Полимерный конъюгат модификаций интерферона – β, фармацевтические продукты на его основе и способ их получения
Номер патента: 8866
Опубликовано: 31.08.2007
Авторы: Мартинез Алекса Л., Шермэн Мэрри Р., Сейфер Марк Г.П., Уильямс Л.Дэвид
Формула / Реферат
1. Способ повышения биологической активности негликозилированного интерферона-b, отличающийся тем, что осуществляют селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров с аминоконцевой аминокислотой указанного интерферона-b, которая находится в отдалении от его рецепторсвязывающего домена(ов).
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную биологическую активность измеряют с использованием анализа на клеточных культурах, которые чувствительны к интерферону-b.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные один или более полимеров выбраны из группы, состоящей из одного или более полиалкиленгликолей, одного или более полиалкиленоксидов, одного или более поливиниловых спиртов, одного или более поликарбоксилатов, одного или более поливинилпирролидонов, одного или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одной или более полиаминокислот, одного или более полиакрилоилморфолинов, одного или более сополимеров, одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, одного или более декстранов и одной или более гиалуроновых кислот.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный интерферон-b имеет последовательность аминокислот интерферона-b-1b, определенную в SEQ ID NO:1.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный интерферон-b имеет практически последовательность аминокислот SEQ ID NO:1.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер ковалентно связан с a-аминогруппой указанной аминоконцевой аминокислоты.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанное ковалентное связывание указанного полимера с указанной a-аминогруппой осуществляется через вторичную амидную связь.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер связан с химически реакционной группой боковой цепи указанной аминоконцевой аминокислоты.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная реакционная боковая цепь представляет собой альдегидную группу, которая интродуцирована путем селективного окислительного отщепления аминоконцевого остатка серина или треонина интерферона-b.
10. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоля и моногидроксиполиэтиленгликоля.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль представляет собой моногидроксиполиэтиленгликоль.
14. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 1 до приблизительно 100 кДа включительно.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 8 до приблизительно 14 кДа.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 10 до приблизительно 30 кДа включительно.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 18 до приблизительно 22 кДа включительно.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
19. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что связывание указанного полимера с указанным интерфероном-b по указанной аминоконцевой аминокислоте имитирует положительные эффекты гликозилирования или гипергликозилирования указанного интерферона-b.
21. Полимерный конъюгат, содержащий интерферон-b с повышенной биологической активностью, полученный способом по п.1.
22. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью интерферона-b, отличающаяся тем, что содержит один или более конъюгатов по п.21 и один или более фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей.
23. Полимерный конъюгат, содержащий интерферон-b с повышенной биологической активностью, представляющий собой ковалентно связанный по его аминоконцевой аминокислоте интерферон-b с одним или более синтетических водорастворимых полимеров, в котором биологическая активность указанного интерферона-b повышена по сравнению с таким же интерфероном-b, который не связан таким образом.
24. Полимерный конъюгат, содержащий интерферон-b с повышенной биологической активностью, представляющий собой ковалентно связанный по его аминоконцевой аминокислоте интерферон-b с одним или более синтетических водорастворимых полимеров, в котором биологическая активность указанного конъюгата интерферона-b повышена по сравнению с таким же интерфероном-b, к которому один или более таких же синтетических водорастворимых полимеров присоединены случайным образом к доступным в растворителе остаткам лизина.
25. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что биологическую активность указанного конъюгата измеряют с использованием анализа на клеточных культурах, которые чувствительны к интерферону-b.
26. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный интерферон-b имеет последовательность аминокислот интерферона-b-1b, определенную в SEQ ID NO:1.
27. Конъюгат по п.26, отличающийся тем, что биологическая активность указанного интерферона- b-1b повышена приблизительно до активности интерферона-b-1a, который имеет последовательность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:2, и который гликозилирован на остатке аспарагина 80.
28. Конъюгат по п.25, отличающийся тем, что указанный анализ на клеточных культурах, чувствительных к интерферону-b, выбран из группы, состоящей из анализа на антипролиферативную активность, анализа на антивирусную активность, анализа сигнальной трансдукции и анализа активации генов.
29. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный один или более полимеров выбраны из группы, состоящей из одного или более полиалкиленгликолей, одного или более полиалкиленоксидов, одного или более поливиниловых спиртов, одного или более поликарбоксилатов, одного или более поливинилпирролидонов, одного или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одной или более полиаминокислот, одного или более полиакрилоилморфолинов, одного или более сополимеров, одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, одного или более декстранов и одной или более гиалуроновых кислот.
30. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный полимер ковалентно связан с a-аминогруппой аминоконцевой аминокислоты указанного интерферона-b.
31. Конъюгат по п.30, отличающийся тем, что указанное ковалентное связывание указанного полимера с указанной a-аминогруппой осуществляют через вторичную аминную связь.
32. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный полимер связан с химически реакционной группой боковой цепи указанной аминоконцевой аминокислоты.
33. Конъюгат по п.32, отличающийся тем, что указанная реакционная боковая цепь представляет собой альдегидную групяу, которая интродуцирована путем селективного окислительного отщепления аминоконцевого остатка серина или треонина интерферона-b.
34. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
35. Конъюгат по п.34, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоля и моногидроксиполиэтиленгликоля.
36. Конъюгат по п.35, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
37. Конъюгат по п.35, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль представляет собой моногидроксиполиэтиленгликоль.
38. Конъюгат по п.34, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 1 до приблизительно 100 кДа включительно.
39. Конъюгат по п.38, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 8 до приблизительно 14 кДа включительно.
40. Конъюгат по п.38, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 10 до приблизительно 30 кДа включительно.
41. Конъюгат по п.40, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 18 до приблизительно 22 кДа включительно.
42. Конъюгат по п.41, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
43. Конъюгат по п.38, отличающийся тем, что указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
44. Конъюгат по п.23 или 24, отличающийся тем, что связывание указанного полимера с указанным интерфероном-b по указанной аминоконцевой аминокислоте имитирует положительные эффекты гликозилирования или гипергликозилирования указанного интерферона-b.
45. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью интерферона-b, отличающаяся тем, что содержит конъюгат по любому из пп.21, 23 и 24 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
46. Набор, содержащий конъюгат по п.21.
47. Набор, содержащий конъюгат по п.23 или 24.
48. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по п.22.
49. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по п.45.
50. Способ предупреждения, диагностики или лечения чувствительного к интерферону-b физического нарушения у животного, страдающего или предрасположенного к указанному физическому нарушению, отличающийся тем, что предусматривает введение указанному животному эффективного количества конъюгата по любому из пп.21, 23 и 25.
51. Способ предупреждения, диагностики или лечения чувствительного к интерферону-b физического нарушения у животного, страдающего или предрасположенного к указанному физическому нарушению, отличающийся тем, что предусматривает введение указанному животному эффективного количества фармацевтической композиции по п.22 или 45.
52. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанное животное является млекопитающим.
53. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанное животное является млекопитающим.
54. Способ по п.52 или 53, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком.
55. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b физическое нарушение выбрано из группы, состоящей из рака, инфекционного заболевания, нейродегенеративного нарушения, аутоиммунного нарушения и генетического нарушения.
56. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака матки, рака яичников, рака простаты, рака яичка, рака легкого, лейкоза, лимфомы, рака толстой кишки, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака костей, неврологического рака, рака головы и шеи, рака кожи, карциномы, саркомы, аденомы и миеломы.
57. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из вирусного гепатита, заболевания, вызываемого кардиотропным вирусом, и ВИЧ/СПИДа.
58. Способ по п.55, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b нейродегенеративное нарушение представляет собой рассеянный склероз.
59. Способ по п.58, отличающийся тем, что указанный рассеянный склероз выбран из группы, состоящей из рецидивирующего-ремиттирующего, первичного прогрессирующего и вторичного прогрессирующего рассеянного склероза.
60. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b физическое нарушение выбрано из группы, состоящей из рака, инфекционного заболевания, нейродегенеративного нарушения, аутоиммунного нарушения и генетического нарушения.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака матки, рака яичников, рака простаты, рака яичка, рака легкого, лейкоза, лимфомы, рака толстой кишки, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака костей, неврологического рака, рака головы и шеи, рака кожи, карциномы, саркомы, аденомы и миеломы.
62. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из вирусного гепатита, заболевания, вызываемого кардиотропным вирусом, и ВИЧ/СПИДа.
63. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанное чувствительное к интерферону-b нейродегенеративное нарушение представляет собой рассеянный склероз.
64. Способ по п.63, отличающийся тем, что указанный рассеянный склероз выбран из группы, состоящей из рецидивирующего-ремиттирующего, первичного прогрессирующего и вторичного прогрессирующего рассеянного склероза.
65. Способ определения количества полимера, который присоединен к аминоконцу белка, отличающийся тем, что синтезированным путем восстановительного алкилирования полимерным конъюгатом белка, имеющего N-концевой остаток серина или треонина В, осуществляют реакцию с достаточным количеством окислителя в течение достаточного времени для отщепления полимера от остатка серина или треонина и измеряют увеличение доли неконъюгированного белка в препарате.
66. Способ по п.65, отличающийся тем, что указанный белок представляет собой цитокин.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой интерферон-b.
68. Способ по п.66, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой фактор роста и развития мегакариоцитов.
69. Способ по п.65, отличающийся тем, что указанный окислитель содержит периодат, выбранный из группы, состоящей из метапериодата натрия, метапериодата калия, метапериодата лития, периодата кальция, периодата бария и йодной кислоты.
70. Способ по п.65, отличающийся тем, что указанное измерение осуществляют одним или более методом(ами), выбранным из группы, состоящей из эксклюзионной хроматографии по размеру, хроматографии с обращенной фазой, гель-электрофореза, капиллярного электрофореза, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, светорассеяния и масс-спектроскопии.
71. Способ селективного окислительного отщепления N-концевого остатка серина или треонина биоактивного белка, отличающийся тем, что доводят концентрацию ионов водорода раствора указанного биоактивного белка до значения рН приблизительно от 7 до приблизительно 8, смешивают указанный раствор биоактивного белка приблизительно от 0,5 до приблизительно 5 молей периодата на моль биоактивного белка, и инкубируют указанную смесь в течение по меньшей мере 1 ч при температуре приблизительно от 2 до приблизительно 40шС.
72. Способ по п.71, отличающийся тем, что указанный биоактивный белок представляет собой интерферон-b.
73. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанный интерферон-b представляет собой интерферон-b-1b, имеющий последовательность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:1.
74. Способ повышения биологической активности препарата интерферона-b-1b, отличающийся тем, что предусматривает удаление одного или более ингибирующих компонентов из указанного препарата интерферона-b-1b.
75. Способ по п.74, отличающийся тем, что один или более ингибирующих компонентов удаляют из указанного препарата интерферона-b-1b с помощью одного или более хроматографических способов, выбранных из группы, состоящей из эксклюзионной хроматографии по размеру, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и аффинной хроматографии.
76. Способ по п.74, отличающийся тем, что биологическую активность указанного препарата интерферона-b-1b измеряют с использованием анализа на клеточных культурах, которые чувствительны к интерферону-b.
77. Способ по п.76, отличающийся тем, что указанный анализ на клеточных культурах, чувствительных к интерферону-b, выбран из группы, состоящей из анализа на антипролиферативную активность, анализа на антивирусную активность, анализа сигнальной трансдукции и анализа активации генов.
Текст
008866 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к области биохимии белков, а также фармакологии и медицине. В частности, изобретение представляет способы получения конъюгатов между водорастворимыми полимерами (например, полиэтиленгликолем и его производными) и цитокинами (например, интерфероном-),которые имеют повышенную активность по сравнению с конъюгатами полимеров с тем же самым цитокином, синтезированными стандартными способами. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие данные конъюгаты и композиции, а также способы применения конъюгатов и композиций для предупреждения,диагностики и лечения многих медицинских и ветеринарных состояний. Изобретение представляет также способы определения центра(ов) присоединения полимеров путем восстановительного алкилирования в определенных условиях. Сведения о предшествующем уровне техники Цитокины представляют собой регуляторные белки, которые контролируют выживаемость, рост,дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор Nicola, N. А. (1994) в монографии Руководство по цитокинам и их рецепторамYork). Цитокины имеют множество потенциальных вариантов применения в качестве терапевтических агентов вследствие их активности, специфичности, маленького размера и относительной простоты получения в рекобинантных организмах. Два ключевых фактора препятствуют созданию цитокинов, в частности, и рекомбинантных белков в целом как терапевтических агентов - их, как правило, короткие полупериоды существования в системе кровообращения и их потенциальная антигенность и иммуногенность. Как используют в данном контексте и в целом в области техники, термин "антигенность" относится к способности молекулы связываться с ранее существующими антителами, тогда как термин "иммуногенность" относится к способности молекулы вызывать иммунный ответ in vivo, включает ли данный ответ образование антител ("гуморальный ответ") или стимуляцию клеточных иммунных ответов. Для введения рекомбинантных терапевтических белков часто является желательным внутривенное(i.v.) введение с целью достижения наиболее высоких активностей в системе кровообращения и сведения к минимуму проблем биодоступности и распада. Однако полупериоды существования маленьких белков после внутривенного введения обычно являются чрезвычайно короткими (см. примеры в статьяхMordenti J. et al. (1991) Pharm. Res., 8:1351-1359; Kuwabara Т. et al. (1995) Pharm. Res., 12:1466-1469). Белки с гидродинамическими радиусами, превышающими радиус сывороточного альбумина, который имеет радиус Стоукса приблизительно 36 и молекулярную массу приблизительно 66000 Да (66 кДа),как правило, задерживаются в кровотоке здоровыми почками. Однако белки меньшего размера, включая цитокины, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF"), интерлейкин-2("ИЛ-2"), интерферон-, ("ИФН-") и интерферон- ("ИФН-"), быстро выводятся из кровотока посредством гломерулярной (клубочковой) фильтрации (см. статьи Brenner В. М. et al. (1978), Am. J. Physiol. 234:F455-F460; Venkatachalam M. А. et al. (1978), Circ. Res., 43:337-347; Wilson G., (1979), J. Gen. Physiol.,74:495-509; Knauf M. J. et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15064-15070; Kita Y. et al. (1990), Drug Des. Deliv.,6:157-167; Rostaing L et al. (1998), J. Am. Soc. Nephrol., 9:2344-2348). В результате поддержание терапевтически эффективных концентраций маленьких рекомбинантных белков в системе кровообращения представляет собой проблему после инъекции. Вследствие этого, как правило, приходится вводить более высокие концентрации таких белков и проводить более частые инъекции. Полученные в результате схемы дозирования повышают стоимость терапии, снижают вероятность соответствия требованиям пациента и повышают риск неблагоприятных событий, например, иммунных реакций. Оба, клеточный и гуморальный, иммунные ответы могут снижать циркулирующие в крови концентрации инъецированных рекомбинантных белков до той степени, которая может препятствовать введению эффективной дозы, или может привести к условиям, ограничивающим лечение, включая ускоренный клиренс, нейтрализацию эффективности и анафилаксию (см. статьи Ragnhammar P. et al. (1994), Blood, 84:4078-4087; Wadhwa M.J. et al. (2001), Blood, 98:3241-3248; Basser R. L. et al. (2002), Blood, 99:2599-2602; Schellekens H. (2002),Clin. Ther., 24:1720-1740). Модификация рекомбинантных белков путем ковалентного присоединения полиэтиленгликоля ("ПЭГ") широко исследовалась как средство, направленное на вышеописанные недостатки (см. обзор Sherman M. R. et al. (1997) в монографии "Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение" (Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications), под ред. Harris J. M. et al.,pp. 155-169, American Chemical Society, Washington, D. С; статью Roberts M. J. et al. (2002), Adv. DrugDeliv. Rev., 54:459-476). Показано, что присоединение ПЭГ к белкам стабилизирует белки, улучшает их биодоступность и/или снижает их иммуногенность in vivo (ковалентное присоединение ПЭГ к белку или другой субстанции называют в данном контексте, и оно известно в технике как "ПЭГилирование"). Кроме того, ПЭГилирование может существенно увеличить гидродинамический радиус белков. Когда маленький белок, такой как цитокин, связывают с одной длинной цепью ПЭГ (например, имеющей молеку-1 008866 лярную массу по меньшей мере приблизительно 18 кДа), полученный в результате конъюгат имеет гидродинамический радиус, превышающий радиуссывороточного альбумина, и его клиренс из системы кровообращения через почечные клубочки резко замедляется. Комбинированные эффекты ПЭГилирования пониженный протеолиз, уменьшенное иммунное распознавание и уменьшенные скорости почечного клиренса - обусловливают существенные преимущества ПЭГилированных белков как терапевтических агентов. С 1970-х гг. были сделаны попытки применить ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных белков, предназначенных для фармацевтического применения (см., например, Davis F.F. et al., патент США 4179337). Некоторые примеры включают связывание ПЭГ или полиэтиленоксида ("ПЭО") с аденозиндезаминазой (ЕС 3.5.4.4) для применения при лечении тяжелого заболевания, связанного с комбинированным иммунодефицитом (см. статьи Davis S. etal. (1981), Clin. Exp. Immunol., 46:649-652; Hershfield M.S. et al. (1987), N. Engl. J. Med. 316:589-596), с супероксиддисмутазой (ЕС 1.15.1.1) для лечения воспалительных состояний (см. Saifer M. et al., патенты США 5006333 и 5080891) и с уратоксидазой (ЕС 1.7.3.3) для выведения избытка мочевой кислоты из крови и мочи (см. статьи Kelly S.J. et al. (2001), J. Am. Soc. Nephrol., 12:1001-1009; Williams L.D. et al.,публикация РСТWO 00/07629 A3 и патент США 6576235; Sherman M. R. et al., публикация РСТWO 01/59078 А 2). ПЭО и ПЭГ представляют собой полимеры, состоящие из ковалентно связанных звеньев этиленоксида. Данные полимеры имеют общую структуруR1-(OCH2CH2)n-R2,в которой R2 может обозначать гидроксильную группу (или ее реакционное производное);R1 может представлять собой водород, как в дигидроксиПЭГ ("ПЭГдиол"), метильную группу, как в монометоксиПЭГ ("мПЭГ") или другую группу низшего алкила, например, как в изопропоксиПЭГ или трет-бутоксиПЭГ; параметр n в общей структуре ПЭГ показывает число этиленоксидных звеньев в полимере и относится в данном контексте и в области техники к "степени полимеризации". Полимеры такой же общей структуры, в которых R1 представляет собой С 1-7-алкильную группу, были также обозначены как оксирановые производные (см. Yasukohchi Т. et al., патент США 6455639). ПЭГ и ПЭО могут быть линейными, разветвленными (см. статью Fuke I. et al. (1994), J. Control Release,30:27-34) или звездообразной формы (см. статью Merrill E.W., (1993), J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 5:1-11). ПЭГ и ПЭО являются амфипатическими, т.