Лиганд, родственный фактору некроза опухоли

1 Данное изобретение относится к лиганду,родственному фактору некроза опухоли или"TRELL", полипептиду, который является членом семейства факторов некроза опухоли. Этот белок или его рецептор могут иметь противораковые и/или иммунорегуляторные применения. Кроме того, клетки, трансфицированные геномTRELL, могут быть использованы в генной терапии для лечения опухолей, аутоиммунных и воспалительных заболеваний или наследственных генетических нарушений. Изобретение, описанное здесь, было сделано частично в ходе работы по гранту 3142275.94 и 32-41729.94 для Irene Garcia от Швейцарского Национального Фонда. Сохраненные права описаны в параграфах 28 и 29 законодательного акта Швейцарского Национального Фонда. Цитокины, родственные фактору некроза опухоли (TNF), являются медиаторами защитных сил организма и иммунорегуляции. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанных формах, действуя локально через контакт клетки с клеткой, или в виде секретируемых белков, способных диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о присутствии этих молекул, приводя к инициации некроза клеток или клеточной пролиферации и дифференцировке в ткани-мишени. В настоящее время TNFсемейство лигандов и рецепторов имеет, по меньшей мере, 9 признанных пар рецепторлиганд, в том числе: TNF:TNF-R; LT-:TNF-R;CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 и 4-1BBL:41BB. Последовательности ДНК, кодирующие эти лиганды, имеют только от примерно 25% до примерно 30% идентичности даже в наиболее родственных случаях, хотя аминокислотное родство составляет примерно 50%. Было найдено, что определяющим признаком этого семейства рецепторов цитокинов является обогащенный цистеином внеклеточный домен, первоначально обнаруженный молекулярным клонированием двух отличающихся рецепторов TNF.1 Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I с внеклеточным лигандсвязывающим доменом, одним проходящим через мембрану районом и цитоплазматическим районом, участвующим в активации клеточных функций. Обогащенный цистеином лигандсвязывающий район обнаруживает прочно связанный, соединенный дисульфидными связями,центральный домен (кор), который, в зависимости от конкретного члена семейства, повторяется много раз. Большинство рецепторов имеют четыре домена, хотя их может быть всего лишь три или даже шесть. Белки в TNF-семействе лигандов характеризуются коротким N-концевым отрезком 2 обычно коротких гидрофильных аминокислот,часто содержащим несколько остатков лизина или аргинина, которые, как полагают, являются стоп-транспортными последовательностями. Далее следует трансмембранный район и внеклеточный район варьирующей длины, который отделяет С-концевой рецептор-связывающий домен от мембраны. Этот район иногда называют "стеблем". С-концевой связывающий район содержит основную массу белка и часто, но не всегда, содержит сайты гликозилирования. "Эти гены лишены классических сигнальных последовательностей, характерных для мембранных белков типа I, и являются мембранными белками типа II с С-концом, лежащим вне клетки, и коротким N-концом, находящимся в цитоплазме. В некоторых случаях, например, в случаеTNF и LT-, расщепление в районе стебля может иметь место на ранних стадиях процессинга белка, и тогда лиганд обнаруживается прежде всего в секретируемой форме. Однако большинство лигандов существует в мембраносвязанной форме, опосредуя локализованную передачу сигнала. Структура этих лигандов была хорошо определена кристаллографическим анализом TNF,LT- и CD40L. TNF и лимфотоксин- (LT-) оба имеют структуру сэндвича из двух антипараллельных -складчатых листов с топологией"jelly roll" (рулета с джемом) или греческого ключа.2 Среднеквадратичное (rms) отклонение между остатками С- и -цепей равно 0,61 С,что предполагает высокую степень сходства в их молекулярной топографии. Структурным признаком, обнаруженным из молекулярных исследований CD40L, TNF и LT-, является склонность к сборке в олигомерные комплексы. Присущим этой олигомерной структуре является образование сайта связывания рецептора в месте соединения между соседними субъединицами, образующими мультивалентный лиганд. Было показано, что четвертичные структурыTNF, CD40L и LT- существуют в виде тримеров, согласно анализу их кристаллических структур. Многие консервативные в различных лигандах аминокислоты расположены в каркасе,имеющем -складчатую структуру. Вероятно,эта основная складчатая сэндвич-структура сохраняется во всех этих молекулах, так как участки этих каркасных последовательностей являются консервативными в различных членах этого семейства. Четвертичная структура может быть также сохранена, так как конформация субъединиц, по-видимому, остается одинаковой. Члены семейства TNF можно наилучшим образом охарактеризовать как главные переключатели в иммунной системе, регулирующие как выживание, так и дифференцировку клеток. Только TNF и LT- признаны в настоящее время в качестве секретируемых цитокинов, противопоставляемых другим преимущественно мем 3 браносвязанным членам семейства TNF. В то время как мембранная форма TNF была хорошо охарактеризована и, по-видимому, играет уникальные биологические роли, секретируемыйTNF действует в качестве основного участника передачи сигнала тревоги клеткам, более отдаленным от места запускаемого события. Таким образом, секреция TNF может усиливать явление, приводящее к хорошо описанным изменениям в выстилке сосудистой сети и воспалительному состоянию клеток. В противоположность этому, мембраносвязанные члены этого семейства посылают сигналы через TNFрецепторы типа I только к клеткам в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают опосредованную CD40 "помощь" только тем Вклеткам, с которыми осуществлен непосредственный контакт через взаимодействия с родственными Т-клеточными рецепторами (TCRвзаимодействия). Подобные ограничения межклеточных контактов, накладываемые на способность вызывать гибель клеток, относятся к хорошо изученной Fas-системе. Способность индуцировать запрограммированную гибель клеток является важным и хорошо изученным признаком нескольких членов семейства TNF. Fas-опосредованный апоптоз играет, по-видимому, роль в регуляции аутореактивных лимфоцитов на периферии и, возможно, в тимусе (Castro et al., 1996), и недавняя работа также подразумевает участие систем TNF иCD30 в выживании Т-клеток и линий крупных клеток анапластической лимфомы (Amakawa etZheng et al., 1995). Нами и другими показано ранее, что смерть этой линии в ответ на передачу сигнала TNF, Fas или LTb-рецептором имеет черты апоптоза (Abreu-Martin et al., 1995;Browning et al., 1996). По-видимому, TNF-лиганды могут быть подразделены на три группы на основе их способности индуцировать гибель клеток (таблицаIII). Во-первых, TNF, Fas-лиганд и TRAIL могут эффективно индуцировать гибель клеток во многих линиях и их рецепторы, по-видимому,имеют определенные канонические домены гибели клеток. Предположительно лиганд к DR-3(TRAMP/WSL-1) должен также входить в эту категорию. Кроме того, имеются лиганды, которые запускают слабый сигнал гибели, ограничивающийся несколькими типами клеток, и примерами этого класса являются TRELL, лигандCD30 и LT12. Как эта группа может запускать гибель клеток в отсутствие канонического домена смерти, является интересным вопросом и предполагает, что существует отдельный механизм передачи слабого сигнала гибели клеток. Наконец, имеются члены, которые не могут эффективно доставлять сигнал смерти клеток. Возможно, все группы могут оказывать антипролиферативное действие на некоторые типы клеток после индуцирования клеточной диффе 003187 4 ренцировки, например, CD40 (Funakoshi et al.,1994). Семейство TNF поразительно увеличилось в последние годы и включает в себя, по меньшей мере, 11 различных путей передачи сигнала, включающих в себя регуляцию иммунной системы. Характер экспрессии TRELL и TRAIL указывает на то, что в этом семействе должно быть раскрыто еще большее функциональное разнообразие. Этот аспект выдвинулся особенно на первый план после недавнего обнаружения двух рецепторов, которые влияют на способность репликации вируса саркомы Рауса и вируса простого герпеса, а также исторических наблюдений, что TNF обладает антивирусной активностью, и поксвирусы кодируют TNFрецепторы-ловушки (Brojatsch et al., 1996;TRELL-рецептора должны обеспечить инструменты для выяснения биологической функции этого интересного белка.TNF является медиатором септического шока и кахексии 3 и участвует в регуляции развития гемопоэтических клеток.4 По-видимому,он играет главную роль в качестве медиатора воспаления и защиты против бактериальных,вирусных и паразитарных инфекций 5, а также обладает противоопухолевой активностью 6.TNF участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях.7 TNF может продуцироваться несколькими типами клеток, в том числе макрофагами, фибробластами, Т-клетками и природными клетками-киллерами.8 TNF связывается с двумя различными рецепторами, каждый из которых действует через специфические внутриклеточные молекулы передачи сигнала,приводя таким образом к различным эффектамTNF.9 TNF может существовать либо в мембраносвязанной форме, либо в виде растворимого секретируемого цитокина.10LT- имеет многие общие активности сLT- и LT- является мембраносвязанным комплексом, который связывается с LТ-рецептором 13. LT-система (LT и LT-R), повидимому, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, так как генетическое разрушение LT- приводит к дезорганизации Ти В-клеток в селезенке и отсутствию лимфатических узлов 14. LTсистема также участвует в гибели клеток некоторых аденокарциномных клеточных линий.15Fas-L, другой член семейства TNF экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках.16 Он индуцирует гибель клеток, несущих его рецептор, в том числе опухо 5 левых клеток и ВИЧ-инфицированных клеток,по механизму, известному как запрограммированная гибель клеток, или апоптоз.17 Кроме того, недостаточность либо Fаs, либо Fas-L может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, подтверждающим роль Fas-системы в регуляции иммунных ответов 18. Fas-система участвует также в повреждении печени, вызываемом хроническим гепатитом,19 и в аутоиммунитете у ВИЧ-инфицированных пациентов.20TRAIL, другой член этого семейства, также, повидимому, участвует в гибели большого разнообразия трансформированных клеточных линии разного происхождения.22CD40-L, другой член семейства TNF экспрессируется на Т-клетках и индуцирует регуляцию СD40-несущих В-клеток.23 Кроме того,изменения в гене CD40-L приводят к заболеванию, известному как Х-сцепленный гипер-IgMсиндром.24 Система CD40 участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях 25, и известно, что CD40-L обладает антивирусными свойствами.26 Хотя система CD40 участвует в спасении апоптотических В-клеток,27 в неиммунных клетках она индуцирует апоптоз 28. Многие дополнительные лимфоцитарные члены семейства TNF также участвуют в костимуляции.29 В общем, члены семейства TNF играют фундаментальную регуляторную роль в регуляции иммунной системы и активации защитных систем хозяина. При текущем прогрессе в манипулировании членами семейства TNF для терапевтических целей вероятным является то,что члены этого семейства могут обеспечить уникальные средства для борьбы с заболеваниями. Некоторые из лигандов этого семейства могут непосредственно индуцировать апоптотическую гибель многих трансформированных клеток, такие, например, как LT, TNF, Fasлиганд и TRAIL (Nagata, 1997). Активация Fas и, возможно, TNF и СD30-рецептора может индуцировать гибель клеток в нетрансформированных лимфоцитах, что может являться иммунорегуляторной функцией (Amakawa et al.,1996; Nagata, 1997; Sytwu et al., 1996; Zheng etal., 1995). Как правило, гибель запускается после агрегации доменов гибели, которые находятся на цитоплазматической стороне TNFрецепторов. Домен гибели управляет ансамблем различных компонентов передачи сигнала, которые приводят к активации каскада (Nagata,1997). Некоторые рецепторы