Связанные с полиэтиленгликолем соединения гпп-1

009366 Область изобретения Настоящее изобретение относится к ГПП-1 (GLP-1) соединениям, ковалентно связанным с одной или более молекулами полиэтиленгликоля или его производного и относящимся к ним композициям и способам, пригодным для лечения патологических состояний или заболеваний, на которые оказывает благоприятное действие снижение глюкозы в крови, снижение потребления пищи, снижение опустошения желудка и кишечника или снижение моторики желудка и кишечника. Предпосылки создания изобретения Глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1) вызывает многочисленные биологические эффекты, такие как стимуляция секреции инсулина, подавление секреции глюкагона, подавление опустошения желудка,подавление моторики желудка и движений кишечника, усиление утилизации глюкозы и индуцирование потери веса. ГПП-1, кроме того, может предотвращать повреждение -клеток поджелудочной железы,которое происходит, когда прогрессирует неинсулинозависимый сахарный диабет (НИЗСД; NIDDM). Значимым свойством ГПП-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина без связанного с этим риска гипогликемии, что наблюдается при инсулиновой терапии или некоторых типах пероральной терапии, которая действует посредством повышения секреции инсулина. Применимость терапии с участием пептидов ГПП-1 была ограничена тем фактом, что ГПП-1(1-37) слабо активен, и два природно встречающихся усеченных пептида, ГПП-1(7-37)ОН и ГПП-1(7-36)NH2,быстро выводятся in vivo и имеют чрезвычайно короткие периоды полужизни in vivo. Известно, что эндогенно продуцируемая дипептидилпептидаза IV (LGG-IV) инактивирует циркулирующие пептиды ГПП-1 путем удаления N-концевых гистидинового и аланинового остатков и является главной причиной короткого периода полужизни in vivo. Были предприняты разные подходы для увеличения периода полувыведения пептида ГПП-1 или снижения клиренса пептида из организма при сохранении биологической активности. В патенте США 5705483 указано, что аналоги пептида ГПП-1 становятся устойчивыми к разрушению ДПП-IV посредством включения модификаций на N-конце пептида. Альтернативным подходом к увеличению периода полужизни пептидов ГПП-1 является дериватизация, причем большие ацильные группы, которые предотвращают подход ДПП-IV к N-концу пептида, связаны с разными аминокислотами ГПП-1 (см. международную заявкуPCT/DK 97/00340, поданную 22 августа 1997 г., озаглавленную Производные ГПП 1, по которой испрошен приоритет предварительной заявки DK 0931/96, поданной 30 августа 1996 г.,1259/96, поданной 8 ноября 1996 г., и 1470/96, поданной 20 декабря 1996 г.). Конкретные аналоги ГПП-1 описаны в патентных заявках США, серийные номера 60/346474, поданной 8 января 2002 г., и 60/405097, поданной 21 августа 2002 г., в настоящее время международная заявкаPCT/US 03/058203, поданная 3 января 2003 г., все озаглавлены Удлиненные аналоги глюкагоноподобного пептида-1 и включены сюда во всей их полноте. В этих заявках описаны аналоги ГПП-1(737)ОН, у которых разные аминокислоты, при добавлении к С-концу дают аналоги пептида ГПП-1 с удлиненным периодом полужизни и сниженным клиренсом, чем клиренс природной молекулы. Кроме того, аналоги ГПП-1 с повышенной активностью описаны в патентной заявке США серийный 60/314573, зарегистрированной 23 августа 2001 г, в настоящее время международная заявкаPCT/US 02/21325, зарегистрированная 14 августа 2002 г, озаглавленная Аналоги глюкагоноподобного пептида 1 (включенная сюда). Экзендин-4 может действовать на рецепторы ГПП-1 in vitro на некоторых типах клеток, включая секретирующие инсулин клетки [Goke, et al., J. Biol. Chem., (1993)268:19650-19655]. В частности, ПЭГилированный эксендин и молекулы агониста эксендина описаны в международной заявке номер PCT/US 00/11814 (включена сюда во всей ее полноте). Хотя разные подходы приводили к соединениям ГПП-1 с более длинным периодом полужизни или большей активностью, чем характеристики природного ГПП-1, необходимы другие подходы, которые могли бы использоваться или отдельно, или в комбинации с известными подходами для дальнейшего снижения клиренса соединения ГПП-1 и повышения периода полужизни с оптимизацией тем самым их пригодности в качестве терапевтического средства, которое можно вводить минимальное число раз в течение продолжительного периода времени. Ковалентное связывание одной или более молекул полиэтиленгликоля с небольшим биологически активным пептидом, таким как ГПП-1 или эксендин-4, несет риск придания побочных характеристик, таких как нестабильность, молекуле и такого сильного снижения биоактивности, что сделает молекулу непригодной для использования в качестве терапевтического средства. Настоящее изобретение, однако, основано на обнаружении того, что ковалентная связь одной молекулы или более молекул ПЭГ с особыми остатками соединения ГПП-1 дает в результате биологически активное ПЭГилированное соединение ГПП-1 с увеличенным периодом полужизни и сниженным клиренсом по сравнению с характеристиками природного ГПП-1 или Val8-ГПП-1 (или природного эксендина-4 по отношению с модифицированными эксендин-4 пептидами по изобретению). ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению обладают большей пригодностью в качестве терапевтического средства, а также большим удобством использования, чем природный ГПП-1, так как они сохраняют всю активность или часть биологической активности природного ГПП-1, и даже имеют увеличенный период полужизни и/или сниженный клиренс по сравнению с характеристиками природного соединения ГПП-1 или характеристиками Val8-ГПП-1(7-37)ОН. ГПП-1(7-37) имеет период полужизни-1 009366 в сыворотке крови, составляющий только от 3 до 5 мин. ГПП-1(7-36)амид имеет время действия, равное примерно 50 мин при подкожном введении. Даже аналоги и производные ГПП-1, которые устойчивы к расщеплению эндогенными протеазами, не обладают периодами полужизни в сыворотке, достаточными для исключения повторных введений в течение 24 ч периода. ПЭГилированные ГПП-1 соединения по изобретению могут обладать периодом полужизни свыше 24 ч, что дает возможность меньшего числа введений ПЭГилированного ГПП-1 соединения при сохранении в то же время высокого уровня в крови этого соединения на протяжении длительного периода времени. Такие ПЭГилированные ГПП-1 соединения можно использовать в терапии для лечения пациентов с заболеваниями, включая, но не ограничивая этим, диабет, ожирение, нарушения моторики желудка и кишечника и нарушения опустошения желудка и кишечника, причем особым преимуществом является то, что ПЭГилированные ГПП-1 соединения по изобретению требуют меньшего числа введений (приемов) в течение 24-часового периода, повышая как удобство для пациента, так и вероятность соблюдения пациентом необходимого режима дозировки. Краткое изложение изобретения Изобретение, описанное здесь, относится к ГПП-1 соединениям, ковалентно связанным с одной молекулой или большим числом молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) или его производного, причем каждый ПЭГ связан по аминокислоте Cys или Lys или с карбоксиконцом пептида с получением в результате ПЭГилированных ГПП-1 соединений с периодом полувыведения, равным по меньшей мере одному часу,предпочтительно по меньшей мере 3, 5, 7, 10, 15, 20 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере 24 ч. ПЭГилированные ГПП-1 соединения по изобретению предпочтительно имеют значение клиренса,равное 200 мл/ч/кг, более предпочтительно 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или менее и наиболее предпочтительно менее 50, 40 или 20 мл/ч/кг. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение, содержащее аминокислотную последовательность ГПП-1(7-37)ОН, как показано в SEQ ID(SEQ ID No.:1) Другим вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение, содержащее аминокислотную последовательность ГПП-1(7-36)NH2, которая показана в SEQ ID No.:2, с молекулой ПЭГ, ковалентно связанной у 3, 2 или 1 из остатков, выбранных из группы, состоящей из(SEQ ID No.:2) Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы I (SEQ ID No.:3) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или аминокислота карбоксильного конца ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы II (SEQ ID No.: 4):-3 009366 и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы III (SEQ ID No.: 5):-4 009366 и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что если Хаа 42, Хаа 43, Хаа 44, Хаа 45, Хаа 46, Хаа 47, Хаа 48 или Хаа 49 отсутствует,каждая аминокислота справа отсутствует; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы IV (SEQ ID No.: 6) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что если Хаа 42, Хаа 43, Хаа 44, Хаа 45 или Хаа 46 отсутствует, каждая аминокислота-5 009366 справа отсутствует; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы V (SEQ ID No.: 7) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что если Хаа 44, Хаа 45, Хаа 46 или Хаа 47 отсутствует, каждая аминокислота справа отсутствует; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы VI (SEQ ID No.: 8) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что если Хаа 44, Хаа 45, Хаа 46 или Хаа 47 отсутствует, каждая аминокислота справа отсутствует; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы VII (SEQ ID No.: 9) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связаны с молекулой ПЭГ, или карбоксиконцевая аминокислота ковалентно связана с молекулой ПЭГ; и при условии, что если Хаа 44, Хаа 45, Хаа 46 или Хаа 47 отсутствует, каждая аминокислота справа отсутствует; и при условии, что в молекуле есть 2, 1 или 0 цистеиновых остатков; и при условии, что если Хаа 42, Хаа 43, Хаа 44, Хаа 45, Хаа 46, Хаа 47, Хаа 48 или Хаа 49 отсутствует, каждая аминокислота справа отсутствует. Предпочтительные варианты формул I-VII включают соединения ГПП-1, которые не отличаются от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 более чем 7 аминокислотами, более чем 6 аминокислотами, более чем 5 аминокислотами, более чем 4 аминокислотами или более чем 3 аминокислотами. Также предпочтительно, чтобы соединения ГПП-1 формул I-VII имели валин или глицин в положении 8 и глутаминовую кислоту в положении 22. Также предпочтительно, чтобы соединения ГПП-1 формул I-VTI имели валин или глицин в положении 8 и глутаминовую кислоту в положении 30. Также предпочтительно, чтобы соединения ГПП-1 формул I-VII имели валин или глицин в положении 8 и гистидин или цистеин в положении 37. Также предпочтительно, когда соединения ГПП-1 формул I-VII имеют 2 остатка или 1 остаток или 0 остатков цистеина. Также предпочтительно, когда присутствует одна молекула ПЭГ на соединение ГПП-1. Еще одним вариантом осуществления изобретения является ПЭГилированное ГПП-1 соединение,содержащее аминокислотную последовательность формулы VIII (SEQ ID No.: 10) и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, и при условии, что в молекуле есть 2 остатка или 1 остаток цистеина; и, кроме того, при условии, что не более чем три из Хаа 9, Хаа 10, Хаа 11,Xaa12, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa18, Xaa19, Хаа 20, Xaa21, Хаа 22, Хаа 23, Хаа 24, Хаа 26, Хаа 27, Хаа 30, Хаа 31,Хаа 32 являются Ala; и при условии, также, что если Xaa1 является His, Arg или Tyr, то по меньшей мере один из Хаа 9, Хаа 10 и Xaa16 является Ala; и, кроме того, при условии, что если Хаа 38, Хаа 39, Хаа 40, Xaa41,Хаа 42, Хаа 43 или Хаа 44 отсутствует, каждая аминокислота справа отсутствует. В положения 7, 28, 29, 31 и 32 формулы VIII не могут быть помещены цистеиновые аминокислотные остатки без получаемой в результате неприемлемой потери активности. Полиэтиленгликолевые полимеры, используемые в настоящем изобретении (ПЭГ), предпочтительно имеют молекулярный вес от 500 до 100000 Да, более предпочтительно от 20000 до 60000 Да, наиболее предпочтительно от 20000 до 40000 Да могут иметь линейные или разветвленные молекулы и могут быть производными полиэтиленгликоля, которые описаны в специальной литературе. Настоящее изобретение охватывает способ стимуляции рецепторов ГПП-1 у пациента, причем указанный способ включает стадию введения пациенту эффективного количества ПЭГилированного ГПП-1-9 009366 соединения, описанного здесь. Настоящее изобретение включает также способ стимуляции рецепторов ГПП-1 у пациента, причем указанный способ включает стадию введения пациенту эффективного количества неПЭГилированного ГПП-1 соединения с последовательностью, которая показана в SEQ ID No.: 310, при условии, что в молекуле присутствуют(ет) 2 или 1 Cys. Пациенты, нуждающиеся в стимуляции рецепторов ГПП-1, включают лиц с неинсулинозависимым диабетом, вызванной стрессом гипергликемией, ожирением, нарушениями моторики и опустошения желудка и кишечника, включая, например,синдром раздраженного кишечника и функциональную диспепсию. Подробное описание изобретения Глюкагоноподобный пептид 1 (ГПП-1) является пептидом из 37 аминокислот, секретируемым Lклетками кишечника в ответ на проглатывание пищи. Многочисленные аналоги и производные ГПП-1 были описаны в специальной литературе. В настоящем изобретении описаны модификации соединений ГПП-1, которые дают в результате увеличенные периоды полувыведения и/или сниженный клиренс. Включение 1 или 2 Cys остатков в определенные аминокислотные сайты пептида обеспечивает тиольную группу, с которой может быть ковалентно связан полиэтиленгликоль (ПЭГ) или производное ПЭГ, давая в результате ПЭГилированное соединение ГПП-1. Кроме того, лизиновые остатки или карбоксиконец ГПП-1 пептидов, аналогов или фрагментов по изобретению может быть ковалентно связан с одной или более молекул ПЭГ или производного ПЭГ, давая в результате молекулу соединения с удлиненным периодом полувыведения и/или сниженным клиренсом. ГПП-1(7-37)ОН имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No.:1(SEQ ID No.:1) Термин полипептид или пептид, который использован здесь, предназначен для обозначения любой структурной формы (например, первичной, вторичной или третичной формы) аминокислотной последовательности, состоящей из более чем 5 аминокислотных остатков, которые могут быть дополнительно модифицированы или немодифицированы (например, ацетилированы, карбоксилированы, фосфорилированы, липидированы или ацилированы). Термин природный относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, которая идентична последовательности, обнаруженной в природе. Термин природный, как предполагается, охватывает аллельные варианты рассматриваемого полипептида. Термин аминокислота используется здесь в его самом широком смысле и включает встречающиеся в природе аминокислоты, а также не встречающиеся в природе аминокислоты, включая варианты и производные аминокислот. Специалист в данной области поймет, принимая во внимание это широкое определение, что упоминание здесь аминокислоты включает, например, встречающиеся в природе протеогенные L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; встречающиеся в природе не протеогенные аминокислоты, такие как норлейцин, -аланин, орнитин и т.