Новые модифицированные полиэтиленгликолем соединения и их применение
Формула / Реферат
1. Соединение, содержащее:
(а) пептидный фрагмент и поли(этиленгликолевый) фрагмент, который содержит не более чем примерно 50 аминокислот; и
(б) поли(этиленгликолевый) фрагмент, ковалентно присоединенный к указанному пептидному фрагменту,
причем указанный поли(этиленгликолевый) фрагмент является линейным, непрерывным и неразветвленным и имеет молекулярную массу, превышающую 20 кДа.
2. Соединение по п.1, в котором поли(этиленгликолевый) фрагмент имеет молекулярную массу от 20 до 40 кДа.
3. Соединение по п.2, в котором поли(этиленгликолевый) фрагмент имеет значение полидисперсности (Mw/Mn) менее 1,20.
4. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный мономер, содержащий единственный пептид.
5. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный димер, содержащий два пептида, соединенных линкерным фрагментом.
6. Соединение по п.4 или 5, в котором каждый пептид содержит не более чем 50 аминокислотных мономеров, предпочтительно от примерно 10 до 25 аминокислотных мономеров, более предпочтительно каждый пептид содержит от примерно 12 до 18 аминокислотных мономеров.
7. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент содержит пептид, который связывается с рецепторами к эритропоэтину.
8. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент содержит пептид, который связывается с рецепторами к тромбопоэтину.
9. Соединение по п.1, содержащее также спейсерный фрагмент между пептидным фрагментом и поли(этиленгликолевым) фрагментом.
10. Соединение по п.9, в котором спейсерный фрагмент имеет структуру
-NH-(CH2)a-[O-(CH2)b]g-Od-(CH2)e-Y-,
где каждое из чисел a, b, g, d и e является целым, значение которого выбирают независимо от других.
11. Соединение по п.10, в котором
a является целым, 1_a_6;
b является целым, 1_b_6;
e является целым, 1_e_6;
d равно 0 или 1;
g является целым, 0_g_10, а
Y представляет собой либо NH, либо СО.
12. Соединение по п.11, где g>1, а b=2.
13. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу от 20 до 60 кДа.
14. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу 20 кДа.
15. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) содержит по меньшей мере одну линейную цепь поли(этиленгликоля).
16. Фармацевтический состав, содержащий соединение по любому из пп.1-15.
Текст
010016 Настоящая заявка на изобретение в соответствии со ст. 35119(e) Свода Законов США испрашивает приоритет согласно другой находящейся на рассмотрении предварительной заявке США 60/470246,поданной 12 мая 2003 г. Содержание этой предварительной заявки полностью включено в настоящее описание путем ссылки. 1. Область техники Настоящее изобретение относится к модификации соединений на основе пептидов поли(этиленгликолем) или, сокращенно, ПЭГ (PEG). B частности, изобретение относится к мономерам,димерам и олигомерам пептидов, модифицированным ПЭГ, предпочтительно линейным фрагментом ПЭГ от 20 до 60 кДа. Дополнительно, данное изобретение относится к новым способам терапии с применением таких модифицированных полиэтиленгликолем соединений. 2. Уровень техники В последние годы в связи с развитием исследований белков было обнаружено большое число пептидов, имеющих различные активности. Благодаря развитию методик генетической рекомбинации и методов органического синтеза пептидов, стало возможным получение таких физиологически активных пептидов и их структурных аналогов в большом количестве. Многие из этих пептидов, обладающие специфической активностью, являются крайне полезными в качестве фармацевтических веществ. Примеры таких пептидов включают пептиды, которые связываются с рецепторами к эритропоэтину(ЭПО, EPO), называемыми также ЭПО-рецепторами (EPO-R). Эритропоэтин (ЭПО) представляет собой гормон гликопротеиновой природы, состоящий из 165 аминокислот, с четырьмя сайтами гликозилирования в 24, 38, 83 и 126 положениях аминокислот и молекулярной массой, примерно равной 34,000. ЭПО стимулирует митотическое деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов, что обеспечивает продукцию эритроцитов. ЭПО необходим для образования эритроцитов, существуют потенциально полезные применения этого гормона как в диагностике, так и в лечении болезней крови, характеризующихся низкой либо дефицитной (недостаточной) продукцией эритроцитов. Открыт ряд пептидов, которые взаимодействуют с ЭПО-рецептором (см., например, патенты США U.S. Patent No. 5773569 (Wrighton et al.); U.S. Patent No. 5830851 (Wrighton et al.) и публикацию WO 01/91780 (SmithSwintosky et al Однако обычно, особенно при введении в кровеносное русло, имеет место очень быстрый клиренс таких пептидов. Следовательно, желательно улучшить долговечность (время жизни в организме) таких пептидов. Кроме того, в случае, когда пептиды получены от разных видов животных, созданы способами белковой инженерии и/или имеют структуру, отличную от структуры белков пациента,существует риск появления серьезных симптомов, причиной которых является продукция антител. Следовательно, также желательно улучшить антигенные характеристики таких пептидов (снизить их антигенность). Для того чтобы можно были использовать эти пептиды в качестве фармацевтических средств,необходимо улучшить как их антигенные характеристики, так и долговечность. Показано, что химическая модификация пептидов такими макромолекулярными соединениями, как поли(этиленгликоль), эффективно улучшает показатель долговечности и снижает антигенность различных пептидов. Так, поли(этиленгликоль) и производные поли(этиленгликоля) широко применяют в качестве макромолекулярных реагентов для модификации пептидов. В наиболее общей форме поли(этиленгликоль) имеет следующую структуру:HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH Изображенный выше полимер альфа-,омега-дигидроксилполи(этиленгликоль) может быть представлен в сокращенном виде НО-ПЭГ-ОН(HO-PEG-OH), при этом предполагается, что символ -PEGпредставляет следующую структурную единицу:-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2He ограничиваясь какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, считают, что цепь молекулы ПЭГ сильно гидратирована и в водной среде находится в состоянии быстрого движения. Считают, что быстрое перемещение приводит к тому, что ПЭГ занимает большой объем и препятствует приближению и влиянию других молекул. В результате при присоединении к другому химическому веществу (такому как пептид) полимерные цепи ПЭГ могут защитить такое вещество от иммунного ответа и других механизмов клиренса. В результате ковалентное присоединение ПЭГ (ПЕГилирование) приводит к повышению эффективности и безопасности лекарств путем оптимизации фармакокинетики, повышения биодоступности, а также снижения иммуногенности и частоты введения доз. Например, некоторые активные производные ПЭГ присоединяли к белкам и ферментам, что давало полезные результаты. ПЭГ растворим в органических растворителях. Присоединение ПЭГ к ферментам может привести к получению конъюгатов ПЭГ-фермент, растворимых и активных в органических растворителях. Присоединение ПЭГ к белку может уменьшить иммуногенность и скорость почечного клиренса (выведения почками) конъюгата ПЭГ-белок по сравнению с неизмененным белком, что может привести к существенному повышению времени циркуляции конъюгата в крови. Например, сообщалось,что ковалентное присоединение ПЭГ к терапевтическим пептидам, таким как интерлейкины [Knauf, et al.chim. Biophy. Acta 660:293), увеличивает время их полужизни in vivo и/или снижает их иммуногенность и антигенность. Дополнительно, присоединенный к поверхностям ПЭГ может уменьшить адсорбцию белков и клеток на данной поверхности и изменить электрические свойства данной поверхности. Аналогично, присоединение ПЭГ к липосомам может привести к существенному увеличению времени жизни этих частиц в циркулирующей крови и, следовательно, возможному увеличению выгоды от использования их для доставки лекарств. (J. M. Harris, Ed., "Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene GlycolChemistry," Plenum, New York, 1992). В патенте США 5767078 (Johnson et al.) описана димеризация мономеров пептидов, которые могут связываться с ЭПО-рецептором. Димеризация основана на образовании ковалентной связи между мономерами. ПЭГ представляет собой предпочтительный линкер для образования димеров. Конкретные используемые в указанном патенте полиэтиленгликоли имеют молекулярную массу, равную только 3400 или 5000. В заявке WO 01/91780 (Smith-Swintosky et al.) описаны димеры и мультимеры пептидов, которые проявляют способность связываться с рецепторами типа рецепторов к факторам роста и инициировать передачу сигнала с них. Описанный линкер представляет собой полиэтиленгликоль. Однако в данном источнике не приведены инструкции по выбору подходящих размеров или классов (например, линейный) полиэтиленгликоля. В патенте США (U.S. Patent 6077939, Wei et al.) описаны составы, состоящие, в основном, из полипептида и водорастворимого полимера, ковалентно присоединенного к N-концевому -атому углерода полипептида гидрозонной или восстановленной гидрозонной связью, либо оксимной или восстановленной оксимной связью. Диапазон молекулярных масс водорастворимого полимера составляет от 200 Да до 200 кДа. ПЭГ описан в качестве примера водорастворимого полимера. Молекулярная масса ПЭГ составляет лишь от 700 Да до 20 кДа, причем сказано, что предпочтительными являются фрагменты ПЭГ,имеющие массу лишь 5 кДа. В заявке WO 01/38342 (Balu et al.) описан димер, образованный линкерным (связывающим) фрагментом C1-12 (1-12 атомов углерода), связывающим две пептидные цепи. Указано, что к N-концам димера может быть присоединен ПЭГ. Однако в данной публикации не указана конкретная молекулярная масса использованного ПЭГ, а также не указано, является ли он линейным или разветвленным.Saifer с соавт. (Adv. Exp. Med. Biol. (1994), 366:377-87) описывают продукт присоединения ПЭГ к рекомбинантной Cu, Zn супероксид дисмутазе (СОД) человека и СОД быка, в котором 1-9 цепей ПЭГ с высокой молекулярной массой (35 К-120 кДа) связаны с СОД. Somack с соавт. (Free Rad. Res. Comms.(1991), 12-13:553-562) описывает продукт присоединения СОД, содержащий от 1 до 4 цепей ПЭГ с высокой молекулярной массой (41 К-72 кДа). Ни в одном из этих двух источников не описано, как модифицировать пептид полиэтиленгликолем. Более того, считают, что используемые в этих соединениях фрагменты ПЭГ были разветвленными, в противоположность линейным. Вопреки достижениям в области модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов остается потребность в новых модифицированных полиэтиленгликолем соединениях с пониженной антигенностью и повышенной длительностью циркуляции в организме. Цитирование и/или обсуждение какого-либо источника в этом разделе, а также во всем описании не следует считать признанием того, что этот источник является прототипом настоящего изобретения. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к соединениям на основе пептидов, содержащим пептидный фрагмент и фрагмент поли(этиленгликоля), в которых фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу, превышающую 20 кДа. Предпочтительно фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу примерно от 20 до 60 кДа. Более предпочтительно фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу примерно от 20 до 40 кДа. Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу, равную примерно 20 кДа. Предпочтительно поли(этиленгликоль) имеет значение полидисперсности (Mw/Mn) меньше чем 1,20, более предпочтительно меньше чем 1,1, а наиболее предпочтительно меньше чем 1,05. Предпочтительно пептидный фрагмент является димерным и содержит два мономерных пептида,связанных линкерным фрагментом. Более того, такие димеры и другие мультимеры могут представлять собой гетеродимеры или гетеромультимеры. В одном способе реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, которые связываются с рецепторами к эритропоэтину. Неограничивающие примеры таких связывающих ЭПО-рецептор пептидов описаны в опубликованных международных заявках PCT/US 00/32224 (публикация WO 01/38342 А 2), PCT/US 96/09810 (публикация WO 96/40749) и PCT/US 01/16654 (публикация WO 01/91780 A1) и патентах США U.S. Patents 5767078, 5773569, 5830851, 5986047. Другие примеры связывающих ЭПОрецептор пептидов, которые могут быть использованы в качестве пептидных фрагментов в настоящем изобретении, описаны в предварительной заявке США 60/479245, поданной 12 мая 2003 г. Другие примеры связывающих ЭПО-рецептор пептидов, которые могут быть использованы в качестве пептидных фрагментов в настоящем изобретении, описаны в предварительной заявке США 60/469993, поданной 12-2 010016 мая 2003 г. Еще ряд примеров связывающих ЭПО-рецептор пептидов, которые могут быть использованы в качестве пептидных фрагментов в настоящем изобретении, описаны в предварительной заявке США 60/470244, поданной 12 мая 2003 г. В другом способе реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, которые связываются рецептором к тромбопоэтину (ТПО-рецептор). Неограничивающие примеры таких связывающих ТРОрецептор пептидов можно найти в патентах США U.S. 6552008, 6506362, 6498155, 6465430, 6333031,6251864, 6121238, 6083913, 5932546, 5869451, 5683983, 5677280, 5668110 и 5654276, а также в опубликованных заявках США U.S. 2003/0083361, 2003/0009018, 2002/0177166 и 2002/0160013. Предпочтительно такие соединения на основе пептидов содержат разделяющий, или спейсерный,фрагмент (спейсер) между пептидным фрагментом и фрагментом поли(этиленгликоля). Наиболее предпочтительно разделяющий фрагмент имеет структуру-NH-(CH2)-[O-(CH2)]-O-(CH2)-Y-,где каждое из чисел , , ,иявляется целым, значения которого выбирают независимо от остальных. Такой спейсерный фрагмент более подробно описан в предварительной заявке на патент США 60/469996, поданной 12 мая 2003 г., озаглавленной "Novel Spacer Moiety For Poly (ethylene Glycol) Modified Peptide-base Compounds" (новые спейсерные фрагменты для модифицированных поли(этиленгликолем) соединений на основе пептидов). В предпочтительных способах реализации В некоторых предпочтительных способах реализации= 2 при 1. В одном особенно предпочтительном способе реализации В других некоторых способах реализации Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим одно или более из описанных выше соединений на основе пептидов. Подробное описание Определения. Названия остатков аминокислот в пептидах имеют следующие сокращения: Фенилаланин-Phe илиF, Лейци - Leu или L, Изолейцин - Ile или I, Метионин - Met или M, Валин - Val или V, Серин - Ser или S,Пролин - Pro или P, Треонин - Thr или T, Аланин - Ala или А, Тирозин - Tyr или Y, Гистидин - His или H,Глутамин - Gln или Q, Аспарагин - Asn или N, Лизин - Lys или K, Аспарагиновая - Asp кислота или D,Глутаминовая кислота - Glu или E, Цистеин - Cys или С, Триптофан - Trp или W, Аргинин - Arg или R,Глицин - Gly или G. Минорные аминокислоты в пептидах имеют следующие аббревиатуры: 1 нафтилаланин - 1-nal или Np, N-метилглицин (также известный как саркозин) - MeG или Sc, а ацетилированный глицин (N-ацетилглицин) - AcG, гомоцистеин - Hsm. Термин пептид или полипептид обозначает здесь полимер, мономерами которого являются аминокислоты, соединенные между собой амидными связями. Длина полипептидов составляет два или часто больше остатков аминокислот. Обычно в данной области и в контексте настоящего изобретения термин пептид обозначает полипептид, длина которого составляет всего несколько остатков аминокислот. В частности, длина пептидов согласно настоящему изобретению составляет предпочтительно не-3 010016 больше чем примерно 50 остатков аминокислот. Более предпочтительно их длина составляет примерно от 5 до 40 остатков аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 17 до 40 остатков аминокислот. Полипептид в отличие от пептида может содержать любое число остатков аминокислот. Следовательно, термин полипептид включает пептиды наравне с более длинными последовательностями аминокислот. Пептиды, использованные в настоящем изобретении, могут представлять собой часть или быть полученными из более длинной последовательности полипептида, такого как последовательность белка. Фраза фармацевтически приемлемый обозначает здесь молекулы или составы, которые считают в целом безопасными, например, которые физиологически приемлемы и обычно не вызывают при введении человеку аллергических или аналогичных им нежелательных реакций, таких как расстройство желудка, головокружение и т.п. Термин фармацевтически приемлемый предпочтительно употребляется здесь в понимании одобренного органом федерального или государственного регулирования либо перечисленного в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее как пригодного для применения у животных, а точнее - у людей. Термин носитель обозначает дилюент, адювант, наполнитель или разбавитель, с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефти, масла растительного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей, особенно для инъекционных растворов, используют предпочтительно воду или водные буферные растворы, а также водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (автор E.W. Martin). Термин агонист обозначает здесь биологически активный лиганд, который связывается с комплементарным ему биологически активным рецептором и активирует последний, что либо вызывает биологический ответ рецептора, либо усиливает уже существующую биологическую активность рецептора. Фрагмент ПЭГ. Фрагмент ПЭГ, используемый в настоящем изобретении, является линейным и имеет молекулярную массу 20 кДа или более. Предпочтительно фрагмент ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20 до 60 кДа. Более предпочтительно фрагмент ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20 до 40 кДа. Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу, равную 20 кДа. Фрагмент ПЭГ ковалентно присоединен к соединениям согласно данному изобретению либо непосредственно к пептидному фрагменту, либо к линкерному фрагменту, либо к разделяющему фрагменту(спейсеру). В одном из способов реализации фрагмент ПЭГ присоединен по меньшей мере к одному концу (N-концу или С-концу) пептидного мономера или димера, например, к каждому N-концу пептидного димера может быть присоединено по фрагменту ПЭГ (всего два фрагмента ПЭГ). В одном способе реализации ПЭГ может служить линкером, который соединяет два пептидных мономера в димер, например, единственный фрагмент ПЭГ может быть одновременно присоединен к обоим N-концам пептидного димера. В другом способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерному фрагменту пептидного мономера или димера. В одном из предпочтительных способов реализации ПЭГ присоединен к линкерному фрагменту пептидного димера. В одном особенно предпочтительном способе реализации ПЭГ прикреплен к спейсерному фрагменту, причем упомянутый спейсерный фрагмент прикреплен к линкерному LK фрагменту пептидного димера. Наиболее предпочтительно ПЭГ прикреплен к спейсерному фрагменту, причем упомянутый спейсерный фрагмент прикреплен к пептидному димеру через атом углерода карбонильной группы лизинового линкера или через атом азота амидной группы линкера на основе амида лизина. Соединения на основе пептидов согласно настоящему изобретению могут содержать многочисленные фрагменты ПЭГ (например, 2, 3, 4 или более). В некоторых способах реализации фрагмент ПЭГ содержит две линейные мономерные цепи ПЭГ. Предпочтительно две линейные мономерные цепи ПЭГ связаны посредством остатка лизина или амида лизина (остатка лизина, в котором карбоксильная группа была трансформирована в амидный фрагмент - CONH2). Более предпочтительно две цепи ПЭГ связаны с- и -аминогруппами лизина, в то время как карбоксильная группа активирована сложными гидроксисукцинимидил эфирами для связывания со спейсерным фрагментом. Например, если амид лизина связывает две мономерные цепи ПЭГ, структура димера может быть изображена, как показано в формуле I. Обобщенное изображение дано в формуле II. Формула I Формула II 2 В формуле I N обозначает атом азота- аминогруппы лизина, a N обозначает атом азота- аминогруппы лизина. В предпочтительных способах реализации C-концевой лизин двух пептидных мономеров представляет собой L-лизин. В альтернативных способах реализации один или более остатков лизина могут представлять собой D-лизин. В случае, когда соединение содержит более одного фрагмента ПЭГ, множественные фрагменты ПЭГ могут представлять собой одинаковые или разные химические фрагменты (например, полиэтиленгликоли разной молекулярной массы). В некоторых случаях на степень ПЭГилирования (число фрагментов ПЭГ, присоединенных к пептиду и/или общее число пептидов, к которым присоединен ПЭГ) может оказывать влияние соотношение количества молекул ПЭГ и молекул пептида в реакции присоединения ПЭГ, а также общая концентрация молекул каждого вида в реакционной смеси. Обычно оптимальное отношение количества молекул ПЭГ и пептида (в терминах эффективности реакции для того, чтобы избежать избытка непрореагировавших пептидов и/или фрагментов ПЭГ) будет определяться такими факторами, как желаемая степень ПЭГилирования (например, моно-, ди-, три- и.т.