмов с од- 25013535 ним или более конъюгатов или композиций в условиях, способствующих связыванию одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с клетками, тканями, органами или организмами. После того как биоактивные компоненты конъюгатов и/или композиций, соответствующих изобретению, связываются (или в ряде случаев интернализуются) клетками, тканями, органами или организмами, компоненты продолжают осуществлять свои заданные биологические функции. Например,пептидные компоненты могут связываться с рецепторами или другими компонентами на или в клетках,тканях, органах или организмах, участвовать в метаболических реакциях в клетках, тканях, органах или организмах, осуществлять, стимулировать, или активировать, или проводить даунрегуляцию, или ингибировать одну или более ферментативных активностей в клетках, тканях, органах или организмах, давать утраченный структурный компонент клеткам, тканям, органам или организмам, обеспечивать одну или более питательных потребностей клеток, тканей, органов или организмов, ингибировать, лечить, реверсировать или иным образом облегчать один или более процессов или симптомов заболевания или физического нарушения и т.п. В дополнительных вариантах осуществления конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в промышленных клеточных культурах вследствие неожиданно высоких активностей биоактивных компонентов конъюгатов, которые получают как результат комбинированных эффектов существенного сохранения их биоактивности и увеличенной продолжительности действия даже в жестких условиях промышленного применения. Данные неожиданно высокие активности настоящих конъюгатов могут привести к необычайно высокой продукции биомассы, необычайно высоким уровням экспрессии рекомбинантных белков и другим усовершенствованиям эффективности биопроцессинга. С. Схемы дозирования. Конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены in vitro, ex vivo или in vivo в клетки, ткани, органы или организмы с целью доставки в них одного или более биоактивных компонентов (т.е. одного или более цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов или их антагонистов). Обычный специалист должен принимать во внимание, что эффективные количества данного активного соединения, конъюгата, комплекса или композиции можно определить эмпирически и можно использовать в очищенной форме или, если данные формы имеются, в форме фармацевтически приемлемого препарата или пролекарства. Соединения, конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены нуждающемуся в этом больному животному (включая млекопитающее, такое как человек) в виде ветеринарных или фармацевтических композиций в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей. Уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая тип и степень клеточного ответа, которого хотят достигнуть, идентичность и/или активность используемого специфического соединения(ий), конъюгата(ов), комплекса(ов) или композиции(ий), возраст, массу или площадь поверхности тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента, время введения, способ введения и скорость выведения активного соединения(ий), продолжительность лечения, другие лекарственные препараты, применяемые в комбинации или одновременно со специфическим соединением(ями), конъюгатом(ами), комплексом(ами) или композицией(ями) и подобные факторы, которые хорошо известны обычным специалистам в области фармацевтики и медицины. Например, в рамках обычной компетенции в данной области правильно начать с доз данного соединения,конъюгата, комплекса или композиции, соответствующих изобретению, на уровнях ниже, чем те, которые требуются для достижения желательного терапевтического эффекта и постепенно повышать дозировки до тех пор, пока не будет достигнуто желательного эффекта. Схемы дозирования могут быть также подобраны с учетом конкретного больного с целью получения заданной концентрации данного активного соединения в крови, как определено с помощью методик,принятых и рутинных для данной области техники, например гель-фильтрации (эксклюзии по размеру),ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ("ВЭЖХ"), биоанализов или иммуноанализов. Таким образом, схемы дозирования для пациента можно подобрать с целью достижения относительно постоянных уровней в крови, как определяют с помощью ВЭЖХ или иммуноанализов согласно способам, которые являются рутинными и знакомы обычным специалистам в областях медицины, фармацевтики и/или фармакологии.D. Диагностическое и терапевтическое применение. Диагностическое применение конъюгата, соответствующего изобретению, могло бы быть проведено для определения положения клеток или тканей, имеющих необыкновенно высокую способность связывания с цитокином, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов, например рака в теле животного, в особенности человека, путем введения конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, в которых конъюгат (или один или более компонентов, т.