Пегилированная l-аспарагиназа
Формула / Реферат
1. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 60% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
2. Конъюгат по п.1, где указанная L-аспарагиназа имеет по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1.
3. Конъюгат по п.1, где указанная L-аспарагиназа представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID №: 1.
4. Конъюгат по п.1, обладающий активностью истощения L-аспарагина, по меньшей мере приблизительно в 50 раз более сильной, чем у L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
5. Конъюгат по п.1, снижающий уровни L-аспарагина в плазме до не поддающихся определению величин в течение по меньшей мере от 48 до 96 ч.
6. Конъюгат по п.1, где ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами указанной L-аспарагиназы.
7. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с указанными одной или более аминогруппами амидной связью.
8. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп.
9. Конъюгат по п.1, имеющий формулу
где Asp представляет собой L-аспарагиназу, NH представляет собой одну или более из NH-групп остатков лизина и/или N-конца в Asp, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля, n представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп в Asp, а х равен целому числу в диапазоне от 1 до 8.
10. Конъюгат по п.1, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
11. Способ получения конъюгата по п.1, включающий объединение некоторого количества указанного ПЭГ с некоторым количеством указанной L-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного связывания указанного ПЭГ с указанной L-аспарагиназой.
12. Способ по п.11, где указанный буферный раствор имеет величину рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0.
13. Способ по п.11, где количество указанного ПЭГ соответствует молярному избытку полимера над аминогруппами в указанной L-аспарагиназе, меньшему чем приблизительно 20:1.
14. Способ по п.11, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
15. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 70% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
16. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 80% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
17. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 87% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ.
18. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет повышенную остаточную ферментативную активность in vitro по сравнению с L-аспарагиназой Erwinia chrysanthemi, конъюгированной с ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 10000 Да.
19. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет пониженную иммуногенность при введении субъекту-человеку с гиперчувствительностью к L-аспарагиназе E.coli.
Текст
Описан конъюгат белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина, и полиэтиленгликоля. В частности, полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а белок представляет собой L-аспарагиназу из Erwinia. Конъюгат по изобретению продемонстрировал превосходные качества, например, сохранение высокого уровня активности in vitro и неожиданное возрастание времени полувыведения in vivo. Также описаны способы получения конъюгата и использования конъюгата в терапии. В частности, описан способ использования конъюгата в лечении рака,особенно острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Более конкретно, описан способ использования конъюгата в качестве терапии второй линии для пациентов, у которых развилась гиперчувствительность или у которых случился рецидив заболевания после лечения другими препаратами L-аспарагиназы. Область техники изобретения Настоящее изобретение относится к конъюгату белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина, и полиэтиленгликоля, особенно когда полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, в частности к конъюгату, в котором белок представляет собой L-аспарагиназу из Erwinia, и его использованию в терапии. Уровень техники Белки с аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина, обычно известные как Lаспарагиназы, на протяжении многих лет успешно использовались для лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей. ОЛЛ является наиболее распространенным злокачественным заболеванием у детей (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44: 367-393).L-аспарагиназу также использовали для лечения болезни Ходжкина, острого миелолейкоза, острого миеломоноцитарного лейкоза, хронического лимфолейкоза, лимфосаркомы, ретикулосаркомы и меланомы (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669). Противоопухолевая активность L-аспарагиназы,как полагают, объясняется неспособностью или пониженной способностью некоторых злокачественных клеток синтезировать L-аспарагин (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669). Эти злокачественные клетки нуждаются во внеклеточном источнике L-аспарагина. Однако фермент L-аспарагиназа катализирует гидролиз L-аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака, тем самым истощая пул циркулирующего L-аспарагина и уничтожая опухолевые клетки, не способные осуществлять синтез белка без L-аспарагина (Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669).L-аспарагиназа из Е. coli была первым ферментативным лекарственным средством, использованным в терапии ОЛЛ, и была выведена на рынок под торговой маркой Elspar в США или под торговыми марками Kidrolase и L-аспарагиназа Medac в Европе. L-аспарагиназы также были выделены из других микроорганизмов, например, белок L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi, названный кризантаспаза,продающийся на рынке под торговой маркой Erwinase (Wriston Jr., J.C. (1985) L-asparaginase, Meth.Enzymol. 113, 608-618; Goward, CR. et al. (1992) Rapid large scale preparation of recombinant Erwinia chrysanthemi L-asparaginase, Bioseparation 2, 335-341). Были также идентифицированы L-аспарагиназы из других видов Erwinia, включая, например, Erwinia chrysanthemi 3937 (регистрационныйв GenbankAAS67028), Erwinia chrysanthemi NCPPB 1125 (регистрационныйв Genbank CAA31239), Erwinia carotovora (регистрационныйв Genbank AAP92666) и Erwinia carotovora подвид Astroseptica (регистрационныйв Genbank AAS67027). Эти L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi имеют между собой приблизительно 91-98% идентичности аминокислотной последовательности, тогда как L-аспарагиназы изErwinia carotovora имеют приблизительно 75-77% идентичности аминокислотной последовательности сL-аспарагиназы бактериального происхождения обладают сильным иммуногенным и антигенным потенциалом и часто вызывают побочные реакции, начиная с легких аллергических реакций до анафилактического шока у сенсибилизированных пациентов (Wang, В. et al. (2003) Evaluation of immunologiccross reaction of anti-asparaginase antibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients),Leukemia 17, 1583-1588). L-аспарагиназа из Е. coli особенно иммуногенна, сообщалось, что частота появления анти-аспарагиназных антител к L-аспарагиназе Е. coli после в/в или в/м введения достигала 78% у взрослых и 70% у детей (Wang, В. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588).L-аспарагиназы из Escherichia coli и Erwinia chrysanthemi различаются по своим фармакокинетическим свойствам и имеют различные профили иммуногенности, соответственно (Klug Albertsen, B. et al.(2001) Comparison of intramuscular therapy with Erwinia asparaginase and asparaginase Medac: pharmacokinetics, pharmacodynamics, formation of antibodies and influence on the coagulation system, Brit. J. Haematol. 115, 983-990). Кроме того, показано, что антитела, которые развивались после лечения L-аспарагиназой из Е. coli, перекрестно не реагируют с L-аспарагиназой из Erwinia (Wang, В. et al., Leukemia 17 (2003) 1583-1588). Таким образом, L-аспарагиназу из Erwinia (кризантаспазу) использовали в качестве терапии второй линии у пациентов с ОЛЛ, у которых развивалась реакция на L-аспарагиназу Е. coli (Duval, M. etCancer, Children's Leukemia Group phase 3 trial, Blood 15, 2734-2739; Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44: 367-393). С очередной попыткой уменьшить иммуногенность, связанную с введением микробных Lаспарагиназ, была создана L-аспарагиназа Е. coli, модифицированная с помощью метоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ) (mPEG). Этот метод широко известен как пегилирование и было показано, что он изменяет иммунологические свойства белков (Abuchowski, A. et al. (1977) Alteration of Immunological Properties of Bovine Serum Albumin by Covalent Attachment of Polyethylene Glycol, J. Biol. Chem. 252 (11), 35783581). Эта так называемая мПЭГ-L-аспарагиназа, или пегаспаргаза, продаваемая под торговой маркойOncaspar (Enzon Inc., USA), была впервые одобрена в США для терапии второй линии от ОЛЛ в 1994 г. и была одобрена для терапии первой линии от ОЛЛ у детей и взрослых с 2006 г. Oncaspar имеет длительное время полувыведения in vivo и пониженную иммуногенность/антигенность.Oncaspar представляет собой L-аспарагиназу Е. coli, модифицированную по множественным остаткам лизина с помощью 5-кДа мПЭГ-сукцинимидилсукцината (СС-ПЭГ) (SS-PEG) (патент США 4179337). СС-ПЭГ представляет собой реагент ПЭГ первого поколения, содержащий нестабильную сложноэфирную связь, чувствительную к гидролизу ферментами или при слабощелочных значениях рН(патент США 4670417; Makromol. Chem. 1986, 187, 1131-1144). Эти свойства снижают стабильность как in vitro, так и in vivo и могут отрицательно сказываться на безопасности лекарственного средства. Кроме того, показано, что антитела, развивающиеся против L-аспарагиназы из Е. coli, перекрестно реагируют с Oncaspar (Wang, В. et al. (2003) Evaluation of immunologic cross-reaction of anti-asparaginaseantibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients), Leukemia 17, 1583-1588). Даже если эти антитела не являются нейтрализующими, данный факт четко продемонстрировал высокий потенциал для перекрестной гиперчувствительности или перекрестной инактивации in vivo. Действительно, согласно одному из отчетов, 30-41% детей, получавших пегаспаргазу, имели аллергическую реакцию(Wang, В. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588). В дополнение к внешним аллергическим реакциям недавно также появилось сообщение о проблеме латентной гиперчувствительности, когда у пациентов развиваются анти-аспарагиназные антитела без видимых клинических проявлений реакции гиперчувствительности (Wang, В. et al. (2003) Leukemia 17,1583-1588). Такая реакция может приводить к образованию нейтрализующих антител к L-аспарагиназе Е.coli и пегаспаргазе; однако данных пациентов не переводят на L-аспарагиназу из Erwinia, поскольку отсутствуют внешние признаки гиперчувствительности, и, следовательно, они имеют меньшую продолжительность эффективного лечения (Holcenberg, J., J. Pediatr. Hematol. Oncol. 26 (2004) 273-274). Лечение L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi часто используют в случае гиперчувствительности к L-аспарагиназам из Е. coli. Однако было отмечено, что 30-50% пациентов, получающих Lаспарагиназу из Erwinia, были положительными по наличию антител (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44: 367-393). Более того, поскольку L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi имеет значительно более короткое время полувыведения, чем L-аспарагиназы из Е. coli, ее необходимо вводить более часто (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44: 367-393). В исследовании Avramis с соавторами аспарагиназа из Erwinia отличалась худшими по качеству фармакокинетическими профилями (Avramis et al., J. Pediatr. Hematol. Oncol. 