д.; и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, известными, как характерные для аминокислот. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают -метиламинокислоты (например, -метилаланин), D-аминокислоты, гистидиноподобные аминокислоты (например, 2-аминогистидин, -гидроксигистидин, гомогистидин, фторметилгистидин и -метилгистидин), аминокислоты, имеющие дополнительный метилен в боковой цепи ("гомо"-аминокислоты), и аминокислоты, у которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи заменена сульфоновой группой (например, цистеиновая кислота). Предпочтительно, однако, когда соединения ГПП-1 по изобретению состоят только из природных аминокислот, за исключением специально представленных здесь. Термин соединение ГПП-1 в соответствии с описанием включает природный ГПП-1, [ГПП-1(737)ОН или ГПП-1(7-36)NH2], аналоги ГПП-1, производные ГПП-1, биологически активные фрагменты ГПП-1, удлиненный ГПП-1 или аналог или фрагмент удлиненного пептида ГПП-1 (см., например, патентные заявки США серийные 60/346474 и 60/405097), аналоги экзендин-4 и производные экзендин-4, содержащие один остаток или два остатка Cys в определенных положениях пептида, как здесь описано. Как принято в данной области, аминоконец природного ГПП-1(7-37)ОН был обозначен номером остатка 7, а карбоксиконец номером 37. Другие аминокислоты в полипептиде прономерованы последовательно, как показано в SEQ ID No.: 1. Например, в природной молекуле в положении 12 находится фенилаланин, а в положении 22 находится глицин. Фрагмент ГПП-1 или фрагмент соединения ГПП-1 в соответствии с описанием является биоло- 10009366 гически активным полипептидом, полученным после усечения одной или более из аминокислот на Nконце и/или С-конце соединения ГПП-1. Номенклатура, используемая для описания ГПП-1(7-37)ОН,применяется и к фрагментам ГПП-1. Например, ГПП-1(9-36)ОН означает фрагмент ГПП-1, полученный усечением двух аминокислот на N-конце и одной аминокислоты на С-конце. Аминокислоты в этом фрагменте обозначены тем же номером, что и соответствующая аминокислота в ГПП-1(7-37)ОН. Например, N-концевая глутаминовая кислота в ГПП-1(9-36)ОН находится в положении 9; положение 12 занято фенилаланином; и положение 22 занято глицином, как и в ГПП-1(7-37)ОН. ГПП-1 соединения включают аналоги ГПП-1 и аналоги экзендин-4. Для ясности, аналоги экзендин-4, которые включены в соединения ГПП-1, всегда имеют один остаток или два остатка Cys. Предпочтительно аналог ГПП-1 имеет аминокислотную последовательность ГПП-1(7-37)ОН или удлиненного пептида ГПП-1, который описан в патентных заявках США серийный 60/346474, поданной 1 августа 2002 г., или 60/405097, поданной 21 августа 2002 г., обе озаглавлены Удлиненные аналоги глюкагоноподобного пептида-1 или его фрагмента, модифицированного так, что 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислоты отличаются от аминокислот в соответствующих положениях ГПП-1(7-37)ОН или фрагмента ГПП-1(7-37)ОН, модифицированного так, что 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот отличаются от аминокислоты в соответствующем положении удлиненного пептида ГПП-1. Наиболее предпочтительные аналоги описаны здесь в формулах I, II, III, IV, V, VI и VII. Наиболее предпочтительные аналоги экзендин-4 описаны здесь в формуле VIII. Термин ПЭГилированные, когда он касается соединения ГПП-1 по изобретению, относится к соединению ГПП-1, которое химически модифицировано ковалентной связью с одной или более молекул полиэтиленгликоля или его производного. Кроме того, подразумевается, что термин ПЭГ относится к полиэтиленгликолю или его производному, которые известны специалистам (см., например, патенты США 5445090, 5900461, 5932462, 6436386, 6448369, 6437025, 6448369, 6495659, 6515100 и 6514491). Предпочтительно в ПЭГилированных соединениях по изобретению ПЭГ (или его производное) ковалентно связаны с одним или более лизиновых или цистеиновых остатков соединения ГПП-1. Наиболее предпочтительно ПЭГ ковалентно связан с одним или более из цистеиновых остатков соединения ГПП-1. Что касается ПЭГилированных аналогов экзендин-4 по изобретению, ПЭГ связан с одним или двумя из цистеиновых остатков, введенных в экзентин-4 и аналог экзендин-4 в положениях, указанных в формуле VIII. По желанию молекулы ПЭГ могут быть связаны с соединением ГПП-1 через линкерную или спейсерную молекулу (см., например, спейсерные молекулы, описанные в патенте США 6268343). В номенклатуре, использованной здесь для обозначения соединений ГПП-1, замещающая аминокислота и ее положение показаны с последующим названием исходного пептида. Например, Glu22-ГПП 1(7-37)ОН означает соединение ГПП-1, в котором глицин, обычно находящийся в положении 22 ГПП 1(7-37)ОН, был заменен глутаминовой кислотой; Val8Glu22-ГПП-1(7-37)ОН (или V8E22-ГПП-1(7-37)ОН) означает соединение ГПП-1, в котором аланин, обычно находящийся в положении 8, и глицин, обычно находящийся в положении 22 ГПП-1(7-37)ОН, были заменены валином и глутаминовой кислотой соответственно. Val8-экзендин-4 означает соединение ГПП-1, в котором серин, обычно находящийся в положении 8 экзендин-4, был заменен валином. Предпочтительно соединения ГПП-1 по изобретению обладают инсулинотропной активностью. Инсулинотропная активность относится к способности стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенные уровни глюкозы, вызывая тем самым поглощение глюкозы клетками и сниженные уровни глюкозы в плазме. Инсулинотропная активность может быть оценена методами, известными специалистам, включая использование экспериментов in vivo и исследований in vitro, которыми количественно определяют связывающую активность или активацию ГПП-1 рецепторов, например исследования с использованием островковых клеток или клеток инсулиномы, как описано в ЕР 619322, Gelfand, et al., и в патенте США 5120712 соответственно. Инсулинотропную активность у людей обычно количественно определяют путем измерения уровней инсулина или уровней С-пептида. В рамках настоящего изобретения используют исследование, сигнализирующее о ГПП-1 рецепторах, для определения того, будет ли ПЭГилированное соединение ГПП-1 по изобретению проявлять инсулинотропную активность in vivo. Инсулинотропная активность является активностью, которую можно использовать для демонстрации того, что ПЭГилированное соединение ГПП-1 является биологически активным. Активность in vitro в соответствии с настоящим описанием является мерой способности пептида активировать рецепторы ГПП-1 при исследовании на клетках. Активность in vitro выражается как ЕС 50, которая является эффективной концентрацией соединения, которая дает в результате 50% активность при эксперименте определения ответа на единственную дозу. В рамках настоящего изобретения активность in vitro определяют, используя флуоресцентное исследование, при котором используют клетки НЕК-293, которые стабильно экспрессируют человеческие ГПП-1 рецепторы. Эти клетки НЕК-293 имеют стабильно интегрированную векторную ДНК, имеющую элемент сАМФ реакции (CRE), стимулирующий экспрессию гена -лактамазы (BLAM). Взаимодействие соединения ГПП-1 (или агониста) с рецептором инициирует сигнал, который вы- 11009366 зывает активацию элемента сАМФ реакции и последующую экспрессию -лактамазы. Субстрат лактамазы CCF2/AM, который испускает флуоресценцию, когда расщепляется -лактамазой (PanVeraLLC), можно затем добавлять к клеткам, которые подверглись воздействию определенного количества агониста ГПП-1 с получением меры активности агониста ГПП-1. Это исследование дополнительно описано Zlokarnik et al. (1998) Science 279:84-88. Значения EC50 для соединений, перечисленных в примере 4,определяли с использованием исследования BLAM, описанного выше. Относительные значения активности in vitro можно установить проведением серии опытов с Val8-ГПП-1 (7-37)ОН или природным ГПП 1 в качестве контроля и принимая контроль как стандартное значение для сравнения, равное 100%. Термин период полужизни в плазме относится к сроку, в течение которого половина рассматриваемых молекул циркулирует в плазме до выведения. Альтернативно используемым термином является период полувыведения. Термин увеличенный или более длительный, используемый в контексте периода полужизни в плазме или периода полувыведения, показывает, что существует статистически значимое увеличение периода полужизни ПЕГилированного соединения ГПП-1 по отношению к показателю для сравниваемой молекулы (например, не ПЭГилированной формы пептида или природного пептида), который определен в сравнимых условиях. Предпочтительно ПЭГилированное соединение ГПП-1 по изобретению имеет период полувыведения, равный по меньшей мере 1 ч, более предпочтительно по меньшей мере 3, 5, 7, 10, 15, 20 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере 24 ч. Период, который представлен здесь в примере 5, является периодом полувыведения; он соответствует концевой logлинейной скорости элиминации. Специалисты в данной области поймут, что период полужизни является производным параметром, который зависит как от клиренса, так и от объема распределения. Клиренс является мерой способности организма выводить лекарственное средство. Так как клиренс уменьшается в результате, например, модификации лекарственного средства, нужно ожидать, что период полужизни увеличится. Однако это обратное отношение является верным только тогда, когда нет изменения в объеме распределения. Подходящее примерное отношение между концевым log-линейным полупериодом (t1/2), клиренсом (C) и объемом распределения (V) дается равенством: t1/20,693 (V/C). Клиренс не показывает, сколько лекарственного средства должно быть удалено, а скорее объем биологической жидкости, такой как кровь или плазма, которая должна быть полностью освобождена от лекарственного средства, чтобы привести к его удалению. Клиренс выражается в виде объема в единицу времени. ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению предпочтительно имеют значение клиренса,равное 200 мл/ч/кг или менее, более предпочтительно 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или менее и наиболее предпочтительно 50, 40 или 20 мл/ч/кг или менее (см. пример 5). В настоящем изобретении аминокислота Cys не может быть включена в положениях 7, 28, 29, 31 или 32 пептидов ГПП-1 или аналога ГПП-1 из-за потери активности получающегося пептида. Предполагается, что все другие остатки могут быть заменены цистеином, но предпочтительно, чтобы такой цистеин был включен в положении(ях), выбранном(ых) из группы, состоящей из 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26,27, 30, 34, 35, 36 и 37 пептидов ГПП-1 или аналога ГПП-1, с предпочтительно не более чем 2 или 1 аминокислотами(ой) Cys на молекулу. Когда Cys аминокислоты присутствуют в молекуле ГПП-1, еще более предпочтительно, когда они локализованы в положении(ях), выбранных из группы, состоящей из 22, 26,34, 35, 36 и 37, и еще более предпочтительно, когда они присутствуют в положениях 26 и/или 34. Получающаяся молекула может быть ПЭГилированной по Cys аминокислотам, давая в результате модифицированную молекулу, которая сохраняет всю биологическую активность или ее часть, давая в то же время более длинный период полувыведения, чем период полувыведения пептида с немодифицированной молекулой или чем период полувыведения пептида с природной молекулой. Альтернативно, в настоящем изобретении пептиды ГПП-1 или аналог ГПП-1 могут быть ПЭГилированными по одному, двум или трем из лизиновых остатков в положениях 18, 22 и 26 или по аминокислоте у карбоксильного конца пептида. Другим вариантом осуществления изобретения являются неПЭГилированные соединения ГПП-1 с последовательностью, которая показана в SEQ ID No.: 3-10, при условии, что присутствует(ют) 2 или 1Cys в молекуле. Открыто, что остатки в определенном положении соединений ГПП-1 могут быть заменены на Cys, и все же биологическая активность сохраняется. Эти неПЭГилированные соединения ГПП 1 могут быть промежуточными соединениями, используемыми в процессе получения ПЭГилированных соединений ГПП-1 по изобретению. Эти соединения можно также использовать в качестве терапевтических средств при заболеваниях, когда нет необходимости в удлиненном периоде полувыведения, например синдром раздраженного кишечника. Когда пептид для использования по изобретению получен и очищен, его модифицируют ковалентным связыванием по меньшей мере одной молекулы ПЭГ с Cys или Lys остатками или с карбоксиконцевой аминокислотой. Трудно придать нестойким пептидным или белковым молекулам подходящие новые свойства путем связывания с ними полимеров, не вызывая потери их функциональности. Широкий ряд методов описан в литературе по данной специальности для получения ковалентно конъюгированных с ПЭГ, и конкретный метод, использованный в изобретении, не имеет ограничительного характера (в отношении обзорных статей, см. Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). Кар- 12009366 боксиконцевое присоединение ПЭГ может быть выполнено посредством ферментативного присоединения с использованием рекомбинантного пептида ГПП-1 в качестве предшественника или альтернативных методов, известных специалистам в данной области и описанных, например, в патенте США 4343898 или International Journal PeptideProtein Research, 43: 127-38, 1994. ПЭГилирование белков может помочь преодолеть многие фармакологические и токсикологические/иммунологические проблемы,связанные с использованием пептидов или белков в качестве терапевтических средств. Однако для любого конкретного пептида точно не известно, будет ли у ПЭГилированной формы пептида значительная потеря биоактивности по сравнению с неПЭГилированной формой пептида. На биологическую активность ПЭГилированных белков могут влиять такие факторы, как i) размер молекулы ПЭГ; ii) конкретные сайты присоединения; iii) степень модификации; iv) неблагоприятные условия присоединения; v) используется ли линкер для присоединения, или непосредственно присоединяется полимер; vi) образование опасных сопродуктов; vii) повреждение, наносимое активированным полимером, или viii) способность сохранять заряд. В зависимости от используемой реакции присоединения, модификация цитокинов полимером, в частности, приводила к заметному снижению биологической активности [Francis, G.E., et al., (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides:the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18]. ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению обладают биологической активностью invitro, которая составляет по меньшей мере 0,5% от активности природного ГПП-1, или более предпочтительно активности Val8-ГПП-1(7-37)ОН. Более предпочтительно, когда ПЭГилированное соединение ГПП-1 по изобретению имеет биологическую активность in vitro, которая по меньшей мере составляет 1 или 3% от активности природного ГПП-1 или более предпочтительно от активности Val8-ГПП-1(737)ОН. Такая биологическая активность может быть определена исследованием активности in vitro, которое описано здесь (пример 4), или другим исследованием ГПП-1, известным специалистам. Хотя некоторые ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению могут обладать биологической активностью более низкой, чем биологическая активность природного ГПП-1 или Val8-ГПП-1(7-37)ОН, которая определена количественно конкретным исследованием; это снижение активности компенсируется увеличенным периодом полужизни соединения и/или более низким значения клиренса, и может быть даже благоприятной характеристикой для соединения ГПП-1 с увеличенным периодом полувыведения. Дополнительно ожидается, что положения пептида ГПП-1, в которые, как было обнаружено, цистеиновый остаток помещается без потери биологической активности, могут быть замещены цистеином в аналогичном положении экзендин-4, и это дает в результате аналог экзендин-4, еще способный к связыванию с рецепторами ГПП-1. Предпочтительно присутствует не более 2 или 1 Cys аминокислот(ы) на аналог экзендин-4 по изобретению. Предпочтительно Cys, которые существуют в молекуле, находятся в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 и 44 (см. формулу VIII); предпочтительно в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 22, 26, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 и 44; еще более предпочтительно положения 26 и/или 34. Cys аминокислоты, присутствующие в молекуле, ковалентно соединяются с молекулой ПЭГ, давая в результате ПЭГилированный аналог экзендин-4 с более длинным периодом полувыведения, чем период полувыведения природного экзендин-4. Предпочтительно пептид, ПЭГилированный аналог экзендин-4 (который описан в формуле VIII) по изобретению обладает биологической активностью, которая составляет по меньшей мере 0,5, 1,0, 3, 10, 30 или 50% от активности неПЭГилированного аналога экзендин-4. Последовательность экзендин-4 дикого типа представляет собой: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID No.: 11). В его типичной форме ПЭГ является линейным полимером с концевыми гидроксильными группами и имеет формулу НО-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-ОН, где n равно от примерно 8 до примерно 4000. Концевой водород может быть замещен защитной группой, такой как алкильная или алканоильная группа. Предпочтительно ПЭГ имеет по меньшей мере одну гидроксильную группу, более предпочтительно,когда она является концевой гидроксильной группой. Она является той гидроксильной группой, которая предпочтительно активирована для того, чтобы реагировать с пептидом. Существует много форм ПЭГ,пригодных для изобретения. Существуют многочисленные производные ПЭГ, известные специалистам и пригодные для использования в настоящем изобретении. (См., например, патенты США 5445090,5900461, 5932462, 6436386, 6448369, 6437025, 6448369, 6495659, 6515100 и 6514491 и Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). Не предполагается, что молекула ПЭГ, ковалентно связанная с соединениями ГПП-1 в настоящем изобретении, ограничивается конкретным типом. Молекулярный вес ПЭГ предпочтительно составляет 500-100000 Да и более предпочтительно 20000-60000 Да и наиболее предпочтительно от 20000 до 40000 Да. ПЭГ может иметь линейные или разветвленные молекулы, и ПЭГилированные соединения по изобретению могут иметь 1, 2, 3, 4, 5 или 6 молекул ПЭГ, связанных с пептидом. Наиболее предпочтительно, чтобы присутствовала одна молекула ПЭГ на молекулу ПЭГилированного соединения ГПП-1; однако, когда присутствует больше молекул ПЭГ на молекулу пептида, предпочтительно, чтобы их было не более шести. Кроме того, предполагается, что оба конца молекулы ПЭГ могут быть гомо- или heroly-функционализированы для перекрестного связывания двух или более ГПП-1- 13009366 соединений вместе. Настоящее изобретение относится к ГПП-1 соединениям с одной или более молекул ПЭГ, ковалентно с ними связанными. Один из способов получения ПЭГилированных соединений ГПП-1 по изобретению включает использование ПЭГ-малеимида для непосредственного связывания ПЭГ с тиольной группой пептида. Введение тиольной функциональной группы может быть достигнуто присоединением к пептиду или вставкой Cys в пептид остатка в положения, описанные выше. Тиольная функциональная группа также может быть введена в боковую цепь пептида (например, ацилирование -аминогруппы тиолсодержащей кислоты. При способе ПЭГилирования по изобретению используется присоединение Мишеля для образования стабильного тиоэфирного линкера. Реакция является высокоспецифичной и происходит в мягких условиях в присутствии других функциональных групп. ПЭГ-малеимид использовали в качестве реактивного полимера для получения четко определенных биологически активных ПЭГпротеиновых конъюгатов. Предпочтительно, когда по данной методике используют молярный избыток тиолосодержащего ГПП-1 соединения по отношению к малеимиду ПЭГ, чтобы довести реакцию до завершения. Реакции предпочтительно производят при рН от 4,0 до 9,0 при комнатной температуре в течение от 15 до 40 ч. Избыток неПЭГилированного тиолосодержащего пептида легко отделяют от ПЭГилированного продукта обычными методами разделения. Примерные условия для ПЭГилирования ГПП-1 соединений представлены в примере 1. ПЭГилирование цистеина может быть выполнено с использованием малеимида ПЭГ или малеимида ПЭГ с бифуркацией. Соединения ГПП-1 обладают разной биологической активностью. Например, ГПП-1, как было обнаружено, стимулирует выделение инсулина, вызывая тем самым поглощение глюкозы клетками и сниженные уровни глюкозы в сыворотке [см., например, Mojsov, S., (1992) Int. Peptide Protein Research,40:333]. ГПП-1 является особенно многообещающим в качестве средства для лечения неинсулинозависимого сахарного диабета (НИЗСД), так как при нем присутствует риск гипогликемии, которая проявляется при лечении НИЗСД. Предполагается также, что ГПП-1 будет средством для лечения ожирения при синдроме раздраженного кишечника и функциональной диспепсии. Предполагается, что использование ПЭГилированного соединения ГПП-1 по изобретению включает использование при производстве лекарственного препарата для лечения неинсулинозависимого сахарного диабета, ожирения, инсульта, инфаркта миокарда, синдрома раздраженного кишечника или функциональной диспепсии. ПЭГилирование соединения ГПП-1 может сочетаться с другими модификациями, известными специалистам в данной области, для увеличения периода полужизни ГПП-1 (см., например, патентные заявки США с серийными номерами: 60/346474, поданная 1 августа 2002 г. и 60/405097, поданная 21 августа 2002 г.) и тем самым еще дополнительно увеличивать период полужизни соединения по сравнению с одним ПЭГилированием или другими модификациями метода по отдельности. В соответствии с описанием термин соединение ГПП-1 включает также фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных здесь. ГПП-1 соединение по изобретению может иметь группы с достаточной кислотностью, достаточными основными свойствами, или обе функциональные группы, и соответственно может реагировать с любым соединением из числа неорганических оснований и неорганических и органических кислот с образованием соли. Кислоты, обычно используемые для образования солей присоединения с кислотой, являются неорганическими кислотами, такими как соляная кислота,бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и тому подобное, и органическими кислотами, такими как п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и тому подобное. Примеры таких солей включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат,изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себакат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, -гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафтален-1-сульфонат, нафтален-2-сульфонат, манделат и тому подобное. Соли присоединения с основанием включают соли, которые получают с неорганическими основаниями, такими как гидроксиды аммония или щелочных или щелочно-земельных металлов, карбонаты бикарбонаты и тому подобное. Такие основания пригодны для получения солей по изобретению и, таким образом, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и тому подобное. ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению особенно подходят для парентерального введения, они могут также доставляться перорально, путем назального введения или путем ингаляции. Парентеральное введение может включать, например, системное введение, например, путем внутримышечной, внутривенной, подкожной или внутрибрюшинной инъекции. ПЭГилированные ГПП-1 соединения можно вводить пациенту в сочетании с приемлемым фарма- 14009366 цевтическим носителем, разбавителем или эксципиентом в виде части фармацевтической композиции для лечения заболеваний, обсужденных выше. Фармацевтическая композиция может быть раствором или, если вводится парентерально, суспензией соединения ГПП-1 или суспензией соединения ГПП-1 в виде комплекса с катионом двухвалентного металла, такого как цинк. Подходящие фармацевтические носители могут содержать инертные ингредиенты, которые не взаимодействуют с пептидом или пептидным производным. Можно использовать стандартные фармацевтические методы изготовления лекарственных препаратов, такие, которые описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Подходящие фармацевтические носители для парентерального введения включают,например, стерильную воду, физиологический раствор, бактериостатический физиологический раствор,бактериостатический раствор (физиологический раствор, содержащий примерно 0,9% мг/мл бензилового спирта), фосфатно-буферный физиологический раствор, раствор Хенкса, лактат Рингера и тому подобное. Некоторые примеры подходящих наполнителей включают лактозу, декстрозу, сахарозу, трегалозу,сорбит и маннит. С ПЭГилированными соединениями по изобретению могут быть изготовлены препараты для такого введения, что уровни в плазме крови поддерживаются в эффективном интервале в течение увеличенных периодов времени. Основным препятствием для эффективной доставки пептидного лекарственного средства путем перорального введения является плохая биодоступность из-за разложения пептидов кислотами и ферментами, плохое всасывание через эпителиальные мембраны и переход пептидов в нерастворимую форму после воздействия окружающей среды с кислым рН в пищеварительном тракте. Системы для пероральной доставки пептидов, такие как осуществляемые по изобретению, известны специалистам. Например, ПЭГилированные ГПП-1 соединения могут быть инкапсулированы с использованием микросфер, а затем доставляться перорально. Например, ПЭГилированные соединения ГПП-1 могут быть инкапсулированы в микросферы, состоящие из доступного для приобретения, биологически совместимого,биоразлагаемого полимера, поли(лактид-со-гликолид)-СООН и оливкового масла в качестве наполнителя. См. Joseph, et al. (2000) Diabetologia 43:1319-1328. Доступны для приобретения также и микросферы других типов технологии, такие как Medisorb и Protease, биоразлагаемые полимеры от Alkermes. Полимеры Medisorb могут быть получены с любым из лактидных изомеров. Отношения лактид:гликолид могут меняться в пределах от 0:100 до 100:0, что дает возможность получения полимеров с широким разнообразием свойств. Это дает возможность создания систем доставки и имплантируемых лекарственных форм с временем ресорбции, находящемся в интервале от недель до месяцев. Emisphere также опубликовала многочисленные статьи с обсуждением технологии пероральной доставки для пептидов и белков. Например, см. WO 9528838, Leone-bay et al., где описаны специфические носители для модифицированных аминокислот для облегчения всасывания. ПЭГилированные соединения ГПП-1, описанные здесь, можно использовать для лечения пациентов с заболеваниями из широкого ряда заболеваний и патологических состояний. ПЭГилированные соединения ГПП-1, охватываемые настоящим изобретением, проявляют свои биологические эффекты путем воздействия на рецепторы, называемые ГПП-1 (GLP-1) рецепторами (см. Dillon et al. (1993) Cloning andFunctional Expression of Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrinology, 133:1907-1910). Пациентов с заболеваниями и/или патологическими состояниями, которые благоприятно реагируют на стимуляцию рецепторов ГПП-1 или на введение соединений ГПП-1, можно поэтому лечить ПЭГилированными соединениями по изобретению. Эти пациенты, как говорят, нуждаются в лечении соединениями ГПП-1 или нуждаются в стимуляции рецепторов ГПП-1. Сюда включаются пациенты с неинсулинозависимым диабетом, инсулинозависимым диабетом, инсультом (см. WO 00/16797, Efendic), инфарктом миокарда (см. WO 98/08531, Efendic), ожирением (см.,WO 98/19698, Efendic), катаболическими изменениями после хирургической операции (патент США 6006753, Efendic), функциональной диспепсией и синдромом раздраженного кишечника (см. WO 99/64060, Efendic). Сюда также включаются пациенты, нуждающиеся в профилактическом лечении соединением ГПП-1, например пациенты с риском развития неинсулинозависимого диабета (см. WO 00/07617). Дополнительно к пациентам относят пациентов с нарушенной толерантностью к глюкозе или с нарушениями уровней глюкозы натощак, пациентов, масса тела которых примерно на 25% выше нормальной массы тела для лиц данного роста и телосложения, пациентов с частичной панкреоэктомией,пациентов, имеющих одного или более из родителей с неинсулинозависимым диабетом, пациентов, у которых был диабет при беременности, и пациентов, у которых был острый панкреатит или с хроническим панкреатитом, и которые подвергаются риску развития неинсулинозависимого диабета. ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению можно использовать для нормализации уровней глюкозы в крови, для профилактики повреждения -клеток поджелудочной железы, для стимуляции пролиферации -клеток, стимуляции транскрипции гена инсулина, регуляции в сторону повышения IDX1/PDX-1 и других факторов роста, улучшения функции -клеток, активации спящих -клеток, дифференцировки клеток в -клетки, стимуляции репликации -клеток, подавления апоптоза -клеток, регуляции массы тела и стимуляции потери массы тела. Эффективное количество ПЭГилированного соединения ГПП-1 представляет собой количество,- 15009366 которое приводит к желаемому терапевтическому и/или профилактическому эффекту, не вызывая неприемлемых побочных эффектов при введении пациенту, нуждающемуся в стимуляции рецепторов ГПП-1. Желаемый терапевтический эффект включает одно или более из следующего: 1) улучшение по симптому(ам), связанному(ым) с заболеванием или патологическим состоянием; 2) задержка начала симптомов, связанных с заболеванием или патологическим состоянием; 3) увеличение продолжительности жизни по сравнению с отсутствием лечения и 4) улучшение качества жизни по сравнению с отсутствием лечения. Например, эффективным количеством ПЭГилированного соединения ГПП-1 для лечения диабета является количество, которое должно привести к большей регуляции концентрации глюкозы в крови, чем при отсутствии лечения, приводя тем самым к задержке начала осложнений диабета, таких как ретинопатия, нейропатия и заболевание почек. Эффективным количеством ПЭГилированного соединения ГПП-1 для профилактики диабета является количество, которое должно отдалять по сравнению с отсутствием лечения начало повышенных уровней глюкозы в крови, которые требуют лечения антигипогликемическими лекарственными препаратами, такими как сульфонилмочевины, тиазолидиндионы,инсулин и/или бисгуанидины. Эффективное количество ПЭГилированного соединения ГПП-1, вводимого пациенту, будет также зависеть от типа и тяжести заболевания и от таких характеристик пациента, как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и толерантность к лекарственным средствам. Обычно ПЭГилированные соединения ГПП-1 по изобретению будет вводиться так, чтобы уровни в плазме находились в интервале от примерно 5 до примерно 200 пмоль/л. Оптимальные уровни в плазме для Val8-ГПП-1(7-37)ОН, как определено, находятся между 30 и примерно 200 пмоль/л. Обычный интервал дозирования для ПЭГилированных соединений ГПП-1 по изобретению будет находиться в промежутке от примерно 0,01 до примерно 1000 мг в сутки для взрослого. Предпочтительно дозировка колеблется в пределах от примерно 0,1 до примерно 100 мг в сутки, более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 10 мг/сутки. Пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком, но может быть также и животным, таким как, например, животные-компаньоны (например, собаки, кошки и им подобные), сельскохозяйственные животные (например, коровы, овцы, свиньи, лошади и им подобные) и лабораторные животные (например, крысы, мыши, морские свинки иим подобные). Пептиды, используемые для получения ПЭГилированных соединений ГПП-1 по изобретению, могут быть получены путем применения стандартных методов и методик синтеза пептидов в фазе раствора или твердой фазе. Синтезаторы пептидов можно приобрести, например, у Applied Biosystems в FosterCity CA. Реагенты для твердофазного синтеза пептидов можно приобрести, например, у Midwest Biotech(Fishers, IN). Синтезаторы пептидов для твердофазного синтеза можно использовать в соответствии с инструкциями производителя для блокирования препятствующих групп, защиты аминокислот, которые должны прореагировать, соединения, разъединения и кеппирования непрореагировавших аминокислот. Обычно, защищенную -N-карбамоилом аминокислоту и N-концевую аминокислоту наращиваемой пептидной цепи на смоле соединяют при комнатной температуре в инертном растворителе, таком как диметилформамид, N-метилпирролидинон или дихлорметан, в присутствии соединяющих средств, таких как дициклогексилкарбодиимид и 1-гидроксибензотриазол и основание, такое как диизопропилэтиламин.-N-карбамоильную защищающую группу удаляют с полученного пептида на смоле, используя такой реагент, как трифторуксусная кислота или пиперидин, и повторяли реакцию присоединения со следующей желательной защищенной по N аминокислотой, которую нужно добавить к цепи. Подходящие защищающие амин группы хорошо известны специалистам и описаны, например, у Green and Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991, положения в котором в целом включены сюда в виде ссылки. Примеры включают т-бутилоксикарбонил (т-БОК; t-Boc) и флуоренилметоксикарбонил (ФМОК; Fmoc). Пептиды синтезируют также, используя методы стандартного автоматизированного твердофазного синтеза, используя т-бутоксикарбонил- или флуоренилметоксикарбониламинокислоты с соответствующей защитой боковой цепи. После завершения синтеза пептиды отщепляют от твердофазного носителя с одновременным удалением защиты боковой цепи, используя стандартные методы с фтористым водородом. Неочищенные пептиды затем дополнительно очищают, используя хроматографию с обращенной фазой на колонках Vydac C18, используя градиенты ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФК). Чтобы удалить ацетонитрил, пептиды лиофилизируют из раствора, содержащего 0,1% ТФК, ацетонитрил и воду. Чистота может быть подтверждена аналитической хроматографией с обращенной фазой. Идентичность пептидов может быть подтверждена масс-спектрометрией. Пептиды можно солюбилизировать в водных буферах с нейтральным pH. Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не предназначены быть ограничительными каким-либо образом.- 16009366 Примеры Пример 1. ПЭГилирование родственных аналогов ГПП-1. Реакции ПЭГилирования выполняют в условиях, которые позволяют образование тиоэфирной связи. В частности, pH раствора колеблется в интервале от примерно 4 до 9, а концентрации содержащего тиол пептида колеблются в интервале концентраций от 1 до 10 молярного избыточной концентрации метокси-ПЭГ 2-МАЛ. Реакции ПЭГилирования обычно протекают при комнатной температуре. ПЭГилированный пептид ГПП-1 затем выделяют, используя ВЭЖХ с обращенной фазой или хроматографию исключения по размеру (ХИР; SEC). ПЭГилированные аналоги ГПП-1 охарактеризуют, используя аналитические ОФ-ВЭЖХ (RP-HPLC), ВЭЖХ-ХИР, ДСН-ПАГЭ (SDS-PAGE) и/или MALDI массспектрометрию. Тиолосодержащие ГПП-1 пептиды приводят во взаимодействие с 40 кДа полиэтиленгликольмалеимидом (ПЭГ-мелеимида) с получением производных с ПЭГ, ковалентно связанным через тиоэфирную связь. Например, пептид Cex-51-C (V8E22I33C40 ГПП-1, 45 аа длиной; 7,5 мг, 1,8 мкмоль) растворяют в 2 мл 200 мМ фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА, рН 7,4. Затем раствор продувают аргоном. К этому раствору добавляют 40 мг метокси-ПЭГ 2-МАЛ, бифуркированного ПЭГ-малеимида (Lot PT-02B10, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) (отношение ПЭГ к пептиду 0,55:1 моль/моль). Реакция осуществляется в течение 2 ч. Затем 25 мг ПЭГилированного пептида очищают ОФ-ВЭЖХ, характеристики определяли ВЭЖХ исключения по размеру и испытывают на активность in vitro. Пример 2. Реакция 40 кДА ПЭГ-малеимида с аналогами ГПП. Аналоги ГПП-1, такие как C16E22V8 ГПП и V8C38 ГПП, селективно ПЭГилируют по введенному остатку цистеина, используя активированный малеимидом бифуркированный 40 кДа мПЭГ (ShearwaterPolymers, Inc.). Для реакции ПЭГилирования пептид, который нужно ПЭГилировать растворяют в 100 мМ ТРИС при pH 8,0 и добавляют всей массой 1,25-кратный молярный избыток 40 кДа-мПЭГ. Реакционную смесь оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 2-3 ч и затем диализируют в течение ночи (мембрана на 7 кДа) против 10 мМ цитрата, 10 мМ фосфата, рН 7,4, при примерно 5 С. Молекулы ПЭГилированного ГПП очищают анионообменной хроматографией на колонке Mono-Q (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ), используя градиент NaCl при нейтральном pH. Пример 3. Реакция ДСФЭ-3,4 кДа-ПЭГ-малеимида с аналогами ГПП-1. Аналоги ГПП-1, такие как C16E22V8 ГПП-1 и V8C38 ГПП-1 селективно ПЭГилируют по введенному остатку цистеина, используя активированный малеимидом 3,4 кДа мПЭГ, имеющий на конце липид,дистеароилфосфатидилэтаноламин (ДСФЭ) (Shearwater Polymers, Inc.). Для реакции ПЭГилирования пептид