лишены канонических доменов гибели, например, LTрецептор и CD30 (Browning et al., 1996; Lee et al., 1996),но все еще могут индуцировать гибель клеток,хотя и более слабо. Вероятно, эти рецепторы функционируют прежде всего, индуцируя дифференцировку клеток, и гибель клеток является аберрантным последствием в некоторых транс 003187 6 формированных клеточных линиях, хотя эта картина является неясной, так как исследования на CD30-нуль-мыши предполагают, что гибель вызывается негативной селекцией в тимусе(Amakawa et al., 1996). Наоборот, передача сигнала через другие пути, такие как CD40, необходима для поддержания выживания клеток. Таким образом, существует необходимость в идентификации и характеристике дополнительных молекул, являющихся членами семействаTNF и тем самым обеспечении дополнительных средств регуляции заболевания и манипулирования иммунной системы. Таким образом, данное изобретение относится к полипептиду, лиганду, называемомуTRELL, родственному фактору некроза опухоли, который, по существу, устраняет одну или несколько проблем, обусловленных ограничениями и недостатками родственного уровня знаний. Заявитель обнаружил новый член TNFсемейства цитокинов и определил аминокислотную последовательность этого белка человека и мыши, а также последовательности ДНК,кодирующие этот белок. Заявленное изобретение может быть использовано для идентификации новых диагностических и терапевтических средств для многочисленных заболеваний и состояний, как обсуждается более детально ниже,а также для получения информации об иммунной системе и ее процессах и манипулировании ими. Кроме того, заявленное изобретение относится к индукции гибели клеток в карциноме. Дополнительные признаки и преимущества данного изобретения будут изложены в следующем далее описании и частично будут очевидны из этого описания или могут быть обнаружены при применении на практике данного изобретения. Цели и другие преимущества данного изобретения будут также реализованы и достигнуты при помощи композиций и способов, конкретно указанных в описании и формуле изобретения, а также в прилагаемых рисунках. Таким образом, для достижения этих и других преимуществ и в соответствии с целью данного изобретения, включенного и широко описанного здесь, данное изобретение включает в себя последовательность ДНК, кодирующуюTRELL. Нуклеотидная последовательность для мышиного TRELL (mTRELL) показана в SEQSEQ ID3. Конкретно, данное изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют TRELL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID2 (mTRELL) или 4 (hTRELL). В других вариантах воплощения данное изобретение относится к последовательностям, которые имеют, по меньшей мере, 50% гомологию с ДНК, кодирующей С-концевой рецептор-связывающий домен TRELL, и гибридизуются с заявленными последовательностями ДНК или их фрагмента 7 ми и которые кодируют TRELL, имеющий последовательность, показанную в SEQ ID4 или SEQ ID2. Данное изобретение в определенных вариантах относится, кроме того, к последовательности ДНК, кодирующей TRELL, где эта последовательность оперативно связана с регуляторной последовательностью экспрессии. Любая подходящая регуляторная последовательность экспрессии применима в заявленном изобретении и может быть легко выбрана специалистом в данной области. Данное изобретение рассматривает также рекомбинантную ДНК, содержащую последовательность, кодирующую TRELL, или ее фрагмент, а также хозяев со стабильно интегрированными последовательностями TRELL, введенными в их геном, или обладающую эписомными элементами. Любой подходящий хозяин может быть применен в этом изобретении и он может быть легко выбран специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования. В других вариантах данное изобретение относится к способам получения, по существу,чистого TRELL, включающим в себя стадию культивирования трансформированных хозяев,и к TRELL, по существу, не содержащему обычно связанных с ним белков животных. Данное изобретение включает в себяTRELL, имеющий аминокислотную последовательность, идентифицированную в SEQ ID4 или SEQ ID2, а также его фрагменты или гомологи. В различных вариантах аминокислотная и/или ДНК-последовательность TRELL может содержать консервативные вставки, делеции и замены, описанные ниже, или может содержать фрагменты указанных последовательностей. Данное изобретение относится в других вариантах к растворимым конструкциямTRELL, которые могут быть использованы для непосредственного запуска опосредованныхTRELL фармакологических событий. Такие события могут иметь полезную терапевтическую ценность в лечении рака или в манипулировании иммунной системы для лечения иммунологических заболеваний. Растворимые формыTRELL могут быть генетически переконструированы для включения в них легко узнаваемого маркера с облегчением тем самым идентификации TRELL-рецепторов. В других вариантах данное изобретение относится к способам генной терапии, в которых используют описанный и заявленный здесьTRELL. Фармацевтические препараты данного изобретения, возможно, могут включать в себя фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и могут вводиться в любой из 8 многочисленных форм или любым способом,известными в данной области. Должно быть понятно, что как предыдущее общее описание, так и последующее подробное описание являются примерными и приведенными для объяснений и предназначены для дополнительного объяснения заявленного изобретения. Сопутствующие рисунки включены для обеспечения дополнительного понимания данного изобретения и включены в описание и представляют собой часть данного описания,иллюстрируют некоторые варианты данного изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов данного изобретения. Краткое описание рисунков Фиг. 1 - сравнение аминокислотных последовательностей TRELL человека (SEQ ID NO:4) и мыши (SEQ ID NO:2). Фиг. 2 А и 2 В - сравнение аминокислот членов семейства TNF человека. Фиг. 3 - Нозерн-анализ экспрессии мРНКTRELL в различных мышиных клеточных линиях и тканях. Дорожки даны в двух повторностях и содержат РНК из (1) индуцированных тиогликолатом перитонеальных макрофагов, (2) костного мозга, (3) селезенки и (4) печени. Фиг. 4 - Нозерн-анализ экспрессии мРНК(обозначаемого здесь как "TWEAK") при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Фиг. 6 - TRELL является цитотоксичным для линии НТ 29 аденокарциномы человека. А. Способность TNF, TRELL, LT/ и анти-Fas блокировать рост линии НТ 29 в присутствии интерферона- человека. Клетки росли в течение 4 дней в присутствии различных агентов, и рост оценивали с применением МТТокрашивания. В. Морфология клеток, подвергшихся гибели. Клетки предварительно выращивали в течение 2 дней и затем обрабатывали в течение 24 ч 80 Е/мл -интерферона без дополнительных добавок (А), или добавляли 100 нг/мл рекомбинантного TRELL (В). Клетки фиксировали этанолом и окрашивали 1 мкг/мл красителя Hoescht для выявления ядер. На верхней панели показаны фазово-контрастные изображения, а на нижней панели - хроматин, окрашенный красителемHoescht. Теперь будут подробно описаны предпочтительные варианты данного изобретения. Это изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют TRELL человека или мыши, их фрагментам и гомологам, и к экспрессии этих последовательностей ДНК в хозяевах,трансформированных ими. Данное изобретение 9 относится к применениям этих последовательностей ДНК и пептидов, кодируемых ими. Кроме того, данное изобретение включает в себя как человеческие, так и мышиные аминокислотные последовательности для TRELL или их фрагменты, а также фармацевтические композиции, содержащие их или полученные из них. А. Определения."Гомологичный" здесь означает сходство между последовательностями сравниваемых молекул. Когда положение в обеих из сравниваемых последовательностей занято одной и той же мономерной субъединицей основания или аминокислоты, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином,то эти молекулы являются гомологичными в данном положении. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, имеющихся в обеих последовательностях, деленной на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 этих положений в двух последовательностях являются совместимыми или гомологичными, то эти две последовательности являются на 60% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК ATTGCC и TATGGC имеют 50% гомологию. Как правило, сравнение выполняют,когда две последовательности выстраивают параллельно одна другой, для получения максимальной гомологии."Очищенный препарат" или "по существу очищенный препарат" полипептида здесь обозначает полипептид, который был отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот,с которыми он обычно встречается. Предпочтительно, этот полипептид отделен также от других веществ, например, антител, матриксов и т.д., которые используют для его очистки."Трансформированный хозяин" здесь обозначает любого хозяина со стабильно интегрированной последовательностью, т.е. последовательностью TRELL, введенной в его геном, или хозяина, обладающего последовательностью,например, TRELL, кодирующей эписомные элементы."Обработка" здесь включает в себя любую терапевтическую обработку, например, введение терапевтического агента или вещества, например, лекарственного средства."По существу очищенная нуклеиновая кислота", например, по существу очищенная ДНК,является нуклеиновой кислотой, (1) которая является одной из нуклеиновых кислот или обеими из них: не смежной непосредственно с одной из последовательностей или с обеими последовательностями, например, кодирующими последовательностями, с которыми она является непосредственно смежной (т.е. одной на 5'-конце и другой на 3'-конце) в природновстречающемся геноме организма, из которого эта нуклеиновая кислота получена; или (2) ко 003187 10 торая, по существу, не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она встречается в организме, из которого эта нуклеиновая кислота получена. Этот термин включает в себя, например, рекомбинантную ДНК,которая включена в вектор, например, в автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус,или в геномную ДНК прокариота или эукариота,или которая существует в виде отдельной молекулы (например, фрагмента кДНК или геномной ДНК, полученного при помощи ПЦР или обработкой рестриктазами), независимой от других последовательностей ДНК. По существу чистая ДНК включает в себя также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена,кодирующего TRELL. Термины "пептиды", "белки" и "полипептиды" используются здесь взаимозаменяемо. Термин "биологически активный" здесь означает имеющуюся in vivo или in vitro активность, которая может проявляться непосредственно или опосредованно. Например, биологически активные фрагменты TRELL могут иметь 70% аминокислотную гомологию с активным сайтом TRELL, более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% гомологию. Идентичность или гомология в отношении TRELL определена здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам TRELL в SEQ ID2 или 4. Применение на практике данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы биологии клеток,культуры клеток, молекулярной биологии,трансгенной биологии, микробиологии, способов рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках квалификации в данной области. Такие способы описаны в литературе.30 В. Последовательности ДНК данного изобретения. Как здесь описано, один аспект данного изобретения показывает, по существу, чистуюID1 или 3, и/или эквиваленты таких нуклеиновых кислот. Термин нуклеиновая кислота здесь может включать в себя фрагменты и эквиваленты, такие, например, как последовательности, кодирующие функционально эквивалентные пептиды. Эквивалентные нуклеотидные последовательности могут включать в себя последовательности, которые отличаются одним или несколькими нуклеотидными заменами,добавлениями или делециями, такие как аллельные варианты, мутации и т.