Антитела против pcrv

Предложено эффективное средство для лечения инфекции, в частности для лечения инфекции,связанной с Pseudomonas aeruginosa. Предложено моноклональное антитело к PcrV или часть такого антитела и фармацевтическая композиция, содержащая такое моноклональное антитело или его часть в качестве активного компонента. В частности, моноклональное антитело согласно настоящему изобретению демонстрирует высокую активность ингибирования цитотоксичности в отношении целевых клеток Pseudomonas aeruginosa. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению также обладает высокой аффинностью к PcrV. Область техники Настоящее изобретение относится к антителу, которое распознает PcrV или часть PcrV. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу, обладающему более высокой нейтрализующей активностью (здесь и далее также называемой активностью по ингибированию цитотоксичности), чем обычные анти-PcrV антитела, а также к фрагментам таких антител и фармацевтическим композициям,включающим такие антитела. Уровень техникиPseudomonas aeruginosa представляет собой облигатно аэробную грамотрицательную бациллу, широко распространенную в природе. Хотя ее патогенность обычно низка, она является патогеном, вызывающим оппортунистическую инфекцию, часто возникающую у пациентов, страдающих различными фоновыми заболеваниями, такими как рак и диабет, а также у пациентов, получающих лекарственные средства, обладающие иммуноподавляющим действием, и часто вызывает пневмонию, инфекции мочевого тракта и т.п., что может приводить к тяжелым последствиям. В клинике инфекция Pseudomonas aeruginosa считается одной из наиболее тяжело поддающихся лечению инфекций, поскольку Pseudomonasaeruginosa не только обладает изначально низкой чувствительностью к существующим антибиотикам, но и легко приобретает устойчивость к различным антибиотикам, что затрудняет лечение инфекции. Таким образом, в случае Pseudomonas aeruginosa путь последовательной разработки новых антибиотиков ограничен, и было бы крайне желательным создание способа терапии, который бы не основывался на применении антибиотиков. Высокая цитотоксичность Pseudomonas aeruginosa обусловлена введением токсина в эукариотическую клетку, осуществляемым посредством системы секреции экзотоксинов III типа. PcrV представляет собой белок, состоящий из 294 остатков (номер в NCBI AAC45935, SEQ ID NO: 1) и являющийся частью системы секреции экзотоксинов III типа. Последовательность, кодирующая данный белок, известна (патентный документ 1, непатентный документ 1). Поскольку PcrV потенциально может обеспечить средство для лечения инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa (непатентный документ 2), были разработаны поликлональные антитела (непатентные документы 3, 4) и моноклональные антитела (непатентные документы 5, 6) против PcrV, обладающие нейтрализующей активностью. Однако поликлональные антитела тяжело гуманизировать и использовать в качестве фармацевтических композиций, поскольку их антигенность сложно улучшить. Также, моноклональные антитела, о которых сообщалось ранее, обладают низкой нейтрализующей активностью и не соответствуют требованиям, предъявляемым в клинике. Патентный документ 1: патент США 6551795. Патентный документ 2: Японский перевод публикации РСТ 2005-500250. Непатентный документ 1: Yahr, T.L. et al., J. Bacteriol., 1997, vol. 179, p.7165. Непатентный документ 2: Т. Sava et al., Nature Medicine, 1999, vol. 5, p.392. Непатентный документ 3: Shime N. et al., J. Immunol. 2001, vol. 167, p.5880. Непатентный документ 4: Imamulra Y. et al., Eur.Respir. J., 2007, vol. 29, p.965. Непатентный документ 5: Karine Faure et al., J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003, vol. 1. Непатентный документ 6: Dara W. Frank et al., J. Infect. Disease, 2002, vol. 186, p.64. Краткое изложение сущности изобретения Задача настоящего изобретения Задачей настоящего изобретения является обеспечение средства, эффективного в лечении инфекции, в частности инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Средства решения проблемы В результате настойчивых усилий, направленных на получение моноклонального антитела противPcrV, авторы настоящего изобретения получили новое моноклональное антитело, которое, как считают,обладает более выраженным терапевтическим эффектом в отношении заболевания, чем известные моноклональные антитела к PcrV. Таким образом было сделано настоящее изобретение. Более конкретно, настоящее изобретение относится к(1) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, причем указанное антитело обладает по меньшей мере одним признаком, выбранным из(А) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток лейкоцитов при концентрации от 1 до 200 нМ in vitro;(B) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток миеломы в концентрации от 1 до 50 нМ in vitro; и(2) моноклональному антителу или части такого антитела, которое содержит последовательность аминокислот, включающую гипервариабельный участок (CDR) моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной под номером PERM P-21403, или гибридомой, депонированной под номером PERM P-21404, или гибридомой, депонированной под номером PERM P-21405, или гибридомой, депонированной под номером PERM P-21406;(3) моноклональному антителу или части такого антитела, продуцируемому гибридомой, депонированной под номером PERM P-21403, гибридомой, депонированной под номером PERM P-21404, гибри-1 020544 домой, депонированной под номером PERM P-21405, гибридомой, депонированной под номером PERM(4) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, эпитоп которого располагается в положениях с 136 по 233 последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1;(5) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, содержащему 1) гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15), INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16), YGNYVVYYTMDY (SEQID NO: 17), и 2) гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18), TTSKLAS (SEQ ID NO: 19), HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20);(6) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, содержащему 1) гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21) YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22), SRNYYGAWFAY (SEQ IDNO: 23), и 2) гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, включающий следующую последовательность аминокислот: KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24), RASTRHT (SEQ ID NO: 25), QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26);(7) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, содержащему 1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 11, и 2) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 12;(8) моноклональному антителу против PcrV или части такого антитела, содержащему 1) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 13, и 2) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот SEQIDNO: 14;(9) фармацевтической композиции, включающей антитело или часть антитела, описанные в любом из пунктов (1)-(8) в качестве активного ингредиента; и(10) гибридоме, продуцирующей антитело или часть антитела, описанные в любом из пунктов (1)(8). Применение изобретения Моноклональное антитело или часть антитела согласно настоящему изобретению пригодно в качестве агента для лечения инфекции, поскольку оно обладает прекрасной нейтрализующей активностью в отношении PcrV. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 показаны кривые вытеснения меченого биотином PcrV немеченым PcrV в антителах кPcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166). На фиг. 2 представлены значения аффинности антител к PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166), определенные методом поверхностного плазмонного резонанса. На фиг. 3 показаны результаты сэндвич-анализа между антителами к PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 иMab166) и Mab166. На фиг. 4 показано ингибирующее влияние антител к PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166) на цитотоксичность Pseudomonas aeruginosa (штамм SR24) в отношении клеток U937. На фиг. 5 показано ингибирующее влияние антител к PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166) ) на цитотоксичность Pseudomonas aeruginosa (штамм SR24) в отношении клеток миеломы P3U1. На фиг. 6 показаны кривые вытеснения меченого биотином PcrV немеченым полноразмерным PcrV и укороченным PcrV в антителах к PcrV (1F3, 2 А 4, 9D12, 12 Н 9 и Mab166). На фиг. 7 показана реактивность антител к PcrV с полноразмерным PcrV и укороченным PcrV (1F3,2 А 4, 9D12, 12 Н 9 и Mab166) в анализе методом Вестерн-блот. На фиг. 8 показана корреляция между антителом и полноразмерным PcrV, определенная по активности ингибирования цитотоксичности. На фиг. 9 показана корреляция между антителом и полноразмерным PcrV, определенная по подавлению ингибирования цитотоксичности. На фиг. 10 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 1F3. Гипервариабельный участок выделен подчеркиванием. На фиг. 11 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 2 А 4. Гипервариабельный участок выделен подчеркиванием. Лучший вариант осуществления изобретения"Моноклональное антитело", являющееся объектом настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое специфично связывает описанный выше PcrV. Более конкретно, такое антитело представляет собой моноклональное антитело против PcrV, обладающее по меньшей мере одним признаком,выбранным из (1) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток лейкоцитов в концентрации от 1 до 200 нМ in vitro; (2) способности к ингибированию 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток миеломы в концентрации от 1 до 50 нМ in vitro; и (3) константой диссоциации с (Kd) PcrV 210-9 (М) или менее. Одним из признаков моноклонального антитело согласно настоящему изобретению является высо-2 020544 кая активность ингибирования цитотоксичности. Например, в случае использования клеток лейкоцитов моноклональное антитело обладает такой активностью ингибирования (нейтрализации), которая обеспечивает ингибирование 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa при концентрации в диапазоне от 1 до 200 нМ, предпочтительно от 2 до 100 нМ, более предпочтительно от 5 до 25 нМ. В случае использования клеток миеломы антитело обладает такой активностью ингибирования (нейтрализации),которая обеспечивает ингибирование 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa, при концентрации в диапазоне от 1 до 50 нМ, предпочтительно от 2 до 30 нМ, более предпочтительно от 4 до 20 нМ. Приведенные значения намного превосходят значения активности Mb166, о которых сообщалось в(Dara W. Frank et al. (J. Infect. Disease, 2002, vol. 186, p. 64. Другим признаком моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является то, что эпитоп этого антитела находится в области в положениях от 136 до 233 в полноразмерной последовательности аминокислот PcrV (SEQ NO: 1). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитело,которое распознает данный участок, обладает более высокой активностью (активностью ингибирования цитотоксичностью), чем антитело, которое распознает другой участок. Распознавание эпитопа моноклональным антителом может быть определено следующим образом. Во-первых, получают множество фрагментов молекулы, которую должно распознавать моноклональное антитело. Для получения указанных фрагментов используют метод получения пептидных фрагментов молекулы по известной методике синтеза пептидов, способ получения их в хозяине, таком как Е. coli,(или секретирования хозяином) путем встраивания в подходящую плазмиду экспрессии последовательности ДНК, кодирующей целевой пептидный фрагмент, и другие подобные способы. Однако, для решений указанной задачи обычно используют комбинацию таких способов. Например, после получения набора полипептидов, представляющих собой укороченный на подходящую длину с С-конца или Т-конца антигенный белок, путем применения технологии рекомбинантных генов, хорошо известной специалистам, исследуют реактивность моноклонального антитела с этими полипептидами, что позволяет приблизительно определить распознаваемый участок. Затем, более направленно синтезируют множество олигопептидов соответствующей части, мутантных пептидов или подобных вариантов с использованием методики синтеза олигопептидов, хорошо известной специалистам, и определяют эпитоп путем изучения способности антитела, содержащего профилактический или терапевтический агент, согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента с указанными пептидами или путем исследования активности конкурентного ингибирования этих пептидов в отношении связывания между моноклональным антителом и антигеном. В качестве удобного средства для получения множества олигопептидов можно также использовать коммерчески доступный набор (например, набор SPOT (который можно приобрести в Genosys Biotechnologies, Inc.),серия наборов для синтеза kit, реализующий метод параллельного синтеза (можно приобрести в ChironCorporation). Активность ингибирования цитотоксичности может быть измерена следующим образом. Вначале моноклональное антитело, для которого следует измерить токсичность, разбавляют до подходящих концентраций путем серийных 2-кратных разбавлений. Затем клетки, обработанные токсином Pseudomonas aeruginosa или чем-то подобным (здесь и далее называемые клетками-мишенями), разбавляют, например, при помощи среды для культуры клеток до получения подходящего количества. В частности, предпочтительно доводить количество клеток до 3106-5106 клеток/мл в случае использования клеток миеломы и до 1106-3106 клеток/мл в случае использования лейкоцитов. Аналогично, клетки Pseudomonas также доводят до 1107-5108 КОЕ/мл с использованием, например, культуральной среды. Клетки Pseudomonas aeruginosa и клетки-мишени культивируют в присутствии моноклонального антитела в одной пробирке или лунке (например, в условияхin vitro: например, в лунке микропланшета) в соответствующих условиях. Условия культивирования могут представлять собой условия, обычно используемые для культивирования, которые считаются подходящими для выращивания клеток или бактерий. Что касается времени культивирования, оптимальные значения варьируют в зависимости от типа клеток-мишеней и могут составлять, например, приблизительно от 1 до 3 ч в случае клеток миеломы и приблизительно от 1 до 3 ч в случае, если предпочтительно использовать лейкоциты. Лунку, в которую не добавлено антитело, используют в качестве контроля и рассчитывают концентрацию, при которой наблюдают 50% ингибирование по сравнению с контролем(эффективная концентрация). Что касается определения живых и мртвых клеток-мишений, то хотя были разработаны различные процедуры, часто применяют измерение поглощения на соответствующей длине волны (например, от 400 до 500 нм) после добавления окрашивающего реагента (см. Nature Medicine 1999, vol.5, p. 392-395). Одним из признаков моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является высокая аффинность в отношении PcrV. Константу диссоциации (Kd), которую используют в качестве показателя аффинности антитела или моноклонального антитела, можно исследовать различными путями. Например, можно легко осуществить анализ по методу Скэтчарда с использованием антигена, меченого различными метками, или метода с использованием коммерчески доступного набора для измеренияBiacore X (можно приобрести в Amersham Pharmacia) или аналогичного набора в соответствии с руководством по применению и протоколам экспериментов, прилагающейся к набору. Константа диссоциации(значение Kd), определенная таким способом, выражается в М (молях). Чем меньше константа диссоциации исследуемого моноклонального антитела, там выше аффинность указанного моноклонального антитела. Что касается антитела согласно настоящему изобретению или части такого антитела, константа диссоциации (Kd) с PcrV составляет 210-9 (М) или менее, предпочтительно 1,510-9 (М) или менее, более предпочтительно 1,210-9 (М) или менее. Предпочтительно в моноклональном антителе согласно настоящему изобретению вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи имеют человеческое происхождение, возможно имеют последовательность, производную от SEQ ID NO: 11-14 (например, включают указанные последовательности, содержащие замену, вставку, делецию или присоединение одной или нескольких аминокислот). Константная область предпочтительно включает соответствующую константную область человека (например, как описано у Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NationalInstitute of Health). Проверка гомологии путем поиска последовательности аминокислот в базе