Модифицированные белки буганины, цитотоксины и способы их применения

010803 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к модифицированным белкам буганинам и к цитотоксинам, содержащим указанные модифицированные белки, используемые в качестве терапевтического противоракового средства. В частности, для снижения иммуногенности буганиновых токсинов Т-клеточные эпитопы удаляют или модифицируют. Предшествующий уровень техники Во многих случаях эффективность терапевтического белка ограничена нежелательной иммунной реакцией на терапевтический белок. Некоторые мышиные моноклональные антитела обнаруживают терапевтические свойства при ряде патологических состояний человека, но в некоторых случаях эти свойства нарушаются из-за индуцирования значительных уровней антимышиного антитела у человека (НАМА) [Schroff R.W. et al. (1985) Cancer Res. 45:879-885; Shawler D.L. et al., (1985) J. Immunol. 135:15301535]. Что касается моноклональных антител, то для снижения НАМА-ответа был разработан ряд способов [WO 89/09622; ЕР 0239400; ЕР 0438310; WO 91/06667]. Обычно такие способы рекомбинантных ДНК позволяют снижать иммуногенность мышиного антитела за счет уменьшения мышиной генной последовательности в конечной конструкции антитела и увеличения человеческой генной последовательности в этой конструкции. Но несмотря на это, полученные "гуманизованные" антитела в некоторых случаях все же вызывают иммунный ответ у пациентов [Isaacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2:449, 456; Rebello P.R. et al. (1999) Transplantation 68:1417-1420]. Принцип индукции иммунного ответа основан на присутствии в данном белке пептидов, которые могут стимулировать активность Т-клеток путем презентации на молекулах МНС класса II так называемых "Т-клеточных эпитопов". Такие Т-клеточные эпитопы обычно определяются как любая последовательность аминокислотных остатков, обладающих способностью связываться с молекулами МНС классаII. Более точно, "Т-клеточный эпитоп" означает эпитоп, который при связывании с молекулами МНС может распознаваться Т-клеточным рецептором (TCR) и который может, по меньшей мере, в принципе,активировать Т-клетки путем связывания с TCR и, тем самым, стимулировать Т-клеточный ответ. Молекулы МНС класса II представляют собой группу в высокой степени полиморфных белков, которые играют основную роль в отборе и активации хелперных Т-клеток. Группа человеческих лейкоцитарных антигенов DR (HLA-DR) представляет собой группу белков преобладающего изотипа, однако,изотипы HLA-DQ и HLA-DP обладают аналогичными функциями. Что касается человека, то он имеет два-четыре аллеля DR, два аллеля изотипа DQ и два аллеля изотипа DP. Была выявлена структура ряда молекул DR, и было установлено, что они представляют собой незамкнутый пептидсвязывающий участок с рядом гидрофобных карманов, которые связаны между собой гидрофобными остатками (остатками карманов) пептида [Brown et al. (1993) Nature 364:33; Stern et al. (1994) Nature 368:215]. Полиморфизм,идентифицирующий различные аллотипы молекулы класса II, играет определенную роль во внесении широкого разнообразия различных связывающих поверхностей для пептидов в пептидсвязывающем участке и на уровне всей популяции обеспечивает максимальную гибкость в отношении способности распознавать чужеродные белки и вырабатывать иммунный ответ на действие патогенных микроорганизмов. Иммунный ответ на терапевтический белок вырабатывается в результате презентации пептида МНС класса II. При этом экзогенные белки поглощаются и подвергаются процессингу для презентации вместе с молекулами МНС класса II типа DR, DQ или DP. Молекулы МНС класса II экспрессируются специальными антигенпрезентирующими клетками (АПК), такими как макрофаги и дендритные клетки и т.п. Образование комплекса пептидов МНС класса II с когнатным Т-клеточным рецептором на поверхности Т-клетки, наряду с перекрестным связыванием некоторых других корецепторов, таких как молекулыCD4, может индуцировать активацию Т-клеток. Такая активация приводит к высвобождению цитокинов,а затем к активации других лимфоцитов, таких как В-клетки, и, тем самым, к продуцированию антител или к активации Т-клеток-киллеров в качестве полного клеточного иммунного ответа. Идентификация Т-клеточного эпитопа представляет собой первую стадию элиминации эпитопа, как описано в WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232; WO 02/079232 и WO 02/079415. В этих заявках предсказанные Т-клеточные эпитопы удаляют путем соответствующих аминокислотных замен в представляющем интерес белке. Для определения способности связывания синтетических пептидов с молекулами МНС класса II, помимо компьютерных способов, применяются способы in vitro. В репрезентативном способе В-клеточные линии с определенным аллотипом МНС используются в качестве источника поверхности связывания с МНС класса II, и эти клеточные линии могут применяться для идентификации лиганда МНС класса II [Marshall K.W. et al., (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan et al. (1990)J. Immunol. 145:1799-1808; Robadey С. et al. (1997) J. Immunol. 159:3238-3246]. Однако такие способы непригодны ни для скрининга множества потенциальных эпитопов на предмет обширного выявления разнообразия аллотипов МНС, ни для подтверждения способности связывающего белка действовать как Т-клеточный эпитоп. Также применяют способы, в которых используют растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами [Kern F. et al. (1998) Nature Medicine 4:975-978;Kwok W.W. et al. (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. Эти реагенты и процедуры используют для идентификации присутствия Т-клеточных клонов, присутствующих в пробах периферической крови че-1 010803 ловека или экспериментального животного и способных связываться с конкретными комплексами МНСпептид, но указанные реагенты и процедуры не применимы для скрининга множества потенциальных эпитопов на предмет выявления обширного разнообразия аллотипов МНС. Биологические анализы на активацию Т-клеток открывают возможности практического определения способности тестируемой последовательности пептида/белка вырабатывать иммунный ответ. Примеры таких способов приводятся в работе Petra et al., в которой описаны анализы на пролиферацию Тклеток с использованием бактериальной протеин-стафилокиназы, с последующим картированием эпитопов с использованием синтетических пептидов для стимуляции Т-клеточных линий [Petra A.M. et al.(2002) J. Immunol. 168:155-161]. Аналогичным образом, анализы на пролиферацию Т-клеток с использованием синтетических пептидов белка столбнячного токсина позволяют определить иммунодоминантные области эпитопов указанного токсина [Reece J.С. et al. (1993) J. Immunol. 151:6175-6184]. В WO 99/53038 описан способ, в котором Т-клеточные эпитопы в тестируемом белке могут быть определены с использованием выделенных субпопуляций человеческих иммунных клеток путем стимуляции их дифференцировки in vitro и культивирования в присутствии представляющих интерес синтетических пептидов и измерения любой индуцированной пролиферации культивированных Т-клеток. Тот же самый способ описан также в публикации Stickler et al. [Stickler M.M. et al. (2000) J. Immunotherapy 23:654-660],где в обоих случаях данный способ применяется для детекции Т-клеточных эпитопов в бактериальном субтилизине. Для проведения такого способа требуется тщательное выделение клеток и культивирование клеток с множеством других цитокинов, с получением нужных субпопуляций иммунных клеток (дендритных клеток, CD4+- и/или CD8+-Т-клеток), но этот способ не позволяет проводить быстрый крупномасштабный скрининг множества образцов, взятых у донора. За последние годы был значительно усовершенствован комбинированный способ, проводимый с помощью анализов на пролиферацию Т-клеточной популяции и in silico стимуляции связывания пептидов МНС для конструирования дефицитных по эпитопам белков [WO 03/104803]. Из всего выше- и нижесказанного следует, что может оказаться желательным идентифицировать и удалять или, по меньшей мере, снижать число Т-клеточных эпитопов из основных терапевтически ценных, но по своей природе иммуногенных пептидов, полипептидов или белков. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является практическая реализация способа, в котором растворимые белки, вводимые человеку в терапевтических целях, могут стимулировать вырабатывание иммунного ответа, приводящего к продуцированию у хозяина антител, которые связываются с указанным растворимым белком. Указанная цель настоящего изобретения может быть достигнута путем получения белков буганина с пониженной способностью вырабатывать иммунный ответ. В соответствии с описанными здесь способами авторами настоящего изобретения были идентифицированы области молекулы буганина, содержащей Т-клеточные эпитопы, стимулирующие вырабатывание иммунных ответов на этот белок. Настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где модифицированный буганин обладает пониженной способностью вырабатывать иммунный ответ. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный буганин обладает пониженной способностью активировать Тклетки, и этот модифицированый буганин является модифицированным в одном или нескольких положениях аминокислотных остатков в Т-клеточном эпитопе. Т-клеточные эпитопы предпочтительно выбирают из группы, состоящей из:c) NGQEIAKFFLIVIQM (область R3 эпитопа, SEQ ID NO:4). Настоящее изобретение также относится к цитотоксину, содержащему нацеливающий фрагмент,присоединенный к модифицированному белку буганину согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанным нацеливающим фрагментом является лиганд, связывающийся с раковой клеткой. В другом варианте изобретения указанным лигандом является антитело или фрагмент антитела, которые связываются с раковой клеткой. В конкретном варианте изобретения указанное антитело распознает ЕрСАМ или опухолеассоциированный антиген. В своем наиболее конкретном варианте настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему VB6-845 или VB6-011. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковых клеток, включающему в себя введение цитотоксина согласно изобретению в раковые клетки. Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака путем введения цитотоксина согласно изобретению животному, нуждающемуся в таком введении. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического средства для лечения рака у животного, где указанный способ включает в себя стадии идентификации Тклеточных эпитопов буганина, модификации одного или нескольких аминокислотных остатков в Тклеточном эпитопе для получения модифицированного буганина, обладающего пониженной способностью к активации Т-клеток; получения цитотоксина, который имеет связывающийся с раковой клеткой лиганд, присоединенный к модифицированному буганину, и суспендирования указанного цитотоксина в фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе.-2 010803 В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения животного, страдающего раком, где указанная композиция содержит цитотоксин согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Цитотоксины, композиции и способы согласно изобретению могут быть использованы для лечения различных форм рака, таких как рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы, Т-клеточные и Вклеточные лимфомы. Настоящее изобретение также относится к пептидам Т-клеточного эпитопа белка буганина и к модифицированным пептидам Т-клеточного эпитопа согласно изобретению. Другие отличительные признаки и преимущества согласно изобретению будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения. Однако следует отметить, что подробное описание и конкретные примеры вариантов предпочтительного осуществления изобретения приводятся лишь в иллюстративных целях, и в него могут быть внесены различные изменения и модификации, которые не выходят за рамки существа и объема изобретения и которые будут очевидны специалистам из подробного описания изобретения. Краткое описание графического материала Настоящее изобретение описано со ссылками на графический материал, где на фиг. 1 приведены результаты анализов на активность дефицитных по Т-клеточным эпитопам модифицированных белков буганинов Bou156 (панель А) и Bou157 (панель В). Bou156 имеет заменыV123A, D127A, Y133N и I152A. Bou157 имеет замены V123A, D127A, Y133Q и I152A. Обе серии анализов проводят с использованием белка дикого типа и неактивного модифицированного буганина (Y70A) в качестве контроля. В этом анализе активность выражена в % измеряемой люциферазной активности по отношению к концентрации белка буганина. На фиг. 2 приведены результаты анализа на пролиферацию Т-клеток для трех синтетических пептидов и для 2 различных образцов МКПК, взятых у донора. Пептиды, обозначенные Del-41, Del-44 и Del50, были протестированы при конечной концентрации 1 мкМ (панель А) и при конечной концентрации 5 мкМ (панель В). Эти пептиды происходят от иммуногенных областей молекулы буганина и имеют замены, введенные для элиминации их иммуногенности. На фиг. 3 проиллюстрирован VB6-845, модифицированный буганиновый цитотоксин, содержащийFab-фрагмент антитела против Ер-САМ, где де-буганин (Bou156) присоединен к С-концу домена СН посредством фуринового линкера. На фиг. 3 А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 3 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:15) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:16) пропоследовательностей, а на фиг. 3 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845, не содержащий последовательностейpelB. На фиг. 4 проиллюстрирована карта экспрессирующего вектора pING3302. Репрезентативные вставки были лигированы в вектор 3302 с использованием рестрикционных сайтов EcoRI и XhoI. На фиг. 5 проиллюстрирована контрольная конструкция Fab-фрагмента антитела против Ер-САМ,не содержащая растительного токсина, де-буганина (VB5-845). На фиг. 5 А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 5 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:17) и аминокислотная последовательность (SEQ IDNO:18) пропоследовательностей, а на фиг. 5 С проиллюстрирован собранный белок VB5-845, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 6 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-CL-де-буганин, где Bou156 присоединен к С-концу домена CL. На фиг. 6 А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 6 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:19) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:20) пропоследовательностей, а на фиг. 6 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845-CL-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 7 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-NVH-де-буганин, где Bou156 присоединен к С-концу домена VH. На фиг. 7 А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 7 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:21) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:22) пропоследовательностей, а на фиг. 7 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845-NVH-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 8 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-NVL-де-буганин, где Bou156 присоединен к N-концу домена VL. На фиг. 8 А проиллюстрированы бицистронные единицы, кодирующие пропоследовательности, на фиг. 8 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:23) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:24) пропоследовательностей, а на фиг. 8 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845-NVL-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB.-3 010803 На фиг. 9 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ экспрессии VB6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3) и VB6-845-CL-де-буганин (Bou156) (конструкции, представленной на фиг. 6) в супернатанте индуцированных клеток Е 104 в лабораторном масштабе. На фиг. 10 представлены результаты исследований реактивности с помощью проточной цитометрии. На фиг. 10 А проиллюстрирована реактивность VB6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3) иVB6-845-CL-де-буганина (конструкции, представленной на фиг. 6) в Ер-САМ-позитивных клеточных линиях CAL 27 и OVCAR-3 и в Ер-САМ-негативной клеточной линии А-375, а на фиг. 10 В проиллюстрированы результаты тех же самых тестов, проведенных с использованием VB6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), VB6-845-гелонина (конструкции, представленной на фиг. 14 С) и контроля (PBS). На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий результаты конкурентного анализа, проводимого с использованием VB6-845 и Proxinium в клетках NIH:OVCAR-3, как описано в примере 7. На фиг. 12 представлен график, иллюстрирующий результаты бесклеточного анализа, описанного в примере 7. На фиг. 13 представлены результаты MTS-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8, в котором сравнивают цитотоксичность VB6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), VB6-845-CLде-буганина (конструкции, представленной на фиг. 6) и де-буганина (Bou156) в клетках CAL 27(фиг. 13 А) и NIH:OVCAR-3 (фиг. 13 В). На фиг. 14 А и В представлены результаты MTS-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8, в котором сравнивают цитотоксичность VB6-845 (конструкции, представленной на фиг. 3), VB6-845 гелонина (конструкции, представленной на фиг. 14 С) и гелонина в клетках CAL 27 (фиг. 14 А) и NIHOVCAR-3 (фиг. 14 В). На фиг. 14 С проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:25) и аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:26) указанной конструкцииVB6-845-гелонина. На фиг. 15 проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ IDNO:27) и аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:28) пропоследовательностей VB6-011. На фиг. 16 представлены результаты MTS-анализа на цитотоксичность, описанного в примере 8 и указывающего на цитотоксичность VB6-011 в клетках MB-435S. Подробное описание изобретения Авторами настоящего изобретения были идентифицированы Т-клеточные эпитопы в буганине и были сконструированы модифицированные белки буганина, которые по сравнению с немодифицированным белком буганином обладают пониженной способностью активировать человеческие Т-клетки.