д), молекулярная масса выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или неразветвленным, и условий реакции для конкретного способа присоединения. Существует ряд доступных специалисту в данной области способов присоединения ПЭГ [см., например, Goodson, et al. (1990) Bio/Technology 8:343 (ПЭГилирование интерлейкина-2 в сайте гликозилирования после сайт-направленного мутагенеза); EP 0401384 (присоединение ПЭГ к G-CSF); Malik, et al.,(1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035 (ПЭГилирование GM-CSF при помощи трезил хлорида); публикацияPCT Pub. No. WO 90/12874 (ПЭГилирование эритропоэтина, содержащего введенный по рекомбинантной технологии остаток цистеина при помощи цистеин-специфической производной мПЭГ); патент США, U.S. Pat. No. 5757078 (ПЭГилирование пептидов ЭПО), патент США, U.S. Pat. No. 5672662 (ПЭГ и родственные полимеры монозамещенные пропионовой или бутановой кислотами и их функциональные производные для применнеия в биотехнологии) и Патент США, U.S. Pat. No. 6077939 (ПЭГилированиеN-концевого -углерода пептида), Veronese et al., 1985, Appl. Biochem. Biotechnol., 11:141-142 (PEGylation of an N-terminal alpha-carbon of a peptide with PEG-nitrophenylcarbonate ("PEG-NPC") or PEGtrichlorophenylcarbonate) a также Veronese (2001) Biomaterials 22:405-417 (обзорная статья, посвященная ПЭГилированию пептидов и белков)]. Например, ПЭГ может быть ковалентно связан с остатками аминокислот через химически активную группу. Химически активными являются те группы, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ (например, свободная амино- или карбоксильная группа). Например, N-концевые остатки аминокислот и остатки лизина (K) имеют свободную аминогруппу, а С-концевые остатки аминокислот имеют свободную карбоксильную группу. Сульфгидрильные группы (например, такие как на остатках цистеина) также могут быть использованы в качестве химически активных групп для присоединения ПЭГ. Кроме того, были описаны способы введения активированных групп при помощи ферментов (например, гидразидных, альдегидных и ароматических аминогрупп) при помощи ферментов [Schwarz, et al.Biol. Chem. 269:7224]. Например, молекулы ПЭГ могут быть присоединены к аминогруппам при помощи метоксилированного ПЭГ (мПЭГ, mPEG), имеющего различные химически активные фрагменты. Неограничивающие примеры таких химически активных фрагментов включают сукцинимидил сукцинат (CC, SS),сукцинимидил карбонат (CK, SC), мПЭГ-имидат, пара-нитрофенилкарбонат (NPC), сукцинимидил пропионат (SPA) и цианомочевая кислота. Неограничивающие примеры таких полиэтленгликолей с химически активными фрагментами включают мПЭГ-сукцинимидил сукцинат (mPEG-SS), мПЭГ- сукцинимидил карбонат (mPEG-SC), мПЭГ-имидат, мПЭГ-паранитрофенилкарбонат (mPEG-NPC), мПЭГсукцинимидил пропионат (mPEG-SPA) и хлорид мПЭГ-цианмочевой кислоты. В тех случаях, когда присоединение ПЭГ является не специфическим, но желательно получить пептид, содержащий специфическое присоединение ПЭГ, желаемое ПЭГилированное соединение может быть выделено из смеси ПЭГилированных соединений путем очистки. Например, если желательным является пептид, ПЭГилированный на N-конце, ПЭГилированная на N-конце форма может быть выделена путем очистки из популяции случайным образом ПЭГилированных пептидов (например, разделением 2-5 010016 этого фрагмента и других моноПЭГилированных фрагментов). В предпочтительных способах реализации присоединение ПЭГ к пептиду является сайтспецифическим. Было проведено сайт-специфическое ПЭГилирование N-конца, бокового радикала и Сконца эффективного аналога релизинг-фактора гормона роста путем твердофазного синтеза [Felix, et al.(1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46:253]. Другой сайт-специфический метод включает сайтспецифическое присоединение пептида к концам выступающих с поверхности липосомы цепей ПЭГ через химически активную альдегидную группу на N-конце, полученную окислением периодатом натрияN-концевого треонина [Zalipsky, et al. (1995) Bioconj. Chem. 6:705]. Однако применение этого метода ограничено полипептидами с N-концевым и остатками треонина или серина. В одном из методов селективное N-концевое ПЭГилирование может быть выполнено путем восстановительного алкилирования, использующего различную химическую активность разных типов доступных для дериватизации первичных аминогрупп (лизина по сравнению с N-концевой) конкретного белка. В подходящих реакционных условиях содержащий карбонильную группу ПЭГ селективно присоединяется к N-концу пептида. Например, можно селективно ПЭГилировать пептид по N-концу, проводя реакцию при таком pH, который позволяет использовать разницу между pKa -аминогрупп остатка лизина и-аминогруппы N-концевого остатка пептида. Благодаря такому селективному присоединению, ПЭГилирование происходит преимущественно на N-конце белка без существенного изменения других химически активных групп (например, аминогрупп бокового радикала лизина). При использовании восстановительного алкилирования нужно, чтобы ПЭГ содержал единственную химически активную альдегидную группу для связывания с белком (например, можно использовать ПЭГ пропиональдегид). Следующим подходом, который может быть использован для приготовления пептидов для сайтспецифического присоединения полимеров, является сайт-специфический мутагенез. Согласно этому методу последовательность аминокислот пептида конструируют таким образом, чтобы в нее в желаемом положении пептида была введена подходящая химически активная группа. Например, в патенте WO 90/12874 описано сайт-специфическое ПЭГилирование белков, модифицированных путем вставки остатков цистеина или замены других остатков на остатки цистеина. В этой публикации также описано приготовление мПЭГ-эритропоэтина (мПЭГ-ЭПО, mPEG-EPO) путем проведения реакции цистеинспецифической производной мПЭГ с введенными рекомбинантными методами остатками цистеина ЭПО. В случае, когда фрагменты ПЭГ присоединяют с спейсерному фрагменту или линкерному фрагменту, могут быть использованы аналогичные способы присоединения. В этом случае линкер или спейсер содержит химически активную группу, а для того, чтобы вызвать ковалентное присоединение используют активированную молекулу ПЭГ, содержащую соответствующую комплементарно активную группу. В предпочтительных способах реализации химически активная группа линкера или спейсера представляет собой терминальную химически активную группу (т.е. расположенную на конце линкера или спейсера). Пептиды, пептидные димеры и другие молекулы на основе пептидов согласно данному изобретению могут быть прикреплены к водорастворимым полимерам (например, ПЭГ) при помощи разнообразных химических структур, используемых для связывания водорастворимого полимера(ов) с рецепторсвязывающей частью молекулы (например, пептид+спейсер). В типичном способе реализации для ковалентного присоединения водорастворимого полимера(ов) к рецептор-связывающей части молекулы используют единственное место (сайт) присоединения. Однако в альтернативных способах реализации могут быть использованы множественные точки присоединения, включая дополнительные варианты, в которых к рецептор-связывающей части в раздельных точках присоединения присоединяют разные виды водорастворимых полимеров, которые могут включать сайт(ы) ковалентного присоединения к спейсеру и/или к одной или обеим пептидным цепям. В некоторых способах реализации димер или мультимер более высокого порядка будет содержать различные виды пептидных цепей (т.е. гетеродимер или другой гетеромультимер). В качестве примера, но не ограничения, димер может содержать одну пептидную цепь, имеющую сайт присоединения ПЭГ, а у второй пептидной цепи может либо отсутствовать сайт присоединения ПЭГ, либо для присоединения может быть использована связь не такого, как в первой цепи, химического состава. В некоторых вариантах спейсер может содержать или не содержать сайт присоединения ПЭГ, а в случае присоединения ПЭГ к указанному спейсеру, для присоединения может быть использована связь не такого, как в первой и/или второй цепи, химического состава. В альтернативном способе реализации ПЭГ присоединен к спейсерной части рецептор-связывающей части, и другой водорастворимый полимер (например, углеводород) конъюгирован с боковым радикалом одной из аминокислот пептидной части молекулы. Для присоединения к рецептор-связывающей части (пептиды+спейсер) может быть использовано множество разных видов полиэтиленгликоля (ПЭГ). Можно использовать практически любой подходящий химически активный реагент ПЭГ. В предпочтительных способах реализации применение химически активного реагента ПЭГ приведет к образованию карбаматной или амидной связи после конъюгирования с рецептор-связывающей частью. Подходящие химически активные реагенты ПЭГ включают, без ограничения, коммерчески доступные реагенты, которые можно приобрести по каталогу Drag DeliverySystems (2003) корпорации NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku,Tokyo 150-6019) и каталогу Molecular Enginering 2003 компании Nectar Therapeutics (490 Discovery Drive,Huntsville, Alabama 35806). В качестве примера, но не ограничения, здесь приводятся следующие часто предпочитаемые в разных способах реализации реагенты ПЭГ: m-PEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-ArmPEG, mPEG(MAL)2, mPEG(MAL), m-PEG2-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-thioesters (тиоэфиры ПЭГ), mPEG-Double Esters (двойные эфиры ПЭГ), mPEG-BTC, mPEG-ButyrALD, mPEG-ACET, гетерофункциональные ПЭГ (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEGMAL), акрилаты ПЭГ (ACRL-PEG-NHS), ПЭГ-фосфолипиды (например, mPEG-DSPE), многолучевые ПЭГ серии SUNBRITE, включая серию GL глицериновых ПЭГ, активированных химическим составом,выбранным специалистом, любой из активированных ПЭГ серии SUNBRITE (включая, без ограничения,карбоксил-ПЭГи, p-NP-ПЭГ, Трезил-ПЭГи, альдегид-ПЭГи, ацеталь-ПЭГи, амино-ПЭГи, тиол-ПЭГи,имид-малеиновые ПЭГи, гидроксил-ПЭГ-амин, амино-ПЭГ-СООН, гидроксил-ПЭГ-альдегид, ПЭГ карбоксильно-ангидридного типа, функционализированные фосфолипид-ПЭГ и другие аналогичные и/или подходящие химически активные ПЭГ, выбираемые специалистами в данной области для конкретного применения и использования. Пептидный фрагмент. В качестве пептидного фрагмента можно применять любые пептиды, полученные от разнообразных животных, включая человека, микроорганизмы, растения, а также пептиды, полученные путем геннетической инженерии и синтеза. Примеры включают белки, которые связываются с ЭПО-рецепторами, и пептиды, которые связываются с ТПО-рецепторами. Предпочтительно пептидный фрагмент содержит один или более фрагментов пептидов, длина каждого из которых меньше чем 50 аминокислот, более предпочтительно от примерно 10 до 25 аминокислот,а наиболее предпочтительно примерно 12-18 аминокислот. В одном из предпочтительных способов реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов,которые связываются с ЭПО-рецептором и, например, описаны в патентах США U.S. Pat.5773569; 5830851 и 5986047 (выданы Wrighton, et al.); публикации договора о патентной кооперации PCT Pub.