данных аминокислотных последовательностей антител, созданных Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest" US Dept. Health and Human Services, 1983) позволяет найти гипервариабельные участки. Что касается гипервариабельного участка, настоящее изобретение включает модифицированные варианты, содержащие по меньшей мере одно присоединение, вставку, замену или делецию при условии сохранения биологической активности (например, активности связывания или активности нейтрализации),требующейся согласно настоящему изобретению. Включены последовательности, обладающие гомологией с каждым гипервариабельным участком, составляющей от 90 до 100%. Предпочтительно настоящее изобретение относится к последовательностям, имеющим гомологию от 95 до 100%. Более предпочтительно изобретение относится к последовательностям, обладающим гомологией от 98 до 100%. Каркасный участок может представлять собой каркасный участок любого вида и предпочтительно является каркасным участком человека. Предпочтительные каркасные участки могут быть выбраны на основании информации, приведенной в цитируемом выше документе (Kabat E.A. et al.). Предпочтительный каркасный участок тяжелой кепи представляет собой каркасный участок тяжелой цепи человека,например, каркасный участок антитела к PcrV, показанного на фиг. 10 или 11. Указанный участок можно определить по показанной на фиг. 10 или 11 последовательности, как описано в цитируемом документе. Аналогично, каркасную область легкой цепи можно определить по последовательности, показанной на фиг. 10 или 11 согласно цитируемому выше документу. В более предпочтительном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению может включать антитело, содержащее по меньшей мере a)(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) или ее фрагмент, последовательность которых содержит гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, причем CDR1 имеет последовательность аминокислот SFTSYWMH (SEQ IDNO: 15), CDR2 имеет последовательность аминокислот INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) и CDR3 имеет последовательность аминокислот YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17), и (ii) константную область тяжелой цепи человека или ее фрагмент. Затем, b) оно предпочтительно включает (i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина(VL), в которой CDR1 имеет последовательность аминокислот SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18), CDR2 имеет последовательность аминокислот TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) и CDR3 имеет последовательность аминокислот HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20), и (ii) константную область легкой цепи человека или ее часть. Далее, более предпочтительное антитело к PcrV согласно настоящему изобретению может представлять собой антитело, содержащее по меньшей мере a)(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина(VH) или ее фрагмент, последовательность которого включает гипервариабельные участки CDR1, CDR2 иCDR3, причем CDR1 имеет последовательность аминокислот SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21), CDR2 имеет последовательность аминокислот YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) и CDR3 имеет последовательность аминокислот SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23), и (ii) константную область тяжелой цепи человека или ее фрагмент. Затем, b) оно предпочтительно включает (i) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL), в которой CDR1 имеет последовательность аминокислот KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24), CDR2 имеет последовательность аминокислот RASTRHT (SEQ ID NO: 25) и CDR3 имеет последовательность аминокислотQQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26), и (ii) константную область легкой цепи человека или ее фрагмент. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть получено в соответствии с обычным существующим методом получения с использованием PcrV (природный вариант, рекомбинантный вариант или синтетический вариант и т.д.) в качестве иммуногена. В частности, вначале млекопитающее, предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, козу, овцу,осла, лошадь или жвачное (включая трансгенных животных, способных продуцировать антитела других животных, например, трансгенная мышь, продуцирующая антитела человека), более предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку или кролика, иммунизируют PcrV, служащего иммуногеном, при необходимости, в комбинации с адъювантов Фрейнда путем однократной или многократных подкожных,внутримышечных, внутривенных, внутрибрюшинных инъекций или инъекций в лапу. Обычно иммунизацию осуществляют от одного до четырех раз с интервалами приблизительно от 1 до 21 дней после первичной иммунизации; клетки животного, продуцирующие антитела, могут быть получены через от 1 до 10 дней после последней иммунизации. Количество иммунизации и интервалы между иммунизациями можно соответствующим образом менять в зависимости от свойства используемого иммуногена. Примеры PcrV, используемого в качестве иммуногена или гаптена, приведены ниже.(A) Клетки, экспрессирующие PcrV на поверхность или искусственно созданные штаммы клеток,экспрессирующие PcrV на поверхность, или рекомбинантные клетки, полученные с использованием технологии рекомбинантных генов, экспрессирующие PcrV на поверхность;(B) супернатант культуры, полученной путем культивирования рекомбинантных клеток, полученных с использованием технологии рекомбинантных генов, экспрессирующих PcrV, или белковая фракция такого супернатанта, или PcrV или его часть, выделенная из супернатанта культуры; или(C) химически синтезированный PcrV или его часть. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть получена в соответствии с методом, описанным Kohler и Milstein (Nature, 1975, vol. 256, p. 495-497), или аналогичным способом. Т.е. гибридома может быть получена в результате слияния клеток, продуцирующих антитела, присутствующих в селезенке, лимфатических узлах, костном мозге, миндалинах и т.д., полученных из организма животного, иммунизированного, как описано выше, и клетки миеломы, лишенной способности продуцировать антитела, полученной предпочтительно из млекопитающего, такого как мышь, крыса, морская свинка, кролик или человек, предпочтительно из мыши, крысы или человека. В качестве клетки миеломы для слияния могут быть использованы линии клеток, полученные из мыши,например мыши, устойчивой к 8-азагуанидину (получены из BALB/c) штамм миеломы P3X63Ag8U.1 (P3-U1)[Kohler, G et al., European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], SP2/O-Ag14 (SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276,269-270 (1978)], P3X63Ag8, 653(653) [Kearney, J.F. et al., J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)],P3X63Ag8(X63) [Horibata, K. and Harris, A.W. Nature, 256, 495-497 (1975)] и т.п. Гибридому, которая продуцирует антитела, подвергают скринингу путем культивирования гибридомы, например, в микротитрационном планшете, измерения реактивности в отношении иммуногена,использованного для иммунизации мышей, описанной выше, в супернатанте культуры в лунке, в которой наблюдают пролиферацию с использование иммунологического метода измерения, такого как РИА или твердофазный ИФА, и отбора клона, который продуцирует моноклональное антитело, демонстрирующее специфичную аффинность в отношении иммуногена или гаптена. Затем обычно используют неконкурентный ИФА, в котором иммуноген находится в твердой фазе, а антитело в супернатанте культуры, которое связывается с иммуногеном, детектируют при помощи вторичных антител к антителам мыши, мыченых ферментом. Продуцирование моноклональных антител гибиродомой может быть осуществлено путем культивирования гибридомы in vitro или в асцитах мыши крысы, морской свинки, хомяка или кролика, предпочтительно мыши или кролика, или более предпочтительно мыши с последующим выделением супернатантов культур или асцитов млекопитающих. В случае культуры in vitro гибридому можно культивировать в ивестной питательной среде или в питательных средах, полученных из известных базовых сред,используемых для размножения, поддержания или хранения гибридом и для продуцирования моноклональных антител в супернатант культуры, в зависимости от многих факторов, таких как вид культивируемых клеток, объект исследования и способ культивирования. В качестве базовой среды могут быть использованы, например, среда с низким содержанием кальция, такая как среда как Ham'F12, среда MCDB153 или культуральная среда MEM с низким содержанием кальция, а также среды с высоким содержание кальция, такие как среда MCDB104, среда MEM, среда DMEM, среда RPMI1640, среда AF104 или среда RD, такие базовые среды могут содержать, например,сыворотку, гормон, цитокин и/или различные органические и неорганические вещества в зависимости от задачи. Выделение и очистка моноклонального антитела могут быть осуществлены путем обработки описанных выше супернатантов культур или асцитов насыщенным сульфатом аммония или проведения ионообменной хроматографии (например, DEAE или DE52), аффинной хроматографии на колонке, например, на колонке с антителами к иммуноглобулинам или на колонке с белком А и т.д. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, представляющее собой рекомбинантное антитело, получают с использованием технологии рекомбинантных генов. Например, ген антитела клонируют из клетки, продуцирующей антитело, например гибридомы, и встраивают в подходящий вектор, и вектор вводят в клетку-хозяина (см., например, Carl et al., THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES, опубл. в 1990). В частности, из гибридомы, которая продуцирует целевое антитело, или из иммунной клетки, которая продуцирует антитело, например, из клетки, полученной путем иммортализации сенсибилизированных лимфоцитов, или подобных клеток при помощи ракового гена или подобным образом, выделяют мРНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела. Из выделенной мРНК известным способом, например, путем ультрацентрифугирования с гуанидином (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294-5299) или подобным способом, получают РНК, после чего готовят мРНК при помощи набора для очистки мРНК mRNA Purification Kit (можно приобрести в Pharmacia) или подобных средств. С использованием полученной мРНК синтезируют кДНК вариабельной области антитела с использованием обратной транскриптазы. Синтез кДНК можно осуществить с использованием набора AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit или подобного средства. Дополнительно, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор 5'-Ampli FINDER RACEKit (можно приобрести в Clonetech) и метод 5'-RACE с использованием ПЦР (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, vol. 85, p. 8998). Целевой фрагмент ДНК выделяют (очищают) из полученного продукта ПЦР и связывают с ДНК-вектором. Полученный таким образом рекомбинантный вектор вводят в Е. coli или подобный организм, отбирают колонию и получают нужный рекомбинантный вектор. Последовательность оснований ДНК для целевой ДНК проверяют известным методом, например, деокси-методом. Получают ДНК, кодирующую вариабельную область целевого антитела, соединяют с ДНК, кодирующей константную область желательного антитела (С-область), и встраивают в вектор экспрессии. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая V-область антитела, может быть встроена в вектор экспрессии, содержащий ДНК С-области антитела. Для получения антитела согласно настоящему ген антитела встраивают в вектор экспрессии, в результате чего экспрессия указанного гена находится под контролем контрольной области, например энхансера/промотора. Затем клетку-хозяина трансформируют указанным вектором экспрессии, что обеспечивает экспрессию антитела. Для экспресснирования гена антитела тяжелая цепь (Н-цепь) или легкая цепь (L-цепь) антитела могут быть встроены в вектор экспрессии по отдельности, либо клетка хозяин может быть трансформирована такими векторами одновременно, или ДНК, кодирующая Н-цепь и L-цепь, может быть встроена в один вектор экспрессии, после чего полученным вектором трансформируют хозяина (см. WO 94/11523). Моноклональное антитела согласно настоящему изобретению включает антитела, полученные при помощи методик рекомбинации генов, которые искусственно модифицицрованы с целью снижения гетерологичной антигенности в организме человека, например, химерные моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела или моноклональные антитела человека. Химерное моноклональное антитело состоит из V-области, полученной из антитела млекопитающего, отличного от человека, и С-области, полученной из антитела человека, а гуманизированное антитело состоит из гипервариабельного участка, полученного из антитела млекопитающего, отличного от человека, и каркасного участка и С-области, полученных из антитела человека. Указанные антитела пригодны в качестве антител согласно настоящему изобретению, поскольку их антигенность для организма человека снижена. Такие модифицированные антитела могут быть получены известными методами. Химерные моноклональные антитела получают путем присоединения ДНК, кодирующей, Vобласть антитела, полученной, как описано выше, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека,встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии и введения полученного вектора экспрессии в хозяина, что обеспечивает продуцирование (например, WO 95/14041). Используя описанный известный метод,можно получить моноклональные антитела согласно настоящему изобретению. Гуманизированные моноклональные антитела получают путем трансплантации гипервариабельного участка (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мыши, в каркасный участок антитела человека. Общая технология рекомбинантных генов, которую можно использовать для этого,также известна (например, WO 95/14041). В частности, последовательность ДНК, сконструированная таким образом, что в ней соединеныCDR антитела мыши и каркасный участок (FR) антитела человека, синтезируют методом ПЦР с нескольких олигонуклеотидов, содержащих перекрывающиеся участки на концах. Полученную ДНК соединяют с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, и встраивают вектор экспрессии, и полученный вектор экспрессии вводят в клетку-хозяина, что обеспечивает продуцирование (например, WO 95/14041). При встраивании в FR антитела человека гипарвариабельных участков CDR выбирают тот, в котором образуется хороший сайт связывания антигена. В случае необходимости, аминокислота каркасного участка в вариабельной области может быть заменена, причм полученный в результате такой заменыCDR антитела человека образует подходящий сайт связывания антигена (Sato, K. et al., Cancer Res. 1993,vol. 53, p. 851). В химерном моноклональном антителе и гуманизированном моноклональном антителе используется С-область антитела человека. К предпочтительным вариантам С-области относится С,например C1, С 2, С 3 и С 4. Дополнительно, для улучшения стабильности антитела или продукции антитела может быть модифицирована С-область. Моноклональное антитело человека состоит из V-области и С-области, полученных из антитела человека, и может быть получено путем иммунизации трансгенного животного, не являющегося человеком, продуцирующего антитела человека, например, трансгенной мыши, продуцирующей антитела человека, (например, WO 94/25585) иммуногеном в соответствии с общим способом продуцирования моноклональных антител. Согласно настоящему изобретению фраза "часть моноклонального антител" обозначает область указанного моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, которая обладает способностью специфично связываться с PcrV аналогично моноклональному антителу (здесь и далее также"фрагмент антитела"). В частности, можно указать Fab (антителосвязывающий фрагмент), F(ab')2, Fab', одноцепочечное антитело (одноцепочечный Fv; далее обозначается scFv), антитело, стабилизированное дисульфидными связями (Fv, стабилизированный дисульфидными связями; здесь и далее dsFv), фрагмент, включающий собой димеризованную V-область (здесь и далее "диатело"), пептид, содержащий, обладающий способностью к специфичному связыванию PcrV (Expert opinion on therapeutic patents, vol. 6, No. 5, p. 441-456,1996).Fab представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой около 50,000, обладающий антигенсвязывающей активностью, состоящий приблизительно из половины N-концевой части Н-цепи и целойL-цепи, полученный путем ферментативного разрушения с использованием фермента папаина части пептида выше двух дисульфидных связей (S-S связь), поперечно сшивающих две Н-цепи в шарнирной областиIgG. Fab, используемый