е. биоактивный компонент и/или синтетический полимер) помечен или содержит одну или более определяемых меток, чтобы обеспечить определение, например, посредством оптической, радиометрической, флуоресцентной или резонансной детекции согласно способам, известным в области техники. Например, в большинстве случаев немелкоклеточный рак легкого экспрессирует необычно высокие концентрации рецепторов для эпидермального- 26013535 фактора роста (см. статью Bunn P.A. и соавт., (2002), Semin. Oncol., 29 (Suppl. 14):38-44). Вследствие этого в другом аспекте изобретения конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в диагностических или терапевтических способах, например в диагностике, лечении или предупреждении множества физических нарушений у животного, в частности млекопитающего, такого как человек, предрасположенный или страдающий от такого нарушения. В данных подходах целью терапии является приостановить или предупредить развитие нарушения и/или вылечить, вызвать ремиссию или поддержать ремиссию нарушения и/или снизить или минимизировать побочные эффекты других терапевтических схем. Следовательно, конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для защиты, супрессии или лечения физических нарушений, таких как инфекции или заболевания. Термин "защита" от физического нарушения, как используют в данном контексте, охватывает "предупреждение", "супрессию" и "лечение". "Предупреждение" включает введение комплекса или композиции, соответствующих изобретению, до индуцирования заболевания или физического нарушения, тогда как "супрессия" включает введение конъюгата или композиции до клинического проявления заболевания, следовательно "предупреждение" и "супрессию" физического нарушения, как правило,предпринимают у животного, которое предрасположено или является чувствительным к нарушению, но которое еще не страдает от него. Однако "лечение" физического нарушения включает введение терапевтического конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, после проявления заболевания. Следует иметь в виду, что в медицине и ветеринарии не всегда возможно провести границу между "предупреждением" и "супрессией" физического нарушения. Во многих случаях первичное индуцирующее событие или события могут быть неизвестными или латентными, и ни пациент, ни врач могут быть не осведомлены об индуцирующем событии достаточно долго после его появления. Вследствие этого обычно используют термин "профилактика" как отличный от термина "лечение", для того чтобы охватить как "предупреждение", так и "супрессию", как определено в данном контексте. Поэтому термин"защита", используемый согласно способам, соответствующим данному изобретению, подразумевает включение термина "профилактика". Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать одну или более стадий, которые позволяют клиническому врачу достигнуть вышеописанных терапевтических целей. Один из таких способов, соответствующих изобретению, может предусматривать, например: (а) выявление животного (предпочтительно млекопитающего, такого как человек), страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению, и (b) введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих данному изобретению, как описано в данном контексте, так что введение конъюгата, комплекса или композиции предупреждает, задерживает или диагностирует развитие, или излечивает либо вызывает ремиссию, или поддерживает физические нарушения у животного. Как используют в данном контексте, животное, которое "предрасположено к" физическому нарушению определяют как животное, которое не проявляет множества явных физических симптомов нарушения, но которое генетически, физиологически или иным образом имеет риск развития нарушения. В данных способах выявление животного (такого как млекопитающее, включая человека), которое предрасположено к или имеет риск либо страдает от данного физического нарушения, может быть осуществлено согласно стандартным известным в области техники способам, которые должны быть известны врачу обычной квалификации, включая, например, радиологические анализы, биохимические анализы(например, анализы относительных уровней определенных пептидов, белков, электролитов и т.