(А) Модифицированные белки буганины. Настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный буганин был модифицирован в целях снижения его способности вызывать иммунный ответ, а предпочтительно Тклеточный ответ, по сравнению с немодифицированным белком буганином. Зрелый белок буганина представляет собой один полипептид, состоящий из 250 аминокислот и имеющий молекулярную массу приблизительно 26200 Да [Den Hartog et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:1772-1779; патент США 6680296]. Буганин представляет собой инактивирующий рибосому белок типа 1 (RIP), впервые выделенный из растения Bougainvillea spectabilis Willd (бугенвиллея замечательная) [Bolognesi et al. (1997)Planta 203:422-429]. RIP, выделенные из растений, представляют собой PHK-N-гликозидазы, которые депуринизируют главную рибосомную РНК клеток, что приводит к разрушению рибосом, прекращению синтеза белка и гибели клеток. Аминокислотная последовательность зрелого белка буганина (обозначенная однобуквенным кодом) представляет собой Термин "немодифицированный белок буганин" означает белок буганин, который не был модифицирован для снижения его способности вызывать иммунный ответ. Последовательность буганина дикого типа или немодифицированного буганина представлена в SEQ ID NO:1. Однако для специалиста в данной области очевидно, что термин "немодифицированный буганин" также включает в себя модификации в SEQ ID NO:1, при условии, что такие модификации не снижают его способности вызывать иммунный ответ. Примерами модификаций, которые могут быть внесены в SEQ ID NO:1, являются замены пептидных фрагментов и консервативных аминокислот, которые не снижают иммуногенности данного белка. Термин "модифицированный белок буганин" означает белок буганин, который по сравнению с немодифицированным белком буганином является модифицированным (как описано выше), где указанные модификации снижают способность данного буганина вызывать иммунный ответ. Модифицированный-4 010803 белок буганин может также называться буганином, лишенным иммуногенных свойств. "Модифицированный белок буганин" может представлять собой полноразмерную последовательность или модифицированный фрагмент немодифицированного белка буганина. "Модифицированный белок буганин" по сравнению с последовательностью буганина дикого типа может также содержать и другие модификации,которые не влияют на иммуногенность пептида. Модифицированный белок буганин предпочтительно обладает такой же биологической активностью, что и немодифицированный буганин. Используемый здесь термин "пониженная способность к вырабатыванию иммунного ответа" означает, что данный модифицированный белок буганин является менее иммуногенным, чем немодифицированный буганин. Термин "иммунный ответ" включает в себя как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный буганин обладает пониженной способностью к активации Т-клеток. Используемый здесь термин "пониженная способность к активации человеческих Т-клеток" означает, что модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток по сравнению с немодифицированным белком буганином. С помощью известных анализов, включая оценку индекса стимуляции белка, специалист в данной области может определить, обладает ли модифицированный буганин пониженной способностью к активации Т-клеток. Используемый здесь термин "индекс стимуляции" означает степень способности модифицированного или немодифицированного белка буганина к активации человеческих Т-клеток. Так, например, модифицированный или немодифицированный белок буганин или его пептиды могут быть протестированы на их способность вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых in vitro. При осуществлении этого способа с использованием "необученных" человеческих Т-клеток, взятых у здоровых доноров, авторами настоящего изобретения было установлено, что при проведении такого анализа индекс стимуляции, равный или превышающий 2,0, является ценным показателем индуцированной пролиферации. Индекс стимуляции обычно вычисляют путем деления величины уровня пролиферации(например, количества радиоактивности в минуту в случае включения 3 Н-тимидина), измеренной для тестируемого пептида, на величину, измеренную для клеток, не контактируемых с тестируемым пептидом. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает биологической активностью и пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин обладает меньшей способностью к активации человеческих Т-клеток и более низкой биологической активностью, чем немодифицированный белок буганин. В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину, где указанный модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток и не обладает биологической активностью. Такие модифицированные белки могут быть, например, использованы в качестве контроля в анализах или в целях сообщения данному индивидууму толерантности к этому белку. Используемый здесь термин "биологическая активность" означает способность модифицированного или немодифицированного белка буганина ингибировать синтез белка на рибосомах, которая может быть оценена различными способами. Следует отметить, что модифицированный белок буганин будет сохранять биологическую активность, даже если такая активность ниже активности немодифицированного белка, однако, при этом необходимо, чтобы он имел определенный уровень детектируемой активности. Так, например, биологическая активность модифицированного или немодифицированного белка буганина может быть оценена путем идентификации его N-гликозидазной активности, а в частности,активности, достаточной для обеспечения значимого уровня ингибирования трансляции белка. Одни из таких подходящих анализов включает в себя тестирование активности различных белков буганинов по сравнению с немодифицированным буганином в бесклеточном анализе синтеза белка. Для этого осуществляют совместное инкубирование метионинсодержащей смеси для транскрипции/трансляции, ДНК,кодирующей репортерный белок люциферазу, и серийные разведения немодифицированного и модифицированного белка буганина. Уровни транслированной люциферазы могут быть легко детектированы с использованием прибора для регистрации люминесценции после добавления реагента-субстрата. Измеренная люминесценция обратно пропорциональна N-гликозидазной активности буганина, присутствующей в реакции. При этом обычно используют негативный контроль, такой как неактивный белок буганин, содержащий, например, замену Y70A. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный пептид буганина является модифицированным в одном или нескольких Т-клеточных эпитопах в последовательности белка буганина. Термин "Т-клеточный эпитоп" означает аминокислотную последовательность, способную связываться с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса II, стимулировать Т-клетки и/или также связываться (необязательно с измеримой активацией Т-клеток) в комплексе с МНС класса II. В одном из аспектов изобретения общий способ, который может быть применен в настоящем изо-5 010803 бретении, позволяет получить модифицированные Т-клеточные эпитопы, содержащие модифицированные белки буганины, где указанный способ включает в себя следующие стадии:(i) определение аминокислотной последовательности указанного белка или его части;(ii) идентификацию одного или нескольких потенциальных Т-клеточных эпитопов в аминокислотной последовательности белка соответствующими способами, такими как определение связывания пептидов с молекулами МНС с применением in vitro или in silico способов или с помощью биологических анализов;(iii) конструирование новых вариантов последовательностей с модифицированными одной или несколькими аминокислотами в идентифицированных потенциальных Т-клеточных эпитопах, где такие модификации приводят к значительному снижению или элиминации активности Т-клеточного эпитопа,определяемой по связыванию пептидов с молекулами МНС с применением in vitro или in silico способов или с помощью биологических анализов. Такие варианты последовательностей конструируют так, чтобы в них не образовывались новые потенциальные Т-клеточные эпитопы, если только эти новые потенциальные Т-клеточные эпитопы не будут, в свою очередь, модифицированы таким образом, чтобы при этом значительно снижалась или элиминировалась активность Т-клеточного эпитопа;(iv) конструирование таких вариантов последовательностей способами рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для идентификации одного или нескольких вариантов с желаемыми свойствами в соответствии с хорошо известными способами рекомбинантных ДНК; и(v) необязательно, повторение стадий (ii)-(iv). В одном из примеров стадию (iii) осуществляют путем замены, добавления или делеции аминокислотных остатков в любом из Т-клеточных эпитопов в немодифицированном белке буганине. В другом примере указанный способ получения модифицированного белка буганина осуществляют с использованием гомологичной последовательности белка и/или in silico моделирования. Идентификация потенциальных Т-клеточных эпитопов в стадии (ii) может быть осуществлена способами, ранее описанными в литературе. Подходящие способы описаны в документах WO 98/59244;WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 и могут быть использованы для идентификации способности связывания происходящих от буганина пептидов с молекулой МНС класса II. Для идентификации биологически релевантных пептидов авторами настоящего изобретения был разработан способ проведения exvivo анализов на пролиферацию человеческих Т-клеток. Этот способ, как было подтверждено, является особенно эффективным и включает в себя тестирование перекрывающихся последовательностей происходящих от буганина пептидов по схеме, подходящей для сканирования и тестирования полноразмерной последовательности буганина. Синтетические пептиды тестируют на их способность вызывать пролиферативный ответ в человеческих Т-клетках, культивируемых in vitro. При осуществлении этого способа с использованием "необученных" человеческих Т-клеток, взятых от здоровых доноров, авторами настоящего изобретения было установлено, что в этом анализе индекс стимуляции, равный или превышающий 2,0, является ценным показателем индуцированной пролиферации. Индекс стимуляции обычно вычисляют путем деления величины уровня пролиферации (например, количества радиоактивности в минуту в случае включения 3 Н-тимидина), измеренной для тестируемого пептида, на величину, измеренную для клеток, не контактировавших с тестируемым пептидом. В соответствии с этим в настоящих исследованиях, в анализах на пролиферацию Т-клеток с применением МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови), взятых у "неиммунизованных" доноров(т.е. не подвергавшихся сенсибилизации буганином), было использовано 89 синтетических 15-мерных пептидов (указанных в табл. 1). Для достижения оптимального охвата аллотипов МНС класса II брали образцы МКПК от 20 доноров. МКПК стимулировали отдельными пептидами в культурах в трех повторах в течение 7 дней, после чего оценивали пролиферацию по включению 3 Н-тимидина. Все пептиды разводили при двух различных концентрациях: 1 и 5 мкМ. Индексы стимуляции (SI) вычисляли как количество 3 Н, включенного в клетки, деленное на количество 3 Н, включенного в контроль, стимулированный миметиком. Этот способ позволяет идентифицировать наибольшее число иммуногенных областей молекулы буганина у человека. В соответствии с этим в конкретном варианте изобретения модифицированный белок буганин является модифицированным в одном или нескольких аминокислотных остатках в Т-клеточном эпитопе, выбранном из группы, состоящей из:a) AKVDRKDLELGVYKL, называемого здесь областью R1 эпитопа (SEQ ID NO:2);b) LGVYKLEFSIEAIHG, называемого здесь областью R2 эпитопа (SEQ ID NO:3);c) NGQEIAKFFLIVIQM, называемого здесь областью R3 эпитопа (SEQ ID NO:4). Эти Т-клеточные эпитопы были идентифицированы на основании величины SI2 в одном или нескольких образцах МКПК, взятых от донора. Вышеописанные пептидные последовательности представляют собой очень важную информацию, необходимую для конструирования модифицированных белков буганинов, в которых нарушены функции одного или нескольких из таких эпитопов. В одном из вариантов изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет по меньшей мере один делетированный Т-клеточный эпитоп. В другом варианте изобретения указанный модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет один, два или три делетированных Т-6 010803 клеточных эпитопа. Настоящее изобретение относится также к модифицированному белку буганину, где 1-9 аминокислотных остатков модифицированы, предпочтительно, в Т-клеточном эпитопе. В другом варианте изобретения модифицированы 1-5 аминокислотных остатков. Используемый здесь термин "модифицированный" относится к аминокислотным остаткам, которые были модифицированы путем замены, добавления или делеции, а предпочтительно путем замены, и такой модифицированный белок буганин обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток. В другом варианте изобретения указанный модифицированный белок обладает биологической активностью. Более предпочтительно указанный модифицированный белок буганин согласно изобретению модифицируют путем замены в положении, соответствующем любой из аминокислот, определяемых в вышеуказанных последовательностях (а), (b) или (с). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к белкам буганинам, для которых лиганды МНС класса II, идентифицируемые в любом из эпитопов R1-R3, модифицируют для предотвращения связывания либо каким-либо иным способом снижения числа аллотипов МНС, с которыми может связываться этот пептид. Аминокислоты в областях R1-R3 могут быть модифицированы путем замены,добавления или делеции для предотвращения связывания либо снижения каким-либо иным способом числа аллотипов МНС, с которыми может связываться этот пептид. Для элиминации Т-клеточных эпитопов аминокислотные замены осуществляют в соответствующих положениях предсказанной пептидной последовательности в целях достижения значительного уровня снижения или элиминации активности Т-клеточного эпитопа. Практически, в одном из вариантов изобретения соответствующим положением является аминокислотный остаток, связывающийся в одном из карманов, находящихся в антигенсвязывающей бороздке молекулы МНС класса II. В одном из вариантов изобретения осуществляют модификацию связывания в первом кармане бороздки в так называемом положении Р 1 или в положении "якоря" Р 1 данного пептида. Качество связывания между остатком якоря Р 1 данного пептида и первым карманом антигенсвязывающей бороздки молекулы МНС класса II считается главным фактором общей аффинности связывания для полноразмерного пептида. Подходящей заменой для остатка, который плохо соответствует данному карману, является, например, замена более гидрофильным остатком в этом положении пептида. В настоящем изобретении рассматриваются также аминокислотные остатки пептида в положениях связывания в других областях кармана в антигенсвязывающей бороздке МНС, и эти аминокислотные остатки входят в объем изобретения. Следует отметить, что одиночные аминокислотные замены, делеции или добавления в данном потенциальном Т-клеточном эпитопе являются предпочтительным способом элиминации данного эпитопа. Могут рассматриваться и комбинированные модификации (т.е. замены, делеции и добавления) в одном эпитопе, и эти модификации, например, могут быть особенно подходящими, если отдельно определяемые эпитопы перекрываются друг с другом, как в данном случае, где области эпитопов R1 и R2 перекрываются по 5 остаткам. Кроме того, отдельные аминокислотные модификации в данном эпитопе или комбинированные модификации в одном эпитопе могут быть осуществлены в положениях, не являющихся "остатками кармана" в антигенсвязывающей бороздке МНС класса II, т.е. они могут быть осуществлены в любом положении пептидной последовательности. Эти модификации могут быть введены на основании гомологичной структуры, либо они могут быть введены структурным способом с использованием in silico техники, известной специалистам, и могут быть созданы на основе из известных структурных особенностей молекулы согласно изобретению. Все указанные модификации входят в объем настоящего изобретения. Области R1-R3 эпитопов буганина были проанализированы на признаки лигандов МНС класса II в их соответствующих последовательностях. Этот анализ был осуществлен с помощью компьютерной программы с использованием схем, описанных в WO 98/59244 и в WO 02/069232. Такая компьютерная программа имитирует презентацию антигена на уровне связывания пептида с МНС класса II и позволяет оценивать уровень связывания для любой конкретной пептидной последовательности. Такую оценку проводят для многих преобладающих аллотипов МНС класса II, имеющихся в данной популяции. Поскольку эта схема позволяет тестировать любую пептидную последовательность, то заранее можно предсказать последствия проведения аминокислотных замен, добавлений или делеций в отношении способности данного пептида взаимодействовать со связывающей бороздкой молекулы МНС класса II. Следовательно, могут быть получены новые композиции последовательностей, содержащие уменьшенное число пептидов, способных взаимодействовать с МНС класса II, и, тем самым, функционировать как иммуногенные Т-клеточные эпитопы. В одном из вариантов изобретения в этой схеме замены в области R1 эпитопа представляют собой замены в положениях V123, D127 и/или Е 129. Аналогичным образом в одном из вариантов изобретения для области R2 эпитопа, указанная замена осуществлена в положении Y133. Этот остаток находится в области перекрывания R1 и R2, но для элиминации лиганда МНС класса II, связанного с R2, достаточной является замена в положении Y133, однако, этой замены недостаточно для элиминации лигандов МНС класса II, связанных с R1. В одном из вариантов изобретения для области R3 эпитопа были сделаны замены в остатках Е 151 и/или в I152. Во всех случаях замены присутствуют в одном или в нескольких альтернативных аминокислотных-7 010803 остатках. Анализ R1, проведенный с помощью компьютерной программы для стимуляции МНС классаII, показал, что аминокислотные остатки 123, 127, 129 и 131 являются остатками, которые в этом эпитопе играют ключевую роль в связывании с молекулами МНС II. Остаток 123 представляет собой предпочтительное положение для мутации области R1, поскольку он находится на поверхности молекулы, удаленной от активного центра, и является вариабельным, как было определено при выравнивании последовательности RIP. Тем не менее, не все замены приводят к получению активной молекулы, а поэтому необходимо подтвердить мутации с помощью анализа на биологическую активность. Так, например, в R1 замены V123T, V123A и V123Q являются примерами предпочтительных альтернативных замен. Было обнаружено, что остаток 131 является абсолютно консервативным в RIP, а поэтому он является мало подходящим для мутации. Остатки 127 и 129 не являются высококонсервативными, однако, было обнаружено, что на связывание с МНС II влияет только ограниченное число остатков. Предпочтительными заменами являются также серии замен в положениях D127G, D127A, E129Q и E129G. Было показано, что для R2 остаток 133 является возможным кандидатом для предотвращения связывания с МНС II, и его явная поверхностная локализация (как было определено путем моделирования), наряду с тем фактом, что он не является высококонсервативным по всему RIP, делает его хорошим кандидатом на мутацию. Было обнаружено, что предпочтительными альтернативными заменами являются замены в положенияхY133N, Y133T, Y133A, Y133R, Y133D, Y133E, Y133Q, Y133G, Y133K, Y133H и Y133S. Для R3 аминокислотные остатки 152, 155 и 158 были идентифицированы как остатки, играющие ключевую роль в связывании с МНС II. Однако остатки 155 и 158 являются частью в высокой степени консервативной гидрофобной последовательности, что позволяет предположить, что их модификация не приводит к получению биологически активных молекул. Было обнаружено, что более подходящим кандидатом является низкоконсервативный остаток. Для R3 предпочтительными заменами также являются серии замен I152Q и I152A. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к модифицированному белку буганину,где указанный буганин модифицирован в одном или нескольких остатках X1, X2, X3, X4 или X5, а именно:c) NGQEX5AKFFLIVIQM (области R3 эпитопа, SEQ ID NO:7),где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту. В конкретном варианте изобретения X1 представляет собой Т, А или Q; X2 представляет собой G или А; X3 представляет собой Q или G; X4 представляет собой N, D, T, A, R, Q, E, G, Н, K или S; а X5 представляет собой Q или А (область R1 эпитопа, SEQ ID NO:8; область R2 эпитопа, SEQ ID NO:9; область R3 эпитопа, SEQ ID NO:10). Наиболее предпочтительные замены, взятые вместе, могут быть осуществлены на основании исследований по картированию иммуногенных эпитопов с помощью Т-клеточных анализов ex vivo путем имитации связывания пептидов с МНС in silico и структурного анализа, основанного на гомологии последовательностей. И, наконец, если биологически активный белок является предпочтительным, то может быть затем осуществлен анализ на in vitro активность модифицированного белка, который может содержать одну или множество мутаций. В соответствии с этим в другом своем варианте настоящее изобретение относится к модифицированному пептиду буганина, содержащему аминокислотную последовательность где X1-X5 могут представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO:11). В предпочтительном варианте изобретения X1 представляет собой Т, А или Q; X2 представляет собой G или А; X3 представляет собой Q или G; X4 представляет собой N, D, T, A, R, Q, E, G, Н, K или S; аX5 представляет собой Q или A (SEQ ID NO:12). В конкретном варианте изобретения модифицированный белок буганин содержит аминокислотную последовательность-8 010803 В еще одном варианте изобретения модифицированный белок буганин содержит аминокислотную последовательность Подчеркнутые остатки представляют собой замененные остатки, отличающиеся от остатков немодифицированного белка буганина. Как очевидно для каждого специалиста, может быть введено множество альтернативных серий модификаций, что позволяет удалять нежелательные эпитопы. Однако полученные последовательности должны быть в общих чертах гомологичными описанным здесь специфическим белкам, а поэтому они входят в объем настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения входят также очевидные химические эквиваленты последовательностей, описанных в настоящем изобретении. Такими эквивалентами являются белки, которые обладают аналогичной функцией и действуют, по существу, по тому же самому механизму. В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению имеет 1,2, 3, 4, 5 или более аминокислотных модификаций в Т-клеточных эпитопах белка. В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению, при его тестировании в Т-клеточном анализе, имеет более низкий индекс стимуляции по сравнению с немодифицированным белком буганином. В другом варианте изобретения Т-клеточные эпитопы белка буганина картируют с помощью Тклеточного анализа, а затем модифицируют, в результате чего, после повторного тестирования в Тклеточном анализе, указанный модифицированный белок буганин, по сравнению с немодифицированным белком буганином, имеет более низкий индекс стимуляции, а предпочтительно индекс стимуляции,составляющий менее чем 2,0. Для специалиста в данной области очевидно, что если модифицированный белок буганин обладает,по существу, пониженной биологической активностью или вообще не обладает такой активностью, то для восстановления биологической активности такого модифицированного белка буганина может потребоваться его дополнительная модификация, проводимая путем замены, добавления или делеции аминокислотных остатков. Однако модифицированные белки буганины, которые, по существу, обладают пониженной биологической активностью или вообще не обладает такой активностью, также входят в объем настоящего изобретения и могут быть использованы в качестве контроля в анализах или в целях сообщения толерантности. В одном из вариантов изобретения указанный модифицированный буганин мутирован в положении 70 тирозинового остатка, в результате чего этот буганин является инактивированным. В конкретном варианте изобретения тирозин в положении 70 заменен аланином. В предпочтительном варианте изобретения указанный модифицированный буганин имеет последовательность В схеме настоящего изобретения эпитопы разрушаются под действием мутации, приводящей к образованию последовательностей, которые уже не способны функционировать как Т-клеточные эпитопы. Для осуществления направленного мутагенеза последовательностей-мишеней могут быть применены способы рекомбинантных ДНК, и многие из этих способов являются доступными и хорошо известны специалистам. На практике могут быть продуцированы различные модифицированные белки буганины,которые могут быть протестированы на нужные иммунные и функциональные свойства. Особенно важно, чтобы при осуществлении модификации белковой последовательности, в которую вносят рассматриваемые изменения, в нее не были введены новые иммуногенные эпитопы. Практически этого можно избежать путем повторного тестирования рассматриваемой последовательности на присутствие эпитопов и/или лигандов МНС класса II любым подходящим способом. Модифицированные белки буганины согласно изобретению могут также содержать "пептидымиметики", либо они могут быть использованы для получения или конструирования "пептидовмиметиков". "Пептиды-миметики" представляют собой структуры, которые служат в качестве заменителей пептидов при их взаимодействии с молекулами (см. Morgan et al. (1989) Ann. Reports. Med. Chem.-9 010803 24:243-252). Пептидами-миметиками являются синтетические структуры, которые могут содержать, а могут и не содержать, аминокислотные и/или пептидные связи, но которые при этом сохраняют структурные и функциональные признаки белка согласно изобретению, включая биологическую активность и пониженную способность активировать человеческие Т-клетки. Пептидами-миметиками также являются пептоиды, олигопептоиды (Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:9367). Пептиды-миметики могут быть сконструированы на основе информации, полученной путем систематической замены L-аминокислот D-аминокислотами, путем замены боковых цепей группами, имеющими различные электронные свойства, и путем систематической замены пептидных связей амидными связями. Для определения конформационных требований к активности кандидата на пептид-миметик могут быть введены также локальные конформационные затруднения. Такие миметики могут включать в себя изостерические амидные связи или D-аминокислоты для стабилизации или стимуляции конформации с обратно направленными витками и для облегчения стабилизации данной молекулы. Для ограничения аминокислотных остатков конкретными конформационными состояниями могут быть использованы циклические аминокислотные аналоги. Указанными миметиками могут быть также имитаторы вторичных структур белков согласно изобретению. Эти структуры могут служить моделью 3-мерной ориентации аминокислотных остатков, с образованием известных вторичных конформаций белков. Могут быть использованы также пептоиды, которые представляют собой олигомеры N-замещенных аминокислот, и эти пептоиды могут быть использованы в качестве мотивов для генерирования химически разнообразных библиотек новых молекул. Молекулы согласно изобретению могут быть получены любыми способами, но наиболее предпочтительно рутинными рекомбинантными способами. Существует относительно простая процедура, в которой анализируют последовательности белка и на основе имеющейся информации получают полинуклеотид (ДНК), кодирующий любую из предпочтительных последовательностей белка. Это может быть достигнуто, например, с использованием компьютерных программ, таких как пакет программ DNSstar[DNAstar Inc, Madison, WI, USA] или аналогичных программ. Любая такая ДНК-последовательность,способная кодировать предпочтительные полипептиды согласно изобретению или их важные гомологи,должна рассматриваться как вариант настоящего изобретения. В соответствии с общей схемой, гены, кодирующие любые предпочтительные модифицированные последовательности белка буганина, могут быть получены путем генного синтеза и клонированы в подходящий экспрессирующий вектор. Этот экспрессирующий вектор, в свою очередь, вводят в клеткухозяина, и клетки отбирают и культивируют. Белки согласно изобретению выделяют из культуральной среды и на их основе получают препарат для терапевтического введения. Альтернативно, генная последовательность буганина дикого типа может быть получена, например, в соответствии со стратегией клонирования кДНК с использованием РНК, выделенной из тканей корней растения Bougainvillea spectabilisWilld. Ген дикого типа может быть использован в качестве матрицы для мутагенеза и конструирования предпочтительных вариантов последовательностей. В этом отношении особенно удобно применять стратегию "ПЦР с перекрывающимся удлинением", как описано Higuchi et al. [Higuchi et al. (1988) NucleicAcids Res. 16:7351], хотя могут быть с успехом использованы и другие методики и системы. Биологическая активность белков согласно изобретению с равным успехом может быть оценена многими способами. В одном из вариантов изобретения модифицированные молекулы буганина идентифицируют по N-гликозидазной активности, а в частности, по активности, достаточной для значительного ингибирования трансляции белка. Один из таких подходящих анализов включает в себя тестирование активности модифицированных белков буганинов по сравнению с немодифицированным буганином в бесклеточном анализе синтеза белка. Для этого осуществляют совместное инкубирование метионинсодержащей смеси для транскрипции/трансляции ДНК, кодирующей репортерный белок люциферазу и серийные разведения немодифицированного и модифицированного белка буганина. Уровни транслированной люциферазы могут быть легко детектированы с использованием прибора для регистрации люминесценции после добавления реагента-субстрата. Измеренная люминесценция обратно пропорциональнаN-гликозидазной активности буганина, присутствующей в реакции. При этом обычно используют негативный контроль, такой как, например, неактивный белок буганин, содержащий замену Y70A. Конструирование предпочтительных и активных молекул буганина может быть осуществлено способами рекомбинантных ДНК, и такое конструирование включает связывание молекул буганина с нужным антителом или с другими нацеливающими молекулами. Способы очистки и модификации рекомбинантных белков, включая гибридные белки, хорошо известны специалистам. Необходимые способы подробно описаны в литературе, например, в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney ed.,1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M.Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991). Белки и пептиды согласно изобретению могут быть получены способами рекомбинантных ДНК. Белки согласно изобретению могут быть также получены способами химического синтеза, хорошо из- 10010803 вестными специалистам в области химии белков, такими как твердофазный синтез (Merrifield, 1964, J.Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) или синтез в гомогенном растворе (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed., E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart). Настоящее изобретение также относится к очищенной и выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую модифицированные белки буганины или их пептиды согласно изобретению, а предпочтительно последовательность, кодирующую белок, описанный здесь как SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. Используемый здесь термин "выделенный и очищенный" относится к нуклеиновой кислоте, по существу, не содержащей клеточного материала или культуральной среды, при ее продуцировании способами рекомбинантных ДНК, или химических предшественников или других химических веществ, при ее продуцировании способом химического синтеза. "Выделенная и очищенная" нуклеиновая кислота также,по существу, не содержит последовательностей, обычно фланкирующих природную нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных у 5'- и 3'-концов данной нуклеиновой кислоты), от которой происходит данная нуклеиновая кислота. Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота" означает последовательность нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящих из природных оснований, сахаров и связей между сахарами (в остове). Этот термин также включает модифицированные или замененные последовательности, содержащие неприродные мономеры или их части, имеющие аналогичную функцию. Последовательностями нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть рибонуклеиновые (РНК) или дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), и эти последовательности могут содержать природные основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Эти последовательности могут также содержать модифицированные основания, такие как ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азаурацил, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил,4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенины, 8-гидроксиаденин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8 гидроксигуанин и другие 8-замещенные гуанины, другие аза- и деазаурацилы, тимидины, цитозины, аденины или гуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин. В одном из вариантов изобретения очищенная и выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую белки или пептиды, а предпочтительно SEQ ID NO:13 илиSEQ ID NO:14 согласно изобретению, где указанная последовательность включает:(a) последовательность нуклеиновой кислоты, где Т может также представлять собой U;(d) фрагмент (а)-(с), который составляет по меньшей мере 15 оснований, а предпочтительно 20-30 оснований, и который гибридизуется с последовательностями (а)-(с) в жестких условиях гибридизации; или(e) молекулу нуклеиновой кислоты, отличающуюся от любой из нуклеиновых кислот (а)-(с) последовательностями кодонов вследствие вырожденности генетического кода. Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие значительную гомологию с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими белки и пептиды согласно изобретению и их фрагменты. Термин "последовательности, имеющие значительную гомологию с данными последовательностями" означает последовательности нуклеиновой кислоты, которые имеют незначительные или не играющие важной роли отличия от этих последовательностей, т.е. последовательности, имеющие, по существу, ту же самую функцию и продуцирующие функционально эквивалентные белки. Указанные отличия могут быть обусловлены локальными мутациями или структурными модификациями. Последовательностями нуклеиновой кислоты, имеющими значительную гомологию, являются последовательности нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80%, а предпочтительно на 90% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белки и пептиды согласно изобретению. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты и к ее фрагментам, имеющим по меньшей мере 15 оснований, которые гибридизуются с молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению в условиях гибридизации, а предпочтительно в жестких условиях гибридизации. Соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, известны специалистам или могут быть описаны в руководстве Current Protocols in Molecular Biology, JohnWileySons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Так, например, гибридизация может быть проведена с использованием 6,0 хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) примерно при 45 С, с последующей промывкой 2,0SSC при 50 С. Жесткость условий гибридизации может быть выбрана исходя из условий, используемых в стадии промывки. Так, например, концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана в соответствии с условиями высокой жесткости, т.е. примерно 0,2SSC при 50 С. Кроме того, температура стадии промывки может также соответствовать условиям высокой жесткости, т.е. составлять примерно 65 С.- 11010803 В соответствии с этим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, имеющие последовательность, кодирующую белок или пептид согласно изобретению, могут быть встроены в соответствии с известными процедурами в подходящий экспрессирующий вектор, гарантирующий хорошую экспрессию белка или пептида. Подходящими экспрессирующими векторами являются, но не ограничиваются ими, космиды, плазмиды или модифицированные вирусы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), при условии, что такой вектор будет совместимым с используемой клеткой-хозяином. Выражение "векторы, подходящие для трансформации клеткихозяина" означает, что данные экспрессирующие векторы содержат молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению и регуляторные последовательности, отобранные из клеток-хозяев, используемых для экспрессии, и функционально присоединенные к данной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин"функционально присоединенный" означает, что данная нуклеиновая кислота присоединена к регуляторным последовательностям так, чтобы осуществлялась ее экспрессия. Поэтому в настоящем изобретении рассматривается рекомбинантный экспрессирующий вектор согласно изобретению, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее фрагмент, и регуляторные последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции встроенной последовательности белка. Подходящие регуляторные последовательности могут происходить от различных источников, включая бактериальные, грибковые или вирусные гены (см., например, регуляторные последовательности, описанные в публикации Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990. Выбор соответствующих регуляторных последовательностей зависит от выбранной клетки-хозяина и может быть легко осуществлен средним специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются транскрипционный промотор и энхансер или последовательность, связывающаяся с РНК-полимеразой, и последовательность, связывающаяся с рибосомой, включая сигнал инициации трансляции. Кроме того, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в экспрессирующий вектор могут быть введены и другие последовательности, такие как ориджин репликации, дополнительные ДНКрестрикционные сайты, энхансеры и последовательности, сообщающие индуцибельность транскрипции. Также следует отметить, что необходимые регуляторные последовательности могут поставляться природным белком и/или его фланкирующими областями. Рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут также содержать селективный маркерный ген, который облегчает выбор клеток-хозяев, трансформированных или трансфецированных рекомбинантной молекулой согласно изобретению. Примерами селективных маркерных генов являются гены, кодирующие белок, такой как G418 и гигромицин, который сообщает резистентность к некоторым лекарственным средствам, -галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу или люциферазу светляков. Мониторинг транскрипции селективного маркерного гена проводят по изменению концентрации селективного маркерного белка, такого как -галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза или люцифераза светляков. Если селективный маркерный ген кодирует белок, сообщающий резистентность к антибиотикам, такую как резистентность к неомицину, то клетки-трансформанты могут быть отобраны с использованием G418. Клетки, включающие селективный маркерный ген, будут выживать, а другие клетки будут погибать. Это позволяет осуществлять визуализацию и анализ на экспрессию рекомбинантных экспрессирующих векторов согласно изобретению, а в частности, определять влияние мутации на экспрессию и фенотип. Следует отметить, что селективные маркеры могут быть введены в отдельный вектор, состоящий из представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут также содержать гены, кодирующие гибридную молекулу, которая обеспечивает повышенную экспрессию рекомбинантного белка, повышенную растворимость рекомбинантного белка и облегчает очистку нужного рекомбинантного белка благодаря своему действию в качестве лиганда при проведении аффинной очистки. Так, например, в нужный рекомбинантный белок может быть введен сайт протеолитического расщепления для отделения данного рекомбинантного белка от гибридной молекулы после очистки гибридного белка. Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки-хозяева для продуцирования трансформированной клетки-хозяина. Термин "трансформированная клетка-хозяин" включает прокариотические и эукариотические клетки, которые были трансформированы или трансфицированы рекомбинантным экспрессирующим вектором согласно изобретению. Термины "трансформированный","трансфицированный", "трансформация" и "трансфекция" относятся к введению нуклеиновой кислоты(например, вектора) в клетку одним из многих возможных способов, известных специалистам. Прокариотические клетки могут быть трансформированы нуклеиновой кислотой, например, путем электропорации или трансформации, опосредуемой хлоридом кальция. Нуклеиновая кислота может быть введена в клетки млекопитающих стандартными способами, такими как копреципитация фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекция, опосредуемая DEAE-декстраном, способ с использованием липофектина, электропорация или микроинжекция. Подходящие способы трансформации и трансфекции клетокхозяев можно найти в руководстве Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 и в других лабораторных руководствах.- 12010803 Подходящими клетками-хозяевами являются прокариотические и эукариотические клетки-хозяева широкого ряда. Так, например, белки согласно изобретению могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как E.coli, клетки насекомых (с использованием бакуловирусов), дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева можно найти в публикации Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991). Нуклеиновая кислота считается "функционально присоединенной", если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально присоединена к ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде пре-белка, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально присоединен к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию последовательности, или сайт связывания с рибосомой функционально присоединен к кодирующей последовательности, если его расположение облегчает трансляцию. Вообще говоря,термин "функционально присоединенный" означает, что присоединенные ДНК-последовательности являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности они являются смежными и сохраняют рамку считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Присоединение осуществляется путем лигирования в подходящих рестрикционных сайтах. Если такие сайты отсутствуют, то в соответствии с общепринятой практикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры. В некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный буганин с низким числом потенциальных Тклеточных эпитопов, и функционально присоединенную к последовательности регуляции экспрессии. В различных вариантах изобретения экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки или пептиды согласно изобретению, или их вырожденный вариант и может содержать, по меньшей мере, RIP-кодирующий домен указанных нуклеиновых кислот, функционально присоединенных к подходящим последовательностям регуляции экспрессии и последовательностям для отбора. Вырожденность полинуклеотидов является хорошо известным фактом, означающим, что многие аминокислоты данного генетического кода кодируются более чем одним кодоном. Вырожденность данного кода приводит к тому, что 20 различных аминокислот кодируются 64 возможными последовательностями-триплетами, имеющими три из четырех возможных оснований, составляющих ДНК. Используемый здесь термин "RIP-кодирующий домен" или "домен, кодирующий белок, инактивирующий рибосому" означает функциональный домен, который сообщает буганину его биологическую активность. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также химически синтезированы стандартными способами. Различные способы химического синтеза полидезоксинуклеотидов являются известными, включая твердофазный синтез, который, подобно пептидному синтезу, полностью автоматизирован и проводится на коммерчески доступных ДНК-синтезаторах (см., например, Itakura et al.,патент США 4598049; Caruthers et al., патент США 4458066 и Itakura, патенты США 4401796 и 4373071). Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим гибридные белки,содержащие новый белок согласно изобретению и выбранный белок, или селективный маркерный белок. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к культивированной клетке, содержащей по меньшей мере один из вышеупомянутых векторов. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного буганина, включающему культивирование вышеупомянутой клетки в условиях, способствующих экспрессии модифицированного буганина в экспрессирующем векторе и выделение указанного буганина из этой клетки.(В) Модифицированные цитотоксины буганины. Как упоминалось ранее, буганин представляет собой инактивирующий рибосому белок типа 1(RIP), который депуринизирует главную рибосомную РНК клеток, что приводит к прекращению синтеза белка и к гибели клеток. Сами модифицированные буганины согласно изобретению могут быть использованы для получения цитотоксинов. Цитотоксины, содержащие модифицированный белок буганин, являются более предпочтительными по сравнению с цитотоксинами, содержащими немодифицированный белок буганин, поскольку первые цитотоксины являются менее иммуногенными и, по всей вероятности,менее подвержены разрушению под действием иммунной системы до того, как они достигнут нужной цели. В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к цитотоксину, содержащему (а) нацеливающую молекулу, присоединенную к (b) модифицированному белку буганину согласно изобретению. Термин "модифицированный белок буганин согласно изобретению" используется для удобства и включает любые и все описанные здесь модифицированные белки буганины, такие как модифицированные белки буганины, описанные выше в разделе (А), а также на фигурах и в примерах. Используемый здесь термин "нацеливающая молекула" означает вещество, средство или способ доставки модифицированного белка буганина в клетку-мишень. В одном из вариантов изобретения ука- 13010803 занной нацеливающей молекулой является антитело. В одном из вариантов изобретения указанной нацеливающей молекулой может быть липосома. В одном из вариантов изобретения указанная липосома может быть присоединена к антителу. В другом варианте изобретения указанной нацеливающей молекулой является белок, способный обеспечивать специфическое связывание с конкретной клеткой-мишенью. Такие белковые молекулы включают различные полипептидные лиганды, для которых имеются специфические рецепторы на клеточной поверхности, а поэтому они включают различные цитокины, пептидные и полипептидные гормоны и другие модификаторы биологических ответов. Характерными примерами являются такие белки, как васкулярный эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста,герегулин, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли и другой белок и молекулы гликопротеина. Могут также рассматриваться гибридные белки этих и других молекул с буганином согласно изобретению, и эти белки могут содержать модифицированную молекулу буганина либо в N-концевой, либо в С-концевой ориентации по отношению к домену белкового лиганда. Указанная нацеливающая молекула может быть присоединена к белкам согласно изобретению непосредственно или посредством линкера. В одном из вариантов изобретения указанным линкером является пептидный линкер или химический линкер. Аналогичным образом, в настоящем изобретении может рассматриваться химическое перекрестное связывание очищенного лиганда с модифицированным белком буганином, и такое связывание входит в объем изобретения. В своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему (а) лиганд, который связывается с раковой клеткой, и (b) связанный с этим лигандом модифицированный белок буганин согласно изобретению. Лигандом может быть любая молекула, которая может связываться с раковой клеткой, включая, но не ограничиваясь ими, белки. В одном из вариантов изобретения указанным лигандом является антитело или фрагмент антитела, которые распознают поверхность раковой клетки. В соответствии с этим цитотоксины согласно изобретению могут быть использованы для лечения различных форм рака, таких как рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы, Т-клеточные и Вклеточные лимфомы. В одном из вариантов изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, содержит полноразмерную молекулу иммуноглобулина, которая связывается с раковой клеткой. Если лигандом, связывающимся с раковой клеткой, является антитело или его фрагмент, то цитотоксин может быть назван иммунотоксином. В другом варианте изобретения лигандом, связывающимся с раковой клеткой, является димер Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, scFv-фрагмента, фрагмента однодоменного антитела или дисульфидстабилизированных Fv-фрагментов. В другом варианте изобретения противораковое антитело содержит вариабельную тяжелую цепь, вариабельную легкую цепь, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, scFv-фрагмент,фрагмент однодоменного антитела или дисульфид-стабилизированный Fv-фрагмент. Части лиганда, связывающегося с раковой клеткой, могут происходить от одного или нескольких видов, предпочтительно они включают части, происходящие от человека, а наиболее предпочтительно эти части является полностью человеческими или гуманизованными. Области, сконструированные для облегчения очистки или для конъюгирования с токсином, могут быть также включены в часть, связывающуюся с раковой клеткой, либо они могут быть присоединены к ней. В конкретном варианте изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, распознает ЕрСАМ. Ер-САМ (адгезивная молекула эпителиальных клеток, также известная как 17-1 А, KSA, EGP-2 иGA733-2) представляет собой трансмембранный белок, который в высокой степени экспрессируется во многих солидных опухолях, включая карциномы легких, молочной железы, яичника, ободочной кишки и плоскоклеточную карциному головы и шеи, но слабо экспрессируется в большинстве нормальных эпителиальных тканей. В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному цитотоксину буганину, конъюгированному с нацеливающей молекулой Ер-САМ, где указанный цитотоксин включает (а) лиганд (такой, как антитело или фрагмент антитела), который связывается с Ер-САМ на раковой клетке; и (b) связанный с этим лигандом модифицированный белок буганин, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки. В конкретном варианте изобретения указанный цитотоксин содержит (а) гуманизованное антитело или фрагмент антитела, которые связываются с внеклеточным доменом человеческого Ер-САМ и включают последовательности гипервариабельной области (CDR), происходящие от антитела МОС-31 и присоединенные к (b) модифицированному белку буганину, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки. Подходящими модифицированными буганинами, конъюгированными с Ер-САМ, согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, VB6-845 и их варианты, другие цитотоксины, содержащие другие одноцепочечные или двухцепочечные иммуноглобулины, которые селективно связываются с ЕрСАМ, или их варианты. Используемый здесь термин "VB6-845" означает цитотоксин, который содержит(SEQ ID NO:13). Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VB6-845 показаны на фиг. 3 В (SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:15, соответственно). В другом варианте изобретения лиганд, связывающийся с раковой клеткой, распознает опухолеассоциированный антиген, который присутствует только на опухолевых клетках, но отсутствует в нормальных клетках. В предпочтительном варианте изобретения указанным лигандом является антитело,которое связывается с опухолеассоциированным антигеном. Антитело против опухолеассоциированного антигена специфически распознает раковые клетки широкого ряда, но не распознает нормальные нераковые клетки. В соответствии с другим своим вариантом настоящее изобретение относится к цитотоксину, содержащему (а) лиганд (такой, как антитело или фрагмент антитела), который связывается с опухолеассоциированным антигеном на раковой клетке; (b) и связанный с этим антигеном модифицированный белок буганин, который, по сравнению с немодифицированным белком буганином, обладает пониженной способностью активировать Т-клетки. Подходящими модифицированными буганинами, конъюгированными с опухолеассоциированным антигеном, согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, VB6-011 и их варианты, или другие цитотоксины, содержащие другие одноцепочечные или двухцепочечные иммуноглобулины, которые селективно связываются с опухолеассоциированным антигеном, или их варианты. Используемый здесь термин "VB6-011" означает цитотоксин, который содержит Fab-вариант моноклонального человеческого антитела Н 11, генетически связанного с модифицированной формой буганина, Boul56 (SEQ IDNO:13). Антитело Н 11 было получено путем слияния лимфоцитов периферической крови, взятых у 64 летнего пациента-мужчины, страдающего раком, с человеческой миеломной клеточной линией с образованием гибридомы. Гибридома NBGM1/H11 продуцирует IgMk, который был реконструирован в Fab с получением VB6-011 (см. патент США 6207153 или WO 97/44461, где подробно описано получение гибридомы, секретирующей антитело Н 11). Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VB6-011 показаны на фиг. 15 (SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:27, соответственно). В конкретном неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин содержит VB6-845(фиг. 3 В, SEQ ID NO:16) или VB6-011 (фиг. 15, SEQ ID NO:28). В других неограничивающих вариантах изобретения указанный цитотоксин содержит вариант VB6-845 или VB6-011. Вариант VB6-845 связывается с тем же самым эпитопом Ер-САМ или, по существу, с аналогичным эпитопом Ер-САМ, который связывается с VB6-845, и этот вариант может конкурентно ингибировать по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание VB6845 с Ер-САМ в физиологических условиях. Вариант VB6-845 может содержать такой же модифицированный буганин, как и VB6-845, либо он может содержать другой модифицированный буганин согласно изобретению. В другом неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин содержит ЕрСАМ-связывающую часть, включающую вариабельную область MOC31 или ее вариант. В еще одном варианте изобретения указанный цитотоксин содержит Ер-САМ-связывающую часть, включающую 4D5MOCB, или ее вариант. Уровень связывания любого из этих цитотоксинов с Ер-САМ может быть снижен по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% путем конкурентного связывания с исходным антителом MOC31 или 4D5MOCB в физиологических условиях. Вариант VB6-011 связывается с тем же самым эпитопом опухолеассоциированного антигена, или,по существу, с аналогичным эпитопом опухолеассоциированного антигена, который связывается с VB6011, и этот вариант может конкурентно ингибировать по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание VB6-011 с опухолеассоциированным антигеном в физиологических условиях. Вариант VB6-011 может содержать такой же модифицированный буганин, как и VB6-011, либо он может содержать другой модифицированный буганин согласно изобретению. В другом неограничивающем варианте изобретения указанный цитотоксин включает часть, связывающуюся с опухолеассоциированным антигеном и содержащую моноклональное антитело H11, антигенсвязывающие фрагменты H11 или его варианты. Уровень связывания любого из этих цитотоксинов сVB6-011 может быть снижен по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90 или 95% путем конкурентного связывания с исходным антителом H11 в физиологических условиях. В предпочтительном варианте изобретения аффинность связывания Ер-САМ-связывающей части или части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, составляет по меньшей мере четыре порядка величины, предпочтительно по меньшей мере три порядка величины, более предпочтительно менее чем два порядка величины аффинности связывания VB6-845 или VB6-011, соответственно, как было измерено стандартными лабораторными способами. В неограничивающих вариантах изобретения Ер-САМ-связывающая часть может конкурентно блокировать по меньшей мере на 0,1, 1, 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание известного анти-Ер-САМ антитела,такого как, но не ограничивающегося ими, PANOREX или МТ 201, с Ер-САМ в физиологических условиях. В неограничивающих вариантах изобретения часть, связывающаяся с опухолеассоциированным антигеном, может конкурентно блокировать по меньшей мере на 0,1, 1, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% связывание известного антитела против опухолеассоциированного- 15010803 антигена, такого как, но не ограничивающегося ими, H11, с опухолеассоциированным антигеном в физиологических условиях. Для специалиста в данной области очевидно, что могут быть идентифицированы специфичностьопределяющие остатки. Термин "специфичность-определяющий остаток", также известный как "SDR",означает остаток, который образует часть паратопа антитела, а в частности, остатки CDR, где их отдельные замены аланином, независимо от любых других мутаций, приводят к снижению аффинности антитела по отношению к эпитопу по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз, а более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз. Такая потеря аффинности указывает на то, что эти остатки играют важную роль в способности антитела связываться с эпитопом. См., например, Tamura et(SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only", J. Immunol. 164(3):1432-1441. Влияние одной или множества мутаций на активность связывания, а в частности, на аффинность связывания, может быть определено одновременно для оценки роли конкретного набора аминокислот в связывании (например, роли CDR2 легкой или тяжелой цепи в связывании). Влияние мутации аминокислот может быть также оценено по отдельности для оценки роли одной аминокислоты в связывании. Такая оценка может быть проведена, например, путем сканирования насыщения in vitro (см., например,патент США 6180341; Hilton et al., 1996, "Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor", J. Biol. Chem. 271:4699-4708) и сайт-направленного мутагенеза (см., например, Cunninghamand Wells, 1989, "High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis", Science 244:1081-1085; Bass et al., 1991, "A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502). При аланинсканирующем мутагенезе во множество положений остатков молекулы вводят одиночные аланиновые мутации, и полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность для идентификации аминокислотных остатков, играющих решающую роль в активности данной молекулы. Сайты связывания лиганда с рецептором или других биологических взаимодействий могут быть также идентифицированы путем проведения физического анализа структуры, определенной, например, с помощью ядерного магнитного резонанса, кристаллографии, электронной дифракции или фотоаффинного мечения, в комбинации с мутацией предполагаемого сайта контактирования аминокислот (см., например, de Vos et al., 1992, "Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure ofthe complex", Science 255:306-312; Smith et al., 1992, "Human interleukin 4. The solution structure of a fourhelix bundle protein", J. Mol. Biol. 