в настоящем изобретении, может быть получен путем обработки моноклонального антитела согласно настоящему изобретению папаином. В качестве альтернативы, Fab может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей Fab моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, в вектор экспрессии и введения указанного вектора в клетку с обеспечением экспрессии.F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой около 100000, обладающий антигенсвязывающей активностью, образованный путем связывания двух фрагментов Fab' в шарнирной области. Указанные области Fab' получают путем разрушения пепсином ниже двух S-S связей шарнирной области IgG. F(ab')2 для использования в настоящем изобретении может быть получен путем обработки моноклонального антитела согласно настоящему изобретению пепсином. В качестве альтернативы, F(ab')2 может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей F(ab')2 моноклонального антитела в вектор экспрессии для клетки и встраивания полученного вектора в клетку Е. coli, клетку дрожжей или животных, что обеспечивает экспрессию.Fab' представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой приблизительно 50000, обладающий антигенсвязывающей активностью, получаемый путем разрезания связи S-S между шарнирными участками упомянутого выше F(ab')2. Fab', используемый в настоящем изобретении может быть получен путем обработки F(ab')2 моноклонального антитела согласно настоящему изобретению восстанавливающим агентом, дитиотреитолом. В качестве альтернативы Fab' может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей Fab' моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и встраивания полученного вектора в клетку Е. coli, клетку дрожжей или клетку животных, что обеспечивает экспрессию.scFv представляет собой пептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором одна цепь VH и одна цепь VL соединены подходящим пептидным ликером (здесь и далее Р), и является фрагментом антитела, обладающим антигенной активностью. VH и VL, входящие в состав scFv, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. scFv, используемый в настоящему изобретении, может быть получен путем выделения кДНК, кодирующей VH иVL, из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии scFv и обеспечения экспрессии путем введения вектора экспрессии в клетку Е. coli, дрожжей или животных.dsFv относится к фрагменту, полученному путем связывания полипептидов, в которых остаток аминокислоты в каждой из VL и VL заменен на остаток цистеина, S-S связью. Остаток аминокислоты для замены на остаток цистеина может быть выбран на основании предсказания третичной структуры антитела согласно методу, описанному Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994. VH или VL, входящие в состав dsFv, используемого в настоящем изобретении, могут быть получены из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. dsFv, используемое в настоящем изобретении, может быть получено путем выделения кДНК, кодирующей VH и VL из гибридомы, продуцирующей антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии dsFv путем встраивания указанной кДНК в подходящий вектор экспрессии и встраивания вектора экспрессии в клетку Е. coli, дрожжей или животных. Диатело представляет собой фрагмент антитела, являющееся димером scFv, обладающим одинаковыми или разными специфичностями связывания антитела. Диатело представляет собой фрагмент антитела, обладающий бивалентной активностью связывания антигена в отношении одного или различных антигенов. Например, бивалентное антитело, которое специфично реагирует с моноклональным антителом, согласно настоящему изобретению может быть получено путем выделения кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей scFv, содержащий пептидный линкер из от 3 до 10 остатков, встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии для клетки и обеспечения экспрессии диатела путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е. coli, дрожжей или животных. Пептид, содержащий CDR, включает по меньшей мере один гипервариабельный участок VH илиVL. Множество CDR могут быть связаны непосредственно или через подходящий пептидный линкер. Пептид, содержащий CDR, используемый в настоящем изобретении, может быть получен путем получе-7 020544 ния кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей встраивания полученной ДНК в вектор экспрессии для клетки экспрессии и обеспечения экспрессии путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е. coli, дрожжей или животных. Пептид, содержащий CDR, может также быть получен путем химического синтеза, например,методом с использованием Fmoc (флуоренил метилоксикарбонил) или методом с использование tBoc (tбутилоксикарбонил). Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть могут быть модифицированы при условии сохранения возможности использования их в настоящем изобретении. Модифицированная форма антител, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой антитела,связанные с различными молекулами, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т.д. Модификация антитела может представлять собой модификацию путем введения химической связи или модификацию аминокислотной последовательности антитела. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть также включает такие вещества, полученные путем модификации антител. Для получения такой модифицированной формы антитела можно подвергнуть модификации полученное антитело. Такие методики хорошо известны в данной области. Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению и его часть пригодны для использования в фармацевтической композиции. Соответственно, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть, можно вводить системно или топически пероральным или парентеральным путем. В случае парентерального введения, например,можно использовать внутривенную инъекцию, такую как капельная ифузия, внутримышечную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, подкожную инъекцию, интраназальное введение, ингаляции и т.д. Однако, поскольку известно, что Pseudomonas aeruginosa поражает в первую очередь клетки эпителия легких и макрофаги альвеол легких, поскольку инфицирует дыхательные пути (Т. Sawa et al., NatureMedicine, 1999, vol. 5, p. 392), предпочтительными являются интраназальное введение и ингаляции. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят пациенту, страдающему от муковисцедоза или инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Например, эффективную дозу выбирают в диапазоне от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы тела за одно введение. В качестве альтернативы может быть выбрана доза от 1 до 1000, предпочтительно от 5 до 50 мг для каждого пациента. Однако, доза в фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его часть, не ограничена указанными дозами. Продолжительность введения может быть выбрана в соответствии с возрастом, симптомами и т.д. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество в зависимости от пути введения. Примеры таких носителей и дополнительных веществ включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия, водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, казеин, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, альбумин сыворотки человека (HSA), маннитол, сорбит, глюкозу и поверхностно-активные вещества, допустимые для применения в качестве фармацевтических добавок. Добавка для использования может быть выбрана из вышеперечисленных или их комбинаций в зависимости от лекарственной формы. Однако приведенный список не является ограничивающим. Типичный пример Получение рекомбинантного Mab166 Для осуществления сравнительного эксперимента получали Mab166 (заявка на патент Японии 2005-500250 и т.