Однородная вакцинная композиция для лечения опухоли и способ ее получения

ОДНОРОДНАЯ ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ И СПОСОБ Е ПОЛУЧЕНИЯ Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к медицине. Раскрыт способ получения конъюгата hrEGF-P64K, включающий ковалентное сопряженное связывание белка hrEGF с белком-носителем P64K и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор,пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100 кДа. Также раскрыта вакцинная композиция, включающая конъюгат hrEGF-P64K, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид. Настоящее изобретение позволяет получить вакцинные композиции, увеличивающие иммунные реакции против аутологичного EGF. Родригес Мартинес Грисселль Мария,Винья Родригес Лисель, Кальво Гонсалес Лоани, Куэвас Фиалло Ариадна, Чико Велис Эрнесто,Кромбет Рамос Таниа, Албиса Ново Айрама, Гонсалес Маринелло Гисела Мария, Лахе Давила Агостин Бьенвенидо (CU) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СЕНТРО ДЕ ИНМУНОЛОГИЯ МОЛЕКУЛАР (CU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицине. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к профилактическим и/или лечебным противораковым вакцинам, главным образом, к композициям вакцин, применяемых для обеспечения значительного усиления иммунной реакции против эпидермального фактора роста (EGF), связь которого с онкологическими заболеваниями была широкого продемонстрирована, главным образом, в отношении роста опухолей эпителиального происхождения. Предшествующий уровень техники Система рецепторов EGF (EGFR), включая лиганды, представляет собой молекулярный комплекс,который специфически регулирует клеточный рост и его воздействие на неконтролируемый рост эпителиальных опухолей. В процессе онкогенеза, нарушение регуляции паракринных и аутокринных процессов с активациейEGFR участвуют в избыточной экспрессии факторов роста, а также увеличенном синтезе и/или мутации рецепторов.EGF представляет собой полипептид из 53 аминокислот с видимой молекулярной массой 6045 Да. Этот пептид был впервые выделен и очищен Cohen S., J. Biol. Chem. 20 (1962) 237, 1555).EGF является членом семейства лигандов EGFR; это семейство включает структурно и функционально связанные белки. Другими членами этого семейства являются: трансформирующий фактор роста(TGF), амфирегулин (AR), криптол (CR1), связывающий герин фактор роста, бетацелулин и эфирегулин. С другой стороны, семейство поксивирусов включает белки, связанные с EGF; среди них, наиболее полно охарактеризованным является фактор роста вируса коровьей оспы (VGF). Все эти молекулы способны связывать EGFR с последующей активацией рецепторов. Таким образом, они известны как лиганды EGFR и играют роль в росте нормальных и опухолевых клеток.EGFR представляет собой гликопротеин 170 кДа; ген был уже клонирован и секвенирован. Внутриклеточный домен этого рецептора связан с активностью тирозин-киназы молекул, которая проявляет структурную гомологию с теми белками, которые кодируются онкогеном v-erb-B, и они участвуют в процессе злокачественной трансформации (HELDIN С.Н. (1984), CELL 37, 9-20). Экспериментальные данные последних лет о связи между EGFR и системой их лигандов и раком,делает ее привлекательной мишенью для иммунотерапии рака. Ранее полученные результаты продемонстрировали эффективность в отношении рака активной иммунотерапии вакцины на основе EGF. Действительно, были получены преклинические и клинические данные об иммуногенности и отсутствии токсичности, вызванной вакцинацией hrEGF, связанным с белком-носителем (Gonzalez et al. (1996) Vaccone Research 5(4), 233-243). В документе ЕР 0657175 описана вакцинная композиция, включающая аналогичный EGF, соединенный с белком-носителем, которая ингибирует рост зависимых от EGF опухолей аутоиммунным эффектом. Вакцинная композиция, описанная в документе ЕР 0657175, представляет собой сопряженно связанные вакцины, содержащие EGF, соединенный с белком-носителем (белок P64K, цепь холерного токсина В, белок столбнячного анатоксина и/или моноклональные антитела), и, как следствие, получается в неоднородной и мало воспроизводимой смеси сопряженно связанных видов. Новая вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, включает аутологичный EGF в качестве активного начала, и характеризуется наличием однородной химической композиции с определенной чистотой, вызывающей более высокую иммуногенность, по