29 (2007) 239-247). Вследствие этого, L-аспарагиназе из E.coli и пегаспаргазе было отдано предпочтение в качестве терапии первой линии при ОЛЛ перед Lаспарагиназой из Erwinia. За многие годы множество биофармацевтических препаратов было успешно пегилировано и выведено на рынок. Для присоединения ПЭГ к белку ПЭГ нужно активировать на его ОН-конце. Активирующую группу выбирают на основании доступной реакционноспособной группы на белке, который предстоит пегилировать. В случае белков наиболее важными аминокислотами являются лизин, цистеин,глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота, С-концевая карбоновая кислота и N-концевая аминогруппа. Учитывая широкий спектр реакционноспособных групп в белках, почти все методы белковой химии применяют для активации фрагмента ПЭГ. Примерами реагентов для таких активированных ПЭГ являются активированные карбонаты, например, п-нитрофенилкарбонат, сукцинимидилкарбонат; активные сложные эфиры, например, сукцинимидильные сложные эфиры; и для сайт-специфического присоединения разработаны альдегиды и малеимиды (Harris, M., Adv. Drug Del. Rev. 54 (2002), 459-476). Наличие различных химических методов для ПЭГ-модификации показывает, что каждая новая разработка пегилированного белка будет отличаться индивидуальным подходом. Помимо химических методов,сильное влияние на фармацевтические свойства пегилированного белка оказывает молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к белку. В большинстве случаев предполагается, что, чем выше молекулярная масса ПЭГ, тем больше улучшаются фармацевтические свойства (Sherman, M.R., Adv. Drug Del. Rev. 60(2008), 59-68; Holtsberg, F. W., Journal of Controlled Release 80 (2002), 259-271). Например, Holtsberg с соавторами обнаружили, что, когда PEG конъюгируют с аргининдезаминазой, другим разрушающим аминокислоту ферментом, выделенным из микробного источника, фармакокинетические и фармакодинамические функции фермента возрастают с увеличением размера присоединенного ПЭГ от молекулярной массы 5000 до 20000 Да (Holtsberg, F.W., Journal of Controlled Release 80 (2002), 259-271). Однако во многих случаях пегилированные биофармацевтические препараты демонстрируют существенно сниженную активность по сравнению с немодифицированными биофармацевтическими препаратами (Fishburn, C.S. (2008) обзор The Pharmacology of PEGylation: Balancing PD with PK to GenerateNovel Therapeutics, J. Pharm. Sci., 1-17). В случае L-аспарагиназы из Erwinia carotovora было обнаружено, что пегилирование снижало ее активность in vitro до приблизительно 57% (Kuchumova, A.V. et al.carotovora имеет только приблизительно 75% гомологии с L-аспарагиназой Erwinia chrysanthemi (кризантаспазой). Для Oncaspar также известно, что его активность in vitro составляет приблизительно 50% по сравнению с немодифицированной L-аспарагиназой Е. coli. Существующие в настоящее время препараты L-аспарагиназы не являются альтернативными или дополнительными лекарственными средствами - особенно средствами для лечения ОЛЛ - отличающимися высокой каталитической активностью и значительно улучшенными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами, а также пониженной иммуногенностью. Краткая сущность изобретения Настоящее изобретение относится к конъюгату белка, обладающего значительной аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина, и полиэтиленгликоля, в котором полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, в частности к конъюгату, в котором белок представляет собой L-аспарагиназу из Erwinia. В одном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из Erwinia, имеющую по меньшей мере 80% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), при этом ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да. В одном варианте осуществления L-аспарагиназа имеет по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно 5000, 4000, 3000, 2500 или 2000 Да. В одном варианте осуществления конъюгат имеет активность in vitro по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с L-аспарагиназой, не конъюгированной с ПЭГ. В другом варианте осуществления конъюгат имеет активность по истощению Lаспарагина, по меньшей мере приблизительно в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз большую, чем у L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. В другом варианте осуществления конъюгат истощает Lаспарагин в плазме до не поддающихся обнаружению уровней по меньшей мере приблизительно на 12,24, 48, 96, 108 или 120 ч. В одном варианте осуществления конъюгат имеет более длительное время полувыведения при циркуляции in vivo по сравнению с L-аспарагиназой, не конъюгированной с ПЭГ. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеет более длительное t1/2, чем пегаспаргаза (то есть конъюгированная с ПЭГL-аспарагиназа из Е. coli), при введении в эквивалентной дозе белка (например, измеренной в мкг/кг). В более конкретном варианте осуществления конъюгат имеет t1/2 по меньшей мере от приблизительно 58 до приблизительно 65 ч в дозе приблизительно 50 мкг/кг, исходя из содержания белка, и t1/2 по меньшей мере от приблизительно 34 до приблизительно 40 ч в дозе приблизительно 10 мкг/кг, исходя из содержания белка, после в/в введения мыши. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет t1/2 по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2). В одном варианте осуществления конъюгат характеризуется большей площадью под кривой (AUC) по сравнению с L-аспарагиназой,не конъюгированной с ПЭГ. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеет среднюю величинуAUC, которая по меньшей мере приблизительно в 3 раза больше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка. В одном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами(где аминогруппы включают остатки лизина и/или N-конец) L-аспарагиназы. В более конкретном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами амидной связью. В другом конкретном варианте осуществления ПЭГ ковалентно связан с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца белка) или с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 90% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца белка). В одном варианте осуществления конъюгат обладает формулой где Asp представляет собой L-аспарагиназу, NH представляет собой одну или более из NH-групп остатков лизина и/или N-конца в Asp, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля, n представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) в Asp, a x равен целому числу в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 8, более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 5. В конкретном варианте осуществления ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ). В другом аспекте изобретение относится к способу получения конъюгата, включающему объединение некоторого количества ПЭГ с некоторым количеством L-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного соединения ПЭГ с L-аспарагиназой. В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, поддающегося лечению истощением L-аспарагина, у пациента, включающему введение эффективного количества конъюгата по изобретению. В одном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. В конкретном варианте осуществления рак представляет собой ОЛЛ. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в количестве от приблизительно 5 Ед/кг массы тела до приблизительно 50 Ед/кг массы тела. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2). В некото-3 021168 рых вариантах осуществления введение может быть внутривенным или внутримышечным и может иметь место реже одного раза в неделю (например, один раз в месяц или один раз в две недели), один раз в неделю, два раза в неделю или три раза в неделю. В других конкретных вариантах осуществления конъюгат вводят в качестве монотерапии и, более конкретно, без ингибитора аспарагинсинтетазы. В других вариантах осуществления конъюгат вводят в составе комбинированной терапии (но в некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия не включает ингибитора аспарагинсинтетазы). В конкретном варианте осуществления пациент, получающий лечение, прежде имел гиперчувствительность к аспарагиназе из Е. coli или ее пегилированной форме, либо к аспарагиназе из Erwinia. В другом конкретном варианте осуществления пациент, получающий лечение, прежде имел рецидив заболевания, в частности рецидив, произошедший после лечения аспарагиназой из Е. coli или ее пегилированной формой. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле очищенной рекомбинантной L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi. Очищенную рекомбинантную L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi (ркризантаспазу) анализировали в SDS-ПААГ. Белковые полосы окрашивали нитратом серебра. Дорожка 1: маркер молекулярной массы (116, 66,2, 45, 35, 25, 18,4 и 14,4 кДа), дорожка 2: очищенная рекомбинантная L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi (р-кризантаспаза). Фиг. 2. Анализ в SDS-ПААГ конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы. Фиг. 3. Уровни L-аспарагина в плазме после одной внутривенной дозы Erwinase (5, 25, 125 и 250 Ед/кг массы тела). Фиг. 4. Уровни L-аспарагина в плазме после одной внутривенной инъекции конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы по сравнению с Erwinase у мышей. Цифры 40% и 100% показывают примерную степень пегилирования, соответственно, приблизительно 40-55% (частичное пегилирование) и приблизительно 100% (максимальное пегилирование) доступных аминогрупп. Фиг. 5. Площадь под кривыми (AUC) (остаточная ферментативная активность), рассчитанная из профилей L-аспарагиназы после одной внутривенной инъекции конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы у мышей. Фиг. 6. Уровни L-аспарагина в плазме у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГр-кризантаспазы (5, 25 и 50 Ед/кг массы тела) (фиг. 6 А), 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5, 25 и 50 Ед/кг массы тела) (фиг. 6 В) или 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5 Ед/кг), 5-кДа-100% мПЭГ-ркризантаспазы (5 Ед/кг) и пегаспаргазы (Oncaspar) (1 Ед/кг) (фиг. 6 С). Введение эквивалентного количества белка (10 мкг/кг) либо 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы (5 Ед/кг), 5-кДа-100% мПЭГ-ркризантаспазы (5 Ед/кг) или пегаспаргазы (Oncaspar) (1 Ед/кг) приводило к аналогичному истощениюL-аспарагина в течение 72 ч. Фиг. 7. Дозозависимый эффект 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы по сравнению с 5 кДа-100% пегилированной р-кризантаспазой. На фиг. 7 А показана остаточная ферментативная активность в плазме после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы в концентрации 5 Ед/кг (10 мкг/кг, исходя из содержания белка), 25 и 50 Ед/кг. На фиг. 7 В показана остаточная ферментативная активность в плазме после одной внутривенной дозы 5-кДа-100% пегилированной ркризантаспазы в концентрации 5 Ед/кг (10 мкг/кг, исходя из содержания белка), 25 и 50 Ед/кг. Фиг. 8. Дозозависимый эффект 2-кДа-100% пегилированной р-кризантаспазы по сравнению с 5 кДа-100% пегилированной р-кризантаспазой. AUC остаточной ферментативной активности, измеренной у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% или 5-кДа-100% мПЭГ-конъюгатов. В целом, при сравнении на том же уровне дозы, AUC, измеренные для 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы, были выше, чем таковые, наблюдаемые для 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы. Разницу в 31, 37 и 14% наблюдали при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно. Фиг. 9. Фармакокинетика конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы в сравнении с пегаспаргазой (Oncaspar) у мышей. На фиг. 9 А представлена остаточная ферментативная активность, измеренная у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы или пегаспаргазы (Oncaspar). На фиг. 9 В представлены AUC остаточной ферментативной активности, измеренной у мышей после одной внутривенной дозы 2-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы, 5-кДа-100% мПЭГ-р-кризантаспазы или пегаспаргазы (Oncaspar). Фиг. 10. Уровни в сыворотке специфических антител против кризантаспазы после введения конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы или Erwinase. Антитела направлены против кризантаспазы. Данные представлены в виде среднегоSD (N=8). Фиг. 11. Уровни в сыворотке специфических антител против конъюгата после введения максимально (100%) пегилированных конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы. Фиг. 11 А. Результаты представлены в виде среднего SD (n=8); фиг. 11B: результаты представлены в виде количества животных в процентах с величинами поглощения 0,5 в анализе ELISA антител против конъюгата. Подробное описание изобретения В одном аспекте изобретение направлено на решение проблемы создания препарата L-аспарагиназы с высокой биологической активностью in vitro; стабильной связью ПЭГ-белок; пролонгированным временем полувыведения in vivo; значительно сниженной иммуногенностью, о чем свидетельствует, например, пониженная или отсутствующая продукция антител против препарата L-аспарагиназы после повторяющихся введений; и возможностью применения в качестве терапии второй линии для пациентов, у которых развилась чувствительность к терапии первой линии при использовании, например, L-аспарагиназ из Е. coli. Данная проблема не была решена с помощью известных конъюгатов L-аспарагиназы, которые либо имеют значительную перекрестную реактивность с модифицированными препаратами L-аспарагиназы(статья Wang, В. et al. (2003) Leukemia 17, 1583-1588, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки), либо имеют существенно сниженную активность in vitro (статья Kuchumova, A.V. et al. (2007) Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 1, 230-232,полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Данная проблема решается в настоящем изобретении путем предложения конъюгата L-аспарагиназы из Erwinia с гидрофильным полимером, более