Применение козьей сыворотки, полученной иммунизацией козы вич, для изготовления лекарственных средств
Номер патента: 13517
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Далглиш Ангус Дж., Уайт Стэнли Д.Т., Кадоган Мартин, Хинни Джонатан
Формула / Реферат
1. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.
2. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения артрита.
3. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения неврита.
4. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения хронического воспалительного состояния нервной системы.
5. Применение по любому из пп.1-4, где сыворотка козы содержит антитела к HLA.
Текст
013517 Настоящее изобретение относится к терапевтическому агенту, в частности, но не исключительно, к терапевтическому агенту для лечения заболеваний, в которые вовлечен пролиферативный иммунный ответ. Предпосылки к созданию изобретения Международная заявка WO 97/02839 относится к подавлению вирусов, лечению и профилактике вирусных инфекций. Она относится к способу выработки нейтрализующих антител для лечения вирусной инфекции у пациента, включающему в себя следующие стадии:a) воздействие на млекопитающее вирусом таким образом, чтобы указанное млекопитающее вырабатывало нейтрализующие антитела против указанного вируса, иb) выделение указанных нейтрализующих антител от указанного млекопитающего. В приведенных примерах вакцину против ВИЧ, обозначенную AAV2, получают, смешивая вирус ВИЧ с ВИЧ-нейтрализующими антителами, полученными от козы. Международная заявка WO 01/60156 относится к композициям нейтрализующих антител и иммуномодулирующим усиливающим иммунный ответ композициям. Она относится к иммуномодулирующей композиции, включающей в себя гетерологичные антитела, специфичные в отношении антигена, и антиген, причем гетерологичные антитела образуют комплекс с антигеном для объединения с фармацевтическим носителем. Данные примеры сходны с примерами в международной заявке WO 97/02839, и вакцину против ВИЧ, обозначенную AAV2, также получают, смешивая вирус ВИЧ с ВИЧ-нейтрализующими антителами, полученными от козы. Международная заявка WO 02/07760 относится к терапевтическому агенту. Она относится к способу профилактики ВИЧ-инфекции или лечению индивида, инфицированного ВИЧ, который включает в себя следующие стадии:(1) воздействие ВИЧ на иммунную систему козы;(2) выделение из организма козы антител после антигенной стимуляции ВИЧ и(3) лечение индивида антителами, полученными на стадии 2 выше. В ходе предварительных клинических испытаний продукта на основе антител, полученных, как описано в WO 02/07760, пациентов с ВИЧ успешно лечили сывороткой, полученной от козы после антигенной стимуляции ВИЧ. Предпочтительно при лечении используется сывороточная композиция, которую можно получить с помощью процесса, включающего в себя выработку эффективных антител у козы, взятие крови у козы,демонстрацию ВИЧ-нейтрализующей способности взятой крови, осаждение твердых веществ с использованием перенасыщенного раствора сульфата аммония или другого подходящего осаждающего агента,отделение осадка, растворение осадка в подходящей водной среде и диализ раствора с отсекающей величиной от 5 до 50000 Да, предпочтительно от 7 до 30000 Да, более предпочтительно от 8500 до 10000 Да,особенно около 10000 Да. Способ иммунизации козы может быть внутримышечным, но также можно использовать и другие стандартные методики, такие как подкожное или внутрикожное введение. Процесс выделения также можно выполнять с помощью других общепринятых способов фракционирования(например, с каприловой кислотой), обеспечивающих использование всего остатка. Более конкретно для лечения обычно применяют сыворотку козы, полученную следующим путем. Пример получения сыворотки козы Козе вводили посредством внутримышечной инъекции лизированный вирус ВИЧ-3b, суспендированный в обычной коммерчески доступной надосадочной жидкости, с использованием внутримышечной инъекции ВИЧ-3b в концентрации 109 вирусных частиц на 1 мл. Вирус предварительно убивали нагреванием до 60 С в течение 30 мин. Образцы крови отбирали после подходящего интервала, например в две недели, для исходной оценки. При оптимизированной процедуре козе производили инъекции каждую неделю в течение четырех недель, затем в шесть недель у животного брали кровь для получения реагента. В стерильных условиях у козы брали около 400 см 3 крови. Область введения иглы брили и обрабатывали бетадином. Для взятия приблизительно 400 см 3 крови у животного использовали иглу калибра 18. Следует отметить, что животное может перенести взятие крови в объеме около 400 см 3 без какого бы то ни было вреда. Животное не нужно умерщвлять. У животного можно повторно брать кровь приблизительно через 10-14 дней после того, как оно восстановит объем крови. Получали подтверждение наличия потенциально пригодных антител. После подтверждения наличия указанных реагентов у козы затем брали кровь между 4-6 неделями и центрифугировали для отделения сыворотки. 300 мл сыворотки затем фильтровали для удаления больших сгустков и твердых частиц. Затем сыворотку обрабатывали перенасыщенным раствором сульфата аммония (45% раствором при комнатной температуре), для осаждения антител и другого материала. Полученный раствор центрифугировали при 5000 об./мин в течение 5 мин, после чего удаляли надосадочную жидкость. Осажденный иммуноглобулин ресуспендировали в объеме физиологического раствора с фосфатным буфером (буфер-1 013517 растворения осадка. Раствор затем диализировали через мембрану с отсекающей величиной молекулярной массы 10000 Да. Диализ проводили в буфере PBS, который меняли каждые 4 ч в течение 24 ч. Диализ проводили при 4 С. После 24-часового диализа содержимое диализного мешка переносили в стерильный химический стакан. Производили доводку раствора таким образом, чтобы величина массы на единицу объема составляла 10 мг на 1 мл. Разбавление осуществляли с использованием PBS. Полученный раствор затем фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильный контейнер. После фильтрования раствор разделяли на аликвоты однократных доз по 1 мл и хранили при -22 С до использования. Реагент затем был готов для применения. В данную процедуру можно вносить изменения, такие, например, как изменения концентрации раствора сульфата аммония или использование других реагентов. Подобно этому, отсекающая величина при диализе не обязательно должна составлять 10000 Да. Изобретение В части лечения с использованием сыворотки козы были отмечены другие благоприятные результаты. Например, у пациентов с ВИЧ, страдающих диабетом I типа, было отмечено улучшение не только в отношении их основной ВИЧ-инфекции, но также и симптомов диабета. У пациентов с ВИЧ, страдающих определенными видами злокачественных опухолей, отмечали ремиссии в отношении злокачественных опухолей, а также симптомов ВИЧ. Обнаружение значительного клинического улучшения у пациентов, инфицированных ВИЧ, а также у пациентов с другими состояниями, такими как рассеянный склероз (PC) и некоторые виды злокачественных опухолей, свидетельствует о наличии между ними той потенциальной связи, что все указанные заболевания представляют собой хронические воспалительные состояния. В соответствии с настоящим изобретением, авторы установили, что сыворотка козы обязана своей активностью наличию анти-HLA-активности. К удивлению авторов, им легко удалось продемонстрировать, что козы, иммунизированные ВИЧ,продуцируют сыворотку, которая способна остановить реакцию смешанного лимфоцитарного ответа,которая представляет собой один из классических анализов активации, используемых in vitro. Авторы,полагая, что этот факт может представлять собой некое свойство, присущее сыворотке козы, подчеркивают, что сыворотки от коз, которым инъекции не производились, не обладали никакой активностью в упомянутых анализах. Авторы показали также, что указанная активность тесно связана с активностью против антител кHLA класса II. Авторы не знают, связано ли это с молекулярной мимикрией или распознает ли организм козы HLA класса II, которые несет вирус по мере своего размножения и высвобождения из инфицированных клеток, или что молекулы HLA (молекулы МНС) распространяются отдельно от вируса, но выделяются вместе с ним, так, что антитела вырабатываются также и против указанных компонентов клеточной оболочки. На самом деле для авторов не остался незамеченным тот факт, что молекулы клеточной оболочки, такие как рецепторы хемокинов и родственные молекулы, также могут находиться в препарате и индуцировать антительные ответы, которые модулируют благоприятный терапевтический эффект. Однако если это действительно происходит, представляется, что анти-HLA-ответы являются очень доминантными, и авторы полагают, что это может играть значительную, но не необходимую, отдельную роль в индукции наблюдавшихся противовоспалительных ответов. Авторы исследовали сыворотки от разных коз, иммунизированных различными вирусными/клеточными препаратами, и могут показать, что смесь антигенов, инъецированная козам, вызывает иммунный ответ, который распознает многие из криптических, т.е. молчащих, частей оболочки ВИЧ,которые могут быть очень важны для создания будущей вакцины. Одна особенность настоящего изобретения относится к антителу, которое распознает антиген HLA класса II, для применения при заболевании, в которое вовлечен пролиферативный иммунный ответ. При высоких титрах антител против HLA как класса I, так и класса II в сыворотках, те из них, которые имеют самые высокие уровни антител, являются теми сыворотками, которые останавливают реакцию смешанного лимфоцитарного ответа наиболее эффективно, и, как представляется, обладают наилучшей эффективностью в клинической ситуации. Неожиданно авторы установили, что уровни антител против FAS, главного лиганда апоптоза, были чрезвычайно высоки. На самом деле, они коррелировали с антителами против МНС класса II. Не имея намерения связывать себя какой-либо теорией, авторы выдвинули гипотезу, которая заключается в том,что высокий титр антител против FAS может приводить к немедленному апоптозу через несколько минут после связывания антитела с антигеном FAS, и клетки могут быть убиты. Это может привести к ингибированию токсичных хемокинов, которые, как полагают, принимают участие в инвалидизации приPC. Таким образом, в настоящем изобретении авторы сообщают, что антитела против FAS могут играть важную роль для лечения ВИЧ, рассеянного склероза и других состояний и могут оказывать при лечении совместное благоприятное действие с другими антителами против класса II и класса I.