существу, повышенную клиническую активность и при меньшем количестве иммунизации для получения терапевтического эффекта. К удивлению, более низкое содержание аутологичного антигена в вакцинной композиции по настоящему изобретению не вызывает более низкие титры антител против EGF у людей; напротив, оно скорее вызывает значительное увеличение титров антител против EGF. Более низкое содержание EGF и его производных в вакцинной композиции было получено разработкой способа очистки на основе мембранной фильтрации, который также является целью настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет однородную и воспроизводимую вакцинную композицию с более длительным клиническим эффектом и требующую меньшее количество иммунизации, что имеет большое преимущество при лечении рака и для пациента, по сравнению с ранее описанными вакцинными композициями. Вакцинная композиция по настоящему изобретению может также содержать соответствующие адъюванты, такие как гидроксид алюминия или монтанид. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к санитарной процедуре для получения указанной вакцинной композиции, целесообразной для применения у людей парентеральным путем. Процедура включает подходящий способ ковалентного сопряженного связывания hrEGF с белкомносителем P64K, и очистку конъюгатов путем использования ультрафильтрационных мембран в диапазоне от 500 до 100 кДа для удаления биологически неактивных видов, сопряженно связанных (без иммуногенной активности), а также других химических примесей. Детальное описание изобретения Настоящее изобретение раскрывает новую вакцину на основе аутологичного EGF, содержащую указанную вакцинную композицию с однородным химическим составом и определенной чистотой, и которая способна вызывать и потенцировать иммуногенность и существенно увеличить клиническую активность. Кроме того, при использовании вакцинной композиции по настоящему изобретению можно использовать более высокие терапевтические дозы без увеличения числа инъекций при необходимости увеличения терапевтической дозы, потому что с помощью процедуры получения вакцинной композиции по настоящему изобретению можно увеличить концентрацию сопряженно связанных видов hrEGFrP64K, которая известна как активность. К удивлению, заявители обнаружили, что при уменьшении содержания аутологичного антигена новой процедурой очистки, вакцинная композиция по настоящему изобретению способна вызвать значительное увеличение иммунной реакции против аутологичного EGF, по сравнению с ранее описанными вакцинами на основе гетерологичного EGF. Вакцинная композиция, полученная в результате уменьшения содержания аутологичного антигена посредством методологии ультрафильтрации через мембрану, имеет однородную композицию, в которой иммунологически активный вид (сопряженно связанные виды hrEGF-rP64K) проявляет молекулярную массу, превышающую 60 кДа. Эта вакцинная композиция проявляет характерный хроматографический профиль молекулярного исключения, потому что вид, имеющий биологическую активность, представляет более чем 90% общей хроматографической площади, соответствующей всей вакцинной композиции,как показано на фиг. 4. Масс-спектрометрический анализ настоящей вакцинной композиции выявил ее структурные признаки. Пептидные карты двух различных лотов показывают высокую гомологию между лотами в положении s, a также в соотношении (фиг. 5). Эта высокая гомология между лотами подтверждает точность параметров химической сопряженной связи, а также процедур очистки, которые описываются настоящим изобретением. Масс-спектрометрический анализ, кроме того, выявил последовательность основных пептидов, полученных из вакцинной композиции по настоящему изобретению (табл. 3). В настоящей вакцинной композиции, соотношение сопряженной связи между белками EGF и P64K составляет 1:2, что означает 2 молекулы EGF на молекулу P64K. Настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата hrEGF-P64K, включающий ковалентное сопряженное связывание белка hrEGF с белком-носителем P64K и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор, пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100 кДа согласно следующим стадиям:i) реакции сопряженного связывания, которая включает смешивание белка hrEGF и белка P64K в реакторе сопряженного связывания, добавления к полученной смеси раствора PBS/MgCl2 с рН 6,8-7,2 и раствора сопряженного связывания 0,5% глутарового