конкретно, полиэтиленгликолем с молекулярной массой 5000 дА или менее, способа получения такого конъюгата и использования конъюгата. В данном документе описана пегилированная L-аспарагиназа из Erwinia с улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с немодифицированным белком L-аспарагиназой, а также по сравнению с препаратом пегаспаргазы из Е. coli. Пегилированный конъюгат L-аспарагиназы, описанный в данном документе, например, L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi, пегилированная при помощи ПЭГ с молекулярной массой 5000 Да, служит в качестве терапевтического средства, в частности, для использования в случае пациентов, демонстрирующих гиперчувствительность (например, аллергическую реакцию или латентную гиперчувствительность) к лечению L-аспарагиназой или пегилированной Lаспарагиназой из Е. coli., либо немодифицированной L-аспарагиназой из Erwinia. Пегилированный конъюгат L-аспарагиназы, описанный в данном документе, также полезен в качестве терапевтического средства для использования в случае пациентов, у которых случился рецидив заболевания, например,рецидив ОЛЛ, или которых прежде лечили другой формой аспарагиназы, например, L-аспарагиназой или пегилированной L-аспарагиназой из Е. coli. Как подробно описано в данном документе, конъюгат по изобретению неожиданно демонстрирует превосходные свойства по сравнению с известными препаратами L-аспарагиназы, такими как пегаспаргаза. Например, немодифицированная L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi (кризантаспаза) имеет гораздо менее длительное время полувыведения, чем немодифицированная L-аспарагиназа из Е. coli (статья Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005) 44: 367-393, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Пегилированный конъюгат по изобретению имеет время полувыведения гораздо более длительное, чем пегилированная L-аспарагиназа из Е. coli при эквивалентной дозе белка. Определения Если прямо не указано иное, термины, используемые в данном документе, следует трактовать в соответствии с их общепринятым значением в данной области. Используемый в данном документе термин включая означает включая, без ограничений и термины, используемые в единственном числе, должны включать множественное число, и наоборот, если из контекста не следует иное. Используемый в данном документе термин болезнь, поддающаяся лечению путем истощения аспарагина означает патологическое состояние или заболевание, при котором клетки, вовлеченные или ответственные за патологическое состояние или заболевание, либо лишены, либо имеют пониженную способность синтезировать L-аспарагин. Истощение или лишение L-аспарагина может быть частичным или практически полным (например, до уровней, не поддающихся определению методами и приборами,известными в данной области). Используемый в данном документе термин терапевтически эффективное количество означает количество белка (например, аспарагиназы или ее конъюгата), необходимое для достижения желаемого терапевтического эффекта. Белок L-аспарагиназа Белок по изобретению представляет собой фермент с аминогидролазной активностью в отношенииL-аспарагина, а именно L-аспарагиназу. Множество белков L-аспарагиназы идентифицировано в данной области, выделено известными методами из микроорганизмов (см., например, статью Savitri and Azmi, Indian J. Biotechnol 2 (2003) 184-194,полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Наиболее широко используемые и коммерчески доступные L-аспарагиназы получают из Е. coli или из Erwinia chrysanthemi,обе из которых имеют 50% или менее структурной гомологии. Среди видов Erwinia, как правило, сообщают о 75-77% идентичности последовательности между ферментами, полученными из Erwinia chrysanthemi и Erwinia carotovora, и приблизительно 90% идентичности последовательности обнаружено между(2007) 127: 657-669, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Некоторые представители L-аспарагиназ из Erwinia включают, например, те, что приведены в табл. 1. Таблица 1 Последовательности L-аспарагиназ из Erwinia и регистрационные номера в GenBank из табл. 1 включены в данный документ посредством ссылки. Предпочтительными L-аспарагиназами, используемыми в терапии, являются L-аспарагиназы, выделенные из Е. coli и из Erwinia, в частности Erwinia chrysanthemi.L-аспарагиназы могут представлять собой природные ферменты, выделенные из микроорганизмов. Их также можно получать методами получения рекомбинантных ферментов в продуцирующих микроорганизмах, таких как Е. coli. В качестве примеров, белок, используемый в конъюгате по изобретению, может представлять собой белок из Е. coli, продуцируемый в рекомбинантном продуцирующем штамме Е.coli, белок из видов Erwinia, в частности Erwinia chrysanthemi, продуцируемый в рекомбинантном продуцирующем штамме Е. coli. Ферменты можно идентифицировать по их специфическим активностям. Таким образом, это определение охватывает все полипептиды, обладающие определенной специфической активностью, которые также присутствуют в других организмах, более конкретно в других микроорганизмах. Часто ферменты со сходными активностями можно идентифицировать, группируя их в определенные семейства, определяемые как PFAM или COG. PFAM (база данных выравниваний и скрытых моделей Маркова белковых семейств; http://pfam.sanger.ac.uk/) представляет большую коллекцию выравниваний белковых последовательностей. Каждая PFAM дает возможность визуализировать множество выравниваний, видеть белковые домены, оценивать распределение между организмами, получать доступ к другим базам данных и визуализировать известные белковые структуры. COGs (кластеры ортологичных групп белков;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) получают путем сравнения белковых последовательностей из 43 полностью секвенированных геномов, представляющих 30 основных филогенетических линий. КаждыйCOG определяют из по меньшей мере трех линий, что позволяет идентифицировать бывшие консервативные домены. Способы определения гомологичных последовательностей и процента их гомологии и/или идентичности хорошо известны специалистам в данной области и включают, в частности, программы BLAST, которые можно найти по сетевому адресу http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi с параметрами по умолчанию, указанными на этом сетевом адресе. Полученные последовательности затем можно использовать (например, выравнивать) при помощи, например, программ CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) илиMULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin.html) с параметрами по умолчанию, указанными на этих сетевых адресах. Используя ссылки, данные в GenBank для известных генов, специалисты в данной области способны определять эквивалентные гены в других организмах, штаммах бактерий, дрожжах, грибах, млекопитающих,растениях и так далее. Эту рутинную работу предпочтительно выполнять, используя консенсусные последовательности, которые можно определять, проводя выравнивание последовательностей с генами из других микроорганизмов и разрабатывая вырожденные зонды для клонирования соответствующего гена в другом организме. Данные рутинные методы молекулярной биологии хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Sambrook et al. (1989 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2-e Изд. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York). Действительно, специалисту в данной области известно, как выбирать и разрабатывать гомологичные белки, в значительной степени сохраняющие их Lаспарагиназную активность. Как правило, анализ Несслера используют для определения L-аспарагиназной активности по методу, описанному Mashburn and Wriston (статья Mashburn, L., and Wriston, J. (1963) TumorInhibitory Effect of L-Asparaginase, Biochem Biophys Res Commun 12, 50, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В конкретном варианте осуществления конъюгата по изобретению белок L-аспарагиназа имеет по меньшей мере приблизительно 80% гомологии или идентичности с белком, содержащим последовательность SEQ ID : 1, более конкретно по меньшей мере приблизительно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологии или идентичности с белком, содержащим последовательность Термин содержащий последовательность SEQ ID : 1 означает, что аминокислотная последовательность белка может не быть четко ограниченной последовательностью SEQ ID : 1, но может содержать дополнительные аминокислоты. В конкретном варианте осуществления белок представляет собой L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, обладающую последовательностью SEQ ID : 1. В другом варианте осуществления Lаспарагиназа происходит из Erwinia chrysanthemi NCPPB 1066 (регистрационныйв GenbankCAA32884, полное содержание литературного источника включено в данный документ посредством ссылки) с наличием или отсутствием сигнальных пептидов и/или лидерных последовательностей. Фрагменты белка с SEQ ID : 1 также попадают под определение белка, используемого в конъюгате по изобретению. Термин фрагмент SEQ ID : 1 означает, что последовательность полипептида может содержать меньше аминокислот, чем SEQ ID : 1, однако все еще достаточно аминокислот для проявления L-аминогидролазной активности. В данной области хорошо известно, что полипептид можно модифицировать путем замены, вставки, делеции и/или добавления одной или нескольких аминокислот с сохранением его ферментативной активности. Например, замена одной аминокислоты в определенном положении эквивалентной с химической точки зрения аминокислотой, которая не влияет на функциональные свойства белка, является общепринятой. Замены можно определить как произведенный обмен внутри одной из следующих групп: небольшие алифатические неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln; полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Cys; большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp. Таким образом, можно ожидать, что в результате изменений, которые приводят к замене одного отрицательно заряженного остатка на другой (например, глютаминовая кислота вместо аспарагинговой кислоты) или одного положительно заряженного остатка на другой (например, лизин вместо аргинина),получится функционально эквивалентный продукт. Положения, в которых аминокислоты подвергаются модификации, и число аминокислот, подвергающихся модификации, в аминокислотной последовательности не имеют конкретных ограничений. Квалифицированные специалисты в данной области способны определять модификации, которые можно вносить без оказания влияния на активность белка. Например, можно ожидать, что модификации в Nили С-концевой части белка не окажут влияния на активность белка при определенных обстоятельствах. В частности, что касается аспарагиназ, было получено много информации, особенно в отношении последовательностей, структур и остатков, образующих активный каталитический центр. Из этих данных можно получить указания на то, какие остатки можно модифицировать без оказания влияния на активность фермента. Все известные L-аспарагиназы из бактериальных источников имеют общие структурные особенности. Все являются гомотетрамерами с четырьмя активными центрами между N- и С-концевыми доменами двух соседних мономеров (статья Aghaipour et al., Biochemistry 40 (2001) 5655-5664, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Все имеют высокую степень сходства их третичных и четвертичных структур (статья Papageorgiou et al., FEBS J. 275 (2008) 43064316, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Последовательности каталитических центров L-аспарагиназ являются высококонсервативными у L-аспарагиназы II Erwinia chrysanthemi, Erwinia carotovora и E. coli (Papageorgiou et al., FEBS J. 275 (2008) 4306-4316). Гибкая петля активного центра содержит аминокислотные остатки 14-33, и структурный анализ показывает, что(2008) 4306-4316). Aghaipour с соавторами провели подробный анализ четырех активных центров Lаспарагиназы из Erwinia chrysanthemi путем изучения полученных с высоким разрешением кристаллических структур фермента в комплексе с его субстратами (Aghaipour et al., Biochemistry 40 (2001) 56555664). Kotzia с соавторами предоставили последовательности L-аспарагиназ из нескольких видов и подвидов Erwinia и, хотя белки имеют только приблизительно 75-77% идентичности между Erwinia chrysanthemi и Erwinia carotovora, каждая из них все еще обладает L-аспарагиназной активностью (статья Kotziaet al., J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Moola с соавторами провели исследования по картированию эпитопов L-аспарагиназы изErwinia chrysanthemi 3937 и показали возможность сохранения ферментативной активности даже после внесения мутаций в различные антигенные последовательности в попытке снизить иммуногенность аспарагиназы (статья Moola et al., Biochem. J. 302 (1994) 921-927, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Полное