-2 013517 Одна особенность настоящего изобретения относится к анти-FAS-антителу для применения при лечении заболевания, поддающегося указанному лечению. Кроме того, настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим анти-HLAантитело и/или анти-FAS-антитело, и к способам лечения с использованием указанных комбинаций. Основное применение настоящего изобретения относится к сывороткам, содержащим анти-HLA-, в качестве лечения заболеваний, при которых наблюдаются патологически высокие уровни HLA. Указанные заболевания включают в себя рассеянный склероз, ревматоидный артрит, сахарный диабет, первичный билиарный цирроз, аутоиммунный цирроз и аутоиммунные состояния при вирусе b и с, поражающие сердце, легкие, кожу, желудочно-кишечный тракт, почки, головной мозг, ЦНС. Более обобщенно,состояния, которые можно лечить с использованием настоящего изобретения, включают в себя ВИЧ,воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, повреждение аксонов или нервов или связанные с ними нарушения, или злокачественные опухоли и другие заболевания или состояния с участием воспалительного компонента. Присутствие анти-FAS делает сыворотки особенно подходящими для заболеваний, связанных с хронически активированными клетками, которые могут секретировать повреждающие мессенджеры,такие как цитокины и хемокины. Указанные заболевания включают в себя рассеянный склероз, все формы хронических воспалительных состояний нервной системы, а также хронические инфекции, такие как вирусные, бактериальные и тропические, злокачественные опухоли, связанные с хроническими воспалительными повреждениями, в частности, легких, поджелудочной железы, печени, кишечника, лимфатических узлов, кожи, особенно чешуйчатоклеточный и базально-клеточный рак; также благоприятным может быть указанное лечение для первичных и вторичных опухолей головного и спинного мозга. Наблюдающиеся улучшения функции нервной системы у людей с травматическими повреждениями нервов наводят на мысль о свойстве фактора роста нейронов и, следовательно, о возможном применении при травме, постинфекционных поражениях, болезни Гийена-Варре, злокачественном повреждении и т.п., невропатиях, связанных с диабетом, алкоголизмом, отравлением металлами или другими токсинами и т.п. Наблюдающееся благоприятное действие на волосы и тон и цвет кожи предполагают другие уникальные свойства, которые нельзя объяснить приведенными выше наблюдениями, относящимися к антителам, и т.п., которые имеются в настоящее время, т.е. действие против старения; сообщения о снижении вторичной раковой активности под действием данной сыворотки предполагают прямую противораковую активность, которая может быть связана с активностью FAS, но также может быть связана с еще неидентифицированными агентами. В одном аспекте антитело предпочтительно получают от козы, которую вакцинировали против бешенства. Как вариант, настоящее изобретение относится к антителу, получаемому от лошади, овцы и других подходящих животных. Антитело можно получать способом, сходным с описанным для получения антитела от козы, и оценивать на предмет анти-HLA- и/или анти-FAS-активности. В еще одном варианте применение вируса ВИЧ в качестве иммуногена для получения антитела не является необходимым, и для получения эффективного препарата антител в качестве иммуногена используют человеческие белые кровяные клетки или мембранные антигены клеточных линий, полученных от человека. Кроме того, авторы рассматривают возможность замены антитела на иммуноген, т.е. возможность того, что терапевтическая композиция может содержать материал ВИЧ или белые кровяные клетки. Еще в одном варианте после инактивации нагреванием надосадочный раствор, в котором выращивалась вирусная культура, или другой раствор, подходящий для этих целей, но который не использовали для выращивания культуры, также можно использовать в качестве иммуногена, который будет продуцировать желательный антительный ответ. Любой надосадочный раствор или другую среду, которая подходит для выращивания in vitro ВИЧ или другого вируса, можно использовать для получения приемлемого иммуногена, который будет вызывать эффективный антительный ответ. В качестве примера приводится надосадочная жидкость ростовой среды для клеточных линий, таких как РМВС или раковая бессмертная клеточная линия, которая используется для выращивания ВИЧ IIIb. ВИЧ или другой выбранный вирус не обязательно должен присутствовать для получения эффективного иммуногена для создания препарата антител. Предпочтительно антитело согласно изобретению представляет собой поликлональное антитело,которое распознает спектр антигенов HLA класса II и антигена gp 120, или которое распознает FAS. Данные, полученные авторами, предполагают, что предпочтительно иметь антиген HLA класса II. Подходящие антитела можно получить, применяя в качестве иммуногена подборку антигенов,предпочтительно смесь антигенов. Возможно, использование ряда различных антигенов способствует выработке антитела, которое распознает общие структуры антигенов, вызывая более сильный ответ у пациента. Авторы выдвинули гипотезу о том, что селекция изолятов ВИЧ дает эпитопы с минимальными структурными вариациями, и в результате получается панантитело. Таким образом, для получения сыворотки авторы предпочитают применять смесь различных вирусов ВИЧ, выращенных, главным образом, на РВМС, а не использовать только Т-клетки в отдельности.-3 013517 Удобно, если смесь содержит 2, 3, 4, 5, 6 или более указанных вирусов. Вирусы предпочтительно находятся в форме лизатов. Примеры предпочтительных лизатов включают в себя следующие изоляты ВИЧ 1: 91US056, 92 НТ 593, 92US723, 92US657, 92US660 и 92US714. Предпочтительно смесь включает в себя по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 из указанных конкретных изолятов. Активация клеток, например, с помощью Конканавалина А (Con А) может давать преимущества, и,например, с использованием Con А можно достигать более высоких уровней антидофаминовой активности. SHULA (неактивированный) не вызывает достоверного подъема антидофаминовых R-уровней по сравнению с фоновыми уровнями, определяемыми по О.П. Между тем, ВИЧ 3 В (среднее от 12 коз и кролика) это делает. Наблюдался также подъем R-уровней дофамина среди клеток РВМС, активированныхCon-А, в смеси. Еще в одном варианте надосадочный раствор, подходящий для выращивания in vitro вируса ВИЧ,но не ограничиваясь ВИЧ, будет супернатантом клеток РВМС или другой средой, такой как среда из-под бессмертной клеточной линии, такой, которая используется, например, для выращивания ВИЧ IIIb, сама по себе, без внедрения вируса, если вирус ВИЧ, убитый нагреванием обычным способом, не должен присутствовать, дает эффективный препарат антител. Указанные антитела также можно получить с использованием белков, содержащих пептиды, выделенные из лизатов ВИЧ, синтетических пептидов, бактериальных слитых белков и белков/пептидов из филогенетически неродственных источников, которые содержат или имитируют желательную клеточную культуру или другой надосадочный дебрис. Можно получить и исследовать антитела против лизата. Не будучи связанными имеющейся в настоящее время теорией, авторы предполагают, что антитело согласно изобретению действует угнетающе на клеточную пролиферацию того вида, который требуется для ВИЧ или для других условий, требующихся для данного иммунного ответа. Так, например, настоящее изобретение находит применение для лечения рассеянного склероза. Теперь зная, как важны анти-HLA- и анти-FAS-активности антитела из сыворотки козы, можно оценить вероятную пригодность ряда указанных сывороток козы. Простой анализ может дать возможность оценить наличие анти-HLA- и/или анти-FAS-активности и позволить идентифицировать сыворотку-кандидат, подходящую для введения пациентам. Согласно настоящему изобретению создан способ изготовления сыворотки, особенно сыворотки козы, который включает в себя введение одного или более, предпочтительно, по меньшей мере, нескольких, изолятов ВИЧ животному, ожидание развития иммунного ответа, взятие крови у животного, мониторинг наличия анти-HLA-антитела и/или анти-FAS-антитела и изготовление анти-HLA- и/или антиFAS-сыворотки, пригодной для лечения человека. Обычно будет использовано множество животных, и животных можно оценивать с точки зрения наибольшего выхода эффективной сыворотки. Указанных лучших животных можно затем разводить для получения линии животных, особенно пригодных для реализации настоящего изобретения. Обычно процедуры контроля качества будут адаптированы таким образом, чтобы убедиться в наличии анти-HLA-антитела, обычно ряда анти-HLA-антител, и/или анти-FAS-антитела, обычно ряда антиFAS-антител. Можно проводить корреляции между сериями, чтобы получить стандартизированный продукт. Основываясь на способности сыворотки резко ингибировать MLR, предполагают, что данная сыворотка может действовать как мощный противовоспалительный агент. Существует ряд механизмов, посредством которых это может происходить, и ингибирование распознавания HLA представляет собой один из наиболее вероятных. Другой механизм действия вполне может объясняться тем фактом, что в активности такой козьей плазмы участвует комплемент, поскольку это единственная активность, о которой известно, что ее предотвращает термическая обработка. Комплемент вполне способен придавать активность ослабленным детекторным механизмам пациента. Например, уничтожение вирусов и опухолевых клеток с помощью нацеленных антител, а также уничтожение, опосредованное клетками и направленными антителами, оба, требуют комплемента, и наблюдается тотальное отсутствие эффекта механизма в отсутствие комплемента. Кроме того, изобретение относится к композиции, включающей в себя активный компонент, который может быть получен из крови козы после должным образом проведенной антигенной стимуляции,посредством методики получения сыворотки, которая не предназначена для выделения отдельных, специфичных антител. В частности, в изобретении рассматривается вопрос о выделении активного компонента, возможно, смеси совместно действующих анти-HLA-антител и/или FAS-антител, из сыворотки крови козы после антигенной стимуляции, без истощающей очистки и экстракции для получения отдельного антитела. Обычно инъекция человеку антител, полученных от хозяина, не являющегося человеком, противопоказана. Против самих чужеродных антител обычно развивается мощный иммунный ответ. Однако неожиданно было установлено, что применение экстракта сыворотки козы не провоцирует иммунных реакций, которые прогнозируются после введения других чужеродных животных белков. Инъекцию экстракта сыворотки козы переносят как пациенты со сниженной функцией иммунной системы, так и здоровые люди.