Соединения-ингибиторы raf

В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль, ингибирующая Raf, которая, таким образом, может подходить для лечения рака.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ; ДЕСИФЕРА ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ,ЭЛЭЛСИ (US) Сигнальный каскад киназы Ras/Raf/митоген-активированной протеинкиназы (также известной как МАР 2 К; МАРК киназы и MAPK/ERK киназы или MEK)/внеклеточной сигнал-регулируемой киназы(ERK) (называемый в настоящем описании "Ras/Raf/MEK/ERK" или "Ras/Raf/MEK/MAPK") сохранился в процессе эволюции и играет основополагающую роль в развитии и гомеостазе тканей млекопитающих. Этот сигнальный путь включает киназный каскад, который передает внеклеточные сигналы к ядру для регуляции экспрессии генов и ключевых клеточных функций. Экспрессия генов, контролируемая сигнальным путем Ras/Raf/MEK/ERK, регулирует фундаментальные клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и ангиогенез. При различных раковых заболеваниях происходит ошибочная активация разнообразных участков сигнального пути Ras/Raf/MEK/ERK. Мутации генов в рамках этого пути могут приводить к образованию конститутивно активных белков, что, в свою очередь,вызывает повышение пролиферации клеток и резистентность к апоптозу.Raf (серин/треонин протеинкиназа) кодируется семейством генов, состоящим из трех генов, являющихся тремя изоформами Raf (B-Raf, C-Raf (Raf-1) и A-Raf). Каждый из этих белков имеет схожие высококонсервативные аминотерминальные регуляторные участки и каталитические домены при концевых карбоксигруппах. Если не указано иное, Raf относится ко всем трем членам семейства. Несмотря на то, что каждая изоформа участвует в пути Ras/Raf/MEK/ERK, было показано, что B-Raf является основным активатором MEK. Ras:FTO осуществляет рекрутинг Raf в направлении внутренней части клеточной мембраны, где происходит активация B-Raf. В свою очередь B-Raf отвечает за активацию MEK1/2, аMEK1/2 активирует ERK1/ERK2. Мутации гена B-Raf приводят к появлению сигнала B-Raf, не зависящему от предшествующих сигналов. В результате мутировавший белок B-Raf (такой как V600E) инициирует избыточный нисходящий сигнал MEK и ERK. Это приводит к избыточной пролиферации клеток, их выживанию и онкогенезу. Чрезмерная активация сигнального каскада мутировавшей B-Raf задействована при многих злокачественных образованиях. Рецепторная тирозинкиназа (РТК) c-Kit (также называемая CD117) экспрессируется широким диапазоном типов клеток. Лигандом с-KIT является фактор стволовых клеток (ФСК). Связывание ФСК с внеклеточным доменом с-KIT вызывает димеризацию рецептора и активацию нисходящих сигнальных путей, включая путь RAS/RAF/MEK/ERK. Мутантная с-KIT задействована в патогенезе некоторых раковых заболеваний. Несмотря на существование специфических ингибиторов B-Raf (таких как вемурафениб) и соединений, таких, как предложены в международных заявках на патент WO 2006/039718 и WO 2008/034008,сохраняется необходимость в ингибиторе Raf, обладающем активностью для ингибирования всех изоформ белков Raf, включая A-Raf, B-Raf, C-Raf и B-Raf с мутацией V600E. Кроме того, сохраняется необходимость в ингибиторе Raf, обладающем активностью в отношении опухолевых клеток, в которых происходит предшествующая активация пути, вызванная мутациями N-Ras, мутациями К-Ras и мутациямиcKit. Кроме того, сохраняется необходимость в обеспечении альтернативных ингибиторов Raf для лечения рака. Также сохраняется необходимость в обеспечении альтернативных ингибиторов Raf, обладающих активностью для ингибирования A-Raf, B-Raf, C-Raf и B-Raf с мутацией V600E для лечения рака. Соответственно, в настоящем изобретении предложен ингибитор Raf, который может обладать ингибирующей активностью в отношении всех изоформ белков Raf. Также в настоящем изобретении предложен ингибитор Raf, который может обладать активностью в отношении опухолевых клеток, в которых происходит предшествующая активация пути, вызванная мутациями N-Ras, мутациями K-Ras и мутациямиcKit. Кроме того, в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор Raf. Также в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор Raf, который может подходить для лечения рака. В настоящем изобретении также предложен альтернативный ингибитор Raf, обладающий ингибирующей активностью в отношении A-Raf, B-Raf, C-Raf и B-Raf с мутацией V600E. Кроме того, в настоящем изобретении предложен альтернативный ингибитор Raf, обладающий ингибирующей активностью в отношении A-Raf, B-Raf, C-Raf и B-Raf с мутацией V600E, который может подходить для лечения рака. На чертеже приведена типовая рентгеновская порошковая дифрактограмма соединения согласно примеру 1. В настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль. В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено соединение,представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3 диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил)фенил)мочевину совместно с фармацевтически приемлемым носителем. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 1-(3,3 диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция,содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину и фармацевтически приемлемый носитель,разбавитель или вспомогательное вещество. В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция,содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль и сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА). В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая комбинация, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил 2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину и сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА). Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации фармацевтических композиций, описываемых в настоящей заявке, в которых ПВП-ВА выбран из группы, состоящей из коповидонов Kollidon VA 64 и Plasdone S-630. Предпочтительно ПВП-ВА представляет собой Kollidon VA 64. Предпочтительный состав согласно настоящему изобретению содержит 1-(3,3-диметилбутил)-3-2 фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенилмочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с Kollidon VA 64 (BASF Corporation, кат. 95405-2-43), сополимером 1-винил-2-пирролидона и винилацетата в отношении 60:40 и 1-2% (мас./мас.) лаурилсульфата натрия. Получают твердую дисперсию, которая может содержать 20% или 40% лекарственного средства и 0-2% лаурилсульфата натрия или соответствующее количество другого подходящего фармацевтически приемлемого увлажнителя, пластификатора, технологической добавки или иного подходящего вспомогательного вещества(веществ). В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4 метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина или ее фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена композиция для применения для лечения рака, содержащая 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил 2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина для применения в терапии. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 1-(3,3 диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил)фенил)мочевину. В настоящем изобретении предложено применение 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7 метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении также предложено применение 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины для получения лекарственного средства для лечения рака. В настоящем изобретении предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина в кристаллической форме. В настоящем изобретении также предложена 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина в кристаллической форме, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические пики, 20,2, при 16,0 и один или более пиков при 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2. Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации способов и применений, описанных в настоящей заявке, в которых рак выбран из группы, состоящей из острой миелоидной лейкемии (ОМЛ), хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ), хронической лимфобластной лейкемии (ХЛЛ), миелодиспластического синдрома, рака яичников, меланомы, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака печени или рака щитовидной железы. Более предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака яичников, меланомы, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и колоректального рака. Еще более предпочтительно рак представляет собой меланому или колоректальный рак. Способ лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому,ОМЛ или колоректальный рак, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли. Соединение,представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. Соединение,представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому, ОМЛ или колоректальный рак. Применение 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины или ее фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, представляющего собой рак щитовидной железы, рак яичников, меланому, ОМЛ или колоректальный рак. В конкретном варианте реализации фармацевтическая композиция содержит 1-(3,3-диметилбутил)3-2-фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенилмочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами. В конкретном варианте реализации фармацевтическая композиция содержит 1-(3,3-диметилбутил)3-2-фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенилмочевину или ее фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами, в частности подходящими для лечения рака в целом или конкретного типа рака. В настоящем изобретении предложено соединение формулы: или его фармацевтически приемлемая соль. Термин "пациент" обозначает млекопитающее, а "млекопитающее" включает, но не ограничивается им, человека."Терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" обозначает дозировку соединения или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей предложенное соединение или его фармацевтически приемлемую соль, необходимое для ингибирования сигналов B-Raf, C-Raf, A-Raf и/или B-Raf V600E у ракового пациента и для уничтожения целевых раковых клеток или замедления или остановки прогрессирования рака у пациента. Предполагаемые дозировки предложенного соединения или его фармацевтически приемлемой соли находятся в диапазоне от 300 до 1500 мг/пациент/сутки. Ожидается, что предпочтительные дозировки находятся в диапазоне от 400 до 1400 мг/пациент/сутки. Ожидается, что наиболее предпочтительные дозировки находятся в диапазоне от 600 до 1200 мг/пациент/сутки. Точную дозировку, требуемую для лечения пациента, и продолжительность курса лечения определяет лечащий врач с учетом стадии и степени тяжести заболевания, а также конкретных требований и ответа каждого пациента и конкретного вводимого соединения. Несмотря на то, что приведенные выше данные выражены в пересчете на суточную дозу, для обеспечения оптимального терапевтического благоприятного действия у пациента схему дозирования можно регулировать. Помимо введения один раз в сутки подходящими схемами являются введение два раза в сутки (BID) или три раза в сутки (TID). Введение BID является предпочтительным согласно настоящему изобретению. Термины "лечение", "лечить" и "излечивать" включают полный спектр мер противодействия раковому заболеванию, от которого страдает пациент, таких как введение активного соединения для ослабления, замедления или обращения вспять одного или более симптомов рака и для отсрочки прогрессирования рака, даже если раковое заболевание фактически не устраняется. Предложенное соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно получают в составе фармацевтической композиции с использованием фармацевтически приемлемого носителя или одного или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ и вводят при помощи ряда способов. Предпочтительно указанные композиции предназначены для перорального введения. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005). Предложенное соединение согласно настоящему изобретению способно взаимодействовать с рядом неорганических и органических кислот с получением фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Указанные фармацевтически приемлемые соли и общая методология их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICALSALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977. Следует понимать,что 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину или ее фармацевтически приемлемую соль можно получать при помощи ряда способов, известных в данной области техники, а также тех, что описаны ниже. Соединение согласно примеру 1 имеет следующее название: 1-(3,3-диметилбутил)-3-2-фтор-4 метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенилмочевина; также его можно называть: N-(3,3-диметилбутил)-N'-[2-фтор-4-метил-5-[7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил]фенил]мочевина; можно использовать и другие названия, позволяющие однозначно определить соединение согласно примеру 1. Соединения, применяемые в качестве исходных веществ для синтеза 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2 фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевины, хорошо известны, и даже если они не являются коммерчески доступными, то их можно легко синтезировать при помощи приведенных конкретных способов, при помощи стандартных способов, применяемых специалистами в данной области техники, или содержащихся в общих справочниках. Примеры известных процедур и способов включают те, что описаны в общих справочниках, таких как Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic"d6-ДМСО" относится к гексадейтерированному диметилсульфоксиду; "ДХМ" относится к дихлорметану; "ДМСО" относится к диметилсульфоксиду; "EtOAc" относится к этилацетату; "EtOH" относится к этанолу; "ВЭЖХ" относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; "IPAC" относится к изопропилацетату; "KF" относится к содержанию воды, определенному по методу Карла Фишера; "МС" относится к масс-спектроскопии; "МеОН" относится к метанолу; "МТБЭ" относится к метил-третбутиловому эфиру; "ЯМР" относится к ядерному магнитному резонансу; "КТ" относится к комнатной температуре; "ТГФ" относится к тетрагидрофурану. Если не указано обратное, соединениям, проиллюстрированным в настоящей заявке, присваивали названия и нумерацию с использованием ACDLABS или Symyx Draw 3.2. Пример получения 1. 5-бром-2-фтор-4-метиланилин Способ А. Объединяли 1-бром-4-фтор-2-метилбензол (30,0 г, 159 ммоль) и концентрированную серную кислоту (100 мл), охлаждали примерно до -5 С и обрабатывали по каплям азотной кислотой (11,00 мл,174 ммоль) в течение 20 мин. Оставляли реакционную смесь нагреваться до КТ и перемешивали в течение 30 мин. Выливали в колотый лед при перемешивании и разделяли с использованием метил-третбутилового эфира (МТБЭ) (200 мл). Отделяли водный слой и экстрагировали МТБЭ (250 мл). Объединяли органические слои, сушили и концентрировали при пониженном давлении с получением 1-бром-4 фтор-2-метил-5-нитробензола в виде оранжевой вязкой маслянистой жидкости (39,0 г). Объединяли неочищенный 1-бром-4-фтор-2-метил-5-нитробензол (32,4 г, 138 ммоль), этанол(275 кПа) и перемешивали до прекращения абсорбции водорода. Спускали давление в реакционном сосуде, удаляли катализатор путем фильтрования и выпаривали фильтрат досуха. Добавляли МТБЭ, затем снова фильтровали и выпаривали фильтрат. Перемешивали остаток в гексанах. Собирали твердые вещества путем фильтрования, промывали холодными гексанами и сушили в вакууме с получением титульного соединения (17,8 г, выход 63%) в виде темного твердого вещества. МС (m/z): 204,0 (М+1)/206,0 (М+3). Способ В. В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром, ледяной баней и подводом N2, добавляли 1-бром-4-фтор-2-метилбензол (1,4 кг, 7,4 моль), затем добавляли кон-4 024824 центрированную H2SO4 (6,3 кг) при 0-10 С. После перемешивания в течение 10-20 мин смесь охлаждали до -100 С и по частям добавляли KNO3 (0,82 кг, 7,8 моль, 1,05 экв.) в течение примерно 6 ч, поддерживая температуру -100 С. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до 10-20 С, прохождение реакции отслеживали путем ТСХ (ЭА:ПЭ = 1:20) и ВЭЖХ до того момента, когда содержание 1-бром-4-фтор-2-метилбензола становилось 0,5%. Смесь выливали в смесь лед/вода (11,2 кг, лед:вода = 1:1) и дважды экстрагировали МТБЭ (4,7 л и 1,9 л). Органические слои объединяли, промывали насыщенным солевым раствором (5,6 кг) и концентрировали до 1,52V при температуре ниже 45 С и пониженном давлении. Остаток разбавляли EtOAc (5,6 л), полученный раствор непосредственно использовали на следующей стадии (1,22 кг (с коррекцией по мас.%), выход 70,5%, чистота 68,3%, определенная по УФ поглощению при 210 нм). 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3):8,35 (s, J = 7,1 Гц, 1H), 7,29 (d, J = 11,3 Гц,1H), 2,59 (d, J = 6,8 Гц, 3 Н). В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли раствор 1-бром-4-фтор-2-метил-5-нитробензола (1,16 кг, 4,96 моль) в EtOAc (5 л) и 36% раствор НС 1 (4,9 кг, 49,6 моль, 10,0 экв.). После перемешивания в течение 510 мин при 2030 С по частям добавляли порошок Fe (1,34 кг, 24,0 моль, 4,8 экв.), поддерживая температуру 20-30 С. Прохождение реакции отслеживали путем ТСХ (ЭА:ПЭ = 1:10). После завершения реакции рН доводили до 23 при помощи NaHCO3 и добавляли Celite (0,56 кг). Смесь перемешивали в течение 0,51 ч и фильтровали. Твердое вещество промывали толуолом (22,6 л). Фильтраты объединяли и перемешивали в течение еще 0,51 ч, после чего разделяли слои. Водный слой экстрагировали толуолом (2,6 л). Органические слои объединяли, промывали солевым раствором (3 л) и фильтровали через подложку с силикагелем(23 см). Фильтрат концентрировали до 22,5 л, остаток перемешивали с н-гептаном (3,3 л). Снова концентрировали до 22,5 л, после чего добавляли н-гептан (1,65 л). Смесь охлаждали до -100 С и перемешивали в течение 1 ч. Осадок собирали путем фильтрования, промывали н-гептаном (0,5 л, предварительно охлажденным до -100 С) и сушили с получением неочищенного титульного соединения в виде коричневого твердого вещества. Перекристаллизация неочищенного продукта в н-гептане (3,3 л) приводила к получению титульного соединения в виде беловато-коричневого твердого вещества (527 г, выход 52%, 98% чистота, определенная по поглощению при 210 нм). 1 Н ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО):6,97 Способ А. Объединяли 5-бром-2-фтор-4-метиланилин (3,1 г, 15,2 ммоль), бис-(пинаколато)дибор (4,24 г,16,7 ммоль) и ацетат калия (4,47 г, 45,6 ммоль) в диоксане (40 мл) и барботировали аргоном. Добавляли комплекс [1,1'-бис-(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(П)-дихлорметан (0,620 г, 0,760 ммоль),снова барботировали аргоном и грели при 100 С в течение ночи. Фильтровали реакционную смесь и концентрировали в вакууме. Очищали путем хроматографии на силикагеле (0-50% EtOAc/гексаны) с получением титульного соединения (3,24 г, выход 85%). МС (m/z): 252,1 (М+1). Способ В. В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли 5-бром-2-фтор-4-метиланилин (200 г, 0,98 моль), CH3COOK (192 г, 1,95 моль, 2,0 экв.), бис-(пинаколато)дибор (248 г, 0,98 моль, 1,0 экв.) и IPAC (3 л). Дегазировали N2 в течение 30 мин,после чего смесь нагревали до 50 С и добавляли Pd(dppf)Cl2 (8 г, 4 мас.%). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение по меньшей мере 10 ч до достижения содержания исходного материала 2% (ГХ). Смесь охлаждали до 2030 С, фильтровали через подложку с Celite и промывалиIPAC (1 л). Фильтрат концентрировали до 400-500 мл. Остаток перемешивали с н-гептаном (700 мл),фильтровали через подложку SiO2 и элюировали смесью IPAC/н-гептан (сначала 1/5, 2 л, затем 2/5,3 л). Фильтрат концентрировали до 350-400 мл. Добавляли н-гептан (300 мл) и смесь снова концентрировали до 350400 мл. Остаток (в виде суспензии) охлаждали до -10-20 С и фильтровали после 2-5 часового перемешивания. Неочищенный продукт растворяли в МеОН (200 мл) при 3040 С, затем медленно по каплям добавляли Н 2 О (600 мл) в течение 0,5-1 ч. Суспензию охлаждали до 2030 С и фильтровали после 1-2-часового перемешивания. Твердое вещество сушили в глубоком вакууме с получением титульного соединения в виде беловатого твердого вещества (183 г, выход 74%, чистота 99%, определена по УФ поглощению при 210 нм); 1 Н ЯМР (400 МГц, CDCl3):7,42 (d, J = 10,2 Гц, 1H), 7,01 (d, J = 12,4 Гц, 1H), 3,76 (s, 2H), 2,64 (s, 3H), 1,55 (s, 12H); 13 С ЯМР (500 МГц, CDCl3): 5 20,66, 20,67, 24,40, 82,93,-5 024824 В EtOAc (60 мл) и насыщенный водный NaHCO3 (60 мл) добавляли 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5 тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (5,0 г, 19,91 ммоль) и изопропенилхлорформиат (2,40 мл,21,90 ммоль) и перемешивали при КТ в течение 6 ч. Разделяли слои, экстрагировали водный слой EtOAc(2), промывали объединенные органические слои солевым раствором, сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением титульного соединения. Использовали для следующего взаимодействия без дополнительной очистки (предполагая 100% выход). МС (m/z): 336,2 (М+1). Пример получения 4. Гидрохлорид 3,3-диметилбутан-1-амина В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли 3,3-диметилбутаналь (200 г, 2,0 моль). Затем по каплям добавляли 1-фенилметанамин(214 г, 2,0 моль, 1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 20-30 С в течение 25 ч до достижения конверсии более 99%, определенной путем ГХ. Добавляли NaCl (4 г) и отбрасывали водную фазу. Добавляли ТГФ (800 мл) и смесь концентрировали до 400 мл. Эту операцию повторяли до тех пор, пока значение KF остатка не становилось менее 0,2%. Добавляли ТГФ (800 мл) и t-BuOK (44,8 г, 0,4 моль,0,2 экв.). Смесь нагревали до 6065 С и перемешивали до тех пор, пока содержание N-бензил-3,3 диметилбутан-1-имина, определенное путем ГХ, не становилось менее 1%. После охлаждения до 10-20 С добавляли воду (1500 мл) и смесь экстрагировали МТБЭ (21500 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным NaCl (800 мл), отбирали пробу для анализа содержания воды и подтверждали 1%-2% содержание, определенное по методу KF. Фракцию N-(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанамина использовали непосредственно на следующей стадии (чистота 83% согласно ГХ; ГХ-МС m/z 188,2[М-Н]+). В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли раствор N-(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанимина, полученный выше (412 г,2,18 моль, 3,27 л МТБЭ, 1,3 л ТГФ), и по каплям добавляли раствор HCl/МТБЭ (16%, 398 г, 1,74 моль, 0,8 экв.) при 2030 С. Во время добавления осаждалось белое твердое вещество. После перемешивания в течение 12 ч фильтровали аликвоту образца суспензии. Надосадочную жидкость исследовали путем ГХ. Если содержание N-(3,3-диметилбутил)-1-фенилметанимина составляло более 30%, то дополнительно добавляли раствор HCl/МТБЭ (45 г, 0,10 экв.) до достижения содержания N-(3,3-диметилбутил)-1 фенилметанимина, определенного путем ГХ, 2030%. Твердое вещество собирали путем фильтрования,промывали МТБЭ (870 мл) и сушили в атмосфере N2 с получением целевого титульного соединения в виде белого кристаллического вещества (195 г, выход 65%); 1 Н ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО):7,90 (s, ЗН),2,74 (m, 2 Н), 1,47 (m, 2 Н), 0,89 (s, 9H); 13 С ЯМР (500 МГц, d6-ДМСО):28,98, 29,31, 35,49, 40,34. Пример получения 5. 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2 ил)фенил)мочевина(2,42 г, 23,9 ммоль) и 1-метилпирролидином (0,169 г, 1,99 ммоль) и грели при 75 С в течение ночи. Охлаждали смесь до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали диэтиловым эфиром с получением титульного соединения (6,62 г, выход 88% за две стадии). МС (m/z): 379,2 (М+1). Способ В. В 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, термометром и подводом N2, добавляли 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (40 г,0,159 моль), ТГФ (600 мл) и NaHCO3 (16,0 г, 0,19 моль, 1,20 экв.). Смесь охлаждали до 05 С и по кап-6 024824 лям добавляли фенилхлорформиат (26,14 г, 0,167 моль, 1,05 экв.). Реакционную смесь нагревали до 60 С и перемешивали до достижения содержания 2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан 2-ил)анилина 2%. Смесь фильтровали и твердое вещество (соль) промывали ТГФ (120 мл). Фильтрат концентрировали до 6580 мл. В остаток добавляли толуол (720 мл), 3,3-диметилбутан-1-амин (соль HCl,26,14 г, 0,19 моль, 1,2 экв.) и ТЭА (20,87 г, 0,21 моль, 1,3 экв.). Полученную смесь нагревали до 90 С и перемешивали до достижения содержания промежуточного вещества 2%. Смесь охлаждали до 1520 С,перемешивали в течение 2 ч и фильтровали. Твердое вещество промывали толуолом (120 мл), Н 2 О(2400 мл) и сушили в глубоком вакууме с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (54,9 г, выход 91,3%, чистота 99%, определенная по УФ поглощению при 210 нм); 1 Н ЯМР Способ А. В интенсивно перемешиваемую суспензию этил-4-хлор-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата(200 г, 860 ммоль) в этаноле (EtOH) (450 мл) добавляли концентрированный гидроксид аммония (335 мл,8,60 моль) и оставляли перемешиваться на ночь. Собирали твердые вещества путем фильтрования, промывали ЕЮН (2100 мл) и Н 2 О (3200 мл) и сушили в вакуумной печи (65-70 С) в течение ночи с получением титульного соединения (164,4 г, выход 90%) в виде белого твердого вещества. МС (m/z): 214,1 (М+1). Способ В. В реакционный сосуд помещали 1190 г ТГФ и 660 г этил-4-хлор-2-(метилсульфанил)пиримидин-5 карбоксилата (1,0 экв., 2,84 моль). Перемешивали при 1020 С в течение 20-30 мин, а затем в смесь добавляли 907 г NH3-H2O и 989 г Et3N. Нагревали до 45-55 С и перемешивали в течение 2-6 ч при 45-55 С. После завершения реакции охлаждали до 8-12 С и добавляли 4000 г воды. Перемешивали в течение 4-8 ч при 8-12 С, фильтровали и промывали 200 г воды. Сушили осадок в вакууме при 80 С в течение 8-24 ч с получением титульного соединения (560 г; чистота 98,8%, выход 92%; [М+1] = 213,8; 1 Н ЯМР (d6-ДМСО, 400 МГц):= 8,564 (s,1H), 8,278 (s, 1H), 8,011 (s, 1H), 7,649 (s, 1H), 4,293-4,240 (dd, J1 = 6,8, J2 = 14, 2H), 2,462 (s, 3H),1,308-1,272 (m, 3 Н. Пример получения 7. Охлаждали раствор этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата (72,3 г, 339 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ) (900 мл) до 0 С. По каплям добавляли раствор LiAlH4 (2 М в ТГФ) (195 мл,390 ммоль) в течение 1 ч. Перемешивали в течение 2 ч при 0 С и оставляли реакционную смесь нагреваться до КТ на ночь. Охлаждали смесь до 0 С и осторожно гасили путем последовательного добавления воды (15 мл), 20% водн. KOH (15 мл) и воды (30 мл). Перемешивали полученную смесь в течение 1 ч. Сушили над MgSO4, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением титульного соединения (55,85 г, выход 96%). МС (m/z): 172,1 (М+1). Пример получения 8. 