п., в образце, полученном от животного), хирургические способы, генетический скрининг, семейный анамнез,физическую пальпацию, патологические и гистологические тесты (например, микроскопическое исследование ткани или образцов жидкостей тела или мазков, иммунологические анализы и т.п.), тестирование жидкостей тела (например, крови, сыворотки, плазмы, спинно-мозговой жидкости, мочи, слюны,спермы и т.п.), визуализацию (например, радиологическую, флуоресцентную, оптическую, резонансную(например, с использованием ядерного магнитного резонанса ("ЯМР") или резонанса спина электрона("ESR", и т.п. После выявления животного с помощью одного или более данных способов животное можно активно и/или профилактически лечить с целью предупреждения, супрессии, задержки развития или излечения физического нарушения. Физические нарушения, которые можно предупредить, диагностировать или лечить с использованием конъюгатов, комплексов, композиций и способов, соответствующих данному изобретению, включают любые физические нарушения, для которых биоактивный компонент (как правило, цитокин, компонент фактора роста, хемокина или полипептидного гормона или его антагонист) конъюгатов или композиций может быть применен при предупреждении, диагностике или лечении. Данные нарушения включают, но без ограничения перечисленным, многие формы рака (например, рак молочной железы,рак матки, рак яичников, рак простаты, рак яичка, лейкозы, лимфомы, рак легкого, неврологический рак,рак кожи, рак головы и шеи, рак костей, рак толстой кишки и другие желудочно-кишечные формы рака,рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки и другие карциномы, саркомы, аденомы и миеломы), ятрогенные заболевания, инфекционные заболевания (например, бактериальные заболевания,грибковые заболевания, вирусные заболевания (включая гепатит, заболевания, вызываемые кардиотроп- 27013535 ными вирусами, ВИЧ/СПИД и т.п.), паразитарные заболевания и т.п.), генетические нарушения (например, кистозный фиброз, боковой амиотрофический склероз, мышечную дистрофию, болезнь Гоше, болезнь Помбе, нарушение типа тяжелого комбинированного иммунодефицита, карликовость и т.п.), анемию, нейтропению, тромбоцитопению, гемофилию и другие нарушения крови, нейродегенеративные нарушения (например, рассеянный склероз, болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п.,ферментативные нарушения (например, подагру, уремию, гиперхолестеринемию и т.п.), нарушения неясной и многоочаговой этиологии (например, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, воспалительную болезнь кишки и т.п.), аутоиммунные нарушения (например, системную красную волчанку,ревматоидный артрит, псориаз и т.п.) и другие важные с точки зрения медицины нарушения, которые должны быть хорошо знакомы обычному специалисту. Конъюгаты, комплексы, композиции и способы,соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для предупреждения прогрессирования заболевания, например для химиопрофилактики развития предзлокачественного повреждения в злокачественное повреждение. Таким образом, в терапевтических способах, соответствующих изобретению, используют один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, или одну или более фармацевтических композиций, соответствующих изобретению, которые могут быть введены нуждающемуся в этом животному множеством способов введения, в том числе перорально, ректально, парентерально (включая внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию), внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (например, в виде порошков, мазей, капель или чрескожных пластырей), защечно, в виде орального или назального спрея или путем ингаляции. В рамках изобретения эффективное количество конъюгатов, комплексов или композиций можно ввести in vitro, ex vivo или in vivo в клетки или животным, страдающим от или предрасположенным к определенному нарушению, таким образом предупреждая, задерживая развития, осуществляя диагностику или лечение нарушения у животного. Как используют в данном контексте, выражение "эффективное количество конъюгата (или комплекса либо композиции)" относится к количеству, в котором данный конъюгат (или комплекс, или композиция) реализует биологическую активность биоактивного компонента (т.е. цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидных гормонов или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции, тем самым предупреждая, задерживая развитие, осуществляя диагностику, лечение или излечение физического нарушения у животного, которому был введен конъюгат, комплекс или композиция, соответствующие изобретению. Обычный специалист будет принимать во внимание, что эффективные количества конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, можно определить эмпирически согласно стандартным методам, хорошо известным обычным специалистам в области фармацевтики и медицины; см., например, работу под ред. Beers M.H. и соавт. (1999), "Руководство по диагностике и терапии" Merck (Merck Manual of DiagnosisTherapy), 17 изд., Merck и Co., Rahway, NJ; монографию под ред. Hardman J.G. и соавт. (2001) "Фармакологическая основа терапевтических препаратов Гудмана и Джилмана" (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics), 10 изд., McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York; монографию под ред. Speight T.M. и соавт. (1997), "Лекарственная терапия Авери" (Avery's Drug Treatment), 4 изд., Adis International, Aukland, New Zealand; монографиюMedical Books/McGraw-Hill, New York, данные ссылки и ссылки, приведенные в указанных изданиях,полностью включены в данном контексте в виде ссылки. Следует понимать, что при введении больному человеку общие ежедневные, еженедельные и ежемесячные дозы конъюгатов, комплексов и композиций, соответствующих данному изобретению, будут определяться лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского суждения. Например, удовлетворительные результаты получают при введении определенных конъюгатов, комплексов или композиций,соответствующих изобретению, в соответствующих дозах, зависящих от конкретного используемого биоактивного соединения, причем данные дозы будут хорошо знакомы обычному специалисту и их легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов. Согласно данному аспекту изобретения конъюгаты, комплексы или композиции можно вводить в один прием или в разделенных дозах, например один или два раза в день, один или два раза в неделю либо один или два раза в месяц и т.п. Соответствующие схемы дозировок для различных способов введения (например, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутриглазного, интраназального и т.п.) легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов или они будут ясно очевидными для обычного специалиста в зависимости от особенностей биоактивного компонента (т.е. цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции. В дополнительных приложениях конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы для получения специфической направленности диагностического или терапевтического агента на клетку, ткань, орган или организм, который экспрессирует рецептор, связывает, инкорпорирует или иным способом может поглощать биоактивный компонент (т.е. цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон или его антагонист) конъюгата, комплекса или компози- 28013535 ции. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут предусматривать, например, контактирование клетки, ткани, органа или организма с одним или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, которые дополнительно содержат один или более диагностических или терапевтических агентов, причем конъюгат, комплекс или композиция связываются или поглощаются клеткой, тканью, органом или организмом, доставляя таким образом диагностический или терапевтический агент в клетку, ткань, орган или организм. Диагностический или терапевтический агент,используемый согласно данному аспекту изобретения, может представлять собой, но без ограничения перечисленным, по меньшей мере один агент, выбранный из нуклеиновой кислоты, органического соединения, белка или пептида, антитела, фермента, гликопротеина, липопротеина, элемента, липида, сахарида, изотопа, углевода, визуализирующего агента, определяемого зонда или их любой комбинации,которая может быть определяемо помечена, как описано в данном контексте. Терапевтический агент,используемый в данном аспекте настоящего изобретения, может обладать терапевтическим эффектом в отношении клетки-мишени (или ткани, органа либо организма), причем эффектом, выбранным из, но без ограничения перечисленным, коррекции дефектного гена или белка, действия лекарственного препарата,токсического эффекта, эффекта стимуляции роста, эффекта ингибирования роста, метаболического эффекта, катаболического эффекта, анаболического эффекта, антивирусного эффекта, противогрибкового эффекта, антибактериального эффекта, гормонального эффекта, нейрогуморального эффекта, стимуляторного эффекта в отношении дифференцировки клеток, ингибирующего эффекта в отношении дифференцировки клеток, нейромодулирующего эффекта, эффекта против новообразований, противоопухолевого эффекта, эффекта