д.) в форме моноклонального антитела. Вначале экстрагировали мРНК гибридомы, которая продуцирует антитело, относящееся к подклассу IgG2a, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи клонировали методом ПЦР в реальном времени. Каждый фрагмент, амплифицированный путем ПЦР, встраивали в сайт Nhel-NotI вектораpcDNA3.1 (+) (можно приобрести в Invitrogen Corporation) и затем вводили сайт мультриклонирования для обеспечения возможности введения фрагмента ДНК вариабельной части. Затем, после разделения последовательности генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи Mab166 на четыре части синтезировали соответствующую смысловую ДНК и антисмысловую ДНК и подвергали ренатурации (отжигу). После ренатурации их связывали с использованием ДНК-лигазы их клонировали в участок Mfel-BlpI для тяжелой цепи и в участок EcoRV-BsiWI для легкой цепи. Векторы тяжелой цепи и легкой цепи с идентифицированными последовательностями вводили в клетку HEK 239 Т с использованием Lipofectamine 2000 (можно приобрести в Invitrogen Corporation) и через 48 ч собирали супернатант культуры клеток. Из полученного супернатанта выделяли Mab166 с использованием колонки с белком G Protein-G (можно приобрести в PIERCE). Ниже настоящее изобретение проиллюстрировано при помощи неограничивающих примеров. Если не указано другое, для получения антител использовали методики, описанные в Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications). Если не указано другое, в качестве генноинженерной методики использовали метод, описанный в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2-e изд. (Cold Spring Harbor Пример 1 Получение антигена Экстрагировали хромосомную ДНК стандартного штамма РАО 1 Pseudomonas aeruginosa, полученного из Университета Токаи, Японии, и амплифицировали ген, кодирующий белок PcrV (SEQ ID NO: 2) методом ПЦР, используя ДНК в качестве матрицы. Создавали сайт распознавания ферментом рестрикции SphI в праймере 5'-части, сайт распознавания ферментом рестрикции HindIII в праймере 3'-части(SEQ ID NO: 3, 4) и осуществляли модификацию вектора с введением цистеина для мечения биотином между гистидиновой меткой и старт-кодоном. Амплифицированный путем ПЦР фрагмент клонировали в вектор pWE30 (можно приобрести в GE healthcare) в сайтах SphI и HindIII. После секвенирования вектор вводили в Е. coli JM109, в результате чего получали рекомбинантную Е. coli (PcrV-JM109). PcrV-JM109 культивировали в 500 мл жидкой среде для культивирования LB/ампицилин при 37 С и после достижения оптической плотности (OD) 600 0,5 добавляли IPTG до конечной концентрации 0,75 мМ. После культивирования при 37 С в течение еще 1,5 ч бактериальные клетки центрифугировали и добавляли к ним 15 мл буфера А (25 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,5 М NaCl, 2 мМ MgCl2), содержащего 0,5% лиозим(можно приобрести в Sigma). После инкубации при 0 С в течение 30 мин клетки обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования получали растворимую фракцию, которую наносили на колонку HisBind (можно приобрести в Novagen), и затем элюировали буфером В (20 мМ фосфатный буфер (рН 7,4),500 мМ NaCl), содержащим 200 мМ имидазола. Конецную элюированную фракцию диализировали против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), чтобы заменить буфер. Мечение антигена биотином Экспрессированный и очищенный, как описано выше, белок PcrV обрабатывали раствором меркаптоэтиламина в конечной концентрации 10 мМ при 37 С в течение 150 мин для восстановления остатка цистеина. Активированный РЕО-амлеимидом биотин (можно приобрести в PIERCE) добавляли в 20 кратном молярном отношении к восстановленным группам SH и оставляли для протекания реакции на ночь при 4 С, после чего осуществляли диализ для удаления непрореагировавшего биотина. Иммунизация антигеном Каждой из семи самок мышей Balb/c в возрасте 4 недель интраперитонеально вводили 20 мкг очищенного антигена PcrV с полным адъювантов Фрейнда. Поддерживающую иммунизацию осуществляли путем введения 20 мкг PcrV в неполном адъюванте Фрейнда через 14 и 35 дней. Затем через 77 дней проводили конечную иммунизацию путем интраперитонеального введения 20 мкг PcrV и введения 10 мкгPcrV в хвостовую вену. Получение гибридомы Селезенку извлекали через 3 дня после последней иммунизации, собирали клетки селезенки. Осуществляли слияние клетки селезенки и клетки миеломы мыши (р 363-Ag8.Ul, лаборатория массовых иммледований, Токио) с использование 50% полиэтиленгликоля 4000 и проводили селекцию в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Селекция антитела к PcrV Через 8 дней после слияния клеток проводили скрининг клеток, продуцирующих специфичные антитела. Метод иммуноанализа применяли следующим образом. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Nunc) добавляли 200 мкл буфера tris (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5), содержащего 2 мкг антитела к IgG мыши (можно приобрести в Shibayagi) и оставляли для иммобилизации на 16 ч при 4 С. Указанные лунки дважды промывали 300 мкл промывочного раствора (солевой раствор, содержащий 0,1% Tween 20), а затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора (50 мМ TrisHCl рН 7,5, 2% BlockAce (можно приобрести в Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), 10% сахарозы) и оставляли на 2 ч при комнатной температуре. После того как каждую лунку дважды промыли 300 мкл раствора для промывки, 50 мкл супернатанта культуры клеток разбавляли 150 мкл буфера С (50 мМ буфер tris, pH 7,6, содержащий 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% TweenSO и 25 мМ диэтилентримин-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты), добавляли в каждую лунку и оставляли для протекания реакции на ночь при 4 С. После трехкратной промывки 300 мкМ раствора для промывки, 200 мкМ буфера С, содержащего 10 нг меченого Eu стрептавидина (можно приобрести в PERKIN ELMER), добавляли 25 нг меченого биотином PcrV и оставляли для протекания реакции на 1 ч при комнатной температуре. После завершения реакции, трехкратной промывки 300 мкл раствора для промывки, добавляли 200 мкл усиливающего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-n-октилфосфин оксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Triton-X100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с временной разверткой. В результате скрининга было отобрано 20 клонов, которые продемонстрировали высокую аффинность в отношении рекомбинантного PcrV, и исследовали активность ингибирования цитотоксичностиPseudomonas aeruginosa, как описано в примере 4. В результате активность ингибирования цитотоксичности обнаружили у 10 клонов, затем эти клоны дважды клонировали методом ограниченного разбавления, часто обеспечивало отбор гибридом. Из полученных 10 клонов отобрали 4 клона, которые демонстрировали высокую активность ингибирования цитотоксичности, и обозначили 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7, соответственно. Для этих антител определяли подкласс с использованием набора для изотипирования на-9 020544 бора для иммуноферментного анализа с антителами мыши (можно приобрести в BD Biosciences) и обнаружили, что 1F3 принадлежит к подклассу IgG2a, 2A4 принадлежит к подклассу IgG2b, 6F5 принадлежит к подклассу IgG2a, 7A7 принадлежит к подклассу IgG2a. Клетки гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7, депонировали в Национальном Институте Передовой Промышленной Науки и Технологии, Международном Депозитарии Запатентованных Организмов ( 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, IBARAGI, JAPAN) 18 октября 2007 г., под номерами PERM P-21403, PERM Р-21404, PERM P-21405 и PERM P-21406, соответственно. Пример 2 Связывающая активность антител Для измерения связывающей активности антител (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7) проводили конкурентный иммуноанализ. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести вNunc) добавляли 100 мкл буфера tris (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела Fc к антителам мыши (можно приобрести в Jackson ImmunoReseach) и иммобилизовали в течение 16 ч при 4 С. Эти лунки дважды промывали 300 мкл раствора для промывки, а затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для обеспечения блокирования (твердофазный планшет с антителом к IgG мыши). После двукратной промывки 300 мкМ раствора для промывки добавляли 2 нг/лунку немеченого PcrV в пяти концентрациях в серии 10-кратных разбавлений, начиная с 500 нг/лунку. Затем добавляли 5 нг/лунку биотинилированного PcrV и оставляли для протекания реакции на ночь. После четырехкратной промывки 300 мкл жидкости для промывки и добавления 100 мкл/лунку усиливающего реагента (можно приобрести в PerkinElmer) измеряли флуоресценцию после перемешивания в течение 1 мин. В результате 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 продемонстрировали более высокую активность связывания в отношении PcrV, чем Mab166 (фиг. 1). Затем определяли аффинность 1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 и Mab166 в отношении PcrV методом поверхностного плазмонного резонанса. Антитела Fc к антителам IgG иммобилизовали на сенсорном чипе CMS с использованием набора для фиксации антител мыши Mouse Antibody Capture Kit (можно приобрести вBIACORE) на устройстве BIAcore Т 100. Затем фиксировали каждое антитело к PcrV и добавляли рекомбинантный PcrV для определения значений KD. В результате каждый клон продемонстрировал более высокую аффинность, чем Mab166. Значения аффинности составили 3,710-10 (М) для 1F3, 3,510-10 (М) для 2 А 4, 1,110-1(М) для 6F5 и 1,110-9 (М) для 7 А 7, в то время как аффинность Mab 166 составила 3,010-9 (М) (фиг. 2). Пример 3 Сэндвич-иммуноанализ с Mab166 Чтобы подтвердить, что 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 распознают эиитоп, отличны от эпитопа, распознаваемого Mab 166, проводили сэндвич-ммуноанализ между каждым антителом и Mab 166. Вначале Mab166 метили биотином. 