Гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения и их применение
Номер патента: 3739
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Уилльямс Кевин П., Гэрбер Эллен Э., Пепински Р.Блэйк, Тэйлор Фредерик Р., Портер Джеффри, Гэлдес Элфонс, Бейкер Даррен П., Вен Дингайи
Формула / Реферат
1. Изолированный белок, включающий в себя N-концевую аминокислоту и C-концевую аминокислоту, который выбран из
(a) белка с N-концевым цистеином, соединенным, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей;
(b) белка с N-концевой аминокислотой, отличной от цистеина, соединенного, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; и
(c) белка, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей, заменяющей N-концевую аминокислоту; при условии, что в изолированном белке, если он представлен природным фрагментом хеджхог-полипептида, гидрофобная структурная единица не является пальмитоильной группой на N-конце полипептида, и
где белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
2. Белок по п.1, где гидрофобная структурная единица представляет собой пептид, содержащий, по меньшей мере, одну гидрофобную аминокислоту.
3. Белок по п.1, где гидрофобная структурная единица представляет собой липид.
4. Белок по п.1, который дополнительно содержит гидрофобную структурную единицу, заменяющую C-концевую аминокислоту или присоединенную к C-концевой аминокислоте.
5. Белок по п.1, который является белком, передающим внеклеточный сигнал.
6. Белок по п.1, где N-концевая аминокислота является функциональным производным цистеина.
7. Белок по п.1, модифицированный как по N-концевой аминокислоте, так и по C-концевой аминокислоте.
8. Белок по п.4 или 7, имеющий гидрофобную структурную единицу, присоединенную, по меньшей мере, к одной аминокислоте, промежуточной между N-концевой и C-концевой аминокислотами, или заменяющую ее.
9. Белок по п.1, имеющий гидрофобную структурную единицу, присоединенную, по меньшей мере, к одной аминокислоте, промежуточной между N-концевой и C-концевой аминокислотами, или заменяющую ее.
10. Белок по п.3, где липидная структурная единица представляет собой жирную кислоту, выбранную из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24.
11. Белок по п.1, который является белком хеджхог, выделяемым из позвоночных.
12. Белок по п.11, отличающийся тем, что белок хеджхог выделяют из человека или крыса.
13. Белок по п.11, отличающийся тем, что белок хеджхог позвоночных выбран из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
14. Белок по п.1, дополнительно содержащий везикулу, контактирующую с гидрофобной структурной единицей.
15. Белок по п.14, где везикула выбрана из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы.
16. Белок по п.11, где белок хеджхог имеет аминокислотную последовательность, соответствующую одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
17. Белок по п.13, отличающийся тем, что на С-конце белка хеджхог отсутствуют от 1 до 10 аминокислот по сравнению с белком хеджхог дикого типа.
18. Белок по п.11, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичную хеджхог Соник, Индиан или Дезерт, и который связывается с пэтч-белком.
19. Изолированный белок по п.1, имеющий вид
A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X,
где A означает гидрофобную структурную единицу;
Cys означает цистеин или его функциональный эквивалент;
[Sp] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность;
B означает белок, включающий в себя многочисленные аминокислоты, и, необязательно, другую спейсерную пептидную последовательность и
X означает, необязательно, другую гидрофобную структурную единицу, связанную с аминокислотой белка B, при условии, что в изолированном белке, если он представлен природным фрагментом хеджхог-полипептида, гидрофобная структурная единица не является пальмитоильной группой на N-конце полипептида.
20. Изолированный белок по п.19, представляющий собой белок хеджхог.
21. Изолированный белок по п.20, где X, если он имеется, представлен холестерином.
22. Изолированный белок по п.19, где белок B модифицирован, по меньшей мере, по одной другой аминокислоте, по меньшей мере, одной гидрофобной структурной единицей.
23. Изолированный белок по п.19, где связь A-Cys осуществляется через аминогруппу цистеина.
24. Изолированный белок по п.19, дополнительно включающий в себя контактирующую с ним везикулу.
25. Изолированный белок по п.24, где контактирующая с ним везикула выбрана из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы.
26. Везикула с присоединенными к ней двумя или более белками, причем, по меньшей мере, два из этих белков имеют вид белка по п.19.
27. Везикула по п.26, выбранная из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
28. Изолированный белок, имеющий C-концевую аминокислоту и N-концевую тиопролиновую группу, причем указанная группа образована в результате реакции альдегида с N-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
29. Изолированный белок, имеющий C-концевую аминокислоту и N-концевую амидную группу, причем указанная группа образована в результате реакции тиоэфира жирной кислоты с N-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
30. Изолированный белок, имеющий C-концевую аминокислоту и N-концевую малеимидную группу, причем указанная N-концевая малеимидная группа образована в результате реакции малеимидной группы с N-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
31. Изолированный белок по п.28, 29 или 30, где C-концевая аминокислота белка модифицирована гидрофобной структурной единицей.
32. Изолированный белок по п.31, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
33. Изолированный белок по п.32, где C-концевая гидрофобная структурная единица представляет собой холестерин.
34. Способ получения мультивалентного белкового комплекса, включающий в себя стадию связывания в присутствии везикулы гидрофобной структурной единицы с N-концевым цистеином белка или с функциональным эквивалентом N-концевого цистеина, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
35. Способ по п.34, где стадия связывания включает в себя связывание липидной структурной единицы, выбранной из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24.
36. Способ по п.34, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
37. Способ по п.34, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
38. Способ по п.36, где стадия связывания включает в себя связывание с везикулой, выбранной из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
39. Способ модификации физико-химического свойства белка, включающий в себя введение, по меньшей мере, одной гидрофобной структурной единицы в N-концевой цистеин белка или в функциональный эквивалент N-концевого цистеина, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
40. Способ по п.39, дополнительно включающий в себя контактирование гидрофобной структурной единицы с везикулой.
41. Способ по п.39, где гидрофобная структурная единица представляет собой либо липидную структурную единицу, выбранную из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24, либо гидрофобный белок.
42. Способ по п.39, где белок содержит аминокислотэую последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
43. Способ по п.39, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
44. Способ по п.40, где стадия контактирования включает в себя контактирование с везикулой, выбранной из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
45. Белковый комплекс, полученный способом по п.34.
46. Модифицированный белок, полученный способом по п.39.
47. Способ модификации белка, обладающего биологической активностью и содержащего N-концевой цистеин, включающий в себя реакцию N-концевого цистеина с тиоэфиром жирной кислоты с образованием амида, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
48. Способ по п.47, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
49. Способ по п.48, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
50. Способ модификации белка, обладающего биологической активностью и содержащего N-концевой цистеин, включающий в себя взаимодействие N-концевого цистеина с малеимидной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
51. Способ по п.50, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
52. Способ по п.50, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
53. Способ модификации белка, который связывается с внеклеточным рецептором, включающий в себя присоединение к белку гидрофобного пептида, причем белок обладает биологической активностью, а гидрофобный пептид усиливает биологическую активность, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
54. Способ по п. 53, где гидрофобный пептид присоединен к аминокислоте белка, выбранной из N-концевой аминокислоты, C-концевой аминокислоты, аминокислоты, расположенной между N-концевой аминокислотой и C-концевой аминокислотой, и комбинации этих вариантов.
55. Способ по п.53, где белок представляет собой белок хеджхог.
56. Способ по п.53, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
57. Терапевтическое применение белка по любому из пп.1 или 11, включающее в себя введение этого белка субъекту с целью лечения у него неврологического заболевания, повреждения глаза, кожного повреждения или заболевания или повреждения костной или хрящевой ткани.
58. Способ лечения неврологического расстройства у пациента, включающий в себя введение пациенту белка по любому из пп.1 или 11.
59. Белок по п.1, представляющий собой белок, передающий внеклеточный сигнал.
60. Способ по п.54, где стадия присоединения включает в себя замену, по меньшей мере, N-концевой аминокислоты белка, по меньшей мере, одной гидрофобной аминокислотой.
61. Способ по п.60, где, по меньшей мере, одна гидрофобная аминокислота представляет собой множество изолейциновых остатков.
62. Способ по п.61, дополнительно включающий в себя химическую модификацию, по меньшей мере, одного из изолейциновых остатков.
63. Изолированный белок, имеющий C-концевую аминокислоту и N-концевую ацетамидную группу, которая образована в результате реакции замещенного ацетамида с N-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
64. Изолированный белок, имеющий C-концевую аминокислоту и N-концевую тиоморфолиновую группу, которая образована в результате реакции галогенкетонной группы с N-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
65. Способ модификации белка, имеющего биологическую активность и содержащего N-концевой цистеин, включающий в себя взаимодействие N-концевого цистеина с замещенной ацетамидной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
66. Способ по п.65, где белок включает в себя аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
67. Способ по п.65, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
68. Способ модификации белка, имеющего биологическую активность и содержащего N-концевой цистеин, включающий в себя взаимодействие N-концевого цистеина с галогенкетонной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
69. Способ по 68, где белок включает в себя аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
70. Способ по п.68, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
71. Полипептид хеджхог, где указанный полипептид хеджхог включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, и где полипептид связывается с пэтч-белком, модифицированный одной или более липофильными структурными единицами, при условии, что в случае, когда полипептид хеджхог представляет собой зрелый N-концевой протеолитический фрагмент белка хеджхог, липофильная структурная единица не является стеролом на C-концевом остатке, а в случае, когда полипептид хеджхог является природным фрагментом полипептида хеджхог, липофильная структурная единица не является пальмитоильной группой на N-концевом остатке.
72. Полипептид хеджхог по п.71, где указанный полипептид модифицирован одной или несколькими липофильными структурными единицами по внутренним аминокислотным остаткам.
73. Полипептид хеджхог по п.71, где указанный полипептид модифицирован одним или более липофильными ароматическими углеводородами.
74. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, который представлен в виде очищенного белкового препарата.
75. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, который представлен в виде лекарственного препарата.
76. Полипептид хеджхог по п.71 или 72, где липофильные структурные единицы выбраны из жирных кислот, липидов, сложных эфиров, спиртов, каркасных структур и ароматических углеводородов.
77. Полипептид хеджхог по п.73 или 76, где ароматический углеводород выбран из бензола, перилена, фенантрена, антрацена, нафталина, пирена, хризена и нафтацена.
78. Полипептид хеджхог по п.77, где ароматический углеводород представляет собой пирен.
79. Полипептид хеджхог по п.71 или 72, где липофильные структурные единицы выбраны из изопреноидов, терпенов и полиалициклических углеводородов.
80. Полипептид хеджхог по п.79, где липофильные структурные единицы выбраны из адамантанов, бакминстерфуллеренов, витаминов, полиэтиленгликоля, олигоэтиленгликоля, (C1-C18)диалкиловых эфиров фосфорной кислоты, O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)алкила.
81. Полипептид хеджхог по п.80, где липофильэых структурные единицы выбраны из 1- или 2-адамантилацетила, 3-метиладамант-1-илацетила, 3-метил-3-бром-1-адамантилацетила, 1-декалинацетила, камфорацетила, камфанацетила, норадамантилацетила, норборнанацетила, бицикло[2.2.2]окт-5-енацетила, 1-метоксибицикло[2.2.2]окт-5-ен-2-карбонила, цис-5-норборненэндо-2,3-дикарбонила, 5-норборнен-2-илацетила, (1R)-(-)-миртентанацетила, 2-норборнанацетила, анти-3-оксотрицикло-[2.2.1.0<2,6>]гептан-7-карбонила, деканоила, додеканоила, додеценоила, тетрадекадиеноила, дециноила и додециноила.
82. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, где липофильная структурная единица или липофильные структурные единицы усиливают биологическую активность полипептида относительно немодифицированного полипептида хеджхог.
83. Способ изменения состояния роста клетки, отвечающей на передачу сигнала белком хеджхог, включающий в себя контактирование клетки с липофильно-модифицированным полипептидом хеджхог по любому из пп.71-73.
84. Применение белка по любому из пп.1-18 в производстве лекарственного средства для лечения неврологического заболевания.
85. Применение липофильно-модифицированного полипептида хеджхог по любому из пп.71-73 в производстве лекарственного средства для изменения состояния роста клетки, отвечающей на передачу сигнала белком хеджхог.
Текст
1 Область изобретения Известно, что некоторые белки проявляют более высокую биологическую активность, будучи присоединенными к другим структурным единицам за счет образования многомерных комплексов, где белки имеют возможность действовать вместе с другими компонентами, или же за счет других изменений в физикохимических свойствах белка, например, за счет абсорбции белка, его биораспределения и изменения времени полупревращения. В соответствии с изложенным, сфера интересов в биотехнологии включает в себя разработку способов модификации физико-химических свойств белков таким образом, чтобы они могли быть использованы в меньших количествах, с меньшим числом побочных эффектов, по новому назначению и менее затратно. Например, способность к связыванию у отдельно взятого белка (например, у лиганда и соответствующего ему рецептора) может быть невысокой. Но клетки производят от сотен до тысяч копий специальных поверхностных рецепторов, и многие взаимодействия типа лиганд-рецептор протекают одновременно. Если в связывании на поверхности клетки участвуют многие молекулы, то общее эффективное связывание оказывается больше, чем сумма эффектов связывания отдельных молекул. В отличие от этого отделение лигандных белков от поверхности клетки и очистка их, или же выделение их с помощью приемов, использующих рекомбинантную ДНК, например, с целью применения в качестве лекарственных средств, приводит к тому, что они действуют в виде мономеров и теряют преимущество, проявляющееся при совместном действии многих других копий того же самого белка, компактно ассоциированных на поверхности клетки. Обусловленное такой изоляцией низкое сродство белка к его рецептору может стать серьезным препятствием на пути эффективного применения его в качестве лекарственного средства для блокирования специфических путей связывания, поскольку ему приходится конкурировать с высокой склонностью клеток к межклеточным взаимодействиям. Эффективное лечение в этом случае может быть обеспечено зa счет постоянного введения средства и/или использования более высоких дозировок. В то же время, такие препятствия можно обойти, если удается обеспечить многомерность форм изолированного белка. Точно так же можно получить положительный эффект при модифицировании других физико-химических свойств биологически активных белков, например, таким образом, чтобы индуцировалась ассоциация белка с мембраной и происходила его локализация в месте поступления, а также чтобы усиливалась способность к связыванию или, иначе, к взаимодействию с соответствующей мишенью. Такие изменения 2 могут оказывать влияние и на фармакологическое распределение белка. Разработаны многочисленные способы генерирования сопряженных белков. Многие из этих способов не отличаются высокой специфичностью, то есть они не ориентируют точку связывания на какой-то определенный сайт на молекуле белка. В результате этого обычные обеспечивающие связывание средства могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные центры, лишая этим связанные белки активности. Более того, связанные продукты могут быть ориентированы таким образом, что активные центры не могут проявлять эффект синергизма и тогда эффективность этих продуктов не превышает эффективность самого мономерного белка. Дополнительным побудительным мотивом для поиска новых способов модификации белка являются белки с N-концевым цистеиновым остатком, который подвержен реакциям окисления или другим химическим превращениям,снижающим активность или время полупревращения. В дополнение к этому, некоторые буферы, обычно используемые для очистки белка,имеют компоненты или загрязнения, которые могут трансформировать N-концевой цистеин. Даже когда избегают применения таких буферов, N-концевой цистеин через какое-то время может претерпеть превращения в результате действия веществ, содержащихся в используемой для хранения посуде или в воздухе. Следовательно, используемые в лекарственных формах буферы должны содержать в своем составе защитные вещества типа дитиотреитола для предотвращения модификации и/или окисления цистеина. Однако такие вещества защитного действия сами проявляют заметную биологическую активность, и поэтому они могут осложнять проведение экспериментов и неблагоприятно влиять на терапевтическое действие лекарственной формы. В соответствии с изложенным имеется потребность в разработке более специфичных средств для получения модифицированных продуктов или их многомерных форм, а также для изменения свойства белка с целью повышения его стабильности, активности, фармакокинетических и фармакодинамических характеристик. В одном из аспектов изобретения авторы решили проблему по разработке удобного способа получения модифицированных форм биологически активных белков. Соответствующие изобретению способы могут использоваться для получения многомерных форм белков и/или они могут использоваться для изменения их физикохимических свойств. Авторы изобретения показали, что модифицирование белка (то есть присоединение или добавление гидрофобной структурной единицы к существующей аминокислоте или замена аминокислоты гидрофобной струк 3 турной единицей) таким образом, чтобы ввести гидрофобную структурную единицу в молекулу белка, может привести к усилению биологической активности белка и/или его стабильности. Так, например, N-концевой цистеин может использоваться в качестве удобной "мишени" для присоединения гидрофобной структурной единицы, например, липида, и модифицирования активного белка. Альтернативно для модифицирования активности белка гидрофобная структурная единица может быть присоединена к С-концовому остатку биологически активного белка, например, хеджхог-белка. Для увеличения активности белка гидрофобная структурная единица может быть также присоединена к остатку аминокислоты во внутренней части цепи, при условии,что такая модификация не влияет на активность белка, например, на способность белков связываться с рецептором или корецептором, или не влияет на трехмерную структуру белка. Предпочтительно, когда гидрофобная структурная единица присоединена к аминокислотному остатку, который находится на поверхности белка,когда белок находится в его нативной форме. Соответствующая изобретению гидрофобная модификация представляет собой в общем удобный способ создания белков с измененными физико-химическими свойствами по сравнению с немодифицированными формами. В основу настоящего изобретения положено обнаруженное авторами изобретения явление, когда в результате экспрессии полной длины Соник хеджхог-белка в клетках насекомого и в клетках млекопитающих в его полной форме(остатки 1-174 в полной последовательности), в дополнение к холестерину у С-концевого остатка, проводилась также его дериватизация жирной кислотой по его N-концевому остатку, и тогда оказалось, что такая форма хеджхог-белка проявляет 30-кратное увеличение активности по сравнению с растворимым, немодифицированным хеджхог-белком в опытах in vitro. В соответствии с этим один из аспектов изобретения относится к изолированному белку,включающему в себя N-концевую аминокислоту и С-концевую аминокислоту, причем белок выбирают из группы, состоящей из белка с цистеином в качестве N-концевой аминокислоты, к которой присоединена по меньшей мере одна гидрофобная структурная единица; включающей в себя белок, N-концевая аминокислота которого не является цистеином, соединенным с гидрофобной структурной единицей; и включающей в себя белок, в котором гидрофобная структурная единица заменяет N-концевую аминокислоту. Гидрофобная структурная единица может быть представлена гидрофобным пептидом или каким-либо липидом или любой другой гидрофобной химической структурной единицей. 