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, "Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25 A resolution", FEBS Lett. 309:59-64). Кроме того, важность конкретных отдельных аминокислот или серий аминокислот может быть оценена путем их сравнения с аминокислотной последовательностью родственных полипептидов или аналогичных сайтов связывания. Кроме того, для специалиста в данной области очевидно, что повышенная авидность может компенсировать пониженную аффинность связывания. Авидность цитотоксина по отношению к рецептору раковой клетки является параметром силы связывания Ер-САМ-связывающих частей с Ер-САМ, который имеет множество сайтов связывания. Сила функционального связывания Ер-САМ и Ер-САМсвязывающей части представляет собой суммарную силу всех аффинных связей, и, таким образом, отдельный компонент может связываться с относительно низкой аффинностью, а мультимер таких компонентов может демонстрировать сильный биологический эффект. Действительно, множество взаимодействий между Ер-САМ-связывающими сайтами и эпитопами Ер-САМ могут давать гораздо больший эффект, чем аддитивный биологический эффект, т.е. преимущество поливалентности может давать величину, которая на много порядков превышает величину константы равновесия. Аналогичным образом, авидность цитотоксина по отношению к рецептору раковых клеток представляет собой параметр силы связывания опухолеассоциированного антигена с частями, связывающимися с таким опухолеассоциированным антигеном, который может иметь множество сайтов связывания. Сила функционального связывания опухолеассоциированного антигена и части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, представляет собой суммарную силу всех аффинных связей, а это значит, что отдельный компонент может связываться с относительно низкой аффинностью, тогда как мультимер таких компонентов может демонстрировать сильный биологический эффект. Действительно, несколько взаимодействий между сайтами, связывающимися с опухолеассоциированным антигеном, и эпитопами опухолеассоциированного антигена могут давать гораздо больший эффект, чем аддитивный биологический эффект, т.е. преимущество поливалентности может давать величину, которая во много порядков превышает величину константы равновесия. В одном из неограничивающих вариантов изобретения Ер-САМ-связывающая часть имеет структуру, по существу, аналогичную структуре 4D5MOCB. В основном, аналогичная структура может быть охарактеризована путем сравнения с эпитопными картами, которые иллюстрируют участки связывания Ер-САМ-связывающей части цитотоксина с молекулой Ер-САМ. В другом неограничивающем варианте изобретения могут быть построены эпитопные карты для части, связывающейся с опухолеассоциированным антигеном, и, по существу, аналогичная структура может быть охарактеризована путем ее сравне- 16010803 ния с эпитопными картами, иллюстрирующими сайты, в которых антигенсвязывающая часть цитотоксина связывается с молекулой опухолеассоциированного антигена. Цитотоксины согласно изобретению могут быть получены с помощью химического синтеза способами, хорошо известными специалистам в области химии белков, такими как твердофазный синтез (Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964 или синтез в гомогенном растворе (Houbenweyl, Methodsof Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15I and II, Thieme, Stuttgart (1987. В одном из вариантов изобретения связывающийся с раковой клеткой лиганд и модифицированный буганин, оба представляют собой белки, и эти белки могут быть конъюгированы способами, хорошо известными специалистам. Существует несколько сотен доступных перекрестносшивающих линкеров, посредством которых могут быть конъюгированы два белка (см., например, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", 1991,Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Перекрестносшивающий линкер обычно выбирают исходя из реакционноспособных функциональных групп, находящихся на лиганде или токсине или встроенных в них. Кроме того, если реакционноспособные группы отсутствуют, то может быть использован фотоактивируемый перекрестносшивающий линкер. В некоторых случаях может оказаться желательным включение спейсера между лигандом и токсином. Известными перекрестносшивающими агентами являются гомобифункциональные агенты: глутаральдегид, диметиладипимидат и бис(диазобензидин), и гетеробифункциональные агенты: м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимид и сульфо-м-малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимид. Гибридный белок "лиганд-буганиновый токсин" может быть также получен способами рекомбинантных ДНК. В этом случае ДНК-последовательность, кодирующую лиганд, связывающийся с раковой клеткой, присоединяют к ДНК-последовательности, кодирующей модифицированный белок буганин, в результате чего получают химерную молекулу ДНК. Химерную ДНК-последовательность трансфицируют в клетку-хозяина, которая экспрессирует гибридный белок "лиганд-буганин". Гибридный белок может быть выделен из клеточной культуры и очищен способами, известными специалистам. Антитела, обладающие специфичностью к белкам клеточной поверхности, таким как Ер-САМ и опухолеассоциированный антиген, могут быть получены стандартными способами. Млекопитающее(например, мышь, хомячок или кролик) может быть иммунизовано иммуногенной формой пептида, который вырабатывает гуморальный ответ у млекопитающего. Способами сообщения иммуногенности пептиду являются его конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам. Так, например, этот пептид может быть введен в присутствии адъюванта. Мониторинг процесса иммунизации может быть проведен путем детекции титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть применены стандартный ELISA-анализ или другие процедуры иммуноанализа с использованием иммуногена в качестве антигена. После иммунизации может быть получена антисыворотка, и из этой сыворотки, если это необходимо, выделяют поликлональные антитела. Для продуцирования моноклональных антител, антителопродуцирующие клетки (лимфоциты) могут быть взяты у иммунизованного животного и подвергнуты слиянию с миеломными клетками в соответствии со стандартными процедурами слияния соматических клеток, и, тем самым, иммортализации этих клеток с получением гибридомных клеток. Указанные способы (например, гидридомная технология, впервые разработанная Kohler и Milstein (Nature 256:495-497 (1975, а также другие способы, такие как технология получения человеческой В-клеточной гибридомы (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72(1983, технология получения EBV-гибридомы для продуцирования человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., pages 77-96 (1985 и скрининг комбинаторных библиотек антител (Huse et al., Science 24 6:1275 (1989 хорошо известны специалистам. Гибридомные клетки могут быть скринированы иммунохимическим способом на продуцирование антител, специфически реагирующих с пептидом, и могут быть выделены моноклональные антитела. Используемый здесь термин "антитело" включает моноклональные антитела и поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab и F(ab')2, одноцепочечные антитела (scFv и химерные антитела, которые также специфически реагируют с компонентом клеточной поверхности. Антитела могут быть фрагментированы стандартными способами, и такие фрагменты могут быть скринированы на их эффективность способом, описанным выше. Так, например, F(ab')2-фрагменты могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Полученный F(ab')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с получением Fab'-фрагментов. Одноцепочечные антитела объединяют с антигенсвязывающими областями антитела на одной полипептидной цепи, имеющей стабильную укладку. Одноцепочечные антитела могут быть получены способами рекомбинантных ДНК. Производные химерных антител, т.е. молекулы антител, в которых объединены вариабельная область животного, не являющегося человеком, и человеческая константная область, также входят в объем настоящего изобретения. Молекулы химерного антитела могут включать, например, антигенсвязывающий домен, происходящий от антитела мыши, крысы или другого животного, и человеческие константные области. Для получения химерных антител, содержащих вариабельную область иммуноглобулина,распознающую антиген клеточной поверхности, могут быть применены стандартные способы (см., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985),Cabilly et al., патент США 4316567; Boss et al., патент США 4816497; Tanaguchi et al., патент E.P.- 17010803171496; европейский патент 173494, патент ВеликобританииGB 2177096 В). Считается, что химерные антитела являются менее иммуногенными для человека, чем соответствующее нехимерное антитело. Химерные антитела могут быть стабилизированы способом, описанным Pluckthun et al.,WO 00/61635. Моноклональные или химерные антитела, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть затем гуманизованы путем продуцирования химер человеческих константных областей, в которых части вариабельных областей, а в частности, консервативных каркасных областей антигенсвязывающего домена, происходят от человеческого антитела, и только гипервариабельные области не являются человеческими. Такие молекулы иммуноглобулина могут быть получены способами,известными специалистам (см., например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:7308-7312 (1983);Kozbor et al., Immunology Today 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982), и публикацию РСТ WO 92/06193 или ЕР 239400). Гуманизованные антитела могут быть также коммерчески доступными(Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain.). Кроме того, моноклональные или химерные антитела, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть сделаны менее иммуногенными путем уменьшения числа их потенциальных Т-клеточных эпитопов. Специфические антитела или фрагменты антител, специфически реагирующие с компонентами клеточной поверхности, могут быть продуцированы путем скрининга экспрессионных библиотек, кодирующих гены иммуноглобулина или их части, экспрессируемые в бактериях, с компонентами клеточной поверхности. Так, например, полноразмерные Fab-фрагменты, VH-области и Fv-области могут быть экспрессированы в бактериях с использованием фаговых экспрессионных библиотек (см., например, Ward etal., Nature 341:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) и McCafferty et al., Nature 348:552554 (1990. Альтернативно, для продуцирования антител или их фрагментов может быть использована мышь SCID-hu, например модель, выведенная Genpharm. Во всех случаях, где модифицированный белок буганин получают путем присоединения к последовательности антитела, наиболее желательно использовать последовательности антител, из которых были удалены Т-клеточные эпитопы или последовательности, способные связываться с молекулами МНС класса II или способные стимулировать Т-клетки или связываться с Т-клетками в ассоциации с молекулами МНС класса II. В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин может быть присоединен в белку, который не является антителом, но который при этом способен обеспечивать специфическое связывание на конкретной клетке-мишени. Такими белковыми молекулами являются различные полипептидные лиганды, для которых имеются специфические рецепторы на клеточной поверхности, и различные цитокины, пептидные и полипептидные гормоны и другие модификаторы биологических ответов. Репрезентативными примерами являются такие белки, как васкулярный эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, герегулин, интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли и другой белок и молекулы гликопротеина. Могут также рассматриваться гибридные белки этих и других молекул с буганином согласно изобретению, и эти белки могут содержать модифицированную молекулу буганина либо в N-концевой, либо в С-концевой ориентации по отношению к домену лиганда белка. Аналогичным образом, в настоящем изобретении может рассматриваться химическое перекрестное связывание очищенного лиганда с модифицированным белком буганином, и такое связывание входит в объем изобретения. В другом варианте изобретения модифицированный белок буганин согласно изобретению может быть использован в виде комплекса, содержащего водорастворимый полимер, такой как гидроксипропилметакриламид или другие полимеры, в которых модифицированный белок буганин присоединен в указанному полимеру посредством ковалентной или нековалентной связи. Указанный вариант может дополнительно включать антигенсвязывающий домен, такой как антитело или фрагмент антитела в комбинации с комплексом "полимер-буганин".(С) Применение цитотоксинов. Модифицированные белки буганины согласно изобретению могут быть использованы для специфического ингибирования или разрушения клеток млекопитающих, пораженных раком. Преимущество цитотоксинов согласно изобретению заключается в том, что они являются менее иммуногенными, что позволяет RIP проникать в клетку и эффективно уничтожать такую раковую клетку. Так, например, цитотоксин может быть использован для специфической доставки в раковые клетки. Буганин, после проникновения в раковую клетку, депуринизирует главную рибосомную РНК, что приводит к разрушению рибосом, к прекращению синтеза белка и к гибели клеток. В соответствии с одним из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковой клетки, включающему введение цитотоксина согласно изобретению животному, нуждающемуся в этом. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению для ингибирования или разрушения раковой клетки. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению в целях изготовления лекарственного средства для ингибирования или разрушения раковой клетки. Тип раковых клеток, которые были ингибированы или разрушены под действием цитотоксина, может быть определен по антигенной специфичности части антитела против этого цитотоксина.- 18010803 В другом варианте изобретения настоящее изобретение относится к способу ингибирования или разрушения раковых клеток, включающему стадии получения цитотоксина согласно изобретению и введения этого цитотоксина в клетки. Указанным раком может быть рак любого типа, включая, но не ограничиваясь им, рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы,рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак печени, рак почек, меланомы, рак желудочно-кишечного тракта, рак предстательной железы, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легких, саркомы, глиомы,Т-клеточные и В-клеточные лимфомы. Способность цитотоксинов согласно изобретению селективно ингибировать или разрушать раковые клетки животного может быть легко протестирована in vitro с использованием раковых клеточных линий животного. Селективное ингибирующее действие цитотоксинов согласно изобретению может быть определено, например, путем выявления селективного ингибирования пролиферации раковых клеток. Токсичность может быть измерена исходя из жизнеспособности клеток, например, может быть проведено сравнение жизнеспособности культур нормальных и раковых клеток, обработанных данными цитотоксинами. Жизнеспособность клеток может быть оценена известными способами, такими как анализ на исключение трипановым синим. В другом примере для тестирования цитотоксичности цитотоксинов может быть применен ряд моделей. В работе Thompson E.W. et al. (Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994 была описана модель для определения инвазивности раковых клеток человеческой молочной железы in vitro путем измерения опосредуемого опухолевой клеткой протеолиза внеклеточного матрикса (коллагена, ламинина,фибронектина, матригеля или желатина) и опухолевой инвазии через реконструированную базальную мембрану. Другими подходящими моделями раковых клеток являются культивированные клетки аденокарциномы яичника (Young T.N. et al., Gynecol. Oncol. 62:89-99 (1996); Moore D.H. et al. Cynecol. Oncol. 65:78-82 (1997, человеческие фолликулярные раковые клетки щитовидной железы (Demeure M.J. et al.,World J. Surg. 16:770-776 (1992, клеточные линии человеческой меланомы (А-2058) и фибросаркомы(НТ-1080) (Mackay A.R. et al., Lab. Invest. 70:781-78 3 (1994 и клеточные линии плоскоклеточного рака легких (HS-24) и аденокарциномы (SB-3) (Spiess E. et al., J. Histochem. Cytochem. 42:917-929 (1994. Была также описана in vivo тест-система, включающая имплантацию опухолей и измерение роста опухоли и метастазов у бестимусных "голых" мышей (Thompson E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370(1994); Shi Y.E. et al., Cancer Res. 53:1409-1415 (1993. Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение эффективного количества одного или нескольких цитотоксинов согласно изобретению животному, нуждающемуся в таком введении. Настоящее изобретение относится к использованию цитотоксина согласно изобретению для лечения рака. Настоящее изобретение также относится к использованию цитотоксина согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для лечения рака. Термин "животное" охватывает всех членов царства животных, включая человека. Термин "лечение рака" или "лечить рак" означает ингибирование репликации раковых клеток, подавление распространение рака (метастазов), ингибирование роста опухоли, снижение числа раковых клеток или замедление роста опухоли, снижение степени злокачественности рака или ослабление ассоциированных с раком симптомов. В предпочтительном варианте изобретения указанным животным является человек. В другом варианте изобретения указанное раковое заболевание выбирают из рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака печени, рака почек, меланомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака предстательной железы, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких, саркомы, глиомы, Т-клеточных и В-клеточных лимфом. Клинические эффекты лечения рака с использованием цитотоксина согласно изобретению могут быть легко оценены специалистом в данной области, например врачом. Так, например, стандартные медицинские тесты для измерения клинических индикаторов рака могут служить убедительным свидетельством эффективности лечения. Такими тестами могут быть, без ограничений, физическое обследование,оценка по соответствующей шкале эффективности, выявление маркеров, являющихся показателями заболевания, ЭКГ в 12 отведениях, измерение размера опухоли, биопсия ткани, цитоскопия, цитология,вычисление наибольшего диаметра опухоли, радиография, компьютерная визуализация опухоли, определение показателей жизненно важных функций, определение массы, регистрация побочных реакций,выявление вспышек инфекции, оценка сопутствующего лечения лекарственными средствами, оценка болей, биохимический анализ крови или сыворотки, анализ мочи, компьютерно-томографическое сканирование и фармакокинетический анализ. Кроме того, синергические эффекты комбинированной терапии,включающей лечение цитотоксином и другими противораковыми терапевтическими средствами, могут быть определены путем сравнительных исследований пациентов, подвергающихся монотерапии. Ремиссия злокачественных опухолей может быть оценена в соответствии с критериями, обычно используемыми специалистами. См., например, Therasse et al., 2000, "New guidelines to evaluate the responseInstitute of the United States, National Cancer Institute of Canada", J. Natl. Cancer. Inst. Feb. 2; 92(3):205-16. Эффективная доза специфической конструкции цитотоксина может зависеть от различных факто- 19010803 ров, включая тип рака, размер опухоли, стадию развития рака, токсичность цитотоксина для пациента,специфичность доставки в раковые клетки, а также возраст, массу и состояние здоровья пациента. Цитотоксины, содержащие модифицированный буганин, могут быть введены путем внутривенного(i.v.) вливания в течение периода времени от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от дозы и концентрации цитотоксина в инфузате. В одном из вариантов изобретения указанный цитотоксин вводят в течение 3 ч. В одном из вариантов изобретения эффективная доза при i.v. введении цитотоксина может составлять в пределах примерно от 1 до 100 мг/кг/дозу. В других вариантах изобретения такая доза может составлять в пределах примерно от 2 до 50 мг/кг/дозу. В конкретных вариантах изобретения такая доза может составлять по меньшей мере примерно 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 мг/кг/дозу. В одном из вариантов изобретения разовую дозу вводят примерно каждую неделю в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Разовая доза может быть введена каждую неделю, либо альтернативно, она может быть введена с перерывом в одну или несколько недель. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 4, 6 или 12 недель. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 4, 6 или 12 недель. В другом варианте осуществления изобретения разовую дозу вводят каждый месяц в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев подряд. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 4, 6 или 12 месяцев. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3,4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 4,6 или 12 месяцев. В конкретном неограничивающем варианте изобретения эффективная доза цитотоксина составляет примерно 1-50 мг/кг/опухоль/день, где пациенту вводят разовую дозу в день. Такую разовую дозу вводят приблизительно каждый день (указанная доза может вводиться с перерывами, но необязательно, в один или несколько дней) в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней подряд. После проведения этого цикла следующий цикл может начинаться приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Такая схема лечения может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более циклов, причем каждый цикл может проводиться с перерывами приблизительно в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель. Объем инъекции предпочтительно представляет собой, по меньшей мере, эффективное количество,которое является подходящим для данного типа и/или локализации опухоли. Максимальный объем инъекции в разовой дозе может составлять примерно 25-75% от объема опухоли, например приблизительно одну четверть, одну треть или три четверти от измеренного объема опухоли-мишени. В конкретном неограничивающем варианте изобретения максимальный объем инъекции в разовой дозе составляет приблизительно 30% от объема опухоли. В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в течение 3 ч при скорости введения 100 см 3/ч в виде раствора, содержащего 1-10 мг цитотоксина/мл. Этот цитотоксин может быть разведен в подходящем физиологически совместимом растворе. Эффективная доза другого противоракового терапевтического средства, вводимого вместе с цитотоксином во время проведения данного цикла, также варьируется в зависимости от способа введения. Одно или несколько противораковых терапевтических средств могут быть введены непосредственно в опухоль или другими способами введения. Обычно химиотерапевтические средства вводят системно. Стандартная доза и схемы лечения известны специалистам (см., например, последние издания Merck Index и Physician's Desk Reference; NCCN Practice Guidelines in Oncology). Комбинированная терапия с использованием цитотоксина может повышать чувствительность рака или опухоли к введению другого противоракового терапевтического средства. В соответствии с этим в настоящем изобретении рассматривается комбинированная терапия для предупреждения, лечения и/или предотвращения рецидивов рака, включающая введение эффективного количества цитотоксина до введения, одновременно с введением или после введения пониженной дозы противоракового терапевтического средства. Так, например, предварительное лечение цитотоксином может повышать чувствительность рака или опухоли к последующему введению дозы противоракового терапевтического средства. При отдельном введении противоракового терапевтического средства или при его введении в отсутствии цитотоксина эта доза может быть примерно равна нижнему пределу интервала стандартных доз либо она может быть ниже этого предела. При одновременном введении данный цитотоксин может быть введен отдельно от противоракового терапевтического средства и, необязательно, другим способом введения. В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинациипо меньшей мере с одним другим иммунотерапевтическим средством. В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с лучевой терапией. Такая терапия может включать хирургическое вмешательство и/или химиотерапию. Так, например, цитотоксин может быть введен в комбинации с лучевой терапией и с цисплатином (Platinol), фторурацилом (5-FU,Adrucil), карбоплатином (Paraplatin) и/или с паклитакселом (Taxol). При лечении цитотоксином могут быть использованы более низкие дозы лучевой терапии и/или менее частое проведение лучевой терапии,что может, например, снизить число случаев тяжелого поражения горла, которое затрудняет процесс- 20010803 глотания и, возможно, приводит к нежелательной потере массы или к обезвоживанию. В другом варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с одним или несколькими цитокинами, которыми являются, но не ограничиваются ими, лимфокин, факторы некроза опухоли, цитокин,подобный фактору некроза опухоли, лимфотоксин, интерферон, макрофагальный белок воспаления, гранулоцитарный-моноцитарный колониестимулирующий фактор, интерлейкин (включая, но не ограничиваясь ими, интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-6, интерлейкин-12, интерлейкин-15, интерлейкин-18) и его вариант, включая их фармацевтически приемлемые соли. В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с противораковой вакциной,включая, но не ограничиваясь ими, аутологичные клетки или ткани, неаутологичные клетки или ткани,карциноэмбриональный антиген, альфа-фетопротеин, человеческий хорионический гонадотропин, "живую" вакцину БЦЖ, белки линии дифференцировки меланоцитов и мутированные опухолеспецифические антигены. В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с гормональной терапией. Гормональными терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, гормональный агонист, гормональный антагонист (например, флутамид, тамоксифен, ацетат лейпролида (LUPRON и стероид (например, дексаметазон, ретиноид, бетаметазон, кортизол, кортизон, преднизон, дегидротестостерон, глюкокортикоид, минералокортикоид, эстроген, тестостерон, прогестин). В еще одном варианте изобретения цитотоксин вводят в комбинации с генотерапией для лечения или предупреждения рака. В другом варианте изобретения Ер-САМ-конъюгированный токсин вводят в комбинации с одним или несколькими агентами, которые повышают уровень экспрессии Ер-САМ в представляющих интерес опухолевых клетках. Уровень экспрессии Ер-САМ, предпочтительно, повышают так, чтобы на поверхности опухолевой клетки экспрессировалось большее число молекул Ер-САМ. Так, например, указанный агент может ингибировать нормальные циклы эндоцитоза антигена Ер-САМ. Такое комбинированное лечение может повышать клиническую эффективность Ер-САМ-конъюгированного цитотоксина, вводимого отдельно или в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами или с лучевой терапией. В конкретных неограничивающих вариантах изобретения агентом, повышающим уровень экспрессии Ер-САМ в опухолевых клетках, является тартрат винорелбина (Navelbine) и/или паклитаксincrease Ep-CAM expression through a novel mechanism". Cancer Immunol. Immunother. Jul; 52 (7):429-37. Таким образом, комбинированная терапия может повышать восприимчивость рака или опухоли к вводимому цитотоксину и/или к дополнительному противораковому терапевтическому средству. А поэтому могут быть проведены более короткие циклы лечения, что позволяет снижать токсическое воздействие. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества цитотоксина и по меньшей мере одного другого противоракового терапевтического средства для проведения короткого цикла лечения. Время проведения такого цикла может варьироваться в зависимости от конкретного использования противоракового терапевтического средства. В настоящем изобретении также рассматривается непрерывное или периодическое введение или ежедневное введение дробных доз. Продолжительность соответствующего цикла лечения рака конкретным терапевтическим средством может быть определена специалистом, и в настоящем изобретении предусматривается непрерывный мониторинг оптимальных схем лечения для каждого противоракового терапевтического средства. Существуют конкретные руководства, известные специалистам. См., например, Therasse et al., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada", J. Natl. Cancer. Inst. Feb 2; 92(3):205-16. Альтернативно, может оказаться желательным проведение более длительных циклов лечения. В соответствии с этим продолжительность такого цикла может варьироваться приблизительно от 10 до 56, от 12 до 48, от 14 до 28, от 16 до 24 или от 18 до 20 дней. Продолжительность цикла лечения может варьироваться в зависимости от конкретно используемого противоракового терапевтического средства. В настоящем изобретении рассматривается по меньшей мере один цикл, а предпочтительно более чем один цикл, в течение которого вводят одно противораковое терапевтическое средство или набор терапевтических средств. Подходящее общее число циклов и интервалы между циклами могут быть определены специалистом. Число циклов может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20 или 21 циклов. Интервалы между циклами могут составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дней. В настоящем изобретении предусматривается непрерывный мониторинг оптимальных схем лечения для каждого цитотоксина и для дополнительного противоракового терапевтического средства. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического препарата для лечения млекопитающего, страдающего раком, где указанный способ включает стадии идентификации Т-клеточных эпитопов буганина, обладающего пониженной способностью к активации Тклеток; получения цитотоксина согласно изобретению, имеющего один или несколько Т-клеточных эпито- 21010803 пов; и суспендирования белка в фармацевтически приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения млекопитающего, страдающего раком, где указанная композиция содержит цитотоксин согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Цитотоксины согласно изобретению могут быть получены в виде фармацевтических композиций для введения индивидууму в биологически совместимой форме, подходящей для введения in vivo. Термин "биологически совместимая форма, подходящая для введения in vivo" означает форму вводимого вещества, терапевтическое действие которого превышает любое его токсическое действие. Эти вещества могут быть введены in vivo в организм человека и животных. Терапевтически активное количество фармацевтических композиций согласно изобретению определяют как эффективное количество, вводимое в соответствующих дозах и в течение периода времени, необходимого для достижения желаемого результата. Так, например, терапевтически активное количество вещества может варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность антитела вырабатывать нужный ответ у индивидуума. Схема введения доз может быть скорректирована для достижения оптимального терапевтического ответа. Так, например, несколько дробных доз могут быть введены ежедневно, либо такая доза может быть пропорционально снижена, если этого требует состояние пациента, подвергаемого терапии. Активное вещество может быть введено подходящим способом, таким как инъекция (подкожная,внутривенная, внутримышечная и т.п.), пероральное введение, ингаляция, чрескожное введение (такое,как нанесение крема или мази и т.п.) или введение суппозиториев. В зависимости от способа введения активное вещество может быть покрыто материалом, защищающим соединение от воздействия ферментов, кислот и других природных условий, которые могут инактивировать такое соединение. Описанные здесь композиции могут быть получены способами, известными per se для приготовления фармацевтически приемлемых композиций, которые могут быть введены индивидуумам, и в которых эффективное количество активного вещества присутствует в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители описаны, например, в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA 1985). В соответствии с этим такие композиции включают, но не ограничиваются ими, растворы веществ в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и содержатся в забуференных растворах, имеющих подходящий pH и обладающих изоосмотическими свойствами, сообщаемыми физиологическими жидкостями. Фармацевтические композиции могут быть использованы в способах лечения животных, включая млекопитающих, а предпочтительно человека, страдающих раком. При этом предполагается, что указанные композиции могут быть, в частности, использованы для лечения пациентов, страдающих раком ободочной кишки, раком молочной железы, раком яичника, раком поджелудочной железы, раком головы и шеи, раком мочевого пузыря, раком желудочно-кишечного тракта, раком предстательной железы, мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легких, саркомой, глиомой, Т-клеточными и В-клеточными лимфомами. Доза и тип вводимого цитотоксина зависит от ряда факторов, которые могут быть легко установлены при обследовании человека. Такими факторами являются этиология и тяжесть (степень и стадия) опухолевого заболевания. Фармацевтическими композициями, адаптированными для прямого введения, являются, но не ограничиваются ими, лиофилизованные порошки или водные или безводные стерильные растворы или суспензии для инъекций, которые могут также содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворимые вещества, которые делают данные композиции, по существу, изотоничными с кровью данного реципиента. Другими компонентами, которые могут присутствовать в таких композициях, являются, например, вода, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Растворы и суспензии для непосредственного введения инъекций могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул или таблеток. Цитотоксин может быть введен различными способами, без каких-либо конкретных ограничений, например, в виде лиофилизованного порошка, который перед введением пациенту разводят в стерильной воде или в физиологическом растворе. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Подходящими фармацевтически приемлемыми носителями являются, по существу, химически инертные и нетоксичные композиции, которые не оказывают негативного влияния на биологическую активность фармацевтической композиции. Примерами подходящих фармацевтических носителей являются, но не ограничиваются ими, вода, физиологические растворы, растворы глицерина, этанол,хлорид N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), диолезилфосфотидилэтаноламин (DOPE) и липосомы. Такие композиции должны содержать терапевтически эффективное количество соединения вместе с подходящим количеством носителя, используемым в приготовлении лекарственной формы для непосредственного введения пациенту. В другом варианте изобретения фармацевтическая композиция содержит цитотоксин и один или несколько дополнительных противораковых терапевтически средств, необязательно, в фармацевтически приемлемом носителе.- 22010803 Данная композиция может быть получена в форме фармацевтически приемлемых солей, которыми являются, но не ограничиваются ими, соли, образованные свободными аминогруппами с кислотами, например с соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотами и т.п., и соли, образованные свободными карбоксильными группами с основаниями, например, с гидроксидами натрия, калия, аммония,кальция и железа (3), с изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.п. Поскольку настоящее изобретение относится к модифицированному буганину, то композиции, содержащие такие модифицированные белки буганины или фрагменты модифицированных белков буганинов, и родственные им композиции, также входят в объем настоящего изобретения. В этой связи подходящим примером может служить разработка стратегий индуцирования опосредуемой пептидом толерантности, где один или несколько описанных пептидов вводят пациенту в целях иммунотерапии. В соответствии с этим молекулы синтетических пептидов, например одна или несколько таких молекул, содержат все области R1-R3 эпитопа, определенные выше, или часть любой из этих областей. Такие пептиды рассматриваются как варианты настоящего изобретения. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам терапевтического лечения человека с использованием композиций модифицированных буганинов. Для введения индивидууму любая из модифицированных композиций должна иметь чистоту предпочтительно по меньшей мере 80% и не должна содержать пирогенов и других примесей. Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему эффективное количество цитотоксина, необязательно, в комбинации с одним или несколькими другими противораковыми терапевтическими средствами, и инструкции по его применению для лечения рака.