-4 013517 В настоящем изобретении особым образом применяется экстракт сыворотки, который, возможно,включает в себя общую популяцию молекул антител, полученную от козы после антигенной стимуляции ВИЧ. Не желая быть связанными теорией, авторы полагают, что подобный подход обладает значительными преимуществами. У пациентов, которых лечили экстрактом сыворотки, наблюдалось выраженное благоприятное действие через минуты после введения. Убитый вирус инъецируют специально идентифицированной козе путем внутримышечной инъекции и позволяют инкубироваться, после чего производят взятие определенного количества крови и обрабатывают соответствующим образом. Сыворотку необязательно тестируют на желаемую антительную активность и, необязательно, на одну или более антигибридизационных способностей, на нейтрализацию вируса СПИД, на ее способность усиливать фагоцитоз и на ее приемлемость для человеческого организма. После инокуляции выбранной козе вируса ВИЧ был отмечен иммунный ответ после воздействия чужеродным белковым антигеном, в соответствии с более ранними исследованиями. Извлеченную сыворотку затем подвергали дальнейшей обработке, чтобы подготовить ее для применения у человека. Реагенты, выработанные в ответ на инокуляцию животному ВИЧ и модифицированные и очищенные с помощью настоящих процедур, как было показано, вызывают полное обратное развитие комплекса СПИДа. Объяснение того, как это происходит на самом деле, является сложным, однако результатом введения индивиду, который является ВИЧ-положительным или имеет полностью развившийся СПИД, является следующее. 1. Почти немедленное улучшение качества жизни пациентов. 2. Генерируется пролиферация клеток CD4 и CD8, в результате чего повышается содержание клеток CD4 и CD8. 3. Снижение у пациентов вирусной нагрузки до теоретического нуля, обычно с инкрементом 0,5log. 4. Сокращение величин Р 24 до нуля. По сути, это означает, что возможно возвращение иммунной системы пациентов к норме и что возможно элиминировать вирус, хотя то, как долго это состояние будет продолжаться, в настоящее время не известно, при трех годах и продолжающемся в настоящее время наблюдении. Приблизительно двести человек в возрасте 10 лет и старше, обоих полов, успешно лечили данным лекарственным средством; при этом ни один из них не имел рецидивов и не страдал от каких бы то ни было побочных эффектов. Лечение осуществлялось посредством подкожной инъекции, в количествах, варьирующих от одной десятой до десяти см 3, и было устроено таким образом, чтобы как можно быстрее доставить лекарственное средство в лимфатическую систему. Согласно настоящему изобретению предпочтительная доза для ВИЧ-инфицированного пациента обычно составляет 1 мл еженедельно или как потребуется, в виде разделенной дозы с введением в обе руки. Введение каждые 2 или 3 недели становится обычным, затем каждые 3 месяца. Для пациентов со злокачественными опухолями наилучшим представляется введение 0,3 мл еженедельно. В большинстве случаев лечение проводилось один раз каждые четыре недели в течение периода времени три месяца. Были сделаны следующие наблюдения: 1. Депрессия, от умеренной до тяжелой, подвергалась обратному развитию менее чем через 60 мин после инъекции. 2. Обычно к пациентам в течение 2 ч после инъекции возвращался аппетит, и они активно искали пищу. 3. В течение приблизительно двух недель после первого введения пациенты начинали набирать вес. 4. Независимые лабораторные исследования подтвердили, что через 4-6 недель после первого введения вирусные нагрузки и величины Р 24 значительно уменьшились и что содержание клеток CD4 иCD8 резко увеличилось. 5. Побочных эффектов не наблюдалось. Важно отметить, что настоящее лекарственное средство, в отличие от имеющихся в настоящее время способов лечения, не требует от пациента строгого почасового или суточного режима и основано на простой инъекции, которую производят еженедельно или ежемесячно. Предпочтительно композиция является очищенной и состоит практически только из очищенного экстракта сыворотки. Еще в одном варианте антитела можно также очищать как целое или отбирать и группировать в соответствии с особыми требованиями при конкретном заболевании в отношении сложной смеси сыворотки или плазмы, с помощью обычной или любой другой подходящей процедуры,включая, без ограничения, например, иммуноаффинную хроматографию, солевое осаждение, ионообменную хроматографию, хроматографию по размерам, аффинную хроматографию, в комбинации, как это необходимо или желательно. Также можно рассматривать, но не обязательно, комбинированную терапию анти-HLA-антителом и/или анти-FAS-антителом согласно изобретению.-5 013517 Экстракт сыворотки козы, полученный, как описано в настоящем документе, можно изготавливать,в соответствии с настоящим изобретением, в виде композиции для ингибирования репликации вируса invitro или in vivo. В качестве такового, настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим в себя реагент козы согласно изобретению, подходящим для лечения заболевания, такого как вирусное заболевание. Реагент согласно изобретению можно смешивать с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями. Примеры фармацевтических композиций включают в себя любую твердую форму (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и т.п.) подходящего состава, или формы для перорального, местного или парентерального введения, и они могут включать в себя носитель. Композиции должны быть стерильными, если предназначаются для парентерального введения. Обычно используют тест-дозу, чтобы увидеть, развивается ли у человека аллергическая реакция на гипериммунную сыворотку козы. Внутрикожная инъекция сопровождается 30-минутным ожиданием,чтобы увидеть, есть ли промежуточная реакция, которая проявляется как отек, эритема и зуд. Если данная реакция отрицательна, то можно сделать предположение о том, что наиболее вероятно, будет наблюдаться реакция гиперчувствительности немедленного типа. Аллергическая реакция, однако, не мешает пациенту принять потенциально спасающее жизнь лечение из-за возможной аллергической реакции. Введение композиции согласно изобретению можно осуществлять любым подходящим способом,таким как внутривенная инфузия, подкожное введение, внутримышечная инъекция, пероральное, интраперитонеальное и внутривенное введение. Адекватная доза будет варьировать в зависимости от конкретной композиции, способа применения и конкретной области, хозяина и состояния, подвергаемых лечению. Должны приниматься во внимание и другие факторы, такие как возраст, масса тела, пол, диета,время введения, скорость экскреции, состояние хозяина, комбинации лекарственных средств, реакции чувствительности и тяжесть заболевания. Введение можно выполнять непрерывно или периодически в пределах максимальной переносимой дозы. Данный продукт, в отличие от имеющихся в настоящее время способов лечения, не требует от пациента строгого почасового или суточного режима его приема и основан на введении простой периодической инъекции. Иммунная система пациентов, которых лечили более двух лет назад и которые остаются в данном проекте, как представляется, стабилизировалась и возвратилась на нормальный оперативный уровень. При лечении ВИЧ данный продукт предназначен для уменьшения воспаления, вызванного ВИЧ,позволяя, таким образом, иммунной системе человека, при отсутствии необходимости в высокотоксичных химических веществах, переориентировать себя против вируса. Данное лекарственное средство, в отличие от его конкурентов, можно использовать в более низких дозах, как профилактическое средство при подозрении на инфекцию, или на ранних стадиях заболевания. В отличие от существующих лекарственных средств, которые зачастую пациенту необходимо принимать ежедневно в течение всей жизни, предлагаемое лечение основано на простой инъекции, которую производит врач еженедельно или ежемесячно. Обычная программа лечения продолжается три месяца, с предполагаемой программой последующего наблюдения в течение шести месяцев, двенадцати месяцев и двух лет, или же по необходимости, если вирус вновь появляется. Композицию согласно изобретению можно применять с другими лекарственными средствами для обеспечения комбинированной терапии. Другие лекарственные средства могут составлять часть этой же композиции или обеспечиваться в виде отдельной композиции для введения в то же время. Изобретение также относится к способу получения защитной композиции, включающей в себя реагент для применения для защиты видов животных, не относящихся к козам; способ включает в себя иммунизацию козы антигеном, не принадлежащим козе (например, вирусом или чужеродным белком), и очистку экстракта сыворотки, полученной от козы после антигенной стимуляции. Реагент затем можно применять для защиты животного, не относящегося к козам, от антигена, использованного в качестве иммуногена. Настоящее изобретение относится также к применению в медицине композиции, включающей в себя экстракт сыворотки козы после антигенной стимуляции человеческим вирусом ВИЧ, и к применению композиции, включающей в себя общую популяцию антител козы после антигенной стимуляции человеческим вирусом ВИЧ для изготовления лекарственного средства для лечения состояний, включая ВИЧ и СПИД. Предпочтительно композицию согласно изобретению обрабатывают путем проведенияодной или всех из следующих процедур: осаждения 45% раствором сульфата аммония, замораживания при -70 С в течение 24 ч или микрофильтрации. Антительный продукт согласно изобретению предназначен для применения для лечения заболеваний с воспалительным компонентом, которые включают в себя не только ВИЧ, но также и диабет, ревматоидный артрит, неврит, множественную миелому, рак толстого кишечника и прямой кишки и т.