е. они растворимы в воде и некоторых органических растворителях и могут прилипать к липидсодержащим материалам, включая вирусы с оболочками и мембраны животных и растительных клеток. Некоторые случайные или блок-, или чередующиеся сополимеры этиленоксида (ОСН 2 СН 2) и пропиленоксида, которые имеют структуру обладают свойствами, которые достаточно близки свойствам ПЭГ, что, как полагают, делает данные сополимеры приемлемыми заместителями ПЭГ в ряде вариантов применения (см., например, Hiratani H.,патент США 4609546 и Saifer M. et al., патент США 5283317). Термин "полиалкиленоксиды" и аббревиатуру "ПАО" используют в данном контексте для обозначения таких сополимеров, а также для ПЭГ или ПЭО и сополимеров поли(оксиэтилен-оксиметилена) (см. Pitt С. G. et al., патент США 5476653). В данном контексте термин "полиалкиленгликоли" и аббревиатуру "ПАГ" используют для родового обозначения полимеров, пригодных для применения в конъюгатах конъюгаты, соответствующих изобретению, в особенности ПЭГ, в частности ПЭГ, содержащего одну реакционную группу("монофункционально активированный ПЭГ"). Для ковалентного присоединения ПЭГ или других полиалкиленоксидов к белку требуется превращение по меньшей мере одной концевой группы полимера в реакционную функциональную группу. Данный процесс часто называют "активацией" и продукт называют "активированным ПЭГ" или активированным полиалкиленоксидом. МонометоксиПЭГ, в которых кислород на одном конце закрыт нереакционной химически стабильной метильной группой (для образования "метоксильной группы") и на другом конце функциональной группой, которая реагирует с аминогруппами на молекуле белка, наиболее часто используют в данных подходах. Так называемые "разветвленные" мПЭГ, которые содержат две или более метоксильных групп, дистальные относительно единственной активированной функциональной группы, используют менее часто. Примером разветвленного ПЭГ является ди-мПЭГ-лизин, в котором ПЭГ связан с обеими аминогруппами, и карбоксильная группа лизина наиболее часто активирована эстерификацией N-гидроксисукцинимидом (см. Martinez А. et al., патент США 5643575;Greenwald R.B. et al., патент США 5919455; Harris J.M. et al., патент США 5932462). Обычно активированные полимеры реагируют с биоактивным соединением, имеющим нуклеофильные функциональные группы, которые служат центрами присоединения. Одна нуклеофильная функциональная группа, которую обычно используют как центр присоединения, представляет собой -2 008866 аминогруппу остатков лизина. Доступные для растворителей -аминогруппы, группы карбоновых кислот, гуанидиногруппы, имидазольные группы, подходящим образом активируемые карбонильные группы, окисленные углеводные структуры и тиоловые группы также были использованы в качестве центров присоединения. Гидроксильная группа ПЭГ была активирована цианурхлоридом перед присоединением к белкамTreat. Rep., 65:1077-1081). Однако применение данного способа имеет недостатки, такие как токсичность цианурхлорида и его неспецифическая реакционность в отношении белков, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как доступные для растворителя остатки цистеина или тирозина, которые могут быть основными в осуществлении функции. Для того чтобы преодолеть данные и другие недостатки, вводили альтернативно активированные ПЭГ, такие как сукцинимидилсукцинатные производные ПЭГ ("СС-ПЭГ") (см. статью Abuchowski А. et al. (1984), Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186),сукцинимидилкарбонатные производные ПАГ ("СК-ПАГ") (см. Saifer M. et al., патент США 5006333) и альдегидные производные ПЭГ (см. Royer G.P., патент США 4002531). Обычно несколько (например, 5-10) цепей одного или более ПАГ, например одного или более ПЭГ с молекулярной массой приблизительно от 5 до приблизительно 10 кДа, связывают с белком-мишенью через первичные аминогруппы (-аминогруппы остатков лизина и, возможно, -аминогруппы аминоконцевой ("N-концевой") аминокислоты). В последнее время были синтезированы конъюгаты, содержащие одну цепь мПЭГ более высокой молекулярной массой, например 12, 20 или 30 кДа. Продемонстрированы прямые корреляции между полупериодами существования конъюгатов в плазме и увеличения молекулярной массы и/или увеличения числа связанных цепей ПЭГ (см. статьи Knauf M.J. et al., см. выше;et al. (1999), Exp. Hematol., 27:425-432; Leong S. R. et al. (2001), Cytokine, 16:106-119). С другой стороны,по мере увеличения числа цепей ПЭГ, связанных с каждой молекулой белка, повышается вероятность того, что будет модифицирована аминогруппа на основном участке белка и, следовательно, будет нарушена биологическая функция белка, в особенности если это белок, связывающий рецептор. Для более крупных белков, которые содержат много аминогрупп, и для ферментов с низкомолекулярными субстратами может быть приемлем компромисс между увеличенной продолжительностью действия и пониженной специфической активностью, поскольку он дает общее повышение биологической активности ПЭГсодержащих конъюгатов in vivo. Однако для менее крупных белков, которые работают через взаимодействия с клеточными поверхностными рецепторами, таких как цитокины, было показано, что относительно высокая степень замещения снижает функциональную активность до уровня, аннулирующего преимущество увеличенного полупериода существования в кровотоке (см. статью Clark R. et al., см. выше). Таким образом, конъюгирование полимеров представляет собой хорошо разработанную технологию пролонгирования биоактивности и снижения иммунореактивности терапевтических белков, таких как ферменты (см., например, предварительную заявку США 60/436020, поданную 26 декабря 2002 г. и предварительные заявки США 60/479913 и 60/479914, поданные 20 июня 2003 г., описания которых включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте). Класс терапевтических белков, который получал бы особенно благоприятный эффект от такой пониженной иммунореактивности, представлен интерферонами-, в частности интерфероном 1b ("ИФН 1b", SEQ ID NO:1) (см. материалы Группы исследования рассеянного склероза IFNB (The IFNB Multiple sclerosis Study Group), (1996), Neurology, 47: 889-894). Однако конъюгирование полимеров с регуляторными белками, которые действуют путем связывания специфическим образом клеточных поверхностных рецепторов, обычно (1) нарушает данное связывание; (2) заметно снижает активности сигнальной трансдукции агонистов цитокинов и (3) заметно снижает конкурентные активности антагонистов цитокинов. Опубликованные примеры данных конъюгатов с пониженной активностью связывания рецепторов включают конъюгаты полимеров с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором ("G-CSF") (см. Kinstler О. et al., публикация РСТWO 96/11953; Bowen S. et al., см. выше); человеческим гормоном роста ("hGH") (см. статью Clark R. et(2001), Pharm. Res., 18:1354-1360 и Wang Y.-S. et al. (2002), Adv. Drug Deliv. Rev., 54:547-570) в числе прочих. В крайнем случае связывание полимеров с интерлейкином-15 ("ИЛ-15") превращает данный ИЛ-2-подобный фактор роста в ингибитор клеточной пролиферации (см. статью Pettit D.K. et al. (1997),J. Biol. Chem., 272:2312-2318). Не имея в виду быть связанным теорией, механизм данных нежелательных эффектов ПЭГилирования может включать стерические препятствия взаимодействий рецептора с объемными группами ПЭГ, нейтрализацию заряда или оба эффекта. Таким образом, имеется потребность в способах получения ПАГ-содержащих (например, ПЭГи/или ПЭО-содержащих) конъюгатах, в особенности, в конъюгатах между данными водорастворимыми полимерами и рецепторсвязывающими белками при сохранении существенной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 40%), почти полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 80%) или практически полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизи-3 008866 тельно 90%). Данные конъюгаты будут иметь обусловленные полимерным компонентом преимущества в виде повышенной растворимости, стабильности и биодоступности in vivo и будут демонстрировать в значительной мере повышенную активность или применимость по сравнению с обычными полимерными конъюгатами у животных, которым данные конъюгаты введены с профилактическими, терапевтическими или диагностическими целями. Сущность изобретения Данное изобретение направлено на вышеописанные потребности и представляет способы получения конъюгатов водорастворимых полимеров, например полиэтиленгликоля и его производных, с биоактивными компонентами, в особенности рецепторсвязывающими белками, в частности, терапевтическими или диагностическими биоактивными компонентами, такими как цитокины, включая интерферон-, и прежде всего интерферон 1b. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами. По сравнению с соответствующими неконъюгированными биоактивные компоненты, конъюгаты, соответствующие изобретению, обладают повышенной стабильностью (т.е. более длительным сроком хранения и более длительными полупериодами существования in vivo). Кроме того, по сравнению с конъюгатами того же самого биоактивного компонента, полученными с использованием полимерных цепей, которые случайным образом присоединены к доступным для растворителя центрам на полипептидных цепях, конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют повышенную рецепторсвязывающую активность, которую можно измерить или использовать in vitro, и повышенную эффективность, которую можно измерить либо in vitro, либо in vivo. Более того, изобретение представляет композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие такие конъюгаты и композиции, и способы применения конъюгатов и композиций во множестве терапевтических и диагностических схем. В одном варианте осуществления изобретение представляет способы повышения активности цитокина. Некоторые способы, соответствующие данному аспекту изобретения, содержат, например, селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров с аминоконцевой аминокислотой цитокина, где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов цитокина. Близкие способы, представленные в изобретении для повышения активности цитокина, содержат, например, селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров в или около центров гликозилирования цитокина, причем один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов цитокина. Подходящие полимеры для применения в данных способах, соответствующих изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, один или более полиалкиленгликолей (включая, но без ограничения перечисленным, один или более полиэтиленгликолей, один или более монометоксиполиэтиленгликолей и один или более моногидроксиполиэтиленгликолей, один или более полиалкиленоксидов,один или более полиоксиранов, один или более полиолефиновых спиртов, например поливиниловый спирт, один поликарбоксилатов, один или более поливинилпирролидонов, один или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одну или более полиаминокислот, один или более полиакрилоилморфолинов, один или более сополимеров одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, один или более декстранов и одну или более гиалуроновых кислот. Полимеры, подходящие для применения в способах, соответствующих изобретению, как правило, имеют молекулярные массы приблизительно от 1 до приблизительно 100 кДа включительно, или, в частности, молекулярные массы приблизительно от 8 до приблизительно 14 кДа включительно, приблизительно от 10 до приблизительно 30 кДа включительно, приблизительно от 18 до приблизительно 22 кДа включительно или приблизительно 20 кДа, или приблизительно 30 кДа. Множество цитокинов и аналогов, которые имитируют (т.е. проявляют агонизм) или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов соответствующего цитокина, которые опосредуются их специфическими поверхностными клеточными рецепторами, пригодны для применения при получении настоящих конъюгатов. Они включают цитокины, имеющие структуру четырехспирального пучка(включая, но без ограничения перечисленным гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор ингибирования лейкоза (LIF), эритропоэтин (Еро),тромбопоэтин (Тро), фактор стволовых клеток (SCF), лиганд Flt3, онкостатин М (OSM), интерлейкин-2(ИЛ-2), ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р 35), ИЛ-13, ИЛ-15,ИЛ-17, интерферон- (ИФН-), интерферон- (ИФН-) (в особенности ИФН 1b), консенсусный интерферон и их мутеины, варианты, аналоги и производные) и цитокины, имеющие структуру -складки или -ствола (включая, но без ограничения перечисленным, фактор некроза опухоли(TNF-), ИЛ-1,ИЛ-1, ИЛ-12 (субъединицу р 40), ИЛ-16, эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор роста основных фибробластов (bFGF), кислый FGF, FGF-4 и фактор роста кератиноцитов (KGF; FGF-7) и их мутеины, варианты, аналоги и производные). Особенно предпочтительные цитокины, пригодные для применения согласно данному изобретению, включают ИЛ-2, ИФН-, ИФН-, IGF-1, EGF и bFGF. Кроме того, особенно пригодными для при-4 008866 менения являются конкурентные антагонисты вышеуказанных цитокинов, а также мутеины, варианты и производные данных цитокинов. В ряде вариантов осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) (в частности, посредством связи вторичного амина) с -аминогруппой аминоконцевой аминокислоты на цитокине. В других вариантах осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) с химически реакционной группой боковой цепи (например, гидроксильной группой, сульфгидрильной группой, гуанидиновой группой, имидазольной группой, аминогруппой, карбоксильной группой или альдегидным производным) аминоконцевой аминокислоты на цитокине. В дополнительных вариантах осуществления связывание полимера с цитокином по аминоконцевой аминокислоте или в либо около одного или более центров гликозилирования имитирует благоприятные эффекты гликозилирования цитокина. В близких вариантах осуществления связывание полимера с цитокином в или около одного или более центров гликозилирования на цитокине имитирует положительные эффекты гипергликозилирование цитокина, где термин "гипергликозилирование" указывает на ковалентное присоединение простых или сложных углеводных молекул кроме тех, которые присутствуют в нативной структуре. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные способами, соответствующими изобретению. Конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат выбранный цитокин или его выбранный антагонист (такой, как вышеописанные), связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких, как вышеописанные), где один или более полимеров связан/связаны с аминоконцевой аминокислотой цитокина и где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов выбранного цитокина. Кроме того, конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат выбранный цитокин или его выбранный антагонист (такой, как вышеописанные),связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких, как вышеописанные),где один или более полимеров связаны с одним или более центров гликозилирования выбранного цитокина и где один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов цитокина. Для полимерных конъюгатов агонистов, соответствующих изобретению, предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров были отдалены от всех рецепторсвязывающих доменов. Для полимерных конъюгатов ряда антагонистов, соответствующих изобретению, может быть предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров были отдалены от некоторых рецепторсвязывающих доменов, которые являются основными для осуществления связывания, но отдаление от всех рецепторсвязывающих доменов, которые важны для сигнальной трансдукции посредством агонистов, не является обязательным. Изобретение представляет также композиции, в особенности фармацевтические, содержащие один или более конъюгатов, соответствующих изобретению, и один или более дополнительных компонентов, таких как один или более фармацевтически приемлемый разбавителей, наполнителей или носителей. Изобретение представляет также наборы, содержащие один или более конъюгатов, композиций и/или фармацевтических композиций, соответствующих изобретению. Изобретение представляет также способы предупреждения, диагностики или лечения физического нарушения у животного (например, млекопитающего, такого как человек), страдающего или предрасположенного к физическому нарушению. Данные способы могут содержать, например, введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, композиций или фармацевтических композиций, соответствующих данному изобретению. Физические нарушения, которые надлежащим образом лечат или предупреждают согласно данным способам, соответствующим изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, формы рака (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичников, рак простаты, рак яичка, рак легкого, лейкоз, лимфому, рак толстой кишки, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки, рак костей, неврологический рак, рак головы и шеи, рак кожи, саркома, карцинома, аденома и миелома); инфекционные заболевания (например, бактериальные, грибковые, паразитарные и вирусные заболевания (такие как вирусный гепатит, заболевание,вызываемое кардиотропным вирусом, ВИЧ/СПИД и т.п.; и генетические нарушения (например, анемия,нейтропения, тромбоцитопения, гемофилия, карликовость и заболевание тяжелый комбинированный иммунодефицит ("SCID"); аутоиммунные нарушения (например, псориаз, системная красная волчанка и ревматоидный артрит) и нейродегенеративные нарушения (например, различные формы и стадии рассеянного склероза ("MS"), такие как рецидивирующий-ремиттирующий MS, первичный прогрессирующийMS и вторичный прогрессирующий MS; болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п.). В близких вариантах осуществления изобретение представляет также способы определения количества полимера, которое присоединено к аминоконцу белка, имеющего N-концевой остаток серина, в конъюгате полимербелок, синтезированном путем восстановительного алкилирования. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, предусматривают, например, (а) реакцию конъюгата с достаточным количеством окислителя в течение достаточного времени для отщепления полимера от остатка серина белка и (b) измерение увеличения доли неконъюгированного белка в препарате. Белки, пригодные для применения согласно данным способам, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины(включая интерферон- (особенно интерферон 1b, который предпочтительно имеет последователь-5 008866 ность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:1) и фактор роста и развития мегакариоцитов). Окислитель, используемый в ряде таких способов, соответствующих изобретению, может быть представлен периодатом, включая, но без ограничения перечисленным, метапериодат натрия, метапериодат калия, метапериодат лития, периодат кальция, периодат бария и йодную кислоту. Подходящие способы измерения увеличения доли неконъюгированного белка в препарате включают любые из ряда известных в области техники способов анализа белков и пептидов, включая, например, эксклюзионную хроматографию по размеру, хроматографию с обращенной фазой, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез, ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию, светорассеяние и масс-спектроскопию. В дополнительных близких вариантах осуществления изобретение представляет способы селективного окислительного отщепления N-концевого остатка серина биоактивного белка без окисления функционально важных остатков аминокислот указанного биоактивного белка. Некоторые такие способы,соответствующие изобретению, содержат, например, (а) подведение концентрации ионов водорода раствора биоактивного белка до рН приблизительно от 5 до приблизительно 10, более предпочтительно рН приблизительно от 7 до приблизительно 8; (b) смешивание раствора биоактивного белка приблизительно от 0,1 до приблизительно 10 молей или более предпочтительно приблизительно от 0,5 до приблизительно 5 молей периодата/моль биоактивного белка и (с) инкубирование указанной смеси в течение по меньшей мере 1 ч, предпочтительно при температуре приблизительно от 2 до приблизительно 40 С. Белки, пригодные для применения в соответствии с данными способами, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины (включая интерферон- (в особенности интерферон 1b, который предпочтительно имеет последовательность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:1. В дополнительных вариантах осуществления изобретение представляет способы повышения биологической активности препарата интерферона-, в частности препарата интерферона 1b, предусматривающие удаление одного или более ингибирующих компонентов препарата интерферона- (или интерферона 1b). Согласно данному аспекту изобретения один или более ингибирующих компонентов можно удалить из препаратов множеством известных в области техники способов процессинга, очистки и/или анализа белков и пептидов, включая, но без ограничения перечисленным, один или более хроматографических способов, таких как эксклюзионную хроматографию по размеру, хроматографию с обращенной фазой, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и аффинную хроматографию. Определение биологической активности данного препарата интерферона- (т.е. возрастает ли активность, уменьшается или не изменяется относительно исходного раствора интерферона-) можно осуществить посредством любого числа анализов in vitro или in vivo, которые знакомы обычному специалисту в данной области. Например, анализ с использованием клеточных культур, которые чувствительны к интерферону-, может быть использован для определения биологической активности препаратов интерферона-. Неограничивающие примеры таких подходящих анализов с использованием клеточных культур включают анализы на антипролиферативную активность, анализы на антивирусную активность, анализы сигнальной трансдукции и анализы активации генов, примеры которых хорошо известны обычным специалистам в данной области. Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидны обычному специалисту в свете следующих рисунков и описания изобретения и формулы изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1-8 представлены молекулярные модели различных цитокинов и факторов роста, созданные с помощью программы RasMol (см. статью Sayle R. А. et al. (1995), Trends Biochem. Sci. 20: 374-376) на основе кристаллографических данных. Каждая из моделей представлена в формате "ленты" или "рисунка" за исключением некоторых остатков, представляющих особенный интерес, которые показаны в формате "шариков и стрежней". Данные форматы являются вариантами, выбранными при использовании программы RasMol. Темные части лент представляют домены цитокинов и факторов роста, которые, как описано, участвуют в связывании с их рецепторами. Для каждой структуры указан инвентарный код банка данных по белкам (Protein Data Bank) ("PDB") (см. статьи Laskowski R.A., (2001), Nucleic Acids Res.,29:221-222; Peitsch M.C., (2002), Bioinformatics, 18:934-938; Schein C.H., (2002), Curr. Pharm. Des. 8:21132129). На фиг. 1 а показана модель интерферона 2 а, в которой четыре остатка лизина (Lys 31, Lys 121,Lys 131 и Lys 134), которые, как описано, являются первичными центрами ПЭГилирования в продукте ПЭГ-интерферон Roche, PegasysRR, представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данных("связывающие центры 1 и 2"). Все четыре остатка лизина, которые, как описано, ПЭГилированы, вPegasys находятся в области связывающего центра 1 (код PDB 1ITF). На фиг. 1b показана модель интерферона 2b, в которой остатки, которые, как описано, являются основными центрами ПЭГилирования в PEG-INTRON Schering-Plough (His 34, Lys 31, Lys 121, Туr 129 и Lys 131) и представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данных Wylie D.C. et al., см. выше). Данные остатки аминокислот находятся в области связывающего центра 1.-6 008866 На фиг. 1 с показана модель интерферона 2b, в которой аминоконцевой остаток цистеина ("Cys 1"), мишень ПЭГилирования в соответствии с данным изобретением, представлены в формате "шариков и стержней". Cys 1 отдален от связывающих центров 1 и 2. На фиг. 1d показана та же самая модель интерферона 2b, что и на фиг. 1 с, к N-концевому остатку цистеина ("Cys 1") которой присоединена одна цепь ПЭГ молекулярной массой 20 кДа. Структура ПЭГ получена с помощью адаптации программы, описанной Lee L.S. et al. 1999), Bioconjug. Chem., 10:973981) и сделана в том же масштабе, что белок. На фиг. 2 показана молекулярная модель человеческого интерферона 1 а (см. SEQ ID NO:2), в которой указано несколько остатков лизина, которые находятся в рецепторсвязывающих доменах или вблизи от них (Lys 19, Lys 33, Lys 99 и Lys 134). Кроме того, центр гликозилирования (Asn 80) и Nконцевой остаток метионина ("Met 1") представлены в формате "шариков и стержней" (на основе данныхLife Sci., 54:1203-1216; Runkel L et al. (2000), Biochemistry, 39:2538-2551). Met 1 находится в отдалении от связывающих центров 1 и 2, тогда как некоторые остатки лизина расположены с рецепторсвязывающих доменах, (код PDB 1AUI). Структура интерферона 1b (см. SEQ ID NO:1) отличается от структуры интерферона 1 а отсутствием N-концевого остатка метионина и углеводной частью, а также наличием остатка серина, замещенного неспаренным остатком цистеина (Cys 17 SEQ ID NO:2). На фиг. 3 показана молекулярная модель человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ("GM-CSF"), где три остатка лизина (Lys 72, Lys 107 и Lys 111), которые находятся в рецепторсвязывающих доменах, а также первый остаток аминокислоты около аминоконца, который визуализируется в кристаллической структуре ("Arg 4"), показаны в формате "шариков и стержней"(на основе данных Rozwarski D.A. et al. (1996), Proteins, 26:304-313). Аминоконцевая область GM-CSF отдалена от связывающих центров 1 и 2 (код PDB 2GMF). На фиг. 4 показана молекулярная модель человеческого интерлейкина-2, в которой остатки аминокислот, которые, как описано, включены в каждый из трех рецепторов (,и ) представлены в формате"шариков и стержней", как и несколько остатков лизина, которые находятся в или вблизи от рецепторсвязывающих доменов. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре, представляет собой серии 6 ("Ser 6"), который отдален от рецепторсвязывающих доменов (на основе данных Bamborough P. et al. (1994), Structure, 2:839-851; Pettit D. K. et al., см. выше). (Код PDB 3INK). На фиг. 5 показана молекулярная модель человеческого эпидермального фактора роста ("EGF") в формате "рисунка" за исключением остатков, которые участвуют в связывании рецептора, и двух остатков лизина (Lys 28 и Lys 48), которые прилежат к рецепторсвязывающим областям. Дисульфидные связи внутри цепи показаны пунктиром. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре, на которой базируется данная модель, представляет собой цистеин 6 ("Cys 6") (на основе данных Carpenter G. et al. (1990), J. Biol. Chem, 265:7709-7712; Lu H.-S. et al.(2001), J. Biol. Chem., 276:34913-34917). Гибкая часть аминоконца EGF (остатки 1-5), которая не визуализируется в кристаллической структуре, по-видимому, не находится в рецепторсвязывающей области (кодPDB 1JL9). На фиг. 6 показана молекулярная модель фактора роста основных фибробластов ("bFGF") В формате "рисунка", на котором остатки, участвующие в связывании с рецепторами и гепарином, идентифицированы представлением в формате "шариков и стержней" (на основе данных Schlessinger J. et al. (2000),Mol. Cell, 6:743-750). Первые 12 остатков аминокислот из аминоконца не участвовали в связывании рецептора (код PDB 1FQ9). На фиг. 7 показана молекулярная модель инсулиноподобного фактора роста-1 ("IGF-1") в формате"рисунка" за исключением остатков, участвующих в связывании рецептора (23-25 и 28-37), и остатка глутаминовой кислоты 3 ("Glu 3"), который представляет собой ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре. Идентифицировано два из остатков лизина, один из которых (Lys 27) принадлежит к рецепторсвязывающему домену, а другой отдален от рецепторсвязывающего домена (на основе данных Brzozowski A. M. et al. (2002), Biochemistry, 41:93899397). Аминоконец IGF-1 отдален от рецепторсвязывающих доменов (код PDB 1GZR). На фиг. 8 показана молекулярная модель интерферона- ("ИФН-"), который представляет собой гомодимер. Для объяснения взаимодействий между двумя полипептидными цепями один из мономеров("цепь А") показан в формате "ленты", а другой ("цепь В") - в формате "линии". Остатки лизина (показаны в формате светлых "шариков и стержней") расположены вдоль полипептидной цепи, включая области, которые участвуют в создании области контакта между мономерами или прилежат к остаткам аминокислот, которые участвуют в связывании белка. Аминоконцевая область ИФН- отдалена от области контакта при димеризации, но глутамин 1 (Gln 1) участвует в связывании рецептора, (см. статью ThielD.J. et al. (2000), Structure, 8:927-936; код PDB 1FG9). На фиг. 9 показано фракционирование неПЭГилированного интерферона 2b ("ИФН"),моноПЭГилированного интерферона 2b ("ПЭГ 1-ИФН") и диПЭГилированного интерферона 2b("ПЭГ 2-ИФН") с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИФН,мПЭГ-альдегид молекулярной массой 20 кДа и восстановитель. На фиг. 10 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 9, и выбранных фракций, собранных с ионообменной колонки, результаты относительно которых показаны на фиг. 9. На фиг. 11 показано фракционирование с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИЛ-2 человека, мПЭГ-альдегид молекулярной массой 20 кДа и восстановитель. В указанных условиях элюции остаточный неПЭГилированный ИЛ-2 не элюировался с колонки в отличие от результатов, полученных для интерферона 2b, которые представлены на фиг. 9. На фиг. 12 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 11, и выбранных фракций, элюированных с данной колонки. На фиг. 13 показаны данные электрофоретических анализов реакционной смеси ПЭГилированного интерлейкина-2 ("ПЭГ-ИЛ-2") и фракции из катионообменной колонки, хроматограмма к которой приведена на фиг. 1. На фиг. 14 представлено разделение с помощью эксклюзионной ВЭЖХ по размеру интерферона 1b ("ИФН") из его конъюгатов, образованных путем восстановительного алкилирования альдегидом мПЭГ молекулярной массой 20 при различных вводимых концентрациях ("1 х", "2 х" или"4 х") с использованием цианоборгидрида (NaBH3CN) в качестве восстановителя. Конъюгаты, содержащие одну цепь ПЭГ ("ПЭГ 1-ИФН") или две цепи ("ПЭГ 2-ИФН"), отделяют от ИФН, к которым ПЭГ не присоединилась в данных условиях ("ложно-ПЭГилированный ИФН"). На фиг. 15 изображено окислительное расщепление с помощью периодата натрия приблизительно 90% ПЭГ 1-ИФН-, синтезированного путем восстановительного алкилирования в различных условиях. Эксклюзионная ВЭЖХ по размеру в присутствии додециллсульфата натрия ("SDS") отделяла остаточный ПЭГ 1-ИФН- от продуктов расщепления, включая формальдгид и ИФН, в котором N-концевой серии был отщеплен до альдегида ("ИФН-альдегид"). На фиг. 16 изображено отделение с помощью хроматографии с обращенной фазой ПЭГ 1-ИФН- от ложно-ПЭГилированного ИФН-, несвязанного ПЭГ, несвязанного SDS и минорных компонентов реакционной смеси. На фиг. 17 изображены результаты аналитической хроматографии с обращенной фазой ("RP") реакционной смеси для ПЭГилирования и фракций из препаративной колонки RP, которые были обогащены ПЭГ 1-ИФН- (фракция 51) или ложно-ПЭГилированным ИФН- (фракция 53), соответственно. На фиг. 18 изображены результаты электрофоретического анализа реакционной смеси для ПЭГилирования и фракций из препаративной колонки RP, которые обогащены либо ПЭГ 1-ИФН- (фракция 51),либо конъюгатами, содержащими более одной цепи ПЭГ (фракция 49). Гель окрашивали на белок флуоресцентным красителем и фотографировали в ультрафиолетовом освещении. Интенсивность окрашивания измеряли с помощью визуплизирующей программы Kodak 1D. На фиг. 19 изображены результаты электрофоретического анализа тех же образцов, что на фиг. 18,за исключением того, что гель, окрашен на ПЭГ реагентом, содержащим BaCl2, I2 и Kl. Интенсивность окрашивания на фотографии геля измеряли, как на фиг. 18. В реакционной смеси определяется пик остаточного свободного ПЭГ молекулярной массой 20 кДа. На фиг. 20 изображены выполненные с обращенной фазой хроматограммы образцов ИФН 1b, которые либо являются необработанными (верхняя кривая), либо инкубированы с 0,5 мМ NaIO4, который отщепляет N-концевые остатки серина основного и минорного компонентов альдегидных производных(средняя кривая) или окислены NaIO4 и прореагировали с 9-флуоренилметилкарбазатом ("Fmocкарбазатом"). Минорный компонент ("пик А") содержит окисленный остаток метионина. Аналогичные увеличения времени удерживания обоих, пика А и основного компонента после окисления отражают разложение N-концевых остатков серина в каждом пике до альдегида. Никакого увеличения доли пика А не было определено после инкубирования с NaIO4 в данных условиях. Образование конъюгатов Fmoc из окисленных форм пика А и основного компонента показывают по увеличению из времени удерживания и значения поглощения после реакции с Fmoc-карбазатом. На фиг. 21 продемонстрирован синтез ПЭГ 1-ИФН- посредством реакции ПЭГ молекулярной массой 20 кДа карбазата с альдегидным производным ИФН-. Увеличивающаяся доля конъюгата,определяемого после инкубирования белка с 0,125 мМ NaIO4 при комнатной температуре в течение 0,5, 1 или 2 ч показывает, что для полного превращения N-концевого серина в альдегид требуется более 1 ч в данных условиях. ПЭГ 1-ИФН- был не полностью разделен с ПЭГ молекулярной массой 20 кДакарбазатом на данной колонке для эксклюзии по размеру. На фиг. 22 демонстрируют более высокую антипролиферативную активность в отношении человеческих клеток лимфомы Burkitt (клетки Daudi) разведений ПЭГ 1-ИФН-, который был очищен с помощью хроматографии с обращенной фазой (фракция 51, охарактеризованная на фиг. 17-19), чем у разведений исходного раствора ИФН-. Концентрация очищенного ПЭГ 1-ИФН-, необходимая для ингибиро-8 008866 вания 50% ингибируемого роста данных клеток, составляла приблизительно 40 пг/мл, что равнялось приблизительно одной шестой концентрации, необходимой для исходного раствора ИФН-. Концентрация очищенного ложно-ПЭГилированного ИФН- (фракция 53 из хроматограммы с обращенной фазой,приведенной на фиг. 17), необходимая для ингибирования 50% ингибируемого роста данных клеток, составляла приблизительно 80 пг/мл, что равнялось приблизительно одной трети концентрации, необходимой для исходного раствора ИФН-. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пока не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном контексте,имеют такие же значения, как обыкновенно имеются в виду обычным специалистом в области, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном контексте, могут быть использованы в практической реализации или тестировании данного изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Определения. Приблизительно: Как используют в данном контексте, когда обращаются к любому числовому значению, термин "приблизительно" означает величину 10% от указанного значения (например, "приблизительно 50 С" охватывает интервал температур от 45 до 55 С включительно; аналогичным образом "приблизительно 100 мМ" охватывает интервал концентраций от 90 до 110 мМ включительно). Остаток аминокислоты: Как используют в данном контексте, термин "остаток аминокислоты" относится к конкретной аминокислоте, как правило, дегидратированной в результате ее участия в двух пептидных связях в полипептидном скелете или боковой цепи, но также при включении аминокислоты в одну пептидную связь, как происходит на каждом конце линейной полипептидой цепи. Остатки аминокислот обозначают трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами, которые приняты в области техники. Антагонист: Как используют в данном контексте, термин "антагонист" относится к соединению,молекуле, структуре или комплексу, который снижает, значительно снижает или полностью ингибирует биологические и/или физиологические эффекты данного цитокина на клетку, ткань или организм, которые опосредуются через рецепторы данного цитокина. Антагонисты могут осуществлять такие эффекты множеством путей, включая, но без ограничения перечисленным, конкуренцию с агонистом за связывающий центр(ы) или рецептор(ы) на клеточной поверхности, взаимодействие с агонистом таким образом, чтобы снизить, значительно снизить или полностью ингибировать способность агониста связываться с клеточными поверхностными рецепторами; связыванием с клеточными поверхностными рецепторами и индукцией в них конформационного изменения, причем рецепторы приобретают структуру, с которой агонист не может более связываться (или может связываться только с пониженной или значительно пониженной аффинностью и/или эффективностью); индукцию физиологического изменения (например,увеличения внутриклеточных комплексов передачи сигнала, повышения уровня ингибиторов транскрипции, снижения экспрессии клеточного поверхностного рецептора лиганда и т.п.) в клетках, тканях или организмах, так что связывание агониста или физиологический сигнал, вызываемый агонистом при связывании с клеткой, снижается, значительно снижается или полностью ингибируется; и другие механизмы, посредством которых антагонисты могут осуществлять свои активности, которые знакомы обычным специалистам. Как будет понятно обычному специалисту, антагонист может иметь структуру, близкую лиганду, относительно которого он оказывает антагонистическое действие (например, антагонист может быть мутеином, вариантом, фрагментом или производным агониста) или может иметь совершенно неродственную структуру. Биоактивный компонент: Как используют в данном контексте, термин "биоактивный компонент" относится к соединению, молекуле, структуре или комплексу, которые имеют определенную биологическую активность in vivo, in vitro или ex vivo в отношении клетки, ткани, органа или организма и которые способны связываться с одним или более полиалкиленгликолей с образованием конъюгатов, соответствующих изобретению. Предпочтительные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным, белки и полипептиды, такие, как описаны в данном контексте. Связанный: Как используют в данном контексте, термин "связанный" относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например, посредством химического связывания, или нековалентным, например, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями, водородными связями и т.п. Ковалентные связи могут быть, например, сложноэфирными, эфирными, фосфоэфирными, сложнотиоэфирными, тиоэфирными, уретановыми, амидными, аминными, пептидными, имидными, гидразоновыми, гидразидными, сероуглеродными связями и фосфоруглеродными связями и т.п. Термин "связанный" включает такие термины, как "спаренный", "конъюгированный" и "присоединенный". Конъюгат/конъюгирование: Как используют в данном контексте, термин "конъюгат" относится к продукту ковалентного присоединения полимера, например, ПЭГ или ПЭО, к биоактивному компоненту,например белку или гликопротеину. Термин "конъюгирование" относится к образованию конъюгата, как описано в предыдущем предложении. Любой способ, обычно используемый компетентными специали-9 008866 стами в области конъюгирования полимеров с биологически активными материалами, может быть использован в данном изобретении. Спаренный: Термин "спаренный", как используют в данном контексте, относится к присоединению посредством ковалентных связей или сильных нековалентных взаимодействий, обычно и предпочтительно к присоединению посредством ковалентных связей. Любой способ, обычно используемый компетентными специалистами в области спаривания биологически активных материалов, может быть использован в данном изобретении. Цитокин: Как используют в данном контексте, термин "цитокин" определяют как секретируемый регуляторный белок, который контролирует выживаемость, рост, дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор в Nicola N.A., см. выше; статью Kossialcoff А.А. et al. (1999), Adv. Protein Chem., 52:67-108). В соответствии с данным определением цитокины включают интерлейкины, колониестимулирующие факторы, факторы роста и другие пептидные факторы, продуцируемые множеством клеток, включая, но без ограничения перечисленным, те, которые специально описаны или приведены в качестве примеров в данном контексте. Как близкие им соединения, полипептидные гормоны и факторы роста, цитокины инициируют свои регуляторные функции путем связывания со специфическими рецепторными белками на поверхности своих клеток-мишеней. Заболевание, нарушение, состояние: Как используют в данном контексте, термины "заболевание" или "нарушение" относятся к любому патологическому состоянию человека или животного, включая опухоли, рак, аллергии, аддикцию (привыкание к употреблению субстанций), аутоиммунитет, инфекцию, отравление или нарушение оптимальной умственной или физической функции. Термин "состояния", как используют в данном контексте, включает заболевания и нарушения, но относится также к физиологическим состояниям. Например, способность к оплодотворению является физиологическим состоянием, но не заболеванием или нарушением. Композиции, соответствующие изобретению, пригодные для предупреждения беременности путем снижения способности к оплодотворению, будут вследствие этого описаны как средство для лечения состояния (способности к оплодотворению), но не как средство для лечения нарушения или заболевания. Другие состояния понятны обычным специалистам в данной области. Эффективное количество: Как используют в данном контексте, термин "эффективное количество" относится к количеству определенного конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желательного биологического эффекта. Эффективное количество определенного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, будет составлять количество, которое достигает заданного результата, и такое количество может быть определено рутинным образом компетентным специалистом в данной области при использовании анализов, который известны в области техники и/или описаны в данном контексте без необходимости проведения излишних экспериментов. Например, эффективным количеством для лечения иммунодефицита могло бы быть количество,необходимое, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящее в результате к образованию антигенспецифического иммунного ответа при воздействии антигена. Термин также является синонимом термина "достаточное количество". Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, которое предусматривается лечить, конкретной композиции, предназначенной для введения, способа введения, размера субъекта и/или тяжести заболевания или состояния. Обычный специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество конкретного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, без необходимости проведения излишних экспериментов. Один или какой-либо неопределенный: Когда термины "один" или "какой-либо неопределенный" используют в данном описании, они означают "по меньшей мере один" или "один или более", пока не указывается иначе. ПЭГ: Как используют в данном контексте, термин "ПЭГ" включает все полимеры этиленоксида, как линейные или разветвленные, либо имеющие множество ветвей, так и блокированные на конце или заканчивающиеся гидроксилом. Термин "ПЭГ" включает те полимеры, которые известны в области техники как полиэтиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль или мПЭГ или полиэтиленгликольмонометиловый эфир, алкоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленоксид или ПЭО, -метилгидроксиполи(окси-1,2-этандиил) и полиоксиран в числе других названий, которые используют в области техники для полимеров этиленоксида. ПЭГилирование, ПЭГилированный и ложно-ПЭГилированный: Как используют в данном контексте, термин "ПЭГилирование" относится клюбому процессу ковалентного связывания ПЭГ с биоактивной молекулой-мишенью, особенно рецепторсвязывающим белком. Конъюгат, полученный таким образом, определяют как "ПЭГилированный". Как используют в данном контексте, термин "ложноПЭГилированный" относится к части белка в реакционной смеси для ПЭГилирования, к которой не был ковалентно присоединен никакой ПЭГ. Тем не менее ложно-ПЭГилированный продукт может быть изменен во время реакции или последующих стадий очистки, например, как последствие воздействия восстановителя во время ПЭГилирования путем восстановительного алкилирования и/или посредством од- 10008866 ного или более ингибирующих агентов, соединений и т.