(D) Пептиды Т-клеточных эпитопов. Другим вариантом настоящего изобретения является пептид Т-клеточного эпитопа. Одним из примеров может служить пептид Т-клеточного эпитопа, который в Т-клеточном анализе способен обеспечивать индекс стимуляции более чем 1,8, а более предпочтительно более чем 2,0. Пептид Т-клеточного эпитопа согласно изобретению способен связываться с МНС класса II. В одном из вариантов изобретения пептид Т-клеточного эпитопа содержит по меньшей мере 9 смежных аминокислотных остатков любой из последовательностей R1, R2 или R3 (см. выше). В другом варианте изобретения аминокислотная последовательность пептида Т-клеточного эпитопа более чем на 90% идентична любой одной из аминокислотных последовательностей пептида R1, R2 илиR3, а более предпочтительно аминокислотная последовательность пептида Т-клеточного эпитопа более чем на 80% идентична любой одной из аминокислотных последовательностей пептида R1, R2 или R3. Используемый здесь термин "пептид" означает соединение, которое включает две или более аминокислоты. Эти аминокислоты связаны между собой пептидной связью (как определено ниже). В природе существует 20 различных аминокислот, участвующих в биологическом продуцировании пептидов, и любые из них могут быть присоединены в любом порядке с образованием пептидной цепи или пептидного кольца. Все природные аминокислоты, участвующие в биологическом продуцировании пептидов, имеютL-конфигурацию. Синтетические пептиды могут быть получены стандартными способами синтеза с использованием L-аминокислот, D-аминокислот или различных комбинаций аминокислот в двух различных конфигурациях. Некоторые пептиды содержат всего несколько аминокислот. Короткие пептиды,например, пептиды, имеющие менее десяти аминокислот, иногда называются "олигопептидами". Другие пептиды содержат большое число аминокислотных остатков, например до 100 или более, и такие пептиды называются "полипептидами". Для удобства под термином "полипептид" может подразумеваться любая пептидная цепь, содержащая три или более аминокислот, а под термином "олигопептид" обычно подразумевается конкретный тип "короткого" полипептида. Таким образом, очевидно, что используемый здесь термин "полипептид" включает понятие "олигопептид". Кроме того, если упоминается термин"пептид", то под этим термином также подразумеваются полипептиды, олигопептиды и белки. При каждом различном расположении аминокислот образуются различные полипептиды или белки. Число полипептидов, а следовательно, и число различных белков, которые могут быть образованы, является практически неограниченным. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к использованию пептидов Тклеточного эпитопа согласно изобретению в целях получения модифицированных белков буганинов согласно изобретению и модифицированных пептидов Т-клеточного эпитопа. Другим вариантом согласно изобретению является модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа, который модифицирован так, что он обладает пониженной способностью к активации человеческих Т-клеток по сравнению с немодифицированным пептидом Т-клеточного эпитопа. Одним из примеров могут служить модифицированные пептиды Т-клеточного эпитопа согласно изобретению, содержащие модификации, которые, как было обнаружено при их тестировании в Т-клеточном анализе, дают более низкий индекс стимуляции, чем немодифицированный пептид Т-клеточного эпитопа. В одном из вариантов изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность: где по меньшей мере один из X1, X2, X3 и X4 является модифицированным, по сравнению с немодифицированной последовательностью, и гдеX4 представляет собой N, D, T, A, R, Q, E, G, Н, K или S (SEQ ID NO:8). В другом варианте изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность: где X4 представляет собой N, D, T, A, R, Q, E, G, Н, K или S (SEQ ID NO:9). В другом варианте изобретения модифицированный пептид Т-клеточного эпитопа имеет следующую последовательность: где X5 представляет собой Q или A (SEQ ID NO:10). Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим пептиды Т-клеточных эпитопов или модифицированные пептиды Т-клеточных эпитопов согласно изобретению. Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводится графический материал, список последовательностей и примеры. При этом следует отметить, что в описанные здесь процедуры могут быть внесены модификации, не выходящие за пределы существа изобретения. Нижеследующие неограничивающие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Способ картирования эпитопов в буганине с помощью анализов на пролиферацию "необученных" человеческих Т-клеток. Пептиды, охватывающие последовательность зрелого белка буганина, были синтезированы как описано Den Hartog et al. [ibid]. Каждый пептид имеет длину в 15 аминокислот, и следующие друг за другом пептиды перекрываются в 12 остатках. Последовательность этих пептидов и их нумерация указаны в табл. 1. Эти пептиды были использованы в анализах на пролиферацию Т-клеток, проводимых с применением МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови), взятых от "неиммунизованных" доноров(т.е. от доноров, которые, как известно, не подвергались сенсибилизации буганином). Для забора МКПК и получения оптимального набора аллотипов МНС класса II было отобрано 20 доноров. Набор аллотипов был взят в 85% избытке. Аллотипы HLA-DR указаны в табл. 2. МКПК стимулировали отдельными пептидами в культурах с тремя повторностями в течение 7 дней, после чего оценивали пролиферацию путем включения 3 Н-тимидина (3 Н-Thy). Все пептиды тестировали в двух различных концентрациях (1 и 5 мкМ). Индексы стимуляции (SI) вычисляли как количество 3 Н, включенного в клетки, деленное на количество 3 Н, включенного в контроль, стимулированный миметиком. Лейкоцитарную пленку человеческой крови, хранящуюся менее 12 ч, закупали у фирмы NationalBiotech (Amersham, UK). Бессывороточную среду AIM V для культивирования первичных человеческих лимфоцитов, содержащую L-глутамин, 50 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентомицина и 0,1% альбумин человеческой сыворотки, закупали у фирмы Gibco-BRL (Paisley, UK). Синтетические пептиды закупали у фирмы Eurosequence (Groningen, The Netherlands) и Babraham Technix (Cambridge, UK). Эритроциты и лейкоциты были выделены из плазмы и тромбоцитов путем мягкого центрифугирования лейкоцитарной пленки. Верхнюю фазу (содержащую плазму и тромбоциты) снимали и отбрасывали. Эритроциты и лейкоциты разводили 1:1 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS),а затем наносили слоями на 15 мл реагента фиколл-пак (Amersham Pharmacia, Amersham UK). Центрифугирование проводили в условиях, рекомендованных производителями, и МКПК собирали из сыворотки + области границы раздела PBS/фиколл-пак. МКПК смешивали с PBS (1:1) и собирали путем центрифугирования. Супернатант удаляли и отбрасывали, и осадок МКПК ресуспендировали в 50 мл PBS. Клетки снова осаждали путем центрифугирования и супернатант PBS отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали с использованием 50 мл среды AIM V, после чего клетки подсчитывали и их жизнеспособность анализировали путем исключения красителем трипановым синим. Затем клетки снова собирали путем центрифугирования и супернатант отбрасывали. Клетки ресуспендировали для их хранения в криогенных условиях при плотности 3107/мл. Среда для хранения представляет собой 90%-ную (об./об.) термоинактивированную человеческую сыворотку АВ (Sigma, Poole, UK) и 10% (об./об.) ДМСО (Sigma, Poole, UK). Клетки переносили в контейнер с регулируемым замораживанием (Sigma) и оставляли на ночь при температуре -70 С. Перед их использованием клетки быстро оттаивали в водяной бане при 37 С, а затем переносили в 10 мл предварительно нагретой среды AIM V.- 24010803 МКПК стимулировали белковыми и пептидными антигенами в 96-луночном плоскодонном планшете при плотности 210 МКПК на лунку. МКПК инкубировали в течение 7 дней при 37 С, а затем вводили 3H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK). В анализах для каждого донора использовали два контрольных пептида, обозначаемых С-32 и С-49, которые, как было предварительно показано, являются иммуногенными, и активный полноразмерный белок, а именно "не воскресший" антиген гемоцианин лимфы улитки (KLH). С-32 = последовательность PKYVKQNTLKLAT гемаглютинина вируса гриппа,остатки 307-319 (SEQ ID NO:127). С-49 последовательность KVVDQIKKISKPVQH от HSP 60 Chlamydia(SEQ ID NO:128). Пептиды растворяли в ДМСО до конечной концентрации 10 мМ, а затем эти маточные растворы разводили 1/500 в среде AIM V (конечная концентрация 20 мкМ). Пептиды добавляли в плоскодонный 96-луночный планшет до конечной концентрации 1 и 5 мкМ в 100 мкл. Жизнеспособность оттаянных МКПК оценивали путем исключения красителем трипановым синим, а затем клетки ресуспендировали при плотности 2106 клеток/мл, и 100 мкл (2105 МКПК/лунку) переносили в каждую лунку, содержащую пептиды. Культуры в лунках с тремя повторностями анализировали при каждой концентрации пептида. Планшеты инкубировали в течение 7 дней в атмосфере повышенной влажности при 5% CO2 и при 37 С. Клетки подвергали импульсному мечению 1 мкКи 3 Н-Thy/лунку в течение 18-21 ч, а затем собирали на фильтровальных слоях. Величины им/мин определяли с использованием бета-счетчика для верхней части микропланшета Wallac (Perkin-Elmer). Результаты выражали как индексы стимуляции, определенные путем деления величины уровня пролиферации (например, число импульсов радиоактивности в минуту), измеренной для тестируемого пептида, на соответствующую величину, измеренную в клетках, не контактировавших с указанным тестируемым пептидом. Интерпретация результатов вышеописанного анализа указывает на присутствие четырех Тклеточных эпитопов, соответствующих пептидам 41, 44 и 50, в зрелой процессированной области белка,и пептиду 88 в непроцессированной форме. Поскольку эпитоп в пептиде 88 не является частью зрелого белка, то он был исключен из схемы настоящего изобретения. Для пептида 41 (обозначаемого областью R1 эпитопа) имелись четыре донора, восприимчивых к этому пептиду, т.е. доноры 4, 5, 10 и 11. Индексы стимуляции (S.I.) для этих пептидов при 5 мкМ составляли 3,6; 4,9; 2,1 и 2,0, соответственно. Для пептида 44 (обозначаемого областью R2 эпитопа) имелись два донора, восприимчивых к этому пептиду: доноры 4 (S.I.=3,5) и 11 (S.I.=2,3). Соседние пептиды 43 и 45 индуцировали более низкий уровень пролиферации Т-клеток, поскольку оба этих пептида перекрывались с пептидом 44 в 12 аминокислот. Для пептида 50 имелись 2 донора, восприимчивых к этому пептиду: доноры 4 (S.I.=2,9) и 14(S.I.=2,0). Пептид 51 индуцировал более низкий уровень пролиферации Т-клеток у донора 14 (S.I.1,9). Типы тканей для всех образцов МКПК анализировали с использованием коммерчески доступной системы реагентов (Dynal, Wirral, UK). Анализы проводили в соответствии с протоколами, рекомендованными поставщиками, с использованием стандартных вспомогательных реагентов и систем электрофореза в агарозном геле. Аллотипическая специфичность каждого из образцов, взятых от восприимчивых доноров, приводится в табл. 2. Пример 2. Клонирование буганина, выделенного из Bougainvillea spectabilis. Полноразмерную РНК выделяли из листьев Bougainvillea spectabilis с использованием системы выделения полноразмерной РНК 'SV и протокола, прилагаемого поставщиком (Promega Southampton, UK). Ткань свежих листьев измельчали в тонкодисперсный порошок в жидком азоте, и приблизительно 50 мг измельченной ткани использовали для выделения РНК. Качество и количество РНК оценивали путем визуализации на 1% агарозном геле, и ген буганина амплифицировали из полноразмерной РНК с помощью ОТ-ПЦР-системы "Access RT-PCR System" (Promega) с использованием приблизительно 1 мкг РНК на реакционную смесь и геноспецифических праймеров OL1032 и OL1033. Последовательности праймеров приводятся ниже в табл. 3. Эта реакция генерировала 1242 п.н.-фрагмент, включающий нативную лидерную последовательность и полноразмерную последовательность буганина. Этот фрагмент клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору, и обозначали pBoul. Последовательность подтверждали путем секвенирования ДНК. Ген буганина переносили в рЕТ 21 а (Novagen, Nottingham, UK) путем ПЦР-клонирования с использованием плазмиды pBoul в качестве матрицы. Лидерную последовательность pelB (пектат-лиазы) присоединяли в 5'-концу, а последовательность, кодирующую 6 гистидиновую метку, присоединяли к 3'концу буганин-кодирующей последовательности. Лидерную последовательность pelB амплифицировали из вектора pPMI-his [Molloy P. et al. (1995) J. Applied Bacteriology, 78:359-365] с использованием праймера OL1322 (вводящего Nde1-сайт) и праймера OL1067. Фрагмент буганин-his амплифицировали из pBoul с использованием праймеров OL1068 и OL1323 (вводящих NotI-сайт). Лидерную последовательностьpelB присоединяли в той же рамке считывания к фрагменту буганин-His посредством ПЦР с перекрыванием, и полученный фрагмент клонировали в вектор pGEM-Т Easy (Promega). После подтверждения последовательности фрагмент pelB-буганин-his клонировали в виде NdeI-NotI-фрагмента в NdeI-NotI- 25010803 гидролизованный вектор рЕТ 21 а. Этот клон обозначали pBou32. Пример 3. Конструирование мутантных белков буганинов. Ряд модифицированных (мутантных) белков буганинов был сконструирован с использованием данных, полученных путем картирования Т-клеточных эпитопов и с использованием компьютерной программы, позволяющей имитировать связывание пептидов со связывающим участком человеческой молекулы МНС класса II. Последний способ подробно описан в литературе [WO 02/069232]. Были сконструированы варианты генов, и мутантные белки были протестированы на функциональную активность. В общих чертах, сначала были сконструированы и протестированы белки с "одиночной мутацией", каждый из которых содержал одну аминокислотную замену, а затем гены, кодирующие активные модифицированные белки, объединяли с получением модифицированных белков с множеством замен. Мутантные гены конструировали посредством ПЦР с перекрыванием, где кодон, кодирующий мутантную аминокислоту, был встроен в ген с использованием мутанта в "перекрывающемся праймере". Эта процедура хорошо известна специалистам и подробно описана в литературе [Higuchi et al. (1900)Nucl. Acids. Res. 16:7351]. Всего было сконструировано 37 модифицированных белков с одиночной мутацией, и эти белки были протестированы на остаточную функциональную активность. Кроме того, был также сконструирован модифицированный белок негативного контроля, содержащий замену Y70A, и этот белок был протестирован во всех анализах. Один из этих 37 модифицированных белков с "одиночной мутацией" в действительности содержал две непосредственно смежные замены (Е 151 Т и I152E), но рассматривался здесь как "одиночный" мутант. Протестированные замены и соответствующие величины активности представлены в табл. 4. Всего было сконструировано 11 модифицированных белков с множеством замен, и эти белки были протестированы на остаточную активность. Протестированные замены и соответствующие величины активности представлены в табл. 5. В табл. 6 представлены последовательности модифицированных белков с заменами. В табл. 7 указаны некоторые специфические последовательности. Во всех случаях белки были очищены и проанализированы в соответствии с процедурами, описанными ниже в примерах 4 и 5. Пример 4. Экспрессия и очистка белка буганина. Плазмиду pBou32 трансформировали в BL21(DE3)-компетентные клетки (Novagen) в соответствии с инструкциями производителя и отбирали на LB-планшетах (Invitrogen, Paisley, UK), содержащих 50 мкг/мл карбенициллина. Свежую колонию, полученную после этой трансформации, использовали для инокуляции 5 мл 2YT-бульона (Invitrogen), не содержащего антибиотиков, и эту культуру выращивали со встряхиванием при 250 об/мин при 37 С до достижения OD600=1,5-2,0. Затем культуру центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, и клетки ресуспендировали в 5 мл свежего 2YT+1 мМ IPTG. Эту культуру инкубировали при 30 С со встряхиванием при 300 об/мин в течение 1,5 ч, и клетки собирали центрифугированием, а супернатант удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл РЕВ 2 (50 мМ Трис-HCl, pH 8, 20% сахароза, 1 мг/мл лизоцима, 1 таблетка всех ингибиторов протеазы (Roche, Lewes, UK), и инкубировали на льду в течение 1 ч при легком перемешивании. Клеточный дебрис центрифугировали при 14000 об/мин при 4 С, и осадок отбрасывали. Полученный супернатант называли здесь "периплазматической фракцией". Белок буганин выделяли из указанной периплазматической фракции с помощью аффинной колоночной хроматографии на никеле, проводимой на коммерчески доступной "центрифужной колонке" в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen, Crawley, UK). Полученный материал диализовали против 4 л забуференного фосфатом физиологического раствора (0,138 М NaCl, 0,0027M KCl, pH 7,4) в течение ночи при 4 С с отсечкой молекулярной массы 10000 на устройстве "Slide-A-Lyzer" (Priece, Chester, UK). После диализа оценивали концентрацию белка с использованием набора для анализа Micro BCA (Pierce), и образцы хранили при -20 С. Затем концентрацию белка буганина определяли с использованием системы ELISA-анализа. Вкратце, антисыворотку против буганина (Genovac, Freiburg, Germany) получали путем генетической иммунизации двух крыс плазмидой, экспрессирующей буганин. Для ELISA рекомбинантный буганин иммобилизовывали на планшетах, покрытых Ni-агарозой, посредством его His-метки, а затем детектировали с использованием крысиной антисыворотки и "второго" ПХ-конъюгированного антитела против крысиного Fc (Sigma, Poole, UK). Для каждого определения в качестве стандарта использовали большой препарат буганина дикого типа, экспрессированного в E.coli, и количественно оцененного с помощью анализа на общий белок. Пример 5. Анализ на активность буганина. Активность белков буганина дикого типа и модифицированных (мутантных) белков тестировали путем определения их способности ингибировать синтез белка в бесклеточном анализе синтеза белка. Смесь, содержащую 10 мкл TNT вместе со смесью для транскрипции/трансляции (Promega),20 мкМ метионина, 120 нг ДНК люциферазы рТ 7 (Promega) и серийные разведения белка дикого типа(WT) и мутантного белка буганина в конечном объеме 12,5 мкл, инкубировали при 30 С в течение 1 ч, а- 26010803 затем реакцию прекращали добавлением 100 мкл реагента для анализа на люциферазу "SteadyGlow"(Promega). Люциферазную активность измеряли с использованием люминесцентного счетчика Wallac. Активный белок буганин детектировали по снижению измеренной люциферазной активности. Каждый модифицированный белок буганин тестировали по меньшей мере в 5 концентрациях, и каждое частное значение получали в дубликате. В каждый эксперимент был включен позитивный и негативный контроль. Результаты для белков с одиночной мутацией представлены в табл. 4. Результаты для модифицированных белков буганинов с множественными мутациями представлены в табл. 5. В каждом случае результаты представлены как величины по отношению к активности белка дикого типа. Все анализы проводили с включением неактивного мутантного белка буганина с заменой Y70A. Кроме того, исходя из результатов люциферазного анализа, может быть построен график зависимости % люциферазной активности по отношению к контролю от концентрации добавленного белка буганина. Примеры таких графиков представлены на фиг. 1, где приводятся результаты, полученные для двух различных белков буганинов с множественными мутациями. Пример 6. Анализ последовательностей вариантов буганина на потерю Т-клеточных эпитопов. Модифицированный белок с множественными мутациями, обозначенный Bou156, отбирали для проведения дополнительного тестирования с помощью анализа на иммуногенность. Этот вариант содержал замены V123A, D127A, Y133N и I152A. Тест на иммуногенность предусматривает использование"живых" клеток, которые могут быть повреждены при тестировании с применением целого белка буганина, а поэтому эти анализы проводили с использованием синтетических пептидов, содержащих замены,введенные в вариант Bou156. Протестированные пептиды приводятся в табл. 8. Эти анализы проводили в соответствии с процедурами, описанными в примере 1 (см. выше), с использованием пула МКПК, взятого у 20 индивидуумов-доноров. Пептиды тестировали с тремя повторностями для каждого образца, взятого у донора, при двух различных конечных концентрациях пептидов (1 и 5 мкМ). Результаты выражали как величину SI/пептид на образец, взятый у донора, и эти результаты приводятся на фиг. 2. Del-41 представляет собой пептидную последовательность AKADRKALELGVNKL (SEQID NO:29). Del-44 представляет собой пептидную последовательность LGVNKLEFSIEAIHG (SEQ IDNO:30). Del-50 представляет собой пептидную последовательность NGQEAAKFFLIVIQM (SEQ IDNO:31). Ни один из модифицированных пептидов не индуцировал Т-клеточный ответ у любого из доноров (S.I.2). В отличие от этого, иммуногенный контрольный пептид стимулировал Т-клетки у 6 доноров(S.I.2). Пример 7. VB6-845: рекомбинантное конструирование Ер-САМ-специфического антитела Fab для оптимальной доставки буганина, лишенного иммуногенных свойств (де-буганина). В этом примере и в примере 8 используемым лишенным иммуногенных свойств буганином является Bou156. Нацеленные на опухоль цитотоксины состоят из вариабельной области антитела, присоединенного к бактериальному, грибковому или растительному токсину. В настоящем исследовании было показано,что конструкции лишенного иммуногенных свойств буганина согласно изобретению, содержащие указанный неиммоногенный буганин, присоединенный к нацеливающей молекуле, обладают пониженной иммуногенностью, но при этом сохраняют биологическую активность. В табл. 12 продемонстрировано связывание антитела против Ер-САМ с опухолями нескольких типов, и, таким образом, было показано,что оно может быть использовано для лечения рака таких типов. Конструкция лишенного иммуногенных свойств буганина: направленная на Ер-САМ нацеливающая молекула, присоединенная к де-буганину.VB5-845, Fab-вариант scFv-антитела против Ер-САМ был генетически присоединен к неиммуногенной форме буганина (де-буганина) Bou156, т.