стимуляции или ингибирования инсулина, эффекта стимуляции костного мозга,эффекта стимуляции плюрипотентных стволовых клеток, стимулирующего эффекта в отношении иммунной системы и другого известного терапевтического эффекта, который может быть обусловлен терапевтическим агентом, доставляемым в клетку (или ткань, орган либо организм) посредством системы доставки, соответствующей этому аспекту данного изобретения. Данные дополнительные терапевтические агенты могут быть выбраны из, но без ограничения перечисленным, известных и новых соединений и композиций, включая антибиотики, стероиды, цитотоксические агенты, вазоактивные лекарственные препараты, антитела и другие терапевтические агенты. Неограничивающие примеры таких агентов включают антибиотики и другие лекарственные препараты,используемые при лечении бактериального шока, такие как гентамицин, тобрамицин, нафициллин, парентеральные цефалоспорины и т.п.; адренокортикостероиды и их аналоги, такие как дексаметазон,уменьшающие клеточное повреждение, вызываемое эндотоксинами; вазоактивные лекарственные препараты, такие как блокаторы -адренергического рецептора (например, феноксибензамин), агонист-адренергического рецептора (например, изопротеренол) и допамин. Конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие изобретению, могут быть также использованы для диагностики заболевания и мониторирования терапевтического ответа. В ряде таких способов конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут содержать одну или более определяемых меток (таких как описанные в других местах в данном контексте). В конкретных данных способах эти несущие определяемую метку конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы для детекции клеток, тканей, органов или организмов, экспрессирующие рецепторы или иным образом поглощающие биоактивный компонент (т.е. цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон или его антагонист) конъюгатов, комплексов или композиций. В одном примере данного способа клетки, ткани, органы или организмы контактируют с одним или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, в условиях, способствующих связыванию или поглощению конъюгата клеткой, тканью или организмом (например, путем связывания конъюгата с клеточным поверхностным рецептором или посредством фагоцитоза либо диффузии конъюгата в клетку) с последующей детекцией конъюгата, связанного или инкорпорированного в клетку при использовании средств для детекции со специфичностью в отношении используемой метки(например, детекции флуоресценции для конъюгатов с флуоресцентной меткой, визуализации с помощью магнитного резонанса для конъюгатов с магнитной меткой, радиовизуализации для конъюгатов с радиоактивной меткой и т.п.). Другие варианты применения данных конъюгатов с определяемой меткой включают, например, визуализацию клетки, ткани, органа или организма либо внутренней структуры животного (включая человека) путем введения эффективного количества меченой формы одного или более конъюгатов, соответствующих изобретению, и измерение определяемой радиации, связанной с клеткой, тканью, органом или организмом (или животным). Способы детекции различных типов меток и их применения в диагностической и терапевтической визуализации хорошо известны обычным специалистам и описаны в других местах в данном контексте. В другом аспекте конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в способах модуляции концентрации или активности специфического рецептора для биоактивного компонента конъюгата на поверхности клетки, которая экспрессирует данный рецептор. Под термином"модуляция" активности данного рецептора понимают, что конъюгат при связывании с рецептором либо активирует, либо ингибирует физиологическую активность (например, внутриклеточный каскад переда- 29013535 чи сигнала), опосредуемый через данный рецептор. Не подразумевая ограничения каким-либо конкретным механистическим объяснением регуляторной активности конъюгатов, соответствующих данному изобретению, данные конъюгаты могут антагонистически действовать на физиологическую активность клеточного рецептора путем связывания с рецептором посредством биоактивного компонента конъюгата, блокируя тем самым связывание естественного агониста (например, неконъюгированного биоактивного компонента) и препятствуя активации естественным агонистом, не индуцируя при этом значительную активацию физиологической активности самого рецептора. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать одну или более стадий, например контактирование клетки (которое может быть осуществлено in vitro, ex vivo или in vivo) с одним или более конъюгатов, соответствующих изобретению, в условиях, при которых данный конъюгат (т.