п., удален во время стадий обработки и/или очистки. Полипептид: Как используют в данном контексте, термин "полипептид" относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (известными также как пептидные связи). Он обозначает молекулярную цепь аминокислот и не относится к специфической длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин предназначен также для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, например гликозилирования, гипергликозилирования, ацетилирования,фосфорилирования и т.п. Полипептид может быть выделен из естественного биологического источника или получен технологией рекомбинантной ДНК, но необязательно, чтобы он был транслирован со сконструированной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым образом,включая химический синтез. Белок и гликопротеин: Как используют в данном контексте, термин "белок" относится к полипептиду, как правило, размером больше приблизительно 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, либо 2000 или более аминокислот. Белки обычно имеют определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют данную структуру, и их часто называют уложенными в противоположность пептидам и полипептидам, которые часто не обладают определенной трехмерной структурой, но могут принимать большое число различных конформаций, и их называют неуложенными. Однако пептиды также могут иметь определенную трехмерную структуру. Как используют в данном контексте, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной молекулой, которая присоединена к белку посредством кислородсодержащей или азотсодержащей боковой цепи остатка аминокислоты, например остатка серина или остатка аспарагина. Отдаленный (в отдалении): Как используют в данном контексте, термин "отдаленный" (как в выражении "отдаленная N-концевая аминокислота" или "отдаленный центр гликозилирования") относится к структуре, в которой положение одного или более центров присоединения для одного или более полимеров на белке находится(ятся) дистально или пространственно отдалены от одного или более рецепторсвязывающих областей или доменов белка, как определяют путем молекулярного моделирования. Конъюгирование полимера с таким отдаленным центром присоединения (как правило, N-концевой аминокислотой (для рецепторсвязывающих белков, которые вследствие этого называют рецепторсвязывающие белки с" отдаленным N-концом" или "RN" рецепторсвязывающие белки) или одной или более углеводных молекул или центров гликозилирования на гликопротеине (для рецепторсвязывающих белков, которые вследствие этого называют рецепторсвязывающие белки с "отдаленным гликозилированием" или"RG" рецепторсвязывающие белки не приводит к значительным стерическим препятствиям связывания белка с его рецептором(ами). Следовательно, полагают, что когда аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования на цитокине "находятся в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов" цитокина, то конъюгирование (например, ковалентное присоединение) водорастворимого полимера с аминоконцевой аминокислотой или центром гликозилирования, соответственно, не нарушает существенным образом способности цитокина связываться с его рецептором (ами), в особенности, с клеточными поверхностными рецепторами. Конечно, признают, что данный цитокин может содержать более одного рецепторсвязывающего домена. В таких ситуациях аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования цитокина могут находиться в отдалении от одного такого домена или более чем от одного из таких доменов, и, кроме того, рассматриваются, как "расположенные в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих доменов" настолько, что конъюгирование аминоконцевой аминокислоты или центра гликозилирования не нарушает существенным образом связывания цитокина с его рецептором(ами) посредством одного или более рецепторсвязывающих доменов. Нарушает или не нарушает существенным образом конъюгирование способность белка связываться с его рецептором(ами), можно легко установить с использованием известных в области техники анализов связывания лиганд-рецептор,которые знакомы обычным специалистам в данной области. Как показано на фиг. 1d данного описания, ПЭГ представляет собой высокообъемный и гибкий полимер, который занимает большой объем в растворе относительно белка близкой молекулярной массы. Хотя остаток аминокислоты, к которому присоединен ПЭГ, может находиться в отдалении от одного или более рецепторсвязывающих центров, части полимера, тем не менее, могли бы до некоторой степени нарушать связывание рецептора. Вероятность такого нарушения повышается с увеличением молекулярной массы и, следовательно, объема, занимаемого полимером в растворе. В любом случае направленное присоединение ПЭГ к одному или более центров, отдаленных от рецепторсвязывающей области(ей), будет меньше нарушать функцию цитокина, чем случайное ПЭГилирование. Способы оценки связывания лиганд-рецептор включают без ограничения перечисленным анализы конкурентного связывания, анализы связывания радиорецептора, анализы на основе клеток, измерения поверхностного плазменного резонанса, динамическое светорассеяние, ультрацентрифугирование и ультрафильтрацию.- 11008866 Существенный, существенно (в существенной мере): Как используют в данном контексте, конъюгирование белка, как считают, не нарушает "в существенной мере" способность белка связываться со своим рецептором(ами), если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с рецептором составляет не меньше чем приблизительно 40,приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75,приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92,приблизительно 93, приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97,приблизительно 98, приблизительно 99 или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания соответствующего цитокина, который не был конъюгирован. Лечение: Как используют в данном контексте, термины "лечение", "лечат", "леченый" или "проходящий лечение" относятся к профилактике и/или терапии. При использовании в отношении инфекционного заболевания, например, термин может относиться к профилактическому лечению, которое повышает резистентность субъекта к инфекции патогена или, другими словами, снижает вероятность того, что субъект будет инфицирован патогеном или продемонстрирует признаки заболевания, присущие инфекции, а также к лечению после инфицирования субъекта с целью борьбы с инфекцией, например, для снижения или уничтожения инфекции или для предупреждения ее ухудшения. Общие положения Данное изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецепторсвязывающую активность относительно полимерных конъюгатов того же самого рецепторсвязывающего белка, к которому один или более полимеров присоединены случайным образом. При использовании структурных анализов на основе рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса, мутационного анализа и компьютерной программы молекулярного моделирования авторы идентифицировали центры-мишени для ПЭГилирования цитокинов, которые участвуют или не участвуют в связывании со своими рецепторами. Как класс белков данные цитокины называют в данном контексте рецепторсвязывающими белками. Посредством выбора стратегии синтеза, которая направляет присоединение полимера на область(и) рецепторсвязывающих белков, которая не участвует во взаимодействиях рецептора, избегают некоторых нежелательных стерических препятствий, и полученные в результате полимерные конъюгаты сохраняют необычайно высокую активность. Данные рецепторсвязывающие белки, которые имеют аминоконцевой остаток, отдаленный от одного или более из их рецепторсвязывающих областей или доменов, определены в данном контексте как рецепторсвязывающие белки "с отдаленным N-концом" или "RN" рецепторсвязывающие белки; они включают в себя все цитокины или их антагонисты, у которых аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от рецепторсвязывающего центра или центров белка. В дополнительных вариантах осуществления изобретения получают конъюгаты, содержащие один или более синтетических полимеров (например, один или более полиэтиленгликолей), ковалентно связанных с цитокинами, которые имеют естественные центры гликозилирования, отдаленные от одного или более их рецепторсвязывающих областей или доменов. Согласно данному аспекту изобретения биоактивные компоненты (например, цитокины) конъюгатов будут проявлять хорошо сохранившиеся рецепторсвязывающие активности, когда синтетические полимеры связываются в области центра(ов) гликозилирования. Данную подгруппу рецепторсвязывающих белков называют в данном контексте "RG" рецепторсвязывающими белками. Когда гидрофильный или амфипатический полимер селективно связывают с таким "отдаленным центром гликозилирования" или около него, в особенности когда белокмишень представляет собой негликозилированную форму белка, который в естественных условиях является гликозилированным, полимер может имитировать благоприятные эффекты природного углевода,например на агрегацию, стабильность и/или растворимость. Вследствие этого присоединение полимера в центр гликозилирования или около него обозначают в данном контексте как "псевдогликозилирование". Таким образом, данное изобретение представляет способы синтеза конъюгатов, в которых центрселективное связывание синтетического полимера эффективно замещает естественные углеводные молекулы. Полученное в результате псевдогликозилирование способствует улученной растворимости, пониженной агрегации и задержанному выведению из кровотока по сравнению с другими негликозилированными формами белка. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в прокариотических клетках-хозяевах (например, бактериях, таких как Escherichia coli), поскольку прокариотические организмы, как правило, не гликозилируют белок, который они экспрессируют. Аналогично селективное ПЭГилирование углеводной части гликопротеина может в результате привести к "псевдогипергликозилированию" гликопротеина. Данный процесс описан, например, С. Воnаet al. в публикации РСТWO 96/40731, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в эукариотических клетках-хозяевах (например, дрожжах, клетках растений и клетках животных (включая клетки млекопитающих и насекомых, поскольку эукариотические организмы, как правило, гликозилируют белки,которые они экспрессируют, если данные белки включают естественные сигналы гликозилирования или- 12008866 сигналы гликозилирования, интродуцированные посредством технологии рекомбинантный ДНК. Данные псевдогликозилированные и псевдогипергликозилированные "RG"-рецепторсвязывающие белки входят в объем данного изобретения. Таким образом, изобретение охватывает также полимерные конъюгаты "RN" рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецепторсвязывающую активность, и псевдогликозилированных или псевдогипергликозилированных "RG" рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецепторсвязывающую активность. В данном контексте считается, что цитокин "сохраняет существенную,почти полную или практически полную рецепторсвязывающую активность" при конъюгировании с одним или более водорастворимых полимеров, соответствующих данному изобретению, если конъюгирование цитокина не нарушает в существенной мере способность белка связываться со своим рецептором(ами), т.е. если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с соответствующим ему рецептором(ами) составляет не меньше чем приблизительно 40, приблизительно 50,приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80,приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 91, приблизительно 92, приблизительно 93,приблизительно 94, приблизительно 95, приблизительно 96, приблизительно 97, приблизительно 98,приблизительно 99 или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания неконъюгированной формы соответствующего белка. В объем данного изобретения включены также полимерные конъюгаты данных рецепторсвязывающих белков, которые классифицированы как оба, "RN" и"RG" рецепторсвязывающие белки. Двумя примерами последних белков являются интерферон- (в частности, интерферон 1b) и ИЛ-2. В дополнительных вариантах осуществления изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецепторсвязывающую активность относительно полимерных конъюгатов этого же рецепторсвязывающего белка, в котором один или более полимеров присоединены случайным образом. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, и композиции, содержащие один или более данных конъюгатов, соответствующих изобретению, которые далее могут содержать один или более дополнительных компонентов или реагентов, таких как одна или более буферных солей, один или более углеводных наполнителей, один или более белков-носителей, один или более ферментов, один или более детергентов,одну или более молекул нуклеиновых кислот, один или более полимеров, таких как неконъюгированный ПЭГ или полиалкиленгликоль, и т.п. Изобретение представляет также наборы, содержащие конъюгаты и/или композиции, соответствующие изобретению. Изобретение представляет также фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие конъюгаты, соответствующие изобретению, и по меньшей мере один наполнитель или носитель, который является приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения. Изобретение представляет также способы лечения или предупреждения множества физических нарушений при использовании данных композиций, предусматривающие введение эффективного количества одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих данному изобретению, животному, страдающему от физического нарушения или состояния или предрасположенному к нему. Кроме того, изобретение представляет стабилизированные рецепторсвязывающие белки и способы их получения для применения в промышленной клеточной культуре, причем получают неожиданно высокие активности в результате комбинированных эффектов существенного сохранения биоактивности и повышенной продолжительности действия при промышленном применении. Неожиданно высокие активности конъюгатов, соответствующих данному изобретению, могут отражаться в необыкновенно высокой продукции биомассы, необыкновенно высоких уровнях экспрессии рекомбинантных белков и других усовершенствованиях эффективности биопроцессинга. В дополнительных вариантах осуществления изобретение представляет альтернативные способы повышения биологической активности препарата интерферона-, в особенности препарата интерферона 1b. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать,например, удаление одного или более ингибирующих компонентов из препарата интерферона(или интерферона 1b). Согласно данному аспекту изобретения один или более ингибирующих компонентов могут быть удалены из препаратов множеством известных в области техники способов обработки, очистки и/или анализа белков и пептидов, включая, но без ограничения перечисленным, один или более хроматографических способов, таких как эксклюзионная хроматография по размеру, хроматография с обращенной фазой, хроматография на основе гидрофобных взаимодействий и аффинная хроматография. На практике определение биологической активности определенного препарата интерферона(т.е. повышается ли активность, снижается или не затрагивается относительно исходного раствора цитокина, такого как интерферон-) может быть осуществлено любым из числа анализов in vitro или in vivo,которые будут знакомы обычному специалисту. Например, анализ с использованием клеточной культуры, которая чувствительна к интерферону-, может быть использован для определения биологической активности препаратов интерферона-. Неограничивающие примеры подходящих анализов с использо- 13008866 ванием клеточных культур включают анализы на антипролиферативную активность, анализы на антивирусную активность, анализы сигнальной трансдукции и анализы активации генов, примеры которых хорошо известны обычным специалистам в данной области техники. В близких вариантах осуществления изобретение представляет также способы определения количества полимера, который присоединен к аминоконцу белка, имеющего N-концевой остаток серина, в конъюгате полимер-белок, синтезированном путем восстановительного алкилирования. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, предусматривают, например, (а) реакцию конъюгата с достаточным количеством окислителя в течение достаточного времени для отщепления полимера от остатка серина белка и (b) измерение увеличения доли неконъюгированного белка в препарате. Белки, пригодные для применения согласно данным способам, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины(включая интерферон- (в особенности интерферон 1b), который предпочтительно имеет последовательность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:1) и фактор роста и развития мегакариоцитов (см. статью Guerra P.I. et al. (1998), Pharm. Res. 15:1822-1827, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте). Окислитель, используемый в ряде таких способов, соответствующих изобретению, может быть представлен периодатом, включая, но без ограничения перечисленным, метапериодат натрия, метапериодат калия, метапериодат лития, периодат кальция, периодат бария и йодную кислоту. Подходящие способы измерения увеличения доли неконъюгированного белка в препарате включают любые из множества известных в области техники способов анализа белков и пептидов, включая, например, эксклюзионную хроматографию по размеру, хроматографию с обращенной фазой, гельэлектрофорез, капиллярный электрофорез, ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию, светорассеяние и масс-спектроскопию. В дополнительных близких вариантах осуществления изобретение представляет способы селективного окислительного отщепления N-концевого остатка серина биоактивного белка без окисления функционально важных остатков аминокислот указанного биоактивного белка. Некоторые такие способы,соответствующие изобретению, содержат, например, (а) подведение концентрации ионов водорода раствора биоактивного белка до значения рН приблизительно от 5 до приблизительно 10, более предпочтительно значения рН приблизительно от 7 до приблизительно 8; (b) смешивание раствора биоактивного белка приблизительно от 0,1 до приблизительно 10 молей или более предпочтительно приблизительно от 0,5 до приблизительно 5 молей периодата/моль биоактивного белка и (с) инкубирование указанной смеси в течение по меньшей мере 1 ч, предпочтительно при температуре приблизительно от 2 до приблизительно 40 С. Белки, пригодные для применения в соответствии с данными способами, включают, но без ограничения перечисленным, цитокины (включая интерферон- (в особенности интерферон 1b, который предпочтительно имеет последовательность аминокислот, определенную в SEQ ID NO:1. Способы Авторы обнаружили, что направленность полимеров на аминоконцевую аминокислоту "RN" рецепторсвязывающего белка или участок, близкий к центру гликозилирования "RG" рецепторсвязывающего белка, обеспечивает то, что полимер присоединяется к центру, который отдален от одного или более рецепторсвязывающих областей или доменов белка, таким образом снижая до минимума стерическое препятствие взаимодействиям рецептора, создаваемое присоединенными молекулами полимера. Следовательно, можно сохранить более высокий процент рецепторсвязывающей активности посредством конъюгирования белков согласно способам, соответствующим данному изобретению, если бы полимер был присоединен к части молекулы или проксимально ей, которая включена в связывание со своим рецептором(ами). Данный принцип, который может в результате привести к неожиданно высокому сохранению рецепторсвязывающей активности, может быть продемонстрирован для рецепторсвязывающих белков,которые выбраны из фактора роста фибробластов ("bFGF" или "FGF-2"), эпидермального фактора роста("EGF"), инсулиноподобного фактора роста-1 ("IGF-1"), интерферона- ("ИФН-"), интерферона("ИФН-, включая, но без ограничения перечисленным ИФН 1b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ("GМ-СSF"), колониестимулирующего фактора моноцитов ("M-CSF"),лиганда Flt3, фактора стволовых клеток ("SCF"), интерлейкинов 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 и 15, трансформирующего фактора роста- ("TGF-"), человеческого гормона роста ("hGH"), пролактина, плацентарного лактогенного гормона, цилиарного нейротрофического фактора ("CNTF"), лептина и структурных аналогов данных рецепторсвязывающих белков, которые имитируют действия данных белков или которые являются их рецепторсвязывающими антагонистами. Напротив, не предполагается, что селективное присоединение большого полимера к аминоконцу ИФН- сохранит большую часть активности данного цитокина, поскольку такое связывание, как ожидают, нарушает связывание активного димера с его рецепторами (на основе данных Walter M.R. et al. (1995), Nature, 376:230-235). В близком данному варианте осуществления изобретения полимеры связаны с аминоконцевым остатком мутеинов рецепторсвязывающих белков, которые работают как конкурентные антагонисты природного белка, связывая один или более тех же рецепторов без инициации сигнальной трансдукции. Примерами являются полимерные конъюгаты антагониста hGH, который содержит точечную мутациюG120R (см. Sundstrom M. et al. (1996), J. Biol. Chem., 271:32197-32203), и антагонист пролактина, кото- 14008866 рый содержит точечную мутацию G129R (см. Goffin V. et al. (1997), J. Mammary Gland Biol. Neoplasia,2:7-17; Chen W.Y. et al. (1999), Clin. Cancer Res., 5:3583-3593; Chen W.Y., публикация PCTWO 99/58142 A1). Другие антагонисты рецепторсвязывающих белков могут быть получены с помощью селективных точечных мутаций, укорочений или делеций (см. например, Tchelet А. et al. (1997),Mol. Cell EndocriNol., 130:141-152; Peterson F.C. (1998), Идентификация мотивов, ассоциированных с лактогенным и соматотропным действием человеческого