4 Белок может быть модифицирован по егоN-концевой аминокислоте, и предпочтительно,чтобы N-концевой аминокислотой являлся цистеин или его функциональное производное. Белок может быть модифицирован по его Сконцевой аминокислоте или же одновременно как по N-концевой аминокислоте, так и по Сконцевой аминокислоте, или, по крайней мере,по одной из аминокислот внутри цепи (то есть между N-концевой и С-концевой аминокислотами), возможны и различные комбинации этих конфигураций. Белок может быть внеклеточным, предназначенным для передачи сигналов белком, и в предпочтительных вариантах - это хеджхог-белок, включая Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белки, источником которого являются организмы позвоночных, наиболее предпочтительно организм человека. Другой вариант представлен изолированным белком формы:A-Cys-[Sp]-B-X,где А означает гидрофобную структурную единицу,Суs означает цистеин или его функциональный эквивалент,[Sp] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность,В означает белок, включающий в себя разнообразные аминокислоты, среди которых, по крайней мере, одна необязательная спейсерная пептидная последовательность и Х означает необязательно другую гидрофобную структурную единицу, связанную с белком. Изолированный белок может быть внеклеточным сигнализирующим белком, предпочтительно это хеджхог-белок. Этот белок может быть модифицирован не менее чем по одной другой аминокислоте не менее чем с одной гидрофобной структурной единицей. В других вариантах белок находится в контакте с везикулой, выбираемой из группы, состоящей из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы. Другой аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и N-концевой тиапролиновой группой,причем тиапролиновая группа образована в результате взаимодействия альдегида с Nконцевым цистеином в молекуле белка. Еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой иN-концевой амидной группой, которая образована при взаимодействии тиоэфира жирной кислоты с N-концевым цистеином белка. И еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой иN-концевой малеимидной группой, причем Nконцевая малеимидная группа образована в результате реакции малеимидной группы с Nконцевым цистеином белка. Еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и N-концевой аце 5 тамидной группой. И еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с Сконцевой аминокислотой и N-концевой тиоморфолиновой группой. В таких вариантах С-концевая аминокислота белка может быть модифицирована гидрофобной структурной единицей. Изолированный белок может представлять собой внеклеточный сигнальный белок наиболее предпочтительно это хеджхог-белок. Соответствующие изобретению способы включают в себя способ получения мультивалентного белкового комплекса, где имеется стадия присоединения в присутствии везикулы гидрофобной структурной единицы к Nконцевому цистеину белка или к функциональному эквиваленту N-концевого цистеина. Стадия присоединения может включать в себя присоединение липидной структурной единицы,выбираемой из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24. Белок может быть внеклеточным сигнальным белком, предпочтительно это хеджхогбелок, выбираемый из группы, состоящей из Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белков. И еще один способ согласно изобретению представляет собой способ модификации физико-химических свойств белка, включающий в себя введение, по крайней мере, одной гидрофобной структурной единицы в фрагмент Nконцевого цистеина в молекуле белка или в фрагмент функционального эквивалента Nконцевого цистеина. Гидрофобная структурная единица может быть липидной структурной единицей, выбираемой из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24. Она может быть представлена и гидрофобным белком. Белок, модифицированный с использованием этого способа, может быть сигнальным внеклеточным белком, предпочтительно это хеджхог-белок, выбираемый из группы, состоящей из Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белков. Белковые комплексы, получаемые этими способами, также входят в объем притязаний настоящего изобретения. Другие внеклеточные сигнальные белки за исключением хеджхог-белка - это гельсолин,интерферон, интерлейкин, фактор некроза опухолей, колониестимулирующий фактор моноцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов, эритропоэтин, фактор роста из тромбоцитов, гормон роста и инсулин. Другой способ представлен способом модификации белка, (такого как внеклеточный сигнальный белок), на N-конце которого находится цистеин. Этот способ включает в себя взаимодействие N-концевого цистеина с тиоэфиром жирной кислоты с образованием амида,причем такая модификация усиливает биологическую активность белка. 6 Еще один способ представлен способом модификации белка (такого как внеклеточный сигнальный белок), на N-конце которого находится цистеин, причем способ включает в себя взаимодействие N-концевого цистеина с малеимидной группой, и в результате такой модификации возрастает биологическая активность белка. Другие варианты этого способа включают в себя взаимодействие N-концевого цистеина с альдегидной группой, с ацетамидной группой или с тиоморфолиновой группой. Еще один способ представляет собой способ модификации белка (такого как внеклеточный сигнальный белок), включающий в себя присоединение к белку гидрофобного пептида. Гидрофобная структурная единица может быть присоединена к аминокислоте белка, выбираемой из группы, включающей в себя N-концевую аминокислоту, С-концевую аминокислоту, аминокислоту, находящуюся между N-концевой аминокислотой и С-концевой аминокислотой,возможна и комбинация перечисленных точек присоединения. В одном из вариантов настоящее изобретение относится к хеджхогполипептидам, которые модифицированы липофильными структурными единицами. В некоторых вариантах соответствующие настоящему изобретению хеджхог-белки модифицированы липофильной структурной единицей или липофильными структурными единицами в одном или в нескольких участках внутри зрелого, обработанного внеклеточного домена, они также могут быть дериватизированы по N- или по Сконцевому остатку зрелого полипептида или же такая дериватизация может быть исключена. В других вариантах полипептид модифицируют по С-концевому остатку гидрофобной структурной единицей отличной от стерола. В еще одном варианте полипептид модифицирован поN-концевому остатку циклической (предпочтительно полициклической) липофильной группой. Возможны также различные сочетания приведенных выше вариантов. Соответствующий изобретению терапевтический способ представляет собой способ лечения неврологических расстройств у пациента, включающий в себя введение в организм пациента гидрофобно модифицированного белка согласно изобретению. Краткое описание рисунков Фиг. 1. Характеристика пальмитоилированной формы Shh. Связанную форму Shh человека иммуноафинным способом очищают от клеток насекомых High Five и анализируют методом SDS-PAGE. Белок окрашивают с помощью Coomassie blue (линия a, Life Technologies, Inc., предварительное окрашивание маркером с высокой молекулярной массой; линия b,растворимый Shh (0,6 мкг); линия с, связанныйShh (0,6 мкг); линия d, смесь растворимого и связанного Shh (по 0,6 мкг каждого). Способность Shh и Ihh (см. линия h) подвергаться мо 7 дификации пальмитиновой кислотой была проверена с использованием свободной от клеток системы, описанной в примере 2. Растворимые формы хеджхог-белка (3 мкг на образец) инкубируют в течение 1 ч с микросомами печени крысы, АТФ, коферментом А и 3H-пальмитиновой кислотой и анализируют методом SDSPAGE для определения степени пальмитоилирования. Образцы, показанные линиями e-i,проявляют флуорографически (линия е, Shh; линия f, des 1-10 Shh, линия g, от Цис-1 до Сер(линия j, Shh; линия k, des 1-10 Shh). Фиг. 2. Анализ очищенного Shh методом масс-спектрометрии с электрораспылением. Растворимый Shh человека (А) и связанный Shh человека с присоединенным гидрофобным фрагментом (В) анализируют методом ESI-MS на тройном квадрупольном масс-спектрометреMicromass Quatrco II, оборудованном источником ионов с электрораспылением. Все полученные при электрораспылении масс-спектральные данные регистрируют и хранят в графическом виде, а обрабатывают их с помощью системы для обработки данных Micromass MassLynx. Представлены спектры молекулярных масс (отнесение масс на основе системы обработки данных). Фиг. 3. Анализ связанного Shh методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Растворимый Shh человека (А), связанный Shh человека из клеток насекомых High Five (В), связанный Shh человека из клеток EBNA-293 (С), и ассоциированный с клетками Shh крысы (D) хроматографируют с обращенной фазой на приборе ВЭЖХ с колонкой narrow bore Vydac C4 (2,1 мм внутренний диаметр х 250 мм). Колонку проявляют градиентным способом, повышая концентрацию ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте от 0 до 80% в течение 30 мин при скорости 0,25 мл/мин, продукт элюирования пропускают через детектор с набором фотодиодов для длин волн от 200 до 300 нм (приведены данные при 214 нм). Соответствующие пикам фракции собирают и после этого характеризуют методомShh человека (В) алкилируют 4-винилпиридином (образец 1 мкл/100 мкл в 6 М гидрохлорида гуанидина, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ гидрохлорида Трис, рН 8,0), осаждают этанолом и обрабатывают эндопротеиназой Lys-C в 50 мМ гидрохлориде Трис с рН 7,0, 2 М мочевины при отношении фермента к белку, равном 1:5, как это было описано ранее (27). Продукты ферментации анализируют методом ВЭЖХ с обращенной фазой, соединенным с тройным квадрупольным масс-спектрометром с электрораспылением Micromass Quattro II. Результаты сканирования 8 обрабатывают с помощью системы обработки данных Micromass MassLinx (представлены полные ионные хроматограммы опытов). Звездочками отмечены положения N-концевых пептидов, подтвержденные с помощью MALDI PSD или N-концевого секвенирования по Эдману. Фиг. 5. Секвенирование N-концевого Shhпептида при определении MALDI PSD. Полученный действием эндопротеиназы Lys-C Nконцевой пептид из связанного Shh человека направляют на определение MALDI PSD на масс-спектрометре Voyager-DE STR с регистрацией времени пролета. Предсказанные продукты фрагментации и номенклатура установленных ионных фрагментов представлены в верхней части рисунка (РА означает пальмитоильный кислотный остаток, 4vp означает 4 пиридилэтильную группу). Остальная часть рисунка представляет собой полученный в опыте молекулярный масс-спектр. Значимые ионы перечислены с использованием схематично представленной номенклатуры. Рассчитанные массы (в Да) для b1-b8 равны 447,3, 504,3, 601,4,658,4, 814,5, 871,5, 1018,6 и 1075,6 соответственно. Для y1-у 8 массы (Да) равны 147,1, 204,1,351,2, 408,2, 564,3, 621,3, 718,4 и 775,4 соответственно. Рассчитанная масса для z8 равна 758,4 Да. Наблюдаемая масса для b8 дополнительно содержит 18 Да от присоединенной воды. Фиг. 6. Увеличение активности связанногоShh в опыте на С 3 Н 10 Т 1/2. Относительные активности растворимого и связанного Shh человека в чистом виде (А) или в присутствии антихеджхог нейтрализующего Mab 5E1 (В) оценивают на клетках С 3 Н 10 Т 1/2 по данным определения индукции щелочной фосфатазы. Представленные числа отражают средние значения двойных определений. (А) Последовательные двукратные разбавления растворимого (6) и связанного (8) Shh инкубируют с клетками в течение 5 дней и определяют конечный уровень активности щелочной фосфатазы, измеренный при 405 нм с использованием хромогенного субстрата щелочной фосфатазы п-нитрофенилфосфата. (В) Серийные разведения Mab 5E1 инкубируют с растворимым Shh (5 мкг/мл: черные столбцы) или со связанным Shh (0,25 мкг/мл: серые столбцы) или же без добавленияShh в контрольных опытах с носителем (белые столбцы) в течение 30 мин, затем анализируют в опыте с С 3 Н 10 Т 1/2. Фиг. 7. Анализ Shh в опыте по связыванию с рецептором. Относительную активность растворимого (6) и связанного (8) Shh определяют в опыте по связыванию с patched на patchedтрансфектных EBNA-293 клетках FACSанализом. Серийные разведения исследуемых образцов инкубируют с клетками EBNA-293,промывают и затем определяют процент связывания, измеряемый по способности образцов конкурировать с Shh-Ig за связывание с клетками. Связанный Shh-Ig количественно определя 9 ют по среднему значению флуоресценции, используя для считывания пробу на FITCмеченное анти-Ig антитело. Эти данные соответствуют гиперболической кривой нелинейной регрессии. Фиг. 8. Выравнивание хеджхог-белков человека по N-концевым фрагментам. Хеджхогбелки человека массой 20 кДа (Соник "Shh",Дезерт "Dhh" и Индиан "Ihh") выравнивают относительно их N-концевого цистеина (Cys-1 в полной последовательности). В полноразмерном белке предшественнике Shh этот цистеин обычно является Cys-24 из-за того, что в нем присутствует естественная сигнальная последовательность, которая отщепляется при секреции. Фактическое положение цистеина может незначительно изменяться у различных видов. Фиг. 9. Согласованная последовательностьN-концевого фрагмента хеджхог-белков человека. Фиг. 10. Влияние длины липидной цепи на активность Соник хеджхог-белка человека. В соответствии с настоящим изобретением синтезируют ряд модифицированных жирной кислотой хеджхог-белков и определяют влияние длины цепи жирной кислоты на активность хеджхог-белка, используя описанную ранее индукцию щелочной фосфатазы клетками С 3 Н 10 Т 1/2. Результаты опытов представлены в графическом виде. Фиг. 11. Опыт на клетках С 3 Н 10 Т 1/2 с пальмитоилированным, миристоилированным,лауроилированным, деканоилированным и октаноилированным Соник хеджхог-белком человека. Пальмитоилированный, лауроилированный,деканоилированный и октаноилированный Соник хеджхог-белок человека в виде раствора в 5 мМ Na2 НРО 4 с рН 5,5, 150 мМ NaCl, 1% октилглюкозида, 0,5 мМ DTT и миристоилированный Соник хеджхог-белок человека в виде раствора в 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT испытывают на клетках С 3 Н 10 Т 1/2, измеряя индукцию щелочной фосфатазы. Числовые значения представляют собой среднее из двух измерений. Последовательные трехкратные разбавления пальмитоилированного (о), миристоилированного ,лауроилированного , деканоилированногои октаноилированногои немодифицированного ( и х) Соник хеджхог-белка человека инкубируют с клетками в течение 5 дней и определяют конечное значение уровней щелочной фосфатазы, измерения проводят при 405 нм,используя в качестве хромогенного субстрата пнитрофенилфосфат. Пальмитоилированный,миристоилированный, лауроилированный и деканоилированный белки испытывались в одном эксперименте с немодифицированным белком,показанным как , в то время как октаноилированный белок испытывался в другом эксперименте с немодифицированным белком, показанным как (х). Стрелка на у-оси обозначает 10 фоновый уровень щелочной фосфатазы без добавленного хеджхог-белка. Фиг. 12. Общие структуры различных гидрофобно модифицированных форм хеджхогбелка. (А) Производные амидов жирных кислот,где R означает углеводородную цепь жирной кислоты, (В) тиазолидиновые производные, гдеR означает углеводород, (С) замещение аминокислотой, где R означает боковую цепь гидрофобной аминокислоты, (D) малеинимидное производное, где R означает углеводород, (Е)SH означает свободную тиольную группу в Nконцевом цистеине хеджхог-белка естественного типа, (F) иодацетамидное производное, где R1 означает углеводород и R2 означает Н или углеводород, и (G) тиоморфолинильное производное, где R означает углеводород. Для всех структур НН означает хеджхог. Фиг. 13. Относительная активность различных гидрофобно модифицированных форм хеджхог-белка в опыте на клетках С 3 Н 10 Т 1/2. Значения EC50 (2 мкг/мл) немодифицированного Соник хеджхог-белка естественного типа представлены, как 1 х. Активность других белков представлена в виде отношения ЕС 50 белка естественного типа к EC50 модифицированного белка. Модификации относятся к N-концу белка,если не указано иное. Фиг. 14. Относительная активность немодифицированного, миристоилированного и мутанта C1II Соник хеджхог-белка человека в опыте на вызванной малонатом стриарной патологии. Рисунок показывает снижение объема вызванного малонатом патологического изменения полосатого тела крысы, которое наблюдается при введении немодифицированного, миристоилированного или мутанта C1II Соник хеджхог-белка. Фиг. 15. Иллюстрация специфических активностей модифицированного малеимидным способом и немодифицированного хеджхогполипептидов. Подробное описание изобретения В основу настоящего изобретения частично положено то, что Соник хеджхог-белок человека, получаемый в результате экспрессии полной длины его структуры в клетках насекомого или в клетках млекопитающих, имеет гидрофобную пальмитоильную группу, присоединенную к -аминогруппе N-концевого цистеина. Это первый известный авторам изобретения пример, когда внеклеточный сигналирующий белок модифицирован таким образом, и в отличие от направленных на тиольную группу модификаций с помощью пальмитиновой кислоты,которые легко обратимы, такое новое Nзамещение пальмитоильной структурной единицей вероятно очень устойчиво по аналогии с модификацией миристиновой кислотой. Прямым следствием этого начального открытия явилось обнаружение авторами изобретения факта, что увеличение гидрофобного ха 11 рактера сигналирующего белка может увеличивать биологическую активность белка. В частности, авторы изобретения обнаружили, что присоединение гидрофобной структурной единицы к сигналирующему белку, например, к хеджхог-белку, может повышать активность белка. Авторы изобретения обнаружили, что Nконцевой цистеин в биологически активных белках не только представляет собой удобный реакционный центр для присоединения гидрофобной структурной единицы, изменяя таким образом физико-химические свойства белка, но модификации N-концевого цистеина могут также сопровождаться увеличением стабильности белка. В дополнение к этому, присоединение гидрофобной структурной единицы к аминокислотному остатку в средней части пептидной цепи на поверхности белковой структуры увеличивает активность белка. Авторы изобретения используют этот пример, демонстрируя лежащую в основе изобретения гидрофобную модификацию хеджхог-белка, например, липидами и гидрофобной аминокислотой. Один из аспектов настоящего изобретения представлен открытием того, что в дополнение к этим эффектам, проявляющимся в результате присоединения холестерина к С-концу внеклеточных фрагментов белка, по крайней мере, некоторые виды биологической активности генных продуктов неожиданно усиливаются при дериватизации белка липофильными структурными единицами в других реакционных центрах белка и/или структурными единицами, отличными от холестерина. Некоторые аспекты настоящего изобретения направлены на получение хеджхог-полипептидов, которые модифицированы не по N-концевым или С-концевым остаткам получаемой в результате естественного процессинга формы белка, а по другим реакционным центрам, и/или которые модифицированы по этим концевым остаткам отличными от стерольных липофильными структурными единицами на С-конце или жирной кислотой на Nконце. Как описано в конвенционных заявках на международный патент 95/18856 и 96/ 17924 (все они специально включены в прилагаемый список литературы),хеджхогполипептиды в общем случае используют invivo и in vitro для исправления и/или для регуляции функционального проявления широкого спектра клеток, тканей и органов; они находят ряд терапевтических применений, распространяющихся на защиту нервной ткани, на нейрорегенерацию, усиление невральной функции, на регуляцию образования и восстановления костной и хрящевой ткани, на регуляцию сперматогенеза, на регуляцию легких, печени и других происходящих от примитивной кишки органов,на регуляцию кроветворной функции и так далее. В соответствии с этим, соответствующие настоящему изобретению способы и компози 003739 12 ции включают в себя применение дериватизированных хеджхог-полипептидов для всех аналогичных областей применения, если при этом используются хеджхог-белки. Более того, эти способы могут быть применены на клеточных культурах (in vitro) или на