Антитела против склеростина

Предложены гуманизированные и гибридные антитела, которые специфически связывают склеростин человека и характеризуются высокой аффинностью к нему и сильными нейтрализующими свойствами. Антитела по настоящему изобретению можно использовать для увеличения костной массы, минеральной плотности костной ткани и прочности костей, а также для лечения различных расстройств, например остеопороза, у человека. Коритко Эндрю Игорь, Маркис Дэвид Мэттью, Смит Эрик Майкл, Свэнсон Барбара Энн (US) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к антителам против склеростина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к высокоаффинным антителам, которые специфично связывают склеростин человека, и к использованию антител в терапии различных расстройств или состояний у человека, при которой увеличение, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности костной ткани, содержания минеральных веществ в костной ткани или прочности костей могло бы иметь терапевтическую ценность. Остеопороз представляет собой заболевание, характеризующееся снижением минеральной плотности костной ткани (BMD), нарушением структуры костной ткани, а для костей, пораженных остеопорозом, высок риск возникновения переломов. Остеопороз остается основной причиной длительной нетрудоспособности и смертности, особенно среди пожилых людей. Хотя существуют эффективные способы лечения остеопороза путем изменения образа жизни и медикаментозного лечения, число и эффективность доступных в настоящее время способов лечения ограничены, они часто вызывают нежелательные побочные эффекты и подходят не всем пациентам. Ряд антирезорбтивных средств, включая кальцитонин,бисфосфонаты, заменители эстрогена и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), предотвращают последующее разрушение кости, но они не восстанавливают кость после разрушения. Существует анаболическое средство, которое увеличивает костную массу и минеральную плотность костной ткани и сохраняет структуру костной ткани, и оно доступно в виде РТН (1-34) человека. Однако это терапевтическое средство требует ежедневного подкожного введения, как правило, в течение года или более, что не совсем удобно пациентам. Склеростин, продукт гена SOST, экспрессируется на высоком уровне в остеоцитах костной ткани. Из-за активности склеростина в качестве эффективного отрицательного регулятора формирования костной ткани он является желаемой мишенью для терапевтического вмешательства при расстройствах или состояниях, при которых эффективно увеличение, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности костной ткани, минерального вещества в костной ткани или прочности кости, например, при остеопорозе. Следовательно, антитела против склеростина могут быть эффективны при анаболическом подходе к лечению таких расстройств или состояний. В международной публикации WO 2006/119107 описаны аминокислотные последовательности некоторых гуманизированных антител против склеростина, в которых все гипервариабельные участки (CDR) являются полностью мышиными, т.е. не отличаются от CDR антитела, продуцируемого мышами in vivo. Существует потребность в альтернативном антителе против склеростина, которое связывает склеростин человека с высокой аффинностью и обладает низким значением 1 С 50 в анализе биоактивности склеростина. Можно предположить, что такое антитело будет обладать большей терапевтической эффективностью, особенно в случае остеопороза, и будет требовать меньшей частоты введения, чем в случае РТН (1-34) или антитела против склеростина с меньшей аффинностью связывания (т.е. более высоким значением KD) или более высоким значением IC50. Также существует потребность в антителе, которое специфично в отношении склеростина человека и при использовании которого снижался бы риск иммунной реакции на введение антитела у человека или уменьшался бы риск нестабильности при сохранении высокой аффинности антитела против склеростина человека и низкого значения IC50 в анализе биоактивности. Антитела против склеростина по настоящему изобретению удовлетворяют этим нуждам и имеют определенные преимущества. Антитела по настоящему изобретению представляют собой химерные или гуманизированные моноклональные антитела, содержащие специфическую полипептидную последовательность, описанную в настоящем изобретении, специфично связывают склеростин человека с высокой аффинностью и могут быть использованы для увеличения, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности костной ткани, содержания минеральных веществ в костной ткани и прочности костей у млекопитающих, предпочтительно у человека. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, аминокислотная последовательность одного CDR антитела по настоящему изобретению отличается от последовательности CDR, расположенного в том же положении родительского антитела, т.е. в антителе, продуцируемом грызунами in vivo (например, мышами), из которого получен вариант антитела, т.е. гуманизированное или химерное антитело по настоящему изобретению. Предпочтительно такая аминокислотная(ые) замена(ы) в последовательностиCDR антитела по настоящему изобретению обеспечивает повышенную аффинность связывания со склеростином человека (т.е. более низкое значение KD), более низкое значение IC50 в тесте на биоактивность склеростина или и то и другое, по сравнению с родительским антителом. Аминокислотная замена в последовательности CDR антитела по настоящему изобретению относительно CDR родительского антитела может привести к снижению иммуногенного ответа на антитело при введении антитела человеку. Более того, аминокислотная замена в последовательности CDR антитела по настоящему изобретению относительно последовательности CDR родительского антитела может снизить риск нестабильности антитела,например, при замене остатка аспарагина на остаток другой аминокислоты, что снижает риск дезамидирования. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению специфично связывает склеростин человека и содержит шесть гипервариабельных участков (CDR) с аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из:(iii) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:32, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:33, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:34,LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:35, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:36 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:37. В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению специфично связывает склеростин человека и содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи ("HCVR") и полипептид вариабельной области легкой цепи ("LCVR"), причем:(i) HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 и LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17;(ii) HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15 и LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 или(iii) HCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 и LCVR имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению специфично связывает склеростин человека и содержит полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи, причем:(i) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;(ii) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или(iii) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 и полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению, описанные в настоящем изобретении, предпочтительно обозначенные номером последовательности SEQ ID, кроме того,отличаются тем, что аффинность связывания (KD) указанного антитела со склеростином человека составляет около 10 пМ или менее при 25 С. Значение KD предпочтительных антител по настоящему изобретению для склеростина яванского макака составляет около 100 пМ или менее при 25 С. Аффинность наиболее предпочтительных антител по настоящему изобретению против склеростина человека составляет около 10 пМ или менее при 25 С, и аффинность против склеростина яванского макака составляет около 100 пМ или менее при 25 С. В другом варианте осуществления антитела по изобретению, описанные в настоящем описании,предпочтительно обозначенные номером последовательности SEQ ID, кроме того, отличаются тем, что в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости, с использованием склеростина человека, значение 1 С 50 указанных антител составляет 50 нм или менее. Предпочтительно значение KD указанных антител для склеростина человека составляет около 10 пМ или менее при 25 С. Более предпочтительно значениеKD указанных антител для склеростина человека составляет около 10 пМ или менее при 25 С, а значениеKD указанных антител для склеростина яванского макака составляет около 100 пМ или менее при 25 С. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит гомогенную или по существу гомогенную популяцию моноклональных антител по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Изобретение также относится к применению антитела по настоящему изобретению для получения лекарственного средства. Кроме того, изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению в способе увеличения, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности кости,содержания минеральных веществ в костной ткани или прочности костей животных, предпочтительно млекопитающих, наиболее предпочтительно человека. Изобретение также относится к способу увеличения, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности кости, содержания минеральных веществ в костной ткани или прочности костей, который включает введение пациенту эффективного количества антитела по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, состояния или расстройства у человека, который заключается в увеличении, по меньшей мере,-2 018204 костной массы, минеральной плотности кости, содержания минеральных веществ в костной ткани или прочности костей, в том числе к лечению, например, остеопороза, остеопении, остеоартрита, боли, связанной с остеоартритом, периодонтального заболевания и множественной миеломы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу обнаружения белка склеростина в биологическом образце, включающему инкубирование антител по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях и в течение времени, достаточных для связывания указанного антитела с белком склеростином и обнаружения указанного связывания. Предпочтительное антитело, которое можно использовать в таком анализе обнаружения, содержит полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:40 и полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:41; полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:42 и полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:43; полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2 и полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:5; полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:3 и полипептид легкой цепи с последовательностьюSEQ ID NO:6 или полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:4 и полипептид легкой цепи с SEQ ID NO:7. Более того, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитело по настоящему изобретению; к вектору, содержащему такую нуклеиновую кислоту,необязательно, функционально связанную с контрольными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной указанным вектором; к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор; к способу получения антител по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина и, таким образом, экспрессию нуклеиновой кислотой, и, необязательно, выделение антител из культуральной среды культуры клеток-хозяев. Изобретение относится к антителам, которые специфично связывают склеростин человека, нейтрализуют или обладают антагонистической активностью в отношении по меньшей мере одной из биологических активностей склеростина человека in vitro или in vivo и, кроме того, проявляют высокую аффинность в отношении склеростина человека. Как используется в настоящем изобретении, термин "склеростин" относится к полноразмерному белку человека с аминокислотой последовательностью SEQ ID NO:1 или к зрелой форме белка без сигнальной последовательности. Термин "антитело", используемый в описании, по отношению к антителу против склеростина по настоящему изобретению (или просто "антитело по настоящему изобретению"), относится к моноклональному антителу. "Моноклональное антитело" относится к химерному антителу или гуманизированному антителу, если не определено иначе. Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть получены с использованием, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, способами синтеза, например прививки CDR, или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных в данной области. "Моноклональное антитело" относится к антителу, которое получено из единственной копии или клона, включая, например, любой клон эукариот, прокариот или фаги, а не к способу его получения."Моноклональное антитело", или "антитело по настоящему изобретению", или просто "антитело" может быть интактным антителом (содержащим полноразмерный Fc-участок) либо частью или фрагментом антитела, содержащим антигенсвязывающий участок, например Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент илиF(ab')2-фрагмент химерного или гуманизированного антитела. Особенно предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты антитела по настоящему изобретению сохраняют способность ингибировать или нейтрализовать один или более видов биологической активности склеростина млекопитающего in vitro или in vivo. Например, в одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий участок антитела по настоящему изобретению может ингибировать взаимодействие зрелого склеростина человека с одним или несколькими лигандами и/или может ингибировать одну или несколько функций склеростина человека, опосредуемых рецептором. Кроме того, как используется в описании, "моноклональное антитело", или "антитело по настоящему изобретению", или просто "антитело" может представлять собой одноцепочечный фрагмент Fv, который может быть получен соединением ДНК, кодирующей LCVR и HCVR с линкерной последовательностью. (См., Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Понятно, что независимо от того, определены ли антигенсвязывающие фрагменты или части, использующийся в настоящем описании термин "антитело" включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы, если не определено иначе. Если белок сохраняет способность связывать склеростин, то он охватывается термином "антитело". Как используется в настоящем описании, термин "специфично связывает" относится к ситуации,когда один член специфически связывающейся пары, по существу, не связывает молекулы, отличные от партнера по специфическому связыванию по результатам измерения с использованием доступных в данной области методик, например, таких как конкурентный анализ ELISA, анализ BIACORE или анализKINEXA. Этот термин также может использоваться в случае, если, например, антигенсвязывающий участок антитела по настоящему изобретению специфичен в отношении конкретного эпитопа, содержа-3 018204 щегося в ряде антигенов, в таком случае антитело, несущее антигенсвязывающий участок, способно специфически связывать различные антигены, несущие этот эпитоп. Термин "эпитоп" относится к части молекулы, которую могут распознавать и связывать один или более антигенсвязывающих участков антитела. Фраза "биологическая активность" применительно к антителу по настоящему изобретению включает, но не ограничивается, аффинность связывания эпитопа или антигена, способность нейтрализовать или проявлять антагонизм в отношении биологической активности склеростина in vitro или in vivo, значение IC50 в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости (в частности, как описано в примере 2) или другом тесте активности антитела in vitro и/или стабильности антитела in vivo и иммуногенные свойства антитела, например, при введении человеку. Указанные свойства или характеристики можно наблюдать или измерять с помощью хорошо известных в данной области методик, включая, но ими не ограничиваясь, ELISA, конкурентный ELISA, метод поверхностного плазмонного резонанса, in vivo и invitro анализы нейтрализации без ограничения, анализы на связывание с рецепторами и иммуногистохимический анализ срезов тканей различных источников, включая ткани человека, обезьяны или ткань из любого другого источника, при необходимости. Фраза "биоактивность" по отношению против склеростина включает, но ими не ограничивается,специфическое связывание склеростина с другим белком (например, с рецептором или членом семействаTGF- ), одну или более опосредуемых рецептором функций склеростина человека, передачу сигнала,иммуногенные свойства, стабильность in vitro или in vivo, влияние на уровень или активность другого белка in vitro или in vivo (см., в частности, пример 2), экспрессию склерозина и распределение его в тканях. Как используется в настоящем изобретении, термин "ингибировать" или "нейтрализовать" по отношению к биоактивности антитела по настоящему изобретению означает, по существу, антагонистическую способность, способность антитела сдерживать, замедлять, разрушать, устранять, останавливать,уменьшать или обращать биологическую активность склеростина (в частности, как измерено в примере 2 настоящего описания). Используемый в настоящем описании термин "нумерация по Кабату" хорошо известен в данной области и относится к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными) по сравнению с другими остатками тяжелой и легкой цепей антителаInterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH91-3242 (1991. Положение CDR в вариабельной области антитела указывают в соответствии с нумерацией Кабат или просто "Кабат". Полинуклеотид является "функционально связанным" в том случае, если он находится в функциональной взаимосвязи с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию этой последовательности. Термины "индивид" и "пациент" в настоящем описании используются взаимосвязано к млекопитающим, предпочтительно к человеку. В одном из вариантов осуществления пациент, кроме того, характеризуется наличием заболевания или расстройства, при которых снижение уровня склеростина или снижения биоактивности склеростина может иметь терапевтическую ценность. Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспортировке другой нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана, включая, но ими не ограничиваясь, плазмидные или вирусные векторы. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую они введены, при этом другие векторы способны интегрировать в геном клеткихозяина после введения в клетку-хозяина и, следовательно, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании называются "рекомбинантными векторами экспрессии"(или просто "векторами экспрессии"). Примеры векторов хорошо известны в данной области. Выражения "клетка", "клетка-хозяин" и "культура клеток" используются в настоящем описании взаимозаменяемо, и к ним относятся отдельные клетки или культура клеток, которые являются реципиентами для любого выделенного полинуклеотида по настоящему изобретению или любого рекомбинантного вектора(ов), содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую HCVR, LCVR или антитело по настоящему изобретению. Клетка-хозяин включает клетки, которые трансформированы, трансдуцированы или инфицированы одним или несколькими рекомбинантными векторами или полинуклеотидами, экспрессирующими моноклональное антитело по настоящему изобретению или его легкую цепь,или тяжелую цепь. Каждая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит N-концевую вариабельную область тяжелой цепи (в настоящем описании "HCVR") и константную область тяжелой цепи. Каждая легкая цепь полноразмерного антитела содержит N-концевую вариабельную область легкой цепи (в настоящем описании "LCVR") и константную область легкой цепи. Области HCVR и LCVR можно, кроме того, разделить на гипервариабельные участки, которые называют участками, определяющими комплементарность("CDR"), между которыми расположены более консервативные участки, называемые каркасные участки("FR"). Функциональная способность антитела связывать конкретный антиген или эпитоп во многом зависит от наличия шести CDR в вариабельной области. Каждая из HCVR и LCVR включает три CDR(HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в HCVR и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в LCVR) и четыре FR, которые расположены от амино- до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.CDR содержат большую часть остатков, которые участвуют в специфичных взаимодействиях с антигеном. Положение CDR в вариабельной области указывают в соответствии с нумерацией Кабат. Легкие цепи классифицируют на каппа и лямбда, и они характеризуются конкретной константной областью, что известно в данной области. Тяжелые цепи классифицируют на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела: IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE соответственно, а некоторые из них дополнительно делят на подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретной константной областью с последовательностью, что хорошо известно в данной области. Предпочтительными для антител по настоящему изобретению являются каппа-область легкой цепи и константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 тяжелой цепи. В наиболее предпочтительном случае константная область тяжелой цепи содержит полипептид с аминокислотной последовательностьюSEQ ID NO:38, кодируемый полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO:39. Химерные антитела могут включать константные области, которые не имеют человеческого происхождения, предпочтительно константные области крысы или мыши. Как используется в настоящем изобретении, термин "антигенсвязывающий участок" или "антигенсвязывающая часть" относится к части молекулы антитела в пределах вариабельной области, содержащей аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с антигеном и придают антителу специфичность и аффинность связывания с антигеном. Эта часть антитела включает каркасные остатки аминокислот, необходимые для поддержания необходимой конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит шесть CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:20, 21, 22, 23, 24 и 25. Другое предпочтительное антитело по настоящему изобретению включает шесть CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:32, 33,34, 35, 36 и 37. Наиболее предпочтительное антитело по настоящему изобретению включает шесть CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:26, 27, 28, 29, 30 и 31. CDR этих предпочтительных антител расположены в положениях, указанных в табл. 1. CDR расположены в вариабельной области в соответствии с нумерацией по Кабат. Предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17, 18 или 19. Другие предпочтительные моноклональные антитела по настоящему изобретению содержат HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, 15 или 16. В наиболее предпочтительном варианте антитело по изобретению содержит LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 и HCVR с аминокислотной последовательностьюSEQ ID NO:14. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению содержит LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:19 и HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16. Наиболее предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:18 и HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15. Такие LCVR предпочтительно связаны с константной областью легкой цепи, предпочтительно полученной из антитела человека, предпочтительно с каппа-цепью. Такие HCVR предпочтительно функционально связаны с константной областью тяжелой цепи, предпочтительно антитела человека, предпочтительноIgG1 или IgG4, наиболее предпочтительно с константной областью тяжелой цепи с последовательностьюSEQ ID NO:38. Одно из предпочтительных антител по настоящему изобретению включает полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2 и полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:5. Полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2 может кодироваться, например, полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:8, полипептид легкой цепи с последовательностьюSEQ ID NO:5 может кодироваться, например, полинуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO:11. Другое предпочтительное антитело по настоящему изобретению включает полипептид тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 и полипептид легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7. Полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:4 может кодироваться, например, полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:10, полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:7 может кодироваться, например, полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:13. Другое предпочтительное антитело по настоящему изобретению включает полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:3 и полипептид легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:6. Полипептид тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:3 может кодироваться полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:9, полипептид легкой цепи с последовательность SEQ ID NO:6 может кодироваться полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:12. Предпочтительные гуманизированные антитела по настоящему изобретению в настоящем описании обозначены как 86, 88 и 89. Номера их последовательностей перечислены в табл. 1. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению, в котором все шесть CDR, HCVR, LCVR,HCVR и LCVR, полная тяжелая цепь, полноразмерная легкая цепь или полноразмерная тяжелая цепь и полноразмерная легкая цепь ограничены конкретной последовательностью, показанной какSEQ ID NO (см., например, табл. 1), дополнительно характеризуется значением KD для склеростина человека при 25 С, равным менее 10, 8, 6 или 4 пМ, более предпочтительно менее 2,2 пМ. Дополнительно,предпочтительно антитело ограничено антителами, характеризующимися значением KD для склеростина яванского макака при 25 С, равным менее чем 100, 90, или 80, или менее примерно 75 пМ. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению, в котором все шесть CDR, HCVR, LCVR,HCVR и LCVR, полноразмерная тяжелая цепь, полноразмерная легкая цепь или полноразмерная тяжелая цепь и полноразмерная легкая цепь ограничены конкретной последовательностью, показанной какSEQ ID NO, дополнительно характеризуется значением IC50 в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости, с использованием склеростина человека (см., например, пример 2), равным около 50 нм или менее, около 40, 35 или 30 нм или менее, более предпочтительно 25 нм, еще более предпочтительно 20 нм (например, 20,2 нм) или менее. Более предпочтительно антитело по настоящему изобретению, в котором все шесть CDR, HCVR,LCVR, HCVR и LCVR, полноразмерная тяжелая цепь, полноразмерная легкая цепь или полноразмерная тяжелая цепь и полноразмерная легкая цепь ограничены конкретной последовательностью, показанной как SEQ ID NO, дополнительно характеризуется значением KD для склеростина человека при 25 С, равным менее примерно 10, 8, 6 или 4 пМ, более предпочтительно менее 2,2 пМ, и также характеризуется значением IC50 в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости, с использованием склеростина человека, равным около 50 нм или менее, около 40, 35 или 30 нм или менее, более предпочтительно 25 нм или менее, еще более предпочтительно около 20 нм (например, 20,2 нм) или менее. Еще более предпочтительно антитело по настоящему изобретению, в котором все шесть CDR,HCVR, LCVR, HCVR и LCVR, полноразмерная тяжелая цепь, полноразмерная легкая цепь или полноразмерная тяжелая цепь и полноразмерная легкая цепь ограничены конкретной последовательностью,показанной как SEQ ID NO, дополнительно характеризуется значением KD для склеростина человека при 25 С, равным менее 10, 8, 6 или 4 пМ, более предпочтительно менее 2,2 пМ; и также имеет в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости, с использованием склеростина человека, значение IC50, равным около 50 нм или менее, около 40, 35 или 30 нм или менее, более предпочтительно около 25 нм или менее, еще более предпочтительно около 20 нм (например, 20,2 нм) или менее; и также характеризуется значением IC50 в тесте с щелочной фосфатазой, специфичной для кости, с использованием склеростина яванского макака, равным около 75 нм или менее. Экспрессия антитела. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, экспрессирующим антитело против склеростина по настоящему изобретению. Создание и выделение линий клеток-хозяев, продуцирующих антитела по настоящему изобретению, можно осуществлять стандартными методами, известными в данной области. Для экспрессии антитела по настоящему изобретению можно использовать различные системы экспрессии, хорошо известные в данной области, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы экспрессии (такие как дрожжи, бакуловирусы, растения, клетки млекопитающих и других животных, трансгенных животных, а также клетки гибридомы), наряду с системами экспрессии на основе фагового дисплея. Антитело по настоящему изобретению может быть получено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансформируют, трансдуцируют, инфицируют или другим образом модифицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина антитела, так, чтобы проходила экспрессия легких и/или тяжелых цепей в клетке-хозяине. Экспрессия тяжелой и легкой цепей может осуществляться независимо от различных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе, или, альтернативно, тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться независимо, от разных промоторов, с которыми они функционально связаны в двух векторах. Один обеспечивает экспрессию тяжелой цепи, а другой - экспрессию легкой цепи. Экспрессию тяжелой и легкой цепей можно осуществлять в различных клетках-хозяевах. Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи антитела против склеростина в клетке-хозяине. Ген лег-6 018204 кой и/или тяжелой цепи антитела можно клонировать в вектор так, чтобы обеспечить функциональную связь сигнального пептида с N-концом гена антитела в одной рамке считывания. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среде, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой антитела можно выделить или очистить. Выделенные ДНК, кодирующие область HCVR, можно преобразовать в полноразмерный ген тяжелой цепи путем функционального соединения HCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи. Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека, а также других млекопитающих хорошо известны в данной области. Фрагменты ДНК,включающие эти области, могут быть получены, например, путем стандартной амплификации методом ПЦР. Константная область тяжелой цепи может быть любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM илиIgD), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или подкласса и может принадлежать к любому аллотипу, как описано у Кабат (выше). Предпочтительная константная область тяжелой цепи содержит полипептид с последовательностью SEQ ID NO:38. Выделенная ДНК, кодирующая область LCVR, может быть преобразована в полноразмерный ген легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания LCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи. Последовательности генов константной области легкой цепи человека, а также других млекопитающих хорошо известны в данной области. Фрагменты ДНК, содержащие эти области, можно получить, например, путем стандартной амплификации методом ПЦР. Константная область легкой цепи может представлять собой каппа- или лямбда-константную область. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих, которые можно использовать в настоящем изобретении, представляют собой клетки СНО (например, клетки АТСС CRL-9096), клетки NSO, SP2/0 и клетки COS (например, АТСС CRL-1650, CRL-1651), HeLa (АТСС CCL-2). Дополнительные клеткихозяева, которые можно использовать в изобретении, включают другие клетки млекопитающих, клетки дрожжей и прокариот. Если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяина млекопитающего, то антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно секреции антител в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из клетки-хозяина и/или культуральной среды стандартными методами очистки. После экспрессии интактные антитела, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены стандартными процедурами, известными в данной области, включая осаждение сульфатом аммония, ионный обмен, аффинные методы, обращенно-фазовую хроматографию, колоночную хроматографую гидрофобного взаимодействия, электрофорез в геле и др. Для фармацевтического применения препочтительными являются, по существу, чистые иммуноглобулины со степенью гомогенности, равной по меньшей мере 90, 92, 94 или 96%, наиболее предпочтительными являются иммуноглобулины со степенью гомогенности от 98 до 99%. После очистки, частичной или до желаемой степени гомогенности, стерильные антитела можно использовать для терапевтических целей, как описано в настоящем изобретении. Гуманизированные антитела. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению, предназначенное для использования в терапевтических целях, имеет последовательность каркасной и константной области (в тех случаях, когда она присутствует в антителе), полученную у млекопитающего, у которого предполагают использовать антитело в качестве терапевтического средства, с тем, чтобы снизить вероятность возникновения иммунного ответа на терапевтическое антитело у млекопитающего. Гуманизированные антитела представляют особый интерес, поскольку важны для терапевтического применения и уменьшают вероятность ответа антител человека на иммуноглобулин мыши, часто наблюдаемый при введении пациенту антител мышиного происхождения или антител, содержащих части, имеющие мышиное происхождение. Предпочтительно вводимые инъекцией гуманизированные антитела имеют период полувыведения,близкий скорее к периоду полувыведения природных антител человека, чем, например, к периоду полувыведения антител мыши, что позволяет снизить дозу и частоту введения пациенту. Как используется в настоящем изобретении, термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, в котором по меньшей мере одна часть имеет человеческое происхождение (т.е., например, является или идентична части антитела человека). Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из антитела, не являющегося антителом человека, например из антитела мыши, и части, полученные из антитела человеческого происхождения, соединенные друг с другом, например, химическим способом стандартными технологиями (например, синтеза) или полученные в виде единого полипептида с использованием технологий генной инженерии. Предпочтительно "гуманизированное антитело" содержит CDR, которые происходят или получены из родительского антитела, т.е. антитела, не являющегося антителом человека (предпочтительно моноклональное антитело мыши), в то время как каркасная и константная область, в случае ее присутствия(либо существенная или значительная часть, т.е. по меньшей мере 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), ко-7 018204 дируются информационной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая встречается в области иммуноглобулина человека зародышевой линии (см., например, International ImmunoGeneTics Database) или в их рекомбинантной или мутированной формах, независимо от того, получены указанные антитела в клетке человека или нет. Предпочтительно по меньшей мере две, три, четыре, пять или шесть CDR гуманизированного антитела получены путем оптимизации из CDR родительского антитела, не являющегося антителом человека, из которого получено данное гуманизированное антитело, для получения желаемого свойства, например улучшения специфичности, аффинности или нейтрализации, что может быть определено скринингом, например методом твердофазного иммуноферментного анализа. Предпочтительно оптимизированный CDR в антителе по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с родительским антителом. Некоторые аминокислотные замены в CDR гуманизированных антител 88 и 89 по настоящему изобретению, по сравнению с родительскими антителами 788 и 789 (см. примеры 5 и 6), уменьшают вероятность нестабильности антитела (например, удаление остатков Asn CDR) или снижают вероятность иммуногенности антитела при введении человеку (например, как спрогнозировано методиками IMMUNOFILTER). Гуманизированные антитела предпочтительно содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого антитела. Гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют как в реципиентном антителе, так и в CDR или каркасных последовательностях, импортированных из родительского антитела. Гуманизированные антитела могут быть подвергнуты мутагенезуin vitro стандартными способами, известными в данной области, и, таким образом, аминокислотные последовательности каркасного участка в областях HCVR и LCVR рекомбинантных гуманизированных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностейHCVR и LCVR зародышевой линии человека, но могут отсутствовать в природном наборе антител зародыша человека in vitro. Было сделано предположение, что такие аминокислотные последовательности каркасных участков HCVR и LCVR рекомбинантных гуманизированных антител по меньшей мере на 90,92, 94, 95, 96, 98%, или более предпочтительно на 99%, или наиболее предпочтительно на 100% идентичны последовательности зародышевой линии человека. В предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит последовательности каркаса легкой цепи зародышевой линии (см., например,РСТ WO 2005/005604) и последовательности каркаса тяжелой цепи зародышевой линии (см., например,РСТ WO 2005/005604). Предпочтительные каркасные участки легкой цепи зародышевой линии человека происходят из гена легкой каппа-цепи человека, выбранного из группы, состоящей из A11, A17, А 18,А 19, А 20, А 27, А 30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O2 и O8. Предпочтительные каркасные участки тяжелой цепи зародышевой линии человека выбраны из тяжелой цепи человека, выбранной из группы, состоящей из VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72,VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21,VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (см. международную публикацию WO 2006/046935). В данной области существует множество способов получения гуманизированных антител. Например, гуманизированные антитела могут быть получены путем получения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих HCVR и LCVR родительского антитела (например, антитела мыши или антитела, продуцированного гибридомой), которое специфически связывает склеростин, предпочтительно склеростин человека, путем определения CDR указанных HCVR и LCVR (нечеловеческих) и путем пересадки таких CDR-кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот на выбранные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих каркас. Необязательно, участок CDR может быть оптимизирован путем случайных мутаций или путем особого расположения так, чтобы заменить одну или несколько аминокислот в CDR на другую аминокислоту перед пересадкой участка CDR зоны в каркасный участок. Альтернативно, участок CDR может быть оптимизирован после встраивания в каркасный участок человека способами, доступными для специалиста в данной области. После пересадки последовательностей, кодирующих CDR, на выбранные последовательности человека, кодирующие каркасные участки, полученные последовательности ДНК, кодирующие гуманизированные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей, экспрессируют с получением гуманизированного антитела, которое связывает склеростин. Гуманизированные HCVR и LCVR могут экспрессироваться как часть полноразмерной молекулы антитела против склеростина, т.е. в виде слитого белка с последовательностями константной области человека. Тем не менее, последовательностиHCVR и LCVR также могут экспрессироваться без константных последовательностей с получением Fv против склеростина. Ниже приведены ссылки, в которых описаны способы, используемые для гуманизирования антител мыши, которые можно использовать, например Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:2869, 1991 и способ Винтера et al. [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Использование в диагностике. Антитело по настоящему изобретению можно использовать для диагностики расстройства или заболевания, связанного с экспрессией склеростина человека. Подобным образом, антитело по настоящему изобретению можно использовать в анализе для определения уровня склеростина у пациента, получающего лечение состояния, связанного со склеростином. Такое использование включает способы, в которых применяют антитело по настоящему изобретению и метку, позволяющую обнаруживать склеростин в биологическом образце, например в жидкости или клетке или экстракте ткани организма человека (см.,например, пример 1). Можно использовать модифицированные или немодифицированные антитела по настоящему изобретению, антитела также могут быть мечены путем ковалентного или нековалентного присоединения детектируемой группы. В данной области известно множество разнообразных способов измерения уровня склеростина в биологическом образце, включая, например, ELISA, RIA и FACS, которые составляют основу диагностики измененного или патологического уровня экспрессии склеростина. Нормальные или стандартные уровни склеростина в образце определяют с использованием любого известного способа, например, путем объединения образца, содержащего полипептид склеростина, например, с антителом по настоящему изобретению в условиях, подходящих для образования комплекса антиген:антитело. Антитело напрямую или косвенно метят детектируемым веществом, что облегчает обнаружение связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Количество образующегося стандартного комплекса определяют различными способами, такими как, например, фотометрическими средствами. Количество полипептида склеростина, присутствующее в образцах, затем сравнивают со стандартными величинами. Терапевтическое применение. Склеростин действует как отрицательный регулятор образования костной ткани (см., например,CytokineGrowth Factor Reviews, 16:319-327, 2005). У взрослых мРНК склеростина в основном обнаруживают в остеоцитах, хотя низкие концентрации авторы изобретения нашли и в хряще. Фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело против склеростина по настоящему изобретению, можно использовать для увеличения, по меньшей мере, костной массы, минеральной плотности костной ткани, содержания минеральных веществ в костной ткани или прочности костей в костях позвоночника, костях, не относящихся к позвоночнику, или в обоих видах костей, при этом пациенту вводят эффективное количество указанной композиции. Фармацевтическую композицию,содержащую моноклональное антитело против склеростина по настоящему изобретению, можно использовать для уменьшения числа переломов костей позвоночника и/или костей, не относящихся к позвоночнику, при этом пациенту вводят