гормона роста (Identification of Motifs Associated with the Lactogenic и Somatotropic Actions of Human Growth Hormone), материалы диссертации на соискание степени доктора философских наук, Ohio State University, UMI9822357). В дополнительных вариантах осуществления изобретения для "RG" рецепторсвязывающих белков способы, соответствующие данному изобретению, приводят в результате к присоединению одного или более синтетических полимеров вблизи естественного центра присоединения углеводных молекул данных рецепторсвязывающих белков, которые представляют собой гликопротеины. В результате это дает"псевдогликозилирование" данных рецепторсвязывающих белков (например, когда они экспрессировались с помощью технологии рекомбинантный ДНК в Е. coli или других прокариотических клетках, которые не осуществляют посттрансляционное гликозилирование) или приводит к "псевдогипергликозилированию" из гликопротеиновых форм (например, для продуцируемых в естественных условиях гликопротеинов или для гликопротеинов, продуцируемых эукариотическими клетками-хозяевами (например,дрожжами, клетками растений и клетками животных (включая клетки млекопитающих и насекомых,которые осуществляют посттрансляционное гликозилирование). Примерами являются полимерные конъюгаты интерферонови , а также эритропоэтин ("Еро") и интерлейкин-2. Присоединение синтетических полимеров в центрах естественного гликозилирования или около них может быть проведено любым способом, который известен в области техники, включая мутационный способ, рассмотренный(см. Bioconjug. Chem., (2001), 12:861-869), который включает предшествующее окисление углевода; в данном контексте описания этих ссылок приведены во всей их полноте. Описание аминоконцевой модификации некоторых белков приведено ранее (см., например,Dixon H.B.F., (1984), J. Protein Chem., 3:99-108). Например, показано, что N-концевая модификация белков стабилизирует некоторые белки в отношении действия аминопептидаз (Guerra P.L et al., см. выше),улучшает растворимость белка (см. Hinds K. et al. (2000), Bioconjug. Chem., 11:195-201), уменьшает заряд на N-концевой аминогруппе или улучшает гомогенность полученных в результате конъюгатов(см. Kinstler О. et al., Европейская патентная заявкаЕР 0822199 А 2; Kinstler О. et al. (2002), Adv.Drug Deliv. Rev., 54:477-485) в числе прочих. Альтернативный способ связывания полимеров с -аминогруппой N-концевого остатка цистеина или гистидина путем адаптации способа,известного в области техники как "нативное химическое лигирование" рассмотрен в РСТWO 2003/031581 А 2, Roberts M.J. et al. и в патентной заявке США 2003/0105224 А 1, описания которых включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте. Однако существование подклассов "RN" и "RG" рецепторсвязывающих белков не учитывалось или не описывалось ранее в обычно используемых способах отбора представителей данных классов, а также не учитывались получение и применение полимерных конъюгатов таких рецепторсвязывающих белков в качестве пути сохранения неожиданно высокой функциональной активности "RN" рецепторсвязывающих белков. Следовательно, преимущество заключается в том, чтобы определить, имеет или не имеет конкретный цитокин N-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отдалены от рецепторсвязывающего центра(ов) лиганда. Возможность предсказать, является ли данный цитокин "RN" или "RG" лигандом перед конъюгированием лиганда с полимером в существенной мере уменьшает необходимость проведения экспериментов для получения конъюгатов полимер-лиганд (например, цитокинов или их антагонистов, конъюгированных с полимерами, например, ПЭГ), где антигенность и иммуногенность конъюгата понижена относительно антигенности и иммуногенности неконъюгированного лиганда без существенного снижения рецепторсвязывающей и физиологической активности конъюгированного лиганда. Соответственно в дополнительных вариантах осуществления данное изобретение представляет способы идентификации и отбора лигандов рецепторсвязывающих белков (например, цитокинов и их антагонистов), которые имеют N-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отдалены от рецепторсвязывающих центров белковых лигандов (т.е. способы идентификации и отбора "RN" или "RG" белков). В некоторых из данных вариантов осуществления изобретения оптимальное положение для конъюгирования одного или более полимеров (например, одного или более ПЭГ) можно определить с использованием молекулярного моделирования, например с учетом трехмерной структуры белка (цитокина или его антагониста) при использовании компьютерной программы молекулярного моделирования для предсказания положения(ий), в котором один или более полимеров могут быть присоединены к белку без существенной потери биологической или рецепторсвязывающей активности белка (см. также Schein C.H., выше). Аналогичный подход был продемонстрирован, например, для конъюгирования ПЭГ с G-CSF в попытке повысить его устойчивость к протеолитическому разложению (см. опубликованную патентную заявку США 2001/0016191 А 1 T.D. Osslund, описание которой включено в виде ссылки в данном контексте- 15008866 во всей ее полноте). Подходящая компьютерная программа молекулярного моделирования для применения в данном изобретении, такая как RASMOL (см. работу Sayle et al., см. выше), и другие программы,использованные для создания баз данных макромолекулярных структур, депонированных в банке данных по белкам, Protein Data Bank (PDB; см. статью Laskowski, R.A., выше), хорошо известны в области техники и должны быть знакомы специалистам в данной области. При использовании такой компьютерной программы молекулярного моделирования можно предсказать или определить трехмерную структуру полипептида, например цитокин или его антагониста с высокой степенью надежности, основываясь на кристаллографических анализах лигандов и их рецепторов. Таким образом, обычный специалист может легко определить, какие лиганды являются "RN" или "RG" лигандами, которые пригодны для применения согласно данному изобретению. Для практической реализации данного изобретения одним из удобных способов ковалентного связывания водорастворимого полимера с -аминогруппой N-концевого остатка аминокислоты белка является восстановительное алкилирование оснований Шиффа, образованных с полимерами, несущими одну альдегидную группу, например, как заявлено G.P. Royer (см. патент США 4002531), но не как заявлено J.M. Harris et al. (см. патент США 5252714), поскольку авторы заявляют только полимеры, дериватизированные по обоим концам альдегидными группами, которые представляют собой перекрестносшивающие агенты и вследствие этого не приемлемы для синтеза длительно действующих рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют существенную рецепторсвязывающую активность. Получение направленности восстановительного алкилирования оснований Шиффа ПЭГмоноальдегидов на -аминогруппу N-концевой аминокислоты рецепторсвязывающего белка и от-аминогрупп его остатков лизина можно осуществить множеством способов, основанных на материалах, представленных J.T. Edsall в главах 4 и 5 монографии Белки, Аминокислоты и Пептиды как ионы и биполярные ионы (Proteins Amino Acids and Peptides as Ions и Dipolar Ions) 1943), Reinhold PublishingCorporation, New York), описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Константа кислотной диссоциации ("рKа") -аминогруппы N-концевой аминокислоты полипептида, как ожидают, составляет меньше 7,6, тогда как значения рKa -аминогруппы остатков лизина в полипептидах, как ожидают, составляет приблизительно 9,5. В статье Edsall (см. (1943), см. выше) однозначно установлено, что альдегиды будут связываться с аминогруппой аминокислоты "только в щелочной области ее изоэлектрической точки". Следовательно, основываясь на настоящем описании и информации, которую легко получить в данной области техники, обычный специалист должен учитывать следующее:(1) селективная реакция альдегидов с -аминогруппой белка будет преобладать в интервале рН ниже 9,5 (приблизительно рKa -аминогрупп в белке);(2) скорость реакции альдегидов с -аминогруппами будет снижаться, если значение рН реакции снижается до 7,6 (приблизительно рKa -аминогруппы белка);(3) скорость реакции альдегидов с -аминогруппами будет снижаться меньше, чем у-аминогруппы при снижении рН реакции до 7,6;(4) селективность реакции альдегида с -аминогруппой будет повышаться до некоторой степени по мере снижения значения рН до 6,6. Поскольку последнее значение приблизительно на одну единицу рН ниже значения рKa -аминогруппы и на три единицы рН ниже значения pKa -аминогрупп, приблизительно 10% -аминогрупп и приблизительно 0,1% -аминогрупп будут находиться в реакционном непротонированном состоянии. Таким образом, при рН 6,6, фракция непротонированных -аминогрупп в 100 раз превышает фракцию непротонированных -аминогрупп. Вследствие этого будет получено очень незначительное повышение селективности при дальнейшем снижении рН реакции, например до 5,6, где теоретически 1% -аминогрупп и 0,01% -аминогрупп могли бы находиться в реакционном непротонированном состоянии. Таким образом, в ряде вариантов осуществления изобретения белковые лиганды (в особенности "RN" или "RG" лиганды, включая цитокины и их антагонисты) конъюгируют с одним или более полимеров путем образования смеси между лигандом(ами) и одним или более реакционных полимеров при рН приблизительно от 5,6 до приблизительно 7,6; приблизительно от 5,6 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,5 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,6 до приблизительно 7,6; приблизительно от 6,6 до приблизительно 7,0 или приблизительно 6,6. Данные способы, таким образом, существенно отличаются от способов, известных в области техники, в которых связывание полимеров с -аминогруппами на N-концевых остатках аминокислот лигандов осуществляют при рН приблизительно 5 (см. статью Kinstler О. et al. (2002), см. выше; патентную заявку ЕР 0822199 А 2; патенты США 5824784 и 5985265; статьи Roberts M.J. et al. (2002), см.- 16008866 выше; Delgado С. et al., патентную публикацию США 2002/0127244 А 1), тогда как связывание полимеров с -аминогруппами остатков лизина в полипептидном скелете лиганда проводят при рН 8,0 (см. статьюKinstler О. et al., патентную заявку ЕР 0822199 А 2; патенты США 5824784 и 5985265). Некоторым образом настоящие способы также существенно отличаются от ферментативных способов, которые были использованы для связывания алкиламиновых производных полиэтиленгликоля с рядом белков с помощью трансглутаминазы, которое проводили при значении рН 7,5 (см. статью Sato H., (2002), Adv. DrugDeliv. Rev., 54:487-504). В результате восстановление полученных оснований Шиффа мягкими восстанавливающими агентами, такими как цианоборгидрид натрия или пиридинборан (см. статью Cabacungan J.C. et al. (1982),Anal. Biochem., 124:272-278) приводит к образованию вторичных аминных связей, которые сохраняют положительный заряд N-концевой -аминогруппы белка при физиологическом значении рН. Данные связи, которые сохраняют такой же заряд, как у нативного белка, с большей вероятностью сохраняют его биологическую активность, чем альтернативные химические способы связывания, которые нейтрализуют заряд, например, посредством образования амидных связей (см. Burg J. et al., публикация РСТWO 02/49673 А 2; Kinstler О. et al., европейская патентная публикацияЕР 0822199 А 2; статьи Kinstler O. et al. (1996), Pharm. Res., 13:996-1002; Kita Y. et al., см. выше) или уретановых связей (см. Gilbert С. W. et al., патент США 6042822; статьи Grace М. et al. (2001), J. Interferon Cytokine Res., 21:11031115; Youngsters, et al. (2002), Curr. Pharm. Des., 8:2139-2157). Компетентным специалистам в области техники известны альтернативные подходы к селективному связыванию полимеров с N-концевыми остатками аминокислот. Здесь включены способы связывания гидразид-, гидразин-, семикарбазид- или других аминсодержащих полимеров с N-концевым остатком серина или треонина, которые были окислительно разложены до альдегидов с помощью периодата(1996), Bioconjug.Chem., 7:38-44; Drummond R.J. et al., патент США 6423685). Подходящие полимеры В некоторых вариантах осуществления изобретения требуется свести к минимуму образование внутримолекулярных и межмолекулярных перекрестных связей полимерами, такими как ПЭГ во время реакции, в которой полимер связывают с биоактивным компонентом для получения конъюгатов, соответствующих изобретению. Это можно осуществить путем использования полимеров, которые активированы только на одном конце (называемых в данном контексте "монофункционально активированными ПЭГ" или "монофункционально активированными ПАГ), или полимерных препаратов, в которых доля бифункционально активированных (называемых в случае линейных ПЭГ "бис-активироваными ПЭГдиолами") либо мультифункционально активированных полимеров составляет меньше чем приблизительно 30%, или более предпочтительно меньше чем приблизительно 10%, или наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 2% (мас./мас.). Применение активированных полимеров, которые полностью или почти полностью монофункциональны, может свести к минимуму образование всех следующих вариантов: внутримолекулярных перекрестных связей внутри отдельных молекул белка, "гантелеобразных" структур, в которых одна цепь полимера соединяет две молекулы белка, и более крупных агрегатов или гелей. Активированные формы полимеров, которые пригодны для применения в способах и композициях, соответствующих данному изобретению, могут включать в себя любые линейные или разветвленные монофункционально активированные формы полимеров,которые известны в области техники. Например, включены формы с молекулярной массой(за исключением массы активирующей группы) приблизительно от 1 до приблизительно 100 кДа. Приемлемые интервалы молекулярных масс включают, но без ограничения перечисленным,приблизительно от 5 до приблизительно 30 кДа; приблизительно от 8 до приблизительно 14 кДа; приблизительно от 10 до приблизительно 20 кДа; приблизительно от 18 до приблизительно 60 кДа; приблизительно от 18 до приблизительно 22 кДа; приблизительно от 12 до приблизительно 30 кДа,приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 кДа или приблизительно 30 кДа. В случае линейного ПЭГ молекулярные массы, составляющие приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа, соответствуют степеням полимеризации (n) приблизительно 230,приблизительно 450 или приблизительно 680 мономерных звеньев этиленоксида соответственно. Следует отметить, что задолго до того, как было признано существование классов "RN" и "RG" рецепторсвязывающих белков, были впервые описаны преимущества связывания терапевтических белков с полимерами, имеющими относительно высокие молекулярные массы (т.е. 20-30 кДа), см. Saifer M. etal., публикация РСТWO 89/01033 А 1, опубликованная 9 февраля 1989 г., которая включена в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. В других вариантах осуществления изобретения конъюгаты рецепторсвязывающих белков с необычно высокой долей сохранившейся биоактивности могут быть получены для применения in vitro, например, в клеточной культуре посредством связывания монофункционально активированных полимеров- 17008866 молекулярной массы приблизительно 1, приблизительно 2 или приблизительно 5 кДа согласно способам,соответствующим данному изобретению. Для таких применений in vitro данный более низкий интервал молекулярных масс может быть предпочтителен. Необязательно линейный полимер может иметь реакционную группу на одном или на обоих концах, создавая таким образом "реакционный полимер". В некоторых вариантах осуществления данного изобретения может быть желательным использование N-гидроксисукцинимидилового сложного эфира производного монопропионовой кислоты ПЭГ, как описано J.M. Harris et al. в патенте США 5672662,который включен в данном контексте полностью в виде ссылки, или других N-гидроксисукцинимидактивированных ПЭГ-монокарбоновых кислот. В некоторых других вариантах осуществления может быть желательным применение либо моносукцинимидилкарбонатных производных ПЭГ ("SC-ПЭГ"),как описано М. Saifer et al. в патентах США 5006333, 5080891, 5283317 и 5468478, либо моно-р-нитрофенилкарбонатного производного ПЭГ, как описано в работах S.J. Kelly et al., см. выше;M.R. Sherman et al., публикация РСТWO 01/59078 А 2. Более того, другие типы реакционных групп могут быть использованы для синтеза полимерных конъюгатов белков. Данные производные включают,но без ограничения перечисленным, моноальдегидные производные ПЭГ (см. Royer G.P., патент США 4002531; Harris J.M. et al., патент США 5252714), моноаминовые, монотрибромфенилкарбонатные,монокарбонилимидазоловые, монотрихлорфенилкарбонатные, монотрифторфенилкарбонатные, моногидразидные, моногидразиновые, моносемикарбазидные, монокарбазатные, монотиосемикарбазидные,моноиодацетамидные, мономалеимдные, моноортопиридилдисульфидные, монооксимовые, монофенилглиоксалевые, монотиазолидин-2-тионовые, монотиоэфирные, монотиоловые, монотриазиновые и моновинилсульфоновые производные ПЭГ. В дополнительных вариантах осуществления цитокины, хемокины, факторы роста, полипептидные гормоны и их антагонисты могут быть связаны с одним или более полимеров, как описано в находящейся в общем владении сопутствующей патентной заявке США 10/669597, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Биоактивные компоненты Как отмечено выше, конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат один ПАГ или ПАО и, в частности, одну цепь ПЭГ, ковалентно присоединенную к одному или более биоактивному компоненту. Биоактивные компоненты, к которым ковалентно присоединен один или более полимер (или их цепи),называют в данном контексте различно и эквивалентно "конъюгированными биоактивными компонентами" или "модифицированными биоактивными компонентами". Данные термины должны быть отделены в данном контексте от терминов "неконъюгированные биоактивные компоненты", "исходные биоактивные компоненты" или "немодифицированные биоактивные компоненты", которые относятся к биоактивным компонентам, не содержащим ковалентно присоединенные к ним полимеры. Однако следует иметь в виду, что "неконъюгированный", "немодифицированный" или "исходный" биоактивные компоненты могут содержать другие, неполимерные конъюгирования или модификации по сравнению с молекулой дикого типа или нативной молекулой и будут, тем не менее, рассматриваться как "неконъюгированные", "немодифицированные" или "исходные" в соответствии с данным изобретением, поскольку биоактивный компонент остается "неконъюгированным", "немодифицированным" или "исходным" в плане присоединения полимеров, как в случае биоактивных компонентов, которые называют в данном контексте "ложно-ПЭГилированными". Термин "стабилизирующий" биоактивный компонент (или "способы стабилизации" или "стабилизированный биоактивный компонент") указывает на то, что биоактивный компонент был стабилизирован согласно способам, соответствующим данному изобретению (т.е. биоактивный компонент, к которому был ковалентно присоединен полимер согласно способам, соответствующим изобретению). Данные стабилизированные биоактивные компоненты будут проявлять некоторые измененные биохимические и биофизические свойства по сравнению с биоактивным компонентом, который не был стабилизирован(т.е. биоактивным компонентом, к которому не был ковалентно присоединен полимер). В данные измененные биохимические и биофизические параметры, в частности, для рецепторсвязывающих белков могут быть включены пониженная чувствительность к протеолитическому разложению и особенно поддержание активности рецепторсвязывающего белка во время инкубирования в определенных жестких условиях окружающей среды и эксперимента. В ряде вариантов осуществления изобретения измененные биохимические и биофизические параметры могут включать, например, увеличенный полупериод существования в кровотоке in vivo, повышенную биодоступность, увеличенную продолжительность действияin vitro и т.п. Любой рецепторсвязывающий белок (обычно цитокин), имеющий биологическую (т.е. физиологическую, биохимическую или фармацевтическую) активность, связанную с частями молекулы, которые отдалены от ее аминоконца или от естественного или мутационным путем интродуцированного центра гликозилирования, можно соответствующим образом использовать в данном изобретении в качестве исходного компонента. Данные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным,пептиды, полипептиды, белки и т.п. Биоактивные компоненты также включают фрагменты, мутеины и производные данных пептидов, полипептидов, белков и т.п., в особенности, такие фрагменты, мутеины и- 18008866 производные, обладающие биологической (т.е. физиологической, биохимической или фармацевтической) активностью. Подходящие пептиды, полипептиды и белки, гликопротеины и т.п., которые в данном изобретении используют как биоактивные компоненты, включают в себя любой пептид, полипептид или белок и т.п.,имеющий одну или более чем одну доступную аминогруппу, тиоловую группу или другую группу, которая отдалена от рецепторсвязывающей области или областей биоактивного компонента и к которой могут быть селективно присоединены полимеры. Данные пептиды, полипептиды, белки, гликопротеины и т.