клетках в организме животного (in vivo). В одном из аспектов настоящее изобретение относится к лекарственным формам, включающим в себя в качестве активного ингредиента хеджхог-полипептид, дериватизированный одной или несколькими липофильными структурными единицами представленными здесь способами. Хеджхог-лечение, о котором идет речь,показывает свою эффективность как на организме человека, так и на животных. Животные субъекты, на которых может быть распространено настоящее изобретение, представлены как домашними животными, так и домашним скотом, которых выращивают в качестве домашних любимцев или в коммерческих целях. В качестве примера можно привести собак, кошек, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней и коз. Хеджхог-белки представляют собой семейство внеклеточных сигналирующих белков,которые регулируют различные аспекты эмбрионального развития как у позвоночных, так и у беспозвоночных (обзоры по этой теме 1, 2). Лучше всего охарактеризованным хеджхогбелком является Соник хеджхог (Shh), участвующий в начальной и последующей дифференциации, в образовании апикального эктодермального гребня, мезодермы задней кишки,позвоночного столба, периферических конечностей, в развитии ребер и в развитии легких, он индуцирует вентральные клетки в спинном мозге, в заднем мозге и в переднем мозге (3-8). Полного понимания механизма действия хеджхог-белков еще не достигнуто, но последние биохимические и генетические данные позволяют предположить, что рецептор Shh продуцируется геном супрессором злокачественных опухолей и связан локально (9, 10) и что в пути сигналирования с участием хеджхог-белка вовлечены другие белки (smoothened (10, 11), Cubitus interruptus (12, 13) и fused (14.Shh человека синтезируется в виде белка предшественника с массой 45 кДа, который расщепляется по автокаталитическому механизму с образованием: (I) N-концевого фрагмента с массой 20 кДа, который отвечает за всю известную сигналирующую активность хеджхог-белка (SEQ ID NOS. 1-4), и (II) С-концевого фрагмента белка 25 кДа, который характеризуется автопроцессинговой активностью (15-17). В состав N-концевого фрагмента входят аминокислотные остатки 24-197 полной длины последовательности в белке предшественнике.N-Концевой фрагмент остается ассоциированным с мембраной благодаря присоединению холестерина к его С-концу (18,19). Этот холе 13 стерин имеет решающее значение для ограничения тканевой локализации сигнала от хеджхог-белка. Присоединение холестерина катализируется С-концевым доменом на стадии процессинга. Все ссылки, приведенные в подробном описании, приводятся в списке литературы, если не указано иное.I. Определения. Далее следует детальное описание изобретения, в которое включены приведенные ниже определения. Аминокислота - мономерная единица пептида, полипептида или белка. В состав встречающихся в природе пептидов, полипептидов и белков входят двадцать аминокислот,все из которых являются L-изомерами. Этот термин включает в себя также аналоги аминокислот, а также D-изомеры белковых аминокислот и их аналоги. Белок - любой полимер, основу которого составляют любые из 20 аминокислот. Правда,понятие полипептид часто используют по отношению к сравнительно большим полипептидам, а понятие пептид часто используется по отношению к небольшим полипептидам, но при использовании этих понятий их значения часто перекрываются и изменяются. Используемое здесь понятие белок относится к пептидам, белкам и полипептидам, если не указано иное.N-конец - это понятие относится к первой аминокислоте (аминокислоте номер 1) в полной форме белка.N-концевой цистеин - означает аминокислотный остаток (номер 1), показанный в SEQID NOS. 1-4. Это понятие относится также к любому цистеину, находящемуся в положении 1 любого другого белка, или к функциональному эквиваленту этого цистеина (см. раздел IV). Спейсерная последовательность - это понятие относится к короткой последовательности, это может быть даже одна единственная аминокислота, которая может быть встроена между подвергающейся гидрофобной модификации аминокислотой (например, такой как Nконцевой цистеин или его функциональный эквивалент) и остальной частью белка. Разделитель предназначен для того, чтобы обеспечить пространственное разделение между гидрофобной модификацией (например, модифицированным N-концевым цистеином) и остальной частью белка и таким образом предотвратить взаимодействие модифицированной части с белковой функцией и/или облегчить соединение модифицированного участка (например, Nконцевого цистеина) с липидом, везикулой или с другой гидрофобной структурной единицей. В соответствии с этим, если белок модифицирован по его N-концевому цистеину и по другой аминокислоте на другом участке, то спейсерных последовательностей может быть две или более. 14 Связанный белок - это понятие относится к гидрофобно модифицированному белку в соответствии с настоящим изобретением. Мультивалентный белковый комплекс это множественность белков (то есть один или более одного). Липид или другая гидрофобная структурная единица присоединены не менее чем к одному из множества белков. Липид или другая гидрофобная структурная единица может находиться в контакте с везикулой, но это не обязательно. Если белок не содержит липида или другой гидрофобной структурной единицы,то такой белок может быть присоединен межмолекулярной связью к другому белку, в составе которого есть липид или гидрофобная структурная единица. Каждый белок может быть таким же, как остальные, или отличаться от них, и каждый липид или другая гидрофобная структурная единица могут быть как одинаковыми,так и разными. Везикула - это любое агрегированное состояние липофильных молекул. Везикула может быть получена из биологических источников (например, это аналогичный клеточной мембране липидный бислой или поверхностноактивный состав на основе желчных кислот) или же из не биологических источников (например,это везикулы из подобных описанным в разделеIV небиологических повехностно-ак-тивных веществ). Форма, тип и конфигурация везикул не могут быть использованы для ограничения объема притязаний настоящего изобретения. Функциональный эквивалент аминокислотного остатка (например, N-концевого цистеина) - это (i) аминокислота с такими же реакционными свойствами, что и заменяемый этим функциональным эквивалентом аминокислотный остаток; (ii) это аминокислота лиганда соответствующего изобретению полипептида с аминокислотным остатком, который имеет те же самые возможности для связывания с гидрофобной (например, липидной) структурной единицей, какие имел заменяемый функциональным эквивалентом аминокислотный остаток;(iii) это молекула, не относящаяся к аминокислотам, которая имеет те же самые возможности для связывания с гидрофобной (например, липидной) структурной единицей, какие имел заменяемый функциональным эквивалентом аминокислотный остаток. Генетическое слияние - этот термин относится к коллинеарному образованию ковалентной связи между двумя или более белками или фрагментами белков через их индивидуальный пептидный остов путем генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки. Химерный белок или белок, полученный слиянием представляет собой продукт слияния первой аминокислотной последовательности,кодированной как хеджхогполипептид, со второй аминокислотной после 15 довательностью, определяющей домен, который отличается от какого-либо домена hh-белка и в основном не гомологичен ему. Химерный белок может содержать чуждый домен, который находится (даже в составе другого белка) в организме, где идет экспрессия и первого белка, или это может быть межвидовое, межгенное и т.п. слияние белковых структур, происходящих от разных организмов. В общем случае полученный слиянием белок может быть представлен общей формулой (X)n-(hh)m-(Y)n, где hh означает весь хеджхог-белок или его часть, Х и Y независимо друг от друга означают аминокислотные последовательности, которые не являются естественными соседями хеджхог-последовательности в полипептидной цепи, m означает целое число, равное или больше 1, и в каждом случае n, независимо для первого и второго фрагмента, равно 0 или означает целое число,равное или больше 1 (предпочтительно n и m не больше 5 или 10)."Мутантный" - это термин, относящийся к любому изменению в генетическом материале организма, в частности любое изменение (то есть деления, замещение, вставка или альтерация) в естественном типе полинуклеотидной последовательности или любое изменение в естественном типе белка."Естественный тип" - это естественная полинуклеотидная последовательность экзона белка или ее часть или же соответственно это последовательность в белке или часть ее в таком виде, в каком она обычно существует in vivo."Стандартные условия гибридизации" - это солевые и температурные условия, преимущественно эквивалентные значениям от 0,5 Х SSC до примерно 5 Х SSC и 65 С как для гибридизации, так и для промывки. Понятие стандартные условия гибридизации используется здесь в качестве операционного определения и включает в себя спектр условий гибридизации. См. также Current Protocols in Molecular Biology,John WileySons, Inc. New York, разделы 6.3.16.3.6 (1989). Контролирующая экспрессию последовательность - это последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов при оперативном связывании с этими генами. Оперативно связанный - это полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК),оперативно связанная с контролирующей экспрессию последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой нуклеотидной последовательности. В понятие оперативно связанный входит соответствующий сигнал начала процесса (например ATG) в передней части экспрессируемой полинуклеотидной последовательности и сохранение корректной рамки считывания для обеспечения экспрессии полинуклеотидной по 003739 16 следовательности под контролем контролирующей экспрессию последовательности и образование целевого полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью. Вектор экспрессии - это полинуклеотид,например, ДНК-плазмида или фаг (наряду с другими обычными примерами), который запускает экспрессию, по крайней мере, одного гена, когда вектор экспрессии вводится в клетку-хозяина. Этот вектор может иметь способность к репликации в клетке, но это не обязательно. Изолированный (используется наравне с термином практически чистый) - этот термин,будучи применен к нуклеиновой кислоте, то есть к полинуклеотидной последовательности,кодирующей полипептиды, относится к полинуклеотиду ДНК или РНК, к части геномного полинуклеотида, к кДНК или к синтетическому полинуклеотиду, который по своему происхождению или в результате манипуляций: (i) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым он ассоциирован в естественных условиях(например, он присутствует в клетке-хозяине в роли вектора экспрессии или его части); или (ii) соединен с нуклеиновой кислотой или с другой химической структурной единицей, которая отлична от той, с которой он соединен в естественных условиях; или (iii) он не существует в природе. Понятие изолированный относится также к полинуклеотидной последовательности,которая: (i) размножена in vitro, например, в результате полимеразной цепной реакции(ii) синтезирована химическим путем; (iii) получена путем рекомбинантного клонирования; или (iv) очищена в результате расщепления и разделения с помощью геля. Тогда практически чистая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая не находится в непосредственном соседстве с одной или с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно связана в естественном состоянии генома в организме, послужившем источником этой нуклеиновой кислоты. Практически чистая ДНК включает в себя также рекомбинантную ДНК,которая является частью гибридного гена, кодирующего последовательность хеджхог-белка. Изолированный (используется наравне с термином практически чистый) - этот термин,будучи применен к полипептиду, относится к полипептиду или к его части, которые по своему происхождению или в результате манипуляций (i) присутствуют в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии вектора экспрессии или его части; или (ii) соединены с белком или с другой химической структурой, которая отлична от той, с которой они соединены в естественных условиях; или (iii) они не существуют в природе, например это белок, который подвергался химическим превращениям с присоедине 17 нием или добавлением, по крайней мере, одной гидрофобной структурной единицы с образованием белка, который в естественных условиях не встречается. Понятие изолированный относится также к белку, который: (i) получен синтетическим путем; или (ii) получен в результате экспрессии в клетке хозяине и очищен от ассоциированных и загрязняющих белков. В общем случае это понятие относится к полипептиду, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, вместе с которыми он обычно встречается. Предпочтительно полипептид отделяют и от таких веществ как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используют для его очистки. Гетерологичный промотор - это понятие используется здесь для обозначения промотора,который в естественных условиях не ассоциирован с геном или с очищенной нуклеиновой кислотой. Гомологичный - это используемое здесь понятие является синонимом понятия идентичность и относится к подобию в последовательности двух белковых молекул или двух нуклеиновых кислот. Если положение в двух сравниваемых последовательностях занимает одна и та же мономерная субъединица основания или аминокислоты (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух пептидов занято лизином), то тогда соответствующие молекулы гомологичны по этому положению. Процент гомологичности между двумя последовательностями представляет собой результат деления числа парных или гомологичных положений в двух последовательностях на число сравниваемых положений и умножения на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях парные или гомологичные, то гомологичность этих двух последовательностей составляет 60%. В другом примере последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT имеют 50%-ную гомологию (парные 3 положения из общего числа, равного 6). В общем случае сравнение проводят таким образом, чтобы две последовательности сопоставлялись в положении, которое дает максимальную гомологию. Такое сопоставление может быть проведено с использованием, например, способа Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970),воплощаемого обычно в такие компьютерные программы как Align program (DNAstar, Inc.). Гомологичные последовательности объединяют идентичные или подобные аминокислотные остатки, когда подобные остатки представлены консервативными заменами или допустимыми точечными мутациями соответствующих аминокислотных остатков в соответственно сопоставленной последовательности. С этой точки зрения консервативная замена сопоставляемого остатка в последовательности представляет собой такие замены, которые по физическим 18 показателям или функционально подобны соответствующим сопоставляемым остаткам, например, при этом сохраняется размер, форма,электрический заряд, химические свойства,включая способность к образованию ковалентных или водородных связей, и тому подобное. В частности, предпочтение отдается таким консервативным замена, которые соответствуют критериям, определяемым для допустимой точечной мутации и описанным в работе Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed.Res. Foundation, Washington, D.C. (1978). Понятия хеджхог-белок или хеджхогполипептид которые могут заменять друг друга при их использовании, в рамках настоящего изобретения относятся к согласованной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или по крайней мере к части ее. Это понятие включает в себя хеджхог-полипептид или функциональный вариант хеджхог-полипептида, или гомолог хеджхог-полипептида, или функциональный вариант, который проявляет биологическую активность. В частности, сюда входит получение белков и их пептидильных фрагментов, которые могут быть представлены как агонистическими, так и антагонистическими формами, что будет освещено в специальном контексте. Используемое при этом понятие биологически активный фрагмент хеджхог-белка относится к фрагменту полной длины хеджхогполипептида, когда этот фрагмент проявляет свойства специфичного агониста или антагониста индуктивного отклика, медиатором которого служат естественные типы хеджхог-белков. Предпочтительно биологически активный фрагмент хедхог-белка представляет собой растворимую внеклеточную часть хеджхог-белка,когда растворимость относится к сравнимым по физиологическим показателям растворам. Примеры биологически активных фрагментов описаны в конвенционных заявках на международный патент 95/18856 и 96/17924. В предпочтительных вариантах соответствующие настоящему изобретению хеджхог-полипептиды связываются с пэтч-белком. Понятие соответствует чему-либо, отнесенное к определенной последовательности в полипептиде или в нуклеиновой кислоте, означает, что последовательность, о которой идет речь, идентична или гомологична соотносимой последовательности, о которой говорится как о соответствующей. Понятия пептид (пептиды), белок (белки) и полипептид (полипептиды) в представленных материалах заменяют друг друга. Понятия полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность также заменяют здесь друг друга. Понятия фрагмент хеджхог-белка и N-концевой фрагмент хеджхог-белка используются наравне с понятием хеджхог-белок. 19 Молекула хеджхог-белка имеет биологическую активность в том случае, если она имеет хотя бы одно из перечисленных далее свойств; (i) молекула отвечает критериям согласованности, определяемым последовательностью (SEQ ID NO: 4), и она способна связываться с ее рецептором в интегрированном виде или молекула кодирует в результате экспрессии полипептид, который имеет эти характеристики;(ii) в молекуле собраны определенные здесь для хеджхог-белка критерии согласованности или она кодирует в результате экспрессии полипептид, который имеет эти характеристики; и (iii) молекула может индуцировать активность щелочной фосфатазы в клетках С 3 Н 10 Т 1/2. В общем случае любой белок имеет биологическую активность, если белок проявляет в опытах invitro активность, свойства или характеристики,которые любой специалист в этой области может определить как соответствующие, сопоставимые или в разумных пределах предсказуемые по отношению к эффектам in vivo. Понятие гидрофобный относится к тенденции химических структурных единиц с неполярными атомами взаимодействовать с такими же атомами более предпочтительно, чем с водой или другими полярными атомами. Гидрофобные материалы чаще всего нерастворимы в воде. Натуральные продукты с гидрофобными свойствами включают в себя липиды,жирные кислоты, фосфолипиды, сфинголипиды,ацилглицерины, воски, стеролы, стероиды, терпены, простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, изопреноиды, ретиноиды, биотин и такие гидрофобные аминокислоты как триптофан,фенилаланин, изолейцин, лейцин, валин, метионин, аланин, пролин и тирозин. Химическая структурная единица гидрофобна или имеет гидрофобные свойства, если ее физические свойства определяются присутствием неполярных атомов. Это понятие включает в себя и липофильные группы. Понятие липофильная группа в данном контексте связанное с полипептидом, относится к группе, отмеченной высоким содержанием углеводородной составляющей, которая придает группе высокое сродство к липидным фазам. Липидная группа может быть, например, сравнительно длинноцепочечной алкильной или циклоалкильной (предпочтительно н-алкильной) группой с примерным числом атомов углерода от 7 до 30. Алкильная группа может заканчиваться гидроксильным или первичным аминным хвостом. Дополнительно это иллюстрируется тем, что липофильные молекулы включают в себя получаемые из природных источников и синтетические ароматические и неароматические структурные единицы, например,жирные кислоты, сложные эфиры и спирты,другие липидные молекулы, такие каркасные структуры, как адамантан и бак-минстерфуллерены, а также такие ароматические углеводоро 003739 20 ды, как бензол, перилен, фенантрен, антрацен,нафталин, пирен, хризен и нафтацен. Фраза внутренняя аминокислота относится к любой аминокислоте в пептидной последовательности, которая не является ни Nконцевой аминокислотой, ни С-концевой аминокислотой. Фраза поверхностная аминокислота относится к любой аминокислоте в пептидной последовательности, которая обращена к растворителю, когда белок свернут в свою нативную форму. Фраза внеклеточный регуляторный белок относится к любому белку, который секретируется клеткой или который связан с клеткой с ее внешней стороны и который при связывании с рецептором для этого белка на клеткемишени вызывает в клетке-мишени отклик. Эффективное количество, например,хеджхог-полипептида с учетам соответствующих способов лечения, относится к количеству полипептид в лекарственной форме, которое,будучи применено в качестве части предписанного режима дозировки, вызывает, например,изменение скорости клеточного деления и/или состояния дифференцировки клетки и/или изменение доли сохранившихся клеток в соответствии с клинически приемлемыми стандартами для