д., и включают в себя последовательности, которые отличаются от нуклеотидной последовательности, коди 11 рующей TRELL, показанной в SEQ ID1 или 3, вследствие вырожденности генетического кода. Авторы изобретения секвенировали человеческую ДНК 1936 п.н., которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую полипептид TRELL, имеющий последовательность из 248 аминокислот, представленную в SEQ ID4. Автор изобретения описывает здесь как человеческие, так и мышиные последовательности; изобретение будет описано в основном со ссылкой на человеческие последовательности,хотя специалисту в данной области будет понятно, что в изобретение включены также мышиные последовательности. Поразительным признаком TRELL является консервативность большой последовательности рецепторсвязывающего домена между мышью и человеком; только Fas-лиганд приближается к такому уровню консервативности. Как мышиный, так и человеческий белки TRELL имеют все характеристики семейства TNF, т.е. организацию мембранного белка типа II и сохранение мотивов последовательности, участвующих в упаковке белка в антипараллельную -складчатую структуру TNF. Нуклеотидная последовательность дляmTRELL представлена в SEQ ID1; аминокислотная последовательность для mTRELL изображена в SEQ ID2. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность дляhTRELL представлены в SEQ ID3 и 4, соответственно. Последовательности данного изобретения могут быть использованы для получения ряда ДНК-зондов, которые применимы в скрининге многочисленных коллекций природных и синтетических ДНК на присутствие последовательностей ДНК, которые кодируют TRELL или его фрагменты или производные. Специалисту в данной области будет понятно, что ссылка"TRELL", используемая здесь, относится также к его биологически активным производным,фрагментам или гомологам. Последовательности ДНК, кодирующиеTRELL данного изобретения могут быть использованы для получения пептидов TRELL экспрессией в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, трансформированных ими. Эти пептиды TRELL могут быть использованы в противораковых и иммунорегуляторных приложениях. Как правило, это предусматривает стадии культивирования хозяина,трансформированного молекулой ДНК, содержащей последовательность,кодирующуюTRELL, оперативно соединенную с регуляторной последовательностью экспрессии. Последовательности ДНК и рекомбинантные молекулы ДНК данного изобретения могут экспрессироваться в разнообразных комбинациях хозяин-вектор. Например, применимые векторы могут состоять из сегментов хромосом 003187 12 ных, нехромосомных или синтетических последовательностей. Экспрессирующие векторы данного изобретения характеризуются, по меньшей мере, одной регуляторной последовательностью экспрессии, которая может быть оперативно связана с последовательностью ДНК TRELL, встроенной в этот вектор, для управления экспрессией и регуляции экспрессии этой последовательности ДНК. Кроме того, в каждом экспрессирующем векторе могут быть выбраны различные сайты для встраивания последовательности TRELL данного изобретения. Эти сайты обычно обозначаются рестриктазой, которая их разрезает, и эти сайты и рестриктазы хорошо известны специалистам в данной области. Конечно, понятно,что экспрессирующий вектор, применимый в этом изобретении, не обязательно должен иметь сайт рестриктазы для инсерции желательного фрагмента ДНК. Вместо этого вектор может быть клонирован в этот фрагмент альтернативными способами. Экспрессирующий вектор и, в частности, сайт, выбранный в нем для встраивания выбранного фрагмента ДНК, и его оперативное связывание в нем с регуляторной последовательностью экспрессии, определяются различными факторами. Эти факторы включают в себя, но не ограничиваются ими, размер экспрессируемого белка, чувствительность желательного белка к протеолитическому расщеплению ферментами клетки-хозяина, количество сайтов, чувствительных к конкретной рестриктазе, загрязнение или связывание экспрессируемого белка белками клетки-хозяина, которые могут оказаться трудно удаляемыми во время очистки. Дополнительные факторы, которые могут учитываться, включают в себя характеристики экспрессии, такие как расположение стартового кодона и стоп-кодона относительно векторных последовательностей, и другие факторы,которые будут понятны специалистам в данной области. Выбор вектора и сайта инсерции для заявленных последовательностей ДНК определяется балансированием этих факторов, причем не все выборы одинаково эффективны для желательного приложения. Однако для специалистов в данной области анализ этих параметров и выбор подходящей системы в зависимости от конкретного применения является рутинной работой. Специалист в данной области, может легко выполнить соответствующие модификации в регуляторных последовательностях экспрессии для получения высоких уровней экспрессии белка, т.е. путем замены кодонов или выбора кодонов для конкретных аминокислот, которые преимущественно используются конкретными организмами, для минимизации протеолиза или для изменения состава гликозилирования. Подобным образом остатки цистеина могут быть заменены на другие аминокислоты для упроще 13 ния проблем получения, повторной укладки или стабильности. Таким образом, не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор функционируют с равной эффективностью в экспрессии последовательностей ДНК данного изобретения. Однако конкретный выбор комбинации хозяин/экспрессирующий вектор может быть сделан специалистами в данной области. Факторы, которые можно учитывать, включают в себя, например,совместимость хозяина и вектора, токсичность для хозяина белков, кодируемых данной последовательностью ДНК, легкость извлечения желательного белка, характеристики экспрессии последовательностей ДНК и регуляторные последовательности экспрессии, оперативно связанные с ними, биологическая безопасность,расходы и укладка, форма или другие необходимые постэкспрессионные модификации желательного белка.TRELL и его гомологи, продуцируемые хозяевами, трансформированными последовательностями данного изобретения, а также нативный TRELL, очищенный способами согласно изобретению или полученный из заявленных аминокислотных последовательностей, применимы в различных композициях и способах для антираковых и иммунорегуляторных применений. Они также применимы в терапии и способах, относящихся к другим заболеваниям. Данное изобретение относится также к применению описанных здесь последовательностей ДНК для экспрессии TRELL в аномальных состояниях, а именно в условиях генной терапии. TRELL может экспрессироваться в опухолевых клетках под контролем промоторов, пригодных для таких приложений. Такая экспрессия могла бы усиливать противораковые иммунные ответы или непосредственно влиять на выживание опухоли. Цитокины, такие какTRELL, могут также влиять на выживание трансплантата органа путем изменения локального иммунного ответа. В этом случае сам трансплантат или окружающие его клетки можно было бы модифицировать сконструированным геном TRELL. Другой аспект данного изобретения относится к использованию выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей TRELL, в "антисмысловой" терапии. Здесь, термин "антисмысловая терапия" относится к введению или генерированию in situ олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизуются в условиях клетки с клеточной мРНК и/или ДНК,кодирующей TRELL, ингибируя экспрессию кодируемого белка, а именно ингибированием транскрипции и/или трансляции. Это связывание может быть обусловлено обычной комплементарностью пар оснований или, например,в случае связывания с дуплексами ДНК, специфическими взаимодействиями в большой бороздке двойной спирали. Обычно термин "анти 003187 14 смысловая терапия" относится к ряду способов,обычно применяемых в данной области, и включает в себя терапию, основанную на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями. Антисмысловая конструкция данного изобретения может быть доставлена, например, в виде экспрессирующей плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, комплементарную, по меньшей мере, части клеточной мРНК, кодирующей TRELL. Альтернативно, антисмысловая конструкция может быть олигонуклеотидным зондом, который генерируется ex vivo. Такие олигонуклеотидные зонды являются предпочтительно модифицированными олигонуклеотидами, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и, следовательно, стабильны in vivo. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в качестве антисмысловых олигонуклеотидов являются фосфорамидаты, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (См., например, 5 176 996; 5 264 564 и 5 256 775). Кроме того, общие подходы к конструированию олигомеров, применимых в антисмысловой терапии, были описаны,например, Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; и Stein et al., (1988) Cancer Res 48:2659-2668, специально включенными здесь в качестве ссылки. С. TRELL и его аминокислотные последовательности. Белок, родственный семейству факторов некроза опухоли (TRELL) согласно изобретению, рассмотренный выше, является членом семейства TNF. Этот белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкое терапевтическое и диагностическое применение.TRELL присутствует во многих тканях, с характером распределения, относительно уникальным среди членов семейства TNF. Поскольку члены семейства TNF участвуют в регуляции гибели и выживания клеток и дифференцировки клеток, возможно, что TRELL участвует также в выживании, дифференцировке и репарации клеток в различных тканях. Хотя точная трехмерная структура TRELL неизвестна, предсказывается, что как член семейства TNF, он может иметь определенные общие структурные характеристики с другими членами этого семейства. Здесь описаны как мышиный, так и человеческий TRELL. Мышиный TRELL, расшифрованный из существующей последовательности кДНК, содержит участок, по меньшей мере, из 21 гидрофобной аминокислоты, который, предположительно, действует в качестве мембраносвязанного домена для мембранного белка типа II. Аминокислотная последовательность mTRELL описана в SEQ ID2.TRELL человека содержит N-концевой гидрофильный цитоплазматический домен, состоящий приблизительно из 27 аминокислот 15 гидрофобный трансмембранный домен типа II и состоящий из 204 аминокислот внеклеточный домен. Аминокислотная последовательностьhTRELL описана в SEQ ID4. Фиг. 1 изображает сравнение аминокислотных последовательностей TRELL человека и мыши. Хотя N-концевой район из 52 аминокислот может быть предсказан из открытой рамки считывания в клоне кДНК, точный стартовый метионин не может быть предсказан. Met-36 имеет приемлемую консенсусную последовательность Козака, которая может сделать его предпочтительным стартовым кодоном. Сравнение этой последовательности TRELL с другими членами семейства TNF человека выявляет значительное структурное сходство. Например, как можно видеть из фиг. 2 А и 2 В, все белки подобны мембранным белкам типа II и имеют несколько общих районов консервативной последовательности во внеклеточном домене. Районы с черточками над последовательностями указывают последовательности в TNF и LT-, участвующие в организации -цепи этих молекул. Предполагаемые N-связанные сайты гликозилирования подчеркнуты. Звездочки указывают цистеины,участвующие в дисульфидной связи в TNF. Консервативные домены, по-видимому, участвуют в межсубъединичных взаимодействиях и организации пластинчатой структуры.EST-поиск выявил человеческий клон из 345 оснований, который является высокогомологичным мышиному TRELL. Аминокислотная последовательность TRELL человека представлена в SEQ ID4. Открытая рамка считывания, кодируемая EST, не содержит мотивов последовательности, которые позволили бы охарактеризовать эту последовательность как члена семейства TNF лигандов, например, мотива,использованного Wiley et al для идентификацииEST TRELL в существующей базе данных. Новые полипептиды данного изобретения специфически взаимодействуют с рецептором,который до сих пор не был идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные здесь, не позволяют идентифицировать рецепторы, которые специфически взаимодействуют с TRELL или его