альдегида, затем полученную смесь инкубируют при 20-24 С при постоянном перемешивании в течение 2 ч;ii) диафильтрации, которая содержит проведение от 10 до 15 замен, раствора, пропитывающего тампон, с получением гомогенной смеси, которая содержит по меньшей мере 90% конъюгированногоhrEGF-P64K, 10% других молекулярных видов, таких как полимеры hrEGF, свободный hrEGF, и не содержит глутарового альдегида, и iii) ультрафильтрации, которая заключается в уменьшении начального объема конъюгата hrEGF-P64K до конечной его концентрации в диапазоне от 1 до 12 мг/мл. Другим вариантом настоящего изобретения является вакцинная композиция, включающая конъюгат hrEGF-P64K, вышеупомянутым способом, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид. Вариантом этой вакцинной композиции является композиция, в которой адъювант представляет собой монтанид. Другим вариантом вакцинной композиции является композиция, в которой адъювант представляет собой гидроксид алюминия. Методология получения вакцинной композиции Процедура очистки для уменьшения содержания аутологичного EGF Начиная с экспериментальных наблюдений, которые показали, что уменьшение содержания hrEGF в вакцинной композиции усиливает ее иммунологическое действие, был разработан способ уменьшения содержания hrEGF в гетерогенной смеси конъюгатов; обогащения вакцинной композиции видами конъюгатов с высокой молекулярной массой (иммунологически активных видов), и получения композиции,не содержащей глутаровый альдегид. Процедура очистки с использованием ультрафильтрационных мембран в диапазоне от 50 до 100 кДа, разработанная и описанная в настоящем изобретении, состоит их двух стадий. На начальной стадии производятся последовательные замены пропитывающего тампон раствора (диафильтрация) для удаления глутарового альдегида и для устранения избытка аутологичного белка, не содержащего или образующего сопряженно связанные hrEGF-hrEGF различных размеров. В течение этой стадии проводится от 10 до 15 замен пропитывающего тампон раствора. Вторая стадия представляет собой концентрацию очищенного химического конъюгата, на которой более чем 90% его композиции соответствует иммуногенному виду hrEGF-rP64K. В течение стадии кон-2 021905 центрации, начальный объем химического конъюгата уменьшается до достижения конечной концентрации белка (конъюгированного вида hrEGF-rP64K) в диапазоне от 1 до 12 мг/мл. Эта многосторонность диапазона концентраций активного начала (общее количество сопряженного связанного hrEGF-rP64K в миллиграммах на миллилитр) для настоящей вакцинной композиции представляет собой большое преимущество для лечения рака. Это обеспечивает возможность увеличения лечебной дозы без необходимости увеличения частоты иммунизации и/или увеличения числа участков иммунизации у пациента. С целью мониторинга качества очистки химического конъюгата, производилась оценка рН и проводимости задержанного и проникшего через мембрану соединения. Проводилось также определение концентрации белка способом, описанным Lowry D.H. et al. J. Biol Chem 191: 495-498, 1951, и определяли однородность в процентах по анализу гель-фильтрационной хроматографии (HPLC-FG). Уникальность данной методологии гарантирует то, что полученная вакцинная композиция имеет однородный состав и определенную частоту и характеризуется присутствием большого количества иммуногенно активного вида: сопряженно связанного hrEGF-rP64K. К удивлению, удаление избытка аутологичного белка (hrEGF), не содержащего полимерного соединения, не вызывает снижения, а скорее позволяет значительно увеличить концентрацию антител противEGF (при разведении 1/1000), до 10 раз больше концентрации, получаемой при иммунизации мышей полимерами hrEGF и свободным hrEGF. Снижение содержания аутологичного белка в вакцинной композиции вызывает у пациента увеличение, по меньшей мере, вдвое максимального титра антител против EGF. Это увеличение титров антител наблюдается даже у тех пациентов, которые получают половину дозы на иммунизацию (2,4 мг), по сравнению с пациентами, которые получают дозу 4,8 мг на дозу вакцинной композиции, описанной в документе ЕР 0657 175. Эти результаты указывают на то, что вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, имеет более высокую иммунологическую активность на 1 мг иммунологически активного белка, по сравнению с другими вакцинными композициями. Получение химического конъюгата между рекомбинантным белком P64K (rP64K) и человеческим рекомбинантным эпидермальным фактором роста (hrEGF) Начиная с оценки и оптимизации условий химической реакции сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K, разработан способ сопряженного связывания, который требует высокой молярной пропорции аутологичного белка, 10 моль hrEGF на каждый моль rP64K, для гарантированного обеспечения высокой эффективности сопряженного связывания между ними. Необходимый избыток аутологичного белка во время химического сопряженного связывания для гарантированного обеспечения его эффективности, в последующем устраняется посредством способа очистки мембранной ультрафильтрацией, как описано ранее, что обеспечивает возможность получения вакцинной композиции с высокой однородностью. Процедура, описанная в настоящем изобретении, используемая для гарантированного обеспечения соответствующего химического сопряженного связывания обоих белков, состоит из одной стадии и начинается со смешивания ранее концентрированного (6 мг/мл) белка hrEGF и белка rP64K(1 мг/мл) в реакторе сопряженного связывания. К этой белковой смеси добавляется раствор PBS (солевого раствора с фосфатным буфером)/MgCl2 (рН 6,8-7,2), и 0,5% конъюгационный раствор глутарового альдегида. Смесь поддерживается при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре 22 С 2 С. Конечная концентрация белка hrEGF в реакционной смеси составляет 0,82 мг/мл, а белкаrP64K составляет 0,89 мг/мл. Общая концентрация белка во время реакции сопряженного связывания составляет 2 мг/мл, а конечная концентрация глутарового альдегида в реакционной смеси составляет 0,05%. Вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением может использоваться вместе с соответствующими адъювантами, таким как гидроксид алюминия или монтанид. В другом аспекте, настоящее изобретение включает гигиеническую процедуру для получения вакцинной композиции, подлежащую введению парентеральным путем, процедуру, которая минимизирует возможности микробного заражения вакцинной композиции во время сопряженного связывания, среди других преимуществ, позволяющую проводить методологию очистки химического сопряженно связанного соединения в течение нескольких часов, и содействующую увеличению получаемого объема вакцинной композиции. Следующие примеры более детально иллюстрируют настоящее изобретение. В примере 1 описана молекулярная характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении. Молекулярная характеристика включает хроматографическую идентификацию HPLC-FG сопряженно связанного вида, образованного во время реакции сопряженного связывания, определение соотношения сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K и определение пептидной карты,которая характеризует данную новую вакцинную композицию. В примере 2 описаны биологические анализы у мышей, проводимые для очистки иммуногенности новой вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении. В примере 3 описана эффективность клинического применения настоящей вакцинной композиции при лечении легочных опухолей эпителиального происхождения. В примере 4 описано получение вакцинных композиций с подобранной различной активностью(общее количество миллиграмм сопряженно связанных hrEGF-rP64K/флакон) с использованием такой же методологии сопряженного связывания и очистки, как описано в настоящем изобретении. В примере 5 показано удаление глутарового альдегида, используемого при реакции сопряженного связывания посредством методологии очистки химического сопряженно связанного соединения пропусканием через ультрафильтрационную мембрану 50 кДа. Примеры Пример 1. Молекулярная характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении (вакцинная композиция А) 1.1 Хроматографическая характеристика вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении Для хроматографической характеристики вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией,в качестве индикаторов использовали гомолигомерные сопряженно связанные hrEGF-hrEGF и rP64KrP64K. Хроматографические профили, проявляемые гомолигомерными сопряженно связанными hrEGFhrEGF и rP64K-rP64K, сравнивали с хроматографическим профилем, проявляемым сопряженно связанными белками без очистки, полученными химической реакцией сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K. На фиг. 1 показаны профили гомолигомерных конъюгатов hrEGF-hrEGF, и профиль,полученный при проведении химического сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K (химически сопряженно связанных без очистки ультрафильтрацией). Площадь, очерченная кругом, относится к сопряженно связанному виду hrEGF-rP64K. Профиль сопряженно связанных hrEGF-rP64K не проявляет полного совпадения с профилем химически сопряженно связанных hrEGF-rP64K ввиду вклада молекул hrEGF, сопряженно связанных с rP64K. На фиг. 2 показаны результаты, полученные после проведения не натурализованного электрофореза в восстановленных условиях и вестерн-блоттинг вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией. Разработку проводили с использованием антитела против EGF, сопряженно связанного со щелочной фосфатазой. EGF представляет собой белок с видимой молекулярной массой 6 кДа и поэтому он должен располагаться в нижней области геля. Его идентификация посредством иммунного выявления антителами против EGF в области, соответствующей белкам с молекулярной массой, видимо превышающей 6 кДа, подтверждает, что молекулы hrEGF существуют вместе с rP64K в области геля, соответствующей сопряженно связанному виду hrEGF-rP64K. При сравнении хроматографического профиля химически сопряженно связанных hrEGF-rP64K без очистки с хроматографическим профилем гомолигомерных сопряженно связанных hrEGF-hrEGF, можно понять, что существует соответствие между обоими профилями. Эти данные подтверждают, что после углубления существует зона, которая соответствует виду hrEGF, с сопряженной связью между ними (полимеры EGF), а также свободному hrEGF (фиг. 3). Хроматографический профиль с исключением молекул по размеру (фиг. 4) вакцинной композиции,являющейся предметом настоящего изобретения, показывает, что область, соответствующая сопряженно связанному виду hrEGF-rP64K, составляет более чем 90% общей площади хроматограммы (заштрихованная область), свидетельствуя о высокой однородности описанной вакцинной композиции. 1.2. Соотношение сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K в вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении С целью определения соотношения сопряженного связывания hrEGF и rP64K в вакцинной композиции, определяли в молях содержание каждого из составляющих конъюгат белков. Для этого брали вакцинную композицию, полученную в результате процесса ультрафильтрации с ограничением по размеру в 50 кДа, и собирали хроматографическую фракцию, соответствующую сопряженно связанному виду hrEGF-rP64K. Эти фракции подвергали аминокислотному анализу. Определение соотношения сопряженного связывания проводили двумя способами. 1. Способ был основан на оценке количества фенилаланина (Phe) и треонина (Thr) в вакцинной композиции (аминокислоты, присутствующей только в молекуле rP64K). Количества этих аминокислот использовали для определения количества rP64K. Начиная с последнего и имея ввиду общее количество аминокислот в смеси, определяли количество EGF. 2. Другой способ был основан на прямом определении реактивных количеств каждого белка с использованием аминокислотной последовательности и основан на количественном определении аминокислот Аспарагина+Аспарагиновой кислоты (Asx), Глутамина+Глутаминовой кислоты (Glx), Глицина(Gly) и Аланина (Ala) (остатков, высоко устойчивых к кислотному гидролизу и обычно используемых при количественном определении белков). В табл. 1 и 2 показаны результаты, полученные каждым способом. Таблица 1. Определение соотношения сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K с проведением определения аминокислотного состава вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией, на основе способа определения количества фенилаланина (Phe) и треонина (Thr) Таблица 2. Определение соотношения сопряженного связывания между белками hrEGF и rP64K с проведением определения аминокислотного состава вакцинной композиции, очищенной ультрафильтрацией,на основе способа определения относительных количеств аминокислот Аспарагина+Аспарагиновой кислоты (Asx), Глутамина+Глутаминовой кислоты (Glx), Глицина (Gly) и Аланина (Ala) Результаты, полученные обоими способами, показывают соответствие в оценке сопряженного связывания между белками hrEGF:rP64K для вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении. Рассчитанное соотношение сопряженного связывания составляло (1:2), что означает 2 молекулы hrEGF на каждую молекулу rP64K. 1.3 Пептидные карты, характеризующие вакцинную композицию, описанную в настоящем изобретении С целью характеристики структуры вакцинной композиции, представленной в настоящем изобретении, и для доказательства воспроизводимости процедуры, была разработана и охарактеризована пептидная карта, полученная после переваривания сопряженно связанных фракций hrEGF-rP64K эндопротеазой Glu-C. Каждую из фракций полученной карты идентифицировали и секвенировали массспектрометрией. На фиг. 5 показаны пептидные карты, полученные, начиная с двух независимо полученных вакцинных композиций, где установлено большое сходство пептидов, представленных в их относительной пропорции. Воспроизводимость этих пептидных карт, полученных, начиная с обеих вакцинных композиций,является показателем контроля, существующего над условиями, в которых происходят процедуры химического сопряженного связывания и очистки (описанных в настоящем изобретении). Идентификацию пептидов, содержавшихся в каждой фракции карты, осуществляли анализом каждого из них методом MALDI (лазерной десорбционной ионизации с матричной подложки) и методомESI-MS (электроаэрозольной ионизации/электрораспылением ионизацией). В табл. 3 показана последовательность основных пептидов. Таблица 3. Аминокислотный состав основных пептидов, полученных после переваривания сопряженносвязанной фракции EGF-rP64K эндопротеазой Glu-C. Аминокислотный состав определяли MALDI и Пример 2. Иммуногенность вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении В данном примере описан количественный анализ биологической активности, проведенный для оценки иммуногенности вакцинной композиции, описанной ранее (вакцинной композиции А), по сравнению с вакцинной композицией, описанной в документе ЕР 0657 175 (названной вакцинной композицией В). Для анализа проводили вакцинацию 10 мышей необычной дозой 200 мкл воды в масляной эмульсии (50/50% об/об) иммуногенов (обычной вакцинной композиции, полученной диализом, вакцинной композиции, полученной очисткой ультрафильтрационной мембраной, и проникшей через мембрану,полученной в результате процесса очистки UF/DF, где присутствуют сопряженно связанные видыhrEGF-rP64K) с адъювантом MONTANIDE ISA 51. Доза белка, применявшаяся для каждого иммуногена,приведена в табл. 4. Через 14 дней после вакцинации проводилось взятие сыворотки у животных и оценка титров антител против EGF посредством ELISA (иммуносорбентного анализа). Положительным критерием для анализа было то, что измеренная оптическая плотность при 405 нм должна была быть выше, чем двойная средняя величина, полученная для контроля. Контроль получали добавлением в лунку блокирующего буфера вместо сыворотки. Для анализа данных применяли критерий Mann-Whitney с использованием статистической программы. Таблица 4. Оценка иммуногенов и концентрации белков, подлежащих вакцинации животным в соответствии с данными анализа биологической активности На фиг. 6 показаны результаты анализа биологической активности как свидетельство иммуногенной активности каждого оцененного иммуногена. Компоненты иммуногена, соответствующие конъюгатам гомополимерного hrEGF, и свободному hrEGF, не проявляют релевантной биологической активности, потому что их реакция находится на уровне положительных критериев для анализа или ниже. Эти результаты верифицируют гипотезу, что сам EGF не вызывает иммуногенной реакции. Статистический анализ всех результатов с использованием критерия Mann-Whitney (табл. 5) показал высоко значимые различия титров антител против hrEGF 1/1000, при р=0,0004, а для титра 1/100 при р=0,0006 для группы животных, вакцинированных вакцинной композицией А, по сравнению с титрами,достигнутыми для группы животных, вакцинированных вакцинной композицией В. Это указывает на то,что вакцинная композиция А, очищенная посредством мембраны ультрафильтрации, имеет большую иммуногенную активность на 1 мг, чем вакцинная композиция В, полученная способом очистки, основанным на мембране для диализа. Вакцинная композиция А вызывает возрастание концентрации антител против EGF (при разведении 1/1000) в 10 раз, по сравнению с концентрацией, достигаемой при иммунизации конъюгатами, соответствующими полимерному hrEGF и свободному hrEGF. При сравнении с вакцинной композицией, ранее описанной в документе ЕР 0657175, вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, вызывает возрастание концентрации антител противEGF вдвое. Таблица 5. Представление статистических данных: критерий Mann-Whitney, используемый для оценки иммуногенности обеих вакцинных композиций