лечения отклонений или для косметических целей. Пациент, или субъект, которого лечат соответствующим способом, может быть человеком или отличным от человека животным. Состояние роста клетки относится к скорости деления клетки и к состоянию дифференцировки клетки. Практикой настоящего изобретения рекомендуются, если не указано иное, обычные приемы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммуннологии, которыми владеют специалисты в этой области. Такие приемы описаны в литературе.II. Общие свойства изолированных хеджхог-белков. Полипептидная часть композиций хеджхог-белков может быть получена способом согласно изобретению с помощью разнообразных приемов, включающих в себя очистку содержащихся в природных субстратах белков, белков,полученных рекомбинантным способом и методами синтетической химии. Полипептидные формы хеджхог-лекарств предпочтительно происходят от хеджхог-белков позвоночных, например, они имеют соответствующие естественным хеджхог-белкам или их фрагментам последовательности из организмов позвоночных. Хотя следует отдавать должное и тому, что хеджхог-полипептид может соответствовать хеджхог-белку (или его фрагменту), который 21 содержится в каком-либо метазойном организме. Изолированные хеджхог-белки, используемые в соответствующих настоящему изобретению способах, представляют собой встречающиеся в природе или рекомбинантные белки семейства хеджхог-белков, и источниками для них могут служить как беспозвоночные, так и позвоночные (см. приведенные далее ссылки). Члены семейства хеджхог-белков позвоночных имеют гомологию с белками, которые кодируются геном Drosophila-хеджхог (hh) (33). В настоящее время комбинированный скрининг мышиной геномной и кДНК библиотек привел к идентификации трех hh двойников млекопитающих, относящихся к Соник хеджхог (Shh),Индиан хеджхог (Ihh) и Дезерт хеджхог (Dhh),которые есть также у других млекопитающих,включая человека, а также у рыб и у птиц. Другие члены включают в себя Мунрат хеджхог(Mhh), а также Соник hh цыплят и Соник hh рыбы зебры. Гены Shh мыши и цыплят, а также Ihh мыши кодируют гликопротеины, которые подвергаются расщеплению с образованием аминоконцевого фрагмента с массой около 20 кДа (см. фиг. 8) и карбоксиконцевого фрагмента с массой около 25 кДа. Наиболее предпочтительный фрагмент 20 кДа имеет согласованную последовательность SEQ ID NO: 4 и включает в себя аминокислотные последовательности SEQ IDNOS: 1-3. В рамках настоящего изобретения рассматриваются и другие разнообразные фрагменты, которые включают в себя структурную единицу 20 кДа. В число сообщений, посвященных этим последовательностям, а также их химическим и физическим свойствам, входят (3438); конвенционная заявка на международный патент 95/23223 (Jessell, Dodd, Roelink и Edlund), заявка на международный патент 95/18856 (Ingham, McMahon и Tabin) и заявка на международный патент 96/17924 (Beachy etal.). Семейство членов, которые могут найти применение в соответствующих изобретению способах, включает в себя любые из встречающихся в естественных условиях нативных хеджхог-белков, в том числе аллельные, филогенетические двойники или другие возможные варианты, полученные из естественных источников или полученные химическим путем,включая мутеины или мутантные белки, а также рекомбинантные формы и новые активные члены семейства хеджхог-белков. В частности, находят применение полипептиды, включающиеSEQ ID NOS: 1-4. Изолированные хеджхог-полипептиды,используемые в способе согласно изобретению,проявляют биологическую активность. Полипептиды включают аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60, 80, 90,95, 98 или 99% гомологична аминокислотной 22 последовательности из SEQ ID NOS: 1-4. Полипептид может также включать в себя практически ту же самую аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность в SEQ ID NOS: 1-4. Длину полипептида определяют не менее чем в 5, 10, 20, 50,100 или 150 аминокислот, в числе которых не менее 5, предпочтительно не менее 10, предпочтительнее не менее 20 и наиболее предпочтительно не менее 50, 100 или 150 соединенных вместе аминокислот из SEQ ID NOS: 1-4. Предпочтительные последовательности согласно включают в себя хеджхог-полипептидную последовательность, а также другие Nконцевые и/или С-концевые аминокислотные последовательности, или же они могут включать в себя всю хеджхог-последовательность аминокислот или ее фрагмент. Изолированный хеджхог-полипептид может также представлять собой рекомбинантный слитый белок, в составе которого есть первая хеджхог часть и вторая полипептидная часть, например, вторая полипептидная часть его имеет аминокислотную последовательность, не относящуюся к хеджхог-белку. Вторая полипептидная часть может быть, например, гистидиновой меткой, связывающим мальтозу белком,глутатион-Sтрансферазой, связывающим ДНК доменом или доменом, активирующим полимеразу. Соответствующие изобретению полипептиды включают в себя те из них, которые образуются в результате существования множественных генов, альтернативных эффектов транскрипции, альтернативных эффектов сплайсинга ДНК и альтернативных трансляционных и посттрансляционных эффектов. Полипептид может быть получен полностью синтетическим путем или он может образоваться в результате экспрессии в системе, например, в культивируемых клетках, что приводит практически к тем же самым посттрансляционным модификациям, которые имеют место при экспрессии белка в нативной клетке, или же в системе, которая образуется в результате пропуска посттрансляционных модификаций, имеющих место при экспрессии в нативной клетке. В предпочтительном варианте изолированный хеджхог-полипептид представляет собой хеджхог-полипептид с одной или с несколькими из следующих характеристик:(i) его последовательность, по крайней мере, на 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична аминокислотам из SEQ ID NOS: 1-4;(ii) N-концевом у него служит цистеин или его функциональный эквивалент;(iii) он может индуцировать активность щелочной фосфатазы в клетках С 3 Н 10 Т 1/2;(iv) идентичность его полной последовательности полипептиду SEQ ID NOS: 1-4 равна по крайней мере 50%, предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70, 80, 90 или 95%;(v) он может быть выделен из таких естественных источников как клетки млекопитающих;(vi) он может связываться или взаимодействовать с интегрированной системой и(vii) он гидрофобно модифицирован (то есть он имеет по крайней мере одну гидрофобную структурную единицу, присоединенную к полипептиду).III. Другие белки. Поскольку существуют приемы для встраивания цистеинового остатка (или его функционального эквивалента) в первичную полипептидную последовательность, в принципе любой белок может быть превращен в его гидрофобно модифицированную форму с использованием представленных здесь способов. Вирусные рецепторы, клеточные рецепторы и клеточные лиганды могут быть полезны в этом отношении, так как они типично связываются с клетками тканей, демонстрирующими многочисленные копии рецепторов. Применение могут найти вирусно-клеточные белковые рецепторы, из которых вместе могут быть образованы комплексы с помощью способов согласно изобретению, включая ICAM1, рецептор риновирусов; CD2, рецептор вируса ЭпштейнаБарр; CD4, рецептор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Другие белки включают в себя членов семейства молекул клеточной адгезии,например, ELAM-1 и VCAM-1 и VCAM-1b, а также их лимфоцитных двойников (лигандов); ассоциированных с лимфоцитами антигеновLFA1, LFA2 (CD2) и LFA3 (CD58), CD59 (второй лиганд CD2), членов семейства CD11/CD18 и такие самые поздние антигены как VLA4 и их лиганды. Иммуногены из различных патогенов (например, из бактериальных, грибковых, вирусных и других эукариотических паразитов) могут быть также использованы в качестве полипептидов в способах согласно изобретению. Бактериальные иммуногены включают в себя, не ограничиваясь этим, бактериальные источники,отвечающие за бактериальные формы пневмонии и пневмоцистную пневмонию. Паразитарные источники включают в себя паразита малярии Plasmodium. Вирусные источники включают в себя поксвирусы (например, оспу крупного рогатого скота, herpes simplex, цитомегаловирусы); аденовирусы; паповавирусы (например, вирусы, вызывающие образование папиллом); парвовирусы(например,аденоассоциированные вирусы); ретровирусы (например, HTLV I, HTLV II, HIV I и HIV II) и другие. Иммуноглобулины или их фрагменты могут также выступать в роли полипептидов, которые могут быть модифицированы в соответствии с настоящим изобретением. С использованием общепринятых способов (49) можно генерировать моноклональные Fab-фрагменты, узнающие специфические антигены, и использовать 24 индивидуальные Fab-домены в качестве функциональных единиц в соответствующих изобретению многомерных структурах. Таким образом можно использовать другие белки, включающие в себя гельсолин (50), цитокины, в число которых входят разнообразные интерфероны (интерферон-, интерферон- и интерферон-),разнообразные интерлейкины (например, IL-1, 2, -3, -4 и подобные им), факторы некроза опухоли- и -; колониестимулирующий фактор моноцитов (M-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий гранулоцитов/макрофагов (GMCSF), эритропоэтин, фактор роста из тромбоцитов (PDGF), а также гормоны человека и животных, включая гормоны роста и инсулин. В общем случае структура соответствующих настоящему изобретению модифицированных белков имеет общую формулу A-Cys-[Sp]B-[Sp]-X, где А означает гидрофобную структурную единицу, Cys означает цистеин или его функциональный эквивалент, [Sp] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность, В означает белок (который, необязательно может иметь еще одну спейсерную пептидную последовательность) и Х означает гидрофобную структурную единицу, связанную(необязательно через спейсерный пептид) с Сконцевым фрагментом белка или другим участком на поверхности белка, причем дериватизированный белок включает в себя по крайней мере один из А или X. Если Х представлен холестерином, тогда В может быть, а может и не быть хеджхог-белком. Как обсуждалось выше,роль спейсерного фрагмента состоит в том, чтобы обеспечить разделение между гидрофобной структурной единицей и остальной частью белка и тем самым облегчить образование связи гидрофобной структурной единицы (например,модифицированного N-концевого цистеина) с другой структурной единицей, которая может быть липидом или везикулой. Спейсер нужен также для того, чтобы затруднить взаимодействие модифицирующего фрагмента с белковой функцией. Длина спейсера может не превышать длины одной единственной аминокислоты. В общем случае предпочтение отдается пролинам и глицинам. В частности, предпочтительная разделяющая последовательность присутствует в Соник хеджхог-белке - это аминокислотная последовательность G-P-G-R.IV. Получение рекомбинантных полипептидов. Описываемые здесь изолированные полипептиды могут быть получены любым известным подходящим для этого способом. Такие способы простираются от прямых синтетических методик до конструирования последовательности ДНК, кодирующей последовательности изолированных полипептидов и приводящей 25 к экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. В одном из вариантов реализации рекомбинантного способа последовательность ДНК конструируют путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей естественный тип представляющего интерес белка. При желании такая последовательность может быть подвергнута сайт-специфическому мутагенезу для получения ее функционального аналога. См., например, (40) и патент США 4588585. Другой способ конструирования последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, может быть представлен химическим синтезом с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Дизайн таких олигонуклеотидов может быть предпочтительно основан на аминокислотной последовательности целевого полипептида, для этого предпочтительно выбирают такие кодоны, которые более благоприятны для клетки-хозяина, в которой будет продуцироваться представляющий интерес рекомбинантный полипептид. Стандартные способы могут быть применены для синтеза изолированной полинуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес изолированный полипептид. Например, полная аминокислотная последовательность может быть использована для конструирования ретранслированного гена (см.Maniatis et al., выше). Кроме того, возможен синтез олигомера ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует конкретный изолированный полипептид. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части целевого полипептида, и после этого объединить их. Такие индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат свешивающиеся 5'- или по 3'-участки для последующей комплементарной сборки. После сборки (синтетическим путем, сайтспецифическим мутагенезом или другим способом) мутантные последовательности ДНК, кодирующие представляющий интерес конкретный изолированный полипептид, внедряют в вектор экспрессии и оперативно соединяют с контролирующей экспрессию последовательностью, которая подходит для экспрессии белка в желательном хозяине. Правильность сборки может быть подтверждена секвенированием нуклеотида, ограниченным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. В этой области хорошо известно, что для получения высокого уровня экспрессии трансфектного гена в хозяине ген должен быть оперативно соединен с транскрибирующими и транслирующими последовательностями контроля экспрессии, которые функционально значимы в выбранном для экспрессии хозяине. 26 Выбор последовательности контроля экспрессии и вектора экспрессии зависит от выбора хозяина. Используется широкое разнообразие комбинаций из хозяина экспрессии и вектора. В качестве векторов экспрессии для эукариотических хозяев используются, например, векторы,включающие в себя последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса бычьей папилломы, аденовируса и цитомегаловируса. Могут быть использованы векторы экспрессии для бактерий-хозяев, включая такие известные бактериальные плазмиды, как плазмиды из Esherichia coli, в том числе pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды более широкого спектра хозяев, например, М 13 и фаги с однонитевыми ДНК. Предпочтительные векторы Е.Coli включают в себя векторы pL, содержащие pL промотор лямбда-фага (патент США 4874702), векторы рЕТ, содержащие промотор Т 7 полимеразы (Studier et al., Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990 1) и вектор pSP72(Kaelin et al., см. выше). Могут быть использованы и векторы экспрессии для дрожжевых клеток, например, включая 2 Т и центромерные плазмиды. В дополнение к этому в таких векторах может быть использовано широкое разнообразие контролирующих экспрессию последовательностей. В число таких используемых контролирующих экспрессию последовательностей входят контролирующие экспрессию последовательности, которые ассоциированы со структурными генами предыдущих векторов экспрессии. Примеры используемых контролирующих экспрессию последовательностей включают в себя, например, ранние и поздние промоторыSV40 или аденовируса, lac-систему, trp-систему,ТАС- или TRC-систему, область главного оператора и промотора фага лямбда, например, pL,контрольную область fd-белка оболочки, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промотеры кислой фосфатазы, например, Pho5, промотеры системы-спаривания дрожжей и другие системы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов прокариотических и эукариотических клеток и их вирусов, а также их разнообразные комбинации. Любой подходящий хозяин может быть использован для количественного получения описанных здесь изолированных хеджхогполипептидов, включая бактерии, грибки (в том числе дрожжи), растения, насекомых, млекопитающих или другие подходящие клетки животных или линии клеток, а также трансгенные животные и растения. В частности, в число этих хозяев могут входить хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как штаммы Е.coli, Pseudomonas, Bacillus,Streptomyces, грибки, дрожжи (например, Hansenula), такие клетки насекомых как Spodopterafrugiperda (SF9) и High Five (см. пример 1), 27 такие клетки животных как клетки яичника китайского хомяка (СНО), такие клетки мыши, какNS/O-клетки, клетки зеленой африканской обезьяны COS1, COS 7, BSC 1, BSC 40 и ВМТ 10, а также клетки человека и клетки растений. Следует понимать, что не все векторы и контролирующие экспрессию последовательности будут функционировать одинаково хорошо при экспрессии данного изолированного полипептида. Точно так же не все хозяева будут функционировать одинаково хорошо с той же самой системой экспрессии. Однако специалист в этой области может провести селекцию среди этих векторов, контролирующих экспрессию систем и хозяев без чрезмерных экспериментирований. Например, для получения изолированного представляющего интерес полипептида в широкомасштабной культуре животных нужно контролировать число копий вектора экспрессии. В этой области хорошо известны амплифицируемые векторы. См., например, (41) и патенты США 4470461 и 5122464. Такое оперативное присоединение последовательности ДНК к контролирующей экспрессию последовательности включает в себя обеспечение трансляции стартового сигнала в правильную рамку считывания по ходу последовательности ДНК. Если полученная в результате экспрессии определенная последовательность ДНК не начинается с метионина, то стартовый сигнал приведет к появлению дополнительной аминокислоты (метионина), локализованной на N-конце продукта. Если гидрофобная структурная единица должна присоединиться кN-концу содержащего метионин белка, то белок можно использовать непосредственно в соответствующей изобретению композиции. Тем не менее, поскольку N-конец белка предпочтительно должен быть представлен цистеином(или его функциональным эквивалентом), метионин должен быть удален перед использованием. Способы удаления таких N-концевых метионинов с полипептидов, которые были получены вместе с ними при экспрессии, известны. Например, некоторые хозяева и условия ферментации позволяют проводить удаление практически всех N-концевых метионинов in vivo. Другие хозяева нуждаются в удалении Nконцевого метионина in vitro. Такие способы invivo и in vitro хорошо известны в этой области. Белки, продуцируемые трансформированными хозяевами, могут быть очищены в соответствии с любым подходящим для этого способом. Такие стандартные способы включают в себя хроматографию (например, ионоoбменную,аффинную и гель-хроматографию на колонке,центрифугирование, способ дифференциальной растворимости или любые другие стандартные приемы для очистки белков. Для иммуноаффинной хроматографии (см. пример 1) такой белок как Соник хеджхог может быть изолирован путем связывания его на аффинной колонке, 003739 28 содержащей фиксированные на стационарном носителе антитела, выработанные на Соник хеджхог или на родственный ему белок. Альтернативно аффинные метки, например, гексагистидин, домен связывания мальтозы, последовательность оболочки гриппа и глутатион-Sтрансфераза, могут быть присоединены к белку для того, чтобы упростить его очистку при пропускании через соответствующую аффинную колонку. Изолированные белки могут быть также охарактеризованы физически с использованием таких приемов как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография. А. Продуцирование фрагментов и аналогов. Фрагменты изолированного белка (например, фрагменты SEQ ID NOS: 1-4) могут быть также эффективно продуцированы рекомбинантными способами, протеолитическим ферментированием или путем химического синтеза с использованием известных специалисту в этой области способов. В рекомбинантных способах внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены в результате удаления одного или нескольких нуклеотидов с одного конца (для концевого фрагмента) или с обоих концов (для внутреннего фрагмента) последовательности ДНК, которая кодирует изолированный хеджхог-полипептид. Экспрессия мутантной ДНК производит полипептидные фрагменты. Ферментация с откусывающими концевые кусочки эндонуклеазами также может генерировать молекулы ДНК, которые кодируют набор фрагментов. Молекулы ДНК, которые кодируют фрагменты белка, могут быть также получены в результате неизбирательных разрывов, ограниченной ферментации или комбинации этих методик. Фрагменты белка могут быть получены прямо из целостного белка. Пептиды могут быть подвергнуты специфическому расщеплению протеолитическими ферментами, в число которых входят плазмин, тромбин, трипсин,химотрипсин или пепсин, но и не только они. Каждый из этих ферментов специфичен к типу атакуемых пептидных связей. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых происходит от основной аминокислоты, обычно от аргинина или от лизина. Пепсин и химотрипсин катализируют гидролиз пептидных связей ароматических аминокислот, например, триптофана, тирозина и фенилаланина. Альтернативные наборы полученных расщеплением белка фрагментов образуются в результате предотвращения расщепления в том месте, на которое нацелен протеолитический фермент. Например,реакция аминогруппы кислоты лизина с этилтрифтортиоацетатом в умеренно основном растворе приводит к блокированным аминокислотным остаткам, и соединенная с ними пептидная связь уже не чувствительна к гидролизу трипсином. 