(Johnson, Zivin); PCT Pub.WO 01/38342 (Balu); WO 01/91780 (Smith-Swintosky, et al.); предварительной заявке США, U.S. Provisional Application Serial60/479245, поданной 12 мая 2003 г.; предварительной заявке США, U.S. Provisional Application Serial60/469993, поданной 12 мая 2003 г.; и предварительной заявке США U.S. Provisional Application Serial60/470244, поданной 12 мая 2003 г.). В других предпочтительных способах реализации пептидный фрагмент выбирают из пептидов, которые связываются с рецепторами к тромбопоэтину (ТПО-рецепторами). Неограничивающие примеры таких связывающих ТПО-рецепторы пептидов включают описанные в патентах США U.S. Patents 6552008, 6506362, 6498155, 6465430, 6333031, 6251864, 6121238, 6083913, 5932546, 5869451, 5683983,5677280, 5668110 и 5654276; и опубликованных заявках на патент США U.S. Patent Applications 2003/0083361, 2003/0009018, 2002/0177166 и 2002/0160013. В одном из способов реализации пептидный фрагмент представляет собой мономер пептида, от 10 до 40 или более остатков аминокислот в длину, и имеющий последовательность аминокислотX3X4X5GPX6TWX7X8, где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой,Х 3 обозначает С, X4 обозначает R, H, L или W, X5 обозначает M, F, или I, Х 6 независимо выбирают из 20 генетически кодируемых L-аминокислот, Х 7 обозначает D, E, I, L, или V, aX8 обозначает С, который связывается с рецептором к эритропоэтину (ЭПО-рецептором) и активирует его или, иначе, действует как агонист ЭПО. В другом способе реализации пептидный фрагмент представляет собой мономер пептида, от 17 до примерно 40 остатков аминокислот в длину, имеющий последовательность аминокислот LYACHMGPITX1VCQPLR, где каждая аминокислота обозначена стандартной однобуквенной аббревиатурой, X1 представляет собой триптофан (W), 1-нафтилаланин (1-nal) или 2- нафтилаланин (2-nal). В еще одном способе реализации пептидный фрагмент содержит один или более пептидов, связывающих ТПО-рецептор, с такой последовательностью как Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Nal(1)Leu-Ala-Ala-Arg-Sar или Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar. Согласно некоторым способам реализации данного изобретения два или более, предпочтительно от двух до шести остатков аминокислот, независимо выбранных из 20 генетически кодируемых Lаминокислот или стереоизомерных D-аминокислот, связаны либо с одним из концов описанных выше основных (коровых) последовательностей, либо с обоими. Например, последовательность GG будет во многих случаях пришита либо к одному из концов коровой последовательности, либо к обоим с целью облегчения синтеза пептида. Настоящее изобретение также предусматривает конъюгаты этих пептидов и производных с миметиками пептидов, которые сохраняют свойство связывания ЭПО-рецептора. Стереоизомеры (например, D-аминоксилоты) двадцати обычных аминокислот, не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как а,а-дизамещенные аминокислоты, N-алкилкиламинокислоты, молочная кислота и другие минорные аминокислоты, также могут быть подходящими компонентами соединений согласно настоящему изобретению. Примеры минорных аминокислот включают, без ограничения, -7 010016 аланин, 3-приридилаланин, 4-гидроксипролин, О-фосфосерин, N-метилглицин, N-ацетилсерин, Nформилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, нор-лейцин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты. В предпочтительных способах реализации пептидные фрагменты согласно данному изобретению содержат внутримолекулярную дисульфидную связь между двумя остатками цистеина основной последовательности. Например,Димеры и олигомеры пептидов. В предпочтительном способе реализации мономерные пептидные фрагменты согласно настоящему изобретению димеризуют или олигомеризуют с целью образования димеров или олигомеров. В одном способе реализации мономеры пептидов согласно данному изобретению могут быть олигомеризованы путем использования системы биотин/стрептавидин. Биотинилированные аналоги мономеров пептидов могут быть синтезированы по стандартным методикам. Например, мономеры пептидов могут быть подвергнуты биотинилированию С-конца. Затем такие биотинилированные мономеры олигомеризуют путем инкубации со стрептавидином (например, в молярном отношении 4:1 при комнатной температуре в фосфатном буферном растворе (ФБР, PBS) или в среде RPMI (Invitrogen) с буферомHEPES в течение 1 ч). В одном из вариантов этого способа реализации биотинилированные мономеры пептидов могут быть олигомеризованы путем инкубации с одним или несколькими из коммерчески доступных антибиотиновых антител (например, антибиотиновый IgG козы от KirkegaardPerry Laboratories, Inc.(Вашингтон, Округ Колумбия, США. Линкеры. В предпочтительных способах реализации мономеры пептидов согласно данному изобретению димеризуют путем ковалентного присоединения по меньшей мере к одному линкерному фрагменту. Линкерный (LK) фрагмент предпочтительно, хотя и не обязательно, представляет С 1-12 линкерный фрагмент,факультативно заканчивающийся одной или двумя связями -NH- и возможно содержащий замены в одном или двух доступных атомах углерода заместителем, который представляет собой низший алкил. Линкер LK предпочтительно содержит -NH-R-NH-, где R обозначает низший (С 1-6) линейный углеводород, замещенный функциональной группой, такой как карбоксильная группа или аминогруппа, которая позволяет присоединять другой молекулярный фрагмент (который может, например, присутствовать на поверхности твердого носителя (подложки. Наиболее предпочтительно линкер представляет собой остаток лизина или амид лизина (остаток лизина, в котором карбоксильная группа была трансформирована в амидный фрагмент -CONH2). B предпочтительных способах реализации линкер соединяет С-концы двух пептидных мономеров путем одновременного присоединения к С-концевой аминокислоте каждого мономера. Например, в случае, когда С-концевой линкер LK представляет собой амид лизина, структура димера может быть изображена, как показано в формуле I. Обобщенное изображение дано в формуле II. Формула I Формула II В формуле I и формуле II N2 представляет атом азота -аминогруппы лизина, а N1 представляет атом азота -аминогруппы лизина. Структуры димеров могут быть записаны следующим образом: [пептид]2Lys-амид, чтобы обозначить пептиды, связанные с - и -аминогруппами лизина, или [Аспептид]2Lys-амид, чтобы обозначить ацетилированные на N-конце пептиды, связанные - и аминогруппами лизина, или [Ас-пептид-дисульфид]2Lys-спейсер-ПЭГ, чтобы обозначить ацетилированные на N-конце пептиды, связанные - и -аминогруппами лизина, каждый из которых содержит внутримолекулярную дисульфидную петлю, и молекулу спейсера, образующую ковалентную связь между Сконцом лизина и фрагментом ПЭГ. Обычно, хотя и не обязательно, димеры пептидов, полученные по методике, отличной от образования межмолекулярных дисульфидных связей, содержат одну или более дисульфидных связей между остатками цистеина пептидных мономеров. Например, два мономера могут быть поперечно сшиты одной или более межмолекулярными дисульфидными связями. Предпочтительно два мономера содержат по меньшей мере одну внутримолекулярную дисульфидную связь. Наиболее предпочтительно оба мономера пептидного димера содержат внутримолекулярную дисульфидную связь, чтобы каждый мономер содержал циклическую группу.-8 010016 Модификация пептидов. Также можно модифицировать амино- и/или карбоксильные концы пептидных соединений согласно настоящему изобретению для того, чтобы получить другие соединения согласно данному изобретению. Модификации N-конца включают метилирование (т.е. -NHCH3 или -N(СН 3)2) ацетилирование (например, уксусной кислотой или ее галоген-производными, такими как -хлоруксусная кислота, бромуксусная кислота или -йодуксусная кислота), добавление бензилоксикарбонильной (Cbz) группы или блокирование N-конца блокирующей группой, содержащей карбоксилатную функциональную группу, обозначенную RCOO-, или сульфонильную функциональную группу, обозначенную R-SO2-, где R выбирают из алкильной, арильной, гетероарильной, алкил-арильной, а также подобным им и аналогичных групп. Также можно ввести дезаминокислоту в N-конец (таким образом на нем будет отсутствоватьN-концевая аминогруппа), чтобы снизить чувствительность к протеазам или чтобы ограничить разнообразие конформаций пептидного соединения. В предпочтительных способах реализации N-конец ацетилирован. В наиболее предпочтительных способах реализации N-концевой глицин ацетилирован, в результате чего образуется N-ацетилглицин (AcG). Модификации С-конца включают замену свободных аминокислот карбоксамидной группой или образование циклического лактама на С-конце с целью введения структурных ограничений. Можно также подвергать пептиды согласно данному изобретению циклизации или вводить дезамино- или декарбоксиостатки на концах пептида таким образом, что на них будет отсутствовать концевая амино- или карбоксильная группа, с целью снизить чувствительность к действию протеаз или чтобы ограничить разнообразие возможных конформаций пептида. С-концевые функциональные группы соединения согласно настоящему изобретению включают амиды, низшие алкиламиды, ди(низший алкил)амиды, низшие алкокси-, гидрокси- и корбоксигруппы, а также их производные с низшими эфирами и их фармацевтически приемлемые соли. Можно заменить встречающиеся в природе боковые радикалы 20 генетически кодируемых аминокислот (или стереоизомерических D-аминоксилот) другими боковыми радикалами, например, такими группами, как алкильные группы, низшие алкилы, циклические 4-, 5-, 6- до 7-членные алкилы, амиды,низший алкиламид-, низшие алкокси-, гидрокси-, карбоксигруппы и их производные с низшими эфирами, а также 4-, 5-, 6- до 7-членные гетероциклические группы. В частности, можно применять аналоги пролина, в которых размер кольца остатка пролина измененили с 5-членного на 4-, 6- или 7-членное. Циклические группы могут являться насыщенными или ненасыщенными, а ненасыщенные - ароматическими или неароматическими. Гетероциклические группы предпочтительно содержат следующие гетероатомы (один или более): азот, кислород и/или серу. Примеры таких групп включают фуразанил-, фуранил-, имидазолидил-, имидазолил-, имидазолил-, изотиазолил-, изоксазолил-, морфолинил- (например,морфолино-), оксазолил-, пиперазинил- (например, 1-пиперазниил-), пиперидил- (например, 1 пиперидил-, пиперидино-), пиранил-, пиразинил-, пиразолидил-, пиразонил-, пиразолинил-, пиридазинил-, пиридил-, пиримидинил-, пирролидинил- (например, 1-пирролидинил-), пирролинил-, иирролил-,тиадиазолил-, тиазолил-, тиенил-, тиоморфолинил- (например, тиоморфолино-) и триазолилгруппы. Эти гетероциклические группы могут являться замещенными или незамещенными. В случае замещенной группы заместитель может представлять собой алкил, алкоксигруппу, галоген, кислород либо замещенный или незамещенный фенил. Можно без труда модифицировать пептиды путем фосфорилирования, а также другими способами[например, как описано в Hruby et al. (1990) Biochem. J. 268:249-262]. Пептидные соединения согласно данному изобретению также служить структурной моделью непептидных соединений со сходной биологической активностью. Специалисты в данной области осознают, что доступно множество методик, позволяющих конструировать соединения с биологической активностью идентичной или аналогичной активности пептидного соединения-образца, но с более подходящей, чем у образцового пептида, активностью в отношении растворимости, стабильности и подверженности гидролизу и протеолизу [см., Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252]. Эти методики включают замену пептидного остова остовом, составленным из фосфонатов, амидатов, карбаматов, сульфонамидов, вторичных