фрагментами. Описанное изобретение в некоторых вариантах включает в себя пептиды, произведенные из TRELL, которые способны связываться сTRELL-рецепторами. Фрагменты TRELL могут быть получены несколькими способами, например, рекомбинантно, при помощи ПЦР, протеолитического расщепления или химическим синтезом. Внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены удалением одного или нескольких нуклеотидов из одного конца или из обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот полипептид. Экспрессия мутированной ДНК продуцирует фраг 003187 16 менты полипептида. Расщепление "отщепляющими концы" эндонуклеазами может, следовательно, генерировать ДНК, которые кодируют различные фрагменты. ДНК, которые кодируют фрагменты белка, могут быть также получены случайным разрезанием, расщеплением рестриктазами или сочетанием рассмотренных выше способов. Полипептидные фрагменты могут быть также синтезированы химически с применением способов, известных в данной области, таких как общепринятые твердофазные f-moc- и t-bocспособы Merri-field. Например, пептиды и последовательности ДНК данного изобретения могут быть произвольно разделены на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагмента или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Такие способы описаны более подробно ниже.D. Генерирование растворимого TRELL. Растворимые формы этого лиганда могут часто эффективно передавать сигнал и, следовательно, могут вводиться в виде лекарственного средства, который теперь имитирует природную мембраносвязанную форму. Возможно, чтоTRELL природно секретируется в виде растворимого цитокина, однако, если это не так, можно переконструировать этот ген для искусственного ускорения секреции. Для создания растворимой секретируемой формы TRELL можно было бы удалить на уровне ДНК N-концевые трансмембранные районы и некоторую часть района стебля и заменить их лидерной последовательностью типа I или альтернативно лидерной последовательностью типа II, что сделает возможным эффективное протеолитическое расщепление в выбранной системе экспрессии. Квалифицированный специалист мог бы варьировать величину района стебля, сохраняемую в секретируемой экспрессионной конструкции для оптимизации как рецептор-связывающих свойств, так и эффективности секреции. Например, конструкции, содержащие все возможные длины стебля, т.е. N-концевые усечения, могли бы быть приготовлены таким образом, чтобы получить белки, начинающиеся при аминокислотах 81-139. При помощи этого типа анализа можно было бы получить последовательность с оптимальной длиной стебля. Е. Генерирование антител, реагирующих сTRELL. Данное изобретение включает в себя также антитела, специфически реагирующие с TRELL или его рецептором. Антисыворотки или моноклональные антитела против белка/против пептида могут быть получены согласно стандартным протоколам (См., например. Antibodies: ASpring Harbor Press: 1988. Млекопитающее,такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой этого пептида. Способы придания иммуногенности 17 белку или пептиду включают в себя конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области. Иммуногенная часть TRELL или его рецептора может быть введена в присутствии адъюванта. Прогрессирование иммунизации можно наблюдать детектированием титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть использованы стандартный метод ELISA или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена. В предпочтительном варианте целевые антитела являются иммуноспецифическими в отношении антигенных детерминант TRELL или его рецептора, например, антигенных детерминант полипептида SEQ ID2 или 4, или близкородственного человеческого гомолога или гомолога млекопитающего не человека (например, с гомологией 70, 80 или 90%, более предпочтительно с гомологией, по меньшей мере,95%). Еще в одном предпочтительном варианте данного изобретения антитела против TRELL или против TRELL-рецептора по существу не реагируют перекрестно (т.е. не реагируют специфически) с белком, который менее, чем на 80% гомологичен SEQ ID2 или 4; предпочтительно менее, чем на 90%, гомологичен SEQID2 или 4; наиболее предпочтительно менее чем на 95%, гомологичен SEQ ID2 или 4. Термин "по существу не реагирует перекрестно" обозначает, что это антитело имеет связывающую аффинность в отношении негомологичного белка менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% от связывающей аффинности в отношении белкаSEQ ID2 или 4. Термин антитело здесь включает в себя его фрагменты, которые также специфически реагируют с TRELL или с TRELL-рецептором. Антитела могут быть фрагментированы при помощи общепринятых способов, и фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для целых антител. Например, F(ab')2-фрагменты могут быть получены обработкой антитела пепсином. Полученный F(ab')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с получением Fab'-фрагментов. Антитела данного изобретения включают в себя также биоспецифические и химерные молекулы,имеющие активность против TRELL или против(Ab) против TRELL и его рецептора и фрагменты антител, такие как Fab' и F(ab')2, могут быть использованы для блокирования действияTRELL и его рецептора. Различные формы антител могут быть также получены при помощи стандартных способов рекомбинантных ДНК. (Winter and Milstein, Nature 349:293-299 (1991), специально включенные в качестве ссылки). Например, мо 003187 18 гут быть сконструированы химерные антитела,в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного связан с константной областью иммуноглобулина человека (например, Cabillyet al., U.S. 4 816 567, включенный в качестве ссылки). Химерные антитела могут уменьшать наблюдаемые иммуногенные ответы, индуцируемые антителами животных при использовании их в клинке в лечении человека. Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные "очеловеченные антитела", которые узнают TRELL или его рецептор. Очеловеченные антитела являются химерами, содержащими в основном последовательности IgG человека, в которые были встроены участки, ответственные за связывание специфического антигена. Животных иммунизируют требуемым антигеном, выделяют соответствующие антитела и часть последовательностей вариабельной области, ответственную за связывание специфического антигена, удаляют. Затем полученные из животного антиген-связывающие участки клонируют в подходящий участок генов антител человека, в которых антиген-связывающие районы были делегированы. Очеловеченные антитела минимизируют применение гетерологичных (т.е. межвидовых) последовательностей в антителах человека и, следовательно,менее вероятно, что они будут вызывать при лечении иммунные ответы у человека. Конструирование различных классов рекомбинантных антител может быть также выполнено приготовлением химерных или очеловеченных антител, содержащих вариабельные области и константные области (СН 1, СН 2,СН 3) человека, выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с увеличенными валентностями сайта связывания антигена могут быть рекомбинантно получены клонированием антиген-связывающего сайта в векторы, несущие константные участки цепи человека. (Arulanandam et al., J. Exp. Med.,177:1439-1450 (1993), включенные здесь в качестве ссылки). Кроме того, стандартные способы рекомбинантных ДНК могут быть использованы для изменения связывающих аффинностей рекомбинантных антител с их антигенами изменением аминокислотных остатков вблизи сайтов связывания антигена. Антиген-связывающая аффинность очеловеченного антитела может быть увеличена мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании. (Queen et al., Proc. Natl.F. Генерирование аналогов: получение измененных последовательностей ДНК и пептидных последовательностей. Аналоги TRELL могут отличаться от природно встречающегося TRELL по аминокислотной последовательности или другим образом, не включающим последовательность, или и тем, и 19 другим образом. Не включающие изменения последовательности модификации включают в себя in vivo и in vitro химическую дериватизацию TRELL. He включающие изменения последовательности модификации включают в себя,но не ограничиваются ими, изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании,карбоксилировании или гликозилировании. Предпочтительные аналоги включают в себя TRELL или его биологически активные фрагменты, последовательности которых отличаются от последовательности, представленной в SEQ ID2 и 4, одной или несколькими консервативными заменами аминокислот или одной или несколькими неконсервативными заменами,делениями или вставками аминокислот, которые не уничтожают активности TRELL. Консервативные замены обычно включают в себя замену одной аминокислоты на другую с подобными характеристиками, например, замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Таблица 1. Консервативные замены аминокислот Для аминокисКод Замена любой из лоты Аланин А D-Ala, Gly, -Ala, L-Cys, D-Cys Аргинин Применимые способы мутагенеза включают в себя ПЦР-мутагенез и насыщающий мутагенез, рассматриваемые более подробно ниже. Библиотека случайных вариантов аминокислотных последовательностей может быть также 20 образована синтезом ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей.- ПЦР-мутагенез В ПЦР-мутагенезе может быть использована пониженная точность полимеразы Taq для введения случайных мутаций в клонированный фрагмент ДНК (Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). Это очень мощный и относительно быстрый способ введения случайных мутаций. Район ДНК, который должен быть мутирован,может быть амплифицирован с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) в условиях, которые понижают точность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Taq, например, путем использования отношения dGTP/dАТР 5 и добавления Mn2+ к ПЦР-реакции. Пул амплифицированных фрагментов ДНК может быть встроен в подходящие клонирующие векторы с получением библиотек случайных мутантов.- Насыщающий мутагенез Насыщающий мутагенез позволяет быстро вводить большое число замен одного основания в клонированные фрагменты ДНК (Mayers et al.,1985, Science 229:242). Этот способ включает в себя генерирование мутаций, например, химической обработкой или облучением одноцепочечной ДНК in vitro и синтез комплементарной цепи ДНК. Частота мутаций может быть модулирована путем модулирования тяжести обработки, и могут быть получены по существу все возможные замены оснований. Поскольку эта процедура не включает в себя отбор на мутантные фрагменты, могут быть получены как нейтральные замены, так и замены (как и в случае белка, получаемого случайным мутагенезом ДНК), которые являются заменами, изменяющими функцию. Распределение точковых мутаций не смещено в направлении консервативных элементов последовательности.- Вырожденные олигонуклеотиды Библиотека гомологов может быть также получена из ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Химический синтез вырожденных последовательностей может проводиться в автоматизированном синтезаторе ДНК и синтетические гены затем лигируют в подходящий экспрессирующий вектор. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен в данной области 31. Такие способы были использованы в прямом выделении других белков 32. Для обеспечения специфических последовательностей или мутаций в специфических районах могут быть использованы неслучайные или направленные способы мутагенеза. Эти способы могут быть использованы для создания вариантов, которые содержат, например, делеции, инсерции или замены остатков известной аминокислотной последовательности белка. Сайты для мутации могут быть модифицированы по отдельности или последовательно, например, (1) замещением сначала консервативных аминокислот, а затем более радикальным 21 выбором в зависимости от полученных результатов, (2) делетированием остатка-мишени или(3) встраиванием остатков того же самого или отличающегося класса рядом с локализованным сайтом, или сочетанием возможностей выбора 1-3.