29 Белки могут быть модифицированы так, чтобы образовались пептидные связи, которые чувствительны к протеолитическим ферментам. Например, алкилирование цистеиновых остатков-галогенэтиламинами делает пептидные связи гидролизующимися трипсином (51). В дополнение к этому могут быть использованы химические реагенты, которые расщепляют пептидные цепи по специфическим остаткам. Например,бромциан расщепляет пептиды по метиониновым остаткам (52). В соответствии с изложенным, при обработке белков различными комбинациями модификаторов, протеолитическими ферментами и/или химическими реагентами белки могут быть разделены на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагментов или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Фрагменты могут быть также синтезированы химическим путем с использованием таких известных в этой области приемов как твердофазный синтез Меррифильда с F-moc или tBOC химизмом. Merrifield. Recent Progress inHormone Research 23: 451 (1967). Далее обсуждаются примеры методик первого рода, которые позволяют получать и испытывать фрагменты и аналоги. Эти или аналогичные способы могут быть использованы для получения и скрининга фрагментов и аналогов изолированного полипептида (например, хеджхог), который, как можно показать, обладает биологической активностью. В качестве примера может быть приведен способ выявления биологической активности у фрагментов и аналогов хеджхог-белка, представленный в примере 3. В. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: неспецифические способы. Варианты аминокислотных последовательностей белка (например, варианты SEQ IDNOS: 1-4) могут быть получены в результате неспецифического мутагенеза ДНК, которая кодирует белок или определенную его часть. Используемые для этого способы включают в себя PCR-мутагенез и насыщающий мутагенез. Библиотека случайных вариантов аминокислотных последовательностей может быть также получена при синтезе набора вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Способы генерирования вариантов аминокислотных последовательностей конкретного белка с использованием измененной ДНК и пептидов хорошо известны в этой области. Следующие далее примеры таких способов не могут служить основанием для сужения объема притязаний настоящего изобретения, но прежде всего служат для иллюстрации показательных приемов. Лица, имеющие обычную специализацию в этой области, поймут, что для этого могут быть использованы и другие способы.(или другая полимераза) используется для вве 003739 30 дения случайных мутаций в клонированный фрагмент ДНК (42). Условия PCR выбирают таким образом, чтобы точность синтеза ДНК была понижена Taq-ДНК полимерами с использованием, например, соотношения dГТФ/dАТФ,равного пяти, и добавления Мg2+ к PCRреакции. Пул амплифицированных фрагментов ДНК внедряют в подходящий вектор клонирования для получения библиотек случайных мутаций. Насыщающий мутагенез: один способ описан в общем виде в (43). Кратко, эта техника включает в себя генерирование мутаций в результате химической или радиационной обработки однонитевой ДНК in vitro или синтеза нити кДНК. Частота мутаций модулируется интенсивностью обработки, и в основном могут быть получены все возможные замены оснований. Мутагенез вырожденных олигонуклеотидов: библиотека гомологичных пептидов может быть генерирована из набора вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Химический синтез вырожденных последовательностей может быть выполнен на автоматическом синтезаторе ДНК, и синтетические гены после этого присоединяют к подходящему вектору экспрессии. См., например, (44, 45) и Itakura et al. Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland(A.G.Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981. С. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: направленные способы. Избирательный, или направленный, мутагенез приводит к получению специфических последовательностей или мутаций в специфических частях полинуклеотидной последовательности, кодирующей изолированный полипептид, для получения вариантов, которые включают в себя делеции, вставки или замещения остатков известной аминокислотной последовательности изолированного полипептида. Точки мутаций могут быть изменены индивидуально или в сериях, например, путем: (1) замещения сначала сохранившихся аминокислот и затем с большим выбором радикалов, в зависимости от достигнутых результатов; (2) удаления целевых остатков или (3) встраивания остатков того же самого или другого класса, примыкающих к локализованному месту, или путем комбинации вариантов 1-3. Очевидно, что такие сайт-направленные способы представляют собой один из путей, по которым N-концевой цистеин (или функциональный эквивалент) может быть введен в данную полипептидную последовательность, чтобы в нем появился сайт для присоединения гидрофобной структурной единицы. Сканирующий аланиновый мутагенез: этот способ определяет местонахождение тех остатков или участков целевого белка, которые пред 31 ставляют собой предпочтительные участки для мутагенеза (46). В аланиновом скрининге выбирают остаток или группу остатков-мишеней и замещают на аланин. Это замещение может влиять на взаимодействие аминокислоты с соседними аминокислотами и/или с окружающим водным или мембранным окружением. Свойства тех из них, у которых имеется функциональная чувствительность к замещениям, после этого могут быть улучшены за счет введения дополнительных или других вариантов по месту замещения или вместо него. Мутагенез с помощью олигонуклеотидов: одна из версий этого способа может быть использована для получения вариантов ДНК с замещением, делецией или со вставкой (47). Кратко, желаемую ДНК изменяют путем гибридизации олигонуклеотидного праймера, кодирующего мутацию ДНК, и матрицы ДНК, которая в типичном случае представляет собой однонитевую форму плазмиды или фага, содержащую неизмененную или дикого типа последовательность ДНК матрицы целевого белка (например,хеджхог-белка). После гибридизации используют ДНК-полимеразу для того, чтобы сделать вторую и комплементарную нить ДНК матрицы,в составе которой будет оли-гонуклеотидный праймер и которая будет кодировать выбранное изменение в желаемой последовательности ДНК. В общем случае используют олигонуклеотиды, длина которых составляет не менее 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет содержать от 12 до 15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице с обеих сторон от мутации. Это обеспечивает то, что олигонуклеотид будет правильно гибридизован с однонитевой ДНК молекулы матрицы. Кассетный мутагенез: для этого способа(48) требуется плазмида или иной вектор, которые содержат предназначенную для мутации белковую субъединицу ДНК. Кодон (кодоны) в белковой субъединице ДНК идентифицируют и встраивают единственный сайт рестриктирующей эндонуклеазы с каждой из сторон от идентифицированного мутантного сайта (мутантных сайтов), используя описанный выше направленный на олигонуклеотид способ мутагенеза. После этого плазмиду разрезают по этим сайтам с целью ее линеаризации. Двухнитевой олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но содержащий желаемую мутацию (желаемые мутации), синтезируют с использованием стандартных процедур. Две нити синтезируют раздельно и после этого гибридизуют вместе, используя стандартные способы. Этот двухнитевой олигонуклеотид представляет собой кассету и у него есть 3'- и 5'-концы, которые совместимы с концами линеаризованной плазмиды так, что непосредственно по ним их можно соединить. Теперь плазмида содержит желаемую мутантную белковую субъединицу последовательности ДНК. 32 Комбинаторный мутагенез: по одной из версий данного способа (Ladner et al., международная заявка на патент 88/06630) аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выравнивают, предпочтительно до достижения максимально возможной степени гомологии. Все аминокислоты, которые проявляются в данном положении выровненной последовательности,могут быть выбраны для создания вырожденного набора комбинаторных последовательностей. В результате комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот создается пестрая библиотека и она кодируется пестрой библиотекой генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может быть ферментативным путем присоединена к генной последовательности так, чтобы стала возможной экспрессия вырожденного набора потенциальных последовательностей в индивидуальные белки, или альтернативно, в набор белков, содержащих полный набор вырожденных последовательностей.D. Другие варианты изолированных полипептидов. В настоящее изобретение включены такие изолированные молекулы, как аллельные варианты, естественные мутанты, индуцированные мутанты и белки, кодированные ДНК, гибридизующейся в более или менее жестких условиях с образованием нуклеиновой кислоты, которая кодирует такие полипептиды как N-концевой фрагмент Соник хеджхог (SEQ ID NO:1), и полипептиды, специфично связанные антисыворотками с хеджхог-пептидами, в первую очередь антисыворотками с активными центрами или связывающими сайтами хеджхог. Все описанные здесь варианты предназначены для (i) сохранения биологической функции исходного белка и (ii) сохранения способности к связыванию с гидрофобной структурной единицей (например, с липидом). Соответствующие настоящему изобретению способы показывают также использование фрагментов, предпочтительно биологически активных фрагментов, или аналогов такого изолированного пептида как хеджхог. В первую очередь биологически активный фрагмент или аналог имеет некоторую активность in vivo илиin vitro, которая характерна для пептида, показанного в SEQ ID NOS: 1-4, или для другого изолированного хеджхог, встречающегося в естественных условиях. Наиболее предпочтительно, чтобы гидрофобно модифицированный фрагмент или аналог имел не менее 10%, предпочтительно 40% или еще больше, или же наиболее предпочтительно не менее 90% активности Соник хеджхог (см. пример 3) в любом опыте in vivo или in vitro. Аналоги могут отличаться от встречающегося в естественных условиях изолированного белка аминокислотной последовательностью или таким образом, что последовательность в 33 этом не участвует, или же и тем и другим. Наиболее предпочтительные соответствующие настоящему изобретению полипептиды имеют предпочтительно не затрагивающие последовательность модификации, включающие химическую дериватизацию in vivo или in vitro (например, по N-концу), а также возможными изменениями являются ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, амидирование, карбоксилирование или гликозилирование. Другие аналоги включают в себя такой белок как Соник хеджхог или его биологически активные фрагменты, последовательность которых отличается от согласованных последовательностей естественного типа (например, SEQID NO: 4) одной или более консервативными заменами аминокислот или же одной или более неконсервативными заменами аминокислот, а также делециями или вставками, которые не лишают изолированный белок биологической активности. Консервативные замены в типичном случае включают в себя замену одной аминокислоты другой с подобными характеристиками, например, это замена в следующих группах: валин, аланин и глицин; лейцин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин,фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные(основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замены могут быть хорошо известны работникам с обычной специализацией. Например, для консервативной замены аминокислоты аланина могут быть взяты любой из D-аланина, глицина, бета-аланина,L-цистеина и D-цистеина. Для лизина заменой может быть любой из D-лизина, аргинина, Dаргинина, гомоаргинина, метиони-на, Dметионина, орнитина или D-орнитина. В общем случае можно ожидать, что замены приведут к изменениям в функциональных свойствах изолированных полипептидов в тех случаях, когда (i) полярный остаток, например,серина или треонина, заменяют (или замещают) гидрофобным остатком, например, лейцином,изолейцином, фенилаланином или аланином; (ii) цистеиновый остаток заменяют (или замещают) любым другим остатком (см. пример 10); (iii) остаток с электроположительной боковой цепью, например, лизина, аргинина или гистидина, заменяют (или замещают) остатком с электроотрицательной боковой цепью, например,глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой; или (iv) остаток с объемной боковой цепью, 003739 34 например, фенилаланина, заменяют (или замещают) остатком без такой боковой цепи, например, глицином. Другие аналоги, используемые в рамках соответствующих изобретению способов, представлены модификациями, которые повышают стабильность пептидов. Такие аналоги могут содержать, например, одну или несколько непептидных связей (которые заменяют пептидные связи) в пептидной последовательности. Также включаются аналоги, в составе которых есть остатки, отличные от естественных Lаминокислот, такие, как D-аминокислоты или же не встречающиеся в природе или синтетические аминокислоты, например, бета- или гаммааминокислоты и циклические аналоги. Включение D- вместо L-аминокислот в изолированный хеджхог-полипептид может повысить его стабильность по отношению к протеазам. См. патент США 5219990 supra. Понятие фрагмент, примененное по отношению к изолированному хеджхог-аналогу,может включать такое малое как одна единственная аминокислота при условии, что при этом сохраняется биологическая активность. В нем может быть, по крайней мере, около 20 остатков, более характерно, по крайней мере, примерно 40 остатков, предпочтительно, по крайней мере, около 60 остатков в длину. Фрагменты могут быть получены способами, которые известны специалисту в этой области. Способность кандидата на роль фрагмента проявлять биологическую активность изолированного хеджхог может быть оценена описанными здесь способами, которые известны специалисту в этой области.V. Получение гидрофобных производных. Авторы изобретения обнаружили, что повышение общей гидрофобной природы сигналирующего белка, например, хеджхог-белка,приводит к повышению биологической активности этого белка. Эффективность такого сигналирующего белка как хеджхог может быть повышена путем: (а) химической модификации,например, добавлением гидрофобной структурной единицы к сульфгидрильной и/или к аминогруппе N-концевого цистеина (примеры 8 и 9); (b) замены N-концевого цистеина гидрофобной аминокислотой (пример 10); или (с) замены N-концевого цистеина другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например, добавлением гидрофобной структурной единицы по месту замены. В добавление к этому модификация белка,например хеджхог-белка, по внутреннему остатку на поверхности белка гидрофобной структурной единицей путем: (а) замены внутреннего остатка гидрофобной аминокислотой; или (b) замены внутреннего остатка другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например, добавле 35 нием гидрофобной структурной единицы по месту замены (см. пример 10), сохраняет или увеличивает биологическую активность белка. В добавление к этому модификация белка,например хеджхог-белка, по С-концу гидрофобной структурной единицей путем: (а) замены Сконцевого остатка гидрофобной аминокислотой; или (b) замены С-концевого остатка другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например,добавлением гидрофобной структурной единицы по месту замены, сохраняет или увеличивает биологическую активность белка. Имеется широкий спектр липофильных структурных единиц, которыми могут быть дериватизированы хеджхог-полипептиды. Липофильная группа может быть представлена, например, сравнительно длинной алкильной цепью или циклоалкильной группой (предпочтительно это н-алкильная группа) с числом атомов углерода приблизительно от 7 до 30. Алкильная группа может заканчиваться гидроксильным или первичным аминным хвостом. Дополнительно это иллюстрируется тем, что липофильные молекулы включают в себя получаемые из природных источников и синтетические ароматические и неароматические структурные единицы, например, жирные кислоты, сложные эфиры и спирты, другие липидные молекулы,такие каркасные структуры как адамантан и бакминстерфуллерены, а также такие ароматические углеводороды как бензол, перилен, фенантрен, антрацен, нафталин, пирен, хризен и нафтацен. В частности, в качестве липофильных молекул могут найти применение алициклические углеводороды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и другие липидные и фосфолипидные структурные единицы, воски, холестерин, изопреноиды, терпены и полиалициклические углеводороды, включая адамантан и бакминстерфуллерены, витамины, полиэтиленгликоль или олигоэтиленгликоль, ди(С 1-С 18)-алкиловые эфиры фосфорной кислоты,-О-СН 2-СН(ОН)-O-(C12-C18)-алкил, и в частности, конъюгаты с пиреновыми производными. Липофильная структурная единица может быть представлена липофильным красителем, пригодным для использования его в рамках настоящего изобретения, включая, но не ограничивая этим, дифенилгексатриен, Найл красный,N-фенил-1-нафтиламин, продан, лауродан, пирен, перилен, родамин, родамин В, тетраметилродамин, Техас красный, сульфородамин,перхлорат 1,1'-дидодецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина, октадецилродамин В иProbes Inc. В число других примеров липофильных структурных единиц входят группы алифатических карбонильных радикалов, включая 1- или 2-адамантилацетил,3-метиладамантан-1 003739[2.2.2]-окт-5-ен-2-карбонил, цис-5-норборненэндо-2,3-дикарбонил, 5-норборнен-2-илацетил,(1R)-(-)-миртентанацетил, 2-норборнанацетил,анти-3-оксотрицикло-[2.2.1.02,6]-гептан-7 карбонил, деканоил, додеканоил, додеценоил,тетрадекадиеноил, дециноил или додециноил. Структуры примеров гидрофобных модификаций показаны на фиг. 12. Если подходящая аминокислота недоступна в специфическом положении, то можно использовать сайтнаправленный мутагенез для того, чтобы поместить на это место реакционноспособную аминокислоту. В число реакционноспособных аминокислот входят цистеин, лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин, треонин, тирозин, аргинин, метионин и триптофан. Мутагенез можно использовать для того, чтобы поместить реакционноспособную аминокислоту в N- или в С-конец или же во внутреннее положение. Например, авторы изобретения обнаружили, что существует возможность химической модификации N-концевого цистеина биологически активного белка, такого как хеджхог-белок,или полного элиминирования N-концевого цистеина при все еще полном сохранении биологической активности белка, при условии, что модифицирующая или замещающая химическая структурная единица имеет гидрофобные свойства. Авторы изобретения нашли, что усиление биологической активности хеджхог-белка грубо коррелирует с гидрофобностью модификации. В дополнение к усилению активности белка модифицирование или замена N-концевого цистеина исключает нежелательные перекрестные реакции и/или модифицирования цистеина, которые могут протекать при получении, очистке,приготовлении лекарственных форм и при хранении белка. Тиольная группа N-концевого цистеина очень реакционноспособна, что связано с близостью к -аминогруппе, которая снижает значение рКа цистеина и усиливает протонную диссоциацию и образование реакционноспособного тиолятного иона при нейтральном или кислом значении рН. Авторы изобретения показали, что заменаN-концевого цистеина хеджхог-белка гидрофобной аминокислотой приводит к получению белка с повышенной эффективностью в опытах по передаче сигнала в клетках. Такой основанный на замене цистеина подход исключает проблему супрессии или нежелательных превращений цистеина, которые могут протекать при получении, очистке, приготовлении лекарственных форм и при хранении белка. Общий характер такого подхода подтверждается тем, что авторы изобретения нашли три различных гидрофобных аминокислоты (фенилаланин, изо 37 лейцин и метионин), каждая из которых приводит к более активной форме хеджхог. Следовательно, замещение цистеина какой-либо иной гидрофобной аминокислотой может привести к образованию активного белка. К тому же, поскольку авторы изобретения обнаружили корреляцию между гидрофобностью аминокислоты или ее химической модификации и эффективностью соответствующего модифицированного белка в опыте на С 3 Н 10 Т 1/2 (например, ФенМет, длинноцепочечная жирная кислотакороткоцепочечная), можно предвидеть, что добавление более чем одной гидрофобной аминокислоты к хеджхог-последовательности приведет к еще большему повышению эффективности белка, чем это достигалось добавлением одной единственной аминокислоты. В действительности, добавление двух следующих один за другим остатков изолейцина к N-концу Соник хеджхог человека приводит к повышению эффективности в опыте на С 3 Н 10 Т 1/2 по сравнению с мутантом, содержащим один единственный добавленный изолейцин (см. пример 10). Тогда, добавляя гидрофобные аминокислоты кN-концу или к С-концу хеджхог-белка, к находящейся на поверхности петле или к некоторой комбинации положений, можно ожидать образования более активной формы белка. Замещенная аминокислота не должна быть одной из 20 обычных аминокислот. Имеются сообщения о замещающих неестественных аминокислотах в специфических сайтах в белках (78, 79), и это может привести к положительным результатам,если аминокислота имеет более гидрофобный характер, устойчива к протеолитической атаке или может быть использована для того, чтобы способствовать направлению хеджхог-белка в определенный сайт in vivo, что может сделать его активность более эффективной или более избирательной. Неприродные аминокислоты могут быть встроены в специфические сайты в белках во время трансляции in vivo, и сообщалось о достигнутых успехах в создании in vivo систем, которые будут позволять осуществление производства таких модифицированных белков в более широких масштабах. Неожиданно оказалось, что белок, например хеджхог-белок, модифицированный в соответствии с настоящим изобретением, сохраняет свою биологическую активность. Во-первых, Nконцевой цистеин сохраняется во всех известных последовательностях хеджхог-белков,включая рыб, лягушек, насекомых, птиц и млекопитающих. Вследствие этого разумно было ожидать, что свободный сульфгидрил Nконцевого цистеина играет важную роль в строении или в активности белка. Вовторых,хеджхог-белки, у которых отсутствует Nконцевой цистеин, по причине протеолитического расщепления или мутационной замены на гидрофильные аминокислоты (например, на аспарагиновую кислоту или на гистидин), неак 003739 38 тивны в опытах на клетках С 3 Н 10 Т 1/2, как это описано в примере 3. Существует много модификаций Nконцевого цистеина, которые защищают тиол и прибавляют гидрофобную структурную единицу. Эти модификации обсуждаются далее более подробно. Специалист в данной области может определить, какая модификация наиболее благоприятна для конкретного случая терапевтического использования. Факторы, влияющие на принятие такого решения, включают в себя стоимость и простоту производства, очистки и перевода в лекарственную форму, сюда входит растворимость, стабильность, эффективность,фармакодинамика и кинетика, безопасность,иммуногенные свойства и тканевая избирательность. А. Химические модификации первичной аминокислотной последовательности. Химическая модификация N-концевого цистеина с целью защиты тиола, сопровождающаяся активацией гидрофобной структурной единицей, может быть проведена специалистом в этой области многими путями. Сульфгидрильная структурная единица с тиолятным ионом в качестве активной функциональной единицы представляет собой наиболее реакционноспособную функциональную группу в белке. Существует много реагентов, которые взаимодействуют с тиолом скорее, чем с какой-либо другой из групп. См. Chemistry of Protein ConjugationRaton, FL, 1991). От тиола N-концевого цистеина, например, такого, как в хеджхог-белках,можно ожидать более высокой реакционной способности, чем от цистеина внутри последовательности. Это связано с близостью к аминогруппе, которая снижает значение рКa тиола, что приводит к более высокой степени протонной диссоциации и к повышению реакционной способности тиолятного иона при нейтральном или кислом значении рН. В добавление к этому, цистеин на N-конце структуры с большей вероятностью находится в экспонированном положении, чем два других цистеина в хеджхог-последовательности, которые погребены в белковой структуре. Авторы изобретения показали, что N-концевой цистеин оказывается единственной модифицированной аминокислотой после реакции в течение 1 ч с Nэтилмалеимидом при рН 5,5 (см. пример 9) и после реакции в течение 18 ч с Nизопропилиодацетамидом при рН 7,0 (см. пример 9). Другими примерами таких способов может быть реакция с другими -галогенацетильными соединениями, с ртутьорганическими соединениями, дисульфидными реагентами и с другими N-замещенными малеимидами. Многочисленные гидрофобные производные этих активных агентов имеются в продажеWI), фенилдисульфид (Aldrich) и N-пиренмалеимид (Molecular Probes, Eugene OR или их можно легко синтезировать (например, Nалкилиодацетамиды (84), N-алкилмалеимиды(85) и ртутьорганические соединения (86). Авторы изобретения показали, что N-концевой цистеин Соник хеджхог человека может быть специфично модифицирован N-изопропилиодацетамидом и что гидрофобно-модифицированный белок в два раза более эффективен в опыте СЗН 10 Т 1/2, чем немодифицированный белок (см. пример 9). Ожидается, что модификация Shh длинноцепочечным производным алкилиодацетамида приведет к модифицированному белку с еще большим усилением эффективности. Такие N-алкилиодацетамиды могут быть легко синтезированы специалистом в этой области с использованием поступающих в продажу исходных продуктов. Другой аспект, касающийся реакционной способности N-концевого цистеина, состоит в том, что он может принимать участие в химических превращениях, которые уникальны для его конфигурации 1,2-аминотиола. Одним из примеров является реакция с тиоэфирными группами с образованием N-концевой амидной группы в результате быстрого сдвига тиоэфира с S на N. Эта реакционная химия может соединять вместе синтетические пептиды и ее можно использовать для добавления одной или нескольких природных или неприродных аминокислот или гидрофобных групп через подходящий для этого активированный пептид. Другой демонстрируемый здесь пример представлен реакцией с альдегидом для получения тиазолидинового аддукта. Многочисленные гидрофобные производные тиоловых эфиров (например, сложные эфиры С 2-С 24 насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и кофермента A (Sigma Chemical Co., St.Louis МО), альдегиды (например, масляный альдегид,н-дециловый альдегид и нмиристиловый альдегид (Aldrich и кетоны (например, 2-, 3- и 4-деканон (Aldrich имеются в продаже или могут быть легко синтезированы(87, 88). Аналогичным образом могут быть приготовлены тиоморфолиновые производные, что показано на примере описанной в примере 9 химии 1-бром-2-бутанона, из разнообразных галогенкетонов в качестве исходных продуктов(88). Поскольку нахождение альтернативных путей для модификации тиола в N-концевом цистеине или любого цистеина в белке не представляет сложности, авторы изобретения не хотят быть связаны специфическими представленными здесь примерами. В белке -амин более предпочтителен для модифицирования по сравнению с другими аминами в белке, потому что его более низкое значение рКа обеспечивает и более высокое содержание реакционноспособной непротонированной формы при нейтральных и кислых рН. 40 Авторы изобретения показали, что модификация N-концевого амина амидной группой на основе длинноцепочечной жирной кислоты с сохранением свободной тиольной группы в цистеине, активирует хеджхог-белок более чем на два порядка величины (см. пример 8). Вследствие этого ожидается, что химизм, который может быть направлен на предпочтительное взаимодействие с N-концевым амином, должен быть использован для повышения эффективности хеджхог-белка. Арилгалогениды, альдегиды и кетоны, ангидриды кислот, изоцианаты, изотиоцианаты, имидоэфиры, галогениды кислот, Nгидроксисукцинимидильные соединения (например, сульфо-NHS-ацетат), нитрофениловые эфиры, ацилимидазолы и другие активированные эфиры известны как соединения, реагирующие с аминными функциями. При замещении N-концевого цистеина в хеджхог-белке некоторыми другими аминокислотами могут быть использованы другие химические способы для добавления гидрофобной структурной единицы к N-концу. Один из примеров представлен помещением серина или треонина на N-конец, окислением этой аминокислоты с образованием альдегида и после этого сочетанием белка с химической структурной единицей, содержащей 1,2-аминотиольную структуру (например, с цистеином). Вторым примером может служить помещение гистидина на N-конец для сочетания с С-концевой тиокарбоновой кислотой. Химическая модификация других аминокислот Существуют специальные химические способы для модификации многих других аминокислот. В соответствии с этим другой путь синтеза более активной формы хеджхог может быть представлен химическим присоединением гидрофобной структурной единицы не к Nконцевому цистеину, а к другой, отличной от него, аминокислоте в хеджхог. Если подходящая аминокислота недоступна в желаемом положении, то можно использовать сайтнаправленный мутагенез для помещения реакционноспособной аминокислоты в такой сайт в хеджхог-структуре, не затрагивая при этом Nили С-концы или же другое положение. В число реакционноспособных аминокислот входят цистеин, лизин, гистидин, аспарагиновая кислота,глутаминовая кислота, серин, треонин, тирозин,аргинин, метионин и триптофан. В соответствии с этим цель создания более гидрофобной формы хеджхог может быть достигнута многими химическими средствами, и авторы изобретения не желают ограничивать себя конкретным химизмом или сайтом для модификации, поскольку полученные результаты подтверждают общий характер такого подхода. Хеджхог-полипептид может быть связан с гидрофобной структурной единицей рядом способов, включая средства для химического сочетания или генную инженерию. 41 Для иллюстрации далее приводится большое число химических средств для образования межмолекулярных связей, которые известны специалистам в этой области. В рамках настоящего изобретения предпочтительными средствами для образования межмолекулярных связей являются гетеробифункциональные образователи межмолекулярных связей, которые могут быть использованы для связывания хеджхогполипептида и гидрофобной структурной единицы постадийным способом. Гетеробифункциональные образователи межмолекулярных связей обеспечивают возможность для разработки более специфичных способов сочетания для сопряжения в белки, снижая при этом вероятность таких нежелательных побочных реакций как образование гомопротеиновых полимеров. В этой области известно множество гетеробифункциональных образователей межмолекулярных связей. В их число входят: сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1 карбоксилат (SMCC), м-малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимидный эфир (MBS), Nсукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат(SPDP), сукцинимидил 6-[3-(2-пиридилдитио) пропионат]гексаноат (LC-SPDP). Эти средства для образования межмолекулярных связей с Nгидроксисукцинимидными структурными единицами могут быть получены как Nгидроксисульфосукцинимидные аналоги, которые в общем случае показывают повышенную растворимость в воде. В дополнение к этому,вместо алкильных производных можно синтезировать такие средства для образования межмолекулярных связей, в связывающей цепи которых есть дисульфидные мостики, чтобы снизить число разрывов в связывающих цепях in vivo. В дополнение к гетеробифункциональным образователям межмолекулярных связей существует большое число других средств для образования межмолекулярных связей, включая гомобифункциональные и фотореактивные образователи межмолекулярных связей. Дисукцинимидилсуберат(ВМН) и диметилпимелинимидат 2 НСl (DMP) могут служить в качестве примеров используемых гомобифункциональных средств для образования межмолекулярных связей, а бис-[-(4 азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED) иN-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат (SANPAH) служат в качестве примеров фотореактивных межмолекулярных связывателей, подходящих для использования в рамках настоящего изобретения. Последний обзор по технике сочетания белков, Means et al.(1990) Bioconjugate Chemistry, 1:2-12, включен в приведенный здесь список литературы. Особенно удобный для использования класс перечисленных выше гетеробифункциональных межмолекулярных связывателей, реагирующих с первичной аминогруппой, представляют собой N-гидроксисукцинимид (NHS) или его растворимый в воде аналог Nгидроксисульфосукцинимид (sulfo-NHS). Первичные амины (эпсилонгруппы лизина) при щелочных значениях рН депротонируются и реагируют в результате нуклеофильной атаки с эфирами NHS или сульфо-NHS. Эта реакция приводит к образованию амидной связи и выделению NHS или сульфо-NHS в виде побочного продукта. Другая реакционноспособная группа, которая может быть использована в качестве части гетеробифункционального межмолекулярного связывателя, представлена реакционноспособной тиольной группой. Обычно реакционноспособные тиольные группы взаимодействуют с малеимидами, галогенами и пиридилдисульфидами. Малеимиды избирательно реагируют со свободными сульфгидридами (цистеиновые остатки) в течение минут в слабокислых или нейтральных средах (рН 6,5-7,5). Галогены (иодацетильные функции) реагируют с НS-группами при физиологических значениях рН. Обе эти реакционноспособные группы приводят к образованию стабильных тиоэфирных связей. Третий компонент гетеробифункциональных межмолекулярных связывателей представляет собой разделительный фрагмент, или мостик. Мостик - это структура, которая соединяет два реакционно-способных конца. Наиболее наглядным атрибутом мостика является эффект стерического препятствия. В некоторых примерах более длинный мостик может более легко обеспечить разделяющее пространство, которое необходимо для связывания двух сложных биомолекул. Например, SMPB имеет промежуток 14,5 Ангстрем. Получение белок-белковых конъюгатов с использованием гетеробифункциональных реагентов представляет собой двухстадийный процесс, включающий в себя реакцию амина и реакцию сульфгидрила. Для первой стадии, реакции амина, выбранный белок должен иметь первичный амин. Это может быть эпсилон-амин лизина или первичный альфа-амин, находящийся на N-конце большинства белков. Белок не должен содержать свободные сульфгидрильные группы. В случае, когда оба предназначенные для конъюгации белка содержат свободные сульфгидрильные группы, один из белков может быть модифицирован таким образом, чтобы все сульфгидрилы были блокированы с использованием, например, N-этилмалеимида (см. Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263, эта ссылка приведена в списке литературы). Реактив Эллмана может найти применение для расчета ко 43 личества сульфгидрилов в конкретном белкеAnal. Biochem. 94:75, эта ссылка приведена в списке литературы). Реакционный буфер не должен содержать посторонние амины и сульфгидрилы. Реакционный буфер должен поддерживать рН 7,0-7,5. Этот интервал значений рН предохраняет малеимидные группы от реакции с аминами, сохраняя малеимидную группу для второй реакции с сульфгидрилами. Межмолекулярные связыватели, содержащие эфиры NHS, имеют ограниченную растворимость в воде. Их следует растворять в минимальном количестве органического растворителя (ДМФ или ДМСО) до введения межмолекулярного связывателя в реакционную смесь. Межмолекулярный связыватель и растворитель образуют эмульсию, которая обеспечивает протекание реакции. Лучше растворимы в воде эфиры сульфоNHS, поэтому их можно добавлять сразу в реакционный буфер. Буферов с высокой ионной силой следует избегать, поскольку они имеют тенденцию к высаливанию эфиров сульфо-NHS. Для того чтобы предотвратить потерю реакционной способности в результате гидролиза,межмолекулярный связыватель прибавляют к реакционной смеси сразу после растворения раствора белка. Реакция может протекать более эффективно в концентрированных растворах белков. Чем более щелочное рН реакционной смеси, тем выше скорость реакции. Скорость гидролиза эфиров NHS и сульфо-NHS также повышается с ростом значений рН. Повышенные температуры повышают скорость обеих реакций гидролиза и ацилирования. По завершении реакции первый белок уже активирован по сульфгидрильной реакционной структурной единице. Активированный белок может быть выделен из реакционной смеси простой гель-фильтрацией или диализом. Для проведения второй стадии реакции образования межмолекулярных связей, сульфгидрильной реакции, липофильная группа, выбранная для реакции с малеимидами, активированными галогенами или с пиридилдисульфидами, должна содержать свободный сульфгидрил. Альтернативно, надо модифицировать первичный амин с добавлением сульфгидрила. Во всех случаях буфер должен быть деаэрирован во избежание окисления сульфгидрильных групп. Для хелатирования вызывающих окисление металлов, которые могут присутствовать в буфере, можно добавлять EDTA. Буферы не должны содержать какие-либо соединения с сульфгидрильными группами. Малеимиды избирательно реагируют с НSгруппами в средах со значениями рН от слабокислых до нейтральных (6,5-7,5). Нейтрального 44 рН достаточно для реакции с участием галогенов и пиридилдисульфидов. В этих условиях малеимиды в общем случае реагируют с НSгруппами в течение минут. Более длительное время взаимодействия требуется для галогенов и пиридилдисульфидов. Первый реагирующий по сульфгидрилу белок, полученный на аминной стадии реакции,смешивают с содержащей сульфгидрил липофильной группой в условиях подходящего буфера. Конъюгаты могут быть выделены из реакционной смеси такими способами как гельфильтрация или диализ. Примерами активированных липофильных структур для конъюгации служат N-(1-пирен) малеимид, 2,5-диметоксистильбен-4'-малеимид,эозин-5-малеимид, флуоресцеин-5-малеимид, N(4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил) малеимид, бензофенон-4-малеимид, 4-диметиламинофенилазофенил-4'-малеимид(DABMI),тетраметилродамин-5-малеимид, тетраметилродамин-6-малеимид, малеимидное производное Родамина красного ТМ С 2, трифторацетат N-(5 аминопентил)малеимида, трифторацетат N-(2 аминоэтил)малеимида, малеимидное производное Орегон зеленого ТМ 488, N-(2-2-4 азидо-2,3,5,6-тетрафтор)бензоил)амино)этил) дитио)этил)малеимид (TFPAM-SSI), 2-(1-(3 диметиламинопропил)индол-3-ил)-3-(индол-3 ил)малеимид (бисиндолилмалеимид, GF109203X).(DACM), AlexaTM 488 С 5 малеимид, AlexaTM 594 С 5 малеимид, натриевая соль N-(1-пирен) малеимида, 2,5-диметоксистильбен-4'-малеимида,эозин-5-малеимида, флуоресцеин-5-малеимида,N-(4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил)малеимида, бензофенон-4-малеимида, 4-диметиламинофенилазофенил-4'-малеимида, метансульфонат 1-(2-малеимидилэтил)-4-(5-(4-метоксфенил)оксазол-2-ил)пиридиния, тетраметилродамин-5-малеимид,тетраметилродамин-6 малеимид, малеимидное производное Родамина красного ТМ С 2, N-(5-аминопентил)-малеимид,N-(2-аминоэтил)малеимид, N-(2-2-4-азидо 2,3,5,6-тетрафтор)бензоил)амино)этил)дитио) этил)малеимид, 2-(1-(3-диметиламинопропил)индол-3-ил)-3-(индол-3-ил)малеимид N-(7-диметиламино-4-метилкумарин-3-ил)малеимид(DACM), 11 Н-бензо[а]флуорен, бензо[а]-пирен. В одном из вариантов хеджхог-полипептид может быть дериватизирован с использованием пиренмалеимида, который может быть приобретен у фирмы Molecular Probes (Eugene, Oreg.),например, это N-(1-пирен)малеимид или 1 пиренметилиодацетат (PMIA эфир). Фиг. 1 иллюстрирует, что пиреновые производные хеджхог-белка имеют спектр активности, которая примерно на два порядка по величине превосходит активность немодифицированной формы белка. 45 В. Получение пептидных гидрофобных производных. В соответствии с настоящим изобретением, белок может быть также модифицирован с использованием гидрофобного пептида. Используемый здесь термин пептид включает в себя последовательность, состоящую не менее чем из одного аминокислотного остатка. Предпочтительно пептид имеет длину в пределах от одной аминокислоты до 18-26 аминокислот,причем последнее значение - это типичная длина пронизывающего мембрану сегмента белка. Аминокислоты для создания пептида с гидрофобным характером выбирают преимущественно из следующих далее гидрофобных аминокислот: фенилаланин, изолейцин, лейцин, валин, метионин, триптофан, аланин, пролин и тирозин. Гидрофобный пептид может также содержать неприродные аналоги аминокислот с гидрофобным характером или D-аминокислоты,пептидные связи, N-концевое ацетилирование или другие особенности, которые снижают чувствительность пептида к протеолизу. Способы замещения неприродными аминокислотами в специфических сайтах протеинов известны (78,79). В общем случае гидрофобный пептид присоединяют по различным сайтам белка. Одним из сайтов может быть N-концевой остаток. Альтернативно N-концевой остаток замещают гидрофобным пептидом. В другом варианте гидрофобный пептид присоединяют к С-концевому остатку белка. Альтернативно С-концевой остаток замещают гидрофобным пептидом. С-конец может быть представлен нативной С-концевой аминокислотой, но это может быть и С-конец усеченного белка, и тогда гидрофобный пептид присоединяется к последней С-концевой аминокислоте усеченной формы, о которой и в этом случае можно говорить как о С-конце. Усеченный хеджхог-белок сохраняет активность,если в нативной С-концевой последовательности удалено до одиннадцати аминокислот. Гидрофобный пептид может быть также встроен между N-концевым остатком и внутренним остатком, который непосредственно соседствует сN-концевым остатком, или между С-концевым остатком и остатком, который непосредственно соседствует с С-концевым остатком, или же между двумя внутренними остатками. В некоторых вариантах липофильная структурная единица представляет собой амфипатический полипептид, например, магаинин,цекропин, аттацин, мелиттин, грамицидин S,альфа-токсин Staph. aureus, аламетицин или синтетический амфипатический полипептид. Способствующие слиянию клеток оболочечные белки из вирусных частиц также могут быть подходящим источником амфипатических последовательностей для соответствующих хеджхог-белков. С. Получение липидных производных. 