содержание каждой из приведенных выше статей вклю-7 021168 чено в данный документ посредством ссылок. Учитывая всестороннее исследование L-аспарагиназ, специалист в данной области сможет определять, как создавать фрагменты и/или вносить замены в последовательности без утраты ферментативной активности. Полимеры для использования в конъюгате Полимеры выбирают из группы нетоксичных водорастворимых полимеров, таких как полисахариды, например, гидроксиэтилкрахмал, полиаминокислоты, например, полилизин, сложные полиэфиры,например, полимолочная кислота, и полиалкиленоксиды, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ). Полиэтиленгликоль (ПЭГ) или монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ) хорошо известны в данной области и включают линейные и разветвленные полимеры. Примеры некоторых полимеров, в частности,ПЭГ, приведены в следующих литературных источниках, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылок: патент США 5672662; патент США 4179337; патент США 5252714; публикация патентной заявки США 2003/0114647; патент США 6113906; патент США 7419600 и РСТ публикацияWO 2004/083258. Качество таких полимеров характеризуется индексом полидисперсности (PDI). PDI отражает распределение молекулярных масс в данном образце полимера и рассчитывается как отношение среднемассовой молекулярной массы к среднечисленной молекулярной массе. Он указывает на распределение отдельных молекулярных масс в партии полимеров. Значение PDI всегда больше 1, но по мере приближения полимерных цепей к идеальному распределению Гаусса (= монодисперсности), PDI приближается к 1. Предпочтительно полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 9000 Да. Более конкретно, полиэтиленгликоль (например, мПЭГ) имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей из полиэтиленгликолей с массой 2000,2500, 3000, 3500, 4000, 4500 и 5000 Да. В конкретном варианте осуществления полиэтиленгликоль (например, мПЭГ) имеет молекулярную массу 5000 Да. Способ получения конъюгата Для последующего присоединения полимера к белкам с аминогидролазной активностью в отношении L-аспарагина полимерный фрагмент содержит активированную функциональную группу, которая предпочтительно вступает в реакцию с аминогруппами в белке. В одном аспекте изобретение относится к способу получения конъюгата, включающему объединение некоторого количества полиэтиленгликоля(ПЭГ) с некоторым количеством L-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного соединения ПЭГ с L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления Lаспарагиназа происходит из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретноL-аспарагиназа содержит последовательность SEQ ID : 1. В одном варианте осуществления ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ). В одном варианте осуществления реакцию между полиэтиленгликолем и L-аспарагиназой проводят в буферном растворе. В некоторых конкретных вариантах осуществления значение рН буферного раствора находится в диапазоне от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0. Наиболее предпочтительное значение рН находится в диапазоне от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5, например, значение рН, равное приблизительно 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4 или 8,5. В конкретном варианте осуществления L-аспарагиназа происходит из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназа содержит последовательность SEQ ID : 1. Кроме того, пегилирование L-аспарагиназы проводят при концентрациях белка от приблизительно 0,5 до приблизительно 25 мг/мл, более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/мл, наиболее конкретно от приблизительно 3 до приблизительно 15 мг/мл. Например, концентрация белка составляет приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/мл. В конкретном варианте осуществления при данных концентрациях белка пегилируют L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. При повышенных концентрациях белка, составляющих более чем 2 мг/мл, реакция пегилирования происходит быстро, в течение менее чем 2 ч. Кроме того, используют молярный избыток полимера над аминогруппами в L-аспарагиназе менее чем приблизительно 20:1. Например, используют молярный избыток менее чем приблизительно 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1,7,5:1, 7:1, 6,5:1, 6:1, 5,5:1, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1 или 1:1. В конкретном варианте осуществления молярный избыток составляет менее чем приблизительно 10:1 и в более конкретном варианте осуществления молярный избыток составляет менее чем приблизительно 8:1. В конкретном варианте осуществления L-аспарагиназа происходит из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназа содержит последовательность SEQ ID : 1. Число фрагментов ПЭГ, которые можно присоединять к белку, будет зависеть от числа свободных аминогрупп и, даже более того, тех аминогрупп, которые доступны для реакции пегилирования. В конкретном варианте осуществления степень пегилирования (то есть число фрагментов ПЭГ, присоединенных к аминогруппам на L-аспарагиназе) находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 100% свободных и/или доступных аминогрупп (например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60,-8 021168 70, 80, 90 или 100%). 100% Пегилирование доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца белка) также называют в данном документе максимальным пегилированием. Одним из методов определения модифицированных аминогрупп в конъюгатах мПЭГ-р-кризантаспазы (степени пегилирования) является метод, описанный Habeeb (статья A.F.S.A. Habeeb, Determination of free amino groups inproteins by trinitrobenzensulfonic acid, Anal. Biochem. 14 (1966), p. 328, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В одном варианте осуществления фрагменты ПЭГ связаны с одной или более аминогруппами (которые включают остатки лизина и/или N-конец) Lаспарагиназы. В конкретном варианте осуществления степень пегилирования находится в диапазоне от приблизительно 10% до приблизительно 100% всех или доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца), например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 95 или 100%. В конкретном варианте осуществления приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В другом конкретном варианте осуществления приблизительно 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99 или 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В конкретном варианте осуществления 40-55% или 100% доступных аминогрупп (например,остатков лизина и/или N-конца) связано с фрагментом ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления фрагменты ПЭГ связаны с L-аспарагиназой ковалентной связью. В конкретном варианте осуществленияL-аспарагиназа происходит из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно, L-аспарагиназа содержит последовательность SEQ ID : 1. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению можно представить формулой где Asp представляет собой белок L-аспарагиназу, NH представляет собой NH-группу остатка лизина и/или the N-конца белковой цепи, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля и n представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) в белке, все это определено выше или ниже в примерах, х равен целому числу в диапазоне от 1 до 8 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), предпочтительно от 2 до 5 (например, 2, 3, 4, 5). В конкретном варианте осуществления L-аспарагиназа происходит из видовErwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназа содержит последовательность SEQ ID : 1. Другие способы пегилирования, которые можно использовать для получения конъюгатов по изобретению, предложены, например, в патенте США 4179337, патенте США 5766897, публикации патентной заявки СШАUS 2002/0065397A1 и публикации патентной заявки СШАUS 2009/0054590A1, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки. Конкретные варианты осуществления включают белки, имеющие значительную аминогидролазную активность в отношении L-аспарагина, и полиэтиленгликоль, выбранные из группы конъюгатов, в которых(А) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi,описываемой в SEQ ID : 1,полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да,белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 80-90%, в частности, приблизительно 84% всех аминогрупп например, остатков лизина и/или N-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля;(В) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi,описываемой в SEQ ID : 1,полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да,белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно от 40% до приблизительно 45% и, в частности, приблизительно 43% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 36% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля;(С) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi,описываемой в SEQ ID : 1,полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 2000 Да,белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, один или более остатков лизина и/или Nконца) или приблизительно 80-90%, в частности, приблизительно 84% всех аминогрупп (например, ос-9 021168(D) белок имеет по меньшей мере 90% гомологии структуры с L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi,описываемой в SEQ ID : 1,полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 2000 Да,белок и фрагменты полиэтиленгликоля ковалентно связаны амидными связями, и приблизительно от 50% до приблизительно 60% и, в частности, приблизительно 55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 47% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) связаны с фрагментом полиэтиленгликоля. Конъюгаты L-аспарагиназы с ПЭГ Конъюгаты по изобретению имеют определенные преимущества и неожиданные свойства по сравнению с немодифицированными L-аспарагиназами, в частности по сравнению с немодифицированнымиL-аспарагиназами из Erwinia, более конкретно по сравнению с немодифицированной L-аспарагиназой изErwinia chrysanthemi, еще более конкретно по сравнению с немодифицированной L-аспарагиназой, имеющей последовательность SEQ ID : 1. В некоторых вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни L-аспарагина в плазме на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96 или 120 ч при введении в дозе 5 Ед/кг массы тела (bw) или 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни L-аспарагина в плазме до не поддающихся определению уровней на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120 или 144 ч при введении в дозе 25 Ед/кг bw или 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни L-аспарагина в плазме на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 или 240 ч при введении в дозе 50 Ед/кг bw или 100 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом варианте осуществления конъюгат по изобретению снижает уровни L-аспарагина в плазме до не поддающихся определению уровней на период времени по меньшей мере приблизительно 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 или 240 ч при введении в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2). В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40% до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 4,5 до приблизительно 8,5, в частности приблизительно 6,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 501 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 75 до приблизительно 85%, в частности приблизительно 81% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 5000 Да мПЭГ. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 12,0 до приблизительно 18,0, в частности приблизительно 15,1; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 483 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 75 до приблизительно 85%, в частности приблизительно 78% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 5000 Да мПЭГ. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0, в частности приблизительно 7,0; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности, приблизительно 501 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 87% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 10000 Да мПЭГ. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 11,0 до приблизительно 17,0, в частности приблизительно 14,1; специфическую активность от приблизительно, 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 541 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 87% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 10000 Да мПЭГ. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 6,5 до приблизительно 10,5, в частности приблизительно 8,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 524 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 84% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 40-55% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 2000 Да мПЭГ. В одном варианте осуществления конъюгат имеет соотношение моль ПЭГ/моль мономера от приблизительно 12,5 до приблизительно 18,5, в частности приблизительно 15,5; специфическую активность от приблизительно 450 до приблизительно 550 Ед/мг, в частности приблизительно 515 Ед/мг; и относительную активность от приблизительно 80 до приблизительно 90%, в частности приблизительно 83% по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1,с пегилированием приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца) за счет 2000 Да мПЭГ. В других вариантах осуществления конъюгат по изобретению имеет эффективность, повышенную по меньшей мере приблизительно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз после одной инъекции по сравнению с соответствующей немодифицированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат с такими свойствами содержит L-аспарагиназу из видовErwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например,мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными. В одном аспекте конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль в соответствии со следующими параметрами: Время полувыведения остаточной ферментативной активности в плазме выводят из следующей формулы. Среднее где t1/2 представляет собой время полувыведения, t представляет собой момент времени, ct представляет собой остаточную активность в плазме в момент времени и С 0 представляет собой остаточную активность в плазме в начальный момент времени. Площадь под кривой (AUC) рассчитывают при помощи компьютерной программы для фармакокинетики, например, SigmaPlot версия 11. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль одной дозы в соответствии со следующими далее параметрами, особенно когда конъюгат содержит мПЭГ с молекулярной массой, меньшей чем или равной 2000 Да, и L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1:dAmax: от приблизительно 220 до приблизительно 250 ч, в частности, приблизительно 238,5 ч (выше нуля, от приблизительно 90 мин до приблизительно 240 ч) ; В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет фармакокинетический профиль одной дозы в соответствии со следующими далее параметрами, особенно когда конъюгат содержит мПЭГ с молекулярной массой, меньшей чем или равной 5000 Да, и L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1:dAmax: от приблизительно 90 ч до приблизительно 250 ч, в частности, приблизительно 238,5 ч (выше нуля, от приблизительно 90 мин до приблизительно 240 ч);t1/2: от приблизительно 30 ч до приблизительно 120 ч. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению приводит к получению такого же уровня истощения L-аспарагина в течение периода времени (например, 24, 48 или 72 ч) после одной дозы, что и эквивалентное количество белка пегаспаргазы. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, и еще более конкретно Lаспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными, более конкретно, приблизительно 40-55% или 100%. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет более длительное t1/2, чем пегаспаргаза, введенная в эквивалентной дозе белка. В конкретном варианте осуществления конъюгат имеетt1/2, равное по меньшей мере приблизительно 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65 ч при дозе приблизительно 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет t1/2, равное по меньшей мере приблизительно 30, 32, 34, 36, 37, 38, 39 или 40 ч при дозе приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат имеет t1/2, равное по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч в диапазоне доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2). В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению имеет среднюю величину AUC, которая по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4 или 5 раз выше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению не вызывает существенной продукции антител в течение конкретного периода времени после введения одной дозы, например, большего чем приблизительно 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель,10 недель, 11 недель, 12 недель и так далее. В конкретном варианте осуществления конъюгат по изобретению не вызывает существенной продукции антител в течение по меньшей мере 8 недель. В одном примере не вызывает существенной продукции антител означает, что субъекта, получающего конъюгат,определяют в соответствии с признанными в данной области параметрами как отрицательного по наличию антител. Уровни антител можно определять методами, известными в данной области, например,методом ELISA или методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR-Biacore) (статьи ZalewskaSzewczyk et al., Clin. Exp. Med. (2009) 9: 113-116; Avramis et al., Anticancer Research 29 (2009) 299-302,полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Конъюгаты по изобретению могут иметь любое сочетание данных свойств. Способы лечения и использования конъюгата Конъюгаты по изобретению можно использовать в лечении заболевания, поддающегося лечению путем истощения аспарагина. Например, конъюгат полезен при лечении или производстве лекарственного средства для использования в лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) как у взрослых, так и у детей, а также других патологических состояний, где, как ожидается, истощение аспарагина произведет полезный эффект. Такие патологические состояния включают, но не ограничиваются ими, следующие: злокачественные заболевания или рак, включая, но не ограничиваясь ими, гематологические злокачественные заболевания, неходжкинскую лимфому, NK лимфому, рак поджелудочной железы, болезнь Ходжкина, острый миелолейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, хронический лимфолейкоз, лимфосаркому, ретикулосаркому и меланому. Типичные не злокачественные гематологические заболевания, отвечающие на истощение аспарагина, включают опосредованные иммунной системой заболевания крови,например, инфекционные заболевания, такие как те, что вызваны инфекцией ВИЧ (то есть, СПИД). Не гематологические заболевания, связанные с зависимостью от аспарагина, включают аутоиммунные заболевания, например, ревматоидный артрит, СКВ, аутоиммунные коллагенозы сосудов, СПИД и так далее. Другие аутоиммунные заболевания включают остеоартрит, синдром Исаака, псориаз, инсулинзависимый сахарный диабет, рассеянный склероз, склерозирующий панэнцефалит, системную красную волчанку,ревматизм, воспалительное заболевание кишечника (например, неспецифический язвенный колит и болезнь Крона), первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, гломерулонефрит, тяжелую миастению, обыкновенную пузырчатку и болезнь Грейвса. Клетки, предположительно вызывающие заболевание, можно проверять на аспарагиновую зависимость в любом подходящем in vitro или in vivo анализе, например, в in vitro анализе, в котором в ростовой среде отсутствует аспарагин. Таким образом,в одном аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, поддающегося лечению, у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества конъюгата по изобретению. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой ОЛЛ. В конкретном варианте осуществления конъюгат, используемый в лечении заболевания, поддающегося лечению путем истощения аспарагина, содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществленияпо меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55% или 100%. В одном варианте осуществления лечение конъюгатом по изобретению будет проводиться в качестве терапии первой линии. В другом варианте осуществления лечение конъюгатом по изобретению будет проводиться в качестве терапии второй линии у пациентов, в частности у пациентов с ОЛЛ, у которых развились объективные признаки аллергии или гиперчувствительности, включая латентную гиперчувствительность, на другие препараты аспарагиназы, в частности природную L-аспарагиназу из Escherichia coli или ее пегилированный вариант (пегаспаргазу). Неограничивающие примеры объективных признаков аллергии или гиперчувствительности включают положительный тест на антитела к ферменту аспарагиназе. В конкретном варианте осуществления конъюгат по изобретению используют в терапии второй линии после лечения пегаспаргазой. В более конкретном варианте осуществления конъюгат, используемый в терапии второй линии, содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются легилированными, более конкретно приблизительно 40-55 или 100%. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения острого лимфобластного лейкоза,включающему введение пациенту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества конъюгата по изобретению. В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 1500 до приблизительно 15000 МЕ/м 2, как правило, от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2) по схеме лечения в диапазоне от приблизительно двух раз в неделю до приблизительно одного раза в месяц, как правило, один раз в неделю или один раз в две недели, в виде одного средства (например, монотерапия) или как часть комбинации химиотерапевтических лекарственных средств, включая, но не ограничиваясь ими, глюкокортикоиды, кортикостероиды, противораковые соединения или другие средства, включая, но не ограничиваясь ими, метотрексат, дексаметазон, преднизон, преднизолон, винкристин, циклофосфамид и антрациклин. В качестве примера, пациентам с ОЛЛ будут вводить конъюгат по изобретению в качестве компонента многокомпонентной терапии в течение 3 фаз химиотерапии, включая индукцию, консолидацию или интенсификацию и поддерживающую фазу. В конкретном примере конъюгат не вводят с ингибитором аспарагинсинтетазы (например, таким, который описан в РСТ публикацииWO 2007/103290, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В другом конкретном примере конъюгат не вводят с ингибитором аспарагинсинтетазы, но вводят с другими химиотерапевтическими лекарственными средствами. Конъюгат можно водить до, после или одновременно с другими соединениями как часть схемы многокомпонентной химиотерапии. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55 или 100%. В конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 25 Ед/кг (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 Ед/кг) или эквивалентном этому количестве(например, исходя из содержания белка). В более конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в количестве, выбранном из группы, состоящей из приблизительно 5, приблизительно 10 и приблизительно 25 Ед/кг. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 20000 МЕ/м 2 (например, 1000, 2000, 3000, 4000,5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 или- 13021168 20000 МЕ/м 2). В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят в дозе, которая приводит к истощению L-аспарагина до уровней, не поддающихся определению с помощью методов и приборов,известных в данной области, на период времени от приблизительно 3 дней до приблизительно 10 дней(например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней) при введении одной дозы. В другом варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению, который вызывает более слабый иммуногенный ответ у пациента по сравнению с не конъюгированной L-аспарагиназой. В другом варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению, который имеет более продолжительное время полувыведения при циркуляции in vivo после одной дозы по сравнению с не конъюгированной Lаспарагиназой. В одном варианте осуществления способ включает введение конъюгата, имеющего более продолжительное t1/2, чем пегаспаргаза, введенная в эквивалентной дозе белка. В конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата с t1/2, составляющим по меньшей мере приблизительно 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65 ч при дозе приблизительно 50 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата сt1/2, составляющим по меньшей мере приблизительно 30, 32, 34, 36, 37, 37, 39 или 40 ч при дозе приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата с t1/2, составляющим по меньшей мере от приблизительно 100 до приблизительно 200 ч при дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 (приблизительно 20-30 мг белка/м 2). В одном варианте осуществления способ включает введение конъюгата, имеющего среднюю величину AUC, которая по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4 или 5 раз выше, чем у пегаспаргазы при эквивалентной дозе белка. В другом конкретном варианте осуществления способ включает введение конъюгата по изобретению с большей величиной AUC после одной дозы по сравнению с не конъюгированной L-аспарагиназой. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например, мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными, более конкретно приблизительно 40-55% или 100%. Частота рецидивов у пациентов с ОЛЛ после лечения L-аспарагиназой остается высокой, составляя приблизительно 10-25% у педиатрических пациентов с ОЛЛ с ранним рецидивом (например, в течение поддерживающей фазы через 30-36 месяцев после индукции) (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet.(2005) 44: 367-393). Если у пациента, проходящего лечение L-аспарагиназой из Е. coli, случается рецидив, последующее лечение препаратами из Е. coli может приводить к эффекту вакцинации, при котором препараты из Е. coli имеют повышенную иммуногенность при последующих введениях. В одном варианте осуществления конъюгат по изобретению можно использовать в способе лечения пациентов с рецидивом ОЛЛ, которых ранее лечили другими препаратами аспарагиназы, в частности, тех, которых ранее лечили аспарагиназами из Е. coli. В некоторых вариантах осуществления варианты применения и способы лечения по изобретению включают введение конъюгата L-аспарагиназы, имеющего свойства или сочетания свойств, описанные выше в данном документе (например, в разделе, озаглавленном Конъюгаты L-аспарагиназы с ПЭГ) или ниже в данном документе. Композиции, препараты и способы введения Изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат по изобретению. В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция находится во флаконе в виде лиофилизированного порошка, который вновь растворяют в растворителе, так же, как и доступные в настоящее время природные L-аспарагиназы, независимо от того, какой бактериальный источник использовали для их получения (Kidrolase, Elspar, Erwinase). В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой готовый к употреблению раствор, такой как пегаспаргаза(Oncaspar), который можно, после соответствующей подготовки, вводить, например, внутримышечно,внутривенно (инфузией и/или болюсной инъекцией), интрацеребровентрикулярно (icv), подкожно. Конъюгаты по изобретению, включая композиции, содержащие конъюгаты по изобретению (например, фармацевтическую композицию), можно вводить пациенту стандартными методами. Методы и препараты, как правило, можно найти в книге Remington's Pharmaceutical Sciences (18-e изд., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990 (включенной в данный документ посредством ссылки. Подходящие лекарственные формы частично зависят от применения или способа введения, например, перорального, трансдермального, через слизистую оболочку или путем инъекции (парентеральной). Такие лекарственные формы должны позволять терапевтическому средству достигать клетки-мишени,либо иным образом производить желаемый терапевтический эффект. Например, фармацевтические композиции, вводимые инъекцией в кровоток, предпочтительно являются растворимыми. Конъюгаты и/или фармацевтические композиции по изобретению можно получать в виде фармацевтически приемлемых солей или их комплексов. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, нетоксичные в количествах и концентрациях, в которых их вводят. Препарат таких солей может облегчать фармацевтическое применение путем изменения физических характеристик соединения без помехи для оказания им физиологического эффекта. Полезные изменения физиологических свойств включают снижение температуры плавления для облегчения введения через слизистую оболочку и увеличение растворимости для облегчения введения лекарственного средства в более высоких концентрациях. Фармацевтически приемлемая соль аспарагиназы может присутствовать в виде комплекса, признанного в данной области. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли, например, содержащие сульфат, гидрохлорид, фумарат, малеат, фосфат, сульфамат, ацетат, цитрат, лактат, тартрат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, циклогексилсульфамат и хиннат. Фармацевтически приемлемые соли можно получать из кислот, включая соляную кислоту, малеиновую кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту, сульфаминовую кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, винную кислоту, малоновую кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, циклогексилсульфамовую кислоту, фумаровую кислоту и хинную кислоту. Фармацевтически приемлемые соли также включают основно-аддитивные соли, например, содержащие бензатин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин, прокаин, алюминий,кальций, литий, магний, калий, натрий, аммоний, алкиламин и цинк, если присутствуют кислые функциональные группы, такие как карбоновая кислота или фенол (см., например, Remington's PharmaceuticalSciences, выше). Такие соли можно получать, используя соответствующие основания. Фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты можно также включать в фармацевтическую композицию по изобретению для облегчения введения конкретной аспарагиназы. Примеры носителей, подходящих для использования в практике изобретения, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, такие как лактоза, глюкоза или сахароза, или различные типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и физиологически совместимые растворители. Примеры физиологически совместимых растворителей включают стерильные растворы воды для инъекций (WFI), солевой раствор и декстрозу. Фармацевтические композиции по изобретению можно водить различными способами, включая внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, пероральное, местное (трансдермальное) или через слизистую оболочку введение. В качестве системного введения предпочтительно пероральное введение. Для перорального введения, например, соединения можно формулировать в виде общепринятых пероральных лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки и жидкие препараты, например, сиропы, эликсиры и концентрированные капли. Альтернативно, можно использовать инъекции (парентеральное введение), например, внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные и подкожные инъекции. Для инъекций фармацевтические композиции формулируют в виде жидких растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах или растворах, таких как физиологический раствор, раствор Хэнкса или раствор Рингера. Кроме того, соединения можно формулировать в твердой форме и растворять или суспендировать непосредственно перед использованием. Например, можно получать лиофилизированные формы конъюгата. В конкретном варианте осуществления конъюгат вводят внутримышечно. В другом конкретном варианте осуществления конъюгат вводят внутривенно. Системное введение можно также осуществлять через слизистую оболочку или трансдермально. Для введения через слизистую оболочку или трансдермального введения в препарате используют смачивающие реагенты, соответствующие преодолеваемому барьеру. Такие смачивающие реагенты хорошо известны в данной области и включают, например, в случае введения через слизистую оболочку, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Кроме того, для облегчения проникновения можно использовать детергенты. Для введения через слизистую оболочку можно использовать, например, назальные спреи, ингаляторы (для доставки в легкие), ректальные суппозитории или вагинальные суппозитории. Для местного введения соединения можно формулировать в виде растираний, мазей, гелей или кремов, хорошо известных в данной области. Количество доставляемого конъюгата будет зависеть от множества факторов, например, IC50, ЕС 50,биологического времени полувыведения соединения, возраста, размеров, веса и физического состояния пациента, а также от заболевания или расстройства, от которого предстоит лечение. Важность этих и других факторов, которые следует учитывать, хорошо известны рядовым специалистам в данной области. Как правило, количество конъюгата для введения будет находиться в диапазоне от приблизительно 10 международных единиц на квадратный метр площади поверхности тела пациента (МЕ/м 2) до 50000 МЕ/м 2, с предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 1000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2, с более предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 6000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2 и с особенно предпочтительным диапазоном доз от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 МЕ/м 2(приблизительно 20-30 мг белка/м 2) для лечения злокачественных гематологических заболеваний, например, лейкоза. Как правило, такие дозы вводят посредством внутримышечной или внутривенной инъекции с интервалом от приблизительно 3 раза в неделю до приблизительно одного раза в месяц, как пра- 15021168 вило, один раз в неделю или один раз в две недели в ходе терапии. Разумеется, можно использовать другие дозировки и/или схемы лечения, определяемые лечащим врачом. В конкретных вариантах осуществления конъюгат и/или фармацевтическая композиция или препарат для введения, описанные в данном документе, содержат L-аспарагиназу из видов Erwinia, более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит L-аспарагиназу из видов Erwinia,более конкретно Erwinia chrysanthemi, еще более конкретно L-аспарагиназу, содержащую последовательность SEQ ID : 1. В конкретном варианте осуществления конъюгат содержит ПЭГ (например,мПЭГ) с молекулярной массой, меньшей чем или равной приблизительно 5000 Да. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% аминогрупп(например, остатков лизина и/или N-конца) являются пегилированными. Примеры Пример 1. Получение рекомбинантной кризантаспазы Рекомбинантным штаммом бактерий, используемым для производства голого рекомбинантного белка L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi (также называемого в данном документе ркризантаспаза) являлся штамм BL21 Е. coli с делетированным геном ansB (ген, кодирующий эндогенную L-аспарагиназу типа II Е. coli), чтобы избежать потенциального загрязнения рекомбинантной Lаспарагиназы Erwinia chrysanthemi этим ферментом. Для делеции гена ansB используют методы гомологичной рекомбинации и фаговой трансдукции, выполняемой согласно следующим трем этапам: 1) бактериальный штамм (NM 1100), экспрессирующий дефектный фаг лямбда, который обеспечивает функции защиты и рекомбинации введенного электропорацией линейного ДНК субстрата в бактериальной клетке, трансформировали линейной плазмидой (канамициновая кассета), содержащей ген канамицина,фланкированный целевой последовательностью узнавания FLP (FRT). Происходила рекомбинация для замены гена ansB канамициновой кассетой в бактериальном геноме, приводящая к созданию штаммаansB; 2) фаговую трансдукцию использовали для интеграции области интегрированной канамициновой кассеты из штамма ansB NM 1100 в локус ansB штамма BL21. Это привело к созданию штамма BL21 Е.coli с делетированным геном ansB, обладающего устойчивостью к канамицину; 3) этот штамм трансформировали FLP-хелперной плазмидой для удаления гена канамицина путем гомологичной рекомбинации по последовательности FRT. Геном конечного штамма секвенировали(штамм BL21 ansB), подтверждая полную делецию эндогенного гена ansB. Оптимизированную последовательность ДНК Е. coli, кодирующую зрелую L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, слитую с сигнальным пептидом ENX из Bacillus subtilis, встраивали в экспрессионный вектор. Этот вектор делает возможной экспрессию рекомбинантной L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi под контролем гибридного промотора Т 5/lac, индуцируемого добавлением изопропилD-1 тиогалактопиранозида (IPTG), и придает устойчивость к канамицину. Штамм BL21 ansB трансформировали данным экспрессионным вектором. Трансформированные клетки использовали для продукции р-кризантаспазы путем ферментации глюкозы по технологии feedbatch в среде Рейзенберга. Индукцию клеток проводили в течение 16 ч при 23 С с IPTG в качестве индуктора. После сбора клеток и лизиса путем гомогенизации в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6, 5 мМ ЭДТА (буфер А), раствор белка осветляли центрифугированием дважды при 15000 g, с последующими этапами фильтрования через 0,45- и 0,22-мкм фильтры. Затем рекомбинантную L-аспарагиназу изErwinia chrysanthemi очищали с помощью последовательных этапов хроматографии и концентрирования. Вкратце, теоретическая изоэлектрическая точка L-аспарагиназы Erwinia chrysanthemi (7,23) позволяет рекомбинантному ферменту адсорбироваться на катионообменных смолах при рН 6. Таким образом, рекомбинантный фермент оставался на колонке Capto S (катионообменная хроматография) и элюировался градиентом соли в буфере А. Фракции, содержащие рекомбинантный фермент, объединяли. Затем объединенный раствор очищали на колонке Capto MMC (катионообменная хроматография) в буфере А с градиентом соли. Элюированные фракции, содержащие L-аспарагиназу Erwinia chrysanthemi, объединяли и концентрировали перед разделением белков методом гель-фильтрации на колонке с Superdex 200 пг в качестве завершающего этапа очистки. Фракции, содержащие рекомбинантный фермент, объединяли,концентрировали и диафильтровали против 100 мМ натрий-фосфатного буфера рН 