растворяют в 100 мМ ТРИС буфере при pH 8 и добавляют всей массой 1,25-кратный избыток ДСФЭ-3,4 кДа-ПЭГ-малеимида. Добавляют абсолютный спирт до примерно 17%, чтобы помочь солюбилизации ДСФЭ-3,4 кДа-ПЭГ-малеимида. Реакционную смесь оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 2-3 ч и затем диализируют в течение ночи (мембрана на 7 кДа) против 10 мМ цитрата, 10 мМ фосфата, pH 7,4, при примерно 5 С. ПЭГилированный пептид очищают анионообменной хроматографией на колонке Mono-Q (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ), используя градиентPanVera LLC CRE-BLAM, засевают при плотности посева 20000-40000 клеток/лунку/100 мкл средыDMEM с 10% ФБР (FBS) в покрытые поли-d-лизином 96-луночный черный с прозрачным дном планшет. Через день после посева среду стряхивают и добавляют 80 мкл не содержащей плазмы среды DMEM. На третий день после посева в каждую лунку добавляют 20 мкл не содержащей плазмы среды DMEM с 0,5% БСА, содержащей разные концентрации ПЭГилированного соединения ГПП-1, для получения кривой зависимости реакции от дозы. Обычно используют четырнадцать разведений, содержащих от 3 до 30 наномолярного ПЭГилированного пептида для получения кривой зависимости реакции от дозы по которой можно определить значения EC50. После 5 ч инкубации с ПЭГилированным пептидом добавляют 20 мкл -лактамазного субстрата (CCF2/AM, PanVera LLC) и инкубацию продолжают в течение 1 ч и после этого срока определяют флюоресценцию на цитофлюориметре. Исследование дополнительно описано уZlokarnik, et al. (1998), Science, 278:84-88. Следующие ПЭГилированные ГПП-1 пептиды испытывали,как описано, и они имели значения EC50, представленные ниже (со значением для V8 ГПП-1, равным 100%) Пример 5. Анализ фармакокинетики дериватизированного пептида ГПП-1. ПЭГилированный аналог ГПП-1 (V8E22I33C45-40 кДа ПЭГ (ПЭГилированный, С 45-модифициро- 17009366 ванный CEX-51 вводят внутривенным (ВВ) или подкожным (ПК) путями в дозе 0,1 мг/кг самцам крысSD. У животных (2 крысы на один срок для ВВ, 3 крысы на срок для ПК) брали кровь в разные сроки между 0 и 336 ч после введения дозы. Плазму отбирали из каждого образца и анализировали с помощью радиоиммуноанализа. Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя зависимые от модели (данные ВВ) и независимые от модели (данные ПК) методы (WinNonlin Pro). Сведения о фармакокинетических параметрах представлены в табл. 1 ниже. При ВВ введении ПЭГилированный аналог ГПП-1 имеет период полувыведения, равный примерно 1,5 дням, тогда как при ПК введении ПЭГилированный аналог ГПП-1 имеет период полувыведения, равный примерно 1,3 дня. Никаких побочных клинических проявлений не было связано с ВВ или ПК введением 0,1 мг/кг V8E22I33C45-40 кДа ПЭГ. Для настоящего соединения наблюдаются пролонгированный период полувыведения, медленный клиренс и относительно высокая биодоступность при подкожном введении (примерно 60%). Таблица 1 Максимальная наблюдаемая концентрация в плазме Время максимальной наблюдаемой концентрации в плазмеc Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени, измеряемой от 0 до бесконечностиd Период полувыведения в днях е Общий клиренс из организма как функция биодоступностиf Объем распределения в стабильном состоянии как функция биодоступности Когда V8-ГПП(7-37)ОН подобным же образом вводят ВВ крысам Fischer 344 в дозе 10 мкг/кг, получены сильно отличающиеся значения клиренса и полупериода элиминации, которые перечислены ниже. ПЭГилированный аналог ГПП-1 V8E22I33C45-40 кДа ПЭГ (ПЭГилированный, С 45-модифицированный CEX-51 вводят внутривенным (ВВ) или подкожным (ПК) путями в дозе 0,1 мг/кг самцам обезьян цитомольгус. У животных отбирали кровь в разные сроки между 0 и 336 ч после введения дозы. Из каждого образца отбирали плазму и анализировали с помощью радиоиммунного исследования. Фармакокинетические параметры рассчитывали с использованием зависимого от модели (данные для ВВ) и независимого (данные для ПК) методов (WinNonlin Pro). Сведения о фармакокинетических параметрах представлены в табл. 2 ниже. При ВВ введении ПЭГилированный аналог ГПП-1 имеет период полувыведения, равный примерно 59,5 ч, тогда как при ПК введении ПЭГилированный аналог ГПП-1 имеет период полувыведения, равный примерно 61,6 ч. Таблица 2 Максимальная наблюдаемая концентрация в плазме Время максимальной наблюдаемой концентрации в плазмеc Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени, измеряемой от 0 до бескоb Период полувыведения в днях Общий клиренс из организма как функция биодоступностиf Объем распределения в стабильном состоянии как функция биодоступности е- 18009366 Пример 6. Фармакодинамический анализ дериватизированного ГПП-1 пептида. ПЭГилированный аналог ГПП-1 V8E22I33C45-40 кДа ПЭГ (ПЭГилированный, С 45-модифицированный CEX-51 вводят подкожным (ПК) путем в дозах 3 нмоль/кг (12,33 мг/кг = 0,62 мкг (микрограммов)/50 г мышь) или 10 нмоль/кг (41 мг/кг = 2 мкг (микрограмов)/50 г мышь) самцам мышейC57BL/60laHsd-Lepob при сравнении с введением только носителя в качестве контроля. Животным (6 мышей на один срок) вводят дозы одной инъекцией или ПЭГилированного аналога ГПП-1 или носителя в 11:00. Затем мышей выдерживали голодными в течение ночи и выполняли IPTGG (1 г декстрозы/кг в/б). Отбирали повторные пробы на глюкозу и инсулин до и после инъекции глюкозы через 15, 30, 60, 90 и 120 мин. Сведения о фармакодинамических параметрах представлены в таблицах ниже. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. ПЭГилированное соединение ГПП-1, содержащее аминокислотную последовательность формулы и где 2 или 1 из Cys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, или 3, 2 или 1 из Lys остатков ковалентно связан(ы) с молекулой ПЭГ, и при условии, что, если Хаа 42, Хаа 43, Хаа 44, Хаа 45 или Хаа 46 отсутствует, каждая последующая кислота справа отсутствует; и при условии, что молекула содержит 2, 1 или 0 Cys. 2. ПЭГилированное соединение ГПП-1 по п.1, при условии, что ПЭГилированное соединение ГПП 1 отличается от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 не более чем 7 аминокислотами из числа аминокислот 7-37. 3. ПЭГилированное соединение ГПП-1 по п.1, при условии, что ПЭГилированное соединение ГПП 1 отличается от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 не более чем 6 аминокислотами из числа аминокислот 7-37. 4. ПЭГилированное соединение ГПП-1 по п.1, при условии, что ПЭГилированное соединение ГПП 1 отличается от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 не более чем 5 аминокислотами из числа аминокислот 7-37. 5. ПЭГилированное соединение ГПП-1 по п.1, при условии, что ПЭГилированное соединение ГПП 1 отличается от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 не более чем 4 аминокислотами из числа аминокислот 7-37. 6. ПЭГилированное соединение ГПП-1 по п.1, при условии, что ПЭГилированное соединение ГПП 1 отличается от ГПП-1(7-37)ОН или ГПП-1(7-36)NH2 не более чем 3 аминокислотами из числа аминокислот 7-37. 7. Применение ПЭГилированного соединения ГПП-1 по любому из пп.1-6 в производстве лекарственного средства для лечения неинсулинозависимого диабета, ожирения, инсульта, инфаркта миокарда,синдрома раздраженного кишечника или функциональной диспепсии. 8. Применение по п.7, в котором лекарственное средство используется для лечения неинсулинозависимого диабета. 9. Применение по п.7, в котором лекарственное средство используется для лечения ожирения.