амидов и N-метиламинокислот. Мономеры, димерны или олигомерны пептидных фрагментов могут быть присоединены непосредственно к фрагменту ПЭГ или через один или более спейсерных фрагментов. Спейсерный фрагмент. В тех способах реализации, где мономерны, димерны или олигомерны пептидных фрагментов присоединены к фрагменту ПЭГ через спейсерный фрагмент, спейсерный фрагмент может факультативно представлять собой фрагмент, заканчивающийся -NH-связями или -C(O)O-группами. Например, спейсер может представлять собой низший (С 1-12) линейный углеводород, факультативно замещенный функциональными группами, такими как карбоксильная группа или аминогруппа, которые обеспечивают связывание с другим молекулярным фрагментом, либо одним или более остатков глицина (G) или аминогексановыми кислотами (Ahx), такими как 6-аминокапроевая кислота, либо остатками лизина (K), либо амида лизина (K-NH2, остаток лизина, в котором карбоксильная группа была трансформирована в амид-9 010016 ный фрагмент -CONH2). В предпочтительных способах реализации спейсерный фрагмент имеет следующую структуру:-NH-(CH2)-[O-(CH2)]O-(CH2)-Y-,где каждое из чисел , , ,иявляется целым, значение которого выбирают независимо от других. В предпочтительных способах реализации В некоторых предпочтительных способах реализации =2 при 1. В одном из особенно предпочтительном способе реализации В других предпочтительных способах реализации В одном из способов реализации Согласно данному изобретению водорастворимый фрагмент (предпочтительно ПЭГ) присоединен кNH-концу спейсера. Водорастворимый фрагмент может быть присоединен непосредственно к спейсеру,либо он может быть присоединен не напрямую, например, амидной или карбаматной связью. Пептидный фрагмент присоединен к Y-концу спейсера. Спейсер может быть присоединен либо к С-концу, либо к Nконцу пептида. Поэтому в тех способах реализации, где спейсер присоединен к С-концу пептида, Y представляет собой NH. В тех способах реализации, где спейсер присоединен к N-концу пептида, Y представляет собой СО. В предпочтительных способах реализации спейсер согласно данному изобретению присоединен к пептидному димеру описанным ниже линкером на основе лизина. В таком способе реализации спейсер предпочтительно присоединен к С-концу линкерного фрагмента, а Y представляет собой NH. В другом предпочтительном способе реализации спейсер согласно данному изобретению присоединен к пептиду как часть трифункционального линкера (также описан ниже). В этом способе реализации Y представляет собой СО, и Y образует амидную связь с атомом N трифункционального линкера. Спейсерный фрагмент может быть введен в пептид в ходе синтеза пептида. Например, если спейсер содержит свободную аминогруппу и вторую функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая дает возможность связывания с другим молекулярным фрагментом, спейсер может быть конъюгирован с твердым носителем. Затем пептид можно синтезировать, непосредственно используя свободную аминогруппу спейсера по стандартным методикам твердофазного синтеза. В одном из предпочтительных способов реализации спейсер, содержащий две функциональные группы, вначале связывают с твердой подложкой через первую функциональную группу. Когда предстоит синтезировать димер пептидов, спейсер факультативно конъюгируют через вторую функциональную группу спейсера и третью функциональную группу линкера с линкерным LK фрагментом, имеющим две- 10010016 или более функциональные группы, которые могут служить сайтами инициации синтеза пептидов, и дополнительную функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая обеспечивает связывание с другим молекулярным фрагментом. Затем два мономера пептида могут быть синтезированы непосредственно на на двух химически активных азотных группах линкерного LK фрагмента (вариант методики твердофазного синтеза). Например, может быть проведена реакция связанного с твердой подложкой спейсера со свободной аминогруппой с лизиновым линкером через свободную карбоксильную группу линкера. В альтернативных способах реализации, где пептидный фрагмент присоединен к спейсерному фрагменту, указанный спейсер может быть конъюгирован с пептидом после синтеза пептида. Такая конъюгация может быть достигнута способами, хорошо разработанными в данной области. В одном из способов реализации линкер содержит по меньшей мере одну функциональную группу, подходящую для присоединения к функциональной группе-мишени синтезированного пептида. Например, может быть проведена реакция спейсера со свободной аминогруппой с карбоксильной группой C-конца пептида. В другом примере может быть проведена реакция спейсера со свободной карбоксильной группой со свободной аминогруппой N-конца пептида или остатком лизина в пептиде. В еще одном примере спейсер,содержащий свободную сульфгидрильную группу, может быть конъюгирован с остатком цистеина в пептиде путем окисления с образованием дисульфидной связи. Фармацевтические составы. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены фармацевтические составы вышеупомянутых пептидных соединений - агонистов ЭПО-рецепторов. Состояния, которые облегчает или корректирует введение таких составов, включают указанные выше. Такие фармацевтические составы могут предназначаться для перорального, парентерального (внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного или подкожного), чрескожного (пассивного либо с применением ионофореза или электропорации) путей введения, введения через слизистые оболочки (назально, ректально, вагинально или сублингвально), либо с использованием биоразрушаемых вставок и могут быть приготовлены в виде лекарственных форм, подходящих для каждого из путей введения. В целом, данное изобретение охватывает фармацевтические составы, содержащие терапевтически эффективные количества пептида - агониста ЭПО-рецептора, или производных продуктов согласно данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемыми дилюентами (разбавителями), консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие составы включают дилюенты, содержащие различные буферные вещества (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат), с различными значениями pH и ионной силы, добавки, такие как ПАВ и солюбилизирующие вещества (например, Tween 20, Tween 80, Polysorbate 80), антиоксиданты(например, аскорбиновая кислота, метабисульфат натрия), консерванты (например, Thimersol, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннитол); соединения могут быть включены в частицы полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д. или в липосомы. Также может быть использована гиалуроновая кислота. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo настоящих белков и производных. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042) pages 1435-1712, которая включена сюда путем ссылки. Составы могут быть приготовлены в жидкой форме или в форме высушенного порошка (например, лиофилизированного). Пероральная доставка. Предусматривается применение твердых лекарственных форм для перорального применения, которые в общем виде описаны в главе 89 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack PublishingCo. Easton PA 18042), которая включена сюда путем ссылки. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, троше или пастилки, саше, болюсы, порошки или гранулы. Также для приготовления лекарственных форм составов согласно данному изобретению может быть применено заключение в липосомальную или белковую капсулы (как, например, белковые микросферы, описанные в патенте США U.S. Patent4925637). Может быть применено заключение в липосому, а липосомы могут быть модифицированы разнообразными полимерами (например, патент США U.S. Patent5013556). Описание возможных твердых лекарственных форм для терапевтических веществ дано в Marshall, K. В: ModernPharmaceutics изданной G.S. Banker and C.T. Rhodes, Глава 10, 1979 и включено в данное описание путем ссылки. В целом, рецептура будет включать пептиды-агонисты ЭПО-рецептора (или их химически модифицированные формы) и инертные ингредиенты, которые обеспечивают защиту от среды желудка и высвобождение биологически активного материала в кишечнике. Также предусматривается применение жидких лекарственных форм для перорального введения,включая фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать другие компоненты, включая инертные дилюенты, адъюванты, такие как смачивающие вещества,эмульгирующие и суспендирующие вещества, подслащивающие вкусовые и ароматизирующие вещества. Пептиды могут быть химически модифицированы таким образом, что пероральная доставка производных становится эффективной. Обычно, рассмотренная химическая модификация заключается в присоединении по крайней мере одного компонента к молекуле самого соединения, где указанный компо- 11010016 нент обеспечивает (а) ингибирование протеолиза и (b) всасывание в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно увеличить общую стабильность соединения или соединений, а также увеличить время циркуляции в организме. Как обсуждалось выше, присоединение ПЭГ является предпочтительной химической модификацией для фармацевтического применения. Другие присоединяемые компоненты, которые могут быть использованы, включают пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, спирт поливинил пирролидона, поливинил пирролидон, полипролин, поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан [см., например, Abuchowski and Davis (1981) "SolubleYork, NY) pp. 367-383; and Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189]. В случае лекарственных форм для перорального введения местом высвобождения может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка и подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалистам в данной области доступны лекарственные формы, которые не растворяются в желудке, но высвободят материал в двенадцатиперстной кишке или каком-либо другом участке кишечника. Предпочтительно избегать отрицательного воздействия среды желудка на высвобождение либо путем защиты пептида (или производной) либо путем высвобождения пептида (или производной) вне среды желудка, например в тонком кишечнике. Для того чтобы обеспечить устойчивость к среде желудка, необходима оболочка, непроницаемая для pH, равного по меньшей мере 5,0. Примерами наиболее обычных инертных ингредиентов, которые применяют в качестве растворяющихся в кишечнике оболочек, являются ацетат тримеллитат целлюлозы(CAT), фталат гидроксипропилметил целлюлозы (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, поливинилацетата фталат (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ацетат фталат целлюлозы (CAP), Eudragit L, Eudragit S и Shellac. Эти оболочки можно применять в виде смешанных пленок. Для таблеток можно также применять покрытие или смесь покрытий, которые не предназначены для защиты от среды желудка. Эти покрытия могут включать сахарные оболочки или оболочки, которые облегчают проглатывание таблеток. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой как желатиновая), предназначенной для доставки сухих терапевтических веществ (т.е. порошка), для жидких форм можно применять мягкий желатин. Материал оболочки каше может представлять собой густой крахмал или другую съедобную оболочку (например, усваиваимый полимер глюкозы). Для пилюлей, пастилок,формовых таблеток или таблетированных порошков можно применять методики обработки влажной массы. Пептид (или производная) может быть включен в лекарственную форму в виде отдельных мелких частиц в форме гранул или шариков с размером частиц примерно 1 мм. Лекарственная форма материала для введения в капсуле может также представлять собой порошок, прессованную пластинку или даже таблетки. Эти терапевтические вещества могут быть приготовлены путем прессования. Также могут быть добавлены красители и/или вкусовые добавки. Например, можно изготовить (таким способом, как инкапсулирование в липосому или микросферу) лекарственную форму, содержащую пептид (или производную) и затем ввести ее в съедобный продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий краситель и вкусообразующее вещество. Пептид (или производную) можно разбавить или увеличить его объем инертным материалом. Эти дилюенты (разбавители) могут включать углеводы, в особенности маннитол, -лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Также в качестве наполнителей можно использовать некоторые неорганические соли, такие как трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторые коммерчески доступные дилюенты Fast-flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell. В рецептуру терапевтического вещества в твердой лекарственной форме могут также быть включены дезинтегрирующие вещества. Материалы, используемые в качестве дезинтегрирующих веществ,включают, без ограничения, крахмал, включая коммерческое дезинтегрирующее вещество на основе крахмала, Explotab. Можно использовать крахмал-гликолят натрия, Amberlite, натрий карбоксиметилцеллюлозу, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, желатин, кожуру апельсина, кислую карбоксиметилцеллюлозу, природную губку и бентонит. Дезинтегрирующие вещества могут также представлять собой нерастворимые катионообменные смолы. В качестве дезинтегрирующих веществ можно также применять порошковые камеди, которые могут включать такие порошковые камеди, как агар, камедь карайи или трагакантовую камедь. Альгеновая кислота и ее натриевая соль также пригодны в качестве дезинтегрирующих веществ. Для того чтобы связать пептидное (или производное) соединение для формирования твердой таблетки, можно применять связывающие вещества, которые включают натуральные материалы, такие как акация, трагакант, крахмал и желатин. Другие включают метилцеллюлозу (МЦ, MC), этилцеллюлозу(ЭЦ, ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, CMC). Для гранулирования пептида (или производной) можно применять поливинил пирролидон (ПВП, PVP) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, CMC) в спиртовых растворах. Для того чтобы предотвратить слипание в ходе приготовления, в рецептуру пептида (или производной) могут быть включены антифрикционные вещества. Смазывающие вещества можно применять в- 12010016 виде прослойки между пептидом (или производной) и стенкой гнезда формы. Эти смазывающие вещества могут включать, без ограничения, стеариновую кислоту, включая ее магниевые и кальциевые соли,политетрафлюороэтилен (ПТФЕ), вазелиновое масло, масла и воски растительного происхождения. Можно также использовать растворимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль разных молекулярных масс, Carbowax 4000 и 6000. Скользящие вещества могут улучшить пластичность лекарственного вещества в ходе приготовления, и их можно добавлять для того, чтобы облегчить преобразования в ходе прессования. Скользящие вещества могут включать крахмал, тальк, пирогенный кварц и гидратный силикоалюминат. Чтобы облегчить растворение пептида (или производной) в водной среде можно добавить поверхностно-активное вещество в качестве смачивающего вещества. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктила натрия и сульфонат диоктила натрия. Можно использовать катионные детергенты, которые могут включать хлорид бензалкония или хлорид бензетомия. Список потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в рецептуру в качестве поверхностно-активных веществ, составляют lauromacrogol 400,polyoxyl 40 stearate (полиоксил стеарат), polyoxyethylene castor oil 10, 50 и 60 (полиоксиэтиленовое касторовое масло), glycerol monostearate (моностеарат глицерина), polysorbate 20, 40, 60, 65 и 80, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностноактивные вещества могут присутствовать в рецептуре белка или производной либо самостоятельно, либо в разных соотношениях в составе смесей. Добавки, которые потенциально повышают всасывание пептида (или производной), представляют собой, например, жирные кислоты, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту. Может быть желательно получить лекарственные формы для перорального введения с отложенным высвобождением. Пептид (или производная) может быть связан с инертным матриксом (основой), который делает возможным высвобождение по механизму диффузии или выщелачивания. Такой матрикс может представлять собой, например, камедь. Также в лекарственную форму могут быть введены медленно разрушающиеся матриксы. Некоторые растворяющиеся в кишечнике оболочки обладают эффектом отложенного высвобождения. Другая форма контролируемого высвобождения представлена способом, основанным на терапевтической системе Oros (Alza Corp.), т.е. лекарственное вещество заключено в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде проникать внутрь и выталкивать лекарственное вещество наружу через единственное маленькое отверстие, благодаря осмотическим эффектам. Для приготовления лекарственной формы могут быть использованы другие оболочки. Эти оболочки включают разнообразные сахара, которые могут быть нанесены на форму для изготовления оболочки. Пептид (или производную) также можно давать в виде покрытой пленкой таблетки, использованные в этом примере материалы разделены на две группы. К первой группе относятся некишечные материалы(т.е. материалы, которые растворяются не в кишечнике). Эта группа включает метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, повидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа состоит из растворяющихся в кишечнике материалов, которые обычно представляют собой сложные эфиры фталевой кислоты. Для получения оптимального пленочного покрытия можно использовать смесь материалов. Нанесение пленочного покрытия может быть произведено в формовочном устройстве для нанесения покрытий либо в псевдоожиженном слое, либо путем напрессовывания покрытия. Парентеральная доставка. Препараты согласно этому изобретению для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей или разбавителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Такие лекарственные формы могут также содержать адъюванты, такие как консервирующие,смачивающие, эмульгирующие и диспергирующие вещества. Препараты могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через бактериальный фильтр, путем введения в состав стерилизующих средств, путем облучения составов или путем нагревания составов. Они также могут быть изготовлены с применением стерильной воды или какой-либо другой стерильной среды для инъекций, непосредственно перед использованием. Ректальная или вагинальная доставка. Составы для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут содержать, в дополнение к активному веществу, наполнители, такие как масло какао или воск для суппозиториев. Составы для назального или сублингвального введения также готовят со стандартными наполнителями, хорошо известными в данной области. Пульмональное введение (через легкие). Также предусматривается пульмональная доставка пептидов-агонистов ЭПО-рецептора (или их производных). Пептид (или производная) доставляется в легкие млекопитающих при вдыхании и переходит через эпителиальную выстилку легкого в кровеносное русло [см., например, Adjei, et al. (1990)on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al.,(1988) J. Immunol. 140:3482-3488 (интерферон- и фактор некроза опухолей ); Патент США U.S. Pat.5284656 (Platz, et al.) (гранулоцит-колониестимулирующий фактор). Способ и состав для пульмональной доставки лекарственного вещества для системного действие описан в патенте США U.S. Pat.5451659,Wong et al. Для применения в реализации этого изобретения предусмотрен широкий ряд механических приспособлений, сконструированных для пульмональной доставки терапевтических продуктов, включающий,без ограничения, небулайзеры, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, каждый из которых хорошо известен специалистам в данной области. Некоторые конкретные примеры коммерчески доступных приспособлений, подходящих для реализации этого изобретения: небулайзер Ultravent (MallinckrodtInc., Сент-Луис, Колорадо, США), небулайзер AcornII (Marquest Medical Products, Инглевуд, Колорадо,США), дозирующий ингалятор Ventolin и порошковый ингалятор Spinhaler (Fisons Corp., Бедфорд, Массачусетс, США). Все подобные приспособления требуют применения лекарственных форм, подходящих для дозирования пептида (или производной). Обычно, каждая лекарственная форма специфична по отношению к типу используемого приспособления и может включать применение соответствующего пропеллента в дополнение к обычным дилюентам, адъювантам и/или носителям, применяемым в терапии. Также рассмотрено применение липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включений или других типов носителей. Химически модифицированные пептиды также можно приготовить в виде разных лекарственных форм в зависимости от типа химической модификации или типа используемого приспособления. Также модифицированный пептид может быть приготовлен в разных лекарственных формах в зависимости от типа химической модификации и применяемого устройства. Лекарственные формы, подходящие для применения с небулайзерами, струевыми или ультразвуковыми, обычно содержат пептид (или его производную), растворенный в воде до концентрации примерно от 0,1 до 25 мг биологически активного белка на мл раствора. Лекарственная форма может также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и регуляции осмотического давления). Лекарственная форма для небулайзера может также содержать поверхностно-активное вещество для предотвращения агрегации пептида (или производной) на поверхности, вызванное атомизацией раствора при образовании аэрозоля. Лекарственная форма для применения в дозирующем ингаляторе будет, в общем случае, содержать тонкоизмельченный порошок, содержащий пептид (или производную), суспендированный в пропелленте при помощи поверхностно-активного вещества. Пропеллент может представлять любой обыкновенный материал, употребляемый обычно для этой цели, такой как хлорофлуороуглерод, гидрохлорофлуороуглерод, гидрофлуороуглерод или углеводород, включая трихлорфлуорометан, дихлорфлуорометан, дихлортетрафлуорометанол и 1,1,1,2-тетрафлюороэтан, либо их комбинации. Подходящие поверхностноактивные вещества включают триолеат сорбита и лецитин сои. Также в качестве поверхностноактивного вещества можно применять олеиновую кислоту. Лекарственные формы для дозирования из порошкового ингалятора будут содержать тонкоизмельченный сухой порошок, содержащий пептид (или производную), и также могут включать наполнитель,такой как лактоза, сорбит, сахароза, маннитол в количествах, которые облегчают распыление порошка из приспособления, например от 50 до 90 мас.