п. Дополнительные примеры приводятся в статьях Н. Baum, которые можно найти на веб-сайте по адресу-6 013517 В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов, не больных ВИЧ. В частности, данный способ лечения может использоваться для лечения диабета или злокачественной опухоли у пациентов, которые не имеют ВИЧ. Выздоровление, наблюдающееся у многих пациентов, страдающих PC, вместе с улучшением настроения, как сообщалось, в течение часа после начала лечения, также навело авторов на мысль о поиске активности в отношении рецепторов в ЦНС, которые могут участвовать в стимуляции и возможной регенерации нервов. Авторы провели скрининг различных сывороток на активность против ряда антигенов и обнаружили активность против дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10 (IP10). Соответственно, изобретение относится к антителу против одного или более из дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10 (IP10). Одна или более из данных активностей антител может присутствовать отдельно или в комбинации с анти-HLA- и/или анти-FAS-активностью. С имеющимся теперь знанием о важности активности против дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10 антитела из сыворотки козы становится возможным оценить возможную пригодность ряда указанных сывороток козы. Простым анализом можно оценить наличие указанной активности и идентифицировать сыворотку-кандидат, подходящую для введения пациентам. В частности, комбинация анти-FAS- и/или анти-HLA-антител может быть важной, вместе с антителом против одного или более из дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10, и, таким образом, анализы могут быть направлены на различные виды активности антител, чтобы убедиться в их наличии в продукте. Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим антитело против одного или более из дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10, обычно также с анти-FAS-антителом и/или анти-HLA-антителом, и к способам лечения с использованием указанных композиций. В одном варианте настоящее изобретение относится к антителу, получаемому от лошади, овцы и других подходящих животных. Антитело можно получать сходным способом, описанным для получения антитела от козы, и оценивать на предмет активности против одного или более из HLA, FAS, дофаминового рецептора, серотонинового рецептора, рецептора фактора роста нервов р 75 и хемокина CXCL10. Еще в одном варианте применение вируса ВИЧ в качестве иммуногена для получения антитела не является необходимым, и для получения эффективного препарата антител в качестве иммуногена используют человеческие белые кровяные клетки. Кроме того, авторы рассматривают возможность замены антитела на иммуноген, т.е. когда терапевтическая композиция содержит материал ВИЧ или белые кровяные клетки. В более общем смысле представляется, что эффективные антитела можно получить, используя в качестве иммуногена клетки (или белковые смеси), полученные от человека. Антитела из указанных человеческих клеток затем вырабатываются в организме-хозяине, а окончательный антительный продукт используется вновь для человека. Белковые смеси могут быть чрезвычайно гомологичными между оригинальным донором и реципиентом. Такая гомологичность допускает концепцию о том, что белки или клетки,например, которые происходят из нервной системы обезьяны, способны действовать в организме человека. Интерес представляют смеси высококонсервативных белков от близкородственного животного. Ожидается также, что будет выявлена связь между типом HLA лица, от которого получена оригинальная клетка, и типом HLA реципиента. Это взаимоотношение может объяснить некоторую вариабельность, которая наблюдалась, и может приниматься во внимание при отборе композиции, подходящей для пациента. Кроме того, авторы рассматривают вопрос об использовании активированных или раковых клеточных линий из различных областей организма, включая клеточные линии из нейробластом, раковых опухолей поджелудочной железы, предстательной железы и чешуйчатоклеточных раковых опухолей. Можно прогнозировать, что неуловимые различия вырабатываемых антител к указанным различным типам клеток дадут очень отличающийся профиль и могут способствовать нацеливанию на определенные системы органов в очень широком аспекте. Существуют некоторые данные о том, что вакцина против бешенства, которую вводят козам, может быть причиной наблюдающегося терапевтического эффекта. Авторы подвергли скринингу сыворотки коз, полученные в Уэльсе, включая пул из 3 различных сывороток (нормальных сывороток), и от козленка-донора, которому не вводили антирабическую или другие профилактические вакцины. У этих животных не было активного антитела. Еще в одном варианте авторы рассматривают вопрос о том, что компоненты клеточной оболочки,распространяющиеся во время размножения клеток in vitro, могут обеспечивать антигены, против которых у козы или другого вида могут быть направлены антительные ответы. Указанный факт может наблюдаться в отсутствие вирусной инфекции. Чертежи Фиг. 1-9 относятся к определению наличия антител анти-HLA класса II;-7 013517 фиг. 10-16 относятся к исследованию MLR; фиг. 17-19 относятся к определению наличия анти-FAS-антител; фиг. 20-29 относятся к определению наличия других дополнительных антител; и фиг. 30 представляет собой профили сывороток коз, иммунизированных различными иммуногенами. Примеры изобретения Следующие детали характеризуют предлагаемую авторами изобретения процедуру для изготовления антительного продукта. Пример получения сыворотки козы Козе путем внутримышечной инъекции вводили смесь лизированных вирусов ВИЧ, изготовленную с добавлением адъюванта Фрейнда. Вирус предварительно убивали нагреванием при 60 С в течение 30 мин. Образцы крови отбирали после подходящего интервала времени, такого как две недели, для исходной оценки. При оптимизированной процедуре козе производили инъекции каждую неделю в течение четырех недель, затем в шесть недель у животного брали кровь для получения реагента. В стерильных условиях у козы брали около 400 см 3 крови. Область введения иглы брили и обрабатывали бетадином. Для взятия у животного приблизительно 400 см 3 крови использовали иглу калибра 18. Следует отметить, что животное может перенести взятие крови в объеме около 400 см 3 без какого бы то ни было вреда. Животное не нужно умерщвлять. У животного затем можно повторно брать кровь приблизительно через 10-14 дней после того, как оно восстановит объем крови. Получали подтверждение наличия потенциально пригодных антител, с точки зрения желательной антительной активности. После подтверждения наличия указанных реагентов у козы затем брали кровь между 4-6 неделями. Основной кровяной продукт с целью получения реагента затем центрифугировали для отделения сыворотки. 300 мл сыворотки затем фильтровали для удаления больших сгустков и твердых частиц. Затем сыворотку обрабатывали перенасыщенным раствором сульфата аммония (45% раствором при комнатной температуре) для осаждения антител и другого материала. Полученный раствор центрифугировали при 5000 об./мин в течение 5 мин, после чего удаляли надосадочную жидкость. Осажденный иммуноглобулин ресуспендировали в объеме физиологического раствора с фосфатным буфером (буфер PBS,см. Sambrook et al., "Molecular cloning, A Laboratory Manual", 1989), достаточного для повторного растворения осадка. Раствор затем диализировали через мембрану с отсекающей величиной молекулярной массы 10000 Да. Диализ проводили в буфере PBS, который меняли каждые 4 ч в течение 24 ч. Диализ проводили при 4 С. После 24-часового диализа содержимое диализного мешка переносили в стерильный химический стакан. Производили доводку раствора таким образом, чтобы величина массы на единицу объема составляла 10 мг на 1 мл. Разбавление осуществляли с использованием PBS. Полученный раствор затем фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильный контейнер. После фильтрования раствор разделяли на аликвоты однократных доз по 1 мл и хранили при -22 С до использования. Реагент затем был готов для применения. Превращение плазмы в сыворотку. Материалы. Приготовление раствора декстрансульфата 100 мг/мл. Растворяют требующееся количество хлорида натрия, дигидроортофосфата натрия и гидроортофосфата натрия в 1 л воды для получения 1 л физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). После полного растворения медленно высыпают 10 г декстрансульфата в 100 мл PBS, перемешиваемого на магнитной мешалке. Перемешивают по меньшей мере в течение 10 мин для полного растворения. Фильтруют через фильтр 0,2 мкм в стерильный контейнер (например, 100 мл мешок) и хранят при комнатной температуре, если не требуется для немедленного использования. Это - маточный раствор декстрансульфата. Превращение плазмы в сыворотку. Взвешивают требующийся объем плазмы, предназначенной для обработки, с использованием переводного коэффициента 1,0275, т.е. 1000 мл весят 1027,5 г. Добавляют 10 мл маточного раствора декстрансульфата в каждые 1000 мл плазмы (конечная концентрация 1 мг/мл). Перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 мин. Переносят в 1-литровые мешки Stedim. Центрифугируют при 4000-4200 об./мин (относительная сила центрифугирования=4910 g) по меньшей мере в течение 30 мин при 22 С. Осторожно отсасывают надосадочную жидкость в 1 л мешок Stedim и сливают осадок. Наполняют требующееся количество 1 л мешков Stedim. Фильтруют надосадочную жидкость через фильтр 0,2 мкм в 1 л мешки Stedim. Каждый мешок содержит приблизительно 500 мл профильтрованной надосадочной жидкости. Записывают объем сыворотки в каждом мешке. Нумеруют и идентифицируют каждый мешок. Если сыворотка не предназначается для немедленной дальнейшей обработки, ее хранят до 7 дней в холодильнике при температуре 4-8 С или при температуре -20C для более продолжительного хранения. Изготовление 36% (мас./об.) раствора сульфата натрия. Материалы.