Белки слияния на основе rage и способы их использования
Номер патента: 12082
Опубликовано: 28.08.2009
Авторы: Ротлейн Роберт, Мджалли Аднан М.М., Тянь Йе Э., Вебстер Джеффри К.
Формула / Реферат
1. Белок слияния, включающий полипептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему СН2 домен иммуноглобулина или часть СН2 домена иммуноглобулина, где полипептид RAGE включает сайт связывания лиганда и где белок слияния не содержит шарнирной области Fc иммуноглобулина.
2. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что:
(a) белок слияния включает междоменный линкер, происходящий из RAGE, а не междоменный шарнирный полипептид, происходящий из иммуноглобулина; или
(b) белок слияния включает (i) междоменный линкер RAGE, который разделяет домены V и Cl RAGE, или (ii) линкер, который разделяет домены С1 и С2 RAGE, расположенные в шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина; или
(c) белок слияния получен удалением шарнирной области Fc иммуноглобулина и заменой ее на полипептид RAGE.
3. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что полипептид RAGE включает междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера RAGE и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего СН2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина.
4. Белок слияния по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что белок слияния включает первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер RAGE, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE и второму междоменному линкеру RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера RAGE, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте иммуноглобулинового домена СН2 или части СН2 домена иммуноглобулина.
5. Белок слияния по п.4, отличающийся тем, что второй междоменный линкер RAGE, непосредственно присоединенный к иммуноглобулиновому домену СН2 или к части иммуноглобулинового домена Сн2, включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, или последовательность, которая на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, или последовательность, которая на 90% ей идентична.
6. Белок слияния по пп.1-3, отличающийся тем, что полипептид RAGE представляет собой один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего СН2 иммуноглобулиновый домен или часть Сн2 домена иммуноглобулина.
7. Белок слияния по п.6, отличающийся тем, что междоменный линкер RAGE, непосредственно присоединенный к СН2 иммуноглобулиновому домену или части СН2 домена иммуноглобулина, включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или последовательность, которая на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или последовательность, которая на 90% ей идентична.
8. Белок слияния по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что сайт связывания лиганда RAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
9. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что полипептид RAGE включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.
10. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептида RAGE представлена в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.
11. Белок слияния по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что полипептид дополнительно включает СН3 домен иммуноглобулина или его часть.
12. Белок слияния по п.11, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептида, включающая Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина, представляет собой или включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38.
13. Белок слияния по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG и IgM.
14. Белок слияния по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
15. Белок слияния по п.14, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой IgG1.
16. Белок слияния, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 37.
17. Белок слияния по п.16, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 34.
18. Белок слияния, кодируемый нуклеиново-кислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок слияния по любому из предшествующих пунктов.
20. Нуклеиновая кислота по п.19, отличающаяся тем, что нуклеиново-кислотная последовательность, кодирующая полипептид RAGE, представляет собой или включает нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 29.
21. Нуклеиновая кислота по п.20, включающая нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.
22. Вектор экспрессии, кодирующий белок слияния по любому из пп.1-18 и/или включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.19-21.
23. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество белка по любому из пп.1-18 в фармацевтическом носителе.
24. Фармацевтическая композиция по п.23, изготовленная в виде инъецируемого раствора или в виде стерильного лиофилизированного порошка.
25. Способ получения белка слияния по любому из пп.1-18, включающий стадию ковалентного присоединения полипептида RAGE к полипептиду, включающему CH2 домен иммуноглобулина или часть СН2 домена иммуноглобулина.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что белок слияния кодируется рекомбинантной конструкцией ДНК.
27. Способ по п.25 или 26, дополнительно включающий стадию встраивания конструкции ДНК в вектор экспрессии.
28. Способ по п.27, дополнительно включающий трансфекцию вектора экспрессии в клетку-хозяина.
29. Применение белка слияния по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения RAGE-опосредованного заболевания у субъекта.
30. Применение по п.29, где лекарственное средство предназначено для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения субъекту белка слияния на основе RAGE.
31. Применение по п.29 или 30, где лекарственное средство предназначено для лечения симптома диабета или симптома поздних осложнений диабета.
32. Применение по п.31, где симптом диабета или поздних осложнений диабета включает диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическое изъязвление стопы, сердечно-сосудистое осложнение или диабетическую нейропатию.
33. Применение по п.29 или 30, где лекарственное средство предназначено для лечения амилоидоза, болезни Альцгеймера, рака, почечной недостаточности, воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспалительным заболеванием кишечника, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, гипоксией, инсультом, сердечным приступом, геморрагическим шоком, сепсисом, трансплантацией оргрэр или плохим заживлением раны.
34. Клетка-хозяин для продуцирования белка слияния по п.1, где клетка трансформирована вектором экспрессии по п.22.
35. Клетка-хозяин по п.34, отличающаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка.
Текст
012082 Перекрестные ссылки на родственные заявки Настоящая заявка устанавливает приоритет в соответствии с положением 35 USC 119 (е) относительно предварительной заявки на патент США 60/598555, зарегистрированной 3 августа 2004 года. Описание предварительной заявки на патент США 60/598555 включено полностью в настоящую заявку в виде ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к регуляции рецептора высокогликозилированных конечных продуктов (RAGE). Более конкретно, настоящее изобретение относится к белкам слияния, включающим полипептид RAGE, к способам получения таких белков слияния и к использованию таких белков для лечения расстройств, связанных с RAGE. Предпосылки создания изобретения Инкубация белков или липидов с альдозными сахарами приводит к неэнзиматическому гликозилированию и окислению аминогрупп на белках с образованием аддуктов Амадори. С течением времени указанные аддукты подвергаются дополнительной перегруппировке, дегидратации и сшиванию с другими белками с образованием комплексов, известных как высокогликозилированные конечные продукты(AGE). Факторы, которые способствуют образованию AGE, включают задержку белкового метаболизма(как, например, в случае амилоидозов), накопление макромолекул, характеризующихся высоким содержанием лизина, и высокие уровни глюкозы в крови (как, например, при диабете) (Hori et al., J. Biol.Chem. 270: 25752-761 (1995. AGE вовлекаются в большое число расстройств, которые включают осложнения, ассоциированные диабетом, а также нормальный процесс старения организма.AGE демонстрируют специфическое и насыщаемое связывание с рецепторами клеточной поверхности на моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках микрососудистой сетки, гладкомышечных клетках, мезангиальных клетках и нейронах. Рецептор для высоко гликозилированных конечных продуктов(RAGE) относится к семейству молекул иммуноглобулинового супергена. Внеклеточный (N-концевой) домен RAGE включает три участка иммуноглобулинового типа: один домен V-типа (вариабельный), за которым следует два домена С-типа (константные) (Neeper, et al., J. Biol. Chem., 267: 14998-15004 (1992);Schmidt et al., Circ. (Suppl). 96194 (1997. За внеклеточным доменом следуют один трансмембранный домен и короткий высокозаряженный цитозольный фрагмент. N-Концевой внеклеточный домен может быть выделен путем протеолиза RAGE или с использованием стратегий молекулярной биологии с получением растворимого RAGE (sRAGE), включающего V и С домены.RAGE экспрессируется на клетках различных типов, включающих лейкоциты, нейроны, клетки микроглии и сосудистого эндотелия (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 (1995. Повышенные уровниRAGE также обнаружены в стареющих тканях (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997 и в сетчатке, сосудистой сетке и почке у больных диабетом (Schmidt et al., Nature Med., 1: 1002-1004 (1995. Кроме AGE, другие соединения также могут связываться и модулировать активность RAGE. RAGE связывается с лигандами, которые характеризуются полифункциональностью и наличием структурных различий и включают амилоид-бета (А), сывороточный амилоид A (SAA), конечные продукты с повышенным уровнем гликозилирования (AGE), S100 (провоспалительный представитель семейства калгранулина), карбоксиметиллизин (CML), афотерин и CD11b/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59: 1117128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect., 6: 1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61, 1-9(2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108: 949-955 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162: 1213-1220 (2003. Было показано, что связывание лигандов, таких как AGE, S100/калгранулин, -амилоид, CML (Nкарбоксиметиллизин) и амфотерин, с RAGE модифицирует экспрессию большого числа генов. Указанные виды взаимодействия могут затем инициировать механизмы сигнальной трансдукции, включая активацию р 38, p21ras, MAP-киназ, фосфорилирование Erk1-2 и активацию медиатора транскрипции воспалительных сигнальных молекул, NF-B (Yeh et al., Diabetes, 50: 1495-1504 (2001. Например, в клетках большого числа типов взаимодействие между RAGE и его лигандами может вызывать окислительный стресс, который приводит к активации фактора транскрипции NF-В, чувствительного к свободным радикалом, и к активации генов, регулируемых NF-В, таких как цитокины IL-1 и TNF-. Кроме того,экспрессия RAGE подвергается позитивной регуляции через NF-В, так что выявляется повышенный уровень экспрессии в сайтах воспаления или при окислительном стрессе (Tanaka et al., J. Biol. Chem. 275: 25781-25790 (2000. Таким образом, связывание лиганда инициирует петлю регуляции по типу положительной обратной связи, которая может быть поддерживать нарастающую и часто неблагоприятную спираль. Активация RAGE в разных тканях и органах может приводить к большому числу патофизиологических последствий. RAGE вовлекается во множество состояний, включающих острое хроническое воспаление (Hofmann et al., Cell. 97: 889-901 (1999, развитие поздних осложнений диабета, таких как повышенная проницаемость сосудов (Wautier et al., J. Clin. Invest., 97: 238-243 (1995, нефропатия (Teillet et(1999. RAGE также вовлекается в патогенез болезни Альцгеймера (Yan et al., Nature, 382: 685-691-1 012082 Несмотря на масштабную экспрессию RAGE и его явную плейотропную роль, продемонстрированную на многих различных моделях заболеваний, по всей видимости, RAGE не является обязательным фактором в случае нормального развития. Например, мыши с выключенным функционированием RAGE не демонстрируют аномального фенотипа, указывая на то, что, хотя RAGE может играть определенную роль в патологии заболевания при хронической стимуляции, ингибирование RAGE, скорее всего, не сказывается на каком-либо нежелательном остром фенотипе (Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113: 1641-50 (2004. Антагонистическое связывание физиологических лигандов с RAGE может оказывать отрицательную регуляцию патофизиологических изменений, создаваемых избыточными концентрациями AGE и других лигандов RAGE. За счет снижения уровня связывания эндогенных лигандов с RAGE могут быть снижены симптомы, ассоциированные с расстройствами, опосредованными RAGE. Растворимый RAGE(sRAGE) способен оказывать эффективное антагонистическое воздействие на связывание лигандовRAGE с RAGE. Однако sRAGE может, в случае его введения in vivo, обладать таким периодом полувыведения, который будет слишком мал для терапевтического применения в случае одного или нескольких расстройств. Таким образом, имеется потребность в разработке соединений, которые бы оказывали антагонистический эффект на связывание AGE и других физиологических лигандов с рецептором RAGE, так чтобы такие соединения имели желательный фармакокинетический профиль. Краткое описание сущности изобретения Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе RAGE и способы использования таких белков. Настоящее изобретение может быть осуществлено в рамках множества способов. Варианты осуществления настоящего изобретения могут включать белок слияния, содержащий полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте белок слияния включает сайт связывания лиганда RAGE. Белок слияния может также включать полипептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен СН 2 иммуноглобулина или часть домена СН 2. Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе RAGE. В одном варианте данный способ включает присоединение полипептида RAGE ко второму полипептиду,отличному от RAGE. В одном варианте полипептид RAGE включает сайт связывания лиганда RAGE. Данный способ может также включать присоединение полипептида RAGE непосредственно к полипептиду, включающему домен CH2 иммуноглобулина или часть домена CH2. В другом варианте настоящее изобретение может включать способы и композиции для лечения у субъекта расстройства, опосредованного RAGE. Данный способ может включать введение белка слияния по настоящему изобретению субъекту. Композиция может включать белок слияния на основе RAGE по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. Можно отметить различные преимущества, ассоциированные с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения. В одном варианте белки слияния по настоящему изобретению могут быть метаболически стабильными при их введении субъекту. Кроме того, белки слияния по настоящему изобретению могут демонстрировать высокую аффинность по связыванию с лигандами RAGE. В некоторых вариантах белки слияния по настоящему изобретению связываются с лигандами RAGE со значениями аффинности, укладывающимися в диапазон от высоких наномолярных до низких микромолярных количеств. В ситуации связывания с высокой аффинностью с физиологическими лигандами RAGE белки слияния по настоящему изобретению могут использоваться для ингибирования связывания эндогенных лигандов с RAGE, что может рассматриваться как способ облегчения заболеваний, опосредованных RAGE. Кроме того, белки слияния по настоящему изобретению могут быть представлены в виде белка или нуклеиновой кислоты. В одном репрезентативном варианте белок слияния может вводиться системно и оставаться в сосудистой сетке для эффективного лечения сосудистых заболеваний, которые частично опосредованы RAGE. В другом репрезентативном варианте белок слияния может вводиться местно для лечения заболеваний, патология которых включает лиганды RAGE. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния, может быть доставлена в нужный сайт путем использования соответствующего носителя, такого как вирус или оголенная ДНК, где временная местная экспрессия может локально ингибировать взаимодействие между лигандами RAGE и рецепторами. Таким образом,введение может быть временным (как, например, в случае введения белка слияния) или более постоянным по своей природе (например, в том случае, когда белок слияния вводят в виде рекомбинантной ДНК). Ниже описываются дополнительные особенности осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается деталями, приведенными в заявке, формуле изобретения и чертежах. Настоящее изобретение может быть осуществлено в виде других вариантов и может быть реализовано или выполнено различными способами. Краткое описание чертежей Различные особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут более понятными при рассмотрении их в сочетании с приведенными чертежами. На фиг. 1 показаны разные RAGE последовательности, относящиеся к различным вариантам настоящего изобретения: панель A: SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность человеческогоRAGE; и SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность человеческого RAGE без сигнальной по-2 012082 следовательности на участке аминокислот 1-22; панель В: SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность человеческого RAGE без сигнальной последовательности на участке аминокислот 1-23; панель С: SEQ ID NO: 4, аминокислотная последовательность человеческого sRAGE; SEQ ID NO: 5, аминокислотная последовательность человеческого sRAGE без сигнальной последовательности на участке аминокислот 1-22; и SEQ ID NO: 6, аминокислотная последовательность человеческого sRAGE без сигнальной последовательности на участках аминокислот 1-23; панель D: SEQ ID NO: 7, аминокислотная последовательность, включающая V-домен человеческого RAGE; SEQ ID NO: 8, альтернативная аминокислотная последовательность, включающая V-домен человеческого RAGE; SEQ ID NO: 9, N-концевой фрагментV-домена человеческого RAGE; SEQ ID NO: 10, альтернативный N-концевой фрагмент V-домена человеческого RAGE; SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 124-221 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 12, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 227317 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 13, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-123 человеческого RAGE; панель Е: SEQ ID NO: 14, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-123 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 15, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-136 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 16, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-136 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 17, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-226 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 18, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-226 человеческого RAGE; панель F: SEQ ID NO: 19, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-251 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 20, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-251 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 21, междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO: 22, второй междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO: 23, третий междоменный линкер RAGE; SEQ ID NO: 24, четвертый междоменный линкер RAGE; панель G: SEQ IDNO: 25, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-118 человеческого RAGE; SEQ ID NO: 26, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-123 человеческого RAGE; и SEQ ID NO: 27, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-136 человеческого RAGE; панель Н: SEQ ID NO: 28, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-230 человеческого RAGE; иSEQ ID NO: 29, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-251 человеческого RAGE; панель I: SEQ ID NO: 38, частичная аминокислотная последовательность CH2 иCH3 доменов человеческого IgG; SEQ ID NO: 39, ДНК, кодирующая часть человеческих доменов СН 2 иCH3 человеческого IgG; SEQ ID NO: 40, аминокислотная последовательность СН 2 и CH3 доменов человеческого IgG; панель J: SEQ ID NO: 41, ДНК, кодирующая человеческие домены СН 2 и СН 3 человеческогоIgG; SEQ ID NO: 42, аминокислотная последовательность CH2 домена человеческого IgG; SEQ ID NO: 43,аминокислотная последовательность СН 3 домена человеческого IgG; и SEQ ID NO: 44, пятый междоменный линкер RAGE. На фиг. 2 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 39) кодирующего участка белка слияния на основе RAGE (TTP-4000) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-753, выделенная жирным шрифтом, кодирует N-концевую белковую последовательность RAGE, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность человеческого IgG Fc (1). На фиг. 3 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 31) кодирующего участка альтернативного белка слияния на основе RAGE (TTP-3000) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-408, выделенная жирным шрифтом, кодирует N-концевую белковую последовательность RAGE, тогда как последовательность 409-1041 кодирует белковую последовательность человеческого IgG Fc (1). На фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32 (TTP-4000), SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34, каждая из которых кодирует четырехдоменный белок слияния на основе RAGE, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. ПоследовательностьRAGE выделена жирным шрифтом. На фиг. 5 показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 35 (ТТР-3000), SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, каждая из которых кодирует трехдоменный белок слияния на основе RAGE, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. ПоследовательностьRAGE выделена жирным шрифтом. На фиг. 6, панель А, приведены сравнение белковых доменов человеческого RAGE и человеческогоIgG гамма-1 Fc белка и точки расщепления, используемые для получения ТТР-3000 (в положении 136) и ТТР-4000 (в положении 251), в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения; и на панели В показана доменная структура ТТР-3000 и ТТР-4000 в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. На фиг. 7 показаны результаты теста на связывание in vitro для sRAGE и белков слияния на основеRAGE, TTP-4000 (TT4) и ТТР-3000 (ТТ 3) с лигандами RAGE амилоид-бета (А-бета), S100b (S100) и амфотерином (Ampho) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения.-3 012082 На фиг. 8 показаны результаты теста на связывание in vitro для белка слияния на основе RAGE TTP4000 (TT4) (белок) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления (только комплекс), и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста RAGE (лиганд RAGE) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. На фиг. 9 показаны результаты теста на связывание in vitro для белка слияния на основе RAGE ТТР 3000 (ТТ 3) (белок) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления (только комплекс), и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста RAGE (лиганд RAGE) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. На фиг. 10 показаны результаты клеточного теста, выполняемого для определения уровня ингибирования индуцированной S100b-RAGE продукции TNF- под действием белков слияния на основеRAGE ТТР-3000 (ТТ 3), и TTP-4000 (TT4), и sRAGE, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. На фиг. 11 показан фармакокинетический профиль для белка слияния на основе RAGE TTP-4000 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, где каждая из кривых относится к разным животным в одних и тех же экспериментальных условиях. На фиг. 12 показаны относительные уровни высвобождения TNF- из клеток ТНР-1 в результате стимуляции белком слияния на основе RAGE TTP-4000 и стимуляции человеческим IgG как меры воспалительного ответа в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Фиг. 13 иллюстрирует использование белка слияния на основе RAGE TTP-4000 для снижении рестеноза у животных с диабетом в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе RAGE TTP-4000 снижает соотношение внутренней оболочки/среды в сравнении с отрицательным контролем (IgG), и на панели В показано, что белок слияния на основе RAGE TTP-4000 снижает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов зависимым от дозы способом. Фиг. 14 иллюстрирует использование белка слияния на основе RAGE TTP-4000 для снижения образования амилоида и дисфункции познавательного процесса у животных с болезнью Альцгеймера (БА) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе RAGE TTP-4000 снижает амилоидную нагрузку мозга, а на панели В показано, что белок слияния на основе RAGE TTP-4000 улучшает познавательную функцию. На фиг. 15 приведены кривые, описывающие насыщение связывания для ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами RAGE, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Подробное описание изобретения В контексте настоящего описания, если особо не указано иное, все цифры, относящиеся к количествам ингредиентов, условиям реакции и т.п. в тексте описания, следует понимать как указываемые в сочетании с термином примерно. Соответственно, если из контекста не следует противоположное, численные параметры, приведенные далее в описании, являются приблизительными значениями, которые могут варьировать в зависимости от желательных свойств, нужных при осуществлении настоящего изобретения. В крайнем случае, но не с целью ограничения применения принципа эквивалентов применительно к настоящему изобретению, каждый численный параметр можно рассматривать как число, соответствующее значимым цифрам с применением обычной методики округления. Несмотря на то что числовые диапазоны и параметры, приведенные в общем описании изобретения, даны в некотором приближении, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, даны настолько точно, насколько это возможно. Однако каждое числовое значение может содержать в себе некоторую ошибку, возникающую как результат стандартного отклонения, присущего соответствующим методикам измерения. Более того, все указанные диапазоны следует понимать как охватывающие любые и все входящие в них поддиапазоны. Например, диапазон, указанный как от 1 до 10, следует рассматривать как включающий любые и все поддиапазоны между приведенными значениями (и включая их) от минимального значения, равного 1, до максимального значения, равного 10, что означает, что все поддиапазоны, начинающиеся от минимального значения 1 или более, например от 1 до 6,1, и заканчивающиеся максимальным значением 10 или менее, например 5,5-10, входят в него. Дополнительно, любые ссылки,обозначаемые как включенные в настоящий контекст, следует понимать как включенные полностью. Следует также отметить, что в контексте настоящего описания единственные формы определений включают их множественное значение, если явно не следует иного. Термин или используется взаимозаменяемо с термином и/или, если из контекста явно не следует иное. Кроме того, термины часть и фрагмент, используемые взаимозаменяемо, относятся к частям полипептида, нуклеиновой кислоты и других молекулярных конструкций. В контексте настоящего описания термин против направления считывания относится к остатку,который является N-концевым относительно второго остатка, в том случае, если молекула является бел-4 012082 ком, или находится в 5' положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту. Кроме того, в контексте настоящего описания термин в направлении считывания относится к остатку, который является С-концевым относительно второго остатка, если молекула является белком, или находится в 3' положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту. Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют значения, общепринятые в данной области. Практикующим специалистам может быть рекомендовано известное руководство (Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel, в котором описаны определения и термины, используемые в данной области. Аббревиатуры аминокислотных остатков представлены стандартными трехбуквенными и/или однобуквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычных L-аминокислот. Термин нуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Термин используется для обозначения одноцепочечных нуклеиновых кислот, двухцепочечных нуклеиновых кислот и РНК и ДНК, полученных из нуклеотидных или нуклеозидных аналогов. Термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может использоваться для транспортировки второй молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой вектор позволяет осуществлять репликацию последовательностей ДНК,введенных в вектор. Вектор может включать промотор для повышения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в некоторых хозяйских клетках. Векторы могут реплицироваться автономно (внехромосомно) или могут быть интегрированы в хромосому хозяйской клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор может включать вектор экспрессии, способный продуцировать белок, полученный по меньшей мере из части последовательности нуклеиновой кислоты,встроенной в вектор. Как известно в данной области, условия гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом могут быть описаны в терминах, варьирующих от низкой до высокой строгости. В основном, высокострогие условии гибридизации относятся к промывке гибридов в низкосолевом буфере при высоких температурах. Гибридизация может включать фильтрование связанной ДНК с использованием растворов для гибридизации, стандартных для данной области, таких как растворы, включающие 0,5 МNaHPO4, 7% додецилсульфат натрия (ДСН), при температуре 65 С, промывку в 0,25 М NaHPC4, содержащем 3,5% ДСН, с последующей промывкой в 0,1SSC/0,1 ДСН при температуре, варьирующей от комнатной температуры до 68 С, в зависимости от длины зондов (см., например, Ausubel, F.M. et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John WileySons, N.Y.). Например, условия высокой строгости промывки включают промывку в 6SSC/0,05% пирофосфата натрия при температуре 37 С в случае олигонуклеотидного зонда с 14 основаниями, или при температуре 48 С в случае олигонуклеотидного зонда с 17 основаниями, или при температуре 55 С в случае олигонуклеотидного зонда с 20 основаниями, или при температуре 60 С в случае олигонуклеотидного зонда с 25 основаниями, или при температуре 65 С в случае олигонуклеотидного зонда, включающего примерно 250 нуклеотидов в длину. Зонды нуклеиновой кислоты могут быть мечены радионуклидами, составляющими концевую метку, например [-32 Р]АТР, или за счет включения радиоактивно меченных нуклеотидов, таких как [-32 Р]dCTP,введенных путем случайного мечения с использованием праймеров. Альтернативно, зонды могут быть мечены путем включения биотинилированных или меченных флуоресцеином нуклеотидов, где выявление зондов проводят с использованием стрептавидина или антител против флуоресцеина. В контексте настоящего описания термин малые органические молекулы относится к молекулам с молекулярным весом менее чем 2000 Да, которые содержат по меньшей мере 1 атом углерода. Термины полипептид и белок используются взаимозаменяемо в тексте настоящего описания для обозначения молекул белка, которые могут включать либо частичные белки, либо белки полной длины. Термин белок слияния относится к белку или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Белок слияния может также включать связующие участки аминокислот между аминокислотными частями, полученными из отдельных белков. В контексте настоящего описания термин полипептид, отличный от RAGE представляет собой любой полипептид, который был получен не из RAGE или его фрагмента. Такие полипептиды, отличные от RAGE, включают иммуноглобулиновые пептиды, димеризуемые полипептиды, стабилизируемые пептиды, амфифильные пептиды или полипептиды, включающие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают наличие соответствующих меток для целевой доставки белка или его очистки. В контексте настоящего описания термин иммуноглобулиновые пептиды может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть. В одном варианте осуществления настоящего изобретения часть тяжелой цепи может представлять собой Fc фрагмент или его часть. В контексте настоящего описания Fc фрагмент включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида, а также CH2 и CH3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в мономерной или димерной форме. В ином случае, CH1 и Fc фрагмент могут использоваться в виде иммуноглобулинового полипептида. Тяжелая цепь (или ее часть) может-5 012082 быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, меняющие их биологическую активность. Примером такой биологической активности, которая может быть изменена, является снижение способности изотипа связываться с некоторыми рецепторами Fc, например, за счет модификации шарнирной области. Термины идентичность или процент идентичности относятся к идентичности на уровне последовательности, имеющейся между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты. Процент идентичности может быть определен путем выравнивания последовательностей и относится к числу идентичных остатков (например, аминокислот или нуклеотидов) в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Выравнивание последовательностей и их сравнение могут быть проведены с помощью известных для этого алгоритмов (см., например, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482: Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444) или при использовании компьютерных версий указанных алгоритмов (пакет прикладных программ Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), которые широко доступны в виде программ BLAST и FASTA. Кроме того, для сравнения последовательностей может использоваться программа ENTREZ, доступная от National Institutes of Health, Bethesda MD. В одном варианте осуществления настоящего изобретения процент идентичности двух последовательностей может быть определен при использовании GCC с весовым значением гэпа (пропуска), равным 1, так что каждому аминокислотному гэпу присваивается весовое значение, соответствующее ошибке в одной аминокислоте между двумя последовательностями. В контексте настоящего описания термин консервативные остатки относится к аминокислотам,которые являются одинаковыми среди множества белков, имеющих одну и ту же структуру и/или функцию. Область консервативных остатков, может быть, имеет значение для описания структуры или функции белка. Так, соприкасающиеся консервативные остатки, идентифицируемые в трехмерном белке, могут быть важны для описания структуры или функции белка. Для выявления консервативных остатков или консервативных участков трехмерной структуры можно провести сравнение последовательностей одинаковых или сходных белков из разных видов или у индивидуумов одного и того же вида. В контексте настоящего описания термин гомолог обозначает полипептид, имеющий определенную степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа. Сравнение гомологии может быть проведено на глаз или, чаще всего, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы позволяют вычислить процент гомологии между двумя или более последовательностями (см., например, Wilbur, W.J. and Lipman, D.J.,1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 726-730). Например, могут быть взяты гомологичные последовательности, включающие такие аминокислотные последовательности, которые в альтернативных вариантах по меньшей мере на 75, на 85, на 90, на 95 или на 98% идентичны друг другу. В контексте настоящего описания полипептидный или белковый домен включает область полипептида или белка, которая включает независимую единицу. Домен может быть определен с точки зрения структуры последовательности и/или биологической активности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептидный домен может включать участок белка, который складывается в пространственную структуру таким образом, что, по существу, не зависит от остальной части белка. Домены могут быть идентифицированы с использованием баз данных доменов, таких как, без ограничения,PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT и PROCLASS. В контексте настоящего описания термин иммуноглобулиновый домен обозначает аминокислотную последовательность, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью к домену иммуноглобулина. Длина последовательности аминокислот в иммуноглобулиновом домене может быть любого размера. В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может включать менее чем 250 аминокислот в длину. В одном репрезентативном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может составлять примерно 80-150 аминокислот в длину. Например, вариабельный домен и участки СН 1, СН 2 и СН 3 в IgG, каждый представляет собой иммуноглобулиновый домен. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариабельные участи CH1, CH2, CH3 и CH4 в IgM, каждый представляет собой иммуноглобулиновый домен. В контексте настоящего описания иммуноглобулиновый домен RAGE представляет собой последовательность аминокислот белка в RAGE, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью к домену иммуноглобулина. Например, домен иммуноглобулина RAGE может включать Vдомен RAGE, домен RAGE Ig-подобного С 2 типа 1 (С 1 домен) или домен RAGE Ig-подобного С 2 типа 2 (С 2 домен). В контексте настоящего описания термин междоменный линкер обозначает полипептид, который соединяет вместе два домена. Fc шарнирная область представляет собой пример междоменного линкера в IgG. В контексте настоящего описания термин непосредственно соединенный идентифицирует кова-6 012082 лентную связь между двумя разными группами (например, между последовательностями нуклеиновых кислот, полипептидов, полипептидными доменами), которые не содержат каких-либо встроенных атомов между двумя соединяемыми группами. В контексте настоящего описания термин лигандсвязывающий домен относится к домену белка,ответственному за связывание лиганда. Указанный термин лигандсвязывающий домен включает гомологи связывающего домена лиганда или его части. В этом контексте могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в связывающем сайте лиганда с учетом сходства по полярности, заряду,растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем, чтобы сохранить специфичность по связыванию домена, ответственного за связывание лиганда. В контексте настоящего описания термин сайт связывания лиганда включает остатки в белке, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом, или остатки, вовлекаемые в осуществление такой локализации лиганда, чтобы он оставался в тесной близости к тем остаткам, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом. Взаимодействие остатков в сайте связывания лиганда может быть определено по пространственной близости остатков к лиганду на примере модели или в самой структуре. Термин сайт связывания лиганда включает гомологи сайта связывания лиганда или его части. В этой связи, могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в сайте связывания лиганда с учетом сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем,чтобы сохранить специфичность сайта по связыванию с лигандом. Сайт связывания лиганда может находиться в одном или нескольких связывающих доменах белка или полипептида. В контексте настоящего описания термин взаимодействует относится к состояниям, предполагающим непосредственную близость между лигандом или соединением, или их частями или фрагментами, и частью второй интересующей молекулы. Взаимодействие может быть нековалентным, например осуществляющимся в результате действия водородных связей, взаимодействий под действием сил Ван дер Вальса или представляющим собой электростатическое или гидрофобное взаимодействие, или оно может быть ковалентным. В контексте настоящего описания термин лиганд относится к молекуле или соединению, или другой структуре, которая взаимодействует с сайтом связывания лиганда, включая субстраты, или аналоги,или их части. В контексте настоящего описания термин лиганд может относиться к соединениям, которые связываются с интересующим белком. Лиганд может представлять собой агонист, антагонист или модулятор. Или указанный лиганд может оказывать биологический эффект. Или указанный лиганд может блокировать связывание других лигандов и, тем самым, ингибировать биологический эффект. Лиганды могут включать, без ограничения, малые молекулы ингибиторов. Указанные малые молекулы могут включать пептиды, пептидомиметики, органические соединения и т.п. Лиганды могут также включать полипептиды и/или белки. В контексте настоящего описания термин соединение-модулятор относится к молекуле, которая изменяет или модифицирует биологическую активность интересующей молекулы. Соединение-модулятор может повышать или понижать активность или изменять физические или химические характеристики, а также функциональные или иммунологические свойства интересующей молекулы. В случае RAGE соединение-модулятор может повышать или понижать активность или изменять характеристики или функциональные или иммунологические свойства RAGE или его части. Соединение-модулятор может включать природные и/или химически синтезированные или искусственные пептиды, модифицированные пептиды (например, фосфопептиды), антитела, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, гликолипиды, гетероциклические соединения, нуклеозиды, или нуклеотиды, или их части, а также малые органические или неорганические молекулы. Соединение-модулятор может представлять собой эндогенное физиологическое соединение или может быть природным синтетическим соединением. Или соединение-модулятор может представлять собой малую органическую молекулу. Термин соединениемодулятор также включает химически модифицированный лиганд или химически модифицированное соединение и включает их изомерные и рацемические формы. Термин агонист включает соединение, которое связывается с рецептором с образованием комплекса, который демонстрирует фармакологический ответ, специфичный для вовлекаемого рецептора. Термин антагонист включает соединение, которое связывается с агонистом или с рецептором с образованием комплекса, который не демонстрирует существенного фармакологического ответа и может ингибировать биологический ответ, индуцированный агонистом. Соответственно, агонисты RAGE могут связываться с RAGE и стимулировать RAGE-опосредованные клеточные процессы, а антагонисты RAGE могут ингибировать опосредованные RAGE процессы,стимулируемые агонистом RAGE. Например, в одном варианте осуществления изобретения клеточный процесс, стимулируемый агонистами RAGE, включает активацию транскрипции гена TNF-. Термин пептидные миметики относится к структурам, которые служат в качестве заместителей пептидов в процессах взаимодействия между молекулами (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem.,24: 243-252). Пептидные миметики могут включать синтетические структуры, которые могут содержать аминокислотные и/или пептидные связи и могут и не содержать, но сохраняют структурные и функциональные особенности пептида, агониста или антагониста. Пептидные миметики также включат пептои-7 012082 ды, олигопептоиды (Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 9367) и пептидные библиотеки,содержащие пептиды заданной длины, отражающие все возможные последовательности аминокислот,соответствующие пептиду, агонисту или антагонисту согласно настоящему изобретению. Термин лечение относится к ослаблению симптома заболевания или расстройства и может включать излечивание расстройства, по существу, предотвращение наступления развития расстройства или улучшение состояния субъекта. Термин терапия в контексте настоящего описания относится к полному спектру терапевтических методов, применяемых в случае того расстройства, от которого страдает пациент, включая облегчение одного симптома или большей части симптомов, определяемых данным расстройством, излечивание конкретного расстройства или предотвращение развития расстройства. В контексте настоящего описания термин ЕС 50 определяется как концентрация агента, которая соответствует 50% от уровня измеряемого биологического эффекта. Например, ЕС 50 терапевтического агента, оказывающего заметный биологический эффект, может включать величину, при которой данный агент демонстрирует 50% уровень указанного биологического эффекта. В контексте настоящего описания термин IC50 определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% ингибированию измеряемого эффекта. Например, IC50 антагониста связывания RAGE может включать значение, при котором антагонист снижает связывание лиганда с сайтом связывания лиганда RAGE на 50%. В контексте настоящего описания термин эффективное количество обозначает количество агента,которое является эффективным для проявления желательного эффекта у субъекта. Термин терапевтически эффективное количество обозначает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое демонстрирует терапевтический ответ у животного или человека, для которого желателен такой ответ. Фактическая доза, которая включает эффективное количество, может зависеть от способа введения, размера субъекта и состояния его здоровья, от природы расстройства, подлежащего лечению, и т.п. Термин фармацевтически приемлемый носитель в контексте настоящего изобретения может относиться к соединениям и композициям, которые приемлемы для использования у человека или животного, например может относиться к терапевтическим композициям, вводимым с целью лечения расстройства или заболевания, опосредованного RAGE. Термин фармацевтическая композиция в контексте настоящего описания обозначает композицию, которая может вводиться в организм хозяина-млекопитающего, например, перорально, парентерально, местно, путем ингаляции, интраназально, ректально, в стандартных дозированных формах,включая обычные нетоксичные носители, разбавители, адъюванты, наполнители и т.п. Термин парентеральный в контексте настоящего описания включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, внутригрудинную инъекцию или методику инфузии. Белки слияния на основе RAGE Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе RAGE, способы получения таких белков слияния и способы использования таких белков слияния. Настоящее изобретение может осуществляться множеством способов. Так, например, варианты настоящего изобретения относятся к белкам слияния, включающим полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте белки слияния могут включать сайт связывания лиганда RAGE. В этом варианте осуществления изобретения сайт связывания лиганда включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда RAGE может включать V домен RAGE или его часть. В этом варианте сайт связывания лигандаRAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, на 90% ей идентичную, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, на 90% ей идентичную. В одном варианте полипептид RAGE может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (например, фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть одного изCH2 или CH3 доменов человеческого IgG. Белок или полипептид RAGE может включать человеческий белок RAGE полной длины (например,SEQ ID NO: 1) или фрагмент человеческого RAGE. В контексте настоящего описания фрагмент полипептида RAGE составляет по меньшей мере 5 аминокислот в длину, может включать более 30 аминокислот в длину, но имеет длину меньше, чем полная аминокислотная последовательность. В альтернативных вариантах полипептид RAGE может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 85,или на 90% идентична человеческому RAGE или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид RAGE может включать человеческий RAGE или его фрагмент, при этом, скорее, первым остатком будет глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или в другом варианте человеческийRAGE может включать RAGE полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например,SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, фиг. 1 А и 1 В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать sRAGE (например, SEQ IDNO: 4), полипептид, который на 90% идентичен sRAGE, или фрагмент sRAGE. В контексте настоящего описания sRAGE или белок RAGE не включает трансмембранный участок или цитоплазматический-8 012082 хвостовой фрагмент (Park et al., Nature Med., 4: 1025-1031 (1998. Так, например, полипептид RAGE может включать человеческий sRAGE или его фрагмент, при этом в первом положении будет находиться, скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или полипептид RAGE может включать человеческий sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, фиг. 1 С) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок RAGE может включать V домен RAGE (например, SEQ ID NO: 7 илиSEQ ID NO: 8, фиг. 1D) (Neeper et al., (1992); Schmidt et al., (1997. Или может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену RAGE или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок RAGE может включать V домен RAGE (например, SEQ ID NO: 9 илиSEQ ID NO: 10, фиг. 1D). В одном варианте белок RAGE может включать сайт связывания лиганда. В этом варианте сайт связывания лиганда может включать SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент RAGE представляет собой синтетический пептид. Таким образом, полипептид RAGE, используемый в белках слияния согласно настоящему изобретению, может включать фрагмент RAGE полной длины. Как известно в данной области, RAGE включает трехдоменный полипептид иммуноглобулинового типа, в который входят V домен и С 1 и С 2 домены,каждый из которых соединен друг с другом через посредство междоменного линкера. RAGE полной длины также включает трансмембранный полипептид и цитоплазматический хвостовой фрагмент в направлении считывания информации (С-концевой) С 2 домена и присоединен к С 2 домену. В одном варианте полипептид RAGE не включает какие-либо остатки сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может включать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 изRAGE полной длины. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-116 из человеческого RAGE (SEQID NO: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, аминокислоты 24-116 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты 124-221 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С 1 домену RAGE. В другом варианте полипептид RAGE может включать аминокислоты 227317 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична,соответствующую С 2 домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-123 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-123 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 14) или последовательность,которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-226 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-226 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 18) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С 1 домену и междоменному линкеру, соединяющему указанные два домена. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична, или остатки 24-339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 6) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую sRAGE (то есть кодирующую V, С 1 и С 2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. В одном варианте иммуноглобулиновый полипептид может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть (то есть фрагмент). Например, фрагмент тяжелой цепи может включать полипептид, полученный из Fc фрагмента иммуноглобулина, где фрагмент Fc включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида и CH2 и CH3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в качестве мономера. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотопа: IgG, IgM , IgD , IgEили IgA . Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2(2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены CH2 и CH3 человеческого IgG1,или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 из человеческого IgG1 или их часть, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40.Fc часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием in vivo. Так, в одном варианте белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из RAGE, но не из шарнирной области междоменного полипептида, полученного из иммуноглобулина.-9 012082 Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе RAGE может также включать полипептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему CH2 домен иммуноглобулина, или фрагмент, или часть CH2 домена иммуноглобулина. В одном варианте CH2 домен или его фрагмент может включать SEQ ID NO: 42. В одном варианте полипептид RAGE может включать сайт связывания лиганда. Сайт связывания лиганда RAGE может включать V домен RAGE или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда RAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична. Полипептид RAGE, используемый в белках слияния согласно настоящему изобретению, может включать иммуноглобулиновый домен RAGE. Дополнительно или альтернативно, фрагмент RAGE может включать междоменный линкер. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный против направления считывания информации (то есть ближе к N-концу) или в направлении считывания информации (то есть ближе к С-концу) междоменного линкера. Еще в одном варианте полипептид RAGE может включать два (или более) иммуноглобулиновых домена RAGE, которые соединяются друг с другом через посредство междоменного линкера. Полипептид RAGE может также включать RAGE с множеством иммуноглобулиновых доменов, соединенных друг с другом с помощью одного или нескольких междоменных линкеров и содержащих концевой междоменный линкер, присоединенный к N-концевому иммуноглобулиновому домену RAGE и/или к С-концевому домену иммуноглобулина. Дополнительные сочетания иммуноглобулиновых доменов RAGE и междоменных линкеров также входят в область настоящего изобретения. В одном варианте полипептид RAGE включает междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового доменаRAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида,включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий CH2 домен иммуноглобулина, может включать CH2 и CH3 домены человеческого IgG1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве примерного варианта можно указать полипептид, включающий CH2 и CH3 домены или их часть из человеческого IgG1, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Как было указано выше, белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из RAGE. Кроме того, полипептид RAGE, включающий междоменный линкер,присоединенный к полипептидному домену RAGE, может включать фрагмент белка RAGE полной длины. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-136 из человеческого RAGE (SEQID NO: 15) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 16) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты 23-251 из человеческого RAGE (SEQ IDV домену, С 1 домену, междоменному линкеру, соединяющему два домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания С 1. Например, в одном варианте белок слияния может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc полипептида человека. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер RAGE, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE и второму междоменному линкеру RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера присеодинена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулиновового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте CH2 домена иммуноглобулина. В одном варианте четырехдоменный белок слияния на основе RAGE может включать SEQ ID NO: 32. В альтернативных вариантах четыре домена белка слияния на основе RAGE включают SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34. Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Fc полипептида человека. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте CH2 домена иммуноглобулина или частиCH2 домена иммуноглобулина. В одном варианте трехдоменный белок слияния на основе RAGE может включать SEQ ID NO: 35. В альтернативных вариантах трехдоменный белок слияния на основе RAGE может включать SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 37. Фрагмент междоменного линкера RAGE может включать пептидную последовательность, которая соответствует считыванию в направлении транскрипции в естественном состоянии и, таким образом,присоединяется к иммуноглобулиновому домену RAGE. Например, в случае V домена RAGE междомен- 10012082 ный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые считываются в естественном состоянии в направлении транскрипции V домена. В одном варианте линкер может включать SEQ IDNO: 21, соответствующую участку аминокислот 117-123 RAGE полной длины. Или, в другом варианте,линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательностиRAGE. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот(например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 32. Таким образом, в одном варианте междоменный линкер включает SEQID NO: 23, включающую аминокислоты на участке 117-136 из RAGE полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23. В случае С 1 домена RAGE линкер может включать пептидную последовательность, которая считывается в естественном варианте по направлению транскрипции С 1 домена. В этом варианте линкер может включать SEQ ID NO: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательности RAGE. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления считывания или в направления считывания информации из SEQ ID NO: 22. Или в другом варианте могут использоваться фрагментыSEQ ID NO: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер RAGE может включать SEQ ID NO: 24,соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или, в другом варианте, междоменный линкер может включать SEQ ID NO: 44, соответствующий аминокислотам на участке 318-342 из RAGE. Способы получения белков слияния на основе RAGE Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе RAGE. Так,в одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения белка слияния на основеRAGE, включающему стадию ковалентного присоединение полипептида RAGE, присоединенного ко второму полипептиду, отличному от RAGE, где полипептид RAGE включает сайт связывания лигандаRAGE. Например, присоединенный полипептид RAGE и второй полипептид, отличный от RAGE, могут кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Данный способ также относится к стадии включения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Кроме того, указанный способ может включать стадию введения вектора экспрессии в хозяйскую клетку. Например, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к белкам слияния, включающим полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте белок RAGE может включать сайт связывания лиганда RAGE. В одном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лигандаRAGE может включать V домен RAGE или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда RAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична. В одном варианте полипептид RAGE может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из доменов CH2 или CH3 доменов человеческого IgG. Белок слияния может быть также получен генноинженерными способами с использованием методик рекомбинантной ДНК. Например, в одном варианте настоящее изобретение может включать выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте полипептид RAGE может включать сайт связывания лиганда RAGE. Белок или полипептид RAGE может включать человеческий RAGE полной длины (например, SEQID NO: 1) или фрагмент человеческого RAGE. В одном варианте полипептид RAGE не включает какиелибо остатки из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может включать остатки 1-22 или остатки 1-23 из RAGE полной длины (SEQ ID NO: 1). В альтернативных вариантах полипептид RAGE может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична человеческому RAGE или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид RAGE может включать человеческий RAGE или его фрагмент, в котором содержится в качестве первого остатка, скорее,глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al. (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать RAGE полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ IDNO: 2 или SEQ ID NO: 3, фиг. 1 А и 1B) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать sRAGE (например, SEQ ID NO: 4) или полипептид, который на 90% идентичен sRAGE или фрагменту sRAGE. Например, полипептид RAGE может включать человеческий sRAGE или его фрагмент, при этом в качестве первого остатка содержится, скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al. (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ IDNO: 5 или SEQ ID NO: 6, фиг. 1 С) или часть такой аминокислотной последовательности. В других вариантах белок RAGE может включать V домен (например, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8; фиг. 1D). Или,в другом варианте, может использоваться последовательность, которая на 90% идентична V доменуRAGE или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок RAGE может включать фрагмент RAGE, включающий часть V домена (например, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, фиг. 1D). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент RAGE представляет собой синтетический пептид. В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты включает SEQ ID NO: 25, который кодирует аминокислоты на участке 1-118 из человеческого RAGE или его фрагмента. Например, может использоваться последовательность, включающая нуклеотиды 1-348 из SEQ ID NO: 25, которая кодирует аминокислоты на участке 1-116 из человеческого RAGE. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность SEQ ID NO: 6, которая кодирует аминокислоты на участке 1-123 из человеческого RAGE. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательностьSEQ ID NO: 27, которая кодирует аминокислоты 1-136 из человеческого RAGE. Или, в другом варианте,нуклеиновая кислота может включать последовательность SEQ ID NO: 28, которая кодирует аминокислоты 1-120 из человеческого RAGE. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность SEQ ID NO: 29, которая кодирует аминокислоты на участке 1-251 из человеческогоRAGE. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты указанных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют фрагменты полипептида RAGE. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина (или ее часть) может быть получена из любого известного изотипа тяжелой цепи: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Кроме того, тяжелая цепь(или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелых цепей: IgG1 (1), IgG2 (2),IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, содержащих мутации, которые меняют биологическую активность. Второй полипептид может включать CH2 иCH3 домены человеческого IgG1, или часть любого из них, или оба указанных домена. В качестве примерных вариантов можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 человеческого IgG или их часть, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 41.Fc часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием in vivo. Так, белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению может включать междоменный линкер, полученный из RAGE, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения белок слияния может кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Кроме того, данный способ может включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. А также данный способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в хозяйскую клетку. Таким образом, в одном варианте настоящее изобретение включает способ получения белка слияния на основе RAGE, включающий стадию ковалентного присоединения полипептида RAGE к полипептиду, включающему домен CH2 иммуноглобулина или часть домена CH2 иммуноглобулина. В данном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда RAGE. Сайт связывания лигандаRAGE может также включать V домен RAGE или его часть. В одном варианте сайт связывания лигандаRAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична. Например, в одном варианте настоящее изобретение включает нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления изобретения CH2 домен или его фрагмент включает SEQ ID NO: 42. Второй полипептид может включать CH2 и CH3 домены из человеческого IgG1. В качестве примерного варианта осуществления изобретения можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 человеческого IgG1, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Иммуноглобулиновый полипептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQID NO: 39 или SEQ ID NO: 41. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид RAGE может включать междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера непосредственно присоединена кN-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий CH2 домен иммуноглобулина, может включать полипептид, включающий CH2 и CH3 домены из человеческого IgG1 или часть одного или обоих указанных доменов. В качестве примерного варианта осуществления изобретения следует указать полипептид, включающий CH2 и CH3 до- 12012082 мены из человеческого IgG1 и их часть, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменовRAGE. Кроме того, полипептид RAGE, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, может включать фрагмент белка RAGE полной длины. Например, в одном варианте белок слияния по настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Fc. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE и второму междоменному линкеру RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к Сконцевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-251 человеческого RAGE (SEQ ID NO: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 человеческого RAGE (SEQ IDNO: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С 1 домену,междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации С 1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 30 или его фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе RAGE. Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептидаFc. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-136 человеческого RAGE (SEQ ID NO: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 человеческого RAGE (SEQ ID NO: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 31 или ее фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе RAGE. Фрагмент междоменного линкера RAGE может включать пептидную последовательность, соответствующую направлению считывания информации в природном состоянии и которая, таким образом,присоединена к иммуноглобулиновому домену RAGE. Например, в случае V домена RAGE междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые соответствуют направлению считывания информации из V домена. В данном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает SEQ ID NO: 23, включающую аминокислоты на участке 117-136 из RAGE полной длины. Или могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 21, содержащие делецию из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23. В случае С 1 домена RAGE линкер может включать пептидную последовательность, которые соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из С 1 домена. В данном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления и в направлении считывания информации (соответственно, в положениях апстрим и даунстрим) из SEQ IDNO: 22. Или могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 15, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер RAGE может включать SEQ ID NO: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать SEQ ID NO: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из RAGE. Описываемый способ может также включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Так, в данном варианте настоящее изобретение включает вектор экспрессии, который кодирует белок слияния, включающий полипептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, вклю- 13012082 чающему домен СН 2 иммуноглобулина или часть домена CH2 иммуноглобулина. В данном варианте полипептид RAGE включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании, содержащие междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии, используемый для трансфекции клеток, может включать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 30 или ее фрагмент или SEQ ID NO: 31 или ее фрагмент. Данный способ может также включать стадию трансфекции клетки вектором экспрессии согласно настоящему изобретению. Так, в одном варианте, настоящее изобретение включает клетку, трансфицированную вектором экспрессии, который экспрессирует белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению, так что клетка экспрессирует белок слияния, включающий полипептид RAGE,непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему СН 2 домен иммуноглобулина или часть СН 2 домена иммуноглобулина. В данном варианте полипептид RAGE включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании конструкции, содержащие междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 30 или ее фрагмент или SEQ IDNO: 31 или ее фрагмент. Например, плазмиды могут быть сконструированы таким образом, что они будут экспрессировать белки слияния RAGE-IgG Fc, получаемые путем объединения 5' последовательностей кДНК различной длины для человеческого RAGE с 3' кДНК последовательностью человеческого IgG1 Fc (1). Последовательности кассет экспрессии могут быть вставлены в вектор экспрессии, такой как вектор экспрессии pcDNA3.1 (Invitrogen, CA), с использованием стандартных рекомбинантных методик. Кроме того, описываемый способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в хозяйскую клетку. В одном варианте рекомбинант может быть трансфицирован в клетки яичника китайского хомяка, после чего проводится оптимизация экспрессии. В альтернативных вариантах клетки могут продуцировать от 0,1 до 20 г/л, или от 0,5 до 10 г/л, или примерно 1-2 г/л. Как известно в данной области техники, такие конструкции нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы за счет мутаций, например, путем амплификации в рамках ПЦР матрицы нуклеиновой кислоты с использованием праймеров, включающих интересующую мутацию. При использовании данного способа могут быть созданы полипептиды, включающие лиганды RAGE с варьирующей аффинностью. В одном варианте мутированные последовательности могут быть на 90% или более идентичны исходной ДНК. В качестве таковых варианты могут включать нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях (то есть в условиях, эквивалентных примерно температуре 2027 С ниже температуры плавления (Тпл) дуплекса ДНК в 1 мол. растворе соли). Кодирующая последовательность может быть экспрессирована при трансфекции вектора экспрессии в соответствующую хозяйскую клетку. Например, рекомбинантные векторы могут быть стабильно трансфицированы в клетки яичника китайского хомяка (СНО), после чего могут быть отобраны и клонированы клетки, экспрессирующие белок слияния. В одном варианте клетки, экспрессирующие рекомбинантную конструкцию, выбирают по резистентности к неомицину, кодируемой плазмидой, при внесении антибиотика G418. Индивидуальные клоны могут быть отобраны, и клоны, экспрессирующие высокие уровни рекомбинантного белка, выявленные по методу вестерн-блоттинга клеточного супернатанта, могут быть размножены, и генный продукт далее очищен аффинной хроматографией с использованием колонок с белком А. Примерные рекомбинантные аминокислоты, которые кодируют белки слияния согласно настоящему изобретению, показаны на фиг. 2-5. Например, в соответствии с указанным выше белок слияния, продуцируемый конструкцией рекомбинантной ДНК, может включать полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. Белок слияния может включать два домена, полученных из белка RAGE, и два домена, полученных из иммуноглобулина. Примерная конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая белок слияния, ТТР-4000 (ТТ 4), имеющий указанный тип конструкции, показана на фиг. 2 (SEQ ID NO: 30). Как видно из фиг. 2, кодирующая последовательность на участке 1-753 (выделенная жирным шрифтом) кодирует N-концевую белковую последовательность RAGE, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность IgG Fc. В случае получения из SEQ ID NO: 30 или последовательности, которая на 90% идентична ей, белок слияния может включать четырехдоменную аминокислотную последовательностью SEQ ID NO: 32 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 33 или SEQ IDNO: 34, фиг. 4). На фиг. 4 аминокислотная последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Иммуноглобулиновая последовательность представляет собой иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 из IgG. Как видно из фиг. 6 В, первые 251 аминокислот белка слияния ТТР-4000 RAGE полной длины содержат в- 14012082 качестве полипептидной последовательности RAGE сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116, междоменный линкер, включающий аминокислоты 117-123,второй иммуноглобулиновый домен (С 1), включающий аминокислоты на участке 124-221, и междоменный линкер в направлении считывания информации, включающий аминокислоты на участке 222-251. В одном варианте белок слияния может необязательно включать второй иммуноглобулиновый домен RAGE. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный изRAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Fc. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей данный тип белка слияния, показан на фиг. 3 (SEQ ID NO: 31). Как видно из фиг. 3, кодирующая последовательность на участке нуклеотидов 1-408 (выделенная жирным шрифтом) кодирует N-концевую белковую последовательность RAGE, а последовательность на участке 409-1041 кодирует белковую последовательность IgG1 Fc (1). В случае получения из SEQ ID NO: 31 или последовательности, которая на 90% ей идентична, белок слияния может включать трехдоменную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 37, фиг. 5). На фиг. 5 аминокислотная последовательность RAGE выделена жирным шрифтом. Как видно из фиг. 6 В,первые 136 аминокислот из белок слияния ТТР-3000 RAGE полной длины содержат в качестве полипептида RAGE сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116,и междоменный линкер, включающий аминокислоты на участке 117-136. Последовательность на участке 137-346 включает иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 из IgG. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут демонстрировать повышенную стабильность in vivo относительно полипептидов RAGE, которые не содержат второй полипептид. Белок слияния может быть далее модифицирован для повышения стабильности, эффективности, активности и биологической доступности. Так, белки слияния по настоящему изобретению могут быть модифицированы за счет посттрансляционного процессинга или путем химической модификации. Например, белок слияния может быть приготовлен методом синтеза, так чтобы он включал L-, D- или неприродные аминокислоты, альфа-двузамещенные аминокислоты или N-алкиламинокислоты. Дополнительно, белки могут быть модифицированы путем ацетилирования, ацилирования, АДФ-рибозилирования, амидирования,присоединения липидов, таких как фосфатидилинозит, за счет образования дисульфидных связей и т.п. Кроме того, может быть добавлен полиэтиленгликоль для повышения биологической стабильности белка слияния. Связывание антагонистов RAGE с белками слияния на основе RAGE Белки слияния согласно настоящему изобретению могут иметь множество различных применений. Например, белок слияния согласно настоящему изобретению может использоваться в тесте на связывание для идентификации лигандов RAGE, таких как агонисты, антагонисты или модуляторы RAGE. Например, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу выявления модуляторовRAGE, включающему: (a) получение белка слияния, включающего полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE, где полипептид RAGE включает сайт связывания лиганда; (b) смешивание интересующего соединения и лиганда, имеющего известную связывающую аффинность для RAGE, с белком слияния и (c) измерение уровня связывания известного лиганда RAGE с белком слияния на основе в присутствии интересующего соединения. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Белки слияния на основе RAGE могут также включать наборы для выявления модуляторов RAGE. Например, в одном варианте набор согласно настоящему изобретению может включать: (а) соединение,обладающее известной связывающей аффинностью с RAGE, в качестве позитивного контроля; (b) белок слияния на основе RAGE, включающий полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду,отличному от RAGE, где полипептид RAGE включает сайт связывания лиганда RAGE; и (с) инструкции по использованию. В одном варианте сайт связывания лиганда RAGE включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Белок или полипептид RAGE может включать человеческий RAGE полной длины (например, SEQID NO: 1) или фрагмент человеческого RAGE. В одном варианте полипептид RAGE не включает какихлибо остатков из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из RAGE полной длины (SEQ ID NO: 1). В альтернативных вариантах полипептид RAGE может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому RAGE или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид RAGE может включать человеческий RAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует,скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al. (1992. Или, в другом варианте, человеческийRAGE может включать RAGE полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например,SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, фиг. 1 А и 1 В) или часть такой аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать sRAGE (например, SEQ ID NO: 4),полипептид, который на 90% идентичен sRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE- 15012082 может включать человеческий sRAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует,скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al. (1992. Или, в другом варианте, человеческийRAGE может включать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, фиг. 1 С) или часть такой аминокислотной последовательности. В других вариантах белок RAGE может включать V домен (например, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, фиг. 1D). Или может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок RAGE может включать фрагмент RAGE, включающий часть V домена (например, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, фиг. 1D). В данном варианте сайт связывания лиганда может включать SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент RAGE представляет собой синтетический пептид. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4),IgA1 (1), IgA2 (2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены CH2 и CH3 из человеческого IgG1, или часть каждого из них, или оба указанных домена. В качестве реперезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 из человеческого IgG или их часть, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 41.Fc часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием in vivo. Так, в одном варианте белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению включает последовательность Fc, полученную из RAGE, а не из иммуноглобулиновой цепи. В данном варианте белок слияния может включать иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен CH2 или его фрагмент. В одном варианте полипептид RAGE может включать междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий CH2 домен иммуноглобулина, может включать полипептид,включающий домены CH2 и CH3 из человеческого IgG1 или часть обоих или любого из этих доменов. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 человеческого IgG1 или их часть, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов изRAGE. Кроме того, полипептид RAGE, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, может включать фрагмент белка RAGE полной длины. Например, в одном варианте белок слияния по настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Fc. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен RAGE, и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE, и второй междоменный линкер RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к Сконцевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена CH2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого RAGE(SEQ ID NO: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену,С 1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второй междоменный линкер в направлении считывания информации из С 1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 30 или его фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе RAGE. Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептидаFc. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен СH2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокис- 16012082 лоты на участке 23-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 человеческого RAGE (SEQ ID NO: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе RAGE. Как указывалось выше, фрагмент междоменного линкера RAGE может включать пептидную последовательность, которая соответствует в природном состоянии направлению считыванию информации и,таким образом, присоединена к иммуноглобулиновому домену RAGE. Например, в случае V доменаRAGE междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые в природном состоянии соответствуют направлению считывания информации из V домена. В данном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться междоменный линкер,включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации SEQ ID NO: 21. Так, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает SEQ ID NO: 23, включающий аминокислоты на участке 117-136 из RAGE полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты SEQ IDNO: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23. В случае С 1 домена RAGE линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует в природном состоянии направлению считывания информации из С 1 домена. В данном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться линкер, включающий несколько (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) аминокислот против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 22. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер RAGE может включать SEQ ID NO: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или, в другом варианте,междоменный линкер может включать SEQ ID NO: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318342 из RAGE. Например, белок слияния на основе RAGE может использоваться в тесте на связывание для идентификации потенциальных лигандов RAGE. В одном примерном варианте такого теста на связывание известный лиганд RAGE может быть нанесен на твердый субстрат (например, на планшеты Максисорб(Maxisorb в концентрации примерно 5 мкг на ячейку, где каждая ячейка содержит общий объем примерно 100 мкл. Планшеты инкубируют при температуре 4 С в течение ночи для абсорбции лиганда. Альтернативно, могут использоваться более короткие периоды инкубации при более высоких температурах(например, при комнатной температуре). После истечения периода времени, необходимого для того, чтобы лиганд связался с субстратом, содержимое ячеек отсасывают и добавляют блокирующий буфер (например, 1% БСА в 50 мМ имидазольном буфере, рН 7,2) для блокирования неспецифического связывания. Например, блокирующий буфер может быть добавлен к планшетам на 1 ч при комнатной температуре. Далее содержимое ячеек в планшетах отсасывают и/или промывают промывочным буфером. В таком варианте может быть использован буфер, включающий 20 мМ имидазола, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, 5 мМ CaCl2 и 5 мМ MgCl2, рН 7,2, в качестве промывочного буфера. Далее к экспериментальным ячейкам может быть добавлен белок слияния в возрастающих разведениях. Далее белок слияния на основе RAGE инкубируют с иммобилизованным лигандом в экспериментальных ячейках, так чтобы было достигнуто равновесие по связыванию. В одном варианте белок слияния RAGE инкубируют с иммобилизованным лигандом примерно в течение 1 ч при температуре 37 С. В альтернативных вариантах используют более длительные периоды инкубации при более низких температурах. По окончании инкубации белка слияния и иммобилизованного лиганда планшет промывают для удаления несвязанного белка слияния. Белок слияния, связанный с иммобилизованным лигандом, может быть выявлен различными способами. В одном варианте для выявления используют методику ELISA. Так, в одном варианте комплекс для иммунологического выявления, содержащий моноклональный мышиный IgG1 против человеческого компонента, биотинилированный козий антимышиный IgG и авидин с присоединенной щелочной фосфатазой, может быть добавлен к белку слияния, иммобилизованному в экспериментальной ячейке. Комплекс для иммунологического выявления может быть подвергнут связыванию с иммобилизованным белком слияния, так чтобы связывание между белком слияния и комплексом для иммунологического выявления достигло равновесия. Например, комплекс может быть подвергнут связыванию с белком слияния в течение 1 ч при комнатной температуре. В этой точке несвязанный комплекс может быть удален промывкой экспериментальных ячеек промывочным буфером. Связанный комплекс может быть вы- 17012082 явлен при добавлении субстрата щелочной фосфатазы, паранитрофенилфосфата (ПНФФ (PNPP, с последующим измерением уровня превращения ПНФФ в паранитрофенол (ПНФ (PNP, определяемого как повышение поглощения при длине волны 405 нм. В одном варианте лиганд RAGE связывается с белком слияния на основе RAGE с наномолярной(нМ) или микромолярной (мкМ) аффинностью. На фиг. 7 проиллюстрирован эксперимент, демонстрирующий связывание лигандов RAGE с белками слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению. Готовят растворы ТТР-3000 (ТТ 3) и ТТР-4000 (ТТ 4) с исходными концентрациями 1,082 мг/мл и 370 мкг/мл, соответственно. Как видно из фиг. 7, при разных разведениях белки слияния ТТР-3000 и ТТР-4000 способны связываться с иммобилизованными лигандами RAGE амилоид-бета (Абета) (Amyloid Beta (1-40) от Biosource), S100b (S100) и амфотерином (Ampho), что приводит к повышению уровня поглощения. В отсутствие лиганда (например, при нанесении покрытия только из БСА) не отмечается повышения поглощения. Тест на связывание согласно настоящему изобретению может использоваться для количественного определения уровня связывания лиганда с RAGE. В альтернативных вариантах лиганды RAGE могут связываться с белком слияния согласно настоящему изобретению с аффинностями по связыванию, варьирующими от 0,1 до 1000 нМ, или от 1 до 500 нМ, или от 10 до 80 нМ. Белок слияния по настоящему изобретению может также использоваться для идентификации соединений, обладающих способностью связываться с RAGE. Как показано на фиг. 8 и 9, соответственно,лиганд RAGE может быть исследован на его способность конкурировать с иммобилизованным амилоидбета за связывание с белками слияния ТТР-4000 (ТТ 4) и ТТР-3000 (ТТ 3). Так, можно видеть, что лиганд RAGE в конечной концентрации в тесте (FAC), равной 10 мкМ, может вытеснять в реакции связывания белка слияния RAGE с амилоид-бета в концентрациях 1:3, 1:10,1:30 и 1:100 исходного раствора ТТР-4000 (фиг. 8) и ТТР-3000 (фиг. 9). Модуляция клеточных эффекторов Варианты белков слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции биологического ответа, опосредованного RAGE. Например, могут быть созданы белки слияния с целью модуляции RAGE-индуцированного повышения их генной экспрессии. Так, в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции функций биологических ферментов. Например, взаимодействие между RAGE и лигандами может вызывать окислительный стресс и активацию NF-В и генов, регулируемых NF-В, таких как цитокины IL-1, TNF- и т.п. Дополнительно было показано, что некоторые другие регуляторные пути, такие как пути, вовлекающиеp21ras, МАР-киназы, ERK1 и ERK2, активируются при связывании AGE и других лигандов с RAGE. Использование белков слияния согласно настоящему изобретению для модуляции экспрессии клеточного эффектора TNF- показано на фиг. 10. Миелоидные клетки ТНР-1 культивируют в среде RPMI 1640 с добавкой 10% ФСТ и индуцируют секрецию TNF- путем стимуляции RAGE с использованиемS100b. В случае такой стимуляции в присутствии белка слияния RAGE индукция TNF- за счет связывания S100b с RAGE может быть ингибирована. Так, на фиг. 10 показано, что добавление 10 мкг белка слияния на основе RAGE ТТР-3000 (ТТ 3) или ТТР-4000 (ТТ 4) снижает индукцию TNF- под действиемS100b примерно на 50-75%. Белок слияния ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, столь же эффективен по блокированию индукции TNF- под действием S100b, как и sRAGE (фиг. 10). Специфичность ингибирования последовательностей RAGE для ТТР-4000 и ТТР-3000 показана в эксперименте, в рамках которого добавляют один IgG к S100b-стимулированным клеткам. Добавление IgG и S100b к тесту приводит к тем же уровням TNF-, что и добавление одного S100b. Физиологические характеристики белков слияния на основе RAGE Хотя sRAGE может оказывать терапевтический эффект при модуляции RAGE-опосредованных заболеваний, человеческий sRAGE может иметь ограничения при использовании его в рамках единственного терапевтического подхода, определяемые относительно коротким периодом полувыведения sRAGE из плазмы. Например, тогда как sRAGE грызунов имеет период полувыведения у нормальных и диабетических крыс, равный примерно 20 ч, человеческий sRAGE имеет период полувыведения менее чем 2 ч при оценке по сохранению иммунореактивности sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290: 14581466 (1999. Для достижения терапевтического эффекта RAGE, который имеет близкие к sRAGE характеристики по связыванию, но более стабильный фармакокинетический профиль, может быть использован белок слияния на основе RAGE, включающий сайт связывания лиганда RAGE, присоединенный к одному или нескольким иммуноглобулиновым доменам человека. Как известно в данной области, иммуноглобулиновые домены могут включать Fc часть тяжелой цепи иммуноглобулина.Fc часть иммуноглобулина может придавать некоторые свойства белкам слияния. Например, белок слияния Fc может повышать период полувыведения таких белков слияния из сыворотки и зачастую от нескольких часов до нескольких дней. Повышение фармакокинетической стабильности, в основном,представляет собой результат взаимодействия линкера, находящегося между участками CH2 и CH3 фрагмента Fc, с рецептором FcRn (Wines et al., J. Immunol., 164: 5313-5318 (2000.