эффективное количество указанной композиции. Снижение числа переломов включает снижение вероятности или фактического количества переломов у пациента по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечение. Более того, антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения состояния, заболевания или расстройства, при котором присутствие склеростина вызывает или способствует появлению нежелательных патологических эффектов или при которых снижение уровня или биологической активности склеростина имеет терапевтическую значимость для пациента. Такие состояния, заболевания или расстройства включают, но ими не ограничиваются, остеопороз, остеопению, остеоартрит, боль, связанную с остеоартритом, периодонтальные заболевания или множественную миелому. Индивидуум может быть мужского или женского рода. Предпочтительно человек имеет риск перелома костей позвоночника и/или костей, не относящихся к позвоночнику. В предпочтительном случае пациент является женщиной и более предпочтительно женщиной с риском или наличием пост-менопаузного остеопороза. Предполагается, что способ по настоящему изобретению будет эффективен для пациента с любой стадией остеопороза. Кроме того, предполагается, что антитело по настоящему изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из вышеупомянутых расстройств. Термин "лечение" относится ко всем процессам, которые могут замедлить, прервать, притормозить,контролировать или остановить развитие описанного в настоящем изобретении расстройства, но не обязательно включает полное устранение всех симптомов расстройства. Как используется в настоящем описании, термин "лечение" включает введение соединения по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, особенно у человека, и включает (а) ингибирование развития заболевания, т.е. подавление его дальнейшего развития; и (b) облегчение заболевания, т.е. регрессию заболевания или расстройства, или снижение выраженности симптомов или связанных с ним осложнений. Режимы дозирования можно изменять для получения оптимального желаемого эффекта (например,терапевтического эффекта). Например, можно осуществлять введение в виде болюсной инъекции нескольких отдельных доз с перерывами или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от конкретной терапевтической ситуации. Фармацевтическая композиция. Антитело по настоящему изобретению можно вводить в состав фармацевтической композиции,подходящей для введения пациенту. Антитело по настоящему изобретению можно вводить пациенту самостоятельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или растворителем в виде одной или нескольких доз. Такие фармацевтические композиции получают в виде фармацевтических форм, подходящих для выбранного пути введения, используя соответствующие фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как дисперсные средства, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, растворяющие средства, изотонические агенты, стабилизирующие средства и т.п. Указанные композиции могут быть получены в соответствии со стандартными способами, описанными, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro,Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где представлено краткое изложение технологических приемов получения фармацевтических форм, хорошо известных специалистам в данной области. Приемлемые носители для фармацевтических композиций включают любое вещество, которое при объединении с моноклональным антителом по настоящему изобретению сохраняет активность молекулы и не взаимодействует с иммунной системой пациента. Фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело против склеростина по настоящему изобретению, можно вводить пациенту, имеющему риск развития или имеющему патологию, указанную в настоящем описании, например остеопороз, остеоартрит или другое дегенеративное заболевание костей, стандартными методиками введения. Предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит "эффективное количество" антитела по настоящему изобретению. Термин "эффективное количество" относится к количеству, необходимому (в дозах и в период времени, а также с учетом средств введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество антитела может изменяться в зависимости от факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол и вес тела индивида, а также способность антитела или части антитела вызывать желаемый эффект у индивида. Эффективное количество или доза - это также такое количество, при котором полезные терапевтические эффекты преобладают над любым токсическим или вредным воздействием антитела. Эффективное количество представляет собой, по меньшей мере, минимальную дозу, которая в то же время меньше токсической дозы, активного агента, которая необходима для получения положительного терапевтического эффекта у пациента. Другими словами, эффективное количество или терапевтически эффективное количество антитела по настоящему изобретению представляет собой количество,которое при использовании у млекопитающих, предпочтительно у человека, (i) увеличивает, по меньшей мере, костную массу, минеральную плотность кости, содержание минеральных веществ в костной ткани или прочность костей, или (ii) лечит состояние, расстройство или заболевание, при котором наличие склеростина вызывает или способствует нежелательному патологическому эффекту, или (iii) уменьшает уровень или биологическую активность склеростина, что приводит к положительному терапевтическому эффекту у млекопитающих, предпочтительно у человека, включая, но ими не ограничиваясь, остеопороз,остеопению, остеоартрит, ревматоидные артриты, периодонтальные заболевания или множественную миелому. В медицине хорошо известно, что дозы для каждого конкретного пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение,пол, длительность введения и путь введения, общее состояние и одновременное введение других лекарственных средств. В дальнейшем доза может быть изменена в зависимости от типа и тяжести заболевания. Обычная доза составляет, например, от 0,001 до 1000 мкг; предпочтительно от 1 до 100 мкг; однако можно использовать более низкие или более высокие дозы по сравнению с примерами указанных областей, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Доза при режиме суточного введения может составлять от около 0,1 мкг/кг до около 20 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг. Процесс можно контролировать путем периодической оценки, и доза может быть изменена соответственно. Предложенные количества антитела значительно зависят от назначения врача. Ключевым фактором в выборе соответствующей дозы и планировании лечения является полученный результат. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают особенности расстройства, на которое направлено лечение, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, место доставки антитела, конкретный тип антитела, способ введения, расписание введения и другие факторы, известные из медицинской практики. Антитело по настоящему изобретению можно вводить перорально, парентерально, путем ингаляции или наносить местно. В предпочтительном случае антитела по настоящему изобретению могут быть включены в состав фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения. Термин"парентеральный" включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшное введение. Парентеральное введение путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции является предпочтительным. Подкожная инъекция является наиболее предпочтительной. Приемлемые растворители для таких инъекций хорошо известны в данной области. Обычно фармацевтическая композиция должна быть стерильна и стабильна в условиях производства и хранения в готовом виде в контейнере, включая, например, запаянную ампулу, шприц или другое средство доставки, например ручку. Следовательно, фармацевтические композиции можно вводить стерильно после получения или другим микробиологически приемлемым способом. Следующие примеры приведены исключительно в качестве иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Этот анализ используют для обнаружения и определения количества склеростина в образцах сыворотки крови человека с нижним пределом обнаружения 0,4 нг/мл. Антитело 86 представляет собой фиксированное антитело, в то время как антитело 88 представляет собой обнаруживаемое антитело (последовательности антител приведены в табл.1). Внутреннюю поверхность лунок 96-луночного планшета покрывают 100 мкл полноразмерного моноклонального антитела 86 против склеростина с концентрацией 0,5 мкг/мл в 0,5 М карбонате натрия при рН 9,6 ("покрывающий буфер"). Планшет плотно закрывают и инкубируют в течение ночи при 4 С. Затем планшет трижды промывают TBST (0,4 М Tris-HCl, 3 M NaCl, 0,1% Tween 20). Затем в каждую лунку добавляют 200 мкл казеинового блокирующего буфера в PBS (Pierce, 37528) и планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшет дважды промывают промывочным буфером для удаления блокирующего раствора. Для получения стандартной кривой получают склеростин человека в концентрации 0,35 мг/мл в казеиновом блокирующем буфере и делают серию двукратных разведений (от 1,25 до 0 нг/мл) в 5% концентрированной сыворотке человека в блокирующем казеиновом буфере в PBS. Сыворотку человека пропускают через колонку с магнитными бусами, покрытыми моноклональным антителом против склеростина 86, для удаления любого эндогенного склеростина, который может присутствовать в сыворотке. 