% лекарственной формы. Наиболее предпочтительно приготовление пептида (или производной) в форме частиц со средним размером, меньшим чем 10 мкм (или микрон), наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мкм для наиболее эффективной доставки в нижние отделы легкого. Назальная доставка. Также рассмотрена назальная доставка пептидов-агонистов ЭПО-рецептора (или их производных). Назальная доставка делает возможным переход пептида в кровеносное русло непосредственно после введения терапевтического продукта в нос, без необходимости накопления этого продукта в легких. Лекарственные формы для назальной доставки включают формы, содержащие декстран или циклодекстран. Дозировки. По мере проведения дальнейших исследований будет появляться информация относительно подходящих уровней дозировки для лечения различных состояний у различных пациентов, и работник обычной квалификации сможет, принимая во внимание терапевтический контекст, возраст и общее состояние здоровья пациента, определить подходящую дозу. Выбранные дозировки зависят от желаемого терапевтического эффекта, пути введения и желаемой продолжительности лечения. Обычно млекопитающим ежедневно вводят дозировки от 0,001 до 10 мг/кг массы тела. Обычно дозировки для внутривенных инъекций могут быть ниже. Режим дозирования можно варьировать в зависимости от полужизни циркуля- 14010016 ции и используемой лекарственной формы. Пептиды согласно настоящему изобретению (или их производные) можно вводить совместно с одним или более дополнительных активных ингредиентов или фармацевтических составов. Примеры Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не являются ограничивающими. Пример 1. Синтез молекулы Н-ТАР-Вос. Этап А. Синтез Cbz-TAP.(DCM) (100 мл) охлаждали до 0C. К раствору ТАР медленно в течение 6-7 ч добавляли через капельную воронку раствор бензилхлороформата (Cbz-Cl, Cbz=карбоксибензилокси) (4,82 мл, 33,7 ммоль) безводном DCM (50 мл), поддерживая температуру реакционной смеси в течение всего процесса на уровне 0 С. Затем полученной смеси позволяли нагреться до комнатной температуры (25 С). После еще 16 ч DCM удаляли под вакуумом и разделяли остаток между 3 н. HCl и эфиром. Собирали водные фазы, нейтрализовали их 50 вод.% NaOH и экстрагировали этилацетатом. Фракцию этилацетата высушивали над безводной Na2SO4, а затем концентрировали под вакуумом, получая в результате неочищенный моно-CbzTAP (5 г, выход около 50%). Это соединение использовали в реакции этапа В без дальнейшей очистки. Этап В. Синтез Н-ТАР-Вос. Вос 2 О (3,86 г, Вос=трет-бутоксикарбонил) добавляли к энергично перемешанной суспензии CbzTAP (5 г, 17,7 ммоль) в гексане (25 мл). Перемешивание продолжали в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (25 мл) и промывали 10 вод.% лимонной кислоты (2X), водой (2X) и раствором NaCl. Органическую фазу высушивали над безводной Na2SO4 и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт (выход 5 г) непосредственно использовали в реакции этапа С. Этап С. Синтез Вос-ТАР. Неочищенный Cbz-TAP-Boc, полученный на этапе В, растворяли в метаноле (25 мл) и гидрогенизировали в присутствии 5% катализатора палладий на угле (5 мас.%) под баллонным давлением в течение 16 ч. Смесь фильтровали, промывали метанолом и концентрировали фильтрат под вакуумом, получая в результате неочищенный продукт Н-ТАР-Вос (выход 3,7 г). Общий выход после этапов A-C составил приблизительно 44% (расчет по отношению к количеству использованного Cbz-Cl). Пример 2. Присоединение спейсера к пептиду со свободным С-концом. Приведенная ниже схема реакции показывает, как присоединить спейсер к пептиду со свободным С-концом. Пептид со свободным С-концомH-TAP-Boc готовили согласно примеру 1. DCC обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид. Пример 3. Присоединение спейсера к пептиду со свободной кислотной группой бокового радикала.- 15010016 Приведенная ниже схема реакции показывает, как присоединить спейсер к пептиду со свободным С-концом. Пептид со свободной кислотной группой бокового радикалаTFA обозначает трифторуксусную кислоту. Пример 4. Ковалентное присоединение ПЭГ к пептиду при помощи mPEG-NPC. Пептид с ТАР, присоединенным к С-концу Пример 5. Ковалентное присоединение ПЭГ к пиптиду при помощи mPEG-SPA. Пептид с ТАР, присоединенным к С-концу Пример 6. Присоединение спейсера к пептиду и синтезирование пептида. Приведенная ниже схема реакции показывает, как присоединить спейсер к твердому носителю(подложке) и синтезировать пептид на таком твердом носителе. Пример 7. Синтез пептидного димера со спейсером, присоединенным к смоле. Этап А. Синтез TentaGel-линкер.(5 экв.) нагревали в 20 мл N,N-диметилформамида (DMF) в течение 14 ч до 70 С. После охлаждения до комнатной температуры смолу промывали (0,1 н. HCl, ацетонитрил (Acetonitril, ACN), DMF, MeOH) и высушивали с получением в результате смолы янтарного цвета. Этап В. Синтез TentaGel-линкер-TAP(Boc). 2,5 г смолы, полученной на этапе А (см. выше), и Н-ТАР-Вос (1,5 г, 5 экв.) и кристаллическийAcOH (34 мкл, 5 экв.) брали в смеси МеОН/тетрагидрофуран(THF) 1:1 и встряхивали в течение ночи. К смеси добавляли 1M раствор цианоборогидрида натрия (5 экв.) в THF и встряхивали в течение ещ 7 ч. Смолу фильтровали, промывали (DMF, THF, 0,1 н. HCl, вода, MeOH) и высушивали. Небольшое количество смолы бензолировали бензилхлоридом и диизопропилэтиламином (DIEA) в дихлорметане, расщепляли 70% трифторуксусной кислотой (TFA)-DCM и проверяли путем жидкостной хроматомассспектрометрии (LCMS) и ВЭЖХ (HPLC). Этап С. Синтез TentaGel-линкер-TAP-Lys. Смолу, полученную на этапе В (см. выше), обрабатывали активированным раствором FmocLys(Fmoc)-OH (Fmoc=9-флуоренметоксикарбонил, приготовленный из 5 экв. аминокислоты и 5 экв.HATU (гексалфуорофосфат N,N,N',N'-тетраметил-0-(7-азабензотриазол-1-ил)урония), растворенного в концентрации 0.5M в DMF, с последующим добавлением 10 экв. DIEA) и осторожно встряхивали в течение 14 ч. Затем смолу промывали (DMF, THF, DCM, MeOH) и высушивали, получая в результате защищенную смолу. Остаточные аминогруппы кэппировали (защищали) путем обработки смолы раствором 10% уксусного ангидрида, 20% пиридина в дихлорметане в течение 20 мин с последующей промывкой(как описано выше). Группы Fmoc удаляли путем осторожного встряхивания смолы в 30% растворе пи- 17010016 перидина в DMF в течение 20 мин с последующей промывкой (DMF, THF, DCM, MeOH) и высушиванием. Этап D. Синтез TentaGel-линкер-TAP-Lys. Смолу, полученную на этапе D (см. выше), подвергали повторным циклам присоединения Fmocаминокислоты с активацией HBTU/HOBt и удаления группы Fmoc пиперидином, в результате чего происходило одновременное построение обеих пептидных цепей. Эту процедуру стандартным образом проводили на автоматическом синтезаторе пептидов ABI 433, коммерчески доступном от AppliedBiosystems, Inc. После последнего удаления Fmoc концевые аминогруппы ацетилировали уксусным ангидридом (10 экв.) и DIEA в течение 20 мин с последующей промывкой, которую проводили, как описано выше. Этап E. Отщепление от смолы. Смолу, полученную на этапе D (см. выше), суспендировали в растворе, состоящем из TFA(82,5%),фенола (5%), этандитиола (2,5%), воды и тиоанизола (5%) в течение 3 ч при комнатной температуре. Также можно использовать альтернативные отщепляющие смеси, такие как TFA (95%), вода (2,5%) и триизопропилсалин (2,5%). Раствор TFA охлаждали до 5C и вливали в Et2O для осаждения пептида. Фильтрация и сушка при пониженном давлении давали желательный димер пептида со спейсером. Очистка путем препаративной ВЭЖХ (колонка С 18) давала очищенный пептидный димер со спейсером. Этап F. Окисление. Димерный пептид растворяли в 20% водном растворе DMSO (1 мг сухой массы белка/мл) и отстаивали при комнатной температуре в течение 36 ч. Пептид очищали путем загрузки в колонку C18 для ВЭЖХ (Waters Delta-Pak C18, размер частиц 15 мкм, размер пор 300 , 40 мм 200 мм длина) с последующим нанесением на линейный градиент ACN/вода/0,01% TFA от 5 до 95% ACN в течение 40 мин. Лиофилизация фракций, содержащих целевой пептид, давала сыпучий белый твердый продукт. Пример 8. Ковалентное присоединение ПЭГ (ПЭГилирование) к пептидному димеру со спейсером при помощи mPEG-NPC.- 18010016 например, Димерный пептид, присоединенный к спейсеру, смешивали с равным количеством (в молях) активированных молекул ПЭГ (mPEG-NPC производства NOF Corp., Япония, доступные для приобретения через Nektar Therapeutics, США, (бывшая "Shearwater Corp." в сухом DMF, получая в результате прозрачный раствор. Через 5 мин к этому раствору добавляли 4 экв. DIEA. Смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 14 ч, после чего следовала очистка путем обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке С 18. Структуру пептида с ковалентно присоединенным ПЭГ подтверждают путем массспектрометрии (модификация MALDI - Matrix-assisted-laser-desorption-ionization, ионизация лазерной десорбцией при содействии матрикса). Пример 9. Ковалентное присоединение ПЭГ к пептидному димеру со спейсером при помощи Ковалентное присоединение ПЭГ к пептидному димеру со спейсером можно также произвести при помощи mPEG-SPA. Образец, полученный в примере 8, использовали для идентификации ионообменного носителя,подходящего для очистки конъюгатов пептид-спейсер-ПЭГ. Общая процедура представляет собой следующее: ионообменную смолу (2-3 г) загружали в 1 см колонку, после чего колонку переводили в натриевую форму (0,2 н. NaOH загружали в колонку до получения значения pH элютанта, равного 14), а затем в во- 19010016 дородную форму (элюировали либо 0,1 н. HCl, либо 0,1M HOAc до тех пор, пока pH элютанта не совпадал с pH загрузки), после чего следовала промывка 25% водным раствором ACN до достижения pH 6. Пептид до конъюгирования с ПЭГ или конъюгат пептид-ПЭГ растворяли в 25% водном растворе ACN(10 мг/мл) и доводили значение pH до 3 при помощи TFA, после чего загружали в колонку в раздельных экспериментах. После промывки 2-3 об. колонки 25% водного раствора ACN и сбора 5 мл фракций пептид высвобождали из колонки путем элюции 0,1M раствором NH4OAc в 25% водном растворе ACN,снова собирая 5 мл фракции. Исследование путем ВЭЖХ выявляло фракции, содержащие желаемый пептид. Исследование на испарительном детекторе светорассеяния (ELSD) показал, что когда пептид удерживался на колонке и его элюировали раствором NH4OAC (обычно между