46 Другая форма белка, входящая в объем притязаний настоящего изобретения, представлена белком, который дериватизирован разнообразными липидными структурными единицами. В общем липид - это представитель гетерогенного класса гидрофобных соединений,характеризующихся переменной растворимостью в органических растворителях и нерастворимостью для большей части соединений в воде. Главный класс липидов, которые входят в объем притязаний настоящего изобретения,представлен жирными кислотами и стеринами(например, холестерином). Соответствующие настоящему изобретению производные белков содержат жирные кислоты, которые представлены циклическими, ациклическими (то есть с неразветвленной цепью) насыщенными или ненасыщенными монокарбоновыми кислотами. Представители насыщенных жирных кислот имеют общую формулу СН 3(СН 2)nСООН. Далее следует таблица со списком примеров некоторых жирных кислот, которые могут быть обычным образом дериватизированы с использованием обычных химических способов. Таблица 2. Примеры насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Насыщенные кислоты СН 3(СН 2)nСООН Значение n 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Ненасыщенные кислоты СН 3 СН=СНСООН СН 3(CH2)3 СН=СН(CH2)7COOH СН 3(СН 2)5 СН=СН(CH2)7COOH СН 3(СН 2)7 СН=СН(CH2)7COOH СН 3(СН 2)3(СН 2 СН=СН)2 Тривиальное название Масляная кислота Капроновая кислота Каприловая кислота Каприновая кислота Лауриновая кислота Миристиновая кислота Пальмитиновая кислота Стеариновая кислота Арахидиновая кислота Бегеновая кислота Лигноцериновая кислота Кротоновая кислота Миристолеиновая кислота Пальмитолеиновая кислота Олеиновая кислота Линолевая кислота Линоленовая кислота Арахидоновая кислота Звездочкаозначает жирную кислоту,которая обнаруживается в рекомбинантном хеджхог-белке, выделяемом из растворимого компонента. Другие липиды, которые могут быть присоединены к белку, включают в себя жирные кислоты с разветвленной цепью и липиды фосфолипидной группы, такие как фосфатидилинозиты (то есть, фосфатидилинозит-4-монофосфат и фосфатидилинозит-4,5-дифосфат), фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и такие изопреноиды, как фарнезильная или геранильная группы. Авторы изобретения показали, что модифицированные липидами хеджхог-белки могут быть выделены в чистом виде из натуральных 47 источников или же они могут быть получены химической модификацией растворимого немодифицированного белка. Для белка, выделенного в чистом виде из натурального источника,показано, что когда Соник хеджхог-белок человека полной длины (Shh), полученный в результате экспрессии в клетках насекомого и связанный с мембраной Shh, очищают от обработанных поверхностно-активным веществом клеток,используя для этого комбинацию хроматографиии на SP-сефарозе и иммуноаффинную хроматографию, то очищенный белок мигрирует на восстановительных SDS-PAGE гелях в виде единственной узкой полосы с наблюдаемой массой 20 кДа (см. пример 1). Растворимые и связанные с мембраной Shh-белки легко определяются способом ВЭЖХ с обращенной фазой,когда связанные формы элюируются позже в градиенте концентрации ацетонитрила (см. пример 1 и фиг. 3). Затем было показано, что Соник хеджхог человека связан с мембраной в двух формах, причем одна форма содержит холестерин и вследствие этого ее характеристики аналогичны данным, приводившимся ранее для хеджхог Drosophila (18), тогда как вторая, новая форма содержит продукты модификации как холестерином, так и пальмитиновой кислотой. Растворимую и связанную формы Shh анализируют методом масс-спектрометрии с электрораспылением, используя тройной квадрупольный масс-спектрометр, снабженный источником ионов с электрораспылением (пример 1), а также масс-спектрометр с жидкостной хроматографией (см. пример 1). Идентичность Nконцевого пептида, полученного при ферментации с эндопротеиназой Lys-C связанного Shh,подтверждена масс-спектрометрическим измерением MALDI PSD на MALDI массспектрометре с определением времени пролета. Сайт пальмитоилирования, определяемый комбинацией метода пептидного картирования и анализа последовательности, находится на Nконце белка (остаток 1 на последовательности зрелого белка в SEQ ID NOS: 1-4). Обе связанные формы одинаково активны в опыте на щелочной фосфатазе С 3 Н 10 Т 1/2, но, что интересно, обе они примерно в 30 раз более эффективны, чем растворимый Shh человека, у которого отсутствует связывание (связывания). Липидная модификация не оказывает существенного влияния на наблюдаемое сродство к связыванию со скоплением его рецепторов (фиг. 7). Далее была изучена полезность дериватизированных форм в ходе испытаний относительных эффективностей растворимого и связанного Shh в чистом виде или в присутствии анти-хеджхог нейтрализующего Mab 5E1 на клетках С 3 Н 10 Т 1/2 по результатам измерения индукции щелочной фосфатазы. Более того,относительная способность растворимого и связанного Shh связываться со скоплением рецепторов была подтверждена на пэтч-трансфициро 003739FACS (пример 3). Для модифицированного липидами хеджхог, полученного при химической модификации растворимого немодифицированного белка в опыте на С 3 Н 10 Т 1/2, показано, что пальмитиновая кислота и другие липиды могут быть добавлены к растворимому Shh для получения модифицированных липидами форм с повышенной эффективностью (пример 8). Авторами изобретения показано (примеры 1, 2 и 8), что тиол и -амин N-концевого цистеина участвуют в реакции дериватизации липидом. Не желая связывать себя какой-либо специальной теорией, авторы считают, что липидная модификация белков начинается с образования тиоэфирного промежуточного соединения, и после этого липидная структурная единица переносится на амин N-конца через стадию образования циклического интермедиата. В связи с этим, в общем случае, реакционно-способная липидная структурная единица может находиться в виде тиоэфиров насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот, таких, как тиоэфиры кофермента А. Такие материалы и их производные могут включать в себя, например, такие коммерчески доступные производные кофермента А как пальмитолеоилкофермент А, арахидоилкофермент А, арахидоноилкофермент А, лауроилкофермент А и подобные им. Эти материалы свободно поставляет Sigma Chemical Company (St.Louis, МО., 1998 catalog pp. 303-306). Влияние различных липидных структурных единиц на функциональную активность хеджхог-белка определено опытным путем (см. пример 8 и фиг. 10 и 11). Точно так же можно легко определить влияние разных липидных структурных единиц на функциональную активность других белков, таких как описанные в разделе III, с использованием способов, которые известны работникам с обычной специализацией. Например, функциональное исследование гельсолина (50), различных интерферонов (интерферон-, интерферон- и интерферон-),различных интерлейкинов (например, IL-1, -2,-3, -4 и подобные им), факторов- и - некроза злокачественных опухолей и других факторов роста, которые были модифицированы липидами в соответствии с настоящим изобретением,могут быть выполнены с использованием хорошо известных методик. Хотя мы установили химические способы,с помощью которых жирные кислоты могут быть присоединены к N-концевому цистеину хеджхог-белков, можно ожидать, что липиды могут быть присоединены по тем же самым или по другим сайтам через катализируемые ферментами реакции. Пальмитоилирование белковin vivo катализируется классом ферментов, известных как пальмитоил-СоА : протеин-3 пальмитоилтрансферазы. На очищенных фер 49 ментах было продемонстрировано ацилирование белковых субстратов in vitro (80, 81). Субстратные специфичности пальмитоилтрансферазных ферментов определены не очень хорошо; анализ сайтов пальмитоилирования клеточных и вирусных белков мало чего дает для согласования окружающих модифицированный цистеиновый остаток последовательностей, но подразумевает совместное присутствие лизинового или аргининового остатка на расстоянии двух аминокислот от цистеина и объемных гидрофобных аминокислот рядом с цистеином. Аминоконцевая последовательностьShh,CGPGRGFG, может совпадать с этой согласованной последовательностью и служить для узнавания сайта для пальмитоилирования. В качестве альтернативы может быть проведено миристоилирование аминного конца хеджхог-белков с использованием N-миристоилтрансферазы (NMT), большое количество этих ферментов было хорошо охарактеризовано как у млекопитающих (82), так и в дрожжах(83). Узнающий сайт для N-миристоилтрансферазы может быть встроен в N-концевую последовательность хеджхог для облегчения его узнавания ферментом. Обе эти стратегии требуют использования производных ацильных остатков жирных кислот и кофермента А в качестве субстратов, и эти производные использовались для неферментативного ацилирования жирными кислотами Соник хеджхог человека,как это описано в примере 8. Альтернативно,белок с встроенной последовательностью узнавания может быть миристоилирован в ходе экспрессии в подходящей для этого линии клеток. Другой способ модифицирования такого белка,как хеджхог, гидрофобной структурной единицей представляет собой создание сайта узнавания для присоединения изопреноидной группы к С-концу белка. Сайт узнавания для фарнезильного и геранил-геранильного присоединения известен и белок может быть модифицирован во время экспрессии в эукариотической клетке (Gelb et al., Cur. Opin. Chem. Biol. 2: 4048 (1998).VI. Многомерные белковые комплексы. Описываемые здесь гидрофобно модифицированные белки особенно легко поддаются переводу их в многомерные белковые комплексы. Многомерные белковые комплексы, соответствующие настоящему изобретению, включают в себя белки, которые могут быть прикреплены через их гидрофобную (например, липидную) структурную единицу к везикуле. Везикула может быть биологической мембраной естественного происхождения, отделенной от естественного материала, или же везикула может представлять собой синтетическую конструкцию. Предпочтительные везикулы представляют собой преимущественно сферические структуры, состоящие из амфифилов, например,из поверхностно-активных веществ или фосфо 003739 50 липидов. Липиды этих сферических везикул организованы обычно таким образом, что они образуют один или более структурных слоев,например, мультиламеллярные везикулы (многослойные подобные луковице оболочки из липидных бислоев, которые включают водный объем между бислоями) или мицеллы. В частности, липосомы - это маленькие сферические везикулы, составленные в первую очередь из различных типов липидов, фосфолипидов и вторичных липофильных компонент. Эти компоненты обычно организованы в бислойное образование, подобное липидной организации биологических мембран. В типичном случае полярный конец компоненты липидной или подобной липиду молекулы находится в контакте с окружающим раствором, обычно с водным раствором, тогда как неполярный, гидрофобный конец липида или подобной липиду молекулы находится в контакте с неполярным, гидрофобным концом другой липидной или подобной липиду молекулы. Образующаяся бислойная мембрана (то есть везикула) избирательно проницаема для молекул определенного размера, гидрофобности, формы и чистого заряда. В большинстве случаев везикулы по природе представляют собой липиды или они подобны липидам, хотя существуют альтернативные липосомные бислойные образования, включающие в себя поверхностноактивное вещество с липидом или с холестерином. Липосомным везикулам может быть в частности отдано предпочтение, поскольку они нашли широкое применение в терапии, диагностике, в промышленности и в торговле. Их используют для доставки молекул, которые не очень хорошо растворимы в воде, или когда желательно направленное по времени высвобождение. По причине их селективной проницаемости для многих химических соединений липосомы находят применение в качестве средств доставки для лекарственных средств и биологических материалов. В соответствии с этим, дериватизированные липидами белки, например,хеджхог, могут стать многомерными, будучи интегрированы в липидный бислой липосомных везикул. По достижении целевого сайта липосомы могут деградировать (например, при действии ферментов желудочно-кишечного тракта) или они могут слиться с мембранами клеток. Известны различные способы получения таких везикул как липосомы. Хорошо известно производство фосфолипидных везикул (53). Имеется общий обзор по обычно используемым для этого способам (54). Наиболее известны из них (1) ультразвуковая обработка раствора, содержащего липиды, за которой иногда следует выпаривание или лиофильная сушка и регидратация (см. например, Stryer, Biochemistry, pp. 290-291, FreemanCo., New York, (1988), и(55); (2) гомогенизация липидного раствора,иногда при высоком давлении и с большим уси 51 лием диспергирования (см., например, патент США 4743449, опубликован 10 мая 1988, и патент США 4753788, опубликован 28 июня 1988); (3) гидратация, иногда сопровождающаяся ультразвуковой обработкой высушенной пленки образующих везикулы липидов, когда липидная пленка получена выпариванием раствора липида, растворенного в органическом растворителе (см., например, патент США 4452747, опубликован 5 июня 1984, патент США 4895719, опубликован 23 января 1990,и патент США 4946787, опубликован 7 августа 1990); (4) лиофильная сушка или упаривание и регидратация (см., например, патент США 4897355, опубликован 30 января 1990, европейский патент 267050, опубликован 5 ноября 1988, патент США 4776991, опубликован 11 октября 1988, европейский патент 172007,опубликован 19 февраля 1986, и заявка на патент АвстралииAU-A-48713/85, опубликован 24 апреля 1986); инъекция или инфузия раствора липида в растворителе в водную среду или обратный процесс (см., например, (56), патент США 4921757, опубликован 1 мая 1990, патент США 4781871, опубликован 1 ноября 1988, заявка на международный патент 87/02396, опубликована 24 марта 1988 и патент США 4895452, опубликован 23 января 1990);(6) распылительная сушка (см., например, заявка на патент АвстралииAU-A-48713/85,опубликована 24 апреля 1986 и патент США 4830858, опубликован 16 мая 1989); (7) фильтрация (см., например, заявка на международный патент 85/01161); (8) выпаривание с обращением фаз, см., например, (57); и (9) комбинации приведенных выше способов, см., например,(58) и (59). Предпочтительные липиды и подобные липидам компоненты, подходящие для использования при получении везикул, включают в себя фосфолипиды, смеси фосфолипидов, полярные липиды, нейтральные липиды, жирные кислоты и их производные. Предпочтительные липиды характеризуются тем, что, будучи диспергированы в воде в чистом виде при температуре выше температуры липидного перехода,они находятся в липидной эмульсионной фазе. В некоторых вариантах липид содержит одну единственную алифатическую цепь с числом атомов углерода более 12, которая может быть насыщенной или ненасыщенной или может иметь другие замещения. В число подходящих липидов входят сложноэфирные, спиртовые и кислотные формы таких жирных кислот как стеарат, олеиновая кислота, линолевая кислота,арахидат, арахидоновая кислота и другие кислоты с одной алифатической цепью. Другие кандидаты включают в себя сложно-эфирные,спиртовые и кислотные формы ретинолов, в частности, ретинола и ретиноевой кислоты. В число других предпочтительных липидов входят фосфатидилхолин (PC), фосфатидил 003739 52 глицерин (PG) и их производные, полученные синтетически или выделенные из различных натуральных источников. В некоторых вариантах везикулы могут быть стерически стабилизированы за счет встраивания полиэтиленгликоля (PEG) или головных PEG-групп синтетического фосфолипида (PEG, конъюгированный с дистеароилфосфатидилэтаноламином (DSPE), см., например,(61. Предпочтение отдается поверхностноактивным веществам, которые хорошо смешиваются, например, это Tween, Triton, додецилсульфат натрия (SDS), лаурелсульфат натрия или октилгликозид натрия. Предпочтительные поверхностно-активные вещества образуют мицеллы при добавлении к водному раствору выше температуры фазового перехода поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества могут состоять из одной или более алифатических цепей. Эти алифатические цепи могут быть насыщенными, ненасыщенными или содержать различные виды замещений, например, это может быть этоксилирование; в типичном случае алифатическая цепь содержит более 12 атомов углерода. В дополнение к этому в число подходящих поверхностно-активных веществ входят лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеилили стеарилсаркозин, линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеиламидопропил-, миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лаурамидопропил); миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилдиметиламин; натрийметилкокоил- или динатрийметилолеилтаурат; а также продукты серии MONAQUAT (Mona Indusries, Inc., Paterson, N.J.), см. также пример 4. Предпочтительными стеролами и эфирами стеролов, которые подходят для использования при получении многомерных белковых комплексов, являются холестерин, (PC), фосфатидилглицерин (PG) и их производные, полученные синтетически или выделенные из различных натуральных источников. В некоторых вариантах везикулы могут быть стерически стабилизированы за счет встраивания полиэтиленгликоля (PEG) или головных PEG-групп синтетического фосфолипида (PEG, конъюгированный с дистеароилфосфатидилэтаноламином (DSPE), см., например,(61. Предпочтение отдается поверхностноактивным веществам, которые хорошо смешиваются, например, это Tween, Triton, додецилсульфат натрия (SDS), лаурелсульфат натрия или октилгликозид натрия. Предпочтительные поверхностно-активные вещества образуют мицеллы при добавлении к водному раствору выше температуры фазового перехода поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества могут 53 состоять из одной или более алифатических цепей. Эти алифатические цепи могут быть насыщенными, ненасыщенными или содержать различные виды замещений, например, это может быть этоксилирование; в типичном случае алифатическая цепь содержит более 12 атомов углерода. В дополнение к этому в число подходящих поверхностно-активных веществ входят лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеилили стеарил-саркозин, линолеил-, миристилили цетил-бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеиламидопропил-, миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например,лаурамидопропил); миристамидопропил-, пальмамидопропилили изостеарамидопропилдиметиламин; натрийметилкокоил- или динатрийметилолеилтаурат; а также продукты серии MONAQUAT(Mona Indusries, Inc., Paterson, N.J.), см. также пример 4. Предпочтительными стеролами и эфирами стеролов, которые подходят для использования при получении многомерных белковых комплексов, являются холестерин, холестанол,сульфат холестерина и другие аналоги и производные холестерина. Тот факт, что везикула может включать в себя множество различных липидов и поверхностно-активных веществ,позволяет с большой гибкостью подходить к конструированию связанных комплексов белоквезикула с желаемыми свойствами. Например,можно получать везикулы, которые связывают различное число белков при изменении липидного состава исходного материала для создания более крупных везикул или путем повышения процентного содержания фосфатидилинозитольных липидов в везикуле.VII. Практическая ценность. В общем случае описываемые здесь модифицированные белки могут найти применение для лечения тех же самых медицинских состояний, для лечения которых могут быть использованы и немодифицированные формы белков. Правда, описываемые здесь гидрофобно модифицированные белки показывают иногда значительные улучшения по сравнению с немодифицированными формами. Во-первых, их повышенная эффективность позволяет проводить лечение меньшими количествами белка и в более короткие временные сроки. Это может быть важно как для системного применения, так и для применения на ЦНС. Во-вторых, замена Nконцевого цистеина на менее реакционноспособную аминокислоту допускает более простое оформление производства, приготовления лекарственных форм и хранения белка для клинического использования. В-третьих, фармакодинамика белка при гидрофобной модификации изменяется и это позволяет белкам локализоваться недалеко от места введения, что приводит к повышению их безопасности за счет ми 003739 54 нимизации системного воздействия и к росту эффективности за счет увеличения локальной концентрации. Соответствующие изобретению белки могут также найти применение в диагностических композициях и в способах для распознавания соответствующих им рецепторов. В качестве примера по первому пункту служит то, что время полупревращения хеджхог при его системном введении очень мало и для достижения лечебного отклика на белок требуются многократные инъекции. Более высокая эффективность модифицированных форм и возможность приготовления липосомных лекарственных форм дают средства для достижения эффекта при меньшем числе медикаментозных воздействий. При применении на ЦНС более высокая эффективность обеспечивает возможность инъекционного введения адекватного количества белка в малых объемах непосредственно в ЦНС. Важность второго пункта иллюстрируется обнаружением авторами изобретения того, чтоN-концевой цистеин в хеджхог очень чувствителен к химической атаке, будь