100 мкг Mab166 и 7,853 мкг биотина NHS-PEO4 (можно приобрести в PIERCE) смешивали в 0,1 М ФБР (рН 7,4), и оставляли для протекания реакции на 2 ч на льду. Затем биотинилированное моноклональное антитело очищали путем гель-хроматографии (колонкаG2000SW (можно приобрести в TOSOH для удаления непрореагировавшего биотина из реакционного раствора. Сэндвич-иммуноанализ проводили следующим образом. В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Nunc) добавляли 100 мкл раствора ФБР (-), содержащего 500 нг антитела PcrV (1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7), и иммобилизовали в течение 16 ч при 4 С. Эти лунки промывали один раз 300 мкМ раствора для промывки, после чего добавляли 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для блокирования. После того как каждую лунку дважды промыли 300 мкл раствора для промывки, добавляли 100 мкл буфера для анализа (можно приобрести вWallac), содержащего 50 нг PcrV и 50 нг меченого биотином Mab166, и оставляли на ночь для протекания реакции при 4 С. После трехкратной промывки промывочным раствором добавляли 100 мкл буфера для анализа, содержащего 50 нг меченного Eu стрептавидина (можно приобрести в Wallac), и оставляли для протекания реакции на 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки промывочным раствором и добавления 100 мкл усиливающего реагента и перемешивания в течение 1 мин осуществляли измерение флюоресценции с разрешением во времени. В результате выяснили, что сэндвич-иммуноанализ возможен между любыми из антител 1F3, 2 А 4,6F5 и 7 А 7 и Mab166, что указывает на то, что антитела согласно настоящему изобретению распознают эпитопы, отличные от Mab166 (фиг. 3). Пример 4 Измерение активности ингибирования цитотоксичности антителами PcrV Для 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 измеряли активность ингибирования цитотоксичности. Измерения проводили следующим образом. Вначале 1F3, 2 А 4, 6F5, 7 А 7 разбавляли в серии 2-кратных разбавлений, начиная с 32 мкг/мл и 10 мкл, и распределяли в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Затем клетки миеломы мыши P3U1(из АТСС) доводили до концентрации 5106 клеток/мл или линию лейкоцитов человека U937 (из АТСС)- 10020544 доводили до концентрации 1106 клеток/мл в среде для культивирования клеток (RPMI1640, содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей L-глютамин и феноловый красный (можно приобрести в Sigma и добавляли по 100 мкл суспензии клеток в лунку 96-луночного микропланшета. Затем штамм SR24Pseudomonas aeruginosa культивировали в течение ночи в дополненной катионами жидкой среде Мюллер-Хинтон (Difco), доводили до концентрации 1108 КОЕ/мл в среде для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37 С в присутствии 5% СО 2. После перемешивания в течение 3 ч в каждую лунку добавляли по 10 мкл WST-8 (можно приобрести в Kishida Chemical Co., Ltd.) и культивировали при 37 С в присутствии 5% в течение 3 ч в случае клеток миеломы P3U1 или в течение 1 ч в случае вкеток U937. После завершения культивирования измеряли поглощение при 450 нм. В результате установили, что в случае использования клеток лейкоцитов U937, активность ингибирования цитотоксичности (IC50) составила 5,3 нМ для 1F3, 20,7 нМ для 2 А 4, 12,7 нМ для 6F5 и 14,7 нМ для 7 А 7, в отличие от значений, превышающих 213 нМ, для Mab166, и в случае использования клеток миеломы U3P1, активность ингибирования цитотоксичности (IC50) составила 4,0 нМ для 1F3, 16 нМ для 2 А 4, 7,3 нМ для 6F5 и 6,0 нМ для 7 А 7, в отличие от 54 нМ для Mab166. Т.е. 1F3, 2 А 4, 6F5 и 7 А 7 демонстрировали более высокую цитотоксичность в отношении обоих типов клеток, чем описанное ранееMab166 (Frank et al., The Journal of Infectious Diseases, 2002, vol. 186, p. 66) (фиг. 4 и 5). Пример 5 Получение укороченного PcrV Укороченный PcrV (136-233) получали следующим образом. Фрагмент, амплифицированный путем ПЦР с 5'-концевого праймера GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (SEQ ID NO: 5) и 3'-концевого праймера GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID NO: 6) с использованием pQE30-PcrV, являющейся плазмидой экспрессии антигенного белка PcrV, в качестве матрицы, обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и HindIII и встраивали в рЕТ 32b (можно приобрести в Novagen). После секвенирования вектор вводили в Е. coli штамма BL21-DE3, в результате чего получали рекомбинантную Е. coli (укороченный PcrV-BL21). Полученный экспрессирующий штамм предварительно культивировали в течение всего дня и ночи при 37 С в 2 мл жидкой культуральной среды LB/ампицилин. 2 мл предварительной культуры добавляли в 500 мл жидкой культуральной среды LB/ампицилин и культивировали при 37 С, после достижения значения OD600 = 0,5, культуральную среду выдерживали в течение 30 мин на льду. Добавляли IPTG в конченой концентрации 0,75 мМ и культивировали при 15 С в течение ночи. Бактериальные клетки собирали путем центрифугирования при 4 С, 5000g в течение 30 мин. Супернатант переносили в тругую пробирку, к осадку добавляли 10 мл буфера X (25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl), содержащего 0,1% лизоцима (можно приобрести в Sigma), и суспендировали, выдерживали на льду в течение 1 ч и после охлаждения льдом обрабатывали ультразвуком. Затем растворимую фракцию загружали на колонку Ni-NTA (Quiagen) и элюировали буфером Y (25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 200 мМ имидазола). Элюируемую фракцию диализировали с 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,4). Определение участка эпитопа В каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (можно приобрести в Nunc) добавляли 150 мкл буфера tris (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела Fc к IgG мыши (можно приобрести в Jackson ImmunoResearch), и иммобилизовали в течение 16 ч при 4 С. Эти лунки дважды промывали 300 мкл промывочным раствором, а затем добавляли в них 300 мкл блокирующего раствора и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для блокирования. После того как каждую лунку промывали 300 мкл промывочной жидкости, в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора антитела к PcrV, разбавленного до концентрации 80 нг/мл буфером С (50 мМ буфер tris, содержащий 0,9% хлорида натрия,0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Tween 80 и 25 мкМ диэтилентриамина-N,N,N',N",N"-пентауксусной кислоты, рН 7,6), после чего добавляли 50 мкл раствора меченого Eu страптавидина (можно приобрести в PERKIN ELMER), разбавленного до концентрации 200 нг/мл буфером С, 50 мкл укороченного булка PcrV, разбавленного до заданной концентрации аналитическим буфером DELFIA, и 50 мкл раствора биотинилированного PcrV, разбавленного до концентрации 1,0 нг/мл буфером С, и оставляли для протекания реакции на ночь при 4 С. После трехкратной промывки 300 мкл раствора для промывки добавляли 200 мкл усиливающего реагента (можно приобрести в PERKINELMER) и измеряли флюоресценцию с временным разрешением (фиг. 6). По результатам анализа антитела к PcrV 1F3, 2 А 4, 9D12, 12 Н 9 и рекомбинантное антитело Mab166,являющееся моделью типичного нейтрализующего антитела к PcrV, описанного ранее, продемонстрировали реактивность с полноразмерным PcrV (1-294). С другой стороны, хотя 1F3 и 2 А 4 продемонстрировали реактивность с отношении PcrV (136-233), Mab166, а также 9D12 и 12 Н 9, у которых отсутствует