- Аланин сканирующий мутагенез Аланин сканирующий мутагенез является ценным способом для идентификации определенных остатков или районов целевого белка,которые являются предпочтительными местоположениями или доменами для мутагенеза(Cunningham and Wells (Science 244:1081-1085,1989, включ. здесь в качестве ссылки). В аланин сканирующем мутагенезе идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например,заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His,Lys и Glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином). Замена аминокислоты может влиять на взаимодействие аминокислот с окружающей водной средой в клетке или снаружи клетки. Затем домены, демонстрирующие функциональную чувствительность к этим заменам, могут быть уточнены путем введения дополнительных или других вариантов при сайтах замены или вместо сайтов замены. Таким образом, в то время как сайт для введения вариации аминокислотной последовательности предварительно определен,характер самой мутации не нуждается в предварительном определении. Например, для оптимизации выполнения мутации в конкретном сайте может быть проведен аланин сканирующий или случайный мутагенез в целевом кодоне или районе и экспрессированные субъединичные варианты целевого белка подвергают скринингу на оптимальную комбинацию желаемой активности.- Мутагенез, опосредованный олигонуклеотидами Мутагенез, опосредованный олигонуклеотидами, является ценным способом получения вариантов ДНК с заменами, делециями или вставками, см., например, Adelman et al., (DNA 2:183, 1983), включ. здесь в качестве ссылки. Вкратце, целевая ДНК может быть изменена гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего мутацию, с ДНК-матрицей, где матрица представляет собой одноцепочечную форму плазмиды или бактериофага, содержащую неизмененную или нативную последовательность ДНК целевого белка. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза всей второй комплементарной цепи матрицы, которая будет,таким образом, включать олигонуклеотидный праймер и будет кодировать выбранное изменение в ДНК целевого белка. Как правило, используют олигонуклеотиды длиной, по меньшей мере, 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет иметь 12-15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице на 22 любой стороне нуклеотида, кодирующего мутацию. Это гарантирует, что олигонуклеотид будет гибридизоваться правильно с одноцепочечной молекулой ДНК-матрицы. Эти олигонуклеотиды можно легко синтезировать с применением способов, хорошо известных в данной области, таких как описанные Сrеа et al., (Proc. Natl.- Кассетный мутагенез Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на способе, описанном Wells et al. (Gene, 34:315 [1985]), включ. в качестве ссылки. Исходным материалом может быть плазмида (или другой вектор), которая содержит ДНК субъединицы белка, которая должна быть мутирована. Кодон (кодоны) ДНК субъединицы белка, которые должны быть мутированы, идентифицируют. На каждой стороне идентифицированного сайта (сайтов) мутации должен быть сайт уникальной рестриктазы. Если такие сайты рестрикции не существуют, они должны быть генерированы при помощи описанного выше мутагенеза, опосредуемого олигонуклеотидами, для введения их в подходящие положения в ДНК субъединицы целевого белка. После введения этих сайтов рестрикции в плазмиду, ее разрезают в этих сайгах и линеаризуют. Синтезируют двухцепочечный олигонуклеотид,кодирующий последовательность ДНК между этими сайтами рестрикции, но содержащий желательную мутацию (мутации), при помощи стандартных процедур. Две цепи синтезируют отдельно и затем гибридизуют вместе при помощи стандартных способов. Этот двухцепочечный олигонуклеотид называют кассетой. Эту кассету конструируют таким образом, чтобы она имела 3'- и 5'-концы, которые сравнимы с концами линеаризованной плазмиды, так, чтобы ее можно было непосредственно лигировать в плазмиду. Теперь эта плазмида содержит мутированную последовательность ДНК субъединицы целевого белка.- Комбинаторный мутагенез Комбинаторный мутагенез может также использоваться для генерирования мутантов. Например, аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выстраивают параллельно, предпочтительно для ускорения наивысшей возможной гомологии. Все аминокислоты, которые появляются в конкретном положении выстроенных последовательностей, могут быть выбраны для создания вырожденного набора комбинаторных последовательностей. При помощи комбинаторного мутагенеза генерируют пеструю библиотеку вариантов на уровне нуклеиновых кислот, и она кодируется этой пестрой библиотекой генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может быть ферментативно лигирована в генные последовательности таким образом, что вырожденный набор потенциаль 23 ных последовательностей экспрессируется в виде индивидуальных пептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков, содержащих этот набор вырожденных последовательностей. В этой области известны разнообразные способы для скрининга генерированных продуктов мутантных генов. Способы скрининга больших библиотек генов часто включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученными библиотеками векторов и экспрессию генов в условиях, в которых детектирование целевой активности, например, в этом случае, связывания с TRELL или его рецептором, облегчает легкое выделение вектора, кодирующего ген,продукт которого был детектирован. Каждый из способов, описанных ниже, поддается анализу с высокой пропускной способностью для скрининга больших количеств созданных последовательностей, например, способами случайного мутагенеза. Данное изобретение обеспечивает также уменьшение белок-связывающих доменов целевых полипептидов TRELL или их рецепторов для образования миметиков, например, пептидных или непептидных агентов. Эти пептидные миметики способны разрушать связываниеTRELL, участвующие в молекулярном узнавании рецепторного полипептида или находящегося ниже по ходу передачи сигнала внутриклеточного белка, могут быть определены и использованы для создания произведенных изTRELL или из его рецептора пептидомиметиков, которые конкурентно или неконкурентно ингибируют связывание TRELL с рецепторомG. Фармацевтические композиции. Путем получения доступного очищенного и рекомбинантного TRELL данное изобретение обеспечивает тесты, которые могут быть использованы для скрининга предполагаемых лекарственных средств, которые являются либо агонистами, либо антагонистами нормальной функции клетки, в данном случае TRELL или его рецептора. В одном варианте этот тест оценивает способность соединения модулировать связывание между TRELL и его рецептором. Большое разнообразие форм этих тестов будет достаточным и, в свете данного изобретения,будет понятным для специалистов с квалификацией в данной области. Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые тестируют библиотеки соединений и природных экстрактов, желательными являются тесты с высокой пропускной 24 способностью для максимизации числа соединений, тестируемых за конкретный период времени. Тесты, которые выполняют в бесклеточных системах, такие, которые могут быть произведены с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве "первичных" скринингов вследствие того, что они могут быть созданы для быстрого проявления и относительно легкой регистрации изменения в молекулярной мишени, которое опосредуется тест-соединением. Кроме того,эффекты клеточной токсичности и/или биодоступности тест-соединения могут обычно игнорироваться в системе in vitro, причем тест вместо этого фокусируется на действии лекарственного средства на молекулярную мишень,которое может проявляться в изменении связывающей активности с другими белками или изменении ферментативных свойств молекулярной мишени. Фармацевтические композиции данного изобретения могут содержать терапевтически эффективное количество TRELL или TRELLрецептора или их фрагментов или миметиков и,возможно, могут включать в себя фармацевтически приемлемые носители. Поэтому данное изобретение обеспечивает способы лечения рака и способы стимулирования или, в некоторых случаях, ингибирования иммунной системы или ее частей путем введения фармацевтически эффективного количества соединения данного изобретения или его фармацевтически приемлемых солей или производных. Конечно, должно быть понятно, что композиции и способы данного изобретения могут использоваться в сочетании с другими способами терапии для различных лечений. Композиции могут быть приготовлены для различных способов введения, в том числе системного, местного или локализованного введения. Для системного введения предпочтительна инъекция, в том числе внутримышечная, внутривенная, внутрибрюшинная и подковная. Для инъекции композиции данного изобретения могут быть приготовлены в жидких растворах,предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса или раствор Рингера. Кроме того, композиции могут быть приготовлены в твердой форме и, необязательно, повторно растворены или суспендированы перед использованием. Лиофилизированные формы также включены в данное изобретение. Эти композиции могут вводиться перорально или трансмукозным или трансдермальным способом. Для трансмукозного или трансдермального введения в композиции используют смачивающие вещества, пригодные для барьера, через который они проникают. Такие смачивающие вещества известны в данной области и включают в себя, например, соли желчных кислот, производные фусидовой кислоты и 25 детергенты. Трансмукозное введение может проводиться при помощи назальных спреев или с применением суппозиториев. Для перорального введения композиции готовят в виде общепринятых форм перорального введения, таких как капсулы, таблетки и тоники. Для топического введения композиции данного изобретения готовят в виде мазей, гелей или кремов, как известно в данной области. Предпочтительно композиции данного изобретения должны быть в форме стандартной дозы и вводиться один или несколько раз в день. Количество активного соединения, вводимого при однократном введении или на протяжении курса лечения, будет зависеть от многих факторов, например, от возраста и размера субъекта,тяжести и протекания подлежащего лечению заболевания, способа и формы введения и мнения лечащего врача. Однако эффективная доза может быть в диапазоне от примерно 0,005 до примерно 5 мг/кг/день, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 0,5 мг/кг/день. Специалисту в данной области будет понятно, что могут применяться также более низкие и более высокие дозы. Генные конструкции согласно данному изобретению могут быть также использованы как часть протокола генной терапии для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих агонистическую или антагонистическую форму полипептида TRELL. Экспрессионные конструкции TRELL могут быть введены в любом биологически эффективном носителе, например, в любом препарате или композиции, способных эффективно доставлять ген TRELL в клетки in vivo. Подходы включают в себя встраивание этого гена в вирусные векторы, которые могут трансфицировать клетки непосредственно, или доставку плазмидной ДНК при помощи, например, липосом или внутриклеточных носителей, а также прямой инъекцией генной конструкции. Предпочтительны способы переноса с применением вирусного вектора. Фармацевтический препарат конструкции для генной терапии может состоять по существу из системы доставки гена в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс замедленного высвобождения, в который погружен носитель доставки гена. Альтернативно, если полная система доставки гена может быть получена в интактном виде из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, то фармацетический препарат может содержать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки гена. Кроме применения в терапии, олигомеры данного изобретения могут использоваться в качестве диагностических реагентов для обнаружения присутствия или отсутствия ДНК-,РНК-мишеней или аминокислотных последовательностей, с которыми они специфически свя 003187 26 зываются. В других аспектах заявленное изобретение может быть использовано для оценки химической молекулярной частицы на ее способность взаимодействовать, например, связываться или физически ассоциироваться, с полипептидом TRELL или его фрагментом. Этот способ предусматривает контактирование химической молекулярной частицы с полипептидом TRELL и оценку способности этой частицы взаимодействовать с TRELL. Кроме того,TRELL согласно изобретению может использоваться в способах оценки природно-встречающихся лигандов или рецепторов TRELL, а также для оценки химических молекулярных частиц,которые ассоциируются или связываются с рецепторами TRELL. В некоторых аспектах заявленное изобретение описывает способ оценки химической молекулярной частицы на способность модулировать взаимодействие между TRELL и его рецептором. Способ предусматривает объединение TRELL-рецептора и TRELL в условиях, в которых эта пара способна взаимодействовать,добавление оцениваемой химической молекулярной частицы и регистрацию образования или растворения комплекса. Эти модулирующие агенты могут быть затем оценены in vitro, например, тестированием активности такого агента в бесклеточной системе, и затем, возможно,введением этого соединения в клетку или в животное с оценкой его действия. Н. Примеры. 