п. включают цитокины, которые могут иметь любую из множества структур (см. статьи Nicola N.A., см. выше; Schein C.H., см. выше). Например, подходящие пептиды, полипептиды и белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным, класс цитокинов, имеющих структуры, содержащие четыре -спиральных пучка (оба из подклассов с длинной цепью и короткой цепью), в качестве обзора см. статью Schein C.H.,см. выше. Множество данных белков, имеющих четырехспиральные пучки, пригодны для применения в данном изобретении, включая, но без ограничения перечисленным, интерлейкины, например ИЛ-2,ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р 35), ИЛ-13, ИЛ-15 и ИЛ-17; колониестимулирующие факторы, например макрофагальный колониестимулирующий факторRozwarski D. А. et al. (1996), Proteins, 26:304-313); интерфероны, например ИФН-, ИФН- (включая, но без ограничения перечисленным, ИФН 1b) и консенсусный ИФН; фактор ингибирования лейкоза(LIF); эритропоэтин (Еро); тромбопоэтин (Тро); фактор роста и развития мегакариоцитов (MGDF); фактор стволовых клеток (SCF), известный также в области техники как фактор Steel (см. статьи MorrisseyP.J. et al. (1994) Cell Immunol., 157:118-131; McNiece I.K. et al. (1995), J. Leukoc. Biol., 58:14-22); онкостатин М (OSM); белок, активирующий фосфолипазу (PLAP); нейротрофические факторы и их пептидомиметики. Хотя пролактин и гормон роста являются классическими гормонами, которые широко циркулируют в организме, в отличие от цитокинов, которые, как правило, образуются около своих клетокмишеней, пролактин и гормон роста принадлежат к тому же самому структурному классу, что цитокины с четырьмя -спиральными пучками (см. статьи Nicola N.A., см. выше; Goffin V. et al., см. выше), и они представляют собой аналогично пригодные мишени для спаривания с полимером и для получения настоящих конъюгатов в соответствии с данным изобретением. Рецепторсвязывающие белки из структурных классов -складки или -ствола с длинной цепью(в качестве обзора см. Schein C.H., см. выше) также пригодны для применения при получении конъюгатов и композиций, соответствующих данному изобретению. Они включают, но без ограничения перечисленным: семейство цитокинов фактора некроза опухоли, например TNF-, TNF-, и лигандов Fas, которые представляют -гелеобразные скрученные структуры; ИЛ-1 (включая ИЛ-1 и ИЛ-1) и семействаFGF (включая фактор роста основных фибробластов (bFGF), кислый FGF, FGF-4 и фактор роста кератиноцитов (KGF; FGF-7, которые демонс трируют укладку в виде -трилистника (см. статьи Schein C.H.,см. выше; Schlessinger J. et al., см. выше); ИЛ-12, ИЛ-16, эпидермальный фактор роста (EGF; см. статьюLu H.-S. et al., см. выше) и факторы роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующие факторы роста(включая трансформирующий фактор роста- и трансформирующий фактор роста- (TGF- и факторы роста нервов, которые принимают структуры цистинового узла. Дополнительный структурный класс белков, которые эффективно используют в конъюгатах и композициях, соответствующих данному изобретению, представляет собой класс богатых дисульфидом смешанных / цитокинов и факторов роста (в качестве обзора см. статью Schein C.H., выше), включая,но без ограничения перечисленным: семейство EGF, которое имеет структуру -изгиба, ИЛ-8, RANTES,нейтрофилактивирующий пептид-2 (NAP-2), фактор 1 из клеток стромы (SDF-1), белки хемоаттрактантов моноцитов (МСР-1, МСР-2 и МСР-3), эотаксины (например, эотаксин-1, эотаксин-2 и эотаксин-3),фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), нейротактин, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), онкоген, связанный с ростом, активность, стимулирующую рост меланомы(GRO-/MGSA), соматомедины, а также инсулин и инсулиноподобные факторы роста (например, IGF-1 и IGF-2). Близкий структурный класс белков, пригодных для применения в конъюгатах и композициях,соответствующих данному изобретению, представляет собой цитокины с мозаичными структурами, которые включают факторы роста, такие как ИЛ-12, и фактор роста гепатоцитов (см. статью Nicola N.A.,см. выше). Другие белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным: гормоны роста (в особенности человеческий гормон роста (hGH; см. Tchelet А. et al. (1997), Mol. Cell Endocrinol.,130:141-152) и их антагонисты (см., например, Sundstrom М. et al. (1996), J. Biol. Chem., 271:3219732203), пролактин и его антагонисты, хорионический гонадотропин, фолликулстимулирующий гормон,тироидстимулирующий гормон, пигментные гормоны, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны и рецепторсвязывающие антагонисты цитокинов и факторов роста всех вышеперечисленных структурных классов. Многие такие белки существуют как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах. Негликозилированные формы могут быть результатом их получения при ис- 19008866 пользовании технологий рекомбинантного ДНК в прокариотах или при использовании химического синтеза. Данные негликозилированные продукты находятся в числе пептидов и белков, которые представляют собой подходящие биоактивные компоненты, соответствующие данному изобретению. Наконец,хотя некоторые антитела действуют как рецепторсвязывающие агонисты или антагонисты (см., например, статью Morris J.C. et al. (2000), Ann. Rheum. Dis., 59 (Suppl I): i109-i114), такие иммуноглобулины не являются подходящими кандидатами на N-концевое связывание с полимером в объеме данного изобретения, т.е. они не являются RN рецепторсвязывающими белками, поскольку аминоконцевые области обеих, легкой и тяжелой, цепей участвуют в распознавании антигена. Особенно применимыми в качестве биоактивных компонентов для использования в получении полимерных конъюгатов, соответствующих данному изобретению, являются интерферон-, интерферон-,ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, hGH, пролактин, инсулин, IGF-1, EGF, bFGF и эритропоэтин (Еро). Также особенно применимыми являются мутеины и фрагменты данных биоактивных компонентов, в частности те, которые способны связываться с рецепторами для соответствующих полипептидов дикого типа и интактных полипептидов, независимо от того, индуцирует или нет данное связывание биологический либо физиологический эффект. В ряде данных вариантов осуществления мутеины и фрагменты биоактивных компонентов могут действовать как антагонисты соответствующих лигандов, которые снижают, существенно снижают или полностью ингибируют связывание лигандов со своими рецепторами и/или активность лигандов на их клетках-мишенях, тканях и/или организмах. Другие антагонисты, которые могут быть или могут не быть структурными аналогами, мутеинами, вариантами или производными лигандов, представляющих интерес, также подходят для получения конъюгатов согласно данному изобретению. Для практических целей можно определить, оказывает ли данный мутеин, фрагмент, вариант, производное или антагонист антагонистическое воздействие на биологические и/или физиологические эффекты данного лиганда без проведения излишних экспериментов, используя анализы биологических/физиологических эффектов самого лиганда, множество из которых хорошо известно в области техники и/или описано в данном контексте. Структуры (первичные, вторичные, третичные и, где применимо, четвертичные) данных и других полипептидов, представляющих интерес, которые эффективно используют в соответствии с данным изобретением, хорошо известны в области техники и будут знакомы обычным специалистам, в особенности в свете структур и в ссылках, приведенных в данном контексте, которые включены в данное описание в виде ссылки во всей их полноте. Конъюгаты Данное изобретение представляет стабильные конъюгаты биоактивных компонентов, в частности цитокинов, для применения во множестве приложений. Данные конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют ряд преимуществ относительно тех, которые были ранее известны в области техники, как показано путем следующих неограничивающих и приведенных в качестве примера сравнений известных в области техники конъюгатов: Н. Hiratani (европейский патентЕР 0098110 В 1 и патент США 4609546) раскрывают конъюгаты сополимеров этиленоксида и пропиленоксида ("ПЭГ-ППГ", представителя общего класса ПАГ) с белками, включая интерфероны и интерлейкины, где не описано никакого предпочтения в плане избежания областей белков, участвующих в связывании рецептора. В данных ссылках интерфероны ,ирассматривались как эквивалентные мишени для связывания ПАГ в отличие отданного изобретения, в котором не считают, что интерферон- является подходящей мишенью для N-концевого связывания, поскольку аминоконец находится внутри рецепторсвязывающей области данного цитокина. Кроме того,Hiratani раскрывает конъюгаты, синтезированные только с ПАГ с молекулярной массой от 1 до 10 кДа,тогда как в способах, соответствующих данному изобретению, предпочитают спаривание водорастворимых, синтетических полимеров с молекулярными массами, превышающими 10 кДа, для терапевтического применения. Аналогично N.V. Katre (см. (1990), см. выше) описывает, что связывание большего числа цепей мПЭГ молекулярной массой 5 кДа с человеческим рекомбинантным интерлейкином-2 увеличивает полупериоды существования полученных в результате конъюгатов в кровотоке мышей и кроликов. Однако данная ссылка не раскрывает или не признает перспективности связывания меньшего числа более длинных цепей ПЭГ или связывания одной цепи высокомолекулярного ПЭГ в аминоконцом ИЛ-2, как представлено в данном изобретении.G. Shaw (патент США 4904584 и публикация РСТWO 89/05824 А 2) раскрывает способы индукции селективного в отношении центра присоединения амин-реакционных полимеров путем интродукции, замены или делеции остатков лизина в белке-мишени, в особенности в Еро, G-CSF и ИЛ-2. Однако в отличие от описания данного изобретения эти ссылки не раскрывают, что аминреакционные полимеры могут реагировать с любым амином в белке-мишени, отличным от -аминогрупп остатков лизина, четко отграничивая данные описания от настоящего изобретения.D.E. Nitecki et al. (патент США 4902502) раскрывают множество ПЭГилированных конъюгатов ИЛ-2, которые были получены из различных хлорформиатных производных ПЭГ, которые были предназначены для реакции с -аминогруппами остатков лизина. Однако в противоположность настоящим спо- 20008866 собам данная ссылка не раскрывает ни способа, как избежать ПЭГилирования остатков лизина в областях белка ИЛ-2, которые участвуют в связывании рецептора, ни какой-либо осведомленности в том, что избежание данных центров является благоприятным.N. Katre et al. (патент США 5206344) раскрывают конъюгаты ПЭГ-ИЛ-2 Ю, в которых ПЭГ связан с -аминогруппами остатков лизина неспаренной сульфгидрильной группой естественного остатка цистеина в положении 125 (считая от аминоконца) или с сульфгидрильной группой остатка цистеина,который был мутационным путем интродуцирован между первым и двадцатыми остатками от аминоконца ИЛ-2. В группу мутеинов, которые описаны в патенте '344, включен "дез-аlа-1" ИЛ-2, т.е. мутеин,в котором аминоконцевой аланин делетирован и который не является ПЭГилированным. Однако в противоположность настоящему описанию патент '344 не раскрывает ни какого-либо способа избежания спаривания ПЭГ с остатками аминокислот, которые участвуют в связывании с рецепторами, ни какоголибо понимания того, что данный подход мог бы быть перспективным. В соответствии с данным замечанием и в противоположность настоящему изобретению широкий интервал точек присоединения, предложенный в патенте '344, не предполагает, что связывание ПЭГ с аминоконцом ИЛ-2 было бы особенно благоприятным. В материалах S.P. Monkarsh et al. (1997), Anal. Biochem., 247:434-440 и S.P. Monkarsh et al. (1997), в монографии под ред. Harris J.M. et al. Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение(Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications), с. 207-216, American Chemical Society, Washington, D.C. описано, что реакция интерферона 2 а с трехкратным молярным избытком активированного ПЭГ с молекулярной массой 5300 Да дает 11 позиционных изомеров моноПЭГ-интерферона, соответствующих 11 остаткам лизина в интерфероне 2 а. В этих материалах нет описания ПЭГ-интерферона, в котором ПЭГ связан с -аминогруппой на аминоконце интерферона. 11 позиционных изомеров, описанных в данных ссылках, проявляли антивирусные активности в клеточных культурах, которые составляли от 6 до 40% от активности немодифицированного интерферона и антипролиферативные активности в клеточных культурах, которые составляли от 9 до 29% от активности немодифицированного интерферона. Данные результаты ясно демонстрируют, что случайное ПЭГилирование остатков лизина, практически осуществленное данными исследователями, нарушало функции интерферона 2 а, опосредованные его рецепторами, в противоположность конъюгатам, полученным способами, соответствующими данному изобретению. Кроме того, в отличие от конъюгатов, соответствующих данному изобретению, в конъюгатах, описанных в данных ссылках, отсутствовал интерферон, ПЭГилированный по N-концу. О. Nishimura et al. (патент СШАH1662, законодательно установленный регистрационный номер изобретения) раскрывает конъюгаты интерферона-, интерферона- и ИЛ-2, которые получают путем восстановительного алкилирования активированных "альдегидов метилового эфира полиэтиленгликоля" цианоборгидридом натрия при рН 7,0 (для конъюгатов интерферона) или рН 7,15 (для конъюгатов ИЛ-2). Однако было описано, что конъюгаты, полученные данными способами, теряют до 95% биоактивности немодифицированных белков, вероятно, вследствие присутствия множества центров присоединения полимера, все из которых, как показано, находятся на -аминогруппах остатков лизина (см. фиг. 1 и 4 данного изобретения). В статье D.K. Pettit et al. 1997), J. Biol. Chem., 272:2312-2318) раскрывают полимерные конъюгаты интерлейкина-15 ("ИЛ-15"). Однако конъюгированный ИЛ-15, описанный в данной ссылке, не только терял свою ИЛ-2-подобную активность стимуляции роста в результате связывания полимеров с остатками лизина в областях белка, которые участвуют в связывании рецептора, но и демонстрировал антагонизм, а не агонизм. Авторы заключают, что селективное ингибирование связывания ИЛ-15 с одним из нескольких клеточных поверхностных рецепторов может быть следствием конъюгирования полимера и может не только снизить уровень связывания с рецептором, но и привести в реверсии биологического эффекта белка. Избегая спаривания полимеров с частями рецепторсвязывающего белка, которые участвуют во взаимодействиях со своими рецепторами, в данном изобретении избегают данного нежелательного следствия связывания полимеров.J. Hakimi et al. (патенты США 5792834 и 5834594) раскрывает уретансвязанные конъюгаты ПЭГ с белками, включая интерферон-, ИЛ-2, интерлейкин-1 ("ИЛ-1") и антагонист рецептора ИЛ-1, которые,как сообщают, были получены с целью снижения иммуногенности, повышения растворимости и увеличения биологического полупериода существования соответствующих белков. В данных ссылках ПЭГ был связан с "различными свободными аминогруппами" без ссылки на N-концевое ПЭГилирование и без описания того, что N-концевые -аминогруппы могут или должны быть ПЭГилированными. Данные патенты устанавливают также, что конъюгат, описанный в данном контексте, "имеет по меньшей мере часть" первоначальной биологической активности исходного белка, указывая таким образом на возможную потерю значительной биоактивности. Данный результат согласовывался бы с использованием способов ненаправленного ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте. В противоположность данному изобретению эти патенты не раскрывают никаких попыток улучшить сохранение биоактивности их конъюгатов путем изменения селективности процессов ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте.O.B.Kinstler et al. (европейская патентная заявкаЕР 0822199 А 2) раскрывает способ проведения реакции полиэтиленгликоля с -аминогруппой аминокислоты на аминоконце полипептида, в особенности консенсусного интерферона и G-CSF, которые представляют собой два из белков, производимыхAmgen, Inc., представителем данной патентной заявки. Данная публикация показывает, что "значение рН, достаточно кислое для селективной активации -аминогруппы", является необходимым признаком описанного способа. Напротив, в настоящем изобретении описано, что снижение рН уменьшает реакционность аминогрупп с альдегидами ПЭГ и что -аминогруппа является более реакционной, когда она непротонирована, т.е. при значении рН выше ее pKa. Так, авторы обнаружили, что никакая величина рН не является "достаточно кислой, для того чтобы селективно активировать -аминогруппу" любого из RN цитокиновых конъюгатов, соответствующих данному изобретению. Объяснения рН-зависимости реакционности N-концевых -аминогрупп с альдегидами, приведенные в работах J.T. Edsall, (см. выше) иR.S. Larsen et al. 2001), Bioconjug. Chem., 12:861-869), более совместимы с опытом настоящих авторов. Более того, Kinstler et al. сообщают о применении N-концевого ПЭГилирования полипептидов для получения повышенной гомогенности полученных в результате конъюгатов и защиты аминоконца от разложения протеиназами, но не раскрывает, что N-концевое ПЭГилирование может сохранить более высокую фракцию рецепторсвязывающей активности ряда рецепторсвязывающих белков (см., например,публикацию РСТWO 96/11953; европейский патентЕР 0733067 В 1 и патенты США 5770577,5824784 и 5985265, все выданные Kinstler О.В. et al.). В европейской заявке Kinstler et al. (ЕР 0822199 А 2) также обобщают преимущества N-концевого ПЭГилирования для всех полипептидов, которые не входят в круг интересов авторов данного изобретения. В частности, поскольку аминоконцы молекул антител расположены проксимально антигенсвязывающему участку белков антител (см. статью Chapman A.P., (2002), Adv. Drug Deliv. Rev., 54:531545), N-концевое ПЭГилирование антител неожиданно вредно сказывается на биоактивности по сравнению со случайным ПЭГилированием остатков лизина, как раскрывает Larsen R.S. et al., см. выше. Аналогично ожидают, что N-концевое ПЭГилирование рецепторсвязывающих белков, которые не являются"RN" рецепторсвязывающими белками, например, интерферона- (см. фиг. 8), будет больше ингибировать взаимодействия с рецепторами, чем случайное ПЭГилирование остатков лизина таких рецепторсвязывающих белков. Таким образом, как отмечено выше, способы, соответствующие данному изобретению, отличаются от тех, которые раскрывают Kinstler et al. в публикациях, приведенных в данном контексте, в том плане,что конъюгаты, соответствующие данному изобретению, получают путем конъюгирования одного или более цитокина или их антагонистов, которые выбраны как RN рецепторсвязывающие белки с одним или более полимеров путем формирования смеси лиганда(ов) и одного или более полимера при значении рН приблизительно от 5,6 до приблизительно 7,6; приблизительно от 5,6 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,0 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,5 до приблизительно 7,0; приблизительно от 6,6 до приблизительно 7,6; приблизительно от 6,6 до приблизительно 7,0; приблизительно 6,6. Напротив, способы Kinstler et al. основаны на конъюгировании лигандов при рН ниже 5,5, причем авторы изобретения обнаружили, что данный интервал является субоптимальным или худшим для получения препаратов лигандов, селективно конъюгированных с полимерами по отдаленным N-концевым аминокислотам и/или по отдаленным центрам гликозилирования.Pepinsky В. et al. (публикация РСТWO 00/23114 и публикация патентной заявки США 2003/0021765 А 1) раскрывают полимерные конъюгаты гликозилированного интерферона 1 а, которые более активны, чем негликозилированный интерферон 1b в анализе на антивирусную активность. Когда Pepinsky et al. спаривали мПЭГ молекулярной массой 5 или 20 кДа с аминоконцом ИФН 1 путем восстановительного алкилирования, не было обнаружено никакого эффекта ПЭГилирования на антивирусную активность, тогда как связывание ПЭГ более высокой молекулярной массы снижало или устраняло активность. Данная ссылка раскрывает также, что полиалкиленгликоль может быть связан с интерфероном 1 а через множество связывающих групп в различных положениях, включая аминоконец, карбоксильный конец и углеводную часть гликозилированного белка. Однако установлено, что способы,описанные в данной публикации, не могут быть обобщены: "данные исследования показывают, что, несмотря на сохранение консервативности между последовательностями интерферона 1 а и интерферона-1b, они представляют собой различные биохимические структуры и, вследствие этого многое из того,что известно об интерфероне 1b, не применимо к интерферону 1 а, и наоборот". Напротив, данное изобретение раскрывает общие черты, присущие "RN" и "RG" рецепторсвязывающим белкам, как определено в данном контексте. Согласно данному изобретению и интерферон 1 а, и интерферон -1b являются "RN" рецепторсвязывающими белками. Кроме того, интерферон -1b представляет собой "RG" рецепторсвязывающий белок. Соответственно, в противоположность способам, соответствующим заявкеWO 00/23114, способы, соответствующие данному изобретению, используют для получения стабильных биоактивных конъюгатов как интерферона 1b, так и интерферона 1 а.Z. Wei et al. (патент США 6077939) раскрывают способы связывания водорастворимых полимеров (в особенности ПЭГ) с N-концевым -углеродным атомом полипептида (в особенности эритропоэтина), где амин на -углероде N-концевой аминокислоты сначала трансаминируют до получения карбонильной группы, которая затем реагирует с производным ПЭГ с образованием оксима или гидразоновой связи. Хотя описанным объектом данной ссылки была разработка способа, который был бы применим к белкам в целом, не дается никаких предположений относительно сохранения рецепторсвязывающей активности, которое может быть результатом выбора аминоконца как центра ПЭГилирования ряда рецепторсвязывающих белков. Таким образом, в противоположность описанию Wei et al., в данном изобретении не требуется отдаления N-концевой -аминогруппы, напротив, можно сохранить заряд Nконцевой -аминогруппы при нейтральном значении рН посредством формирования вторичной аминной связи между белком и полимером.C.W. Gilbert et al. (патент США 6042822; европейский патентЕР 1039922 В 1) раскрывают желательность использования смеси позиционных изомеров ПЭГ-интерферон 2b, где особенно желательный изомер содержит ПЭГ, связанный с остатком гистидина интерферона 2b, в особенности гистидина-34, и демонстрируют, что связь ПЭГ с гистидином-34 нестабильна. Поскольку гистидин-34 лежит на поверхности интерферона 2b в области, которая должна находиться в тесном контакте с рецептором интерферона, чтобы включать сигнальную трансдукцию (см. фиг. 1b настоящего описания), нестабильность связи между ПЭГ и гистидином-34, описанная в данных ссылках, по-видимому, является важной для функции описанного в данном контексте конъюгата ПЭГ-интерферон. Практически чистые связанные через гистидин полимерные конъюгаты белков описаны S. Lee et al., см. патент США 5985263. Напротив, настоящее изобретение демонстрирует, что одним из предпочтительных конъюгатов является конъюгат ПЭГ-интерферон, где ПЭГ стабильно связан с центром, который отдален от рецепторсвязывающих доменов интерферонового компонента.P. Bailon et al. (2001), Bioconjug. Chem., 12:195-202, раскрывает, что интерферон 2 а, который ПЭГилирован одной молекулой ди-мПЭГ-лизина с молекулярной массой 40 кДа/молекулу интерферона,состоит из четырех основных позиционных изомеров. В данной ссылке описывают, что почти все из ПЭГ присоединены амидными связями к лизинам 31, 121, 131 или 134, каждый из которых находится или принажлежит к рецепторсвязывающим доменам интерферона 2 а (остатки 29-35 и 123-140, согласно данным Bailon et al.; см. фиг. 1 а настоящего описания). N-концевое ПЭГилирование не было описаноBailon et al. Сообщают, что антивирусная активность выделенной смеси позиционных изомеров ПЭГинтерферона в отношении инфекции вируса везикулярного стоматита клеток бычьей почки Madin-Darbyin vitro составляет 7% от уровня неконъюгированного интерферона 2 а, который был тестирован. Существенная потеря биоактивности, которую наблюдают у данных конъюгатов ПЭГ-интерферона, не включает ПЭГилированный по N-концу интерферон, что, таким образом, четко отделяет конъюгаты,предложенные Bailon et al., от конъюгатов, соответствующих данному изобретению.R.B. Pepinsky et al. 2001), J. Pharmacol. Exp. Then, 297:1059-1066) раскрывают синтез конъюгата,состоящего из (1) гликозилированного интерферона 1 а, имеющего N-концевой остаток метионина и (2) ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 20 кДа. Конъюгат, который в данной ссылке рассматривают как моноПЭГилированный по N-концевому метионину, как показывают, сохраняет полную биоактивность в анализе на антивирусную активность. Хотя данные авторы описывают, что их выбор N-концевого центра для ПЭГилирования гликозилированного интерферона 1 а был продиктован доступностью реагентов для центр-селективного ПЭГилирования и молекулярного моделирования, они признают, что "некоторые эффекты являются специфическими для продукта". Более того и в противоположность данному изобретению, описанные в данном контексте наблюдения не были обобщены так, чтобы включить класс рецепторсвязывающих белков, которые определены в данном контексте как "RN" рецепторсвязывающие белки.J. Burg et al. (публикация РСТWO 01/02017 А 2) раскрывает получение алкоксиПЭГ-конъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей метоксиПЭГ реагировала/реагировали с сульфгидрильными группами, которые были химически интродуцированы посредством модификации-аминогрупп остатков лизина на поверхности гликопротеина. Однако в противоположность данному изобретению данная ссылка не раскрывает никаких попыток связать ПЭГ со свободной -аминогруппойN-концевой аминокислоты эритропоэтина или избежать модификации остатков лизина в областях гликопротеина эритропоэтина, которые являются основными во взаимодействиях с эритропоэтиновыми рецепторами.J. Burg et al. (публикация РСТWO 02/49673 А 2) раскрывает синтез связанных через N-концевой амид конъюгатов ПЭГ с природными и мутеиновыми гликопротеинами эритропоэтина способом, в котором используют селективно отщепляемые удлинения N-концевого пептида, которые отщепляют перед ПЭГилированием и после обратимого цитраконилирования всех -аминогрупп остатков лизина гликопротеина. Описанный рациональный момент для многостадийного процесса в данной ссылке состоял в- 23008866 том, чтобы сделать процесс ПЭГилирования селективным в отношении свободных -аминогрупп Nконцевой аминокислоты с целью получения гомогенных моноПЭГилированных конъюгатов, избегая,таким образом, необходимости отделять моноПЭГилированные конъюгаты от множественно ПЭГилированных производных. Данный способ отличается от способа, соответствующего данному изобретению по ряду важных аспектов, включая, но без ограничения перечисленным:(1) подход Burg et al. ограничен гликопротеинами эритропоэтина, к которым алкоксиПЭГ присоединен через амидные связи, тогда как данное изобретение применимо к множеству биоактивных компонентов, конъюгированных при использовании множества синтетических полимеров;(2) данное изобретение касается как гликозилированных, так и негликозилированных "RN" и "RG" рецепторсвязывающих белков, тогда как Burg et al. раскрывают только конъюгирование гликопротеинов;(3) данное изобретение охватывает как алкоксиПЭГ, такие как мПЭГ, так и монофункционально активированные гидроксиПЭГ, тогда как Burg et al. раскрывает только применение алкоксиПЭГ;(4) в данном изобретении вторичные аминные связи между полимером и белком предпочтительны относительно амидных связей, использованных Burg et al., поскольку последние более стабильны и сохраняют положительный заряд на аминогруппе. В аналогичной работе этой же группы J. Burg et al. (патент США 6340742) раскрывают получение связанных с амидом конъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей алкоксиПЭГ связана/связаны с от одной до трех аминогрупп белка. Однако, в противоположность данному изобретению, в этой ссылке не сообщают о предпочтительности -аминогрупп N-концевой аминокислоты или аминогрупп, которые не находятся в областях, которые участвуют во взаимодействиях с рецепторами. С. Delgado et al. (патент США 6384195) раскрывает конъюгаты гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, который получают при использовании реакционного полимера, который представлен как трезилмонометоксиПЭГ и обозначен в данном контексте как "ТМПЭГ". Данная ссылка показывает, что, когда ТМПЭГ контактирует с рекомбинантным человеческим GM-CSF, "модифицированный материал содержит молекулы, не обладающие активностью и имеющие более высокую активность, чем немодифицированный материал". Как легко может понять обычный специалист, присутствие молекул, не обладающих активностью, нежелательно в смеси конъюгатов полимер-биоактивный компонент, в особенности в композициях для терапевтического применения, которые содержат такие конъюгаты, поскольку они могут способствовать возникновению риска введения конъюгата нуждающемуся в данном введении пациенту, не участвующего в создании положительных эффектов. Как отмечено в данном контексте, настоящее изобретение преодолевает это ограничение в области техники по меньшей мере в части избежания модификации GM-CSF и других рецепторсвязывающих белков в центрах на белках, которые участвуют в их рецепторсвязывающей активности, снижая таким образом или устраняя синтез молекул, не обладающих никакой активностью. Данное изобретение представляет также способы фракционирования и очистки конъюгатов, которые имеют различные размеры, разные заряды и/или различные степени защиты зарядов на белке посредством полимера (см. фиг. 9-12). Заслуживает внимания, что в патенте США 6384195 не упоминают N-концевое ПЭГилированиеGM-CSF и, вследствие этого, не признают преимуществ способов, соответствующих данному изобретению. Наконец, патент США 6384195 показывает преимущество конъюгатов, в которых более чем одна молекула ПЭГ связана с каждой молекулой GM-CSF, без какого-либо анализа того, где на молекуле GMCSF присоединены данные молекулы ПЭГ (отличные от связанных с остатками лизина). Утверждая предпочтительность конъюгатов, содержащих до шести молекул ПЭГ/молекулу GM-CSF, ссылка, таким образом, утверждает предпочтительность конъюгатов, в которых ПЭГ мог быть присоединен ко всем возможным остаткам лизина, обеспечивая тем самым, что ПЭГ будет присоединен в положениях, которые стерически затрудняют близкий подход белка к его клеточным поверхностным рецепторам(см. фиг. 3 данного описания). Напротив, настоящее изобретение показывает нежелательность связывания ПЭГ с остатками лизина, за исключением тех случаев, когда данные остатки лизина отдалены от доменов рецепторсвязывающего белка, которые являются основными для взаимодействий с рецепторами и,следовательно, для сигнальной трансдукции (в случае агонистов) или для конкурентного ингибирования сигнальной трансдукции (в случае антагонистов). Т. Nakamura et al. (публикация РСТWO 02/32957 А 1) показывает, что увеличение молекулярной массы ПЭГ, который связан с -аминогруппой остатка лизина в положении 52 гликопротеина эритропоэтина, повышает эритропоэтический эффект конъюгата in vivo при снижении аффинности конъюгата в отношении эритропоэтиновых рецепторов. Однако в противоположность данному изобретению ссылка не раскрывает связывание ПЭГ на аминоконце или около центра гликозилирования и не признает какихлибо преимуществ осуществления этого. Следовательно, данное изобретение представляет конъюгаты биоактивных компонентов, связанные с синтетическими полимерами, которые имеют различные структурные и функциональные преимущества относительно тех, которые были описаны ранее.- 24008866 Композиции Изобретение представляет конъюгаты или комплексы, содержащие один или более биоактивных компонентов, соответственно один или более цитокинов, связанных с одним или более стабилизирующих полимеров, таких как один или более ПЭГ. Как правило, данные конъюгаты получают способами,соответствующими данному изобретению, описанными в данном контексте; однако, конъюгаты, имеющие структуры и активности, описанные в данном контексте, независимо от способов, использованных для получения данных конъюгатов, считают эквивалентными тем, которые получены данными способами, и вследствие этого они охватываются данным изобретением. В близких аспектах изобретение представляет также композиции, содержащие один или более таких конъюгатов или комплексов. Композиции, соответствующие этому аспекту изобретения, должны содержать один или более (например, один,два, три, четыре, пять, десять и т.п.) вышеописанных конъюгатов или комплексов, соответствующих изобретению. В ряде таких аспектов композиции могут содержать один или более дополнительных компонентов, таких как одна или более буферных солей, один или более хаотропных агентов, один или более детергентов, один или более белков (например, альбумин или один или более ферментов), один или более несвязанных полимеров, один или более осмотически активных агентов и т.п. Композиции, соответствующие данному аспекту изобретения, могут быть в любой форме, включая твердую форму (например, сухой порошок) или раствор (в частности, в форме физиологически совместимого забуференного солевого раствора, содержащего один или более конъюгатов, соответствующих изобретению). А. Фармацевтические композиции. Некоторые композиции, соответствующие изобретению, в частности, приготовлены для применения в качестве фармацевтических композиций для использования в профилактических, диагностических или терапевтических приложениях. Данные композиции, как правило, будут содержать один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Термин "фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель", как используют в данном контексте, относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному составу любого типа, который может переноситься животным-реципиентом, включая человека или другое млекопитающее, которому введена фармацевтическая композиция, без вредных эффектов, происходящих от их добавления. Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены реципиенту посредством любого подходящего способа введения, такого как перорально, ректально, парентерально,внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (как в виде порошков, мазей, капель или чрескожного пластыря), защечно, как пероральный или назальный спрей или путем ингаляции. Термин "парентеральный", как используют в данном контексте, относится к способам введения, которые включают внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Фармацевтические композиции, представленные в данном изобретении для парентеральной инъекции, могут содержать фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления с образованием стерильных инъекционных растворов или дисперсий перед применением. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или инертных наполнителей включают воду, этанол,полиолы (такие как глицерин и т.п., пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), карбоксиметилцеллюлозу и их приемлемые смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую сыпучесть можно поддерживать, например,посредством применения покрывающих материалов, таких как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ. Данные фармацевтические композиции, соответствующие настоящему изобретению, могут также содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение действия микроорганизмов может быть обусловлено включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, бензилового спирта, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Может также потребоваться включение осмотических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть осуществлено включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия, гидрогели и желатин. В ряде случаев для того, чтобы пролонгировать эффект лекарственных препаратов, требуется замедлить всасывание из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить посредством применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в водных жидкостях тела. Скорость всасывания лекарственного препарата тогда зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от его физической формы. Альтернативно замедленное всасывание парентерально введенной лекарственной формы можно осуществить путем растворения или суспендирования лекарственного препарата в масляном носителе.- 25008866 Инъекционные депо-формы получают формированием микроинкапсулированных матриц лекарственного препарата в биоразрушаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарства к полимеру-носителю и природы конкретного используемого полимераносителя, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного препарата. Примеры других биоразрушаемых полимеров включают биосовместимые полиортоэфиры и полиангидриды. Инъекционные депо-препараты также готовят путем захватывания лекарственного препарата липосомами или микроэмульсиями, которые совместимы с тканями тела. Инъекционные препараты могут быть простерилизованы, например, путем фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, или посредством введения стерилизующих агентов в форме стерильной твердой композиции, которую можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением. Твердые дозированные формы для перорального применения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В данных твердых дозированных формах активные соединения смешивают по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или: а) инертными наполнителями, либо агентами для увеличения объема, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота;d) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, ряд силикатов и карбонат натрия; е) агентами, замедляющими растворение, такими как парафин;f) ускорителями всасывания, такими как соединения четвертичного аммония;h) адсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина;i) скользящими агентами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый ПЭГ, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции подобного типа могут быть использованы также в качестве наполнителей в мягких и твердых наполненных желатиновых капсулах при использовании таких наполнителей как лактоза (молочный сахар), а также высокомолекулярный ПЭГ и т.п. Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно приготовить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные и хрономодулирующие покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области приготовления фармацевтических препаратов. Они могут необязательно содержать рентгеноконтрастные агенты и могут также быть такой композиции, при которой они высвобождают активный ингредиент(ы) только или предпочтительно в определенной части желудочнокишечного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры композиций для заключения в них агентов, которые могут быть использованы, включают полимерные субстанции и воска. Активные соединения также могут быть в микроинкапсулированной форме, при необходимости, с одним или более вышеуказанным наполнителем. Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений, жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, из проростков растений, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидофурфуриловый спирт, ПЭГ и сорбитановые сложные эфиры жирных кислот и их смеси. Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать вспомогательные агенты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и отдушки. Суспензии, кроме активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты как, например,этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар, трагакант и их смеси. Наружное применение включает нанесение на кожу или слизистую оболочку, включая поверхности легкого и глаза. Композиции для наружного применения, включая предназначенные для ингаляции, могут быть приготовлены в виде сухого порошка, который может находиться под давлением или не находиться под давлением. В композициях порошка, не находящегося под давлением, активные ингредиенты в тонко измельченной форме могут быть использованы в смеси с более крупным по размеру фармацевтически приемлемым инертным носителем, содержащим частицы, имеющие размер, например до 100- 26008866 микрометров в диаметре. Подходящие инертные носители включают сахара, такие как лактоза и сахароза. Желательно, чтобы по меньшей мере 95 мас.% частиц активного ингредиента имело эффективный размер частиц в интервале от 0,01 до 10 мкм. Альтернативно фармацевтическая композиция может находиться под давлением и содержать сжатый газ, такой как азот, или сжиженный газ-пропеллент. Сжиженная среда пропеллента и вся композиция в целом могут быть предпочтительно такими, что активные ингредиенты не растворяются в ней до любой существенной степени. Композиция, находящаяся под давлением, содержит также поверхностноактивный агент. Поверхностно-активный агент может представлять собой жидкий или твердый неионогенный поверхностно-активный агент или может быть твердым анионогенным поверхностно-активным агентом. Предпочтительно использовать твердый анионогенный поверхностно-активный агент в форме натриевой соли. Следующая форма для наружного применения представляет собой форму для введения в глаз. В данном способе введения конъюгаты или композиции, соответствующие изобретению, доставляют в фармацевтически приемлемом глазном носителе, так что активные соединения находятся в контакте с поверхностью глаза в течение достаточного периода времени, чтобы обеспечить проникновение соединений в конъюнктиву или роговицу и внутренние области глаза, как например, в переднюю камеру, заднюю камеру, стекловидное тело, водянистую влагу, жидкую часть стекловидного тела, роговицу, радужную оболочку/ресничное тело, хрусталик, сосудистую оболочку/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемый глазной носитель может, например, быть мазью, растительным маслом или инкапсулирующим материалом. Композиции для ректального или вагинального введения представлены предпочтительно суппозиториями, которые могут быть получены при смешивании конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, ПЭГ или воск для суппозиториев, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и вследствие этого плавится в прямой кишке и полости вагины и высвобождает лекарственные препараты. Фармацевтические композиции, используемые в данных терапевтических способах, могут быть также введены в форме липосом. Как известно в области техники, липосомы, как правило, получают из фосфолипидов или других липидных субстанций. Липосомы формируют одно- или многослойные гидратированные жидкие кристаллы, которые диспергированы в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный формировать липосомы. Кроме одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, данные фармацевтические композиции в липосомальной форме могут также содержать один или более стабилизаторов, консервантов, наполнителей и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как естественные, так и синтетические. Способы формирования липосом известны в области техники (см., например, Zalipsky S. et al., патент США 5395619). Липосомы, которые содержат фосфолипиды, конъюгированные с ПЭГ, чаще всего фосфатидилэтаноламин, связанный с монометокси-ПЭГ, имеют перспективные свойства, включая пролонгированные периоды существования в системе кровообращения млекопитающих (Fisher D., патент США 6132763). В. Применение. Как отмечено в другом месте в данном контексте, способы, конъюгаты и композиции, соответствующие данному изобретению, преимущественно применяют в способах поддержания или повышения биоактивности биологических компонентов, не нарушая способности биологических компонентов связываться со своими рецепторами. Некоторые такие способы, соответствующие изобретению, могут осуществлять доставку одного или более конъюгатов и композиций в клетки, ткани, органы или организмы. В частности, изобретение представляет контролируемую доставку одного или более компонентов конъюгатов, комплексов или композиций в клетки, ткани, органы или организмы, давая тем самым пользователю возможность регулировать во времени и пространстве количество определенного компонента, которое высвобождается для воздействия на клетки, ткани, органы или организмы. В общем данные способы, соответствующие изобретению, включают одну или более активностей. Например, один из таких способов, соответствующих изобретению, предусматривает:(а) получение одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, как детально описано в данном контексте;(b) контактирование одной или более клеток, тканей, органов или организмов с одним или более конъюгатов или композиций в условиях, способствующих связыванию одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с клетками, тканями, органами или организмами. После того как биоактивные компоненты конъюгатов и/или композиций соответствующих изобретению, связываются (или в ряде случаев интернализуются) клетками, тканями, органами или организмами, компоненты продолжают осуществлять свои заданные биологические функции. Например, пептидные компоненты могут связываться с рецепторами или другими компонентами на или в клетках, тканях,органах или организмах, участвовать в метаболических реакциях в клетках, тканях, органах или организмах, осуществлять, стимулировать, или активировать, или проводить даунрегуляцию, или ингибиро- 27008866 вать одну или более ферментативных активностей в клетках, тканях, органах или организмах, давать утраченный структурный компонент клеткам, тканям, органам или организмам, обеспечивать одну или более питательных потребностей клеток, тканей, органов или организмов, ингибировать, лечить, реверсировать или иным образом облегчать один или более процессов или симптомов заболевания или физического нарушения и т.