- 18012082 Хотя белки слияния, включающие полипептид Fc иммуноглобулина, могут давать преимущество,определяемое повышенной стабильностью, иммуноглобулиновые белки слияния могут вызывать воспалительный ответ при введении в организм хозяина. Воспалительный ответ может определяться, в основном, Fc частью иммуноглобулина в белке слияния. Провоспалительный ответ может быть желательным,если целевое соединение экспрессируется в таких клетках, пораженных таким заболеванием, которые следует устранить (например, в раковой клетке или в популяции лимфоцитов, вызывающих аутоиммунное заболевание). Провоспалительный ответ может быть нейтральной особенностью, если целевое соединение представляет собой растворимый белок, поскольку большая часть растворимых белков не активирует иммуноглобулины. Однако провоспалительный ответ может быть отрицательной характеристикой, если целевое соединение экспрессируется на клетках такого типа, разрушение которых может привести к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, провоспалительный ответ также может быть отрицательной характеристикой, если воспалительный каскад устанавливается в сайте связывания белка слияния с тканью-мишенью, поскольку многие медиаторы воспаления могут быть вредны для окружающей ткани и/или могут вызвать системные эффекты. Первичный провоспалительный сайт на иммуноглобулиновых Fc фрагментах находится на шарнирном участке между CH2 и CH3. Данный шарнирный участок взаимодействует с FcR1-3, находящимися на разных лейкоцитах, и заставляет эти клетки воздействовать на мишень (Wines et al., J. Immunol., 164: 5313-5318 (2000. Белки слияния на основе RAGE при их использовании в качестве терапевтических препаратов для лечения RAGE-опосредованных заболеваний могут не вызывать воспалительный ответ. Так, некоторые варианты белков слияния RAGE по настоящему изобретению могут включать белок слияния, включающий полипептид RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому(ым) домену(ам), где Fc шарнирный участок в иммуноглобулине удален и замещен полипептидом RAGE. В этом случае взаимодействие между белком слияния на основе RAGE и Fc рецепторами на воспалительных клетках может быть минимизировано. Однако может быть важно поддерживать соответствующие липкие свойства и другие формы взаимодействия, определяемые трехмерной структурой, между различными иммуноглобулиновыми доменами белка слияния. Так, варианты белков слияния согласно настоящему изобретению могут замещать биологически инертный, но структурно близкий междоменный линкер RAGE, который разделяет V и С 1 домены RAGE, или линкер, который разделяет С 1 и С 2 домены RAGE в нормальном шарнирном участке тяжелой цепи иммуноглобулина. Так, полипептид RAGE в белке слияния может включать последовательность междоменного линкера, которая в природном состоянии соответствует направлению считывания информации из иммуноглобулинового домена RAGE, с образованием иммуноглобулинового доменаRAGE/линкерного фрагмента. При осуществлении данного способа удается сохранять трехмерные взаимодействия между иммуноглобулиновыми доменами, определяемыми RAGE или иммуноглобулином. В одном варианте белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению может вызывать существенное повышение фармакокинетической стабильности в сравнении с sRAGE. Например, как видно из фиг. 11, при насыщении ТТР-4000, белка слияния на основе RAGE, его лигандами может сохраняться период полувыведения более 300 ч. Это резко отличается от значения периода полувыведенияsRAGE, который насчитывает лишь несколько часов в плазме человека. Таким образом, белки слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению могут использоваться для антагонизации в процессе связывания физиологических лигандов с RAGE и представлять собой средство лечения RAGE-опосредованных заболеваний, не вызывая неприемлемого уровня воспаления. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут демонстрировать существенное снижение воспалительного ответа в сравнении с IgG. Например, как видно из фиг. 12, ТТР-4000, белок слияния на основе RAGE, не стимулирует высвобождение TNF- из клеток в условиях, при которых выявляется высвобождение TNF-, стимулированное человеческим IgG. Лечение заболевания белками слияния на основе RAGE Настоящее изобретение может также включать способы лечения RAGE-опосредованного расстройства у человека. В одном варианте данный способ может включать введение субъекту белка слияния,включающего полипептид RAGE, который включает сайт связывания лиганда RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда RAGE. В одном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда RAGE может включать V домен RAGE или его часть. В данном варианте сайт связывания лиганда RAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. В одном варианте полипептид RAGE может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть фрагмент) иммуноглобулинового домена. В данном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из CH2 или CH3 доменов человеческого IgG.- 19012082 Белок или полипептид RAGE может включать человеческий RAGE полной длины (например, SEQID NO: 1) или фрагмент человеческого RAGE. В данном варианте полипептид RAGE не включает какиелибо остатки из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из RAGE полной длины (SEQ ID NO: 1). В альтернативных вариантах полипептид RAGE может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому RAGE или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид RAGE может включать человеческий RAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует,скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать RAGE полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, фиг. 1 А и 1 В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать sRAGE (например,SEQ ID NO: 4), полипептид, который на 90% идентичен sRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может включать человеческий sRAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, фиг. 1 С) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок RAGE может включать V домен (например, SEQ ID NO: 7 или SEQ IDNO: 8, фиг. 1D). Или, в другом варианте, может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок RAGE может включать фрагментRAGE, включающий часть V домена (например, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, фиг. 1D). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент RAGE представляет собой синтетический пептид. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид в белке слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь(или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: IgG , IgM , IgD, IgEили IgA . Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4), IgA1 (1), IgA2 (2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать CH2 и CH3 домены из человеческого IgG1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий CH2 и CH3 домены человеческого IgG1 или их часть, который может включатьSEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 41. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-116 из человеческогоRAGE (SEQ ID NO: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-116 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 124-221 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С 1 домену RAGE. В другом варианте полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 227-317 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую С 2 домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-123 из человеческого RAGE (SEQID NO: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-123 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 14) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-226 из человеческогоRAGE (SEQ ID NO: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-226 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 18) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С 1 домену и междоменному линкеру, соединяющему оба указанных домена. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична, или остатки на участке 24-339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 6) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую sRAGE (то есть кодирующую V, С 1 и С 2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.Fc часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительной активностью in vivo. Так, в одном варианте белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из RAGE, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе RAGE может также включать полипеп- 20012082 тид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему CH2 домен иммуноглобулина или фрагмент. В одном варианте CH2 домен или его фрагмент может включать SEQ ID NO: 42. В одном варианте полипептид RAGE может включать междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающийCH2 домен иммуноглобулина, может включать СН 2 и CH3 домены из человеческого IgG1. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий CH2 и CH3 домены человеческогоIgG1, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов изRAGE. Кроме того, полипептид RAGE, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, может включать фрагмент белка RAGE полной длины. Например, в одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Fc. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE и второму междоменному линкеру RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена CH2 или его фрагмент. Например, полипептидRAGE может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С 1 домену, междоменному линкеру, соединяющему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации из С 1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 30 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе RAGE. Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептидаFc. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая SEQ ID NO: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния RAGE. Фрагмент междоменного линкера RAGE может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии и, таким образом, присоединенную к иммуноглобулиновому домену RAGE. Например, в случае V домена RAGE междоменный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации из V домена, в природном состоянии. В данном варианте линкер может включатьSEQ ID NO: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает SEQ ID NO: 23, включающую аминокислоты на участке 117136 из RAGE полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 21,содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентичнаSEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23. В случае С 1 домена RAGE линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации из С 1 домена, в природном состоянии. В одном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 22, соответствующий аминокислотам на участке 222-251 RAGE полной длины. Линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться линкер, включающий несколько (например,1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) аминокислот против направления или в направлении считыва- 21012082 ния информации из SEQ ID NO: 22. Или могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер RAGE может включать SEQ ID NO: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать SEQ ID NO: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из RAGE. В одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может вводиться различными способами. Введение белка RAGE согласно настоящему изобретению может включать внутрибрюшинную инъекцию (в/б). Альтернативно, белок слияния на основе RAGE может вводиться перорально, интраназально или в аэрозольной форме. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе RAGE может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния. В другом варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозиториев и т.п. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний в тех случаях, когда желательно самолечение. Для подтверждения полезности использования соединений, модулирующих RAGE, в качестве лекарственных средств оценивались результаты их применения у разных животных, взятых в качестве соответствующих моделей. Примеры таких моделей включают:a) ингибирование под действием sRAGE образования неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерий как у диабетических, так и нормальных крыс путем ингибирования активации эндотелия, гладких мышц и макрофагов посредством RAGE (Zhou et al., Circulation 107: 2238-2243 (2003;RAGE, снижение образования амилоидных бляшек на модели мышей с системный амилоидозом (Yan etal., Nat. Med., 6: 643-651 (2000. Снижение амилоидных бляшек сопровождается снижением уровня воспалительных цитокинов, интерлейкина-6 (IL-6) и макрофагального колониестимулирующего фактора(М-КСФ), а также сниженной активацией NF-В у обработанных животных;c) RAGE-трансгенные мыши (осуществляющие суперэкспрессию RAGE и негативную экспрессию доминантного RAGE) демонстрируют образование бляшек и расстройство распознавательной способности, в рамках модели мышей с БА (Arancio et al., EMBO J. , 23: 4096-4105 (2004;d) использование sRAGE при лечении мышей с диабетом снижает проницаемость сосудовe) лечение с использованием sRAGE снижает уровень атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином E-null и предотвращает появление функциональных и морфологических признаков диабетической нефропатии у db/db мышей (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419: 80-88 (2003) иf) sRAGE ослабляет тяжесть воспаления на модели мышей с артритом, индуцированным коллагеном (Hofmann et al., Genes Immunol., 3: 123-135 (2002, на модели мышей с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (Yan et al., Nat. Med., 9: 28-293 (2003 и на модели мышей с воспалительным заболеванием кишечника (Hofmann et al., Cell., 97: 889-901 (1999. Таким образом, в одном варианте осуществления белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения симптомов диабета и/или осложнений диабета, опосредованныхRAGE. В альтернативных вариантах симптомы диабета или поздние осложнения диабета могут включать диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечно-сосудистые осложнения диабета или диабетическую невропатию. Первоначально идентифицированный как рецептор молекул, экспрессия которых ассоциирована с патологией диабета, сам по себе RAGE является обязательным компонентом в патофизиологии диабетических осложнений. Было показано, что ингибирование взаимодействия RAGE с его лигандом(ами) invivo оказывает терапевтический эффект на многих моделях диабетических осложнений и воспаления(Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419: 80-88 (2003. Например, лечение в течение 2 месяцев с использованием антител против RAGE нормализовало почечную функцию и снизило аномальную гистопатологию почки у мышей с диабетом (Flyvbjerg et al., Diabetes., 53: 166-172 (2004. Кроме того, лечение с использованием растворимой формы RAGE (sRAGE), который связывается с лигандами RAGE и ингибирует взаимодействия RAGE/лиганда, снижает выраженность атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином E-null и снижает функциональную и морфологическую патологию диабетической нефропатии у мышей db/db (Bucciarelli et al., Circulation., 106: 2827-2835 (2002. Кроме того, было показано, что неэнзиматическое гликоксилирование макромолекул, приводящее в итоге к образованию конечных продуктов с повышенным гликозилированием (AGE), усиливается в сайтах воспаления при почечной недостаточности, в случае гипергликемии и других состояний, ассоциированных с системным или локальным окислительным стрессом (Dyer et al., J. Clin. Invest., 91: 2463-2469Degenhardt et al., Cell. Mol. Biol., 44: 1139-1145 (1998. Накопление AGE в сосудистой сетке может осу- 22012082 ществляться в очагах, например в суставном амилоиде, состоящем из AGE-2-микроглобулина, обнаруженного у пациентов с амилоидозом, связанным с диабетом (Miyata et al., J. Clin. Invest., 92: 1243-1252(1993); Miyata et al., J. Clin. Invest., 99: 1088-1094 (1996, или, в основном, встречается в сосудистой сетке и ткани пациентов с диабетом (Schmidt et al., Nature. Med., 1: 1002-1004 (1995. Прогрессирующее накопление AGE с течением времени у пациентов с диабетом говорит о том, что механизм эндогенного клиренса не способен эффективно функционировать в сайтах осаждения AGE. Такие аккумулированныеAGE обладают способностью менять клеточные свойства посредством множества механизмов. ХотяAGE экспрессируется на низком уровне в нормальных тканях и в сосудистой клетке, было показано, что в среде, где накапливаются лиганды рецептора, RAGE подвергается позитивной регуляции (Li et al., J.Chem., 275: 25781-25790 (2000. Экспрессия RAGE повышается в эндотелии, гладкомышечных клетках и инфильтрующих моноядерных фагоцитах сосудистой сетки при диабете. Кроме того, исследования с использованием клеточной культуры показали, что взаимодействие AGE-RAGE вызывает изменения клеточных свойств, важных для сосудистого гомеостаза. Использование белков слияния на основе RAGE при лечении патологий, связанных с диабетом,проиллюстрировано на фиг. 13. Белок слияния на основе RAGE, TTP-4000, оценивают на модели рестеноза у крыс с диабетом при проведении измерения пролиферации гладких мышц и размножения клеток интимы после поражения сосудистой сетки. Как показано на фиг. 13, лечение с использованием ТТР 4000 существенно снижает соотношение интима/среда (И/С) (фиг. 13 А, табл. 1) на модели ассоциированного с диабетом рестеноза зависимым от дозы способом. Кроме того, лечение с использованием ТТР 4000 существенно снижает ассоциированную с рестенозом пролиферацию гладкомышечных клеток сосудистой сетки зависимым от дозы способом. Таблица 1 Эффект ТТР-4000 на модели крыс с рестенозом Р 0,05.