то с образованием химического аддукта или по схеме окислительной димеризации с другим хеджхог-белком. Для предотвращения этого при очистке используются специальные буферы и приемы, а на конечной стадии получения лекарственной формы используется дитиотреитол. Эти меры предосторожности требуют тщательного изучения эффектов буфера в лекарственной форме на подопытных животных. И в качестве примера по третьему пункту: чем более ограничена область, на которую распространяется белок из точки его введения, тем выше локальная концентрация. Такая повышенная локальная концентрация может приводить к более специфичным клиническим откликам во время лечения неврологических расстройств после непосредственной инъекции в соответствующую область головного или спинного мозга. Точно так же модифицированные белки могут быть использованы для локального введения в места перелома костей для помощи в лечении этих переломов, в половые железы для лечения нарушений в репродуктивной сфере,внутрь глаза для лечения нарушений зрения и под кожу для лечения дерматологических состояний и для стимуляции местного роста волос. Таким образом, локализация гидрофобномодифицированных белков в месте введения снижает возможность нежелательного системного воздействия на другие ткани и органы. Для терапевтического использования соответствующие настоящему изобретению гидрофобно-модифицированные белки вводят в состав фармацевтически приемлемых стерильных,изотонических лекарственных форм, которые могут вводиться стандартными средствами, хорошо известными в этой сфере. Лекарственные формы - это предпочтительно жидкости или это 55 могут быть лиофилизованные порошки. Предполагается, что терапевтическое введение, например, многомерных белковых комплексов,может распространяться и на липосомы с описываемыми здесь производными белков. Специалист с обычными познаниями в данной области отдает себе отчет в том, что в конкретном случае введения дозировка и клиническое применение соответствующего настоящему изобретению гидрофобно-модифицированного белка будет изменяться в зависимости от конкретного белка и его биологической активности. В качестве единственного примера применения соответствующего настоящему изобретению белка в терапевтическом контексте, терапевтические гидрофобно-модифицированные хеджхог-белки могут быть введены пациентам,страдающим от разнообразных неврологических расстройств. Способность хеджхог-белка регулировать нейрональную дифференциацию в ходе развития нервной системы, а также предположительно и во взрослом состоянии, показывает, что от гидрофобно-модифицированного хеджхог вполне можно ожидать упрощения контроля над нейронами взрослого человека по отношению к поддержанию жизнедеятельности,функционирования и контроля над процессом старения нормальных клеток; по отношению к восстановительным и регенеративным процессам в поврежденных клетках, также по отношению к предупреждению дегенерации и преждевременной гибели, в основе которой лежит утрата дифференциации в определенных патологических условиях. В свете этого представленные гидрофобно-модифицированные хеджхогкомпозиции при лечении способом локальной инфузии могут предотвращать и/или снижать остроту неврологических состояний, причиной которых являются (i) острое, подострое или хроническое заболевание нервной системы,включая травматическое повреждение, химическое повреждение, сосудистое повреждение и дефицит (такие, как ишемия при ударе) вместе с инфекционным и вызванным злокачественной опухолью повреждением; (ii) старение нервной системы, включая болезнь Альцгеймера; (iii) хронические нейродегенеративные заболевания нервной системы, включая болезнь Паркинсона,хорею Хантингтона, боковой амилотрофический склероз и подобные им заболевания; (iv) хронические иммунологические заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз. Гидрофобно-модифицированный белок может также вводиться инъекционным путем в спинномозговую жидкость, например, для того, чтобы бороться с недостаточностью клеток мозга,или же в лимфатическую систему или в ток крови, когда требуется направить его на другие ткани или органы с системно-специфическими нарушениями. 56 Соответствующие настоящему изобретению хеджхог-композиции могут быть использованы для спасения, например, различных нейронов от гибели, вызванной повреждением, а также для управления воспроизведением таких нейронов после повреждения такого рода. Такое повреждение является следствием состояний,включающих в себя, но не ограничиваемых этим, инфарктную травму ЦНС, инфекцию, метаболическое заболевание, дефицит питательных веществ и действие токсических агентов(например, при лечении цисплатиной). Некоторые хеджхог-белки делают неопластически или гиперпластически трансформированные клетки постмитотическими или апоптотическими. Поэтому такие композиции могут использоваться для лечения, например, злокачественных глиом,медулобластом и нейроэктодермальных опухолей. Эти белки могут быть также связаны с обнаруживаемыми метками, например, с флуороскопически и радиографически непрозрачными веществами, и тогда их вводят субъекту для того, чтобы получить изображение тканей, в которых идет экспрессия хеджхог-рецепторов. Белки могут быть также связаны с такими веществами как пероксидаза хрена, и тогда они могут найти применение в качестве иммуноцитохимических красителей, позволяющих визуализировать области хеджхог-лиганд-положительных клеток в гистологических срезах. Соответствующие настоящему изобретению гидрофобно модифицированные белки в чистом виде или в виде мультивалентных белковых комплексов могут быть использованы для специфического нацеливания медицинской терапии на рак и опухоли, в которых идет экспрессия хеджхогрецепторов. Такие материалы могут стать более эффективными для лечения рака при использовании их в качестве средств для доставки антинеопластических лекарств, токсинов и цитоцидных радионуклидов, например иттрия 90. Токсин может быть также сопряжен с гидрофобно модифицированным хеджхог (или с везикулами, содержащими его мультивалентные комплексы) для селективного нацеливания и уничтожения отзывающихся на хеджхогклеток, таких, как опухоль с экспрессией хеджхог-рецептора (хеджхог-рецепторов). Могут быть использованы и другие токсины, известные специалистам в этой области. В числе таких токсинов можно назвать, не ограничиваясь этим, экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный токсин и сапорин. Этот подход может оказаться успешным, поскольку экспрессия хеджхогрецептора (рецепторов) идет в очень ограниченном числе тканей. Другой подход к такой лекарственной терапии состоит в применении меченного радиоизотопами гидрофобно-модифицированного белка(или его мультивалентного комплекса). Такие радиационномеченные соединения будут предпочтительно 57 нацеливать радиоактивность на сайты в клетках,где идет экспрессия рецептора (рецепторов) белка, обходя нормальные ткани. В зависимости от используемого радиоизотопа радиация, излучаемая реактивно меченным белком, который связан с раковой клеткой, может также убивать расположенные рядом злокачественные раковые клетки, в которых экспрессия рецепторов белка не идет. Возможно применение самых разных радионуклидов. Радиоактивный иод (например 131I) был успешно применен с моноклональными антителами против CD20, присутствующего в В-клетках лимфом (63). Предназначенные для использования в терапии белковые композиции переводят в лекарственные формы, а дозировку устанавливают в соответствии с хорошо зарекомендовавшей себя медицинской практикой, принимающей во внимание нарушение, являющееся объектом терапии, состояние индивидуального пациента, место высвобождения изолированного полипептида, способ его введения и другие известные практикующему специалисту факторы. Лекарственное средство может быть приготовлено для введения путем смешения белка, содержащей белок везикулы или дериватизированного комплекса с требуемой степенью чистоты с физиологически приемлемыми носителями (то есть с носителями, которые не токсичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях). Предполагается, что локальное поступление по месту будет первым путем для терапевтического введения соответствующего настоящему изобретению белка. Также предполагается внутривенное введение или введение через катетер или через другие хирургические трубочки. Альтернативные пути включают таблетки и подобные формы, поступающие в продажу пульверизаторы для жидких лекарственных форм, а также ингаляцию лиофилизованных или аэрозольных лекарственных форм. Жидкие лекарственные формы могут использоваться после возвращения их в это состояние из порошкообразных лекарственных форм. Доза для введения зависит от свойств везикулы и используемого белка, например, от его способности к связыванию и от времени полупревращения в плазме in vivo, от концентрации везикул и белка в лекарственной форме, от способа введения, от места и скорости поступления, от клинической переносимости данного пациента, от болезненного состояния, поразившего пациента и так далее, насколько это входит в компетенцию врача. В общем случае предпочтительны дозы от примерно 5 х 10-7 до 5 х 10-9 молей/л белка на пациента за прием, хотя доза зависит от природы белка. В ходе следующих одно за другим введений могут быть применены различные дозировки. 58 Настоящее изобретение направлено также на фармацевтическую форму, которая включает хеджхог-белок, модифицированный в соответствии с настоящим изобретением, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В одном из вариантов лекарственная форма включает также везикулы. Соответствующие изобретению гидрофобно модифицированные хеджхог-белки могут найти применение и в способах генной терапии. Для нейродегенеративных нарушений доступны некоторые модельные опыты на животных, результаты которых, как считается, имеют некоторую ценность при экстраполяции их на клинику. Для болезни Паркинсона модельные опыты включают предупреждение или выздоровление у грызунов или у приматов, когда нигрально-стриарный дофаминэргический путь нарушается системным введением МРТР или местным (внутричерепным) введением 6 гидроксидофамина [6-OHDA], двух селективных дофаминэргических токсинов. Специфическими модельными опытами были: модельные опыты на получавших МРТР мышах (64); модельные опыты на получавших МРТР приматах(мартышка или резус) (65); а также модельные опыты на крысах с односторонним разрушением, вызванным 6-OHDA (66). Для ALS (боковой амиотрофический склероз) модельные опыты включали лечение некоторых линий мышей,которые показывают спонтанную дегенерацию двигательных нейронов, включая мышей wobbler (67) и pmn (68), а также трансгенных мышей с экспрессией мутированного гена супероксидазы дисмутазы человека (hSOD), который связывают с семейной ALS (69). Для повреждений спинного мозга наиболее распространенный модельный опыт включает контузионное повреждение крыс, вызванное падением калиброванного груза или повреждение жидкостью(гидродинамическое) (70). Для Хантингтона модельный опыт включает защиту от разрушения эксцитотоксином (NMDA, хинолиновая кислота, каиновая кислота, 3-нитропропионовая кислота, АМРА) полосатого тела у крыс (71,72). В последнее время был также описан модельный опыт на трансгенных мышах с избыточной экспрессией huntingtin гена человека с повторением размноженного тринуклеотидного фрагмента(73). Для рассеянного склероза у мышей и у крыс индуцируют ЕАЕ иммунизацией МBР (основной белок миелина) или пассивным переносом Т-клеток, активированных МВР (74). Для Альцгеймера целесообразным модельным опытом на мелких грызунах является определение защиты от разрушения fimbria-fornix у крыс(септальное разрушение), главного пучка нервов, обеспечивающих холинэргическую иннервацию гиппокампа (75), а также использование трансгенных мышей с избыточной экспрессией бета-амилоидного гена человека. Для периферических нейропатий целесообразным модель 59 ным опытом является защита от потери проводимости периферических нервов, вызванной такими химиотерапевтическими средствами, как таксол, винкристин и цисплатин на мышах и крысах (76). Настоящее изобретение далее будет представлено более подробно на следующих, не ограничивающих объем притязаний примерах. Пример 1. Соник хеджхог человека подвергается липидной модификации при экспрессии в клетках насекомых. А. Экспрессия Соник хеджхог человека. Готовят кДНК для Соник хеджхог (Shh) человека полной длины в виде фрагмента 1,6 кб(подарок Дэвида Бамкрота из Ontogeny, Inc.,Cambridge MA). Сайты 5' и 3' NotI, находящиеся непосредственно по бокам Shh открытой рамки считывания, добавляют мутагенезом с удалением одного сайта, используя для этого наборNotI фрагмент, несущий полную длину Shh кДНК, субклонируют в вектор экспрессии насекомого, pFastBac (Life Technologies, Inc.). Рекомбинантный бакуловирус генерируют с использованием процедуры, поставляемой LifeTechnologies, Inc. Полученный вирус используют для создания фонда вируса с высоким титром. Способы, используемые для производства и очистки Shh, описаны ниже. Присутствие ассоциированного с мембраной Shh проверяют методом FACS и Western blot анализа. Максимальная экспрессия происходит через 48 ч после инфицирования. Для Western blot анализа отстоявшуюся жидкость и лизаты клеток из зараженных Shh или незараженных клеток направляют на анализ SDS-PAGE на гель с градиентом 1020% в восстановительной среде, переносят электрофоретически на нитроцеллюлозу и проявляют Shh поликлональной антисывороткой кролика, вырабатываемой на N-концевой Shh 15-mer, в конъюгате из замочной скважины(принцип ключ-замок) на пептид в прочном соединении с гемоцианином. Лизаты клеток получают в результате инкубации клеток в течение 5 мин при 25 С в 20 MM Na2HPO4 рН 6,5,1% Nonidet P-40 и 150 мМ NaCl или 20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 50 мМ NaCl, 0,5% Nonidet P-40 и 0,5% деоксихолата натрия, а затем осаждают центрифугированием взвесь при 13000 об/мин в течение 10 мин при 4 С в центрифуге Eppendorf. В. Очистка связанного с мембраной Соник хеджхог человека. Связанную с мембраной форму Shh получают на клетках High-Five насекомого (Invitrogen) с использованием рекомбинантного бакуловируса, в котором кодирована обсуждавшаяся выше полная длина Shh. High-Five клетки выращивают при 28 С в освобожденной от сыворотки среде sf900 II (Life Technologies,Inc.) в биореакторе на 10 л с контролем по со 003739 60 держанию кислорода. Клетки заражают вирусом на поздней log-фазе при содержании примерно 2 х 106 клеток/мл при MOI, равном 3 и собирают выращенные клетки через 48 ч после инфицирования (жизнеспособность клеток ко времени сбора была 50%). Клетки отделяют центрифугированием и промывают в 10 мМ Na2HPО 4 рН 6,5, 150 мМ NaCl pH плюс 0,5 мМ PMSF. Образующийся осадок клеток (150 г массы во влажном состоянии) суспендируют в 1,2 л 10 мМNa2HPО 4 рН 6,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ PMSF, 5 мкМ пепстатина А, 10 мкг/мл лейпептина и прибавляют затем 2 мкг/мл Е 64 и 120 мл 10%ного раствора Triton X-100. После инкубации в течение 30 мин на льду отделяют частички центрифугированием (1500 хg, 10 мин). Все последующие операции проводят при температуре 4-6 С. Значение рН жидкости над осадком устанавливают равным 5,0 запасом раствора 0,5 М MES рН 5,0 (конечная концентрация 50 мМ) и загружают в колонку на 150 мл SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia); колонку промывают 300 мл 5 мМ Na2HPO4 рН 5,5,150 мМ NaCl, 0,5 мМ PMSF, 0,1% Nonidet P-40,затем 200 мл 5 мМ Na2HPO4 рН 5,5, 300 мМNaCl, 0,1% Nonidet Р-40 и элюируют связанный хеджхог 5 мМ Na2HPO4 рН 5,5, 800 мМ NaCl,0,1% Nonidet P-40. Затем Shh направляют на афинную хроматографию на 5 Е 1-Sepharose resin, которая получена сочетанием 4 мг антител на 1 мл с активированной CNBr Sepharose 4B resin. Сборник элюатов SP-Sepharose разбавляют двумя объемами 50 мМ HEPES рН 7,5 и всю партию загружают на 5 Е 1 смолу (1 ч). Смолу собирают в колонку, промывают содержащим PBS раствором 0,1% гидрированного Triton X-100 (Calbiochem) с объемом, равным десяти объемам колонки и элюируют 25 мМ NaH2PО 4 рН 3,0, 200 мМ NaCl,0,1% гидрированного Triton X-100. Полученные при элюировании фракции нейтрализуют 0,1 объема 1 М HEPES рН 7,5 и анализируют на общее содержание белка по данным измерения поглощения при 240-340 нм и на чистоту методом SDS-PAGE. Фракции хранят при -70 С. Фракции с максимальной концентрацией,полученные на трех стадиях афинной очистки,объединяют, разбавляют 1,3 объемами 50 мМHEPES рН 7,5, 0,2% гидрированного Triton X100 и снова всю партию загружают на смолу 5 Е 1. Смолу собирают в колонку, промывают тремя объемами колонки PBS рН 7,2, 1% октилглюкозида (US Biochemical Corp.) и элюируют 25 мМ NaH2PO4 рН 3,0, 200 MM NaCl, 1% октилглюкозида. Полученные при элюировании фракции нейтрализуют и анализируют описанным выше способом, затем объединяют, фильтруют через 0,2 микронный фильтр, делят на аликвоты и хранят при -70 С. Когда полную длину Соник хеджхог (Shh) человека получают экспрессией в клетках насекомого High Five, то более 95% N-концевых
МПК / Метки
МПК: A61K 38/00, C07K 14/00, A61P 25/00
Метки: способы, применение, белки, гидрофобно-модифицированные, получения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-3739-gidrofobno-modificirovannye-belki-sposoby-ih-polucheniya-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения и их применение</a>
Новые белки, связывающиеся с рецептором 1 интерферона, кодирующая их днк и способы модуляции клеточного ответа на интерфероны
Номер патента: 3250
Опубликовано: 27.02.2003
Авторы: Ревель Мишель, Чебат Джудит Е., Абрамович Каролина
МПК: C12N 15/12, A61K 48/00, C07K 14/715...
Метки: клеточного, связывающиеся, новые, ответа, днк, способы, модуляции, белки, интерферона, интерфероны, кодирующая, рецептором
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором IFNAR1, способный индуцироваться интерфероном IFN-a или IFN-b, и имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID ь 1 или варианты SEQ ID ь 1, полученные в силу вырожденности генетического кода. 2. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, связывающийся с рецептором IFNAR1,...
Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение
Номер патента: 3675
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Ким Соо Хиун, Новик Даниела, Рубинштейн Менахем, Динарелло Чарльз
МПК: C07K 14/54
Метки: связывающие, применение, получение, интерлейкин-18, белки
Формула / Реферат:
1. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 и AA29-AA197 SEQ ID NO: 6, (b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (a), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по...
Новые ингибиторы фарнезилтрансферазы, способы их получения, содержащие их фармацевтические композиции и их применение для получения медикаментов.
Номер патента: 2114
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Капе Марк, Коммерсон Алан, Бурза Жан-Доминик, Шев Мишель, Суниго-Томсон Фабьенн, Мартэн Жан-Поль, Майлие Патрик, Дере Норбер
МПК: A61K 31/40, A61P 35/00, C07D 209/72...
Метки: композиции, медикаментов, фармацевтические, способы, ингибиторы, содержащие, фарнезилтрансферазы, применение, новые, получения
Формула / Реферат:
1. Соединения формулы I в которой Аr обозначает фенил, замещенный одним или несколькими атомами галогена, радикалом алкил С1-С4, С1-С4 алкокси, которые могут в свою очередь быть замещены атомами галогена или радикалом гидрокси; радикалом 3-N,N-диметиламино или 4-N,N-диметиламино; радикалом 4-метилсульфанил или радикалом циано; 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил; дигидробензофуран; дигидробензопиран; нафтил или тетрагидронафтил; инданил; тиенил...
Неорганические водородные соединения, способы получения и применение
Номер патента: 2888
Опубликовано: 31.10.2002
Автор: Милз Рэнделл Л.
Метки: способы, получения, соединения, неорганические, водородные, применение
Формула / Реферат:
1. Соединение, содержащее, по меньшей мере, одну разновидность водорода с увеличенной энергией связи, выбранную из группы, содержащей (a) атом водорода, имеющий энергию связи примерно 13,6 эВ/(1/р)2, где р - целое число, больше 1; (b) гидрид-ион (Н- ) с увеличенной энергией связи, имеющий энергию (Е) связи, равную где s=1/2, p - пи, ħ - постоянная Планка, деленная на 2p, mo - проницаемость вакуума, mе - масса электрона, me - приведенная...
1-арил-3-иминопиразолы, способы их получения и применение в качестве инсектицидов
Номер патента: 2341
Опубликовано: 25.04.2002
Авторы: Ву Тай-Тех, Меннинг Девид Тридвей
МПК: A01N 43/56, C07D 231/44
Метки: получения, качестве, инсектицидов, применение, способы, 1-арил-3-иминопиразолы
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) где R31 представляет амино; C1-C20 алкил, необязательно замещенный одним или более R35; фенил, необязательно замещенный R36 или R37; R38; NH-CO-NH-N=CR8R9; NH-CS-NH-N=CR8R9; NH-CO-NR8R9; NH-CS-NR8R9; NH-CO-OR8 или NH-CS-OR8; R32 представляет C1-С6 алкил, предпочтительно метил; R33 представляет свободную пару электронов или кислород, предпочтительно свободную пару электронов; R35 представляет галоген, амино, C1-С6...
Предыдущий патент: Бактериальные плазмиды
Случайный патент: Система и способ распределения данных