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегид(818 мл) добавляли MnO2 (49,8 г, 572 ммоль) и грели реакционную смесь при 55 С (внутренняя температура смеси) в течение 4 ч. Фильтровали горячую реакционную смесь и промывали осадок горячим хлороформом и ТГФ. Концентрировали объединенные фильтраты при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением титульного соединения (26,7 г, выход 96%) в виде бледно-желтого твердого вещества МС (m/z) 170,1 (М+1). Способ В. В реакционный сосуд помещали 450 г (2,08 моль, 1,0 экв) этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5 карбоксилата и 6750 мл (15,0 V) ТГФ В отдельный реакционный сосуд помещали 88,1 г (1,1 экв) LiAlH4 и 2250 г (5,0 V) ТГФ Охлаждали полученную смесь, содержащую LiAlH4, до -55 С По каплям добавляли раствор этил-4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбоксилата в ТГФ в смесь, содержащую LiAlH4,при температуре ниже 10 С После завершения добавления перемешивали смесь при 515 С в течение 2-3 ч Охлаждали до -55 С и по каплям добавляли 279 г (1,5 экв) EtOAc при температуре ниже 20 С Перемешивали смесь при 1020 С в течение 1-2 ч Добавляли 450 г (0,66 экв) Na2SO4 10H2O по частям при температуре ниже 20 С Перемешивали смесь при 1020 С в течение 12 ч фильтровали суспензию через диатомитовую землю промывали осадок ТГФ В фильтрат, содержащий раствор (4-амино-2(метилтио)пиримидин-5-ил)метанола, помещали 734 г (4,0 экв) MnO2 Нагревали смесь до 40 С перемешивали смесь при 4045 С в течение 68 ч фильтровали суспензию через диатомитовую землю промывали осадок ТГФ объединяли фильтраты, концентрировали и по каплям добавляли 1530 г (5,0 V) н-гептана перемешивали смесь при 1020 С в течение 34 ч фильтровали суспензию и промывали осадок гептаном Сушили осадок при пониженном давлении при 4050 С в течение 10-16 ч с получением титульного соединения (276 г, чистота 97,9%, выход 75%, [М+1] = 171,8, 1 Н ЯМР (d6-ДМСО, 400 МГц)= 7,887 (s, 1H), 6,704 (s, 2H), 5,066-5,042 (m, 1H), 5 4,292-4,280 (d, 2H), 2,392 (s, 3 Н); [М+1] = 169,8,1 Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц)= 9,769 (s, 1H), 8,414 (s, 1H), 8,190 (s, 1H), 5,772 (s, 1H), 2,540 (s, 3 Н. Пример получения 9 7-метил-2-(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ол Способ А. В раствор гидроксида натрия (23,64 г, 591 ммоль) и воды (200 мл) добавляли 1-гидроксипропан-2 он (24,3 мл, 355 ммоль) и 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегид (50 г, 296 ммоль). В суспензию добавляли EtOH (600 мл) и перемешивали при КТ в течение ночи. Медленно добавляли раствор концентрированной HCl (50 мл) в воде (350 мл). Добавляли 1:1 EtOH/H2O (100 мл) и собирали твердые вещества путем фильтрования. Промывали твердые вещества 1:1 EtOH/H2O (250 мл), ледяным EtOH(425 мл) и гексанами (2250 мл). Сушили в вакуумной печи при 30-35 С с получением титульного соединения в виде бежевого твердого вещества (34 г, выход 56%). МС (m/z): 208,1 (М+1). Способ В. В реакционный сосуд помещали 2400 г (8,0 V) Н 2 О и 177,3 г (2,5 экв.) NaOH и 300,0 г (1,77 моль,1,0 экв.) 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегида и 157,6 г (1,2 экв.) гидроксиацетона. Нагревали смесь до 35-45 С и перемешивали в течение 10-20 ч при 35-45 С. Охлаждали смесь до 5-15 С. По каплям добавляли 4500 мл 1 н. HCl и доводили рН до 34 при температуре ниже 15 С. Перемешивали в течение 1-2 ч при 10-15 С. Фильтровали и промывали осадок 300 г воды. Сушили осадок при пониженном давлении при 5060 С в течение 16-24 ч с получением титульного соединения (372 г коричневого твердого вещества; площадь пика ВЭЖХ: 98,0% (исследование: 90,0%); выход 90%; 1H ЯМР (d6-ДМСО,400 МГц):= 10,864 (s, 1H), 9,276 (s, 1H), 7,529 (s, 1H), 2,570 (s, 6H. Пример получения 10. 7-метил-2-(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-илтрифторметансульфонат Способ А. Объединяли 7-метил-2-(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ол (25 г, 121 ммоль), ДХМ (1100 мл) и пиридин (98 мл, 1206 ммоль) и охлаждали смесь на ледяной бане до достижения внутренней температуры 3 С. Медленно при помощи шприца добавляли ангидрид трифторметансульфокислоты (24,5 мл,145 ммоль) с такой скоростью, чтобы поддерживать внутреннюю температуру ниже 5 С. Перемешивали реакционную смесь при 0 С в течение 2 ч. Промывали водой (3300 мл) и солевым раствором (300 мл),сушили над MgSO4 и фильтровали. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении (температура водяной бани 35 С) и сушили в глубоком вакууме в течение 2-3 ч при КТ. Растворяли остаток в ДХМ и очищали путем хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексаны). Концентрировали фракции с получением получистого твердого вещества. Растирали твердое вещество в 20% смеси EtOAc/гексаны (100 мл), собирали путем фильтрования, промывали 20% смесью EtOAc/гексаны (210 мл) и сушили в вакууме при КТ с получением титульного соединения в виде бледно-розового твердого вещества (28,6 г, выход 70%). МС(m/z): 340,0 (М+1). Способ В. В реакционный сосуд помещали 4000 мл (20,0 V) ДХМ и 208 г (1,0 моль, 1,0 экв.) 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ола. Перемешивали смесь в течение 10-20 мин. Помещали 312 г(4,0 экв.) пиридина при температуре ниже 20 С. Охлаждали до -50 С и по каплям добавляли раствор 416 г ангидрида трифторметансульфокислоты (1,5 экв.) в ДХМ (2000 мл, 10,0 V) при температуре ниже 0 С. После завершения добавления перемешивали при 0-5 С в течение 2-3 ч. Гасили реакцию 2000 мл 1 н.HCl (2 х). Дважды промывали 500 мл Н 2 О. Добавляли 100,0 г силикагеля и перемешивали при 1020 С в течение 1-2 ч. Фильтровали смесь через диатомитовую землю. Концентрировали фильтрат и по каплям добавляли 1000 мл н-гептана (5,0 V) при перемешивании при 1020 С. Перемешивали смесь при 1020 С в течение 3-4 ч. Фильтровали и сушили осадок при пониженном давлении при 3540 С в течение 8-12 ч с получением титульного соединения (307 г коричневого твердого вещества; площадь пика ВЭЖХ 99,1% (исследование: 96,8%)%; выход 86%); 1 Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц):= 9,216 (s, 1H), 8,120 (s,1H), 2,890 (s, 3 Н), 2,773 (s, 3 Н). Пример получения 11. 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-илтрифторметансульфонат(28,6 г, 84 ммоль), диметилформамида (74 мл) и ледяной уксусной кислоты (9,61 мл, 169 ммоль) до 45 С,а затем по каплям добавляли 6,15% водный NaOCl (хлорная известь, 612 г, 506 ммоль) в течение 2 ч. Грели при 45-50 С в течение 2 ч, охлаждали до КТ, собирали твердые вещества путем фильтрования и промывали водой (300 мл). В твердые вещества добавляли ДХМ (200 мл), охлаждали суспензию на бане лед-вода и обрабатывали 2,0 М раствором N-метиламина в ТГФ (126 мл, 253 ммоль). Оставляли смесь медленно нагреваться до КТ и перемешивали в течение 2 ч. Удаляли растворитель при пониженном давлении, обрабатывали метанолом (МеОН) (50 мл) и перемешивали при КТ в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали МеОН. Обрабатывали твердое вещество EtOAc(30 мл) и перемешивали при КТ в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали EtOAc с получением титульного соединения (19,82 г, выход 73%). МС (m/z): 323,0 (М+1). Способ В. В реакционный сосуд помещали 150 г (0,442 моль, 1,0 экв., ограничивающий реагент) 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-илтрифторметансульфоната, добавляли 3000 мл ДХМ до получения прозрачного раствора, охлаждали смесь до -55 С. Добавляли 105 г (0,442 моль, 1,0 экв.) м-ХПБК по частям при температуре ниже 5 С. Перемешивали смесь при 05 С в течение 34 ч (Е/А = 1%). По каплям добавляли 660 мл (1,326 моль, 3,0 экв.) 2 М метиламина в ТГФ при температуре ниже 10 С, перемешивали смесь при 010 С в течение 3-4 ч. Добавляли 1500 мл ДХМ и 1000 мл Н 2 О при перемешивании и отделяли водный слой. Четыре раза промывали органический слой 500 мл Н 2 О и концентрировали до 600 г при температуре ниже 40 С. Дважды проводили замену растворителя на н-гептан и перемешивали смесь при 1020 С в течение 34 ч. Фильтровали суспензию. Промывали 150 г н-гептана и сушили осадок при пониженном давлении при 6575 С в течение 10-16 ч с получением титульного соединения Обрабатывали раствор 4-амино-2-(метилтио)пиримидин-5-карбальдегида (10 г, 59,1 ммоль) в ацетоне (100 мл) с использованием KOH (3,32 г, 59,1 ммоль), перемешивали при КТ в течение 10 мин, затем концентрировали досуха. Обрабатывали остаток EtOAc, промывали насыщенным водным NaHCO3, затем солевым раствором, сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением 7-метил-2(метилтио)пиридо[2,3-d]пиримидина. МС (m/z): 192,1 (М+1). Добавляли раствор метиламина в этаноле(33%, 80 мл) и грели при 110 С в течение ночи в пробирке, стойкой к давлению. Удаляли растворитель при пониженном давлении и очищали неочищенный продукт путем хроматографии на силикагеле(50-100% EtOAc/гексаны) с получением титульного соединения (6,73 г, 65% за 2 стадии). МС (m/z): 175,1 Охлаждали раствор N,7-диметилпиридо[2,3-d]пиримидин-2-амина (6,73 г, 38,6 ммоль) в ацетонитриле (160 мл) на ледяной бане, защищая от доступа света алюминиевой фольгой. ДобавлялиN-бромсукцинимид (6,88 г, 38,6 ммоль) и перемешивали при 0 С в течение 2 ч. Переносили реакционную смесь в холодильник при 5 С на 4 дня. Собирали твердое вещество путем фильтрования. Промывали твердое вещество ДХМ и концентрировали промывочные растворы с получением титульного соединения (3,0 г, выход 31%). МС (m/z): 253,0/255,0 (М+1). Пример 1. 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 ил)фенил)мочевина Соединение согласно примеру 1 можно получать при помощи способа А, способа В или способа С. Способ А. Объединяли 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2 ил)фенил)мочевину (25,9 г, 68,5 ммоль), 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 илтрифторметансульфонат (22,09 г, 68,5 ммоль) и NaHCO3 (17,28 г, 206 ммоль) в 1,4-диоксане (500 мл) и воде (125 мл) и барботировали аргоном в течение 20 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (3,96 г, 3,43 ммоль), а затем грели в атмосфере аргона при 50 С. Добавляли дополнительное количество 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6 илтрифторметансульфоната (300 мг, 0,55 ммоль) и продолжали нагревать при 50 С в течение ночи. Охлаждали смесь до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования и промывали водой, а затем диэтиловым эфиром. Обрабатывали твердое вещество ацетонитрилом (50 мл) и грели взвесь при 80 С в течение 30 мин. Собирали твердое вещество путем фильтрования, промывали ацетонитрилом и сушили в вакууме при 80 С с получением бледно-желтого твердого вещества. Обрабатывали твердое вещество МеОН (50 мл) и грели смесь при 80 С в течение 1 ч. Охлаждали до КТ, собирали твердое вещество путем фильтрования, промывали МеОН (20 мл) и сушили в вакууме с получением титульного соединения(22,5 г, выход 77%) в виде бледно-желтого твердого вещества. МС (m/z): 425,2 (М+1). Способ В. Барботировали суспензию 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2 диоксаборолан-2-ил)фенил)мочевины (4,48 г, 11,8 ммоль), 6-бром-N,7-диметилпиридо[2,3-d]пиримидин 2-амина (3,0 г, 11,8 ммоль) и K2CO3 (4,91 г, 35,6 ммоль) в диоксане (80 мл) и воде (20 мл) аргоном, обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (0,685 г, 0,593 ммоль) и грели при 85 С в течение ночи. Удаляли диоксан при пониженном давлении, обрабатывали смесь EtOAc и солевым раствором, разделяли