В качестве высокой и низкой дозы используется нагрузочная доза, равная 3 мг/животное. В других вариантах белки слияния согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения или реверсирования амилоидоза или болезни Альцгеймера. RAGE представляет собой рецептор для бета-амилоида (А), а также других амилоидогенных белков, включая SAA и амилин (Yan etMed., 6: 643-651 (2000); Sousa et al., Lab. Invest., 80: 1101-1110 (2000. Кроме того, лиганды RAGE,включая AGE, S100b и А белки, найдены в ткани, окружающей старческие бляшки у человека (Luth etRAGE связывается с фибриллярным -складчатым, независимо от состава субъединиц (пептид амилоидal., Nat. Med., 6: 643-651 (2000. Кроме того, было показано, что отложение амилоида приводит к усилению экспрессии RAGE. Например, в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) экспрессия RAGE повышается в нейронах и глии (Yan et al., Nature., 382: 685-691 (1996. Одновременно с экспрессией лигандов RAGE, RAGE подвергается позитивной регуляции в астроцитах и микроглиальных клетках в гиппокампе индивидуумов с болезнью Альцгеймера, но не у индивидуумов с выраженной позитивной регуляцией, но которые не имеют БА (Lue et al., Exp. Neurol., 171: 29-45 (2001. Приведенные данные позволяют полагать, что клетки, экспрессирующие RAGE, активируются за счет взаимодействия RAGE/лиганда RAGE вблизи старческих бляшек. Кроме того, А-опосредованная активация клеток микроглии invitro может блокироваться антителами, направленными против домена связывания лиганда в RAGE (Yanet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 5296-5301 (1997. Было также показано, что RAGE может служить в качестве очаговой точки для сборки фибрилл (Deane et al., Nat. Med., 9: 907-913 (2003. Кроме того, ингибирование in vivo взаимодействия RAGE/лиганда с использованием sRAGE или антител против RAGE может снижать образование амилоидных бляшек на модели мышей с системным амилоидозом (Yan et al., Nat. Med., 6: 643-651 (2000. У двойных трансгенных мышей, осуществляющих суперэкспрессию человеческого RAGE и белка-предшественника человеческого амилоида (АРР) с мута- 23012082 циями Swedish и London (мутант hAPP), в нейронах развиваются дефекты обучения и нейропатологические аномалии раньше, чем в случае их hAPP трансгенных вариантов с одной мутацией. И наоборот,двойные трансгенные мыши со сниженной А сигнальной способностью за счет нейронов, экспрессирующих доминантную негативную форму RAGE на фоне того же мутанта hAPP, демонстрируют задержанное развитие аномалий в обучении в сравнении с их трансгенным вариантом, содержащим один АРР(Arancio et al., EMBO J., 23: 4096-4105 (2004. Кроме того, было показано, что ингибирование взаимодействия RAGE-амилоид снижает экспрессию клеточного RAGE и маркера клеточного стресса (а также активацию NF-В) и снижает отложение амилоида (Yan et al., Nat. Med., 6: 643-651 (2000, что указывает на возможную роль взаимодействияRAGE-амилоида в перестройке клеточных свойств в окружении, обогащенном амилоидом (даже на ранних стадиях), а также при накоплении амилоида. Таким образом, белки слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения с целью снижения амилоидоза, числа амилоидных бляшек, а также познавательной дисфункции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера (БА). Как указывалось выше, на модели животных с БА было показано, что sRAGE снижает как образование амилоидных бляшек в мозге, так и последующее повышение уровня воспалительных маркеров. На фиг. 14 А и 14 В показано, что мыши с БА, которых лечили в течение 3 месяцев с использованием ТТР-4000 или мышиного sRAGE, имеют сниженный уровень амилоид-бета (А) бляшек и менее выраженную познавательную дисфункцию, чем животные, которые получали носитель или человеческий IgG в качестве отрицательного контроля(IgG1). Как и sRAGE, TTP-4000 может также снижать уровень воспалительных цитокинов IL-1 и TNF(данные не показаны), ассоциированных с БА. Кроме того, белки слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых расстройств. Так, было показано, что ишемическая болезнь сердца особенно часто встречается у пациентов с диабетом (Robertson et al., Lab.Care, 2: 120-126 (1979. Кроме того, в других исследованиях было показано, что атеросклероз у пациентов с диабетом развивается быстрее и более масштабно, чем у пациентов без диабета (см., например,Waller et al., Am. J. Med., 69: 498-506 (1980); Crall et al., Am. J. Med., 64: 221-230 (1978); Hamby et al.,Chest, 2: 251-257 (1976); и Pyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3: 463-524 (1978. Хотя имеется множество разных причин ускоренного развития атеросклероза при диабете, было показано, что снижение уровня AGE может приводить к сниженному образованию бляшек. Например, белки слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению могут также использоваться при лечении инсульта. При сравнении ТТР-4000 с sRAGE на релевантной модели животных для инсульта было показано, что ТТР-4000 обеспечивает значительно большее снижение объема некроза. В рамках данной модели среднюю сонную артерию мышей лигируют и затем проводят реперфузию с образованием зоны некроза. Для оценки эффективности белков слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению, в плане лечения или предотвращения инсульта, мышам перед реперфузией вводятsRAGE, или ТТР-4000, или контрольный иммуноглобулин. Как показано в табл. 2, ТТР-4000 был более эффективен, чем sRAGE, по ограничению площади некроза у данных животных, что указывает на то, что ТТР-4000, в связи с его лучшими показателями полувыведения из плазмы, способен оказывать большую защиту, чем sRAGE. Таблица 2 Снижение зоны некроза при инсульте Значимые данные при р 0,001.Сравнение с солевым раствором. В других вариантах белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения рака. В одном варианте лечение рака с использованием белков слияния согласно настоящему изобретению включает раковые клетки, которые экспрессируют RAGE. Например, рак, который можно лечить с использованием белков слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению, включает некоторые виды рака легкого, некоторые глиомы, некоторые папилломы и т.п. Амфотерин представляет собой высокомобильный негистоновый белок группы I, связывающийся с хромосомальной ДНК (Rauvalaet al., J. Biol. Chem., 262: 16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem., 268: 19726-19738 (1994,который, как было показано, взаимодействует с RAGE. Было показано, что амфотерин способствует об- 24012082 разованию нейритных отростков, а также служит в качестве поверхности для сборки протеазных комплексов в системе фибринолиза (который, как известно, также вносит вклад в клеточную мобильность). Дополнительно, местный ингибирующий эффект на рост опухоли за счет блокирования RAGE наблюдается на модели первичной опухоли (С 6 глиома), на модели Льюиса (Lewis) метастазирования в легких(Taguchi et al., Nature 405: 354-360 (2000 и в случае спонтанно возникающих папиллом у мышей, экспрессирующих трансген v-Ha-ras (Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9178-9182 (1990. Еще в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения воспаления. Например, в альтернативных вариантах белок слияния согласно настоящему изобретению используют для лечения воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспаления, ассоциированного с воспалительным заболеванием кишечника, воспаления, ассоциированного с ревматоидным артритом, воспаления, ассоциированного с псориазом, воспаления, ассоциированного с рассеянным склерозом, воспаления, ассоциированного с гипоксией, воспаления, ассоциированного с инсультом, воспаления, ассоциированного с сердечным приступом, воспаления, ассоциированного с геморрагическим шоком, воспаления, ассоциированного с сепсисом, воспаления, ассоциированного с трансплантацией органа, или воспаления, ассоциированного с плохим заживлением ран. Например, после тромболитического лечения воспалительные клетки, такие как гранулоциты, инфильтруют ишемизированную ткань и создают кислородные радикалы, которые могут разрушать больше клеток, чем их было уничтожено гипоксией. Ингибирование рецептора на нейтрофиле, ответственном за способность нейтрофилов инфильтрировать ткань антителами или другими белковыми антагонистами,как было показано, снижает указанную реакцию. Поскольку RAGE представляет собой лиганд такого нейтрофильного рецептора, белок слияния, содержащий фрагмент RAGE, может действовать в качестве приманки, и предотвращать поступление нейтрофилов в реперфузированный сайт, и таким образом предотвращать дальнейшую деструкцию ткани. Роль RAGE в предотвращении воспаления может быть продемонстрирована на примере результатов исследований, в которых показано, что sRAGE ингибирует размножение неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерии, как у крыс с диабетом, так и у нормальных крыс, прежде всего, за счет ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и за счет активации макрофагов через RAGE (Zhou et al., Circulation, 107: 2238-2243 (2003. Дополнительно было показано, что sRAGE оказывает ингибирующее действие на моделях воспаления, включающих гиперчувствительность задержанного типа, на модели с экспериментальным аутоиммунным энцефалитом и на модели воспалительного заболевания кишечника (Hofman etal., Cell, 97: 889-901 (1999. Кроме того, в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения аутоиммунных расстройств. Например, белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения почечной недостаточности. Так, белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения системного волчаночного нефрита или воспалительного волчаночного нефрита. Например, было показано, что S100/калгранулины включают семейство близкородственных кальцийсвязывающих полипептидов, для которых характерно наличие участков с двумя EF-полосами, соединенными связующим пептидом (Schafer et al., TIBS., 21: 134-140 (1996);Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25: 659-664 (1995. Хотя у них отсутствуют сигнальные пептиды, уже давно известно, что S100/калгранулины имеют преимущество, связанное с возможностью их доступа во внеклеточное пространство, особенно в сайты хронических иммунных/воспалительных ответов, как в случае цистного фиброза и ревматоидного артрита. RAGE представляет собой рецептор для многих представителей семейства S100/калгранулина, опосредующих провоспалительное действие на клетки,такие как лимфоциты и моноядерные фагоциты. Кроме того, результаты исследований ответов на моделях гиперчувствительности задержанного типа, колита у мышей IL-10 null, коллагениндуцированного артрита и экспериментального аутоиммунного энцефалитом дают основания полагать, что взаимодействие RAGE-лиганд (преимущественно в рамках S100/калгранулины) играют определенную роль в воспалительном каскаде, находясь в его начале. Так, в различных выбранных экспериментах настоящее изобретение может относиться к способу ингибирования взаимодействия AGE с RAGE у субъекта, осуществляемого путем введения субъекту терапевтически эффективного количества белка слияния согласно настоящему изобретению. Субъект, подлежащий лечению с использованием белков на основе RAGE согласно настоящему изобретению, может представлять собой животное. В одном из таких вариантов указанный субъект представляет собой человека. Субъект может страдать от AGE-родственного заболевания, такого как диабет, диабетические осложнения, такие как нефропатия, нейропатия, ретинопатия, язва стопы, амилоидоз или почечная недостаточность, а также воспаление. Или указанный субъект может представлять собой индивидуум с болезнью Альцгеймера. В альтернативном варианте указанный субъект может быть раковым больным. Еще в других вариантах указанный субъект может представлять собой больного с системой красной волчанкой или с воспалительным волчаночным нефритом. Другие заболевания также могут быть опосредованы участием RAGE и, в этой связи, могут лечиться с использованием белков слияния согласно настоящему изобретению. Так, в дополнительных альтернативных вариантах белки слияния согласно настоящему- 25012082 изобретению могут использоваться для лечения болезни Крона, артрита, васкулита, нефропатий, ретинопатии и нейропатий у человека или животного. Терапевтически эффективное количество может включать собой такое количество, которое способно предупреждать взаимодействие RAGE с AGE или другими типами эндогенных лигандов RAGE у субъекта. Указанное количество может варьировать, в зависимости от субъекта, подлежащего лечению. Введение соединения может осуществляться ежечасно, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно или представлять собой разовое явление. В различных альтернативных вариантах эффективное количество белка слияния может находиться в диапазоне от примерно 1 нг/кг веса тела до примерно 100 мг/кг веса тела, или от примерно 10 мкг/кг веса тела до примерно 50 мг/кг веса тела, или от примерно 100 мкг/кг веса тела до примерно 100 мг/кг веса тела. Фактическое эффективное количество может быть установлено в экспериментах при определении зависимости дозы/ответ с использованием стандартных методик (Johnson et al., Diabetes, 42: 1179 (1993. Так, в соответствии с общими известными положениями, эффективное количество может зависеть от биологической доступности соединения, его биологической активности и способности к биологической деградации. Композиции Настоящее изобретение может включать композицию, в состав которой входит белок слияния согласно настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Белок слияния может включать полипептид RAGE, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В одном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда RAGE. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть N-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда RAGE может включать V домен RAGE или его часть. В данном варианте сайт связывания лигандаRAGE включает SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. В одном варианте полипептид RAGE присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид,включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного изCH2 или CH3 доменов человеческого IgG. Белок или полипептид RAGE может включать человеческий RAGE полной длины (например, SEQID NO: 1) или фрагмент человеческого RAGE. В одном варианте полипептид RAGE не включает какихлибо остатков из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность RAGE может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из RAGE полной длины (SEQ ID NO: 1). В альтернативных вариантах полипептид RAGE может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому RAGE или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид RAGE может включать человеческий RAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует,скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать RAGE полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, фиг. 1 А и 1 В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать sRAGE (например,SEQ ID NO: 4), полипептид, который на 90% идентичен sRAGE, или фрагмент sRAGE. Например, полипептид RAGE может включать человеческий sRAGE или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, Neeper et al., (1992. Или, в другом варианте, человеческий RAGE может включать sRAGE с удаленной сигнальной последовательностью (например, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, фиг. 1 С) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок RAGE может включать V домен (например, SEQ ID NO: 7 или SEQ IDNO: 8, фиг. 1D). Или, в другом варианте, может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок RAGE может включать фрагментRAGE, включающий часть V домена (например, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, фиг. 1D). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент RAGE представляет собой синтетический пептид. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-116 из человеческогоRAGE (SEQ ID NO: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-116 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 124-221 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С 1 домену RAGE. В другом варианте полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 227-317 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую С 2 домену RAGE. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-123 из человеческого RAGE (SEQID NO: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-123 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 14) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в- 26012082 другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-226 из человеческогоRAGE (SEQ ID NO: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-226 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 18) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую V домену, С 1 домену и междоменному линкеру, соединяющему оба указанных домена. Или, в другом варианте, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична,или аминокислоты на участке 24-339 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 6) или последовательность,которая на 90% им идентична, соответствующую sRAGE (то есть кодирующую V, С 1 и С 2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из RAGE или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотопа: IgG , IgM , IgD , IgEили IgA . Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелой цепи: IgG1 (1), IgG2 (2), IgG3 (3), IgG4 (4),IgA1 (1), IgA2 (2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены CH2 и CH3 из человеческого IgG1, или любую часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены CH2 и CH3 из человеческого IgG1 или их часть,который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 41.Fc часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительной активностью in vivo. Так, в одном варианте белок слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из RAGE, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина. Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе RAGE может также включать полипептид RAGE, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте CH2 домен или его фрагмент может включать SEQ ID NO: 42. В одном варианте полипептид RAGE включает междоменный линкер RAGE, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового доменаRAGE присоединена к N-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида,включающего CH2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий CH2 домен иммуноглобулина, может включать CH2 и CH3 домены из человеческого IgG1. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий CH2 и CH3 домены из человеческого IgG1, который может включать SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 40. Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов изRAGE. Кроме того, полипептид RAGE, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену RAGE, может включать фрагмент белка RAGE полной длины. Например, в одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Fc. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен RAGE и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену RAGE и второму междоменному линкеру RAGE, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена RAGE, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена RAGE присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена RAGE и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера RAGE непосредственно присоединена к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена CH2 или его фрагмент. Например, полипептидRAGE может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С 1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации из С 1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая SEQ ID NO: 30 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе RAGE. Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен,полученный из RAGE, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептидаFc. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен RAGE, присоединенный через междоменный линкер RAGE к N-концевой аминокислоте полипептида, включающего имму- 27012082 ноглобулиновый домен СН 2 или его фрагмент. Например, полипептид RAGE может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого RAGE (SEQ ID NO: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену RAGE и междоменному линкеру, в направлении считывания информации. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты,включающая SEQ ID NO: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния RAGE. Фрагмент междоменного линкера RAGE может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии и, таким образом, присоединения к иммуноглобулиновому домену RAGE. Например, в случае V домена RAGE междоменный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из V домена. В одном варианте линкер может включатьSEQ ID NO: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 RAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает SEQ ID NO: 23, включающий аминокислоты на участке 117136 из RAGE полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 21,содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентичнаSEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23. В случае С 1 домена RAGE линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из С 1 домена. В одном варианте линкер может включать SEQ ID NO: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 изRAGE полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности RAGE. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из SEQ ID NO: 22. Или, в другом варианте,могут использоваться фрагменты SEQ ID NO: 23, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер RAGE может включать SEQ ID NO: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать SEQ ID NO: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из RAGE. Фармацевтически приемлемые носители могут включать любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, известные в данной области. Носитель может включать разбавитель. В одном варианте фармацевтический носитель может представлять собой жидкость и белок слияния или конструкция нуклеиновой кислоты могут быть представлены в виде раствора. В другом варианте фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество, имеющее вид порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. Или, в другом варианте, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой гель, суппозиторий или крем. В альтернативных вариантах носитель может включать липосомы, микрокапсулы, клетку, инкапсулированную в полимер, или вирус. Так, термин фармацевтически приемлемый носитель включает, без ограничения, любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, такие как вода, спирты, фосфатно-буферные солевые растворы, сахара (например, сахарозу или маннит), масла или эмульсии, такие как эмульсии типа вода-в-масле или триглицеридная эмульсия, различные типы увлажнителей, покрытые оболочкой таблетки и капсулы. Введение белков слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению может осуществляться разными способами. Так, введение белка слияния на основе RAGE согласно настоящему изобретению может осуществляться внутрибрюшинной (в/б) инъекцией. Альтернативно, белок слияния на основеRAGE может вводиться перорально, интраназально или в форме аэрозоля. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе RAGE может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния. В другом варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозиториев и т.п. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний в тех случаях, когда желательно самостоятельное введение. Фармацевтические композиции могут иметь вид стерильного инъецируемого раствора в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или носителе. В числе приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, следует указать воду, раствор Рингера, 3-бутандиол, изотонический раствор хлорида натрия или водные буферы, такие как, например, физиологически приемлемые цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буферы. Инъецируемый раствор может содержать стабилизаторы для предупреждения химического разложения и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать антиоксиданты, такие как бутилированный гидро- 28012082 ксианизол (БГА) и бутилированный гидрокситолуол (БГТ), буферы (цитраты, глицин, гистидин) или поверхностно-активные вещества (полисорбат-80, полоксамеры). Растворы могут также содержать противомикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Раствор может также содержать поверхностно-активные вещества (полисорбат-80, полоксамеры). Растворы могут также содержать поверхностно-активные вещества для снижения тенденции к агрегации, такие как полисорбат-80, полоксамер или другие поверхностно-активные вещества, известные в данной области. Раствор может также содержать другие добавки, такие как сахар(а) или солевой раствор, для коррекции осмотического давления композиции с целью достижения показателей, соответствующих крови человека. Фармацевтические композиции могут иметь вид стерильного лиофилизированного порошка для инъекции, который восстанавливают разбавителем. Разбавитель может представлять собой воду для инъекций, бактериостатическую воду для инъекций или стерильный раствор соли. Лиофилизированный порошок может быть получен при лиофильной сушке раствора белка слияния с образованием сухого белка. Как известно в данной области, лиофилизированный белок, в основном, обладает повышенной стабильностью и более длительным сроком годности, чем жидкий раствор белка. Лиофилизированный порошок(высушенный осадок) может содержать буфер, применяемый для коррекции рН, такой как, например,физиологически приемлемый цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буфер. Лиофилизированный порошок может также содержать лиопротекторные вещества для поддержания его физической и химической стабильности. Обычно используемые лиопротекторы представляют собой нередуцирующие сахара и дисахариды, такие как сахароза, манит или трегалоза. Лиофилизированный порошок может содержать стабилизаторы для предупреждения химического разложения и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать, без ограничения, антиоксиданты(БГА, БГТ), буферы (цитраты, глицин, гистидин) или поверхностно-активные вещества (полисорбат-80,полоксамеры). Лиофилизированный порошок может также содержать противомикробные консерванты,такие как бензиловый спирт и парабены. Лиофилизированный порошок может также содержать поверхностно-активные вещества для снижения агрегации, такие как, без ограничения, полисорбат-80 и полоксамер. Лиофилизированный порошок может также содержать добавки (такие, как сахар(а) или насыщенный солевой раствор) для коррекции осмотического давления с целью достижения показателей, соответствующих крови человека, при восстановлении порошка. Лиофилизированный порошок может содержать агенты-наполнители, такие как сахара и дисахариды. Фармацевтические композиции для инъекций могут также иметь вид маслянистой суспензии. Такая суспензия может быть получена по известным методикам с использованием подходящих диспергирующих агентов или увлажнителей и соответствующих агентов, применяемых для суспендирования. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные масла. Этой цели можно достичь за счет любого легкого жирного масла при использовании синтетических моно- или диглицеридов. Кроме того, масляные суспензии могут быть изготовлены при суспендировании активного ингредиента в растительном масле, например в арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или минеральном масле, таком как жидкий парафин. Например, жирные кислоты,такие как олеиновая кислота, нашли применение при изготовлении инъецируемых композиций. Масляные композиции могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Такие композиции могут содержать в качестве консерванта добавку антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также иметь вид эмульсии типа масло-в-воде или водных суспензий. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смесь. Приемлемые эмульгаторы могут включать природные камеди, например аравийскую камедь или трагакант, природные фосфатиды, например соевый лецитин, и сложные эфиры или частичные сложные эфиры, получаемые из жирных кислот и ангидридов гексита, например сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитан. Водные суспензии могут также содержать активные соединения в смеси с эксципиентами. Такие эксципиенты могут включать суспендирующие агенты, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиприпилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; средства, способствующие диспергированию, или увлажнители, такие как природные фосфатиды, такие как лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида и длинноцепочечных алифатических спиртов, например гептадекаэтиленоксицитанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как, например, полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитанмоноолеат. Диспергированные порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, могут давать активное соединение в смеси с диспергирующим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие консерванты, диспергирующие агенты и- 29012082 суспендирующие агенты описаны выше. Композиции могут также иметь вид суппозиториев для реактального введения соединений согласно настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть получены при смешивании лекарственного агента с подходящим нераздражающим эксципиентом, который представляет собой твердое вещество при обычных температурах, но который разжижается при ректальной температуре, расплавляясь, таким образом, в прямой кишке с высвобождением лекарственного вещества. Такие материалы включают, например, какао-масло и полиэтиленгликоли. Для местного применения могут использоваться кремы, мази, гели, растворы или суспензии, содержащие соединения согласно настоящему изобретению. Средства для местного применения могут включать промывные жидкости для ротовой полости и горла. Могут использоваться подходящие консерванты,антиоксиданты, такие как БГА и БГТ, диспергирующие средства, поверхностно-активные вещества. Соединения согласно настоящему изобретению могут также вводиться в виде липосомных систем доставки, таких как маленькие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы на основе множества фосфолипидов, таких как холестерин,стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемые соединения могут быть модифицированы для дальнейшего задержания клиренса из кровотока метаболическими ферментами. В одном варианте соединения могут быть модифицированы путем ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры ПЭГ и пропиленгликоля, поливинилпирролидон или полипролин, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт и т.п. Такие модификации могут также повышать растворимость соединения в водном растворе. Полимеры, такие как ПЭГ, могут быть ковалентно присоединены к одному или нескольким реактивным аминокислотным остаткам, сульфгидрильным остаткам или карбоксильным остаткам. Могут быть использованы различные активированные формы ПЭГ, включая активные сложные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в частности такие, в которых удаляемые группы представляют собой Nгидроксисукцинид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-3-сульфон, для реакции с аминогруппами, мультимодальные или галогенацетильные производные для реакции с сульфгидрильными группами и аминогидразиновые или гидразиновые производные для реакции с углеводными группами. Дополнительные методики получения белковых композиций, которые могут использоваться в случае белков слияния согласно настоящему изобретению, описаны в патентах США 6267958 и 5567677. В другом аспекте осуществления настоящего изобретения модуляторы RAGE согласно настоящему изобретению используют в адъювантной терапии (с другими средствами) или в комбинированной терапии вместе с другими известными терапевтическими агентами. Ниже приведен некоторый неисчерпывающий перечень вспомогательных средств и дополнительных терапевтических агентов, которые могут использоваться в сочетании с белками слияния на основе RAGE в качестве модулятора согласно настоящему изобретению. Фармакологическая классификация противораковых агентов 1. Алкилирующие агенты: циклофосфамид, нитрозомочевина, карбоплатина, цисплатина, прокарбазин. 2. Антибиотики: блеомицин, даунорубицин, доксорубицин. 3. Антиметаболиты: метотрексат, цитарабин, фторурацил. 4. Растительные алкалоиды: винбластин, винкристин, этопозид, паклитаксел. 5. Гормоны: тамоксифен, октреотида ацетат, финастерид, флутамид. 6. Модификаторы биологического ответа: интерфероны, интерлейкины. Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении ревматоидного артрита 1. Анальгетики: аспирин. 2. НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства): ибупрофен, напроксен, диклофенак. 3. DMARD (антиревматические средства, модифицирующие заболевание): метотрексат, препараты на основе золота, гидроксихлорохин, сульфасалазин. 4. Модификаторы биологического ответа, DMARD: этанерцепт, инфликсимаб, глюкокортикоиды. Фармакологическая классификация средств, применяемых для лечения сахарного диабета 1. Сульфонилмочевины: толбутамид, толазамид, глибурид, глипизид. 2. Бигуаниды: метформин. 3. Другие пероральные агенты: акарбоза, троглитазон. 4. Инсулин. Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении болезни Альцгеймера 1. Ингибитор холиностеразы: такрин, донепезил. 2. Антипсихотические препараты: галоперидол, тиоридазин. 3. Антидепрессанты: Дезипрамин, Флуоксетин, Тразодон, Пароксетин; 4. Противосудорожные препараты: карбамазепин, вальпроевая кислота.
МПК / Метки
МПК: C07K 14/705, C07K 19/00
Метки: белки, основе, использования, слияния, способы
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-12082-belki-sliyaniya-na-osnove-rage-i-sposoby-ih-ispolzovaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Белки слияния на основе rage и способы их использования</a>
Трициклические соединения – ингибиторы интегразы вич, способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция на их основе, способ ее получения и способы их использования в лечении болезней
Номер патента: 11399
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Шахерер Лаура Н., Чен Сяову, Ким Чанг Ю., Джин Хаолун, Фардис Мерайя, Чен Джеймс М.
МПК: C07D 471/04, C07D 498/20, C07D 487/04...
Метки: композиция, способ, использования, лечении, способы, соединения, трициклические, варианты, болезней, получения, интегразы, основе, вич, фармацевтическая, ингибиторы
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы где А1 независимо выбирают из ряда: C(R2)2, CR2OR, CR2OC(=O)R, C(=O), C(=S), CR2SR, C(=NR); А2 независимо выбирают из ряда: О, S, NR, C(R2)2-C(R3)2, C(R2)=C(R3), C(=O)C(R3)2, NR-C(R3)2, N=C(R3), N=N или C(R2)=N; Q означает N или CR4; L выбирают из ряда: связь, О, S, S-S, S(=O), S(=O)2, S(=O)2NR, NR, N-OR, C1-С12алкилен, замещенный C1-C12алкилен, С2-С12алкенилен, замещенный С2-С12алкенилен, С2-С12алкинилен, замещенный...
Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения
Номер патента: 10803
Опубликовано: 30.12.2008
Авторы: Сизо Жанник, Карр Фрэнсис Дж., Макдональд Глен Кристофер, Хеллендорн Коэн, Энтуистл Джойслин, Гловер Николя Рональд, Боск Дени Жорж, Бейкер Мэттью
МПК: A61P 35/00, A61K 47/48, A61K 38/16...
Метки: белки, буганины, применения, модифицированные, способы, цитотоксины
Формула / Реферат:
1. Модифицированный белок буганин, который обладает пониженной способностью к активации иммунного ответа. 2. Модифицированный буганин по п.1, обладающий пониженной способностью к активации Т-клеток и модифицированный по одному или нескольким аминокислотным остаткам в Т-клеточном эпитопе. 3. Модифицированный буганин по п.2, являющийся модифицированным по одному или нескольким аминокислотным остаткам в Т-клеточном эпитопе, выбранном из группы,...
Гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения и их применение
Номер патента: 3739
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Гэрбер Эллен Э., Уилльямс Кевин П., Пепински Р.Блэйк, Бейкер Даррен П., Портер Джеффри, Тэйлор Фредерик Р., Гэлдес Элфонс, Вен Дингайи
МПК: C07K 14/00, A61P 25/00, A61K 38/00...
Метки: белки, применение, получения, способы, гидрофобно-модифицированные
Формула / Реферат:
1. Изолированный белок, включающий в себя N-концевую аминокислоту и C-концевую аминокислоту, который выбран из (a) белка с N-концевым цистеином, соединенным, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; (b) белка с N-концевой аминокислотой, отличной от цистеина, соединенного, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; и (c) белка, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей, заменяющей N-концевую...
Новые белки, связывающиеся с рецептором 1 интерферона, кодирующая их днк и способы модуляции клеточного ответа на интерфероны
Номер патента: 3250
Опубликовано: 27.02.2003
Авторы: Ревель Мишель, Абрамович Каролина, Чебат Джудит Е.
МПК: A61K 48/00, C07K 14/715, C12N 15/12...
Метки: белки, днк, рецептором, новые, модуляции, ответа, связывающиеся, кодирующая, интерфероны, клеточного, способы, интерферона
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором IFNAR1, способный индуцироваться интерфероном IFN-a или IFN-b, и имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID ь 1 или варианты SEQ ID ь 1, полученные в силу вырожденности генетического кода. 2. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором IFNAR1,...
Стресс-белки и пептиды и способы их применения
Номер патента: 6650
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Праккен Берент Дж., Альбани Сальваторе
МПК: A61K 38/10, A61K 39/04, A61P 19/02...
Метки: способы, стресс-белки, применения, пептиды
Формула / Реферат:
1. Выделенный пептид, содержащий приблизительно от 10 до 30 аминокислотных остатков, характеризующийся тем, что по меньшей мере 9 аминокислотных остатков пептида состоят из последовательностей, показанных в перечне последовательностей как SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 23. 2. Выделенный пептид по п.1, отличающийся тем, что пептид связывается с подтипами АЧЛ DR1, DR4 и DR7. 3. Выделенный пептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что...