1. Выделение кДНК TRELL. а) Клонирование мышиного TRELL. кДНК, кодирующую mTRELL, выделяли при помощи ПЦР из библиотеки кДНК из мышиных перитонеальных макрофагов. Аминокислотная последовательность и расположение трансмембранного района являются типичными для мембранного белка. Аминокислотная последовательность mTRELL изображена в SEQID2, а последовательность ДНК изображена в SEQ ID1. Макрофагальные клетки получали из мышей Balb/c при помощи перитонеального лаважа, и клетки, прикрепившиеся к пластику в пределах 1 ч, лизировали и обрабатывали для экстракции РНК. Синтезировали антисмысловой олигонуклеотидный праймер 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' (SEQ ID NO:5) из последовательности мышиного эритропоэтина. С.В.Shoemaker and L. D. Mistock, "Murine eruthropoietin gene: cloning, expression and human gene homology", Mol. Cell. Biol., 6, 849 (1986), включ. в качестве ссылки. Этот праймер использовали в протоколе 5'RACE согласно рекомендации изготовителя (5'RACE system из BRL) в ассоциации со сконструированным BRL якорным праймером. Первую цепь кДНК получали из РНК,экстрагированной из прикрепившихся в течение 1 ч перитонеальных макрофагов. Амплификацию проводили в ДНК-термоциклере PerkinElmer с ДНК-полимеразой Taq из Perkin Elmer. После денатурации, 5 мин при 94 С, условия проведения циклов были следующими: 35 циклов при 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с и 72 С в течение 3 мин. Проводили дополнительное удлинение при 72 С и затем реакции выдерживали при 4 С. Анализ ПЦРэксперимента на агарозном геле выявил 2 амплифицированных фрагмента в 650 п.н. и 500 п.н. Эти два фрагмента вырезали из геля,встраивали в векторы pBS-T и секвенировали. Эти две вставки были различными. Обе они имели при каждом конце один и тот же специфический для гена эритропоэтина олигонуклеотид, использованный в качестве праймера в ПЦР-синтезе. Нозерн-гибридизации с 32 Р-меченными случайно праймированными фрагментами показали, что они гибридизуются с двумя различными РНК, причем фрагмент 500 п.н. гибридизуется с РНК 1, 4 т.п.н. в макрофагах. Для определения ориентации этой кДНК в Нозернгибридизации использовали 32 Р-рибозонды в обоих направлениях. Из определенных ориентации и последовательностей были получены два внутренних праймера для мРНК 1,4 т.п.н. Их использовали в 3' и 5'RACE, соответственно. 3'RACE-эксперимент выявил фрагмент 750 п.н., который встраивали в вектор pBS-T и секвенировали. Он соответствует 3'-концу РНК 1,4 т.п.н., так как эта последовательность имеет сигнал присоединения полиА ААТААА (SEQ ID NO: 6) непосредственно перед полоской полиА. 5'RACE не выявил какой-либо полосы. Набор для амплификации Clontech Marathon использовали для получения библиотеки кДНК из одночасовых прикрепленных макрофагов. Использовали ПЦР-фрагмент 1040 п.н., выделенный при помощи ПЦР со смысловым и антисмысловым олигонуклеотидными праймерами из определенной последовательности кДНК, и универсальный праймер из этого набора. Это привело к выделению фрагмента большего размера, чем исходный фрагмент 1040 п.н. Этот новый фрагмент, который секвенировали, добавлял 60 п.н. к 5'-последовательности (SEQ ID1). РНК экстрагировали из мышиных индуцированных тиогликолатом макрофагов после 1 часа прикрепления. Гибридизацию проводили с 32 Р-меченной кДНК mTRELL. На фиг. 3 изображен Нозерн-анализ экспрессии мРНК TRELL в мышиных перитонеальных макрофагах и в различных мышиных тканях. Первые аминокислоты (21 аминокислота) соответствуют гидрофильному трансмембранному домену. В доступных базах данных не были найдены идентичные последовательности на нуклеотидном или аминокислотном уровнях. С применением программы PROSITE и аминокислотной последовательности из 225 аминокислот было определено, что эта последовательность принадлежит к TNF-семейству белков. Этот 28 белок обладал также различными доменами,описанными для LT-a и других членов этого семейства (J . Browning et al., Lymphotoxin-a, aTschopp (Eds), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p. 175-218 (1995), каждая включена в качестве ссылки). Эта последовательность является уникальной. На нуклеотидном или аминокислотном уровнях наблюдали слабую идентичность или сходство с различными членами TNFсемейства или с какими-либо последовательностями. Поиск в базах данных EST показал, что 1 последовательность человека была явно гомологичной этой мышиной последовательности. Клон 154742,5' (GenBank accession No: R55379) из библиотеки молочной железы, приготовленной Soares, Washington University, имеет последовательность 345 п. н., на 80% гомологичную мышиному TRELL. Человеческая последовательность в доступных базах данных, совпадающая с доступной 5'-ДНК mTRELL, не была найдена.b) Клонирование TRELL человека. 1) Генерирование олигонуклеотидных зондов и ПЦР-праймеров. Последовательность EST R55379 человека,которая имеет гомологию с мышиным TRELL,использовали как основу для синтеза олигонуклеотидных праймеров. Были синтезированы два 20-мерных олигонуклеотида со смысловыми цепями:ii) Идентификация источника библиотеки мРНК и кДНК для клонирования hTRELL. ПолиА+ мРНК из печени человека (кат.6510-1), селезенки (кат.6542-1) и лимфатического узла (кат.6594-1) были приобретены изClontech. ПолиА+ мРНК из линий клеток человека ТНР-1, U937 и II-23 генерировали в Biogen,Cambridge, МА. Библиотеку кДНК из миндалин человека в Лямбда gt10 и ДНК из библиотеки миндалин также готовили в Biogen. ОФ-ПЦР (RT-PCR) проводили на шести пробах РНК. Каждая кДНК-реакция содержала 1 мкг полиА+ мРНК, 50 мМ Трис рН 8,3, 75 мм КСl, 3 мм MgCl2, 10 мМ ДТТ, 250 мкМ dNTP, 50 нг случайного гексамера (50 нг/мкл) и 400 единиц обратной транскриптазы Super-scriptII(Gibco BRL кат.6542-1) в конечном объеме 40 мкл. Реакцию выведения цыплят осуществляли при 20 С в течение 20 мин, при 42 С в течение 50 мин, и при 99 С в течение 5 мин. Для 29 ПЦР-реакций использовали 1/5 каждой кДНКреакции или 100-1000 нг ДНК библиотеки кДНК. Устанавливали две ПЦР-реакции для каждой пробы, одну с парой праймеров LTB066 и LTB-067, которая дает ПЦР-продукт 201 п.н., и вторую реакцию с парой праймеров LTB066 и LTB-067, которая дает продукт 257 п.н.,если транскрипт присутствует в этой пробе. ПЦР-реакции проводили в 10 мМ Трис рН 8,3,содержащем 50 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% желатин, 10% ДМСО, 100 мкМ dNTP, 30 пмоль каждого праймера и 5 единиц Amplitaq (PerkinElmer, кат.801-0060). ПЦР проводили в ДНКтермоциклере модели 480 Perkin Elmer Cetus. Условия циклов были 95 С 1 мин, 60 С 1 мин и 72 С 1 мин в течение 35 циклов. Продукты точного размера получали из мРНК печени, селезенки, лимфатического узла,ТНР-1 и миндалины, но не из U937 или 11-23. Продукт ПЦР 201 п.н., полученный из печени,очищали для применения в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК.iii) Скрининг библиотеки кДНК. После демонстрации при помощи ПЦР того, что библиотека миндалин содержала TRELL,один миллион бляшкообразующих единиц(БОЕ) из библиотеки кДНК человека в Лямбдаgt10 высевали при плотности 1 х 105 БОЕ/чашкуNunc. "Лифты" в двух повторностях получали на фильтрах 20 х 20 см Schleicher and ScheullVogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267, 1984,включ. здесь в качестве ссылки). Фильтры гибридизовали в течение ночи при 65 С в 400 мл буфера для скрининга бляшек (50 мМ Трис, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,1% пирофосфат натрия, 0,2% ПВП и 0,2% Фиколл), содержащего 10% декстрансульфата, 100 мкг/мл тРНК и 6 х 105 имп/мин на мл зонда. Их промывали дважды буфером для скрининга бляшек и дважды 2 хSSC, 0,1% ДСН при 65 С и экспонировали на пленке при -70 С с усиливающим экраном в течение 40 ч. Дубликатные позитивные колонии вырезали в виде цилиндров из основных чашек в SM(100 мМ NaCl, 10 мМ МgSO4, 50 мМ Трис, рН 7,5) плюс желатин. 12 из позитивных колоний очищали титрованием бляшек. Miniprep ДНК Лямбда из 12 очищенных кандидатов расщепляли NotI, подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, блоттингу по Саузерну и гибридизовали с зондом 201 п.н. Клоны с наибольшими вставками (приблизительно 2 т.п.н.), которые гибридизовались с зондом, отбирали для крупномасштабной очистки ДНК и секвенирования ДНК. Вставки из каждого из этих клонов субклонировали в сайт NotI pBluescript SK+ (Stratagene 212205). Последовательность ДНК получали из ДНК Лямбда и плазмидной ДНК. КлонF1a, который имеет вставку кДНК 2006 п.н., повидимому, имел интрон в 5'-конце кодирующего 30 района и не содержал полной открытой рамки считывания. Клон А 2 а, также называемый РВ 133, содержал вставку кДНК 1936 п.н. Этот клон содержал 5'-нетранслируемый район 543 п.н., открытую рамку считывания из 852 п.н. и 3'-нетранслируемый район, но не содержал сигнала полиаденилирования или хвоста полиА. Нуклеотидная последовательность, кодирующая открытую рамку считывания кДНКклона А 2 а hTRELL, изображена в SEQ ID3. Расшифрованная аминокислотная последовательность из 284 аминокислот изображена вSEQ ID4. Второй метионин в положении 36 может быть с большей вероятностью стартовым сайтом трансляции, так как этот сайт более близко удовлетворяет требованиям для старта,определенным Kozak. При помощи идентифицированных последовательностей были определены последовательности кДНК, кодирующие TRELL. Из последовательностей ДНК, описанных выше (например, SEQ ID3), мы расшифровали аминокислотные последовательности TRELL (SEQ ID4). Должно быть ясно, что в условиях существующего состояния области конструирования белков специалист мог бы производить целенаправленные изменения, инсерции или делеции в этих аминокислотных последовательностях и получать множество молекул, имеющих по существу те же самые биологические или иммунологические активности, какими обладают молекулы, описанные здесь.iv) Нозерн-анализ экспрессии человеческого TRELL. Фрагмент PpuMI/BstXI 440 п.н. кДНКклона 2 а человека метили 32 Р случайным праймированием и использовали для зондирования коммерческих Нозерн-блотов, содержащих РНК из различных тканей человека. Нозерн-блоттинг показал, что фрагмент hTRELL гибридизовался с отдельными видами мРНК длиной приблизительно 1,4-1,6 т.п.н. Человеческий TRELL экспрессируется в большинстве органов иммунной системы, т.е. в селезенке, лимфоцитах периферической крови (рb1), лимфатических узлах,аппендиксе, но относительно мало в тимусе,печени эмбриона (источнике предшественников лимфоцитов) и костном мозге (фиг. 4). Таким образом, органы вторичной иммунной системы первично экспрессируют TRELL. Экспрессия была также детектирована в яичнике, предстательной железе, тонкой кишке, ободочной кишке, сердце, мозгу, плаценте, легком, печени,скелетной мышце, почке и поджелудочной железе. Экспрессия была относительно низкой в яичке, печени, почке и тимусе. Это распределение показывает широко распространенную экспрессию, очень сходную с экспрессией TRAILлиганда, за исключением того, что TRAIL слабо экспрессируется в сердце и в мозгу. 