слои, сушили органический слой над Na2SO4, концентрировали и очищали путем хроматографии на силикагеле (от 40% до 100% EtOAc/гексан, 100% EtOAc, 5% MeOH/EtOAc). Обрабатывали веществоCH3CN, грели при 80 С в течение 1 ч, охлаждали до КТ и собирали твердое вещество путем фильтрования с получением титульного соединения (3,52 г, выход 70%) в виде бледно-желтого твердого вещества. МС (m/z): 425,2 (М+1). Способ С. В реакционном сосуде продували смесь растворителей, состоящую из 1,4-диоксана (1250 г) и воды(200 г), с использованием N2. Нагревали смесь до 8085 С. Помещали 100 г (0,31 моль, 1,0 экв, ограничивающий реагент) 7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-илтрифторметансульфоната,117,4 г (0,31 моль, 1,0 экв) 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2 диоксаборолан-2-ил)фенил)мочевины, 128,7 г (0,93 моль, 3,0 экв) K2CO3 и 6,81 г (0,0093 моль, 0,03 экв)Pd(dppf)Cl2 в атмосфере азота Перемешивали смесь при 8090 С в течение 4-6 ч Охлаждали смесь до 4050 С Концентрировали и по каплям добавляли 2000 г воды при температуре ниже 30 С После завершения добавления перемешивали смесь при 1030 С в течение 6-8 ч Фильтровали и промывали 200 г воды, затем промывали осадок Сушили осадок при пониженном давлении и 6070 С в течение 14-16 ч с получением технически чистого титульного соединения в качестве АФИ (158 г, чистота 90,4%, исследование 63,4%, KF: 5%-6%) Растворяли технически чистое титульное соединение, представляющее собой АФИ, в 1000 мл ДХМ и 1000 мл EtOH при 1030 С Добавляли 50 г силикагеля, 80 г Na2S2O35H2O и 10 г активированного угля Нагревали смесь до 4050 С и перемешивали в течение 3-5 ч, охлаждали до 1030 С Фильтровали и промывали осадок 200 г ДХМ/EtOH (1 1) Перемешивали с 5 г SilicaThiol при 4050 С и фильтровали Дважды заменяли растворитель на 390,0 г EtOH Концентрировали и фильтровали суспензию, затем промывали осадок 39,0 г EtOH Сушили осадок при пониженном давлении при 6575 С в течение 14-16 ч с получением титульного соединения в качестве АФИ (61 г, чистота 98,5%,исследование 97,5%, выход 65%), 1 Н ЯМР (d6-ДМСО, 400 МГц)= 9,077 (s, 1H), 8,278 (s, 1H), 7,9687,947 (d, 1H), 7,893 (s, 1H), 7,680 (s, 1H),7,193-7,162 (d, 1H), 6,512-6,485 (m, 1 Н), 3,088-3,035 (m, 2 Н),- 10024824 2,924-2,914 (d, ЗН), 2,296 (s, 3 Н), 1,955 (s, ЗН), 1,344-1,304 (m, 2 Н), 0,875 (s, 9H). Рентгеновская порошковая дифракция. Дифрактограммы XRD кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оборудованном источником CuKa ( = 1,54060 ) и детекторомVantec, с рабочими характеристиками 35 кВ и 50 мА Образец сканировали в диапазоне от 4 до 402 с шагом 0,0092 и скоростью сканирования 0,5 секунды/шаг, дивергенция составляла 0,6 мм, фиксирующая антирассеивающая щель 5,28, щель детектора 9,5 мм Сухие порошки помещали в кварцевый держатель образцов, гладкую поверхность получали при помощи предметного стекла Дифрактограммы кристаллических форм собирали при температуре и относительной влажности окружающей среды В области кристаллографии хорошо известно, что любая данная кристаллическая форма может иметь различные значения относительной интенсивности пиков дифракции, вызванных предпочтительной ориентацией,что обусловлено такими факторами, как морфология и форма кристаллов. В случае наличия предпочтительной ориентации интенсивности пиков изменяются, но положения характеристических пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, Фармакопея США 23, Национальный формуляр 18,стр. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут незначительно изменяться. Например, сдвиг пиков может происходить в результате изменения температуры или влажности, при которых проводят анализ образца, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В настоящем случае погрешность измерения положения пиков 0,22 учитывает эти возможные изменения, но не препятствует однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы можно проводить на основании любой уникальной комбинации различных пиков(в 2), как правило, наиболее выраженных пиков. Дифрактограммы кристаллической формы, собранные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали по стандартным пикамNIST 675 при 8,853 и 26,774 градуса 2-тета. Твердая кристаллическая форма свободного основания. Таким образом, полученный образец твердой кристаллической формы свободного основания согласно примеру 1 был охарактеризован при помощи дифрактограммы XRD, полученной с использованием излучения CuKa и имеющей пики дифракции (в градусах 2-тета), такие как описано ниже в табл. 1, в частности имеющей пики при 16,0 в комбинации с одним или более пиков, выбранных из группы, состоящей из 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2; где погрешность углов дифракции составляла 0,2 градуса. Таблица 1 Пики рентгеновской порошковой дифракции твердой кристаллической формы свободного основания согласно примеру 1 Общеизвестно, что биодоступность соединения с низкой растворимостью можно увеличивать за счет введения его в состав твердой дисперсии в полимерной матрице. Указанные твердые дисперсии представляют собой дисперсии лекарственного средства в инертной матрице-носителе, полученные пу- 11024824 тем плавления (плавки) смесей лекарственное средство-полимер и последующего отверждения гомогенной расплавленной смеси посредством быстрого охлаждения (например, при помощи способов, таких как экструзия горячего расплава) или путем растворения лекарственного средства и полимера в подходящем органическом растворителе и последующего удаления растворителя посредством выпаривания(например, при помощи сушки распылением) или осаждения с использованием антирастворителя. В твердых дисперсиях, как правило, лекарственное средство переходит в аморфную форму, что приводит к увеличению скорости растворения и/или к увеличению степени (уровня) и продолжительности пересыщения, обеспечивая повышенную пероральную биодоступность соединений с низкой растворимостью по сравнению с недиспергированным кристаллическим лекарственным средством. Полимеры, которые успешно используют в твердых дисперсиях, включают (но не ограничиваются ими) поливинилпирролидон(ГПМЦФ-55), ацетат-фталат целлюлозы (ЦАФ) и Eudragit EPO. Физическая и химическая стабильность твердых дисперсий являются факторами, определяющими возможность применения указанных составов. Содержание лекарственного средства является другой переменной, которая может влиять на физическую стабильность метастабильной аморфной фазы лекарственного средства, а также на его характеристики in vivo. Предпочтительным способом введения твердой дисперсии человеку является ее дополнительная обработка с получением капсулы, таблетки или другой твердой пероральной лекарственной формы путем добавления фармацевтически приемлемого носителя и необязательно других вспомогательных веществ, подходящих для получения и улучшения характеристик указанных лекарственных форм. Твердые дисперсии можно дозировать в виде капсул, заполненных порошком или гранулированной смесью, суспензии в подходящем носителе или любой другой подходящей пероральной фармацевтической лекарственной формы, такой как (не ограничиваясь ими) таблетки, саше, гранулы, капсулы, заполненные гранулами, и т.д. Вследствие низкой биодоступности соединения согласно примеру 1, вызванной его низкой растворимостью, желательным является получение составов для проведения исследования на небольших животных, таких как собаки и крысы, а также для клинического исследования. С использованием нейтрального полимера ПВП-ВА (Kollidon VA 64) получали твердые дисперсии, которые обладали химической и физической стабильностью в ускоренном исследовании стабильности (40 С; относительная влажность 75%) в течение одного месяца, а также в исследовании хранения в течение продолжительного периода времени (11 месяцев для 20% содержания лекарственного средства и 10 месяцев для 40% содержания лекарственного средства) в условиях окружающей среды. Пример композиции 1. 20% твердая дисперсия, содержащая соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (20:80). Кристаллическое соединение согласно примеру 1 использовали для получения твердой дисперсии. Сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА) коммерчески доступен под торговой маркой Kollidon VA 64 производства BASF Corporation. В качестве растворителя использовали 1:1 смесь дихлорметана и метанола, полученную путем смешения равных объемов дихлорметана (Fisher Scientific) и метанола (OmniSolv). Также использовали коммерчески доступный лаурилсульфат натрия (Fisher Scientific). Способ. Твердую дисперсию получали и сушили распылением в виде двух небольших партий. Для получения первой партии соединение согласно примеру 1 (22,22 г) добавляли в 2000 мл бутыль. Добавляли 1180 мл растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) и образец обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение примерно 20 мин до полного растворения соединения, что давало теоретическое значение концентрации 19 мг/мл. В полученный раствор добавляли 88,86 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор соединения согласно примеру 1 и ПВП-ВА (20:80) в смеси дихлорметан:метанол (1:1) сушили распылением при помощи распылительной минисушилки (Buchi Mini Spray Dryer 290). Расход раствора составлял 9-12 мл/мин, температуру на входе устанавливали на 100 С-110 С, температура на выходе, соответственно, составляла 37-55 С. Для получения второй партии соединение согласно примеру 1 (34,62 г) добавляли в 2000 мл бутыль. Добавляли 1820 мл растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) и образец обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение примерно 20 мин до полного растворения соединения, что давало теоретическое значение концентрации 19 мг/мл. В полученный раствор добавляли 138,48 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор соединения согласно примеру 1 и ПВП-ВА (20:80) в смеси дихлорметан:метанол (1:1) сушили распылением при помощи распылительной минисушилки (Buchi Mini SprayDryer 290). Расход раствора составлял 14-15 мл/мин, температуру на входе устанавливали на 100-110 С,температура на выходе, соответственно, составляла 62-70 С. Высушенный распылением материал из двух полученных партий перемешивали и дополнительно сушили в вакуумной печи в течение ночи при температуре 40-60 С, а затем выдерживали в вакууме еще день при комнатной температуре. В 236,28 г твердой дисперсии, содержащей смесь соединение согласно примеру 1:ПВП-ВА (20:80) добавляли 4,278 г лаурилсульфата натрия, тщательно перемешивали в крупном сосуде для кристаллиза- 12024824 ции при помощи шпателя с получением конечной композиции, содержащей 98% твердой дисперсии и 2% лаурилсульфата натрия. Полученный состав можно дозировать в виде капсул, заполненных перемешанным порошком, или суспензии, полученной путем суспендирования в носителе, например в смеси 1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% полисорбат 80/0,05% противовспенивающая добавка Dow Corning 1510-US. Пример композиции 2. 