100 мкл образцов (5% сыворотки в казеиновом блокирующем буфере) или стандарта добавляют в лунки в двух повторах и затем планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем лунки промывают 5 раз промывочным буфером. В каждую лунку добавляют 100 мкл обнаруживаемого антитела (полноразмерное моноклональное антитело против склеростина 88), биотинилированного с использованием набора Pierce EZ link NHSLCbiotin. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем промывают 4 раза промывочным буфером. Пероксидазу хрена со стрептавидином разводят 1:2000 казеиновым блокирующим буфером в PBS до концентрации 0,5 мкг/мл, затем в каждую лунку добавляют 100 мкл, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и промывают 7 раз промывочным буфером. Субстрат OPD (Сигма Р 8806) добавляют в количестве 100 мкл/лунку и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем реакцию останавливают добавлением 100 мкл/лунку 1 н. HCl. Планшет считывают при OD 490 нм. Пример 2. Нейтрализация - анализ на щелочную фосфатазу, специфичную для костной ткани. Щелочная фосфатаза костной ткани является биохимическим индикатором активности остеобластов. Анализ на щелочную фосфатазу костной ткани, описанный в данном примере, основан на способности склеростина снижать уровни ВМР-4- и Wnt3a-стимулированной щелочной фосфатазы в мультипотентных клетках линии С 2 С 12 мыши, в то время как антитело, которое нейтрализует активность склеростина, будет приводить к зависимому от дозы увеличению активности щелочной фосфатазы в этом тесте.Wnt3a и ВМР-4 являются остеогенными факторами роста. Клетки С 2 С 12 (АТСС CRL 1772) помещают по 3000-5000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для тканевых культур в среде MEM с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, затем инкубируют при 37 С в 5% СО 2 в течение ночи. Исследуемое антитело разводят 0,5 средой с Wnt3a до различных конечных концентраций. Затем среду удаляют от клеток в планшете для тканевых культур и добавляют по 150 мкл на лунку предварительно смешанного раствора антитела-ВМР 4-склеростина (человека или яванского макака) до конечной концентрации антитела от 30 до 0,5 мкг/мл, конечная концентрация ВМР 4 составляет 25 нг/мл, и конечная концентрация белка склеростина составляет 1,0 мкг/мл, а концентрация кондиционированной среды составляет 0,5. Затем планшет инкубируют при 37 С в 5% СО 2 в течение 72 ч. Среду удаляют от клеток в планшете для тканевых культур, клетки промывают 1 раз PBS, затем планшет с клетками замораживают и оттаивают 3 раза попеременно при температурах от -80 и 37 С. Среду с Wnt3a получают путем выращивания клеток L-Wnt-3 А и контрольных L-клеток (АТССCRL-2647 и CRL-2648 соответственно) в течение четырех дней в пропорции 1:20 конфлюэнтного слоя клеток в среде DMEM с 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 2 мМ L-глютамином. Собранную среду фильтруют через нейлоновые мембраны размером 0,2 мкм и хранят либо при -20 С в случае длительного хранения, либо при 4 С в случае краткосрочного хранения. Активность щелочной фосфатазы измеряют путем добавления по 150 мкл на лунку субстрата щелочной фосфатазы (1-этап PNPP, Pierce 37621). Затем планшет с клетками инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, после чего считывают OD при 405 нм для определения активности щелоч- 11018204 ной фосфатазы. Значения IC50, нейтрализующей антитела, представленные в табл.2, представляют собой среднее значение величин, полученных в двух отдельных экспериментах. Вычисление значения 1 С 50 проводят с использованием SigmaPlot Regression Wizard, с приближением результатов 4-параметрической сигма-кривой. Таблица 2 Пример 3. Аффинность связывания. Равновесные исследования связывания между антителом против склеростина и склеростином либо человека, либо яванского макака ("макак"), либо крысы измеряют на приборе KinExA 3000 (SapidyneInstruments Inc.) в условиях контроля KD. Согласно этой методике антитело в фиксированной концентрации, ниже KD, смешивают с различными концентрациям склеростина и инкубируют до наступления равновесия. Фракцию свободного, несвязанного антитела, оставшегося в растворе, исследуют путем кратковременного контакта указанной равновесной смеси с бусами, покрытыми склеростином, а затем детектируют по флуоресцентно меченым вторым антителам. Обычно 2 пМ анализируемого антитела против склеростина смешивают с различными концентрациями склеростина либо человека, либо яванского макака ("макака"), либо крысы, начиная с концентрации 2-50 нм с серией трехкратных разбавлений в связывающем буфере (1 фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,02% азид натрия и 1 мг/мл альбумин коровьей сыворотки), содержащем 2 пМ анализируемого антитела. Эти растворы инкубируют до наступления равновесия в течение более двух дней при 25 С. Количество несвязанного антитела исследуют с использованием азлактонных бус, покрытых склеростином человека (Sapidyne Instruments Inc.). Эти бусы получают путем взаимодействия 50 мг сухих азлактонных шариков с 50 мкг/мл раствора склеростина человека в 50 мМ буфере карбоната натрия при рН 9,0-9,6, перемешивая в течение ночи. Затем бусы осаждают и верхнюю фракцию заменяют блокирующим раствором (1 М Tris, рН 8,0, плюс 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) и перемешивают в течение 1 ч. Исходный раствор бус разбавляют в 20 раз связывающим буфером и используют в течение трех дней. Для исследования связывания используют прибор АKinExA 3000, откалиброванный при комнатной температуре (комнатная температура равна 25 С). Обычно 6,25 мл уравновешенного раствора антитело/склеростин пропускают через колонку с бусами, покрытыми склеростином человека-азлактоном при скорости потока 0,25 мл/мин, которую затем промывают буфером (1 фосфатно-солевой раствор, рН 7,4 с 0,02% азидом натрия). Количество фракции свободного антитела против склеростина, связанного с этими бусами, определяют путем измерения флуоресценции,возникающей в результате инъекции второго меченого антитела (Су 5-меченое Fab'2-антитело козы против иммуноглобулина человека). Тестируют образцы в двух повторах для каждого набора условий условия и определяют значение KD путем приближения данных к модели связывания 1:1 с использованием программы KinExA Pro. Средние значения KD при 25 С представлены в табл.3. Таблица 3 Аффинность Пример 4. Анализ кальцина in vitro. Анализ кальцеин крысы позволяет точно оценить образование костной ткани за короткий период(10 дней) и оценить влияние антитела по настоящему изобретению на образование костной ткани. Кальцеин является флуорохромной меткой, которая встраивается в матрицу костной ткани при образовании новой костной ткани. Количественное измерение кальцеина отражает степень образования костной ткани под действием фармакологических средств. Используют шестимесячных самок крыс Спрейг-Доули(n=6/доз группа). Крысам вводят дозу каждые 3 дня подкожной инъекцией (дни 0, 3 и 6) в количестве 1 или 6 мг/кг антитела в PBS, либо в количестве 10 мкг/кг РТН ежедневно, либо в количестве 6 мг/кг IgG человека в качестве отрицательного контроля. Кальцеин вводят подкожно на 7 день и крыс умерщвляют на 10 день. Собирают бедренные кости и разрезают для определения образования трабекулярной костной ткани (дистальный метафиз) или для определения образования корковой костной ткани (тибиальный метафиз), подвергают деминерализации и определяют общее количество кальцеина путем подсчета флюорохрома. Величины, представленные в табл. 4, представляют собой средние значения, притом, что за"1,0" было принято значение для IgG человека. Данные показывают, что введение антител по настоящему изобретению приводит к образованию как трабекулярной, так и кортикальной костной ткани. Таблица 4 Пример 5. Остеоартрит. Экспрессия SOST главным образом ограничена костной тканью. Однако авторы настоящего изобретения определили, что