8. Чистоту конечного препарата L-аспарагиназы Erwinia chrysanthemi оценивали методом SDS-ПААГ (фиг. 1) и ОФ-ВЭЖХ, и она составляла по меньшей мере 90%. Целостность рекомбинантного фермента проверяли N-концевым секвенированием и ЖХ-МС. Активность фермента измеряли при 37 С с помощью реагента Несслера. Специфическая активность очищенной рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia chrysanthemi составляла приблизительно 600 Ед/мг. Одну единицу ферментативной активности определяют как количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль аммиака из L-аспарагина в минуту при 37 С. Пример 2. Получение конъюгатов 10-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы Раствор L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 8,0 с концентрацией белка от 2,5 до 4 мг/мл в присутствии 150 или 36 мг/мл 10-кДа мПЭГ-NHS в течение 2 ч при 22 С. Полученную неочищенную 10-кДа мПЭГ-L-аспарагиназу очищали гельхроматографией на колонке с Superdex 200 пг, используя систему Akta purifier UPC 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 10-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом TNBS с немодифицированной L-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 78% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца; а второй соответствовал частичному пегилированию (39% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 50% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца. Анализ в SDS-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы. Пример 3. Получение конъюгатов 5-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы Раствор L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 8,0 с концентрацией белка 4 мг/мл в присутствии 150 или 22,5 мг/мл 5-кДа мПЭГ-NHS в течение 2 ч при 22 С. Полученную неочищенную 5-кДа мПЭГ-L-аспарагиназу очищали гель-хроматографией на колонке с Superdex 200 пг, используя систему kta purifier UPC 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 5-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом TNBS с немодифицированной L-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 84% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца; а второй соответствовал частичному пегилированию (36% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 43% доступных аминогрупп(например, остатков лизина и/или N-конца. Анализ в SDS-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы. Пример 4. Получение конъюгатов 2-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы Раствор L-аспарагиназы из Erwinia chrysanthemi перемешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 8,0 с концентрацией белка 4 мг/мл в присутствии 150 или 22,5 мг/мл 2-кДа мПЭГ-NHS в течение 2 ч при 22 С. Полученную неочищенную 2-кДа мПЭГ-L-аспарагиназу очищали гель-хроматографией на колонке с Superdex 200 пг, используя систему kta purifier UPC 100. Содержащие белок фракции объединяли и концентрировали, получая концентрацию белка от 2 до 8 мг/мл. Таким способом получали два конъюгата 5-кДа мПЭГ-L-аспарагиназы, различающиеся по степени пегилирования, что определяли анализом TNBS с немодифицированной L-аспарагиназой в качестве образца сравнения, один из них соответствовал полному пегилированию (100% доступных аминогрупп (например, остатков лизина и/или Nконца), при этом конъюгируемые остатки соответствовали пегилированию 86% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца; а второй соответствовал частичному пегилированию (47% всех аминогрупп (например, остатков лизина и/или N-конца) или приблизительно 55% доступных аминогрупп(например, остатков лизина и/или N-конца. Анализ в SDS-ПААГ конъюгатов представлен на фиг. 2. Полученные конъюгаты выглядели как практически гомогенные полосы и не содержали поддающейся определению немодифицированной р-кризантаспазы. Пример 5. Активность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы Аминогидролазную активность L-аспарагиназы каждого конъюгата, описанного в предшествующих примерах, определяли методом Несслера на основании количества аммиака, высвобождающегося из Lаспарагина в результате ферментативной активности. Вкратце, 50 мкл раствора фермента смешивали с 20 мМ L-аспарагином в 50 мМ натрий-боратном буфере, рН 8,6, и инкубировали в течение 10 мин при 37 С. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл реактива Несслера. Поглощение этого раствора измеряли при 450 нм. Активность рассчитывали на основании калибровочной кривой, полученной с сульфатом аммония в качестве образца сравнения. Результаты приведены в табл. 2 ниже. цифры 40% и 100% указывают примерную степень пегилирования, соответственно, 40-55 и 100% доступных аминогрупп (см. примеры 2-4, выше).отношение моль ПЭГ/моль мономера экстраполировано из данных анализа TNBS, который предполагает, что все аминогруппы из белка (например,остатки лизина и N-конец) доступны. Остаточная активность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы находилась в диапазоне от 483 до 543 ед./мг. Это соответствует 78-87% аминогидролазной активности в отношении L-аспарагина немодифицированного фермента. Пример 6. L-аспарагин-истощающий эффект немодифицированной кризантаспазы Фармакодинамический профиль Erwinase определяли у гибридов B6D2F1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Charles River, Германия. Erwinase является коммерчески доступной кризантаспазой (L-аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi). Вкратце, 2 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25, 125 или 250 ед./кг bw Erwinase. В моменты времени -1 ч до введения и 6, 12, 24 и 48 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни Lаспарагина в плазме. Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот PICO-TAG(Waters). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ. Как показано на фиг. 3, дозы 5 и 25 Ед/кг не были эффективны в истощении уровней L-аспарагина у мышей после в/в введения. Только доза 250 Ед/кг вызывала полное истощение на протяжении 48 ч. Этот результат свидетельствует о клинических ограничениях Erwinase, немодифицированной кризантаспазы, которую необходимо вводить вплоть до 3 раз в неделю болезненными инъекциями пациентам, страдающим от ОЛЛ, и которая в высоких дозах приводит к быстрому появлению аллергических реакций и иммуногенности. Пример 7. L-аспарагин-истощающий эффект и активность L-аспарагина в плазме после однократного введения шести конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы Фармакодинамические и фармакокинетические профили 6 различных конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы определяли у гибридов B6D2F1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Charles River, Германия. Шесть тестированных конъюгатов отличались молекулярным размером ПЭГ (2, 5 или 10 кДа) и степенью пегилирования (максимальное против частичного пегилирования). Немодифицированную кризантаспазу (Erwinase) использовали в качестве образца сравнения. Вкратце, 4 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5 Ед/кг bw конъюгата против 250 Ед/кг bw Erwinase. В моменты времени -1 ч до введения и 6, 12, 24, 48, 96 и 192 ч после инъекции образцы плазмы собирали из орбитального синуса каждого животного и анализировали на уровни L-аспарагина в плазме и остаточную ферментативную активность, соответственно. Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот PICO-TAG(Waters). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ. Ферментативную активность в плазме определяли хромогенным анализом. -Гидроксамат Lаспарагиновой кислоты (AHA) использовали в качестве субстрата. Ферменты гидролизовали AHA до LAsp и гидроксиламина, который определяли при 710 нм после конденсации с 8-гидроксихинолином и окисления до индооксина (статья Analytical Biochemistry 309 (2002): 117-126, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Как показано на фиг. 4, конъюгаты, введенные в дозе 5 Ед/кг, демонстрировали эффективность истощения L-аспарагина, по меньшей мере, такую же высокую, как и у Erwinase 250 Ед/кг, из чего следует,что пегилирование повышает эффективность белка по меньшей мере в 50 раз. Все конъюгаты демонст- 18021168 рировали сходную эффективность, истощая уровни L-аспарагина в плазме в течение 2 дней, за исключением 5-кДа-100% конъюгата, который отличался более длительным действием (96 ч = 4 дня по сравнению с 48 ч = 2 дня для других конъюгатов). Таким образом, увеличение размера ПЭГ, конъюгированного с р-кризантаспазой, с 2 до 5 кДа приводило к возрастанию эффективности и продолжительности действия. Однако, на удивление, увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало эффективность и продолжительность действия конъюгата, это даже приводило к снижению по сравнению с 5-кДа максимально пегилированным конъюгатом. Ферментативная активность согласовалась с истощением L-аспарагина. Как показано на фиг. 5, 5 кДа-100% конъюгат отличался наибольшей величиной AUC, что отражало более длительное время полувыведения. Более низкие величины AUC наблюдали в случае ПЭГ-40% (частично пегилированных) против ПЭГ-100% (максимально пегилированных) конъюгатов для 2- и 5-кДа кандидатов и не наблюдали никакой разницы в случае 10-кДа кандидатов. В соответствии с данными по истощению L-аспарагина, увеличение молекулярного размера ПЭГ,конъюгированного с р-кризантаспазой, с 2 до 5 кДа приводило к более длительной циркуляции Lаспарагиназной активности. Однако, на удивление, увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало ферментативную активность конъюгата in vivo, это даже приводило к снижению по сравнению с 5-кДа максимально пегилированным конъюгатом. Кроме того, примечательно, что когда р-кризантаспаза была монопегилирована по N-концу с помощью мПЭГ с высокой молекулярной массой (то есть 40 кДа),не было никакого существенного влияния на устойчивость фермента к протеолизу in vitro (данные не представлены). Пример 8. Дозозависимые эффекты двух конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы на L-аспарагин в плазме Фармакодинамический профиль 2 конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы в сравнении с пегаспаргазойCharles River, Германия. Тестированными конъюгатами были 2-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза и 5-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза в 3 дозах. Вкратце, 8 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25 или 50 Ед/кг bw конъюгатов р-кризантаспазы, что соответствовало 10, 50 или 100 мкг белка/кг. Для сравнения тестировали Oncaspar в дозе 1 Ед/кг, что соответствовало 10 мкг белка/кг. В моменты времени -1 ч до введения и 90 мин, 6, 24, 48, 72, 96, 120,144, 192 и 240 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни L-аспарагина в плазме. Уровни аминокислот в плазме определяли с помощью набора для анализа аминокислот PICO-TAG(Waters). Вкратце, образцы плазмы депротеинизировали осаждением метанолом. Свободные аминокислоты в супернатанте дериватизировали фенилизотиоцианатом и количественно определяли методом ОФВЭЖХ. Дозозависимые эффекты конъюгатов на уровни L-аспарагина в плазме представлены на фиг. 6. Как показано на фиг. 6 А и 6 В, оба конъюгата были высокоэффективны в истощении циркулирующего Lаспарагина. В случае 2-кДа-100% конъюгата, полное истощение наблюдали на протяжении 3, 6 и по меньшей мере 10 дней при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно. В случае 5-кДа-100% конъюгата, полное истощение наблюдали на протяжении 3, 10 и 10 дней при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг, соответственно. В случае обоих протестированных конъюгатов дозы 5, 25 и 50 Ед/кг соответствовали 10, 50 и 100 мкг/кг,исходя из содержания белка, что является очень малым количеством белка в сравнении с другими имеющимися в продаже препаратами L-аспарагиназы. Действительно, 250 Ед/кг Erwinase соответствует приблизительно 520 мкг/кг, а 1 Ед/кг Oncaspar соответствует приблизительно 10 мкг/кг (исходя из содержания белка). На фиг. 6 С показано, что введение эквивалентного количества белка (10 мкг/кг) либо 2 кДа-100% конъюгата, 5-кДа-100% конъюгата, либо Oncaspar приводило к сходному истощению Lаспарагина на протяжении 72 ч. Пример 9. Фармакокинетические профили двух конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы Фармакокинетический профиль конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы определяли у гибридов B6D2F1(иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Charles River, Германия. Тестированными конъюгатами были 2-кДа максимально (100%) пегилированная р-кризантаспаза и 5-кДа максимально(100%) пегилированная р-кризантаспаза в 3 дозах. Немодифицированная кризантаспаза (Erwinase) в дозе 250 Ед/кг и Oncaspar в дозе 1 Ед/кг также тестировали в качестве контролей. Вкратце, 8 животных в группе получали одну в/в инъекцию 5, 25 или 50 Ед/кг bw каждого из конъюгатов мПЭГ-ркризантаспазы в сравнении с Erwinase и Oncaspar. В