е. часть биоактивного компонента конъюгата) связывается с рецептором для биоактивного компонента на клеточной поверхности, но не активирует рецептор существенным образом. Данные способы будут эффективны в множестве диагностических и терапевтических приложений, как может легко представить себе обычный специалист в данной области. Наборы Изобретение представляет также наборы, содержащие конъюгаты и/или композиции, соответствующие изобретению. Данные наборы, как правило, содержат упаковку, такую как коробка, картонная упаковка, трубка ампулы или т.п., в которой близко друг к другу лежат один или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки, ампулы, бутылочки, шприцы и т.п., где первый контейнер содержит один или более конъюгатов и/или композиций, соответствующих данному изобретению. Наборы, охватываемые данным аспектом настоящего изобретения, могут, кроме того, содержать один или более дополнительных компонентов (например, реагентов и соединений), необходимых для реализации одного или более конкретных применений конъюгатов и композиций, соответствующих данному изобретению, таких как один или более компонентов, используемых для диагностики, лечения или предупреждения конкретного заболевания или физического нарушения (например, одно или более дополнительных терапевтических соединений или композиций, один или более диагностических реагентов, один или более носителей или наполнителей и т.п.), один или более дополнительных конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, и т.п. Обычному специалисту в соответствующих областях будет легко увидеть, что можно сделать другие приемлемые модификации и адаптации способов и применений, описанных в данном контексте, не выходя из объема изобретения или любого варианта его осуществления. Теперь, после детального описания данного изобретения то же самое будет яснее пониматься со ссылкой на последующие примеры,которые включены в данный материал только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения. Пример 1. Конъюгаты ПЭГ-интерферон-. Интерферон- представляет собой коммерчески важный белок медицинского назначения с уровнем продажи на мировом рынке в 2001 г., превышающим 2 млрд. долларов США, в основном для лечения больных с инфекциями вируса гепатита С ("HCV"). В Соединенных Штатах Америки от трех до четырех миллионов человек заражены хроническим гепатитом С, и каждый год происходит приблизительно 10000 смертей, связанных с HCV (см. статью Chander G. и соавт. (2002), Hepatology, 36:5135-5144). Пытаясь повысить эффективность ИФН-, обе компании, которые в основном занимаются его разработкой и маркетингом (Schering-Plough Corp. и F. Hoffmann-La Roche AG), разработали и освоили коммерческий выпуск конъюгатов ИФН- с монометоксиполиэтиленгликолем или "мПЭГ". В каждом из случаев мПЭГ связан с каждой молекулой интерферона- только в одной точке присоединения. В каждом из случаев продукт содержит смесь позиционных изомеров с заметно пониженной рецептор-связывающей активностью по сравнению с немодифицированным интерфероном. В каждом случае повышенная биодоступность и продолжительность действия конъюгата in vivo более чем компенсирует пониженную биоактивность in vitro, которая является результатом конъюгирования с ПЭГ, как измеряют по улучшенной клинической эффективности одной инъекции конъюгата в неделю по сравнению с тремя инъекциями немодифицированного белка в неделю при лечении хронической инфекции HCV (см. статью Manns M.P. и соавт. (2001), Lancet, 358:958-965). В конъюгате ПЭГ-интерферон 2 а, разработанном фирмой F. Hoffmann-La Roche, PEGASYS, две цепи мПЭГ молекулярной массы 20 кДа связаны с одним лизиновым линкером (так называемый "разветвленный ПЭГ"), который присоединен в основном к Lys 31, Lys 121, Lys 131 или Lys 134 (см. работуBailon P. и соавт., см. выше), все из которых находятся внутри или прилежат к рецептор-связывающему домену интерферон 2 а (см. связывающий центр 1 на фиг. 1 а и SEQ ID NO:1). В конъюгате ПЭГ-интерферон 2b, разработанном фирмой Schering-Plough Corp., одна цепь мПЭГ молекулярной массы 12 кДа связана в основном с остатком гистидина в положении 34 (His 34; см. работы Wylie D.C. и соавт., см. выше; Gilbert C.W. и соавт., патент США 6042822; Wang Y.-S. и соавт., см. выше), который находится в области, важной для связывания с рецептором (см. фиг. 1b). Другие центры присоединения ПЭГ в ПЭГ-UNTRON продукте, производимом Schering-Plough (Lys 121, Tyr 129 и Lys