-9 013517 Взвешивают 1,5 л воды (допуская, что 1 мл = 1 г) в 2 л стерилизованный Duran. Подогревают воду до 30-35 С путем помещения Duran в предварительно нагретый термостат по меньшей мере на 1 ч. Вводят стерильные магнитные бусы и помещают на магнитную мешалку. Медленно добавляют 360 г сульфата натрия при перемешивании. Продолжают перемешивание до полного растворения соли и прозрачности раствора. Если раствор не был достаточно теплым или ему дали остыть, соль начинает кристаллизоваться из раствора. Соль можно ресолюбилизировать нагреванием раствора до 50 С. Фильтруют 1 л 36% (мас./об.) раствора сульфата натрия через фильтр 0,2 мкм в 1-литровый мешокStedim. Помещают на мешок соответствующую этикетку. Фильтруют оставшиеся 500 мл в отдельный мешок Stedim. Добавляют дополнительно 500 мл воды для инъекций через фильтр и надписывают данный мешок как 18% (мас./об.) раствор сульфата натрия. Осаждение иммуноглобулинов из сыворотки с помощью сульфата натрия. На заметку. Плазма должна быть дефибринирована способом с использованием декстрансульфата до обработки сульфатом натрия. Материалы. Подогревают профильтрованную сыворотку в мешках Stedim с использованием режима термостата 30-35 С. Берут два образца по 5 мл. Добавляют равный объем теплого 36% раствора сульфата натрия к сыворотке в мешках, например,500 мл солевого раствора:500 мл сыворотки. Осторожно перемешивают смесь соль:сыворотка (похожий на сливки белый раствор), покачивая мешком вручную или помещая на пластину качалки. Перемешивают в течение 30 мин. Взвешивают и уравновешивают мешки и центрифугируют при 4000-4200 об./мин по меньшей мере в течение 30 мин при 25-30 С. Осторожно отсасывают надосадочную жидкость в качестве отходов. Стараются не касаться осадка. Берут 15 мл образец надосадочной жидкости. В каждый мешок с осадком добавляют достаточный объем 18% (мас./об.) раствора сульфата натрия,чтобы довести массу каждого мешка приблизительно до 1000 г. Перемешивают вручную или с помощью качалки по меньшей мере в течение 10 мин для отмывания захваченного альбумина из иммуноглобулинового осадка. Переносят мешки в центрифугу и повторяют центрифугирование, как описано выше. Осторожно отсасывают надосадочную жидкость в качестве отходов. Стараются не всколыхнуть осадок. В каждый мешок с осадком добавляют достаточный объем физиологического раствора с фосфатным буфером, чтобы довести массу каждого мешка приблизительно до 1000 г. Перемешивают вручную или с помощью качалки по меньшей мере в течение 10 мин и переносят мешки в холодильник для хранения в течение ночи. Извлекают мешки из места их хранения и убеждаются, что осадок ресолюбилизирован. Фильтруют через 0,2 мкм фильтр в мешок для диафильтрации подходящего размера. Берут 2 образца по 5 мл. Составление всего объема раствора иммуноглобулинов. Устанавливают на устройство для ультрафильтрации (UF) по меньшей мере одну мембрану 0,1 м 2 30000 MWCO. Прочищают систему путем рециркуляции 0,5-1 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере в течение 30 мин.- 10013517 Сливают из системы раствор гидроксида натрия и промывают водой для промывки вплоть до достижения нейтральных значений рН смыва. Подсоединяют мешок для диафильтрации, содержащий раствор иммуноглобулинов, к UF. Подсоединяют мешок, содержащий PBS (10 объем раствора иммуноглобулинов), через перистальтический насос к мешку для диафильтрации. Подсоединяют задерживающую линию к мешку для диафильтрации. Подсоединяют диафильтрационную линию к мешку для отходов. Медленно пропускают продукт через утрафильтрационное устройство, при подборе величин давления на входе и выходе в размере 2,0 бар на входе и 0,5 бар на выходе, с использованием скорости насоса и конфигурации клапанов. Концентрируют раствор иммуноглобулинов приблизительно до 50 г/л. Расчет производят с учетом исходной концентрации и измеряя количество удаленной жидкости. Например: Исходный раствор составляет 2 л с концентрацией 25 г/л=50 г. Объем раствора, переместившегося в диафильтрат, составляет 1 л. Таким образом, концентрация составляет 50/1=50 г/л. Измеряют скорость диафильтрационного потока и подбирают скорость насоса таким образом, чтобы скорость потока из мешка, содержащего PBS, была равна указанной скорости. Продолжают диафильтрацию до тех пор, пока не будет заменено 10 объемов буфера, т.е. 1 л раствора IgG требует 10 л PBS. Сливают из системы концентрированный диафильтрационный раствор IgG в мешок для диафильтрации. Отсоединяют мешок и подсоединяют мешок с PBS в количестве по меньшей мере 1 л напрямую к системе. Дают возможность промывающему раствору PBS рециркулировать и собирают промывные воды в мешок, содержащий раствор IgG. Фильтруют через 0,2 мкм фильтр весь объем раствора IgG в предварительно взвешенный мешокStedim. По окончании берут 1 мл образец профильтрованного раствора и оценивают в нем концентрацию белка. Взвешивают мешок и рассчитывают объем раствора IgG. Используя концентрацию белка и объем IgG, рассчитывают объем PBS, который требуется для разбавления раствора до конечной концентрации 10 мг/мл, например: объем IgG=1300 мл; концентрация белка = 30 мг/мл; общее количество IgG=39000 мг; требуется = конечная концентрация 10 мг/мл. Таким образом, требующийся конечный объем=39000/10=3900 мл. Текущий объем составляет 1300 мл. Таким образом, требующийся для добавления объем PBS составляет 3900-1300=2600 мл. Фильтруют PBS в мешок, содержащий основную массу раствора IgG, для достижения требующегося конечного объема с концентрацией 10 мг/мл. Реагент готов для использования, и его можно хранить в холодильнике до 1 недели или в замороженном виде предпочтительно при -20 С, если требуется более длительное хранение. В описанных процедурах можно производить изменения, например изменяя концентрацию раствора сульфата натрия или переключаясь на его реагенты. Подобно этому, отсекающая величина для диализа не обязательно должна составлять 10000 Да. Вид активности. Введение. Частные наблюдения показывают, что состояние пациентов, страдающих СПИДом, которым вводят сыворотку коз, иммунизированных ВИЧ, как представляется, в некоторых случаях резко улучшается, и авторы заняты выяснением потенциального механизма. Несмотря на то, что козам инъецируют ВИЧ и иммунный ответ, как представляется, является высокоспецифичным, это еще не объясняет наблюдающееся благоприятное действие для пациентов, страдающих рассеянным склерозом и, в некоторых случаях, злокачественной опухолью. Научное обоснование исследования Несмотря на то, что несколько лет назад Dalgleish и его коллеги установили, что рецептор для CD4 является главным входом для ВИЧ, классическая интерпретация, что ВИЧ убивает клетки CD4, количество которых измеримым образом уменьшается по мере прогрессирования инфекции до СПИДа, не подходила для объяснения патогенеза. Главные наблюдения, которые не слишком хорошо соответствуют данной интерпретации, включают в себя следующие:(1) продолжительный период времени от заражения до начала СПИДа (приблизительно десять лет);(2) отсутствие болезни почти у всех шимпанзе и приблизительно у 5% ВИЧ-инфицированных людей. У шимпанзе имеются те же рецепторы и сорецепторы, что и у людей, и вирус легко выявляется у инфицированных шимпанзе, у которых содержание CD4 не снизилось.- 11013517 Основываясь на этих наблюдениях, исследователи искали определяющее различие между теми индивидами, у которых развилось заболевание после заражения, и теми, у которых оно не развилось. Главным прогностическим признаком заболевания является степень иммунной активации после первоначального заражения и тот уровень, на котором она персистирует. Иными словами, чем выше иммунная активация, тем короче период времени до болезни. Умеренная степень активации может приводить к более длительному периоду времени до развития СПИДа, а отсутствие иммунной активации даже при имеющейся репликации вируса играет важную роль у шимпанзе и редко встречающихся индивидов. Важно подчеркнуть, что термин иммунная активация в данном контексте означает тотальную иммунную активацию, т.е. когда все аспекты иммунной системы активируются, что включает все субпопуляции Т-клеток, а также В-клеток. Существуют только три признанных причины тотальной иммунной активации. Первой причиной является гипервариабельность антигена, которую отчетливо демонстрирует ВИЧ,однако, гипервариабельность выявляют у инфицированных людей и шимпанзе, у которых инфекция не прогрессирует. Второй возможностью является суперантиген, который обходит антиген-специфичный механизм и вызывает активацию всей иммунной системы. Несмотря на первоначальный энтузиазм, десятилетие назад, не было найдено убедительного суперантигена, связанного с ВИЧ, который объяснял бы данные открытия. Westby и Dalgleish показали, что вариабельность спектра Т-клеток, которая предполагает возможность наличия суперантигена, была целиком результатом уменьшения популяции CD4, а различия можно было объяснить случайной деструкцией CD4. Единственным другим объяснением является то, что организм распознал чужеродную клетку или орган и развил на них хронический ответ. Клинически это явление часто наблюдается после трансплантации и, в частности, после трансплантации костного мозга, и известно как хроническая болезнь "трансплантат против хозяина" (GVH). В данном сценарии выживания даже немногих чужеродных клеток достаточно для активации всей иммунной системы, что приводит к развитию агрессивных аутоиммунных ответов, подобных тем, которые наблюдаются у ВИЧ-инфицированных пациентов. Клинические признаки данного заболевания настолько сходны со СПИДом, что еще до открытия этого вируса ведущий иммунолог США Gene Shearer из NIH (США) высказал предположение, что данное заболевание может быть индуцировано чужеродными клетками, передающимися путем переливания крови или при половом акте. Открытие вируса через несколько следующих месяцев и передачи фактором VIII (продуктом, не содержащим клеток), привело к тому, что принципиальность данного наблюдения была проигнорирована. Отсутствие другого объяснения тотальной активации побудило Dalglelsh и Habeshaw искать свидетельства того, что вирус может быть способен имитировать HLA класса I или класса II (которые являются молекулами, определяющими собственные и присутствующие антигены). Несмотря на то, что уже опубликованы некоторые последовательности GP120 с незначительной гомологией с HLA, авторам удалось идентифицировать большую область оболочки ВИЧ (GP120), которая обладает выраженной структурной гомологией как с HLA класса I, так и с HLA класса II. Elizabeth Hounsell (MRC) удалось смоделировать GP120 на основе тех молекул HLA, структура которых известна в деталях. На основе данных молекул и последовательностей Habeshaw и Hounsell предсказали, что вирус может распознаваться как"чужеродный" лицами с HLA-B8, а также может распознаваться как "свой" лицами с HLA-B27. В настоящее время имеется публикация о том, что только различия в HLA в исследовании пан-ВИЧ-маркераHLA, проведенном в Великобритании MRC, играют роль в том, что у лиц с HLA-B8 заболевание развивается гораздо быстрее, чем в остальной популяции, и что лица, у которых заболевание длительное время не развивается или развивается крайне медленно, имеют HLA-B27. Последующая работа показала следующее.(1) Т-клетки-киллеры, количество которых увеличилось в ответ на антигенную стимуляцию чужеродными клетками (т.е. с другим типом HLA), также будут убивать собственные ВИЧ-инфицированные клетки.