40% твердая дисперсия, содержащая соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (40:60) Использовали кристаллическое соединение согласно примеру 1, сополимер поливинилпирролидона и винилацетата (ПВП-ВА) и лаурилсульфат натрия, такие как описано для примера композиции 1. Способ. Твердую дисперсию получали при помощи способа сушки распылением, по существу, такого, как описано для примера композиции 1, с использованием 3,79 г соединения согласно примеру 1,соответствующего объема растворителя (дихлорметан:метанол, 1:1) с получением раствора с концентрацией 20 мг/мл. В полученный раствор добавляли 5,68 г ПВП-ВА и растворяли путем перемешивания до получения гомогенного раствора. Раствор сушили распылением, по существу, так, как описано для примера композиции 1. Расход раствора устанавливали на 40% при помощи 2 мм силиконовой трубки, температуру на входе устанавливали на 80 С, соответственно, температура на выходе составляла 34 С. Высушенный распылением материал собирали и дополнительно сушили в вакуумной печи в течение 14 ч при комнатной температуре, медленно подавая ток азота, в присутствии поглотителя влаги. В 6,64 г твердой дисперсии, содержащей смесь соединение согласно примеру 1: ПВП-ВА (40:60) добавляли 0,0665 г лаурилсульфата натрия, тщательно перемешивали в сосуде при помощи шпателя, что приводило к получению конечной композиции, содержащей твердую дисперсию и лаурилсульфат натрия в отношении 99:1. Полученный состав можно дозировать в виде капсул, заполненных перемешанным порошком, или суспензии, полученной путем суспендирования в носителе, например в смеси 1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% полисорбат 80/0,05% противовспенивающая добавка Dow Corning 1510-US. Рак в последнее время все чаще воспринимают как гетерогенную группу заболеваний, возникновение и прогрессирование которых происходит в результате нарушения функции одного или более генов,которые регулируют репарацию ДНК, стабильность генома, пролиферацию клеток, гибель клеток, адгезию, ангиогенез, инвазию и метастаз в клеточных и тканевых микросредах. Измененная или нарушенная функция "раковых" генов может возникать в результате естественного полиморфизма ДНК, изменений числа копий генома (за счет амплификации, делеции, утраты хромосом или дупликации), изменений структуры генов и хромосом (за счет хромосомной транслокации, инверсии или иной перегруппировки,которая приводит к дерегуляции экспрессии генов), а также точечных мутаций. Раковые новообразования могут возникать в результате единственного нарушения функции гена и поддерживаться тем же нарушением функции гена, или могут поддерживаться и прогрессировать за счет дополнительных нарушений функции генов. Помимо генетических структурных изменений хромосом, отмеченных выше, каждое из раковых заболеваний может включать эпигенетические модификации генома, включая метилирование ДНК, геномный импринтинг и модификации гистонов в результате ацетилирования, метилирования или фосфорилирования. Эпигенетические модификации могут влиять на возникновение и/или поддержание злокачественного образования. Были составлены расширенные каталоги цитогенетических нарушений при раковых заболеваниях человека, которые поддерживаются и регулярно обновляются в сети Интернет (см. базу данных Мительмана для структурных нарушений хромосом при раке в проекте анатомии генома при раке (Cancer Genome Anatomy Project (CGAP национального института рака США (NCI), веб-сайт:http://cgap.nci.nih.gov). База данных включает структурные нарушения хромосом, по меньшей мере, для некоторых злокачественных образований, приведенных в настоящем изобретении. В проекте генома рака института Сенгера (Wellcome Trust) ведут подробную онлайн-базу данных "Cancer Gene Census" для всех генов человека,которые имеют причинно-следственную связь с онкогенезом(см. http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census), а также базу данных COSMIC (каталог соматических мутаций при раке) для соматических мутаций при раковых заболеваниях человека(см. http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Дополнительным источником, в котором содержится подробная информация о цитогенетических изменениях, имеющих причинно-следственную связь с различными раковыми заболеваниями, является Атлас генетики и цитогенетики при онкологии и гематологии (http://atlasgeneticsoncology.Org//Anomalies/Anomliste.htmlMDS). Указанные базы данных также включают структурные нарушения хромосом, по меньшей мере, для некоторых злокачественных образований, приведенных в настоящем изобретении. Известна и традиционно используется диагностика раковых злокачественных образований путем биопсии, иммунофенотипирования и других исследований. Помимо технологий бэндинга хромосом с высоким разрешением и усовершенствованной визуализации хромосом структурные нарушения хромосом в случаях, где предполагают рак, можно определять путем цитогенетического анализа, такого как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), кариотипирование, спектральное кариотипирование (SKY),- 13024824 мультиплексная FISH (M-FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH), матрицы однонуклеотидного полиморфизма (SNP Chips) и другие диагностические и аналитические исследования, известные и используемые специалистами в данной области техники. Сигнальный путь Ras/Raf/MEK/MAPK передает внеклеточные стимулы к ядру, регулируя тем самым разнообразные клеточные ответы, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Нарушение указанных процессов в результате изменений сигнала МАРК, таких как генетические изменения, часто приводят к злокачественной трансформации. Важность этого сигнального пути при новообразованиях становится очевидной с учетом открытия множества мутантных аллелей, которые активируют этот путь при различных злокачественных образованиях у человека. Онкогенные мутации рецепторных тирозинкиназ (РТК), таких как РЭФР и cMet, или избыточная экспрессия РТК и их лигандов приводят к нарушению активации Ras и нисходящих компонентов ее сигнального пути. Активирующие мутации Ras были выявлены примерно в 30% раковых заболеваний человека. Указанные мутации значительно снижают активность ГТФазы, тем самым переводя Ras в ГТФ-связанное и активное состояние. У млекопитающих семейство Ras состоит из трех генов: K-Ras, N-Ras и H-Ras. Мутации K-Ras часто происходят при эпителиальных раковых заболеваниях, таких как рак поджелудочной железы, легких и колоректальный рак, тогда как мутации N-Ras часто происходят при меланоме, злокачественных образованиях в печени и миелоидных (ОМЛ, ХМЛ) злокачественных образованиях. Активирующие мутации B-Raf, члена семейства Raf, очень часто обнаруживают при меланоме и карциноме щитовидной железы и реже при колоректальном раке, раке яичников и легких. У пациентов с меланомой были выявлены соматические мутации MEK1 и MEK2. Наконец, исчерпание отрицательных регуляторов, таких как члены семействаSprouty, и GAP (белков, активирующих ГТФазу), таких как NF1, может косвенным образом активировать этот путь. Полагают, что при многих опухолях происходит дерегуляция пути Ras/Raf/MEK/MAPK, что делает его привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Семейство белков Raf состоит из трех членов, A-Raf, B-Raf и C-Raf (также называемого Raf1), которые играют ключевую роль при переносе сигналов от Ras к нисходящим компонентам пути MEK1/2 иERK1/ERK2. Было показано, что протеинкиназы Raf задействованы в онкогенезе, включая пролиферацию, выживание, инвазию и ангиогенез опухолевых клеток, Sebolt-Leopold et al., Nat Rev Cancer, 2004, 4: 937-947; Wellbrock et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 875-885. Активация пути МАРК в опухолевых клетках проходит по нескольким механизмам, таким как мутации или повышенная экспрессия РТК и мутации Ras, и все из них опосредованы белками Raf. Активирующие мутации B-RAF, что более важно,часто наблюдают при некоторых злокачественных образованиях, включая меланому, колоректальный рак, карциномы легких, яичников и щитовидной железы, Davies et al., Nature, 2002, 417: 949-954. Примерно 90% мутаций B-Raf заключаются в изменении Т 1799 А в экзоне 15, что приводит к аминокислотной замене Val на Glu (B-Raf V600E). Эта мутация B-Raf приводит к увеличению конститутивной активности киназы примерно в 500 раз по сравнению с белком дикого типа, вызывая злокачественную трансформацию. Также известны дополнительные мутации, такие как T529I, мутация с заменой треонина на изолейцин в гене-привратнике B-Raf, и G468A, вторичная мутация B-Raf при G1403C в 11 экзоне, которые, как полагают, играют роль в появлении, поддержании или усилении злокачественной трансформации, Whittaker et al., Sci. Transl. Med., 2010, 2(35) ra41; Wan et al., Cell, 2004, 116: 855-867. Недавно специфический ингибитор киназы B-Raf вемурафениб (также называемый PLX-4032) был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для лечения пациентов с меланомой, имеющих мутацию B-Raf V600E. Вемурафениб является эффективным и обеспечивает благоприятные показатели выживаемости у указанных пациентов. Тем не менее, у пациентов, чувствительных к этому лекарственному средству, обычно развивается лекарственная резистентность, что приводит к рецидиву заболевания в среднем через 7 месяцев. По аналогии со многими другими терапиями направленного действия приобретенная резистентность к ингибированию B-RAF значительно затрудняет достижение долгосрочных благоприятных показателей выживаемости при лечении этой популяции пациентов. В поисках улучшений благоприятного действия ингибиторов B-Raf продолжают проводить исследования по выявлению механизмов, которые наделяют клетки меланомы, экспрессирующие мутантнуюB-RAF, резистентностью к вемурафенибу. Недавние исследования показали, что механизмом резистентности к ингибированию B-RAF является повторная активация пути МАРК. В механизмах резистентности, главным образом, задействована повторная активация сигнала ERK за счет вспомогательных механизмов, которые могут быть Ras/RAF-зависимыми, такими как активация N-Ras, Nazarian et al, Nature. 2010, 468: 973-7, активация H-Ras (Su et al., New England Journal of Medicine. 2012, 366: 207-215) или повышающая регуляция C-RAF (Johannessen et al., Nature. 2010, 468: 968-72; Montagut et al., Cancer Res. 2008, 68: 4853-61), вариации B-RAF V600E с нарушенным сплайсингом (Poulikakos et al., Nature. 2011,480: 387-390), или Ras/RAF-независимыми (повышенная экспрессия Tpl2/COT), Johannessen et al., Nature. 2010, 468: 968-72. Следовательно, ослабление действия ингибирования B-RAF на сигнальный путь МАРК при раковых заболеваниях с мутацией B-RAF может происходить по нескольким механизмам. Несмотря на то, что мутации гена-привратника B-RAF (T529I), которые могут вызывать резистентность к ингибированию BRAF, до настоящего времени еще не получили клинического подтверждения, сущест- 14024824 вуют экспериментальные доказательства того, что указанная мутация вызывает резистентность, Whittaker et al., Sci Transl Med. 2010, 2(35): ra41. В недавних исследованиях также высказывались предположения о том, что активация MARK-избыточных сигнальных путей посредством РТК, таких как IGF-1R или PDGFRP, может иметь значение при приобретенной резистентности к ингибированию B-RAF; Nazarian et al., Nature. 2010, 468: 973-7; Villanueva et al., Cancer Cell. 2010, 18: 683-95; Shi et al., Cancer Res. 2011, 71: 5067-74. Очевидно, что во многих из указанных механизмов резистентности задействована повторная активация МАРК. Можно ожидать, что универсальный ингибитор Raf сможет блокировать повторную активацию МАРК. Кроме того, было показано, что специфические ингибиторы В-Raf, включая вемурафениб и его ближайший аналог N-[3-(5-хлор-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1 сульфонамид (PLX4720; коммерчески доступный селективный ингибитор В-Raf) вызывают активацию парадоксального пути посредством димеризации с другими изоформами Raf в окружении B-Raf дикого типа, Hatzivassiliou G, et al. Nature, 2010, 464: 431-435; Poulikakos et al., Nature, 2010, 464: 427-430; Heidorn, et al., Cell, 2010, 140: 209-221. Полагают, что вемурафениб активирует путь Raf/MEK/ERK посредством связывания B-Raf дикого типа и стимуляции димеризации B-Raf-C-Raf. Полагают, что активация такого парадоксального пути за счет специфического ингибирования B-Raf является основной причиной побочных эффектов на коже (таких как плоскоклеточная карцинома) у некоторых пациентов с меланомой, которых лечили вемурафенибом. Вемурафениб не одобрен для лечения раковых пациентов с генетическим окружением B-Raf дикого типа вследствие его активности в отношении активации парадоксального пути при данном генетическом окружении. Исследуемое предложенное соединение является ингибитором Raf киназы, ингибирующим все изоформы белков Raf, включая A-Raf, B-Raf, C-Raf и B-Raf с мутацией V600E. Вследствие универсальной активности в отношении Raf исследуемое предложенное соединение обладает активностью в отношении опухолевых клеток, в которых активация пути МАРК происходит посредством предшествующих сигналов, таких как мутация N-Ras и мутация K-Ras в генетическом окружении B-Raf дикого типа. Таким образом, исследуемое предложенное соединение обладает потенциалом для лечения пациентов с раковыми заболеваниями с мутацией B-Raf (такими как меланома, колоректальный рак, карцинома легких, яичников и щитовидной железы), с мутацией N-Ras B-Raf дикого типа (такими как меланома,ОМЛ, ХМЛ, ОЛЛ, ХЛЛ, рак печени) (Schubbert et al., Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Guptaet al., Nature Reviews Cancer, 2011, 11: 761); или с мутацией K-Ras B-Raf дикого типа (такими как рак желчевыводящих путей, шейки матки, колоректальный рак, рак эндометрия, легких, яичников, поджелудочной железы и печени; Schubbert et al., Nature Reviews Cancer, 2007, 7: 295; Pylayeva-Gupta et al., NatureReviews Cancer, 2011,11: 761) или Raf, активированной по другому механизму, включая предшествующую активирующую мутацию/повышенную экспрессию РТК. Исследуемое предложенное соединение также обладает активностью в отношении опухолевых клеток меланомы с развившейся резистентностью к вемурафенибу. Таким образом, полагают, что исследуемое предложенное соединение является эффективным для лечения пациентов с меланомой, лечение которых с использованием вемурафениба или других ингибиторов B-Raf не дало результата. Исследуемое предложенное соединение также является ингибитором c-Kit. C-Kit представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая в обычных условиях контролирует функцию примитивных гематопоэтических клеток, меланоцитов и зародышевых клеток. После связывания со своим лигандом,фактором стволовых клеток (ФСК), c-Kit подвергается димеризации/олигомеризации и аутофосфорилированию. Генетические мутации (такие как L576P, К 642 Е, T670I и V654A) c-Kit, которые приводят к конститутивной активации c-Kit, могут вызывать меланому, острую миелоидную лейкемию и стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), таким образом, исследуемое предложенное соединение обладает потенциалом для лечения пациентов с меланомой, острой миелоидной лейкемией и GIST,Lennartsson et al., Current Cancer Drug Targets, 2006, 6: 65. Предложенное соединение можно применять в качестве единственного агента или в комбинации с одним или более другими одобренными лекарственными средствами для лечения раковых пациентов. Указанные раковые пациенты включают: пациентов с меланомой с мутацией B-Raf V600E, пациентов с меланомой, лечение которых с использованием вемурафениба или других ингибиторов B-Raf не дало результатов, пациентов с меланомой с мутацией N-Ras B-Raf дикого типа, пациентов с меланомой с повышенной экспрессией c-Kit или мутацией c-Kit; пациентов с колоректальным раком с мутацией B-RafK-Ras B-Raf дикого типа; пациентов с миелоидной лейкемией с мутацией N-Ras B-Raf дикого типа или повышенной экспрессией c-Kit или мутацией c-Kit; пациентов с раком печени с мутацией N-Ras или KRas B-Raf дикого типа; пациентов с раком поджелудочной железы с мутацией K-Ras B-Raf дикого типа; пациентов с карциномой щитовидной железы с мутацией B-Raf V600E или N-Ras B-Raf дикого типа; пациентов с раком желчевыводящих путей с мутацией K-Ras B-Raf дикого типа; пациентов с GIST с мутацией или повышенной экспрессией c-Kit. В следующих исследованиях in vitro и in vivo продемонстрирована ингибирующая активность предложенного соединения в отношении сигнального пути Ras/Raf/MEK/ERK. Специалисты в данной области техники, в целом, считают, что эти исследования подтверждают клиническую химиотерапевтическую активность при лечении человека. Исследования, в которых получают подтверждения универсальности ингибирования Raf и ингибирующей активности в отношении сигнального пути, можно проводить, по существу, при помощи приведенных далее способов или при помощи схожих исследований с получением схожих данных. Если не указано иное, приведенные значения IC50 являются абсолютными. Ферментные исследования киназной активности B-Raf, C-Raf и мутантных B-Raf. Проводили оценку ингибирующей активности исследуемого соединения в отношении человеческойV600E+T529I или человеческой B-Raf V600E+G468A. T529I представляет собой мутацию генапривратника B-Raf с заменой треонина на изолейцин, a G468A представляет собой вторичную мутациюB-Raf при G1403C в 11 экзоне. В ферментных исследованиях B-Raf, C-Raf и мутаций B-Raf проводили оценку свойства комплекса Raf и MEK1, который в присутствии АТФ катализирует усиленный гидролиз АТФ (Rominger, et al., Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137; опубликованная заявка на патент США 2006/0211073). Образующийся АДФ отслеживают с использованием хорошо известной системы связанных ПК/ЛДГ (пируваткиназа/лактатдегидрогеназа) по окислению НАДН, которое можно наблюдать и детектировать спектрофотометрическими методами по поглощению при 340 нм (A340; основы метода см. в Schindler et al., Science, 2000, 289: 1938-1942). Активируемая Raf активность АТФазы MEK1 является общим свойством всех форм белков Raf. Экспрессия и очистка белков Raf. В целом, клеточные линии получали с использованием коммерчески доступных материалов при помощи способов, известных и традиционно применяемых специалистами в данной области техники. Известны последовательности нуклеотидов, кодирующие ДНК непроцессированного B-Raf дикого типа(Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), стандартная последовательностьNC000007.13), C-Raf (Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), стандартная последовательность NC000003.11) и A-Raf (Национальный центр биотехнологической информацииB-Raf V600E (остатки 433-726, содержащие мутацию V600E), содержащую N-терминальную метку очистки, экспрессировали и очищали, по существу, согласно приведенному ранее описанию (Wan et al.,Cell, 2004,116, 855-867). Конструкты B-Raf V600E, содержащие вторичную мутацию T529I или мутацию G468A, получали путем сайт-направленного мутагенеза (Quikchange, Strategene) основного конструкта bRaf (433-726,V600E). Последовательности, которые применяли согласно настоящему описанию, включают: B-Raf V600EBRAF-V600E; BRAF-V600E+T529I; BRAF-V600E+G468A; BRAF дикого типа, непроцессированный; последовательность белков MEK1, которую применяли для скрининга. Ферментные исследования для измерения киназной активности Raf. Проводили оценку ингибирующей активности исследуемого соединения в отношении B-Raf дикого типа, C-Raf дикого типа, B-Raf V600E, B-Raf V600E+T529I и В-Raf V600E+G468A. T529I представляет собой мутацию гена-привратника B-Raf, a G468A является вторичной мутацией B-Raf. В ферментных исследованиях B-Raf, C-Raf и мутантных B-Raf проводили оценку свойства комплекса Raf и MEK1, который в присутствии АТФ катализирует усиленный гидролиз АТФ (Rominger, et al., Arch. Biochem. Biophys. 2007, 464: 130-137). Образующийся АДФ отслеживают с использованием хорошо известной системы связанных ПК/ЛДГ (пируваткиназа/лактатдегидрогеназа) по окислению НАДН, которое можно наблюдать и детектировать по поглощению при 340 нм (А 340; основы метода см. в Schindler et al., Science,2000, 289: 1938-1942). Активируемая Raf активность АТФазы MEK1 является общим свойством всех форм белков Raf. В ферментном исследовании B-Raf дикого типа реакционная смесь содержала: 1,2 нмоль В-Raf, 30 нмоль MEK1, 1000 мкмоль АТФ, 3,5 единицы (на 100 мкл) ПК, 5 единиц (на 100 мкл) ЛДГ, 1 ммоль фосфоенолпируват (ФЕП) и 280 мкмоль НАДН. В исследовании C-Raf реакционная смесь содержала 0,6 нмоль C-Raf, 26 нмоль MEK1, 2000 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. В исследовании B-Raf V600E реакционная смесь содержала 1,6 мкмоль B-RafV600E, 26 нмоль MEK1, 200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. В исследовании B-Raf V600E+T529I реакционная смесь содержала 6,2 нмоль B-Raf V600E+T529I,30 нмоль MEK1, 200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. В исследовании B-Raf V600E+G468A реакционная смесь содержала 3,5 нмоль В-Raf, 30 нмоль MEK1,200 мкмоль АТФ и такие же количества ФК, ЛДГ, ФЕП и НАДН, что указаны выше. Все исследования начинали путем перемешивания приведенной выше смеси с исследуемым соединением и непрерывно отслеживали при A340 в течение примерно 5 ч. Данные, полученные для реакционных смесей в период с 3 по 4 час, собирали для вычисления значений IC50. Для соединения согласно примеру 1 значение IC50 в отношении фермента B-Raf V600E составляло 6 нмоль, а в отношении C-Raf - 15 нмоль. Эти данные подтверждают, что предложенное соединение ингибирует B-Raf V600E и C-Raf в указанных исследованиях. Проводили оценку соединения согласно примеру 1 в других ферментных исследованиях, которые осуществляли при помощи способов, по существу схожих с теми, что описаны выше. Соединение согласно примеру 1 ингибирует B-Raf дикого типа, B-Raf V600E+T529I и B-Raf V600E+G468A со значениями IC50, составляющими 9,8, 15,47 и 16,9 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 является ингибитором Raf в указанных исследованиях. Ферментное исследование киназной активности c-Kit.c-Kit является важным онкогеном, и ее повышенную экспрессию и генетические мутации часто наблюдают у пациентов с меланомой и стромальной опухолью желудочно-кишечного тракта (GIST). В ферментном исследовании c-Kit спектрофотометрическими методами отслеживали фосфорилирование поли-Е 4Y под действием АТФ, катализируемое человеческой c-Kit. АДФ, получаемый в результате киназной реакции вступает в реакцию сочетания с системой пируваткиназа/лактатдегидрогеназа (ПК/ЛДГ),в результате которой из пирувата и НАДН образуется НАД. НАДН можно детектировать по поглощению при 340 нм, что описано выше для ферментных исследований киназных активностей В-Raf, C-Raf и мутантных В-Raf. Экспрессия и очистка рецептора c-Kit дикого типа. В целом, клеточные линии получали с использованием коммерчески доступных материалов при помощи способов, известных и традиционно используемых специалистами в данной области техники. Использовали известную последовательность нуклеотидов, кодирующую ДНК непроцессированного рецептора человеческой c-Kit дикого типа (Национальный центр биотехнологической информации(NCBI), стандартная последовательность NC000004.11). См. также для последовательности человеческого белка cKit: Y. Yarden,Y., et al., "Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinaseMethods Mol. Cell Biol. 4 (1993) 220-229. Исследования c-Kit. Исследуемая реакционная смесь содержала 6 нмоль человеческой с-KIT дикого типа, 1 мг/мл поли(Glu, Tyr) (Sigma), 1 ммоль фосфоенолпируват, 280 мкмоль НАДН, 5 ед./3,5 ед. (на 100 мкл) пируваткиназы/лактатдегидрогеназы, 85 ммоль Tris, pH 7,5, 17 ммоль MgCl2, 0,0042% Triton Х-100, 0,005% БСА, 1% ДМСО. Исследуемое соединение инкубировали с реакционной смесью в течение 0,5 ч, после чего добавляли 200 мкмоль АТФ для инициирования реакции при 30 С. Скорости реакции в диапазоне от 0,5 до 1 ч использовали для вычисления значений ингибирования в % и IC50. Последовательность, которую использовали в данном исследовании, включала с-KIT сN-терминальным GST гибридным белком. Для соединения согласно примеру 1 значение IC50 в исследовании ингибирования с-Kit составляло 21 нмоль. Эти данные подтверждают, что исследуемое предложенное соединение является ингибитором человеческой c-Kit дикого типа в указанном исследовании. Для дополнительной оценки исследуемого соединения его тестировали в отношении мутаций c-Kit,традиционно встречающихся при меланоме и/или GIST. Клеточную линию Ba/F3 (производства АТСС) трансфицировали c-Kit дикого типа (WT), c-Kit L576P (Willmore-Payne et al., Human Pathology, 2005,36(5), 486; Willmore-Payne et al., Human Pathology, 2006, 37, 520), c-Kit K642E (Willmore et al., Am J ClinPathol, 2004, 122(2), 206; Monsel et al., Oncogene, 2010, 29, 227); c-Kit T670I (Tamborini et al., Oncogene,2006, 25,6140) или c-Kit V654A (Tamborini et al., Oncogene, 2006, 25,6140), соответственно, при помощи способов ретровирусной трансфекции, хорошо известных и используемых специалистами в данной области техники. Мутации создавали путем мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции(ПЦР) и подтверждали путем автоматического секвенирования конструкта, экспрессирующего c-Kit, амплифицированного путем ПЦР. Стабильные клеточные линии Ba/F3 получали путем трансфицирования плазмидной ДНК. Экспрессию соответствующих мутантных c-Kit подтверждали путем вестерн-блот анализа. Рост клеток Ba/F3 дикого типа, в целом, зависит от IL-3. После трансфекции C-Kit указанные клетки выращивали в питательной среде, рекомендованной АТСС для Ba/F3, в присутствии фактора стволовых клеток (ФСК), лиганда c-Kit. Активность исследуемых соединений в отношении подавления пролиферации указанных клеток тестировали в присутствии IL-3 или ФСК. Таблица 2 Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации клеточных линий Данные, приведенные в табл. 2, подтверждают, что соединение согласно примеру 1 обладает ингибирующей активностью в отношении пролиферации и жизнеспособности клеток Ba/F3 с c-Kit дикого типа и выявленными генетическими мутациями c-Kit. Измерение киназной активности Raf с использованием нативных полных ферментов в исследовании KiNativ, разработанном в ActivX Biosciences Inc. Для дополнительной оценки универсальной активности исследуемого соединения в отношении ферментов Raf его тестировали в исследовании KiNativ, разработанном и реализуемом ActivX Biosciences Inc., с использованием цельноклеточных лизатов клеток А 375. Клетки А 375 представляют собой клетки меланомы человека с мутацией B-Raf V600E, A-Raf дикого типа и C-Raf дикого типа. Получение образца: Клетки А 375 (B-Raf V600E), полученные в АТСС, лизировали путем обработки ультразвуком в коммерчески доступном лизисном буфере, сгусток клеток удаляли путем центрифугирования, полученный надосадочный гель фильтровали в коммерчески доступный буфер для киназной реакции, содержащий 20 ммоль MnCl2. Конечная концентрация белка в лизатах составляла 10 мг/мл. По 5 мкл каждого исследуемого соединения добавляли из 100 мкмоль, 10 мкмоль, 1 мкмоль или 0,1 мкмоль маточных растворов в ДМСО в 500 мкл лизатов в двух повторностях до достижения конечных концентраций 1 мкмоль, 0,1 мкмоль, 0,01 мкмоль и 0,001 мкмоль. В качестве контроля в 500 мкл лизатов