моменты времени -1 ч до введения и 90 мин, 6,24, 48, 72, 96, 120, 144, 192 и 240 ч после введения образцы плазмы собирали из орбитального синуса и анализировали на уровни в плазме остаточной ферментативной активности. Ферментативную активность в плазме определяли хромогенным анализом. -Гидроксамат Lаспарагиновой кислоты (AHA) использовали в качестве субстрата. Ферменты гидролизовали AHA до LAsp и гидроксиламина, который определяли при 710 нм после конденсации с 8-гидроксихинолином и окисления до индооксина. (Analytical Biochemistry 309 (2002): 117-126). Для расчета времени полувыведения строили экспоненциальные наилучшие эмпирические кривые соответствующих остаточных активностей в плазме, используя функциональные возможности и инструменты MS-excel. Отрицательные значения активности исключали из расчетов. Время полувыведения остаточной ферментативной активности в плазме выводили из следующей формулы, используя функциональные возможности и инструменты MS-excel и соответствующие формулы экспоненциальных наилучших эмпирических кривых. Среднее где t1/2 представляет собой время полувыведения, t представляет собой момент времени, ct представляет собой остаточную активность в плазме в момент времени и С 0 представляет собой остаточную активность в плазме в начальный момент времени. Площадь под кривой (AUC) рассчитывали при помощи программы SigmaPlot версия 11. Фармакокинетические данные приведены в табл. 3 и 4 ниже и на фиг. 7-9. Таблица 3. Первичная фармакокинетика при однократном воздействии 250 Ед/кг bw Erwinase, 1 Ед/кг Таблица 4. Первичная фармакокинетика при однократном воздействии 250 Ед/кг bw Erwinase, 1 Ед/кг Данные свидетельствуют о том, что пегилирование р-кризантаспазы значительно продлевает время полувыведения по сравнению с немодифицированной кризантаспазой, к тому же дозозависимым образом (табл. 3 и 4, фиг. 7-9). Кроме того, при сравнении в одинаковых уровнях доз величины AUC, измеренные для 5-кДа-100%, были выше, чем таковые, наблюдаемые в случае 2-кДа-100% конъюгатов. Постоянно наблюдали разницу в 21, 37 и 14% в пользу 5-кДа-100% конъюгата при дозах 5, 25 и 50 Ед/кг,соответственно (фиг. 8). 5-кДа-100% Конъюгат, судя по всему, также имел более продолжительное время полувыведения по сравнению с собственно Oncaspar при тестировании в той же дозе, исходя из содержания белка, как показано на фиг. 9 и в выведенных фармакокинетических параметрах, приведенных в табл. 4. Превосходящие фармакокинетические профили для конъюгатов из Erwinia были неожиданными,поскольку известно, что L-аспарагиназа из Е. coli имеет более продолжительное время полувыведения в организме человека и животных, чем L-аспарагиназа из Erwinia chrysanthemi (кризантаспаза). Следовательно, логично было бы предположить, что у пегилированной L-аспарагиназы из Е. coli (пегаспаргазы) будет более продолжительное время полувыведения по сравнению с пегилированной р-кризантаспазой. Однако неожиданным и благоприятным фактом явилось то, что пегилированная р-кризантаспаза имеет более продолжительное время полувыведения, чем пегаспаргаза. Ниже в табл. 5 приведены фармакокинетические и фармакодинамические данные, собранные из нескольких экспериментов, включая те, которые описаны в примерах 7-9 в данном документе, демонстрирующие, что: 1) как 2-кДа-100%, так и 5-кДа-100% конъюгаты были высокоэффективными с точки зрения возрастания эффективности и продолжительности действия кризантаспазы, о чем свидетельствуют заметные различия, наблюдаемые в сравнении с Erwinase; 2) 5-кДа-100% конъюгат действовал более продолжительное время, чем оба 2-кДа-100% конъюгат и Oncaspar, о чем свидетельствует более про- 20021168 должительное время полувыведения, наблюдаемое при всех тестируемых дозах. С учетом удивительно невысоких результатов, полученных с 10-кДа-100% конъюгатом, эти данные свидетельствуют о том, что преимущество от пегилирования возрастает с увеличением размера фрагмента ПЭГ, заякоренного на кризантаспазе, вплоть до 5 кДа. Более высокая молекулярная масса ПЭГ не добавляет дополнительных преимуществ и, по меньшей мере, в случае 10 кДа может даже наносить вред. Это неожиданно и противоречит результатам, полученным, например, когда Holtsberg с соавторами конъюгировали ПЭГ, имеющий различную молекулярную массу, с аргининдезаминазой, другим разрушающим аминокислоту ферментом, выделенным из микробного источника. В этих исследованиях фармакокинетическая и фармакодинамическая функция фермента аргининдезаминазы возрастала с увеличением размера присоединенного фрагмента ПЭГ от молекулярной массы 5000 до 20000 Да (статья Holtsberg, F. W., Journal of ControlledRelease 80 (2002), 259-271, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). Таблица 5 Кроме того, как показано ниже более подробно, данные по иммуногенности свидетельствуют о том,что 10-кДа-100% конъюгат отличался неприемлемым профилем иммуногенности, основным недостатком с точки зрения введения соединения пациентам, страдающим аллергией к L-аспарагиназе Е. coli или вырабатывающим антитела против L-аспарагиназы. В этом отношении 10-кДа-100% конъюгат действительно не годится. Предпочтительными являются 2-кДа-100% и 5-кДа-100% конъюгаты, и 5-кДа-100% конъюгат является особенно предпочтительным. Пример 10. Иммуногенность Иммуногенность конъюгатов мПЭГ-р-кризантаспазы определяли у гибридов B6D2F1 (иммунокомпетентных самок), приобретенных у компании Charles River, Германия. Животные получали дважды в неделю в недели 1, 2, 3, 4 и 8 введенные внутривенной инъекцией 250 Ед/кг bw Erwinase и по 5 Ед/кгbw всех конъюгатов р-кризантаспазы. Образцы сыворотки собирали в моменты времени -1 ч до введения и через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 6 недель и 8 недель из орбитального синуса. Уровни в сыворотке антител против кризантаспазы или против мПЭГ-р-кризантаспазы определяли методом ELISA. Результаты приведены на фиг. 10 и 11. Высокие титры анти-кризантаспазных антител были обнаружены в случае Erwinase, начиная с недели 2, и сохранялись в течение всего периода исследования. Напротив, никаких существенных уровней антител не наблюдали в случае конъюгатов р-кризантаспазы (фиг. 10). Как показано на фиг. 11, продукция антител против конъюгата отличалась низкой интенсивностью и частотой в случае конъюгатов 2-кДа и 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы, и более высокие значения и частота наблюдались в случае конъюгатов 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы. Не было замечено четких различий между полностью и частично пегилированными конъюгатами (не показано). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что выбранная стратегия пегилирования снижала иммуногенность конъюгатов по сравнению с немодифицированной L-аспарагиназой, значительно уменьшая продукцию анти-кризантаспазных антител. Однако антитела против конъюгатов были обнаружены, особенно в случае 10-кДа конъюгатов, и с меньшей интенсивностью в случае 2-кДа и 5-кДа конъюгатов. В заключение, представляется, что пегилирование вплоть до 5 кДа было способно улучшать фармакокинетический профиль, эффективность и продолжительность действия р-кризантаспазы, при этом снижая иммуногенность по сравнению с немодифицированным белком, причем эффективность и продолжительность действия возрастали с увеличением размера используемого полимера и конъюгат 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы был немного более эффективным, чем конъюгат 2-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы. Однако дальнейшее увеличение размера ПЭГ до 10 кДа больше не увеличивало эффективность и продолжительность действия, поскольку конъюгат 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы был менее эффективен invivo, чем конъюгат 5-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы, несмотря на сходную эффективность in vitro. Кроме того, конъюгаты 10-кДа мПЭГ-р-кризантаспазы демонстрировали неприемлемый профиль иммуногенности, неожиданный результат с учетом опубликованных результатов с другими белками. Хотя варианты осуществления и применения настоящего изобретения были описаны более подробно в качестве иллюстраций и примеров, для специалистов в данной области очевидно, что возможны различные дополнительные модификации без отклонения от концепций изобретения, содержащихся в данном документе. Полное содержание всех цитированных в данном документе литературных источников включено в него посредством ссылок. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 60% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. 2. Конъюгат по п.1, где указанная L-аспарагиназа имеет по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1. 3. Конъюгат по п.1, где указанная L-аспарагиназа представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID : 1. 4. Конъюгат по п.1, обладающий активностью истощения L-аспарагина, по меньшей мере приблизительно в 50 раз более сильной, чем у L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. 5. Конъюгат по п.1, снижающий уровни L-аспарагина в плазме до не поддающихся определению величин в течение по меньшей мере от 48 до 96 ч. 6. Конъюгат по п.1, где ПЭГ ковалентно связан с одной или более аминогруппами указанной Lаспарагиназы. 7. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с указанными одной или более аминогруппами амидной связью. 8. Конъюгат по п.6, где ПЭГ ковалентно связан с по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп. 9. Конъюгат по п.1, имеющий формулу где Asp представляет собой L-аспарагиназу, NH представляет собой одну или более из NH-групп остатков лизина и/или N-конца в Asp, ПЭГ представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля, n представляет собой число, соответствующее по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 100% доступных аминогрупп в Asp, а х равен целому числу в диапазоне от 1 до 8. 10. Конъюгат по п.1, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль. 11. Способ получения конъюгата по п.1, включающий объединение некоторого количества указанного ПЭГ с некоторым количеством указанной L-аспарагиназы в буферном растворе в течение периода времени, достаточного для ковалентного связывания указанного ПЭГ с указанной L-аспарагиназой. 12. Способ по п.11, где указанный буферный раствор имеет величину рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0. 13. Способ по п.11, где количество указанного ПЭГ соответствует молярному избытку полимера над аминогруппами в указанной L-аспарагиназе, меньшему чем приблизительно 20:1. 14. Способ по п.11, где указанный ПЭГ представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль. 15. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 70% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. 16. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 80% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. 17. Конъюгат по п.1, где указанный конъюгат имеет активность in vitro, составляющую по меньшей мере 87% активности L-аспарагиназы, не конъюгированной с ПЭГ. 18. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет повышенную остаточную ферментативную активность in vitro по сравнению с L-аспарагиназой Erwinia chrysanthemi, конъюгированной с ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 10000 Да. 19. Конъюгат, содержащий L-аспарагиназу из Erwinia chrysanthemi, имеющую по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID : 1, и полиэтиленгликоль (ПЭГ), где ПЭГ имеет молекулярную массу, меньшую чем или равную приблизительно 5000 Да, а конъюгат имеет пониженную иммуногенность при введении субъекту-человеку с гиперчувствительностью к Lаспарагиназе E.coli.
МПК / Метки
МПК: C12N 9/82, A61K 47/48, A61P 35/02
Метки: пегилированная, l-аспарагиназа
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/28-21168-pegilirovannaya-l-asparaginaza.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Пегилированная l-аспарагиназа</a>
Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт.
Номер патента: 11438
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Пломп Питер Ян Арнольдус Мария, Ройен Ван Рутгер Ян, Мейма Рульф Бернхард, Бур Де Лекс
МПК: A23L 1/03, C12N 9/80, A23L 1/30...
Метки: продукта, пищевого, niger, клетка-хозяин, способ, aspergillus, полученная, пищевой, получения, продукт, аспарагиназа, полинуклеотид, вектор
Формула / Реферат:
1. Выделенная из Aspergillus niger аспарагиназа, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или аспарагиназа, последовательность которой гомологична указанной по меньшей мере на 80%. 2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. 3. Выделенный полинуклеотид по п.2, полученный из нитчатых грибов. 4. Выделенный...
Предыдущий патент: Разделительный резервуар для отделения нефти и газа от воды
Следующий патент: Водопроводящий бытовой прибор с дозирующим устройством и устройством ввода
Случайный патент: Счетчик ингалятора сухого порошка