(2) Что оболочка вируса ВИЧ, известная как GP120 (которая, как полагают авторы, обладает структурной гомологией с молекулами HLA, которые определяют "свое"), может связывать пептиды очень сходным с HLA образом. Более того, Т-клетки, направленные на пептиды и HLA, которые имитируютGP120, будут также отвечать на GP120 с пептидом, но не на GP120 без пептида, что наводит на мысль,что способность связывать пептиды может быть очень важна для подтверждения и, следовательно, способности вызывать хроническую иммунную активацию у чувствительных к этому субъектов.(3) Позже авторы показали, что область, где пептиды связываются с HLA, присутствует на GP120, и что если данную часть молекулы удалить, как это было любезно выполнено профессором Sodroski в DanaFaber в Бостоне, пептиды более не будут связываться. Влияние приведенных выше наблюдений наводит на мысль, что иммунную активацию системы теоретически можно отключить, и что заболевание, таким образом, может не прогрессировать. С этой точки зрения существует два главных наблюдения, одно из которых представляло собой клиническое испытание как результат этих научных данных, в котором пациентов, которые больше не могли принимать AZT из-за угнетения костного мозга, переводили на стероиды, классический сильнодействующий- 12013517 противовоспалительный агент, который нельзя давать в течение длительных периодов времени без значительных побочных эффектов. Авторы наблюдали выраженное улучшение при использовании стероидов у очень больных пациентов с классическими признаками, сильно напоминающими заболеваниеGUH, и им удалось показать, что доза, которая требуется для получения этого эффекта, является крайне высокой и не может представлять собой практическое предложение на длительный срок. Позже группа исследователей из университета Duke (США) показала, что у пациентов, которым вводят стероиды в связи с ВИЧ, вирусная нагрузка падает, поэтому в настоящее время это осуществляют все больше и больше,чтобы бороться с тем, что считают аутоиммунитетом (классическим признаком хронической болезни трансплантат против хозяина). Кратко, существует научное обоснование того, что противовоспалительный агент, который преимущественно действует на пути, индуцированные HLA класса I или HLA класса II, может оказывать благоприятное действие при ВИЧ-инфекции. Исследования и результаты Для того чтобы выяснить, обладает ли сыворотка козы какими-либо противовоспалительными свойствами, авторы добавляли ее в реакционные смеси, образованные в результате смешивания клеток двух различных индивидов с различным генетическим фоном. К удивлению авторов, она оказалась чрезвычайно эффективной для ингибирования данной реакции. Используя большое количество молекулярных антител, авторы установили, что только антитело, которое близко подходило к реактивности козы,представляло собой анти-HLA класса II. Антитела против класса I только частично редуцировали данную реакцию. Большой интерес представляет тот факт, что антитела к петле V3 ВИЧ, которую большинство научного сообщества считает главной мишенью вакцины, действительно ухудшают эту тотальную активацию. Это открытие должно соответствовать теории иммунной активации, поскольку иммунный ответ на вирус на самом деле способствует росту и активности вируса в отношении уничтожения клеток,и это может объяснить, почему вакцины, направленные против данной области, являются столь неэффективными. Помня, что козам часто приписывают магические свойства, и что сыворотки от других животных могут обладать неожиданной активностью в конкретных анализах, авторы получили сыворотки от невакцинированных коз, которые совсем не обладали активностью. Затем были получены сыворотки от различных коз с различными схемами вакцинации. Неожиданно удалось показать, что данная сыворотка распознает только оболочку ВИЧ и HLA класса II. В самом деле, более маленькие части вируса, которые,как известно, обладают значительной гомологией с HLA, сыворотками не распознавались. Таким образом, совершенно неожиданно авторы обнаружили большое различие между инъекцией смеси и одной отдельной инъекцией, в том, что спектр консервативных областей HLA в GP120 активно распознается сыворотками коз, которым инъецировали смесь. Интерпретацию приведенных данных суммирует тот факт, что козы, которым инъецировали ВИЧ,продуцировали мощный ответ, подобный ответу против МНС класса II, который можно расширить использованием различных изолятов. Возможной интерпретацией того, каким образом это происходит,является следующее.(1) Оболочка ВИЧ является настолько сходной с HLA класса II, что она и распознается в качестве такового иммунной системой коз, которая имеет полностью отличный спектр HLA.(2) Второй возможностью является то, что в иммуногене, т.е. препарате вируса, HLA, который находится на поверхности клеток, через которые размножается вирус, ловится, и что иммунный ответ наблюдается не на вирус, а на связанный с ним HLA.(3) В третьем объяснении участвует комбинация двух объяснений, приведенных выше. Возможно,что размножающийся вирус сливается с HLA при изготовлении препарата, и что данная комбинация весьма эффективно распознается сыворотками коз. Недавняя публикация показала, что до тех пор, пока вирус размножается посредством клетки с HLA и инкорпорирует HLA в мембрану, он остается неинфекционным. Это означает, что он должен иметь некоторое количество HLA, полученное от клетки-хозяина,для активации механизма проникновения в клетку. В настоящем документе авторы показали, что козы, которым инъецировали препараты ВИЧ, продуцируют мощный антительный ответ на молекулу HLA класса II. Известно, что при ряде заболеваний возникают деструктивные воспалительные повреждения только потому, что участвующие клетки экспрессируют HLA класса II в избыточном количестве. Несмотря на то, что многие типы аутоиммунных заболеваний обладают этим свойством, одним из наиболее известных примеров является рассеянный склероз. Таким образом, может иметь место то, что иммунный ответ козы устраняет толерантность к данным молекулам, и что данный процесс может вызывать сильный противовоспалительный процесс invivo, что может быть связано с клинически благоприятным действием. Если это так, то будут очевидны преимущества перед длительным использованием стероидов в высоких дозах, если постоянное введение сыворотки козы не имеет значительных побочных эффектов. Анти-ВИЧ-ответ, который представляет собой сильный анти-HLA класса II ответ, вполне может обеспечить успешность действия жизненно необходимой вакцины против СПИДа, и авторы намерены расчленить данный ответ, чтобы получить вакцину против ВИЧ. Сыворотки козы, иммунизированной ВИЧ-1, и противовоспалительные свойства.- 13013517 Введение. Получали козьи сыворотки от животных, иммунизированных вирусным лизатом ВИЧ-3 В или вирусной смесью NIH из 6 различных изолятов ВИЧ-1. Некоторые из этих сывороток ранее использовали как часть экспериментальных схем лечения с хорошим эффектом, однако, механизм, посредством которого они действуют, не известен. Для определения механизма действия авторы провели скрининг сывороток на планшетах для ELISA против gp120 ВИЧ-1, HLA-DR1 и выбранных пептидов из различных областей поверхностного гликопротеина вируса, некоторые из которых имели гомологичные последовательности с HLA. Материалы и методы. Сыворотки и антитела. Получали образцы сывороток коз, иммунизированных оригинальным ВИЧ-3 В, которые использовали для лечения пациентов, вместе с образцами от ряда коз, иммунизированных вирусным лизатом ВИЧ-3 В (животные 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, иммунизированные 14 сентября 1999 г., 21 сентября 1999 г. и, вновь, 29 сентября и 7 ноября 2000 г.), а также информацию, касающуюся дат взятия крови и иммунизации. Для проведения ELISA авторы просто предпочли выполнить скрининг образцов сывороток крови, взятой на более поздних стадиях (30 ноября 2000 г. и 1 декабря 2000 г.). Животное 378 иммунизировали вирусной смесью NIH, состоящей из следующих изолятов ВИЧ 92 НТ 593, 92US657,92US660, 92US714, 92US723, 91US056. Иммунизации осуществляли 7 и 28 ноября. Сыворотки крови,взятой 25 января 2001 г., использовали для скрининга посредством ELISA. Получали также контрольные сыворотки козы. Помимо сывороток авторы включили античеловеческий HLA-DR и античеловеческийHLA-DR, DP и DQ (Pharmingen) как в ELISA, так и в исследования смешанной реакции лимфоцитов, а также мышиные анти-gp120 IgG (EVA3047), специфичные в отношении домена V3 ВИЧ-i IIJb(IRIQRGPGR), полученные у доктора J. Laman при содействии доктора Harvey Holmes (программа MRCAIDS reagents programme, National Institute for Biological Standarts and Control, Potter's Bar, UK), во время исследования MLR. Пептиды и белки. Рекомбинантный gp120 ВИЧ-i IIIB был получен в клетках яичника китайского хомячка и поставлен в программу реагентов MRC AIDS доктором J. Raina при содействии доктора Harvey Holmes. Рекомбинантный HLA-DR1 был тем же белком, полученным профессором Don С. Wiley, который использовал его во время экспериментов по связыванию пептидов. Пептиды ВИЧ-1, использованные в исследовании,перечислены в табл. 1. Пептиды ARP7022, ARP7 10, ARP740-23, -28, -42, -44, -45, -46 и -47 были получены у доктора Harvey Holmes в программе MRC AIDS reagents. Контрольный пептид Р 12 представляет собой последовательность CS области gp120 ВИЧ-1 и был предоставлен профессором E.F. Hounsell,School of Biological and Chemical Sciences, Birkbeck College london, UK. Пептиды хранили в виде аликвот при -20 С до использования. Анализы ELISA. Анализы ELISA выполняли по протоколу, сходному с протоколом, описанным Brown et al. (J. Immunological methods 1997, 200:79-88). Пептиды и белки смешивали с 0,05 М рН 9,6 связывающим карбонатным/бикарбонатным буфером с содержанием 16 и 1 мкг/мл соответственно и наносили их в двух повторностях на микротитрационные планшеты с высокой связывающей способностью Immulon 4 LIBX(Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, USA) на ночь при 40C. Лунки блокировали с использованием казеина 5 мг/мл в PBS и оставляли на ночь при 40 С. Козьи сыворотки разводили в 1/500 и 1/1000 раз в PBS/0,25% казеине, в то время как очищенные антитела разводили в 1/1000 и 1/3000 раз, соответственно, и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Лунки промывали 3 разаPBS/0,05% Tween 20, с использованием машины для промывания лунок Wellwash 4 (Denley). Иммобилизованные козьи антитела обнаруживали с использованием конъюгированных с пероксидазой мышиного моноклинального клона GT-34 (SIGMA) антикозьих антител/овечьих IgG, разведенных 1/1000 раз в PBS/0,25% казеине/0,01 Tween 20, а анти-HLA-антитела обнаруживали с использованием козьих антимышиных IgG в виде конъюгата с пероксидазой (SIGMA), инкубированных в течение 1 ч