посредством титров антител против hrEGF у мышей Пример 3. Оценка клинической эффективности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, при лечении легочных опухолей эпителиального происхождения Целью этого примера является оценка у пациентов иммуногенности, вызванной вакцинной композицией А, по сравнению с иммуногенностью, вызванной вакцинной композицией В, полученной спосо-8 021905 бом очистки путем диализа. В данном исследовании лечили пациентов с запущенными стадиями не мелкоклеточного рака легких (NSCLC). Были выделены 2 группы пациентов (пациенты, вакцинированные препаратом В, и пациенты, вакцинированные препаратом А, описанным в настоящем изобретении). Доза вакцинной композиции на пациента в каждой группе была следующей: пациенты, вакцинированные препаратом В, получали общую дозу белка 1,2 мг на участок иммунизации, тогда как пациенты, вакцинированные препаратом В, получали общую дозу белка 0,6 мг на участок иммунизации. У обеих групп было 4 участка иммунизации. Все пациенты получали специфическое противораковое лечение, по меньшей мере, за 4 недели до начала испытания. Иммунизации выполняли внутримышечным путем и продолжали введением 1 раз в месяц. Гуморальную иммунную реакцию обеих групп пациентов оценивали исследованием их сыворотки. Основной переменной величиной для оценки результатов был титр специфического антитела противEGF. Этот параметр определяли посредством ELISA. Положительными величинами были те, которые давали показатели оптической плотности, в 2 раза превышающие отрицательный контроль. Представленный в результатах титр антител представляет собой максимальное разбавление положительной сыворотки. Анализ иммунного ответа у пациентов в каждой группе, представленный в табл. 6, показал, что геометрическая средняя максимального титра антител в группе пациентов, получавших лечение препаратом А, соответствует 1:56421, тогда как в группе пациентов, иммунизированных препаратом В, она составила 1:23515. Это означает, что вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении, вызывала увеличение вдвое геометрической средней максимальных титров антител, по сравнению с титрами,достигнутыми при использовании препарата В. Накопленные данные свидетельствуют о том, что у иммунизированных пациентов титр антител против аутологичного EGF составляет 1:500. Поэтому вакцинная композиция, описанная в настоящем изобретении (вакцинная композиция А), вызывает у неиммунизированных пациентов возрастание титра антител против EGF по меньшей мере в 100 раз. Таблица 6. Результат анализа геометрической средней иммуногенности для обеих вакцинных композиций посредством измерения титров антител против EGF в сыворотке пациентов Важно подчеркнуть, что у группы пациентов, иммунизированных вакцинной композицией А, описанной в настоящем изобретении, проявилась более высокая геометрическая средняя титров антител против EGF при введении половины общего количества белков на иммунизацию (2,4 мг), чем у группы пациентов, иммунизированных вакцинной композицией В (4,8 мг общего количества белков), что представляет собой удивительный результат. Эти результаты свидетельствуют о том, что избыток аутологичного белка hrEGF или в форме полимеров, или в свободной форме, не вносит вклад в увеличение иммуногенности вакцинной композиции, но он снижает иммунологическое действие химически сопряженно связанного hrEGF-rP64K. Пример 5. Удаление глутарового альдегида из вакцинной композиции по настоящему изобретению Для оценки удаления агента сопряженного связывания (глутарового альдегида) была произведена количественная оценка остаточного содержания глутарового альдегида в вакцинной композиции В и в вакцинной композиции А посредством способа хроматографического разделения в обращенной фазе(HPC-RP) с использованием колонки С-8. Для осуществления способа требуется, во-первых, осаждение белка, содержащегося в образцах,хлорной кислотой, а затем взаимодействие с фенилгидрацином. На фиг. 7 показано, что остаточное содержание этой примеси в обеих вакцинных композициях составляло менее чем 0,2 мкг/мл или менее чем 0,002 м.д. (самый высокий предел концентрации, установленный для этой примеси) от начальной концентрации 530 мг/мл или 530 м.д. Даже когда оба препарата соответствуют установленной спецификации для этой примеси, фиг. 7 иллюстрирует, что вакцинная композиция А (полученная при применении способа ультрафильтрации для очистки химического сопряженно связанного соединения) имеет меньшее содержание глутарового альдегида, что способствует большей безопасности для пациента, у которого применяется эта вакцинная композиция. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано перекрытие хроматограммы гомолигомерного сопряженно связанного rP64KrP64K хроматограммой неочищенного химического сопряженно связанного EGF-P64K. Овалом показано совпадение профилей между обеими хроматограммами. Ось X представляет время до элюирования каждого компонента образца, а ось Y представляет величину интенсивности при 216 нм для каждого компо-9 021905 нента образца как показателя концентрации белка. На фиг. 2 показано иммунное выявление антителом против EGF, сопряженно связанным со щелочной фосфатазой после электрофоретического разделения SDS-PAGE (электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) для вакцинной композиции, полученной ультрафильтрацией (полоса 1: Маркер молекулярной массы), полоса 2 - вакцинная композиция. На фиг. 3 показано перекрытие хроматограммы, соответствующей гомолигомерному сопряженно связанному hrEGF-hrEGF и хроматограммы, соответствующей химическому сопряженно связанномуhrEGF-rP64K без очистки. Овалом показано совпадение видов между обеими хроматограммами. Ось X представляет время элюирования каждого компонента, а ось Y представляет величину интенсивности при 216 нм каждого компонента образца как показателя концентрации белка. На фиг. 4 показан хроматографический профиль, соответствующий вакцине, раскрытой настоящим изобретением. Заштрихованная область соответствует сопряженно связанному виду hrEGF-rP64K. Ось X представляет время для элюирования каждой фракции, а ось Y представляет величину интенсивности при 216 нм каждого компонента в образце как показателя концентрации белка. На фиг. 5 показана пептидная карта хроматографической фракции, соответствующей сопряженно связанному hrEGF-rP64K. Представлены результаты по двум вакцинным композициям, независимо очищенным мембраной ультрафильтрацией. Ось X представляет время, а ось Y представляет единицы интенсивности в милях. На фиг. 6 показаны титры антитела против hrEGF у мышей, иммунизированных различными иммуногенами: обычной вакцинной композицией, вакцинной композицией, очищенной ультрафильтрацией, и композицией, прошедшей через мембрану, при способе очистки ультрафильтрацией. Ось X соответствует разведениям сыворотки от каждого животного, а ось Y представляет величину оптической плотности при 405 нм каждого образца как показателя концентрации белка. На фиг. 7 показан хроматографический профиль SDS-PAGE, полученный во время количественного определения содержания остаточного глутарового альдегида в вакцинной композиции, полученной способом очистки с использованием ультрафильтрационных мембран 50 кДа (вакцинная композиция А) и для вакцинной композиции с использованием способа очистки диализом (вакцинная композиция В). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения конъюгата hrEGF-P64K, включающий ковалентное сопряженное связывание белка hrEGF с белком-носителем P64K и очистку молекулярного комплекса методом ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны, имеющей размер пор, пропускающих белки с молекулярной массой от 50 до 100 кДа согласно следующим стадиям:i) реакция сопряженного связывания, которая включает смешивание белка hrEGF и белка P64K в реакторе сопряженного связывания, добавление к полученной смеси раствора PBS/MgCl2 с рН 6,8-7,2 и раствора сопряженного связывания 0,5% глутарового альдегида, затем полученную смесь инкубируют при 20-24 С при постоянном перемешивании в течение 2 ч;ii) диафильтрация, которая содержит проведение от 10 до 15 замен, раствора, пропитывающего тампон, с получением гомогенной смеси, которая содержит по меньшей мере 90% конъюгированногоhrEGF-P64K, 10% других молекулярных видов, таких как полимеры hrEGF, свободный hrEGF, и не содержит глутарового альдегида; иiii) ультрафильтрация, которая заключается в уменьшении начального объема конъюгата hrEGFP64K до конечной его концентрации в диапазоне от 1 до 12 мг/мл. 2. Вакцинная композиция, включающая конъюгат hrEGF-P64K, полученный способом по п.1, и адъювант, выбранный из группы, включающей гидроксид алюминия или монтанид. 3. Вакцинная композиция по п.2, где адъювант представляет собой монтанид. 4. Вакцинная композиция по п.2, где адъювант представляет собой гидроксид алюминия.