е. к активному инактивирующему рибосому (RIP) растительному белку типа I, для создания конструкции "антитело-токсин" VB6-845. На фиг. 3 проиллюстрирована конструкции VB6-845. На фиг. 3 А проиллюстрирована бицистронная единица про-VB6-845 с лидерными последовательностями pelB. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:16) и кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:15) представлены на фиг. 3 В. На фиг. 3 С проиллюстрирован сконструированный белок VB6-845, более подробно описанный ниже. Тестирование этой конструкции показало, что данная конструкция сохраняет свою биологическую активность (цитотоксичность) и специфичность нацеливающей молекулы (антитела против Ер-САМ). Ориентация конструкции, содержащей лишенный иммуногенных свойств буганин. Для определения оптимальной ориентации конструкции "антитело-де-буганин", были созданы, экспрессированы и протестированы на активность несколько форм бицистронных экспрессионных единиц. В каждом случае бицистронную единицу клонировали в вектор pING3302 (фиг. 4) под контролем индуцируемого арабинозой промотора araBAD и трансформировали в Е 104 E.coli. После индуцирования присутствующая лидерная последовательность pelB направляет секрецию гибридного белка "Fab - дебуганин" в супернатант культуры. Расщепление линкера приводит к отщеплению де-буганина от нацеливающей молекулы и сообщает ему биологическую активность. В одном из вариантов изобретения указанным линкером является фуриновый линкер, хотя для специалиста в данной области очевидно, что- 27010803 могут быть использованы и другие расщепляемые линкеры. Предпочтительные линкеры могут быть выбраны исходя из специфичности мишени и ее окружения. Образец конструкций получали и тестировали,как описано ниже. На фиг. 3 проиллюстрирован VB6-845, где де-буганин (Bou156) присоединен к С-концу домена СН посредством фуринового линкера. На фиг. 3 А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 3 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:15) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:16) пропоследовательностей, а на фиг. 3 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845, не содержащий последовательностейpelB. На фиг. 5 проиллюстрирована контрольная конструкция Fab-фрагмента антитела против Ер-САМ,не содержащая растительного токсина, де-буганина (VB5-845). На фиг. 5 А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 5 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:17) и аминокислотная последовательность (SEQ IDNO:18) пропоследовательностей, а на фиг. 5 С проиллюстрирован собранный белок VB6-845, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 6 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-CL-де-буганин, где Bou156 присоединен к С-концу домена CL. На фиг. 6 А проиллюстрирована бицистронная единица пропоследовательностей, на фиг. 6 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:19) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:20) пропоследовательностей, а на фиг. 6 С проиллюстрирован собранный белок VB6845-CL-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 7 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-NVH-де-буганин, где Bou156 присоединен к N-концу домена VH. На фиг. 7 А проиллюстрированы бицистронные единицы пропоследовательностей, на фиг. 7 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:21) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:22) пропоследовательностей, а на фиг. 7 С проиллюстрирован собранный белок VB6845-NVH-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB. На фиг. 8 проиллюстрирована конструкция, содержащая Fab-фрагмент антитела против Ер-САМ и де-буганин, VB6-845-NVL-де-буганин, где Bou156 присоединен к N-концу домена VL. На фиг. 8 А проиллюстрирована бицистронная единица, кодирующая пропоследовательности, на фиг. 8 В проиллюстрирована кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:23) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:24) пропоследовательностей, а на фиг. 8 С проиллюстрирован собранный белокVB6-845-NVL-де-буганин, не содержащий последовательностей pelB. В одном из вариантов изобретения молекула де-буганина присоединена к С-концу тяжелой или легкой цепи. Оптимальная конфигурация состоит из лидерной последовательности pelB, смежной с доменом VH-CH с N-концевой гистидиновой аффинной меткой в качестве первого звена. Непосредственно за этим звеном расположено второе звено, содержащее домен pelB-VL-CL, присоединенный к дебуганину посредством чувствительного к протеазе линкера (фиг. 6). Вестерн-блот-анализ, проведенный для конструкций, в которых де-буганин был снова расположен у N-конца, не выявил детектируемого продукта, и только С-концевой де-буганин (конструкции на фиг. 3 и 6) давал интактный растворимый белок (фиг. 9), который обладал хорошей способностью связываться с Ер-САМ-позитивными клеточными линиями, как было проиллюстрировано в тестах на реактивность, детектированную с помощью проточной цитометрии. Вестерн-блот-анализ, проиллюстрированный на фиг. 9, указывал на экспрессиюVB6-845 и VB6-845-CL-де-буганина в супернатанте индуцированных клеток Е 104 в лабораторном масштабе. Аликвоту супернатанта, 16 мкл, в невосстанавливающих условиях загружали на ДСНакриламидный гель и анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием либо кроличьего поликлонального антитела против 4D5, а затем козьего антикроличьего антитела (1/2000), либо козьего ПХ-конъюгированного антитела против каппа-цепи человеческого иммуноглобулина (1/1000), для подтверждения идентичности и размера рекомбинантного белка. Стрелки указывают на полноразмерныйVB6-845 (конструкция на фиг. 3) и VB6-845-CL-де-буганин (конструкция на фиг. 6). Вестерн-блотанализ супернатанта неиндуцированной культуры Е 104 не выявил соответствующих полос, что указывает на специфичность антител (данные не приводятся). Результаты тестов на реактивность VB6-845 (фиг. 3) и VB6-845-CL-де-буганин (фиг. 6) в Ер-САМпозитивных клеточных линиях CAL 27 и NIH:OVCAR-3 по сравнению с контролем (Ер-САМ-негативной клеточной линией А-375) проиллюстрированы на фиг. 10 А. Эти результаты были сравнимы с результатами такого же теста на реактивность, но проводимого с другой анти-Ер-САМ конструкцией, VB6-845 гелонином, где де-буганин был заменен другим растительным токсином гелонином (см. фиг. 14 С, где представлены его аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:26) и последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:25. Результаты теста на реактивность с использованием гелониновой конструкции приводятся на фиг. 10 В. Присоединение второго домена де-буганина к указанной молекуле в оптимальной ориентации не приводило к продуцированию продукта. Тесты с помощью проточной цитометрии проводили путем инкубирования конструкций или кон- 28010803 троля с 0,45106 клеток на льду в течение 1 ч. После промывки конструкции, связанные с клеточной поверхностью, детектировали с использованием кроличьего антитела против буганина (фиг. 10 А) или мышиного антитела против His-метки (фиг. 10 В) в течение 1 ч на льду. Клетки промывали и инкубировали с ФИТЦ-конъюгированным овечьим антителом против кроличьих IgG (фиг. 10A) и ФИТЦконъюгированным овечьим антителом против мышиных IgG (фиг. 10 В) в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали, ресуспендировали в PBS, 5% FCS, содержащем иодид пропидия, для оценки связывания антитела с помощью проточной цитометрии. После инкубирования VB6-845 и VB6-845-CL-дебуганина с А-375 не было детектировано какого-либо изменения средней интенсивности флуоресценции. В противоположность этому, заметное изменение средней интенсивности флуоресценции наблюдалось для Ер-САМ-позитивных клеточных линий, CAL 27 и NIH:OVCAR-3 (фиг. 10A). Как указывалось выше,результаты, полученные для VB6-845, были аналогичны результатам для гелониновой конструкции (фиг. 10 В). Специфичность к Ер-САМ. Конкурентный анализ, проводимый с использованием VB6-845 (конструкция на фиг. 3) иProxinium, scFv-формата VB6-845, содержащего эндотоксин A Pseudomonas, продемонстрировал, что при конструировании Fab-формата специфичность VB6-845 к Ер-САМ не изменялась (фиг. 11). На фиг. 11 представлены результаты конкурентного анализа, проводимого с помощью проточной цитометрии, где VB6-845 при концентрации 1 и 10 мкг/мл и Proxinium в повышенной концентрации, в пределах от 0 до 100 мкг/мл, инкубировали с клетками NIH:OVCAR-3 (Ер-САМ-позитивной опухолевой клеточной линией). После инкубирования в течение 1 ч при 4 С клетки промывали, и связанный VB6845 детектировали с использованием биотинилированного кроличьего антитела против буганина, а затем с использованием стрептавидина-цитохрома. Аналогичный эксперимент проводили для 4 В 5-РЕ, который был использован в качестве негативного контроля. Условия реакции указаны на фиг. 11. Эффективность (биологическая активность). Кроме того, бесклеточный анализ (фиг. 12) и MTS-анализ на цитотоксичность (фиг. 13 А и В) продемонстрировали, что де-буганин сохранял свою активность при конъюгировании с Fab-фрагментом.MTS-анализ проводили для измерения активности известным стандартным способом, и этот анализ более подробно описан ниже в примере 8. При использовании Ер-САМ-позитивных клеточных линий, CAL 27 и NIH:OVCAR-3, IC50 для VB6-845 составляла 3-4 нМ и 2-3 нМ, соответственно. В случае VB6-845CL-де-буганина, измеренная активность для CAL 27 составляла 1-2 нМ, а для NIH:OVCAR-3 она составляла 0,6-0,7 нМ. Разработка Fab-конструкции против Ер-САМ, содержащей фрагмент антитела, для доставки в человеческую опухоль, присоединенный к лишенному иммуногенных свойств буганину, позволяет проводить повторное системное введение этого лекарственного средства и, тем самым, повышает его клиническую эффективность. Получение конструкций. Конструкции могут быть выделены из клеточных культур известными способами. Так, например,если His-метка присутствует у N-конца пептидной конструкции, то белок Fab-буганин может быть очищен способом иммобилизации на хелатообразующем Ni2+. В качестве примера может быть использован описанный ниже протокол. Ферментацию вариантов VB6-845 с подпиткой проводили в 15-литровом ферментере СНЕМАР с использованием среды ТВ. При OD600=20 (в средней логарифмической фазе роста), культуру индуцировали смесью питательного вещества и индуктора, содержащего 50% глицерин и 200 г/л L-арабинозы. Через 30 ч после индуцирования культуру собирали, центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин, и варианты VB6-845 очищали с использованием СМ-сефарозы и на колонках с сефарозой, образующей хелатный комплекс с металлом, а затем на эксклюзионной колонке. Вкратце, супернатант концентрировали и подвергали диафильтрации против 200 мМ фосфата натрия, pH 6,90,1. Затем подвергнутый диафильтрации концентрированный супернатант наносили на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия, 25 мМ NaCl, pH 6,90,1. Колонку промывали 20 мМ фосфатом натрия, 25 мМ NaCl, pH 6,90,1, а затем связанный VB6-845 элюировали 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМNaCl, pH 7,50,1. Элюат СМ-сефарозы доводили до конечной концентрации 0,25% Тритона Х-100 и наносили на колонку с сефарозой, образующей хелатный комплекс. Затем колонку с сефарозой, образующей хелатный комплекс, промывали 3 различными промывочными буферами, сначала 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ NaCl, 0,25% тритоном Х-100, pH 7,50,1, а затем 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ NaCl,pH 7,50,1, и, наконец, 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ NaCl и 10 мМ имидазолом, pH 7,50,1. Затем связанный VB6-845 элюировали 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ NaCl, 250 мМ имидазолом, pH 7,50,1,и собирали в 2 мл-фракции. Оптическую плотность при А 280 определяли для каждой фракции, и фракции,содержащие объединенный материал, подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200 до достижения чистоты фракций 80%. В одном из вариантов изобретения для повышения чистоты белка и для удаления эндотоксина объединенную фракцию SEC 5-кратно разводили 20 мМ NaPO4, pH 7,5, и пропускали через 15-миллилитровую колонку Fast Flow с Q-сефарозой, уравновешенную 20 мМ NaPO4,25 мМ NaCl, pH 7,5, при скорости потока примерно 5 мл/мин. После нанесения образца на колонку эту- 29010803 колонку промывали 10 колоночными объемами уравновешивающего буфера и промывку объединяли с исходной промывкой, полученной с проточной колонки с Q-сефарозой. Выходящий поток концентрировали примерно до 10 с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 30 кДа(мембраны Sartorius Hydrosart) до достижения конечной концентрации 7,5 мг/мл. Затем добавляли твин 80 до конечной концентрации 0,1%. Конечный продукт подвергали стерильной фильтрации и хранили при -80 С. После иммуноблоттинга с использованием анти-4D5 антитела образцы в каждой стадии данной процедуры анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа. Чистоту подтверждали путем окрашивания коллоидным синим. Уровень экспрессии вариантов VB6-845 определяли с помощью Вестерн-блотанализа и ELISA. Пример 8. Функциональная и биологическая характеризация VB6-845, т.е. рекомбинантного ЕрСАМ-специфического Fab-антитела, генетически присоединенного к лишенному иммуногенных свойств буганину (де-буганину). Химиотерапевтическими средствами являются в высокой степени цитотоксические агенты, которые представляют собой стандартные лекарственные средства, часто применяемые для лечения многих солидных раковых опухолей. Цитотоксическое действие этих лекарственных средств заключается в индуцировании быстрого деления клеток как нормальных, так и опухолевых, и приводит к развитию ряда негативных побочных клинических эффектов. VB6-845 представляет собой Fab-фрагмент антитела, связанный с неиммуногенной формой растительного токсина буганина. В отличие от химиотерапевтических средств, которые не обладают специфичностью к определенным опухолям, действие VB6-845 ограничено цитолитическим действием лишь на Ер-САМ-позитивные опухоли-мишени. В этом исследовании для оценки активности и селективности VB6-845 проводили проточный цитометрический анализ и анализ на цитотоксичность. Проточная цитометрия. Опухолевые клеточные линии, применяемые в данном исследовании, закупали в АТСС и размножали в соответствии с рекомендациями АТСС, за исключением клеточных линий С-41, TOV-112D, которые культивировали в RPMI 1640 или в DMEM с добавлением 10% FCS, соответственно. Опухолевые клетки собирали при конфлюентности 60-70% с жизнеспособностью выше 90%. Эпителиальные клетки здоровой молочной железы человека (НМЕС) закупали у CAMBREX и поддерживали в специальной среде в соответствии с процедурой, рекомендованной CAMBREX. Клетки собирали при конфлюентности 70% с жизнеспособностью выше 90%. Клеточные линии, взятые у женщин с симптомами рака эндометрия, яичника и шейки матки, тестировали на связывание с VB6-845 с помощью проточной цитометрии (табл. 9). 10 мкг/мл VB6-845 добавляли к каждой клеточной линии (3105 клеток) и инкубировали в течение 2 ч при 4 С. А-375 и CAL 27 использовали в качестве клеточных линий негативного и позитивного контроля, соответственно. После отмывки несвязанного материала добавляли мышиное моноклональное антигистидиновое антитело(Ameraham Pharmacia, Cat27471001), разведенное 1/800 в PBS, содержащем 10% FCS, и инкубировали еще 1 ч при 4 С. Затем добавляли ФИТЦ-меченное антитело против мышиных IgG (The Binding Site,Cat AF271), разведенное 1/100 в PBS-10% FCS, и инкубировали в течение 30 мин при 4 С. И, наконец,после окрашивания иодидом пропидия для идентификации погибших клеток клетки анализировали на устройстве FACS Calibur. Цитотоксичность. Уровень ингибирования VB6-845 в клетках, используемых в исследовании с помощью проточной цитометрии, указанный в табл. 10, показал, что эта конструкция сохраняла цитотоксическую активность де-буганина против Ер-САМ-позитивных клеточных линий. Такая цитотоксичность была сравнима с цитотоксичностью другого Fab-варианта VB6-845, содержащего другой растительный токсин, а именно гелонин (фиг. 14). На фиг. 14 А проиллюстрировано сравнение цитотоксичности гелонина, конструкции- де-буганин" (Bou156) (VB6-845) в клетках CAL 27 (фиг. 14 А) и NIH:OVCAR-3 (фиг. 14 В). Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность конструкции VB6-845-гелонин представлены на фиг. 14 С. Для исследования специфичности и селективности VB6-845 (конструкция на фиг. 3), цитотоксическую активность VB6-845 (90% чистоты) тестировали против Ер-САМ-позитивной (NIH:OVCAR-3) и Ер-САМ-негативной клеточных линий (НМЕС, DAUDI, А-375) (табл. 11) наряду с 17 химиотерапевтическими лекарственными средствами (LKB Laboratories Inc.).MTS-анализ осуществляли стандартными способами, известными специалистам. Более конкретно,50 мкл клеток (2104 клеток/мл) высевали на лунки и планшеты и инкубировали при 37 С в 5% CO2 в течение 2 ч. Затем в культуральную среду с возрастающими концентрациями путем впрыска добавляли 50 мкл лекарственного средства (т.е. тестируемой конструкции или контроля). В качестве позитивного и негативного контроля использовали культуральную среду, содержащую или не содержащую клетки, соответственно. Планшеты оставляли на 5 дней при 37 С в атмосфере 5% CO2. На 5-й день ингибирование пролиферации клеток оценивали добавлением 20 мкл реагента MTS (Promega, Cat G5430). Затем план- 30