добавляли по 5 мкл ДМСО в четырех повторностях. После 15-минутной инкубации в каждый образец добавляли дестиобиотин-АТФ ацилфосфат в качестве зонда до достижения конечной концентрации 5 мкмоль и инкубировали совместно с образцами в течение 10 мин. После взаимодействия с зондом образцы готовили для анализа таргетной масс-спектрометрии в соответствии со стандартным протоколом ActivX. Вкратце, образцы подготавливали для гидролиза с трипсином (денатурировали, восстанавливали алкилят), подвергали гидролизу с трипсином, дестио-биотинилированные пептиды концентрировали на смоле со стрептавидином. Сбор данных: Образцы, обогащенные пептидом, анализировали путем ЖХ-МС/МС на массспектрометре Thermo-LTQ с ионной ловушкой с использованием методологии сбора данных ActivX для клеток A375 V600E. Анализ данных: Количественную оценку проводили путем выделения характеристических фрагментов ионных сигналов таргетных МС/МС спектров и сравнения сигналов в контрольных и обработанных образцах. Использовали программное обеспечение ActivX, проводя при необходимости неавтоматизированную валидацию/визуальную проверку в целях выделения/фильтрации данных. Все значения данных ингибирования подтверждали визуально, так же как и все значения данных, свидетельствующие о колебаниях за рамками нормального диапазона. Значимость значений, соответствующих ингибированию 35%, определяли по следующей формуле: (средняя площадь контрольных пиков - средняя площадь пиков после обработки/(2 СКО(площади контрольных пиков + площадь пика после обработки для первого эксперимента - площадь пика после обработки для второго эксперимента 0,8. Значения IC50 определяли при помощи программного обеспечения IGOR. Таблица 3 Универсальная активность соединения согласно примеру 1 в отношении Raf в исследовании цельноклеточных лизатов A375 ActivX KiNativ Как показано в табл. 3, соединение согласно примеру 1 ингибировало A-Raf, B-Raf V600E и C-Raf со значениями IC50, составляющими 44, 31-47 и 42 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают ингибирование A-Raf, C-Raf и B-Raf V600E в исследовании цельноклеточных лизатов при использовании соединения согласно примеру 1. Соединение согласно примеру 1 ингибирует клеточную активность фосфо-ERK. Для исследования возможности соотнесения биохимической активности соединения согласно примеру 1 in vitro с его клеточной активностью соединение согласно примеру 1 использовали для обработки клеток меланомы A375 V600E и резистентных клеток WM-266-4 V600E, А375 V600E-PLX4032 (A375res; получение описано ниже) и клеток НСТ-116 (B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras), клеток опухоли толстой кишки с мутацией K-Ras. Клетки А 375 V600E, WM-266-4 V600E, НСТ-116 с B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras приобретали в АТСС. Клеточную активность определяли при помощи набора для исследования ELISA, коммерчески доступного в TGR Biosciences, измеряя уровень фосфо-ERK для каждого типа клеток. Резистентные клетки A375 V600E, А 375 V600E-PLX4032, клетки WM-266-4 V600E или НСТ-116(B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras) выращивали в питательной среде (описанной ниже для исследования CellTiterGlo) в 96-луночных планшетах производства Perkin Elmer в течение ночи, затем обрабатывали соединением согласно примеру 1 в концентрации 0 и в 11 различных концентрациях, полученных путем последовательного разбавления в диапазоне от 0,17 до 10000 нмоль, в течение 1 ч. Затем клетки в каждой лунке лизировали 50 мкл лизисного буфера производства TGR Biosciences. Активность фосфоERK определяли при помощи набора для исследования SureFire фосфо-ERK AlphaScreen производстваTGR Biosciences в соответствии с инструкцией производителя. Соединение согласно примеру 1 ингибировало уровень фосфо-ERK зависящим от дозы образом во всех исследуемых клеточных линиях. Значения IC50 для клеток А 375 V600E, WM-266-4 V600E, А 375V600E-res и НСТ-116 (B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras) составляли 3, 4,9, 9,7 и 132,8 нмоль, соответственно. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 ингибирует нисходящие сигналы в клетках A375 V600E, WM-266-4 V600E, А 375 V600E-res и НСТ-116 с B-Raf дикого типа с мутациейK-Ras в соответствии с результатами ингибирования Raf в этом исследовании. Исследование пролиферации и жизнеспособности клеток CellTiter-Blue Исследование пролиферации клеток А 375. Клетки A375 ( в каталоге CRL-1619) получали в Американской коллекции типовых культур(АТСС, Manassas, VA). Вкратце, клетки выращивали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, СА) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 70-95% конфлюентности, после чего их пересевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли по шестьсот двадцать пять клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37C, 5% СО 2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (Sigma, St. Louis, МО) в PBS и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе Synergy2 (Biotek, Winooski, VT), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений IC50 данные анализировали при помощи программного обеспечения Prism (Graphpad, San Diego, CA). Исследование пролиферации клеток Colo-205. Клетки Colo205 ( в каталоге НВ-8307) получали в Американской коллекции типовых культур(АТСС, Manassas, VA). Вкратце, клетки выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 ммоль пирувата натрия и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 30-60% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384- 19024824 луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (Sigma, St. Louis, МО) в PBS и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе Synergy2 (Biotek, Winooski, VT), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений IC50 данные анализировали при помощи программного обеспечения Prism (Graphpad, San Diego, CA). Исследование пролиферации клеток НТ-29. Клетки НТ-29 ( в каталоге НТВ-38) получали в Американской коллекции типовых культур(АТСС, Manassas, VA). Вкратце, клетки выращивали в среде МакКоя 5 А с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, СА) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 75-90% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (Sigma, St. Louis, МО) в PBS и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе Synergy2 (Biotek, Winooski, VT), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений IC50 данные анализировали при помощи программного обеспечения Prism (Graphpad,San Diego, CA). Исследование пролиферации клеток НСТ-116. Клетки НСТ-116 ( в каталоге CCL-247) получали в Американской коллекции типовых культур(АТСС, Manassas, VA). Вкратце, клетки выращивали в среде МакКоя 5 А с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA) и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 75-90% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли шестьсот двадцать пять клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (Sigma, St. Louis, МО) в PBS и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе Synergy2 (Biotek, Winooski, VT), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений IC50 данные анализировали при помощи программного обеспечения Prism (Graphpad,San Diego, CA). Исследование пролиферации клеток SK-Mel-2. Клетки Sk-Mel-2 ( в каталоге НТВ-68) получали в Американской коллекции типовых культур(АТСС, Manassas, VA). Вкратце, клетки выращивали в среде MEM с добавлением 10% стандартной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 ммоль пирувата натрия, 0,1 нмоль заменимых аминокислот и 1% смеси пенициллин/стрептомицин/L-глутамин при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки оставляли для прохождения роста до достижения 70-95% конфлюентности, после чего их высевали или собирали для использования в исследовании. Исследуемое соединение после последовательных разбавлений помещали в 384-луночный черный планшет с прозрачным дном в трех повторностях. Добавляли одну тысячу двести пятьдесят клеток на лунку в 50 мкл полной питательной среды в 384-луночный планшет. Планшеты инкубировали в течение 67 ч при 37C, 5% CO2 и 95% влажности. По завершении периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл 440 мкмоль раствора резазурина (Sigma, St. Louis, МО) в PBS и планшеты дополнительно инкубировали в течение 5 ч при 37C,5% CO2 и 95% влажности. Планшеты исследовали на анализаторе Synergy2 (Biotek, Winooski, VT), используя длины волн возбуждения 540 нм и испускания 600 нм. Для вычисления значений IC50 данные анализировали при помощи программного обеспечения Prism (Graphpad, San Diego, CA). Клетки А 375, HT-29 и Colo-205 (АТСС) имели мутацию V600E. Клетки НСТ-116 (АТСС) содержали B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras, а клетки SK-Mel-2 (АТСС) содержали B-Raf дикого типа с мутацией N-Ras. Данные, приведенные в табл. 4, подтверждают, что предложенное соединение подавляет пролиферацию и жизнеспособность конкретных клеток, имеющих указанные мутации, в этом исследовании. Ингибирующая активность в отношении пролиферации и жизнеспособности. Тестировали ингибирующую активность соединения согласно примеру 1 в отношении пролиферации и жизнеспособности широкого набора клеточных линий опухолей человека в исследованияхCellTiter-Glo. В целом, в исследовании CellTiter-Glo (Promega) клетки выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Thermo Scientific) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS,Invitrogen). Клетки (5103), которые выдерживали в питательной среде, помещали в 96-луночные планшеты с покрытием поли-D-лизина (BD Biosciences) за день до начала обработки. Клетки обрабатывали в течение 48-72 ч, после чего проводили анализ пролиферации и жизнеспособности в люминесцентном исследовании жизнеспособности клеток CellTiter-Glo согласно инструкциям производителя (Promega) на планшетном анализаторе SpectraMax (Molecular Devices). Для расчета значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) использовали нелинейную регрессию и сигмоидальные кривые зависимости доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 4. Для определения чувствительности соединения согласно примеру 1 дополнительно исследовали клеточные линии гематологических раковых заболеваний с B-Raf дикого типа с мутацией N-RAS. Мутации, активирующие N-Ras, распространены при гематологических раковых заболеваниях, возникая с частотой 10-30%. Исследовали две клеточные линии меланомы с мутантной B-Raf V600E (А 375 и SKMel-28), девять гематологических клеточных линий с мутацией N-Ras (HL-60, THP-1, TALL-1, C8166,Н 9, IM-9, GA-10 клон 4, P31-FUJ, MOLT-4) и семь клеточных линий с N-Ras дикого типа (LOUCY, HEL,U266, ЕВ 2, Р 30-ОНК, NOMO-1, CCRF-CEM), определяли значения IC50. Несмотря на то, что между значениями чувствительности указанных клеточных линий имеются некоторые различия, 7 из 9 клеточных линий гематологических раковых заболеваний с B-Raf дикого типа с мутациями N-Ras были чувствительными к соединению согласно примеру 1 в субмикромолярной концентрации (IC50 1 мкмоль). Таблица 5 Ингибирующая активность соединения согласно примеру 1 в отношении пролиферации и жизнеспособности клеток, в нмоль Приведенные выше данные подтверждают, что клетки меланомы A375 чувствительны к соединению согласно примеру 1. В число наиболее чувствительных клеточных линий по результатам данного скрининга входят клетки HepG2 и ТНР-1. HepG2 получали из линии печеночноклеточной карциномы,ТНР-1 является клеточной линией ОМЛ, оба типа клеток содержали активирующие мутации N-RASB-Raf дикого типа. Данные подтверждают универсальную ингибирующую активность в отношении Raf и нарушение активации предшествующего сигнала при использовании соединения согласно примеру 1 в этом исследовании. Соединение согласно примеру 1 ингибирует рост клеток НСТ-116 с мутацией K-Ras. Мутация K-Ras B-Raf дикого типа является одной из наиболее распространенных и важных мутаций при многих типах раковых заболеваний, включая рак поджелудочной железы, легких и колоректальный рак (Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682). Мутация K-Ras приводит к активации каскадаRas/Raf/MEK/MAPK, который вносит вклад в трансформацию и злокачественное развитие клеток. Для определения активности соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации клеток с B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras в исследовании пролиферации и жизнеспособности клетокCellTiter-Glo использовали клетки НСТ-116 (АТСС), содержащие B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras. Соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток НСТ-116 с B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras зависящим от дозы образом, значение IC50 составляло 178 нмоль. Эти данные подтверждают, что ингибирующая активность соединения согласно примеру 1 в отношении Raf препятствует возникновению нарушенного активированного предшествующего сигнала в указанном исследовании. Соединение согласно примеру 1 подавляет рост опухолевых клеток с мутацией N-Ras. Мутация N-Ras часто происходит при меланоме, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и раке печени (Bos, Cancer Research, 1989, 49(17): 4682). Мутации N-Ras в B-Raf дикого типа приводят к активации МАРК посредством белков Raf, в частности C-Raf. Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления пролиферации опухолевых клеток с B-Raf дикого типа с мутацией N-Ras, клеточной линии меланомы человека SK-Mel-2, имеющей мутацию N-Ras Q61R и B-Raf дикого типа (АТСС), тестировали в исследовании CellTiter-Glo для определения подавления пролиферации и жизнеспособности клеток, также проводили вестерн-блот анализ. Иммуноблоттинг (вестерн-блот). Исследование проводили для дозы 0 и 11 доз, полученных путем последовательного разбавления, в диапазоне от 0,17 до 10000 нмоль. Лизаты белков получали путем обработки клеток лизисным буферомRIPA производства Millipore. Вестерн-блот анализ проводили, по существу, согласно описанию, данному в Yadav et al., Molecular Carcinogenesis, 2011, 50: 346-52. Вкратце, проводили ДСН-ПААГ-электрофорез клеточных лизатов с общим содержанием белка 20 мкг с использованием трисглициновых гелей Novex(Invitrogen) с градиентом 4-20%. Белок переносили на мембраны с 0,45 мкмоль нитроцеллюлозой с использованием трансферного буфера NuPAGE (Invitrogen) и 10% метанола при 100 В, 4 С в течение 1 ч. В целом, использовали первичное антитело в разбавлении 1:1000 и вторичное антитело в разбавлении 1:20000. Белки детектировали с использованием системы визуализации инфракрасного спектра Odyssey(Li-COR Biosciences). Антитела к ERK1/2, фосфо-ERK1/2, фосфо-MEK1/2 и актину получали в Cell Signaling Technology. Соединение согласно примеру 1 ингибировало зависящим от дозы образом фосфо-MEK и фосфоERK в клетках SK-Mel-2, имеющих мутацию N-Ras Q61R и B-Raf дикого типа согласно данным вестернблот анализа. Активность фосфо-ERK, по существу, пропадала при 370 нмоль дозе. Соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток SK-Mel-2 в исследовании CellTiter-Glo, значение IC50 составляло 188 нмоль. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток SK-MEL-2, имеющих В-Raf дикого типа и мутацию N-Ras Q61R в указанном исследовании. Активность соединения согласно примеру 1 в отношении подавления клеток меланомы, резистентных к вемурафенибу. Вемурафениб (PLX4032) и PLX4720 являются ингибиторами B-Raf с мутацией V600E (Johannessenet al., Nature, 2010, 468: 968-72; Montagut et al., Cancer Res. 2008, 68: 4853-61; Wagle et al., Journal of Clinical Oncology, 2011, 29: 3085-96). У некоторых пациентов, у которых изначально происходил ответ на терапию с использованием вемурафениба, развивалась лекарственная резистентность, и в среднем в течение 7 месяцев они становились нечувствительными к лечению, Whittaker et al., Sci Transl Med. 2010,2: 35-41. Клеточную линию с резистентностью к вемурафенибу получали путем долгосрочной обработки клеточной линии меланомы человека A375 (АТСС), имеющей мутацию B-Raf V600E, с использованием увеличивающихся концентраций PLX4720. Получение клеточной линии меланомы с B-RAF V600E, резистентной к ингибированию B-RAF. Для получения резистентных клеток клетки А 375 B-Raf V600E (АТСС) выращивали в питательной среде, такой как описано выше для исследования CellTiter-Glo, в присутствии N-[3-(5-хлор-1Hпирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамида (PLX4720; коммерчески доступный селективный ингибитор B-Raf) в концентрациях, постепенно повышающихся от 0,02 до 2 мкмоль в течение примерно 4 месяцев, с использованием 30 пересевов с получением резистентной клеточной линии, обозначенной как A375res. Резистентность A375res к вемурафенибу и PLX4720 подтверждали по повторной активации МАРК в вестерн-блот анализе и сдвигу значений IC50 в отношении пролиферации и жизнеспособности клеток в исследовании CellTiter-Glo.PLX4032 значительно теряет активность в отношении указанных клеток A375res, происходит ее примерно 30-кратное изменение от 252 нмоль до более чем 7 мкмоль. Активность соединения согласно примеру 1 в отношении указанных резистентных клеток выражается значением IC50 34 нмоль, что соответствует только 3-кратному изменению по сравнению с 11 нмоль. Эти данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 подавляло пролиферацию и жизнеспособность клеток A375res в указанном исследовании. Соединение согласно примеру 1 вызывает минимальную активацию парадоксального пути. В опубликованных недавно исследованиях (см. выше) было выдвинуто предположение, что специфические ингибиторы B-Raf, такие как вемурафениб (PLX-4032), индуцируют "активацию парадоксального пути" посредством димеризации B-Raf и других изоформ Raf в окружении B-Raf дикого типа. Вемурафениб не одобрен для лечения раковых пациентов с меланомой с генетическим окружением B-Raf дикого типа. Полагают также, что активация указанного парадоксального пути является причиной побочных эффектов на коже (таких как плоскоклеточная карцинома) у некоторых пациентов с меланомой,которым проводили лечение с использованием вемурафениба. Соединение согласно примеру 1 тестировали в отношении клеток НСТ-116 (АТСС), имеющихB-Raf дикого типа и мутацию K-Ras, в исследовании жизнеспособности CellTiter-Glo. Исследование проводили для дозы 0 и 11 доз, полученных путем последовательного разбавления, от 0,17 до 10000 нмоль. Проводили оценку активности фосфо-MEK и фосфо-ERK при помощи иммуноблоттинга (вестерн-блот анализа). Соединение согласно примеру 1 вызывало минимальную активацию парадоксального пути и сохраняло ингибирующую активность в отношении фосфо-MEK и фосфо-ERK для клеток НСТ-116, имеющих генетическое окружение B-Raf дикого типа и K-Ras. Соединение согласно примеру 1, по существу, устраняло сигнал фосфо-ERK в дозах более 41 нмоль в указанном исследовании. С учетом того, что соеди- 24024824 нение согласно примеру 1 также ингибирует C-Raf (предыдущие исследования, см. выше), полагают, что активация парадоксального пути не происходит. Соединение согласно примеру 1 подавляет рост опухолевых клеток с мутацией B-Raf V600E. Мутации B-Raf, в частности B-Raf V600E, при раковых заболеваниях человека часто наблюдают при злокачественных образованиях у человека, включая меланому, колоректальный рак, рак легких и яичников. Эта мутация B-Raf может вызывать конститутивную активность киназы и злокачественную трансформацию. Соединение согласно примеру 1 тестировали в исследовании CellTiter-Glo с использованием трех клеточных линий меланомы А 375 (АТСС), WM-266-4 (АТСС) и SK-Mel-28 (ATCC) и двух клеточных линий опухоли толстой кишки НТ-29 (АТСС) и Colo-205 (АТСС); все пять клеточных линий имели мутацию B-Raf V600E. Таблица 6 Активность соединения согласно примеру 1 в отношении опухолевых клеток, имеющих мутацию B-Raf Соединение согласно примеру 1 подавляло жизнеспособность трех клеточных линий меланомы,А 375, WM-266-4 и SK-Mel-28, со значениями IC50, составляющими 9,2, 52,9 и 29 нмоль, соответственно. Аналогично, соединение согласно примеру 1 подавляло жизнеспособность двух клеточных линий опухоли толстой кишки, НТ-29 и Colo-205, со значениями IC50, составляющими 7,3 и 27 нмоль. Данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 обладает активностью в отношении подавления жизнеспособности и роста опухолевых клеток с мутацией B-Raf V600E в указанном исследовании. Соединение согласно примеру 1 также ингибировало активность фосфо-MEK и фосфо-ERK в клетках А 375, которые исследовали выше, проводили дополнительную оценку при помощи вестерн-блот анализа, который подтвердил ингибирование нисходящего сигнала зависящим от дозы образом. Активность фосфо-ERK, по существу, пропадала при 41 нмоль. Активность in vivo. Для оценки активности соединения согласно примеру 1 in vivo использовали модели ксенотрансплантатов опухолей А 375 V600E (АТСС) и НСТ-116 с B-Raf дикого типа с мутацией K-Ras (АТСС). Вкратце, 10106 клеток (А 375) или 5106 клеток (НСТ-116) в смеси 1:1 среды и матригеля (общий объем 0,2 мл) имплантировали путем подкожной инъекции в заднюю лапу самок бестимусных крыс (МодельNIHNIHRNU-M от Taconic). Для исследования эффективности использовали всего 8 крыс в каждой группе, а для исследования фармакодинамики использовали всего 3-4 крыс в каждой группе. Комитет по содержанию и использованию животных компании Eli Lilly and Company одобрил все протоколы экспериментов. Лечение начинали с перорального введения (принудительного) соединения согласно примеру 1 или носителя (20% Captisol, 25 ммоль фосфат, рН 2,0) в объеме 0,6 мл, когда размер опухоли достигал примерно 500 мг. Соединение согласно примеру 1 вводили перорально два раза в сутки в дозировках 5, 10, 15 и 20 мг/кг в течение 21 дня в модели ксенотрансплантата A375 или 15 и 30 мг/кг в течение 21 дня в модели ксенотрансплантата НСТ-116. Рост опухоли и массу тела отслеживали со временем для оценки активности и признаков токсичности. Измерения размеров опухоли в двух измерениях проводили два раза в неделю, объем опухоли рассчитывали на основании значений длины по средней оси и ширины по средней оси. Данные объема опухоли переводили в логарифмическую шкалу для выравнивания дисперсии по времени и группам лечения. Логарифмированные данные значений объема анализировали при помощи двухфакторного дисперсионного анализа повторных измерений, рассматривая время и группу лечения, при помощи инструмента MIXED в программном обеспечении SAS (версия 8.2). Корреляционная модель повторных измерений является пространственной. Группы лечения сравнивали с контрольной группой для каждого момента времени. Инструмент MIXED также использовали для каждой группы лечения в отдельности для вычисления скорректированных средних значений и стандартных ошибок для каждого момента времени. В обоих анализах учитывали автокорреляцию для каждого животного и потерю данных, которая происходила в случае, когда животных с крупными опухолями досрочно выводили из исследования. Строили графики зависимостей скорректированных средних значений и стандартных ошибок для каждой группы лечения от времени. В моделях ксенотрансплантатов A375 во всех группах, которым вводили дозы соединения, происходило подавление роста опухоли и обращение вспять роста опухоли, ни в одной из этих групп снижения массы тела животных не наблюдали. В модели ксенотрансплантатов НСТ-116 в группе, которой вводили 30 мг/кг соединения, наблюдали статистически значимое подавление роста опухоли. Эти данные свидетельствуют об активности соединения согласно примеру 1 in vivo и подтверждают корреляцию данных, полученных в ферментных исследованиях, исследованиях клеточных лизатов и пролиферации клеток, с активностью in vivo. В отдельном исследовании, которое проводили для оценки фармакодинамического (ФД) действия соединения согласно примеру 1 в модели ксенотрансплантата А 375, проводили испытание единственной дозы в диапазоне от 3,125 до 50 мг/кг. Через 2 ч после введения единственной дозы наблюдали зависящее от дозы ФД действие, которое подтверждали путем вестерн-блот анализа. Во всех группах, которым вводили дозу, наблюдали ингибирование фосфо-MEK и фосфо-ERK, а доза 25 мг/кг практически полностью подавляла активность фосфоMEK и фосфо-ERK в этой модели. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину, или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение по п.1, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину. 3. Соединение по п.2, представляющее собой 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2(метиламино)пиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил)фенил)мочевину в кристаллической форме, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой, имеющей характеристические пики, в 20,2, при 16,0 и при одном или более из 6,9, 7,0, 18,2 и 23,2. 4. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. 5. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. 6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 и поливинилпирролидонвинилацетат (ПВП-ВА). 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что ПВП-ВА представляет собой Kollidon VA 64. 8. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии рака. 9. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения рака. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака яичников, меланомы, острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и колоректального рака. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой меланому. 12. Применение по п.10, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой колоректальный рак.