п. В дополнительных вариантах осуществления конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в промышленных клеточных культурах вследствие неожиданно высоких активностей биоактивных компонентов конъюгатов, которые получают как результат комбинированных эффектов существенного сохранения их биоактивности и увеличенной продолжительности действия даже в условиях промышленного применения. Данные неожиданно высокие активности настоящих конъюгатов могут привести к необычайно высокой продукции биомассы, необычайно высоким уровням экспрессии рекомбинантных белков и другим усовершенствованиям эффективности биопроцессинга. С. Схемы дозирования. Конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены in vitro, ex vivo или in vivo в клетки, ткани, органы или организмы с целью доставки в них одного или более биоактивных компонентов (т.е. одного или более цитокинов или их антагонистов). Обычный специалист должен принимать во внимание, что эффективные количества данного активного соединения, конъюгата,комплекса или композиции можно определить эмпирически и можно использовать в очищенной форме или, если данные формы имеются, в форме фармацевтически приемлемого препарата или пролекарства. Соединения, конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены нуждающемуся в этом больному животному (включая млекопитающее, такое как человек) в виде ветеринарных или фармацевтических композиций в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей. Уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая тип и степень клеточного ответа, которого хотят достигнуть, идентичность и/или активность используемого специфического соединения(ий), конъюгата(ов),комплекса(ов) или композиции(ий), возраст, массу или площадь поверхности тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента, время введения, способ введения и скорость выведения активного соединения(ий), продолжительность лечения, другие лекарственные препараты, применяемые в комбинации или одновременно со специфическим соединением(ями), конъюгатом(ами), комплексом(ами) или композицией(ями) и подобные факторы, которые хорошо известны обычным специалистам в области фармацевтики и медицины. Например, в рамках обычной компетенции в данной области правильно начать с доз данного соединения, конъюгата, комплекса или композиции, соответствующих изобретению, на уровнях ниже, чем те, которые требуются для достижения желательного терапевтического эффекта и постепенно повышать дозировки до тех пор, пока не будет достигнуто желательного эффекта. Схемы дозирования могут быть также подобраны с учетом конкретного больного с целью получения заданной концентрации данного активного соединения в крови, как определено с помощью методик,принятых и рутинных для данной области техники, например, гель-фильтрации (эксклюзии по размеру),ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ("ВЭЖХ"), биоанализов или иммуноанализов. Таким образом, схемы дозирования для пациента можно подобрать с целью достижения относительно постоянных уровней в крови, как определяют с помощью ВЭЖХ или иммуноанализов согласно способам, которые являются рутинными и знакомы обычным специалистам в областях медицины, фармацевтики и/или фармакологии.D. Диагностическое и терапевтическое применение. Диагностическое применение конъюгата, соответствующего изобретению, могло бы быть проведено для определения положения клеток или тканей, имеющих необыкновенно высокую способность связывания с цитокином, например, рака в теле животного, в особенности человека, путем введения конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, в которых конъюгат (или один или более компонентов, т.е. биоактивный компонент и/или синтетический полимер) помечен или содержит одну или более определяемых меток, чтобы обеспечить определение, например, посредством оптической, радиометрической, флуоресцентной или резонансной детекции согласно способам, известным в области техники. Например, в большинстве случаев немелкоклеточный рак легкого экспрессирует необычно высокие концентрации рецепторов для эпидермального фактора роста (см. статью Bunn P.А. et al. (2002), Semin.Oncol., 29 (Suppl 14):38-44). Вследствие этого в другом аспекте изобретения конъюгаты и композиции,соответствующие изобретению, могут быть использованы в диагностических или терапевтических способах, например в диагностике, лечении или предупреждении множества физических нарушений у животного, в частности млекопитающего, такого как человек, предрасположенный или страдающий от такого нарушения. В данных подходах целью терапии является приостановить или предупредить развитие нарушения и/или вылечить, вызвать ремиссию или поддержать ремиссию нарушения и/или снизить или минимизировать побочные эффекты других терапевтических схем. Следовательно, конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для защиты, супрессии или лечения физических нарушений, таких как инфекции или заболевания. Термин "защита" от физического нарушения, как используют в данном контексте, ох- 28008866 ватывает "предупреждение", "супрессию" и "лечение". "Предупреждение" включает введение комплекса или композиции, соответствующих изобретению, до индуцирования заболевания или физического нарушения, тогда как "супрессия" включает введение конъюгата или композиции до клинического проявления заболевания, следовательно, "предупреждение" и "супрессию" физического нарушения, как правило,предпринимают у животного, которое предрасположено или является чувствительным к нарушению, но которое еще не страдает от него. Однако "лечение" физического нарушения включает введение терапевтического конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, после проявления заболевания. Следует иметь в виду, что в медицине и ветеринарии не всегда возможно провести границу между "предупреждением" и "супрессией" физического нарушения. Во многих случаях первичное индуцирующее событие или события могут быть неизвестными или латентными, и ни пациент, ни врач могут быть не осведомлены об индуцирующем событии достаточно долго после его появления. Вследствие этого обычно используют термин "профилактика" как отличный от термина "лечение" для того, чтобы охватить как "предупреждение", так и "супрессию", как определено в данном контексте. Поэтому термин"защита", используемый согласно способам, соответствующим данному изобретению, подразумевает включение термина "профилактика". Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать одну или более стадий, которые позволяют клиническому врачу достигнуть вышеописанных терапевтических целей. Один из таких способов, соответствующих изобретению, может предусматривать, например: (а) выявление животного (предпочтительно млекопитающего, такого как человек), страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению, и (b) введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих данному изобретению, как описано в данном контексте, так что введение конъюгата, комплекса или композиции предупреждает, задерживает или диагностирует развитие или излечивает либо вызывает ремиссию физического нарушения у животного. Как используют в данном контексте, животное, которое "предрасположено к" физическому нарушению определяют как животное, которое не проявляет множества явных физических симптомов нарушения, но которое генетически, физиологически или иным образом имеет риск развития нарушения. В данных способах выявление животного (такого как млекопитающее, включая человека), которое предрасположено к или имеет риск либо страдает от данного физического нарушения, может быть осуществлено согласно стандартным известным в области техники способами, которые должны быть известны врачу обычной квалификации, включая, например, радиологические анализы, биохимические анализы(например, анализы относительных уровней определенных пептидов, белков, электролитов и т.п., в образце, полученном от животного), хирургические способы, генетический скрининг, семейный анамнез,физическую пальпацию, патологические и гистологические тесты (например, микроскопическое исследование ткани или образцов жидкостей тела или мазков, иммунологические анализы и т.п.), тестирование жидкостей тела (например, крови, сыворотки, плазмы, спинномозговой жидкости, мочи, слюны,спермы и т.п.), визуализацию (например, радиологическую, флуоресцентную, оптическую, резонансную(например, с использованием ядерного магнитного резонанса ("ЯМР") или резонанса спина электрона("ESR", и т.п. После выявления животного с помощью одного или более данных способов животное можно активно и/или профилактически лечить с целью предупреждения, супрессии, задержки развития или излечения физического нарушения. Физические нарушения, которые можно предупредить, диагностировать или лечить с использованием конъюгатов, комплексов, композиций и способов, соответствующих данному изобретению, включают любые физические нарушения, для которых биоактивный компонент (как правило, цитокин или его антагонист) конъюгатов или композиций может быть применен при предупреждении, диагностике или лечении. Данные нарушения включают, но без ограничения перечисленным, многие формы рака (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичников, рак простаты, рак яичка, лейкозы, лимфомы, рак легкого, неврологический рак, рак кожи, рак головы и шеи, рак костей, рак толстой кишки и другие желудочно-кишечные формы рака, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки и другие карциномы, саркомы, аденомы и миеломы), ятрогенные заболевания, инфекционные заболевания (например, бактериальные заболевания, грибковые заболевания, вирусные заболевания (включая гепатит,заболевания, вызываемые кардиотропными вирусами, ВИЧ/СПИД и т.п.), паразитарные заболевания и т.п.), генетические нарушения (например, кистозный фиброз, боковой амиотрофический склероз, мышечную дистрофию, болезнь Гоше, болезнь Помбе, нарушение типа тяжелого комбинированного иммунодефицита, карликовость и т.п.), анемию, нейтропению, тромбоцитопению, гемофилию и другие нарушения крови, нейродегенеративные нарушения (например, рассеянный склероз ("MS", включая, но без ограничения перечисленным рецидивирующий-ремиттирующий MS, первичный прогрессирующий MS и вторичный прогрессирующий MS и т.п.), болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п., ферментативные нарушения (например, подагру, уремию, гиперхолестеринемию и т.п.), нарушения неясной и многоочаговой этиологии (например, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, воспалительную болезнь кишки и т.п.), аутоиммунные нарушения (например, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, псориаз и т.п.) и другие важные с точки зрения медицины нарушения, которые должны быть хорошо знакомы обычному специалисту. Конъюгаты, комплексы, композиции и способы, соответст- 29008866 вующие данному изобретению, могут быть также использованы для предупреждения прогрессирования заболевания, например для химиопрофилактики развития предзлокачественного повреждения в злокачественное повреждение. Таким образом, в терапевтических способах, соответствующих изобретению, используют один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, или одну или более фармацевтических композиций, соответствующих изобретению, которые могут быть введены нуждающемуся в этом животному множеством способов введения, в том числе перорально, ректально, парентерально (включая внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию), внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (например, в виде порошков, мазей, капель или чрескожных пластырей), защечно, в виде орального или назального спрея или путем ингаляции. В рамках изобретения эффективное количество конъюгатов, комплексов или композиций можно ввести in vitro, ex vivo или in vivo в клетки или животным, страдающим от или предрасположенным к определенному нарушению, таким образом,предупреждая, задерживая развития, осуществляя диагностику или лечение нарушения у животного. Как используют в данном контексте, выражение "эффективное количество конъюгата (или комплекса либо композиции)" относится к количеству, в котором данный конъюгат (или комплекс или композиция) реализует биологическую активность биоактивного компонента (т.е. цитокина или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции, тем самым предупреждая, задерживая развитие, осуществляя диагностику, лечение или излечение физического нарушения у животного, которому был введен конъюгат,комплекс или композиция, соответствующие изобретению. Обычный специалист будет принимать во внимание, что эффективные количества конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, можно определить эмпирически согласно стандартным методам, хорошо известным обычным специалистам в области фармацевтики и медицины; см., например работу под ред. Beers M.H. et al.(1999), Руководство по диагностике и терапии Merck (Merck Manual of DiagnosisTherapy), 17-е изд.,Merck и Co., Rahway, NJ; монографию под ред. Hardman J.G. et al. (2001) Фармакологическая основа терапевтических препаратов Гудмана и Джилмана (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofT.M. et al. (1997), Лекарственная терапия Авери (Avery's Drug Treatment), 4-е изд., Adis International,Auckland, New Zealand; монографию Katzung B.G., (2000), Общая и клиническая фармакология (BasicClinical Pharmacology), 8 изд., Lange Medical Books/McGraw-Hill, New York, данные ссылки и ссылки,приведенные в указанных изданиях, полностью включены в данном контексте в виде ссылки. Следует понимать, что при введении больному человеку общие ежедневные, еженедельные и ежемесячные дозы конъюгатов, комплексов и композиций, соответствующих данному изобретению, будут определяться лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского суждения. Например, удовлетворительные результаты получают при введении определенных конъюгатов, комплексов или композиций,соответствующих изобретению, в соответствующих дозах, зависящих от конкретного используемого биоактивного соединения, причем данные дозы будут хорошо знакомы обычному специалисту, и их легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов. Согласно данному аспекту изобретения конъюгаты, комплексы или композиции можно вводить в один прием или в разделенных дозах, например, один или два раза в день или один или два раза в неделю либо один или два раза в месяц и т.п. Соответствующие схемы дозировок для различных способов введения (например,парентерального, подкожного, внутримышечного, внутриглазного, интраназального и т.п.) легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов или они будут ясно очевидными для обычного специалиста в зависимости от особенностей биоактивного компонента (т.е. цитокина или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции. В дополнительных приложениях конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы для получения специфической направленности диагностического или терапевтического агента на клетку, ткань, орган или организм, который экспрессирует рецептор, связывает, инкорпорирует или иным способом может поглощать биоактивный компонент (т.е. цитокин или его антагонист) конъюгата, комплекса или композиции. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут предусматривать, например, контактирование клетки, ткани, органа или организма с одним или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, которые дополнительно содержат один или более диагностических или терапевтических агентов, причем конъюгат,комплекс или композиция связываются или поглощаются клеткой, тканью, органом или организмом,доставляя, таким образом, диагностический или терапевтический агент в клетку, ткань, орган или организм. Диагностический или терапевтический агент, используемый согласно данному аспекту изобретения, может представлять собой, но без ограничения перечисленным, по меньшей мере один агент, выбранный из нуклеиновой кислоты, органического соединения, белка или пептида, антитела, фермента,гликопротеина, липопротеина, элемента, липида, сахарида, изотопа, углевода, визуализирующего агента,определяемого зонда или их любой комбинации, которая может быть определяемо помечена, как описано в данном контексте. Терапевтический агент, используемый в данном аспекте настоящего изобретения,может обладать терапевтическим эффектом в отношении клетки-мишени (или ткани, органа либо орга- 30
МПК / Метки
МПК: A61K 38/21
Метки: модификаций, конъюгат, продукты, фармацевтические, beta, основе, интерферона, способ, получения, полимерный
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-8866-polimernyjj-konyugat-modifikacijj-interferona-beta-farmacevticheskie-produkty-na-ego-osnove-i-sposob-ih-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Полимерный конъюгат модификаций интерферона – β, фармацевтические продукты на его основе и способ их получения</a>
Способ получения водно-спиртового раствора и продукты, полученные на его основе
Номер патента: 6862
Опубликовано: 28.04.2006
Автор: Сорокин Валерий Николаевич
МПК: A61K 8/34, A61K 8/36, A61K 47/10...
Метки: водно-спиртового, раствора, основе, полученные, продукты, способ, получения
Формула / Реферат:
1. Способ получения водно-спиртового раствора, включающий: а) раздельное протонирование очищенной питьевой воды и ректифицированного этилового спирта; б) раздельное фильтрование целевых продуктов со стадии а) и в) смешивание отфильтрованных продуктов со стадии б), причем указанное протонирование воды осуществляют донорами протонов более сильными, чем вода, а протонирование этилового спирта - донорами протонов, более сильными, чем этиловый спирт....
Способ получения полимера, обладающего бимодальным молекулярно-массовым распределением, способ модификации молекулярно-массового распределения статистического сополимера изобутилена, полимерный продукт и полимерная композиция на его основе
Номер патента: 1222
Опубликовано: 25.12.2000
Автор: Уайт Дональд Эндрю
МПК: C08F 8/00
Метки: молекулярно-массового, получения, статистического, модификации, обладающего, молекулярно-массовым, изобутилена, полимерный, основе, распределением, композиция, способ, продукт, распределения, сополимера, бимодальным, полимерная, полимера
Формула / Реферат:
1. Способ получения полимера, обладающего бимодальным молекулярно-массовым распределением, из полимера, обладающего мономодальным молекулярно-массовым распределением, молекулярная масса которого уменьшается при перемешивании с высокой сдвиговой деформацией необязательно в присутствии инициатора свободнорадикальной полимеризации, характеризующийся тем, что исходный полимер выбирают из группы, включающей полипропилен, сополимеры пропилена и...
Новые 19-норстероиды, замещенные в положении 11&beta, способ и промежуточные продукты для их получения, применение в качестве лекарственных средств и содержащие их фармацевтические композиции
Номер патента: 3133
Опубликовано: 27.02.2003
Автор: Ник Франсуа
МПК: A61K 31/566, A61P 19/10, C07J 41/00...
Метки: 19-норстероиды, лекарственных, замещенные, промежуточные, получения, качестве, продукты, фармацевтические, содержащие, средств, композиции, применение, 11&beta, способ, новые, положении
Формула / Реферат:
1. Соединения общей формулы (I) в которой R1 обозначает атом водорода иди радикал ацил, R2 обозначает радикал (C1-C4)алкил, X обозначает атом галогена или атом водорода, n равно 3, 4 или 5, R3 и R4 обозначает (C1-C4)алкил или R3 и R4 образуют вместе с атомом азота, с которым они связаны, группу пироолидинил или пиперидинил, R5 обозначает OH и R6 обозначает H, (C1-C4)алкил возможно замещенный одним или тремя атомами галогена или R5 и R6...
Производные циклопентанонов, способ их получения и фармацевтические препараты на их основе
Номер патента: 1888
Опубликовано: 22.10.2001
Авторы: Томинага Таканари, Тоно Хидето, Хагийа Митио, Еноки Тацудзи, Нисийама Ейдзи, Като Икуносин, Койама Нобуто, Ву Хуа-Канг, Икаи Кацусиге, Сагава Хироаки, Охноги Хирому
МПК: C07C 323/50, A61K 31/10, A61P 29/00...
Метки: препараты, циклопентанонов, способ, основе, фармацевтические, производные, получения
Формула / Реферат:
1. Соединение следующей формулы [I] или его оптически активный антипод или соль (в которой связь, показанная пунктирной линией в пятичленном кольце, обозначает, что пятичленное кольцо может быть любым циклопентеновым кольцом, имеющим двойную связь, и циклопентановым кольцом, в котором эта связь является насыщенной, и, в случае циклопентенового кольца, Х обозначает ОН, Y обозначает =О и Z обозначает Н, тогда как в случае циклопентанового...
19-норстероиды, галогенированные в положении 17, способы их получения и их применение, промежуточные продукты и фармацевтические композиции, их содержащие
Номер патента: 3325
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Буали Йасмина, Може Жак, Ник Франсуа, Ван Де Вельд Патрик
МПК: A61K 31/56, A61P 19/10, C07J 41/00...
Метки: положении, способы, галогенированные, промежуточные, получения, продукты, фармацевтические, применение, 19-норстероиды, содержащие, композиции
Формула / Реферат:
1. Соединения общей формулы (I) в которой R1 обозначает атом водорода, метил, этил, COCH3, COEt, COPh или CH2Ph, R2 обозначает метил, X обозначает атом галогена, Y обозначает простую связь, O, NH, S, SO или SO2, Z обозначает атом водорода или атом галогена, n равно 2, 3, 4 или 5, или R3 и R4, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или алкил с 1-6 атомами углерода, или R3 и R4 образуют вместе с атомом азота, с которым они связаны, один...
Предыдущий патент: Производные 2-амино-4-оксотиазолидина
Следующий патент: Фунгицидные смеси
Случайный патент: Отбор клеток-хозяев, экспрессирующих белок на высоких уровнях