фракциям 4 и 10), загрязнения неконъюгированным ПЭГ выявлено не было. Когда пептид элюировали исходным промывочным буфером (обычно первые две фракции), не было выявлено разделения желательного конъюгата с ПЭГ и избыточного ПЭГ. Ионообменные носители выбирали на основании их способности разделять конъюгат пептид-ПЭГ и непрореагировавший (или гидролизованный) ПЭГ, а также способности удерживать исходный димерный пептид. Следующие инонообменные носители были идентифицированы как подходящие: Колонка MonoS HR 5/5, загруженная сильным катионообменным носителем (Amersham Biosciences), сильный катионообменный целлюлозный носитель SE53 Cellulose (Whatman), сильный катионообменный целлюлозный носитель SP Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences). Пример 11. Синтез трифункциональных молекул на основе -аминокислот. Трифункциональные молекулы, имеющие структуру синтезировали согласно следующей схеме реакции: Такие трифункциональные молекулы могут одновременно служить линкером и спейсером. Пример 12. Синтез трифункциональных молекул на основе третичных амидов. Трифункциональные молекулы, имеющие структуру синтезировали согласно следующей схеме реакции: Такие трифункциональные молекулы могут одновременно служить линкером (линкерами) и спейсером. Пример 13. Синтез гомотрифункциональных молекул. Гомотрифункциональные молекулы, имеющие структуру синтезировали согласно следующей схеме реакции: Такие гомотрифункциональные молекулы могут одновременно служить линкером (линкерами) и спейсером. Пример 14. С-концевая димеризация и присоединение ПЭГ при использовании трифункциональной молекулы. Трифункциональную молекулу, имеющую структуру готовили согласно примеру 12. Эту трифункциональную молекулу использовали для С-концевой димеризации и присоединения ПЭГ согласно следующей схеме реакции: Пример 15. N-концевая димеризация и присоединение ПЭГ при использовании трифункциональной молекулы. Трифункциональную молекулу готовил согласно следующей схеме:(10,0 г, 52,8 ммоль) в 200 мл дихлорметана (DCM) при 0C в течение 5 мин добавляли DCC (дициклогексилкарбодиимид, 10,5 г, 50,9 ммоль). Белый осадок образовывался в течение 5 мин. Реакционной смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 24 ч. Мочевину отфильтровывали на спеченном фильтре (средней пористости), а растворитель удаляли при пониженном давлении. Осадок экстрагировали в 500 мл EtOAc (EtOAc=этилацетат), фильтровали, как описано выше, и переносили в разделительную воронку. Органическую фазу промывали (насыщ. NaHCO3, конц. NaCl, 0,1 н.HCl), высушивали (MgSO4), фильтровали и высушивали, получая в результате бесцветное масло. Масло затвердевало, превращаясь в белое твердое кристаллическое вещество в течение 10 мин. Неочищенный диэфир экстрагировали в 75 мл THF (THF=тетрагидрофуран) и 75 мл MeOH (MeOH= метанол) и добавляли 50 мл воды. К этому раствору добавляли раствор KOH (KOH=гидроксид калия)(8,6 г, 153 ммоль) в 25 мл воды. Реакционная смесь приобретала светло-желтый цвет. После перемешивания в течение 12 ч (значение pH оставалось 12) органический растворитель удаляли в роторном испарителе, а оставшуюся взвесь разделяли между Et2O (Et2O=диэтилэфир) и насыщ. NaHCO3. Объединенную водную фазу подкисляли до pH 1, насыщали NaCl и экстрагировали EtOAc. Фазу EtOAc промывали(конц. NaCl), высушивали (Mg2SO4) и высушивали, получая в результате 13,97 г продукта в виде белого твердого вещества (90,2% для двух этапов). Замечания: если реакцию DCC проводили в ACN, выход падал до 73%. При использовании DIC(растворенный неорганический углерод) побочный продукт (мочевины) не удавалось отделить от желаемого продукта (удалить) без применения хроматографии, количество мочевины в реакции DCC можно уменьшить без помощи хроматографии. Реакция также хорошо идет с водорастворимым карбодиимидом.ACN добавляли DCC (1,36 г, 6,59 ммоль) в течение 5 мин. Белый осадок образовывался мгновенно. Реакционную смесь перемешивали 22 ч и фильтровали для того, чтобы удалить DCC мочевину. Растворитель удаляли при пониженном давлении, а остаток экстрагировали в EtOAc (250 мл) и переносили в разделительную воронку. Органическую фазу промывали (насыщ. NaHCO3, 1 н. HCl, конц. NaCl), высушивали (MgSO4), фильтровали и высушивали, получая в результате белое твердое вещество. Белое вещество экстрагировали в 75 мл ACN, фильтровали и концентрировали, получая в результате 1,28 г продукта в виде белого твердого вещества (выход 78%). Замечания: выход падал до 31% в TFN, 68% в DMF (с DIC вместо DCC) и до 57% в смесиDCM/DMF. Исходная двукислота растворима в ACN, она может быть отфильтрована и удалена. Эту трифункциональную молекулу использовали для N-концевой димеризации и присоединения ПЭГ (ПЭГилирования) согласно следующей схеме реакции:- 23010016 Пример 16. Синтез mPEG3-лизонол-NPC. Коммерчески доступный лизинол обрабатывали избытком mPEG2, что приводило к образованию конъюгата mPEG2-Lysinol (мПЭГ 2-лизинол). После этого mPEG2-Lysinol обрабатывали избытком NPC,что приводило к образованию PEG2-Lysinol-NPC (mPEG2-Лизонол-NPC). Пример 17. Ковалентное присоединение ПЭГ с использованием трифункциональной молекулы(фрагмент ПЭГ содержит две линейные цепи ПЭГ). Трифункциональную молекулу, имеющую структуру готовили согласно примеру 15. Этап 1. Присоединение трифункционального линкера к мономерам пептидов. Для присоединения линкера 2 экв. пептида смешивают с 1 экв. трифункционального линкера в сухом DMF, получая в результате прозрачный раствор, к которому через 2 мин добавляют 5 экв. DIEA. Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 14 ч. Растворитель удаляют при пониженном давлении, а неочищенный продукт растворяют в 80% TFA в DCM в течение 30 мин для того, чтобы удалить группу Boc, после чего следует очистка обращено-фазной ВЭЖХ на колонке C18. Структуру димера подтверждали масс-спектрометрией (электроспрей). В ходе этой реакции к атому азота -аминогруппы остатка лизина каждого мономера присоединяется линкер.- 24010016 Этап 2. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру. Присоединение ПЭГ карбаматной связью. Пептидный димер смешивают с равным количеством (в молях) активированных молекул ПЭГ (mPEG2-Lysinol-NPC) в сухом DMF, в результате чего получают прозрачный раствор. После 5 мин к полученному раствору добавляют 4 экв. DIEA. Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 14 ч, после чего следует очистка обращено-фазной ВЭЖХ на колонке С 18. Структуру пептида с присоединенным ПЭГ подтверждают путем масс-спектрометрии(модификация MALDI). Очищенный пептид также подвергают очистке катионообменной хроматографией, схема которой описана ниже. Присоединение ПЭГ амидной связью. Пептидный димер смешивают с молекулами ПЭГ [mPEG2-Lys-NHS] в молярном отношении 1:2 в сухом DMF, в результате чего получают прозрачный раствор. mPEG2-Lys-NHS можно приобрести, например, по каталогу Molecular Engineering catalog (2003) фирмы Nektar Therapeutics (490 Discovery Drive,Huntsville, Alabama 35806), предмет 2Z3X0T01. Через 5 мин к полученному, как описано выше, раствору добавляют 10 экв. DIEA. Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 2 ч,после чего следует очистка обращено-фазной ВЭЖХ на колонке С 18. Структуру пептида с присоединенным ПЭГ (ПЭГилированного пептида) подтверждают путем масс-спектрометрии (MALDI). Очищенный пептид также подвергают очистке катионообменной хроматографией, схема которой описана ниже. Объем настоящего изобретения не ограничен описанными здесь конкретными способами реализации. Действительно, из предшествующего описания и сопутствующих чертежей специалисту в данной области станут очевидны разнообразные модификации данного изобретения, дополняющие описанные здесь. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы. Описание изобретения содержит цитаты и обсуждение многочисленных источников, включая патенты, патентные заявки и различные публикации. Цитирование и/или обсуждение таких источников приведено просто для того, чтобы сделать более ясным описание настоящего изобретения, но не является признанием того, что какая-либо из этих ссылок является прототипом по отношению к настоящему изобретению. Все источники, цитируемые и обсуждаемые в этой спецификации, включены в не в полном объеме путем ссылки, и в такой же степени включен путем ссылки каждый источник отдельно. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, содержащее:(а) пептидный фрагмент и поли(этиленгликолевый) фрагмент, который содержит не более чем примерно 50 аминокислот; и(б) поли(этиленгликолевый) фрагмент, ковалентно присоединенный к указанному пептидному фрагменту,причем указанный поли(этиленгликолевый) фрагмент является линейным, непрерывным и неразветвленным и имеет молекулярную массу, превышающую 20 кДа. 2. Соединение по п.1, в котором поли(этиленгликолевый) фрагмент имеет молекулярную массу от 20 до 40 кДа. 3. Соединение по п.2, в котором поли(этиленгликолевый) фрагмент имеет значение полидисперсности (Mw/Mn) менее 1,20. 4. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный мономер, содержащий единственный пептид. 5. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент представляет собой пептидный димер, содержащий два пептида, соединенных линкерным фрагментом. 6. Соединение по п.4 или 5, в котором каждый пептид содержит не более чем 50 аминокислотных- 26010016 мономеров, предпочтительно от примерно 10 до 25 аминокислотных мономеров, более предпочтительно каждый пептид содержит от примерно 12 до 18 аминокислотных мономеров. 7. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент содержит пептид, который связывается с рецепторами к эритропоэтину. 8. Соединение по п.1, в котором пептидный фрагмент содержит пептид, который связывается с рецепторами к тромбопоэтину. 9. Соединение по п.1, содержащее также спейсерный фрагмент между пептидным фрагментом и поли(этиленгликолевым) фрагментом. 10. Соединение по п.9, в котором спейсерный фрагмент имеет структуру-NH-(CH2)-[O-(CH2)]-O-(CH2)-Y-,где каждое из чисел , , ,иявляется целым, значение которого выбирают независимо от других. 11. Соединение по п.10, в которомявляется целым, 16;является целым, 16;является целым, 16;равно 0 или 1;является целым, 010, аY представляет собой либо NH, либо СО. 12. Соединение по п.11, где 1, а =2. 13. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу от 20 до 60 кДа. 14. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) имеет молекулярную массу 20 кДа. 15. Соединение по п.1, в котором фрагмент поли(этиленгликоля) содержит по меньшей мере одну линейную цепь поли(этиленгликоля). 16. Фармацевтический состав, содержащий соединение по любому из пп.1-15.
МПК / Метки
МПК: C07K 14/505, A61K 47/48
Метки: полиэтиленгликолем, новые, применение, модифицированные, соединения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/28-10016-novye-modificirovannye-polietilenglikolem-soedineniya-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Новые модифицированные полиэтиленгликолем соединения и их применение</a>