31 с) Выделение рецептора, связывающегося с TRELL-лигандом. Лиганды TNF-семейства могут быть использованы для идентификации и клонирования рецепторов. С описанной последовательностьюTRELL можно было бы слить 5'-конец внеклеточного домена TRELL-лиганда, который включает в себя рецепторсвязывающую последовательность, для маркировки или мечения последовательности и затем добавить лидерную последовательность, которая будет усиливать секрецию этого лиганда в любой из ряда экспрессионных систем. Один пример этой технологии описанVCAM используют для усиления секреции обычно мембраносвязанной молекулы LT-. Секретируемый белок сохраняет mус-метку наN-конце, которая не нарушает способности связываться с рецептором. Такой секретируемый белок может быть экспрессирован либо во временно трансфицированных клетках COS, либо в подобной системе, например, произведенных изEBNA векторах, клетке насекомого/бакуловирусе, Picchia и т.д. Неочищенный клеточный супернатант может быть использован в качестве источника меченого лиганда. Клетки, экспрессирующие рецептор, могут быть идентифицированы экспонированием их меченому лиганду. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в FACS-эксперименте(анализе с активируемой флуоресценцией) мечением mус-метки антителом против mуспептида (9 Е 10) и затем меченым фикоэритрином (или подобной меткой) антимышиным иммуноглобулином. FACS-позитивные клетки могут быть легко идентифицированы и могут служить источником РНК, кодирующей рецептор. Затем можно было бы приготовить экспрессионную библиотеку из этой РНК при помощи стандартных способов и разделить ее на пулы. Пулы клонов могли бы трансфицироваться в подходящие клетки-хозяева, и связывание меченого лиганда с рецептором позитивно трансфицированных клеток можно было бы определить под микроскопом после мечения связаннойmус-пептидной метки меченым ферментом антимышиным Ig-реагентом, а именно, меченным галактозидазой, щелочной фосфатазой или люциферазой антителом. После идентификации позитивного пула размер пула может быть уменьшен, пока не будет идентифицирована кДНК, кодирующая рецептор. Эту процедуру можно проводить либо с мышиным, либо с человеческим TRELL как с лигандом, который может более легко приводить к рецептору. 2. Клетки и реагенты. 32 Все клетки получали из American TypeCulture Collection (ATCC, Rockville, MD), кроме клона 13 WEHI 164, который получили от доктора Kawashima (Geneva Biomedical Research(HT29-14) был описан ранее (Browning et аl.,1996) и TNF-чувствительный субклон ME180 получили от доктора Carl Ware. Т-клеточная гибридома 11-23 была описана (Browning et аl.,1991). Мышей Balb/c инъецировали внутрибрюшинно за 3 дня перед умерщвлением 1,5 мл содержащего тиогликолат бульона (Difco Lab). Клетки брали из перитонеальной полости и культивировали при плотности 106 клеток/мл в течение 1 ч в DMEM (Gibco Lab). Неприкрепленные клетки смывали с чашек, а прикрепленные клетки, почти исключительно макрофаги,лизировали в реагенте Tri-Reagent (MolecularResearch Center Inc.) и обрабатывали для экстракции РНК. Рекомбинантные человеческие TNF, LT-oc,LT-ct1/p2, антитела к этим белкам и слитые белки рецептор-Ig были описаны ранее (Browning et аl., 1995). Антитело 5 С 8 против CD40L было описано. Поликлональную антисыворотку против hTRELL получали инъекцией в лимфатический узел чистого рекомбинантного hTRELL вCFA, как описано ранее (Browning and Ribolini,1989). После 2 месяцев наблюдали ответ в виде антител против hTRELL и иммуноглобулин очищали при помощи Протеин А-Сефарозы. Клонирование мышиного TRELL Антисмысловой олигонуклеотидный праймер 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' (SEQID NO:10) из последовательности мышиного эритропоэтина использовали в протоколе 5'RACE согласно рекомендации изготовителя(5'RACE system из BRL) в ассоциации со сконструированным BRL якорным праймером. Первую цепь кДНК получали из РНК, экстрагированной из прикрепившихся в течение 1 ч перитонеальных макрофагов. Амплификацию проводили в ДНК-термоциклере Perkin Elmer с ДНК-полимеразой Taq. После денатурации 5 мин и при 94 С условия проведения циклов были следующими: 35 циклов при 94 С в течение 30 с , 55 С в течение 30 с и 72 С течение 3 мин с конечным дополнительным удлинением при 72 С. Анализ ПЦР-эксперимента на агарозном геле выявил 2 амплифицированных фрагмента 650 п.н. и 500 п.н. Эти два фрагмента вырезали из геля, встраивали в векторы pBS-T и секвенировали. Нозерн-гибридизации с 32 Р-мечеными случайно праймированными фрагментами показали, что фрагмент 500 п.н. гибридизуется с РНК 1,4 т.п.н. в макрофагах. Для определения ориентации этой кДНК в Нозерн-гибридизации использовали 32 Р-рибозонды в обоих направлениях. Из определенных ориентации и последовательностей были получены два внутренних праймера для мРНК 1,4 т.п.н.: 5'ТСАGGТGСАСТТТGАТGАGG3' (SEQ IDID NO:12), которые использовали в 3' и 5'RACEPCR, соответственно. S'RACE-эксперимент выявил фрагмент 750 п.н., который встраивали в вектор pBS-T и секвенировали. Он соответствует 3'-концу РНК 1,4 т. п.н., так как эта последовательность имеет сигнал присоединения полиА непосредственно перед полоской полиА. 5'RACE не выявил какой-либо полосы. Набор для амплификации кДНК Clontech Marathon использовали для получения библиотеки кДНК из одночасовых прикрепленных макрофагов. Использовали ПЦР-фрагмент 1040 п.н., выделенный при помощи ПЦР со смысловым и антисмысловым олигонуклеотидными праймерами из определенной последовательности кДНКCAGGGAGGAGCTTGTCC3') и универсальный праймер из этого набора. Это привело к выделению фрагмента, большего на 60 п.н. на 5'-конце,чем исходный фрагмент 1040 п.н. Клонирование человеческого TRELL Поиск в базе данных EST обнаружил один человеческий клон, который был явно гомологичен мышиной последовательности. Клон 154742 (Genbank accession No. R55379) имеет последовательность 345 п.н., на 89% гомологичную мышиной кДНК. Для скрининга использовали два праймера, полученные из EST(SEQ ID NO:16 при помощи ОФ-ПЦР различных тканей и библиотек на присутствие транскриптов hTRELL. Продукты точного размера получали из мРНК печени, селезенки, лимфатического узла, ТНР-1 и миндалины, но не изU937. Продукт ПЦР 201 п.н. клонировали и использовали для скрининга библиотеки кДНК миндалин человека в Лямбда gtl0. 106 бляшкообразующих единиц высевали при плотности 105 БОЕ на чашку. "Лифты" в двух повторностях получали на нитроцеллюлозных фильтрах 20 х 20 см и гибридизовали с зондом, приготовленным случайным праймированием. Фильтры гибридизовали в течение ночи при 65 С в буфере для скрининга бляшек (50 мМ Трис, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,1% пирофосфат натрия, 0,2% поливинилпирролидон и 0,2% Фиколл), содержащем 10% сульфат декстрана, 100 мг/мл тРНК и 6 х 105 имп/мин на мл зонда. Их промывали дважды буфером для скрининга блюшек и дважды 2 хSSC, 0,1% ДСН при 65 С. Miniprep ДНК Лямбда получали из позитивных колоний и клоны с наибольшими вставками отбирали для крупномасштабной очистки ДНК и секвенирования ДНК. Вставки субклонировали в сайт NotIEST человека (R55379) кодирует части последовательности TRELL человека. 34 Анализ РНК Либо фрагмент PpuMI/BstXI 0,45 т.п.н.,либо фрагмент Narl/NotI 1,25 т.п.н. кДНКhTRELL метили случайным праймированием и использовали для зондирования Нозерн-блотов человеческих и мышиных тканей, приобретенных из Clontech. Из мышиных тканей и клеток экстрагировали РНК TRI-реагентом. Нозернанализ проводили по существу, как уже описано(Chicheportiche and Vassalli, 1994) с 4 мкг общей РНК и 32 Р-меченой случайно праймированной кДНК mTRELL. Хромосомное распределение Панель ДНК из монохромосомных клеточных гибридов HGMP Resource centre, Hinxton,Cambridge, UK) использовали для амплификации при помощи ПЦР-фрагмента 340 п. н. с праймерами, выбранными в 3'-нетранслируемом районе, который не является гомологичным мышиной последовательности (5'AGTCGTCCNO:18. Амплификацию проводили в течение 40 циклов, 30 с при 94 С, 90 с при 65 С и 90 с при 72 С. Регистрацию проводили на окрашенном бромидом этидия агарозном геле. Экспрессия рекомбинантного белка hTRELL Растворимую экспрессионную конструкцию, объединяющую лидерную последовательность УСАМ, mус-пептидную метку и внеклеточный домен hTRELL, сходный с доменом,описанным для лимфотоксина-р (ссылка), получали подобно способу, описанному для LT(Browning et al., 1996). Были выделены следующие фрагменты ДНК, NotI/тупой фрагмент, кодирующий лидер УСАМ, и пара олигонуклеотидов, кодирующих mус-метку (5 тупой, 3' сайт PpuMI), которые были описаны, фрагментBstl/NotI 0,65 т. п. н. TRELL. Эти четыре фрагмента лигировали в вектор pBluescript, обработанный NotI/фосфатазой. Вставку NotI из этого вектора переносили в вектор pFastBacI (GibcoBRL) и использовали для получения рекомбинантного бакуловируса. Растворимый TRELL получали инфицированием клеток насекомых(MOI) 10, и среду собирали после 2 дней. К среде добавляли: буфер HEPES до конечной концентрации 25 мМ, рН 7,4, 1 мМ AEBSF (Pierce) и 1 мг/мл пепстатина. Среду фильтровали и концентрировали в 10 раз ультрафильтрацией на фильтре Amicon с отсечением 10 кДа. Концентрированную содержащую TRELL среду непосредственно нагружали на колонку SPSepharose Fast Flow и промывали 25 мМ буфером HEPES, рН 7,0, содержащим 0,4 М Nad.TRELL элюировали тем же буфером с 0,6 МNaCl. Для определения размера очищенныйTRELL подвергали анализу методом гельэксклюзивной хроматографии. 35 Анализ секреции Векторы для экспрессии на основе EBNA конструировали с применением вектора СН 269,который является модифицированной версиейpEBVHis ABC (Invitrogen), в которой ген EBNA и гистидиновая метка удалены. Фрагмент 0,71 т.п.н. hTNF в векторе pFastBac получили от докторов Р. Pescamento и A. Goldfeld. ВставкуCH269. Геномная TNF-вставка, содержащая делецию сайта расщепления 1-12, была подарком от доктора G. Kollias и была встроена в вектор CH269 A.hTRELL, фрагмент NotI 0,98 т.п.н., содержащий кДНК hCD40L, полученный от доктора Е. Garber, и вставку NotI 1,46 т.п.н., содержащую hLTaCH269. Вставку Hindlll 0,81 т.п.н., содержащую кодирующий район hLT (3 с модифицированным стартовым сайтом (Browning et аl., 1995),лигировали в сайт Hindlll CH269. Клетки EBNA293 трансфицировали различными векторамиCH269 вместе с вектором GFP с применением липофектамина и либо удаляли ЗФР с 5 мМ ЭДТА для FACS-анализа, либо после 2 дней эти клетки подвергали метаболическому мечению. В обеих процедурах использовали следующие антитела: Ig-фракцию кроличьих поликлональных антител к hTRELL, mAb 104 с против hTNF,mAb AG9 против hLTa, mAb B9 против LTal/p2 и mAb 5C8 против CD40L. FACS-анализ проводили в среде RPMI, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 50 мкг/мл агрегированного нагреванием человеческого IgG, с антителами при 5 мкг/мл. Меченные фикоэритрином антитела против мышиного или кроличьего IgG(Jackson ImmunoResearch) использовали для детектирования связывания антител. GFP-яркие трансфицированные клетки задерживались. Для иммунопреципитации клетки через 2 дня после трансфекции промывали ЗФР и переносили в не содержащую Met/Cys MEM, содержащую 200 мкКи/мл TranSlabel (IСN). После 3 ч супернатанты собирали и подвергали иммунопреципитации, как описано (Browning et аl., 1995). Тесты цитотокcичности Тесты роста клеток проводили, как описано ранее (Browning and Ribolini, 1989). Для микроскопии клетки НТ 29-14 высевали в 24 луночные планшеты при плотности 200000 клеток на лунку и выращивали в течение 2 дней. Человеческий TRELL, TNF, лимфотоксин-12(Browning et al., 1996) или антитела против fas(СН 11, Kamaya) добавляли вместе с 80 единицами на мл человеческого -интерферона. После 26 ч удаляли среду, которая после обработки цитокином или антителом против fas содержала много мертвых клеток, которые отделялись от пластика. Оставшиеся клетки фиксировали 80% этанолом и промывали в ЗФР, содержащим 1 36 мг/мл красителя Hoescht. Через 2 мин краситель удаляли, клетки промывали в ЗФР и наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Таблица II. Сайты связывания и цитотоксические эффекты человеческого TRELL на различных клеточных линиях СвязываКлеточная ЦитотокТип ние линия сичностьa- итотоксичность наблюдали только в присутствии не опр. - не определяли- изменения морфологии Таблица III. Разделение на группы различных членов семейства TNF по распределению цитотоксичности Группа Активация рецептора Сильные индукторы апоптоза воDR-3 Слабые индукторы только в ограLT-R, TRELL-Ra,ниченных типах клетокCD30 Не могут индуцировать некрозa Эти рецепторы еще не были идентифицированы ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли,причем указанная последовательность состоит,по существу, из SEQ ID1. 2. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли,причем указанная последовательность состоит,по существу, из SEQ ID3. 3. Молекула ДНК, кодирующая полипептид, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 50% гомологична активному сайту лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанная молекула ДНК гибридизуется с ДНК-зондом, содержащим, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов последовательности SEQ ID1. 4. Молекула ДНК, кодирующая полипептид, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 50% гомологична активному сайту лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанная молекула ДНК гибридизуется с ДНК-зондом, содержащим, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов последовательности SEQ ID3. 5. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли,где кодируемый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID2, причем указанная аминокислотная последовательность может содержать консервативные замены, изменения или делеции. 6. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли,где кодируемый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID4, причем указанная аминокислотная последовательность может содержать консервативные замены, изменения или делеции. 7. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК по п.1, причем указанная последовательность оперативно связана с последовательностью, регулирующей экспрессию. 46 8. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК по п.2, причем указанная последовательность оперативно связана с последовательностью, регулирующей экспрессию. 9. Линия рекомбинантных клеток, содержащих молекулу ДНК по п.1 или 7, для экспрессии лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанные клетки выбраны из клеток EBNA293 и клеток HighFive. 10. Линия рекомбинантных клеток, содержащих молекулу ДНК по п.2 или 8, для экспрессии лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанные клетки выбраны из клеток EBNA293 и клеток HighFive. 11. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий биологически функциональную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID2. 12. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий биологически функциональную последовательность, содержащую аминокислотную SEQ ID4. 13. Способ получения лиганда по п.11, который предусматривает культивирование клеток-хозяев по п.9, в условиях, при которых клетка-хозяин продуцирует лиганд, и выделение указанного лиганда. 14. Способ получения лиганда по п.12, который предусматривает культивирование клеток-хозяев по п.10, в условиях, при которых клетка-хозяин продуцирует лиганд, и выделение указанного лиганда. 15. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий последовательность SEQID2, получаемый способом по п.13, причем указанный лиганд, полученный таким способом,затем подвергается очистке, достигая высокой степени чистоты. 16. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий последовательность SEQID4, получаемый способом по п.14, причем указанный лиганд, полученный таким способом,затем подвергается очистке, достигая высокой степени чистоты. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество лиганда по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество лиганда по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель. 19 . Способ предотвращения или уменьшения тяжести аутоиммунного заболевания, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17. 20. Способ предотвращения или уменьшения тяжести аутоиммунного заболевания, предусматривающий стадию введения пациенту 47 терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18. 21. Способ предотвращения или уменьшения тяжести иммунного ответа на тканевый трансплантат, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17. 22. Способ предотвращения или уменьшения тяжести иммунного ответа на тканевый трансплантат, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18. 23. Способ стимуляции иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.17. 24. Способ стимуляции иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.18. 25. Способ супрессии иммунной системы,предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.17. 26. Способ супрессии иммунной системы,предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.18. 27. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17. 28. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18. 29. Способ идентификации молекулы, которая специфически связывается с лигандом,родственным фактору некроза опухоли, по п.11,предусматривающий(a) обеспечение биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли;(b) мечение указанного биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли, регистрируемой меткой;(c) введение композиции, содержащей, по меньшей мере, один белок, в контакт с меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, стадии (b);(d) регистрирование специфического связывания белка с указанным меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, идентифицирующее таким образом молекулу, которая специфически связывается с меченым лигандом, родственным фактору некроза опухоли. 30. Растворимый фрагмент лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11, где указанный фрагмент содержит аминокислотную 48 последовательность SEQ ID2 без трансмембранного участка и N-конца указанного лиганда, родственного фактору некроза опухоли. 31. Растворимый фрагмент лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12, где указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID4 без трансмембранного участка и N-конца указанного лиганда, родственного фактору некроза опухоли. 32. Аналог лиганда, родственного фактору некроза опухоли, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере,на 40% гомологична полипептидной последовательности SEQ ID2, причем указанный аналог кодируется молекулой ДНК по п.3. 33. Аналог лиганда, родственного фактору некроза опухоли, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере,на 40% гомологична полипептидной последовательности SEQ ID4, причем указанный аналог кодируется молекулой ДНК по п.4. 34. Способ получения препарата антител,реагирующего с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.11, предусматривающий стадию иммунизации организма указанным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, или его антигенным фрагментом. 35. Способ получения препарата антител,реагирующих с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.12, предусматривающий стадию иммунизации организма упомянутым лигандом, родственным фактору некроза опухоли, или его антигенным фрагментом. 36. Препарат антитела, полученный способом по п.34. 37. Препарат антитела, полученный способом по п.35. 38. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат антител по п.36. 39. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат антител по п.37. 40. Способ экспрессии гена в клетке млекопитающего, предусматривающий(a) введение последовательности по п.1,кодирующей лиганд, родственный фактору некроза опухоли, в клетку;(b) предоставление упомянутой клетке возможности жить в условиях, в которых указанный ген экспрессируется в упомянутой клетке млекопитающего. 41. Способ экспрессии гена в клетке млекопитающего, предусматривающий:(a) введение последовательности по пункту 2, кодирующей лиганд, родственный фактору некроза опухоли, в клетку;(b) предоставление упомянутой клетке возможности жить в условиях, в которых указанный ген экспрессируется в упомянутой клетке млекопитающего. 42. Способ лечения нарушения, связанного с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, предусматривающий введение в клетку 49 млекопитающего эффективного количества рекомбинантной молекулы по п.7. 43. Способ лечения нарушения, связанного с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, предусматривающий введение в клетку млекопитающего эффективного количества рекомбинантной молекулы по п.8. 44. Способ по пп.42 и 43, при котором млекопитающим является человек. 45. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.30. 46. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.31. 47. Способ по пп.45 и 46, дополнительно предусматривающий введение -интерферона. 48. Способ лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, включающего в себя путь передачи сигнала между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, и его рецептором, при этом указанный способ предусматривает стадию введения эффективного количества агента, способного противодействовать связи между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.11 и его рецептором,причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.30. 49. Способ по п.48, где в указанном иммунном ответе участвуют клетки аденокарциномы человека. 50. Способ идентификации молекулы, которая специфически связывается с лигандом,родственным фактору некроза опухоли, по п.12,предусматривающий(a) обеспечение биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли;(b) мечение указанного биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли, регистрируемой меткой;(с) приведение композиции, содержащей,по меньшей мере. один белок, в контакт с меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, стадии (b);(d) регистрирование специфического связывания белка с указанным меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, идентифицирующее таким образом молекулу, которая специфически связывается с меченым лигандом, родственным фактору некроза опухоли. 51. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда,родственного фактору некроза опухоли, по п.11. 52. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда,родственного фактору некроза опухоли, по п.12. 53. Способ лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, включающего в себя путь передачи сигнала между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, и его рецептором, при этом указанный способ предусматривает стадию введения эффективного количества агента, способного противодействовать связи между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.12 и его рецептором,причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.31. Фиг. 3 Фиг. 1 Сравнение последовательностей человеческих лигандов вTNF- семействе Анализ первичной структуры 10 членов семействаTNF-лигандов (человека), иллюстрирующий вариации в длине внутриклеточных N-концевых доменов и районов стебля, отделяющих С-концевой рецепторсвязывающий домен от трансмембранного района (начинающегося непосредственно перед первой бета-цепью). N-конец человеческого FasL был усечен. Этот анализ первичной структуры показывает сильную консервативность цистеина и вследствие очень слабой гомологии в некоторых районах между некоторыми членами этого семейства могут быть предложены многие альтернативные сравнения (выстраивания), варьирующие в деталях. Полосы над последовательностями указывают структуры бета-цепей в TNF и LT с номенклатурой, которая используется Eck и Sprang. Канонические Nсвязанные сайты гликозилирования подчеркнуты как и возможные трансмембранные последовательности, и связанные дисульфидной связью цистеины в TNF отмечены точками. Последовательности со звездочками являются мотивами,используемыми в узнавании членов TNF-семейства.