при 37 С. После еще одного цикла промываний в лунках инкубировали свежеприготовленный субстрат дигидрохлорид О-фенилендиамина (OPD; SIGMA) при комнатной температуре в темноте, и реакции останавливали через 15 мин добавлением 2,5 М H2SO4 50 мкл на лунку. Величины ОП измеряли при 492 нм с использованием микропланшет-ридера. Таблица 1 Пептиды, использованные для анализовARP7022: (DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC) Пептид из 24 остатков из консервативной области gp41 ВИЧ (593-616) распознавался большинством европейских и африканских ВИЧ-положительных сывороток.ARP710: (VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR) Пептид из 23 остатков, полученный из консервативного С-концевого домена (CS) gp120 ВИЧ (486508), ведущего к сайту расщепления gp120/41, содержит структурную гомологию с HLA.ARP740/23: (RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV) Пептид из 20 остатков, полученный из С 2-области gp120 (252-271), содержит гомологичную последовательность с -цепью HLA DR4.ARP740/28: (NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG) (302-321) Пептид из 20 остатков, полученный из петли v3 gp120 ВИЧ-1.ARP740/45: (GQDMRDMWRSELYKYKVVKI) (469-488) Последовательность, распознаваемая М 38, антителом, который перекрестно реагирует с HLA-C и областью С 5.ARP740/46: (ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA) (469-478) Пептид из 20 остатков, полученный из С 5-конца gp120, содержит первые 3 гомологичных остатка на С-конце.ARP740/47: (EPLGVAPTKAKRRVVQREKR) (479-498) Пептид из 20 остатков, полученный из С 5-области gp120, обладает структурной гомологией с HLA. Р 12. (RAKTVERKVERRK) Последовательность CS-домена gp120 ВИЧ, полученная от Е. Hounsell. He распознается WVположительными сыворотками. Контрольная последовательность. Анализы ингибирования смешанной лимфоцитарной реакции. Доноры крови. Не подходящие друг другу по HLA класса II образцы крови, с согласия доноров, были получены через службу крови South Thames Blood transfusion service, Tooting, Лондон. Получение РВМС. Только что взятую венозную кровь разбавляли сбалансированным солевым раствором Хенкса(HBSS; SIGMA), осторожно наслаивали на Histopaque (SIGMA) и центрифугировали при 800 g в течение 25 мин при 20 С. РВМС собирали на границе раздела плотности пастеровской пипеткой, промывали 3 раза в HBSS и подсчитывали на счетчике Beckman Coulter. Анализы ингибирования смешанных лимфоцитов. Для данной MLR, PBMC от двух не подходящих друг другу по HLA класса II индивидов ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержавшей 10% инактивированной нагреванием человеческой АВ сыворотки (SIGMA), 4 нМ L-глутамина, пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) (SIGMA), и обозначали для клеток-стимуляторов или клеток-респондеров. Клетки засевали в трех повторностях со стимуляторами в количестве 1 клеток на лунку и респондерами в количестве 110 клеток на лунку для получения соотношения респондер-стимулятор 10:1. Для определения любого ингибирующего влияния на клеточную пролиферацию под действием козьих сывороток и различных антител, 3 мкл неразведенной козьей сыворотки или 1 мкл очищенного антитела добавляли в лунки, содержащие смешанные клеточные культуры, и инкубировали при 37 С с 5% СО 2 в течение 6 дней. В культуры добавляли 1 мкКи меченного по тритию метилтимидина (3H-Thd; Amersham) на 5 день, за 18 ч до сбора клеток. Клетки собирали с помощью клеточного харвестера Tomtec Harvester 96 Mach III на фильтровальные полоски из стекловолокна, и включение 3H-Thd измеряли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика Wallac 1450 microbeta. Результаты представлены как среднее количество импульсов в минуту(имп/мин). Результаты. Антитела анти-HLA класса II, присутствующие в козьих сыворотках. Авторы изучали степень распознавания различными козьими сыворотками пептидов gp120 ВИЧ-1,взятых из различных участков gp120 ВИЧ-1, множества несущих последовательностей и структурной гомологии с HLA (табл. 1). В эти исследования были включены также растворимый gp120 ВИЧ-1 и HLADR1. Результаты показаны на фиг. 1-9. Bg означает фоновые уровни. Уровень ОП выше 0,1 был принят за положительный результат, дающий отсутствие реактивности на любой из антигенов, распознаваемых преиммунными сыворотками. Различные сыворотки давали различающиеся результаты, но обычно имели тенденцию реагировать с HLA-DR1. Преиммунные сыворотки не реагировали ни с одним из отобранных путем скрининга пептидов или белков, а сыворотки 0125 и 0126 не проявили большой реактивности. Однако все остальные сыворотки проявили высокие уровни реактивности к HLA-DR1, в частности 0127 и 0128, которые обладали очень высокой реактивностью. Реактивность к HLA-DR1 на фиг. 9 для ясности сравнивают с античеловеческим HLA-DR и античеловеческим HLA DR, DQ и DP. Анти-HLA-активность представляет интерес, поскольку она, наиболее вероятно, представляет собой активность против молекул HLA из тех самых клеток, в которых культивировался вирус до иммунизации. Поскольку ВИЧ имеет тенденцию нести в своей оболочке больше молекул HLA, чем он экспрессирует молекул gp120, особенно молекул HLA класса II, количество которых он в клетках увеличивает,- 15013517 объединенная активность анти-gp120 и анти-HLA класса II может представлять собой хороший защитный ответ против ВИЧ. В случае некоторых сывороток, особенно 0127 и 0128, сильный "алло"ответ был индуцирован у этих коз после иммунизации вирусом, который нес на своей поверхности высокие уровни молекул класса II. Сыворотка 0378 от козы, иммунизированной вирусной смесью NIH, обладала самой лучшей суммарной перекрестной реактивностью в отношении множества пептидов ВИЧ-i, с уровнями анти-HLADR1, приблизительно такими же, что и у исходной анти-LILV-3 В козьей сыворотки, что предполагает,что данная сыворотка может лучше других действовать против ВИЧ. Эта сыворотка очень хорошо реагирует с рядом пептидов ВИЧ-1, гомологичных HLA. Ни одна их сывороток не реагировала с контрольной последовательностью Р 12, что указывает на то, что реактивность является специфичной в отношении пептидов LIIV. Сыворотки 0127 и 0128 представляют собой лучшие сыворотки с точки зрения связывания с gp120 ВИЧ-i, в то же время обладающие очень высокой анти-HLA DR-активностью. Ингибирование MLR козьими сыворотками. В MLR, представленных на фиг. 10 и 11, использовали клетки от случайных, не подходящих друг другу индивидов. Хотя это не обязательно давало наибольшую пролиферацию (в то время имелись проблемы со средами), возникла тенденция, свидетельствующая об ингибировании пролиферации в процессе MLR под действием козьих сывороток (в каждом случае использовали сыворотки животных, иммунизированных исходным ВМЧ-3 В). Впоследствии авторы начали использовать клетки, не подходящие друг другу по HLA класса II (фиг. 12), которые давали более высокую пролиферацию. Как в случае с антиHLA DR-антителом, козья сыворотка успешно полностью ингибирует клеточную пролиферацию, и может оказаться, что она обладает противовоспалительной активностью. Судя по результатам ELISA, которые наблюдали авторы, весьма вероятно, что анти-HLA DRантитела являются ответственными за ингибирующие эффекты. Авторы подчеркивают скорее роль антиHLA DR, чем антикласса II в целом, поскольку антитело с широким спектром не ингибирует пролиферацию даже приблизительно столь же эффективно, как анти-HLA DR в отдельности. Почему это так, остается загадкой, однако, может быть, что HLA DR является главным антигеном класса II, участвующим в воспалительной активности, и антитела против него могут приводить к возникновению в клетках сигнала к ингибированию репликации. Сыворотки козы, таким образом, могли действовать как противовоспалительный агент, подавляя клеточную пролиферацию. Это могло бы быть прогнозом положительного исхода в случае инфекции ВИЧ-1, когда индуцированная вирусом клеточная активация является необходимой для репликации вируса. Хотя при поверхностном взгляде это может показаться контрпродуктивным, введение мягкого иммунодепрессанта могло бы действовать как ингибитор репликации вируса и контролировать заболевание, поскольку ВИЧ, в отличие от родственных ретровирусов HTLV-1 илиHTLV-2, не вызывает иммортализацию клетки, вызывая злокачественные опухоли, поэтому он полностью зависит от клеточной активации для пролиферации. В настоящее время для ВИЧ не известен Т-клеточный суперантиген, который позволяет заключить,каким образом вирус, который представляется относительно плохо оснащенным для активации клеток,которые он инфицирует, может вызывать заболевание. Авторы изучают теорию о том, что в основе лежит индуцированная вирусом аллоактивация, будь она связана со связанными с вирусом молекуламиHLA или с молекулярной мимикрией, наблюдающейся между ВИЧ и HLA. Сыворотки козы, возможно,улучшают состояние пациента, просто ограничивая описанную тотальную активацию. Сходные наблюдения описаны и в статье Saifuddin M. et al. (Clin. Exp. Immunology 2000, 221: 324-331), показывая значение молекул HLA класса II, в частности HLA-DR, для репликации вируса. Они отметили, что антитела к молекулам HLA класса II ингибировали экспрессию вируса в клетках, экспрессирующих класс II, и предположили участие индуцируемого трансактиватора МНС класса II (CIITA) в усилении транскрипции ВИЧ-1. Эти эффекты с успехом наблюдались в случае козьих сывороток. Сравните это с антителом против петли V3, которое вызывает повышение пролиферации и может быть, следовательно, контрпродуктивным в общем ходе событий. Высоковариабельная область петли V3 gp120 не только позволяет появляться вирусным ускользнувшим мутантам, но также действует как западня для иммунной системы в дальнейших циклах активации. К сожалению, преоккупация данной области является крайне благоприятной для вируса и отводит иммунный ответ от более консервативных областей, активность против которых могла бы быть более полезной. Если противовоспалительные эффекты действительно являются главным способом действия сывороток, это может оказаться полезным при ряде других состояний, при которых гиперактивность и клеточная пролиферация лежат в основе симптомов болезни, например рассеянного склероза. Для будущих экспериментов важно повторить анализы ELISA для всех сывороток, чтобы подтвердить степень антиHLA- и gp120-активности. В данном случае авторы очень заинтересованы в сыворотке 0378 от животного, иммунизированного вирусной смесью NIH, поскольку она эффективно реагирует с многими пептидами ВИЧ, имеющими гомологию с антигенами