существует другая ткань, в которой также происходит экспрессия SOST, а именно хрящевая ткань (согласно анализу ПЦР в режиме реального времени). Также экспрессия SOST была отмечена в хряще при анализе РНК, выделенных из хрящей обычных людей или больных остеоартритом. Более того, экспрессия SOST возрастает по мере роста тяжести остеоартрита, поэтому экспрессия в хряще при умеренной тяжести остеоартрита выше по сравнению с контрольной группой, при тяжелой степени выше по сравнению со средней тяжестью, а при хирургически тяжелой степени (устраняемой хирургическим путем) выше остальных, что указывает на корреляцию остеоартрита и экспрессии SOST. Антитело, специфичное в отношении против склеростина, можно использовать для лечения остеоартрита. Химерное антитело против склеростина, содержащее вариабельную область мышиного происхождения в Fc-области крысы, антитело 789, содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO:42 и легкую цепь сSEQ ID NO:43, исследуют на способность блокирования боли в суставах в модели остеоартрит MIA. Вариабельная область данного антитела представляла собой родительскую последовательность для получения гуманизированного антитела 89 (HCVR с SEQ ID NO:16 и LCVR с SEQ ID NO:19). Как гуманизированное антитело 89, так и химерное антитело 789 связывают один и тот же эпитоп. На этой модели остеоартрита используют инъекции монойодацетата MIA непосредственно в коленный сустав для стимуляции ОА-подобного процесса, который вызывает воспалительную и опосредуемую цитокинами боль и разрушение хряща. В контралатеральное колено крысы вводят только солевые инъекции и измеряют боль по разности нагрузки на 2 задние ноги. В эксперименте 1 с MIA используют молодых самок крыс Lewis (7-8 недельного возраста) в "режиме предотвращения", при котором антитело против склеростина вводят до инъекций MIA. За день до инъекций MIA крысам вводили либо 10 мг/кг антитела против склеростина внутрибрюшинно, либо 10 мг/кг контрольного IgG или PBS (n=6 на группу). На следующий день крысам делали анестезию и вводили в правое колено по 0,3 мг йодоацетата натрия, растворенного в 50 мкл 0,9% стерильного солевого раствора. В левое колено делали инъекцию одного солевого раствора. Инъекции делали через пателлярную связку с использованием инсулинового шприца с иглой 28G, закрытой пластиковым футляром,чтобы только 5 мм иглы проникало в коленный сустав. Измерения боли проводили на 2 и 7 дни после инъекции MIA (3 и 8 дни после инъекции антитела). После измерения боли на 7 день вводят вторую дозу антитела или контрольную инъекцию. Затем проводят дополнительные измерения боли на 10 и 14 дни после MIA (3 и 7 дни после второй инъекции антитела). Боль измеряют по разности нагрузки на ноги, в которые делали инъекции, при использовании парализующего средства. Крыс помещали в ящик Perspex. При этом их лапы находились на датчиках давления. Когда крысы были надежно обездвижены, проводили считывания в течение 1 с, а затем 2 дополнительных считывания и вычисляли среднее значение. Массу, действующую на ногу после инъекции MIA,вычитали из массы на ноге, в которую вводили солевой раствор и получали нагрузки. Статистически значимое уменьшение боли наблюдали при использовании антитела против склеростина в сравнении с контрольным IgG (и ФБР) на 7, 10 и 14 дни после введения MIA (табл. 5). Величины разности нагрузки на ногу, в которую делали инъекции MIA, и на ногу, в которую вводили солевой раствор, представлены в граммах (с учетом стандартной ошибки). Второй эксперимент по использованию MIA проводили на более старых крысах (27-недельного возраста) и использовали "режим лечения", в котором антитело вводят после инъекций MIA. Крысы получали MIA или контрольные солевые инъекции, как и ранее, и затем через 6 дней вводили 10 мг/кг антитела против склеростина, контрольного IgG или PBS (n=6 на группу). На 8 и 15 дни после MIA(2 и 9 дни после введения антитела), как и ранее, проводили измерения боли. На 16 день после MIA вводили вторую дозу антитела против склеростина и контрольные инъекции, а на 21 день (5 дней после введения второй дозы антитела) снова проводили измерения боли. Вскоре после введения антитела против склеростина (8 день после MIA) не наблюдали никакого влияния антитела на боль, но через 7 дней появлялась тенденция к уменьшению боли, определенная по значению разности нагрузки на ногу, в которую вводили MIA, и на ногу, в которую вводили солевой раствор, в граммах. Тенденцию к уменьшению боли при использовании антитела против склеростина также наблюдали через 5 дней после введения второй дозы антитела. Химерное антитело 789 отличалось от IgG контрольных величин на р-величину, равную 0,06 и 0,08, на 15 и 21 дни соответственно. Вместе эти результаты показывают, что боль в суставах, при болезненном процессе, вызванном действием MIA,можно устранить путем введения нейтрализующего антитела против склеростина. Пример 6. Исследование на крысах с OVX. Крыса, подвергнутая овариэктомии (OVX), представляет собой распространенную модель для изучения пост-менопаузного остеопороза. В данном изобретении эффекты антисклеростиновых антител по настоящему изобретению, содержащего вариабельную область мыши и Fc крыс, изучали на OVXкрысах. Шестимесячных самок крыс Sprague-Dawley подвергали овариэктомии и позволяли костной ткани разрушиться в течение 1 месяца перед введением доз. Одну группу крыс (n=8) не подвергали овариэктомии, а брали для сравнения с крысами, подвергнутыми овариэктомии. Всех OVX крыс случайно делили на группы лечения (n=7 в каждой) и лечили РТН (1-38), контрольным IgG (10 мг/кг) или 10 мг/кг химерного антитела против склеростина (антитело 788 с тяжелой цепью SEQ ID NO:40 и легкой цепьюSEQ ID NO:41 [вариабельная область этого антитела содержит родительскую последовательность для получения человеческого антитела 88]; антитело 789 с тяжелой цепью SEQ ID NO:42 и легкой цепьюSEQ ID NO:43 в течение всех 58 дней. Все антитела вводили подкожно единовременно 1 раз в 3 дня, а РТН (1-38) ежедневно вводили подкожно в дозе 10 мг/кг. При умерщвлении крыс бедра и позвоночник брали для количественной компьютерной томографии (СТ) с использованием СТ сканера для измерения в дистальной части бедра (трабекулярной костной ткани) и проксимальной части (кортикальной костной ткани), а также и 5-го поясничного позвонка. Ткани кости помещали на формовочную глину для обеспечения воспроизведения измерений и осуществляли сканирование бедра в 2 мм от конца эпифиза (дистальное бедро) или в 10 мм от эпифиза (проксимальная часть бедра). Измерения для позвоночника проводили с позвонком L-5, сканируя от ориентира "V" структуры в позвоночнике. Данные рассчитывали с помощью пакета программ SYS-C320-V 1.5. Биомеханические свойства бедренного диафиза, позвонка L-5 и шейки бедра измеряли после вскрытия трупов крыс в соответствии с Turner CH, Burr DB, Basic biomechanical measurements of bone: a tutorial. Bone. 14(4):595-608,1993. Механические свойства проксимальной части бедра измеряли для неповрежденного левого бедра с использованием 3-точечного сгибания под грузом, подвешенным между двух опор на расстоянии 15 мм. Бедро располагали таким образом, чтобы точка нагрузки была примерно на 7,5 мм ближе к месту крепления от дистальной подколенной ямки и сгибание осуществлялось вдоль средней поперечной оси. Экземпляры исследовали в солевой ванне при 37 С. Кривые нагрузка-смещение регистрировали при скорости головки 10 мм/мин с использованием устройства для тестирования материалов (модель: 1/S, MTS Corp, Minneapolis, MN) и анализировали с использованием программного обеспеченияTestWorks 4 (MTS Corp.) для вычисления пиковой нагрузки. Механические свойства L-5 позвонка анализировали после удаления задних отростков и получения параллельных краев тела с помощью напильника(Buehler Isomet, Evanston, IL). Экземпляры позвоночника нагружали в условиях компрессии с использованием прибора для тестирования материалов и анализировали с помощью программного обеспеченияTestWorks 4 (MTS Corp.). Для измерений шейки бедра бедро устанавливали вертикально в зажиме проксимальной частью вверх и подвешивали груз к средней части бедренной головки. Анализ проводили с помощью программного обеспечения TestWorks 4 (MTS Corp.). Средние величины и стандартные ошибки значений величин представлены в табл. 5 и 6. Данные показывают, что химерные антитела 788 и 789 увеличивают минеральную плотность кости ("BMD"), содержание минеральных веществ в костной ткани Статистически существенное увеличение от IgG контрольных инъекций, р 0,05, способ Даннета. Статистически значимое увеличение от IgG контрольных инъекции, р 0,05, метод Даннета.