нейтрализующая активность, не продемонстрировали реактивности. Также был проведен анализ связывания методом Вестерн-блот. Очищенное рекомбинантное антитело нанесли на ПААГ-SDS и затем переносили на мембрану из PVDF. Мембрану блокировали ФБР,содержащем 2% реагента Block Асе (можно приобрести в Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) при комнатной температуре в течение 2 при встряхивании. К мембране добавляли раствор антитела к PcrV, раз- 11020544 бавленный до 1 мкг/мл, и оставляли до протекания реакции на ночь при 4 С, и затем промывали промывочным буфером В (10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05% Tween 20). К мембране добавляли раствор вторичного антитела, меченного пероксидазой хрена антитела к IgG (можно приобрести в GE Healthcare),и оставляли для протекания реакции на 2 ч при комнатной температуре. Затем мембрану промывали промывочным буфером В и детектировали сигнал с использованием системы ECL Plus Western Blot Detection System (можно приобрести в GE Healthcare) (фиг. 7). Нейтрализующие антитела к PcrV 1F3 и 2 А 4 реагировали с полноразмерным белком PcrV и укороченным PcrV (136-233), Mab166, a 9D12 и 12 Н 9 реагировали только с полноразмерным PcrV и не реагировали с укороченным PcrV (136-233). Эти результаты показывают, что эпитоп PcrV, распознаваемым антителами 1F3 и 2 А 4, соответствует остаткам аминокислот 136-233, а Mab166, 9D12 и 12 Н 9 распознают не только эпитоп, соответствующий остаткам аминокислот 136-233. Пример 6 Корреляция между специфичным участком белка PcrV и эффективностью цитотоксичности Проводили тест на активность подавления цитотоксичности для антител 1F3, 2 А 4 и Mab166 с использованием полноразмерного белка PcrV (SEQ ID NO: 1) и укороченного белка PcrV (имеющего последовательность аминокислот, соответствующую остаткам с 136 по 233 в SEQ ID NO: 1). Тест осуществляли следующим образом. Вначале 1F3, 2 А 4 и Mab166 разбавляли до концентрации 1,56-6,25 нМ, 6,25-25 и 50-200 нМ, соответственно, и 10 мкл этих антител добавляли в 96-луночный планшет. Для каждого диапазона концентраций в 96-луночный планшет добавляли по 10 мкМ полноразмерного белка PcrV или укороченного белка PcrV в молярных отношениях 30, 10, 3, 1 и 0,3 и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем готовили клетки миеломы в концентрации 5106 клеток/мл в среде для культивирования клеток (RPMI1640, содержащая гидрокарбонат натрия и не содержащая L-глютамина и фенолового красного (можно приобрести в Sigma и добавляли по 70 мкл в лунки 96-луночного микропланшета. Затем жидкую культуру бактерий Pseudomonas aeruginosa, штамм SR24, культивируемую в течение ночи в бульоне Мюллер-Хинтон (Difco), доводили до концентрации 1108 КОЕ/мл, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37 С в присутствии 5% CO2. По истечении 3 ч добавляли по 10 мкл WST-8 (можно приобрести в Kishida Chemical Co., Ltd.) и культивировали при 37 С в присутствии 5% СО 2 в течение 3 ч. После завершения культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм. По результатам описанного теста 1F3 и 2 А 4 продемонстрировали более высокую активность ингибирования цитотоксичности, чем Mab166. При добавлении полноразмерного белка PcrV ингибирующее действие анти-PcrV антител подавлялось дозозависимым образом (фиг. 8). При добавлении укороченного белка PcrV (136-233) ингибирующая активность 1F3 и 2 А 4 также подавлялась дозозависимым образом. Ингибирующая активность Mab166, напротив, не изменялась при добавлении укороченного PcrV(136-233) (фиг. 9). Приведенные результаты указывают на то, что антитела, распознающие эпитоп, соответствующий остаткам аминокислот 136-233 (1F3 и 2 А 4), обладают более высокой активностью ингибирования цитотоксичности, чем антитела, распознающие другие эпитопы (например, Mab166). Другими словами, можно сделать вывод, что активность ингибирования цитотоксичности зависит от области эпитопа, распознаваемой антителом к PcrV, и антитело, реагирующее с участком 136-233 белка PcrV, обладает более высокой нейтрализующей активностью. Пример 7 Анализ последовательности аминокислот антитела к PcrV (1F3 и 2 А 4) Из полученных клеток гибридомы выделяли РНК с использованием набора RNeasy Mini Kit (можно приобрести в QIAGEN). Из 1 мкг выделенной РНК амплифицировали фрагмент ДНК с использованием системы 5'RACE для быстрой амплификации кДНК, версия 2,0 (можно приобрести в Invitrogen). Для синтеза кДНК использовали праймеры TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT (SEQ ID NO: 7) для 1F3, и TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC (SEQ ID NO: 8) для 2 А 4. Праймеры, использованные в методе 5'RACE: AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (SEQ ID NO: 9) для 1F3, и AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (SEQ ID NO: 10) для 2 А 4. Амплифицированные фрагменты клонировали с использованием набора ТОРО ТА Cloning Kit (можно приобрести в Invitrogen) и секвенировали на приборе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (можно приобрести в Applied Biosystems. Результаты анализа показаны на фиг. 10 дляIF3 и на фиг. 11 для 2 А 4. Промышленная применимость Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть такого антитела не только обладают высокой аффинностью к PcrV, но также демонстрируют высокую активность ингибирования цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении эукариотических клеток. Соответственно, фармацевтическая композиция, содержащая такое моноклональное антитело или его часть, пригодна в качестве лекарственного средства для лечения инфекций, связанных с Pseudomonas aeruginosa, которые в настоящее время считаются в медицине с трудом поддающимися лечению. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моноклональное антитело против PcrV или обладающая способностью специфично связываться с PcrV часть указанного антитела, которое имеет 1) в вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельные участки, включающие следующие последовательности аминокислот: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) для CDR1; INPSNGRTNYNEKFNT (SEQID NO: 16) для CDR2; YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) для CDR3; и 2) в вариабельной области легкой цепи гипервариабельные участки, включающие следующие последовательности аминокислот: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) для CDR1; TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) для CDR2; HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) для CDR3. 2. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое способно инги- 19020544 бировать 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток лейкоцитов при концентрации от 1 до 200 нМ in vitro. 3. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое способно ингибировать 50% или более цитотоксичности Pseudomonas aeruginosa в отношении клеток миеломы при концентрации от 1 до 50 нМ in vitro. 4. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое имеет константу диссоциации (Kd) с PcrV 210-9 (М) или меньше. 5. Моноклональное антитело или часть указанного антитела согласно п.1, которое связывается с эпитопом в положениях с 136-233 последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1. 6. Фармацевтическая композиция для профилактического или терапевтического лечения инфекцииPseudomonas aeruginosa, содержащая эффективное количество моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.1-5 в качестве активного ингредиента. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей. 8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-7, отличающаяся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом. 9. Применение моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.15 для профилактического или терапевтического лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей. 11. Применение по любому из пп.9-10, отличающееся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом. 12. Применение моноклонального антитела или части моноклонального антитела по любому из пп.1-5 в изготовлении лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения инфекции Pseudomonas aeruginosa. 13. Применение по п.12, отличающееся тем, что указанная инфекция представляет собой инфекцию дыхательных путей. 14. Применение по любому из пп.12-13, отличающееся тем, что указанная инфекция ассоциирована с муковисцидозом.