HLA, а также HLA-DR1. Дальнейшие эксперименты. Следующие данные получены из экспериментов, сходных с теми, которые были предприняты ранее, где были идентифицированы анти-HLA-антитела в козьих сыворотках, которые использовали для- 16013517 лечения добровольцев, страдающих рассеянным склерозом и СПИДом, когда обычная терапия более не была целесообразна. Эта работа включает в себя изучение предполагаемого противовоспалительного механизма действия козьих сывороток в выздоровлении указанных пациентов после лечения. Это было предложено ранее, когда были выявлены анти-HLA-антитела. Однако в настоящее время авторы также добавляют и роль анти-FAS-антител, присутствующих в козьих сыворотках, вызывающих индукцию в течение часов апоптоза клеток, экспрессирующих рецептор FAS.FAS/APO-1 (CD95) заметно присутствует в большом количестве на активных лимфоцитах, через которые передаются сигналы, которые могут побудить клетку к самоуничтожению после перекрестного связывания с лигандом FAS или анти-FAS-антителом. Роль этих молекул крайне важна не только в цитотоксическом иммунном ответе для уничтожения инфицированных клеток, но также в снижении иммунного ответа после исчезновения антигена, для предотвращения постоянной пролиферации клеток, которая может принести вред хозяину. Таким образом, данный путь представляется жизненно важным для поддержания сбалансированного иммунного ответа. В случае ВИЧ-инфекции иммунная система, как представляется, является патологически активной,давая большие возможности для репликации вируса, так как он требует для данного процесса наличия активированных клеток. У пациентов, страдающих рассеянным склерозом, высокоактивированные клетки проходят через гематоэнцефалический барьер и являются ответственными за повреждение миелиновой оболочки, что приводит к образованию бляшек и утрате невральной функции. Противовоспалительный механизм, опосредованный активностью анти-HLA-антител (по крайне мере, анти-HLA DR), присутствующих в козьих сыворотках, может являться тем механизмом, который стоит за выздоровлением пациента. В настоящее время авторы установили, что анти-FAS-антитела в козьих сыворотках присутствуют в различной степени, и предлагают рассматривать суммарное действие анти-HLA- и анти-FAS-антител в предложенном противовоспалительном механизме действия у пациентов с рассеянным склерозом и СПИДом. Предполагается, что указанные антитела нацелены на наиболее высокоактивные клетки, что приводит к их гибели, в то время как анти-HLA-антитела тормозят любую иммунную активность. Затем может последовать резкое снижение выработки цитокинов и хемокинов,приводящее к прекращению иммунной атаки на миелин в случае рассеянного склероза или к снижению вирусной нагрузки в случае ВИЧ-инфицированных пациентов, приводя к отсутствию активированных клеток и гибели клеток, секретирующих вирус, или тех, которые вскоре начнут секретировать вирус. Экспериментальная работа. Авторы начали поиск анти-FAS-антител, в результате которого были сделаны наблюдения, что козья сыворотка от респондеров повреждала клетки, когда ее добавляли в смешанные реакции лимфоцитов(MLR). MLR являются результатом смешения лимфоцитов от 2 разных людей с различными типамиHLA, реагирующих неспецифическим образом, что приводит к пролиферации и повышению турновера лимфоцитов. Авторы полагают, что это является хорошей системой для тестирования противовоспалительных антител, поскольку все аутоиммунные реакции направлены на неадекватную экспрессию "своих" пептидов на молекулах HLA класса 2. Фиг. 13-16 представляют собой фотографии некоторых недавних MLR, с сыворотками и без них. Фиг. 13 представляет собой фотографию смешанной реакции лимфоцитов через 72 ч. Фиг. 14 представляет собой MLR, смешанную с преиммунной сывороткой, через 72 ч. Во всех случаях не наблюдалось значимых изменений по сравнению с самой MLR. Действительно,преиммунная сыворотка ускоряет MLR. Фиг. 15 представляет собой MLR с добавленной сывороткой 0125. Эта сыворотка получена от козы, которая, как считали, не реагировала на иммунизацию, так как у нее наблюдалось присутствие малого или крайне малого количества HLA- и/или FAS-антител, что коррелировало с предварительными результатами ELISA, полученными при идентификации анти-HLA DR у респондеров. Фиг. 16 представляет собой MLR с добавленной сывороткой 0127, которая, как было показано,оказалась очень хорошим респондером. В MLR наблюдалась значительная клеточная деструкция многих РВМС. Этот результат обычно является сходным у всех сильных респондеров при использовании препарата сыворотки для лечения. Авторы занялись поиском антитела, способного индуцировать деструкцию высокоактивных клеток,как это могло происходить в случае MLR. Таким образом, они пытались обнаружить наличие антитела против FAS, которое могло бы перекрестно реагировать с рецептором FAS и индуцировать сигналы, необходимые для возникновения апоптоза. В результате ELISA против FAS удалось выявить наличие указанных антител в сыворотках коз, которые считались самыми лучшими респондерами, и это обогатило предыдущие результаты анти-HLA-антителами. Эти результаты, вместе с ранее полученными авторами данными, хорошо коррелируют со всем тем,что наблюдалось в MLR с пониженной клеточной пролиферацией благодаря клеточной деструкции. На основании полученных результатов ELISA авторы предприняли идентификацию дальнейших возможных активных компонентов в козьих сыворотках, которые использовались для лечения добровольцев, страдающих рассеянным склерозом (MS) и СПИДом, когда обычная терапия более не была целесообразна.- 17013517 Ниже приведены данные скрининга с использованием ELISA в разведении 1 к 1000 преиммунных сывороток. Антигенами для скрининга были овальбумин, HLA-DR1 (DR1), Fas, рецептор р 75 фактора роста нервов (NGFr), серотониновый рецептор (Ser R), дофаминовый рецептор (Dop R), CXCL 10 и монокин, индуцированный интерфероном- (MIG). Уже очевидно, что антитело против дофаминового рецептора присутствует в высоких концентрациях в сыворотках, в то время как активности против любого из остальных антигенов не наблюдается. Однако имеется активность против многих из этих антигенов в исходной 3 В-сыворотке, которую ранее использовали для лечения, и в сыворотке 0127, полученной от козы, иммунизированной ВИЧ IIIb, полученным на Т-клеточной линии, включая активность против NGFr, дофаминового рецептора и CXCL10. Активность против HLA и FAS вновь очевидна и соответствует противовоспалительному механизму,который уже предполагали авторы. К этому авторы могут теперь добавить активность против CXCL 10 и рецептора р 75 фактора роста нервов (NGF R р 75). Антисыворотка против CXCL 10, как было недавно показано, обладает благоприятным действием в отношении выраженного уменьшения тяжести заболевания на мышиной модели рассеянного склероза, посредством снижения инвазии ЦНС CD4+ Т-клетками и макрофагами, уменьшая экспрессию ТН 1 цитокина IFN- и увеличивая ремиелинизацию. Это представляет интерес, так как локальные клетки в воспалительных повреждениях обычно продуцируют CXCL 10,который связывается и привлекает воспалительные ТН 1 клетки посредством рецептора CXCR3. Следовательно, нейтрализация названного хемокина или блокада его рецептора антителами в козьей сыворотке вполне может быть частью противовоспалительного механизма действия, который предположили авторы для козьей сыворотки. Тем временем антитела к низкоаффинному рецептору фактора роста нервов NGF R р 75 ассоциированы с гибелью ВИЧ-инфицированных моноцитов и макрофагов в результате блокады NGF, не допускающей достижения ими рецептора, что также представляет собой другой противовоспалительный механизм. Интересен факт обнаружения высочайших уровней антител против указанных рецепторов в сыворотке 0378, полученной путем иммунизации коз смесью 6 различных вирусов ВИЧ, продуцированных скорее в РВМС, чем в Т-клетках в отдельности. Активность оставалась очень высокой даже в разведении 1 к 4000. Таким образом, вкладом авторов явилось добавление активности против этих антигенов в противовоспалительный механизм действия сывороток в случае обоих заболеваний. Вкладом авторов явилось также добавление активности в отношении дофаминовых и серотониновых рецепторов как ответственных за улучшение самочувствия, связанное с лечением. Было отобрано много новых коз (707-718), которых недавно вакцинировали ВИЧ, а также получены пре-иммунные сыворотки от этих коз. Несмотря на то, что ни в одной из них не было обнаружено антител против дофаминового рецептора, как и в исходных пре-иммунных сыворотках, описанных выше,некоторые из коз имели в среднем более высокий уровень такого антитела при сравнении с козами из Уэльса, которым никогда не вводили вакцину против бешенства. Более высокие уровни, наблюдавшиеся в исходном преиммунном образце, могут быть обязаны своим появлением воздействию некоего фактора окружающей среды когда-то в прошлом, с последующим сильным ответом. Альтернативный иммуноген. Еще в одном варианте, применение вируса ВИЧ в качестве иммуногена для получения антитела не требуется, и в качестве иммуногена для получения эффективного антительного препарата применяются человеческие лейкоциты. На фиг. 30 показаны профили сывороток от коз, иммунизированных смесью ВИЧ и человеческими лейкоцитами, обозначенных SHULA. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения рассеянного склероза. 2. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения артрита. 3. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения неврита. 4. Применение козьей сыворотки, полученной путем иммунизации козы ВИЧ, для изготовления лекарственного средства для лечения хронического воспалительного состояния нервной системы. 5. Применение по любому из пп.1-4, где сыворотка козы содержит антитела к HLA.
МПК / Метки
МПК: A61P 31/18, A61P 25/02, A61K 39/395
Метки: козы, лекарственных, козьей, вич, сыворотки, полученной, изготовления, иммунизацией, применение, средств
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/27-13517-primenenie-kozejj-syvorotki-poluchennojj-immunizaciejj-kozy-vich-dlya-izgotovleniya-lekarstvennyh-sredstv.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Применение козьей сыворотки, полученной иммунизацией козы вич, для изготовления лекарственных средств</a>
Предыдущий патент: Способ получения экстракта затора и установка для осуществления способа
Следующий патент: Кристаллические полиморфные формы n-[8(2-гидроксибензоил)амино]каприлата натрия
Случайный патент: Способ приготовления стекольной шихты