Способ получения фармацевтического препарата, обладающего фибринолитической и противовоспалительной активностью
Номер патента: 2561
Опубликовано: 27.06.2002
Авторы: Федорова Надежда Ивановна, Федулов Александр Сергеевич, Марченко Людмила Николаевна, Андреенко Галина Васильевна, Максимова Роза Алексеевна, Хлюстов Станислав Валентинович, Серебрякова Тамара Николаевна, Цыманович Светлана Георгиевна, Пленина Людмила Васильевна
Формула / Реферат
1. Способ получения фармацевтического препарата, обладающего тромболитической и противовоспалительной активностью из культуральной жидкости штамма продуцента Trichothecium roseum, включающий глубинное культивирование последнего на питательной среде, с аэрацией в процессе культивирования, для образования фибринолитических ферментов, отделение культуральной жидкости с последующей фильтрацией, фракционированием и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что глубинное культивирование проводят из исходной культуры Trichothecium roseum LK.ex., штамм "Д" в течение 96+2 ч на питательной среде, содержащей, г/дм3:
Аммоний сернокислый (NH4)2SO4 | 0,8-1,4 |
Магний сернокислый MgSO4 | 0,2-0,7 |
Калий фосфорнокислый 2-х замещенный K2НРO4 | 0,8-1,2 |
Хлористый калий KCl | 0,2-0,7 |
Пищевой сахар | 25-35 |
Кукурузный экстракт (50%) | 8-12 |
Молочная кислота (100%) | 1,2-1,7 |
Вода водопроводная |
при рН среды 5,8+0,5 и температуре +25-26шС,
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракционирование культуральной жидкости ведут путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта, охлажденного до -20шС при рН = 6,4-6,8 и конечной температуре осаждения 6-10шС,
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку препарата проводят методом диализа с дополнительной очисткой на колонке с сефадексом G-100.
Текст
1 Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам получения протеолитических ферментов, обладающих фибринолитической и противовоспалительной активностью, синтезируемых микроорганизмами. Возможными продуцентами таких ферментов, обладающих фибринолитическим действием, могут служить микроорганизмы, низшие грибы. Довольно подробно изучены ферменты,продуцируемые группой плесневых грибов родаAspergillus. Препараты, полученные из них дают возможность применять их в тромболитической терапии, так как расщепляют фибриноген и фибрин до высокомолекулярных продуктов. Фибринолитическая активность обнаружена также среди несовершенных грибов. Из них особое внимание привлек сапрофитный грибTrichothecium rozeum LK. ex. Т. roseum является продуцентом многих биологически активных веществ, в том числе антибиотиков и протеолитических ферментов с фибринолитическим действием. Фибринолитическая активность свойственна всем морфологическим вариантам гриба. Однако наибольшей активностью обладают сильно измененные формы, относящиеся к линии мутантного штамма, образующего микроконидиальное спороношение. Фибринолитическая активность культуральной жидкости была обнаружена в стационарной культуре гриба. Известен метод выращивания в течение 48 ч при глубинном культивировании Т. roseumLK. ex на синтетической среде (регламентная среда для биосинтеза ферментов, включающая: г/л NaH2PO4 - 2,4; KNO3 -0,6; NH4Cl - 0,2; СаСО 3- 0,2; MgCl2 - 0,2; молочную кислоту - 0,6; сахарозу - 40; глицерин - 10 и воду водопроводную[1]. Данный метод выращивания гриба Trichothecium roseum LK. ex. в колбах и ферментере в режиме аэрации обеспечивает получение протеолитических ферментов, фибринолитическая активность которых весьма значительна. Известные методы обеспечивают высокий уровень образования фибринолитических ферментов, сопровождающихся высокой антибиотической активностью гриба. Однако при изучении влияния O2 на продукцию фибринолитических ферментов при глубинном культивировании Т.roseum LK. ex, а также регуляции биохимической активности гриба путем уменьшения значений рН среды в результате накопления СO2 в среде культивирования установлено, что имеет место снижение фибринолитической активности при увеличении концентрации СО 2 в среде культивирования. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в увеличении выхода конечного продукта и повышении 2 фибринолитической и противовоспалительной активности препарата за счет увеличения интенсивности биосинтеза ферментов, выбора оптимального времени культивирования и рН среды,а также условий фракционирования и очистки культуральной жидкости. Проведенные исследования показали, что биосинтез ферментов в культуре Trichotheciumroseum имеет два максимума: первый - на 48 ч культивирования гриба, второй - на 96 ч и связан со значительным лизисом мицелия гриба и выходом в культуральную жидкость эндогенных протеинов. Одновременно в культуре происходит образование антибиотика трихоцетина. Для решения поставленной задачи в способе получения фармацевтического препарата,обладающего фибринолитической и противовоспалительной активностью из культуральной жидкости штамма продуцента Trichotheciumroseum, включающем глубинное культивирование и последнего на питательной среде, с аэрацией в процессе культивирования с образованием фибринолитических ферментов, отделение культуральной жидкости с последующей фильтрацией, фракционированием и очисткой целевого продукта, при котором глубинное культивирование проводят из исходной культуры Trichothecium roseum LK.ex., штамм Д на питательной среде в ферментере в течение 96 2 ч на среде, содержащей, г/дм 3: Аммоний сернокислый (NH4)2SO4 Магний сернокислый MgSO4 Калий фосфорнокислый 2-х замещенныйK2 НРO4 Хлористый калий KСl Пищевой сахар Кукурузный экстракт (50%) Молочная кислота (100%) Вода водопроводная при рН среды 5,80,5 и температуре +25-26 С,фракционирование культуральной жидкости ведут путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта, охлажденного до - 20 С при рН = 6,4-6,8 и конечной температуре осаждения 6 - 10 С, а очистку методом диализа и дополнительной очисткой на колонке с сефадексом G-100. Полученный препарат представляет собой комплекс протеолитических ферментов и обладает высокой фибринолитической, плазминогенактиваторной и противовоспалительной активностью. Способ осуществляется следующим образом. Для получения препарата используют грибTrichothecium rozeum LK.ex., штамм Д. По традиционной технологии исходную культуру хранили в пробирках на косяках агара Чапека при температуре 04 С. При изготовлении из исходной культуры рабочей посевной партии T.rozeum LK.ex. штамм Д конидии гриба переносили петлей в пробирки с агаром Чапека на среде следующего состава, г/дм 3: Натрий азотнокислый NaNO3 Магний сернокислый MgSO4 Калий фосфорнокислый 2-х замещенный Пробирки инкубировали в термостате при температуре 25-26 С в течение 7-9 дней. Далее пробирки выставляли на дневной свет при комнатной температуре на 3-4 дня. В течение этого времени культура приобрела характерную для нее розовую окраску. Спустя две недели выросшие культуры в пробирках просматривали и проводили отбор, получили посевной материал мицелия. Далее проводили выращивание посевного мицелия на заявляемой питательной среде, содержащей аммоний сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый 2-х замещенный, калий хлористый, сахарозу, молочную кислоту, кукурузный экстракт и воду, рН = 5,80,5. Посевной мицелий выращивали на качалках, делающих 200 об/мин в течение 48-60 ч при температуре 25-26 С. Проводили глубинное культивирование и ферментацию выросшего вегетативного мицелия. Ферментацию осуществляли в цилиндрическом аппарате из нержавеющей стали с турбинной мешалкой и барботером. Объем 20,0 л. Для ферментации использовали питательную среду, содержащую аммоний сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый 2-х замещенный, хлористый калий, пищевой сахар, кукурузный экстракт, молочную кислоту, воду, рН=5,80,5. Среду стерилизовали в течение 40 мин при 2,8 атм. при 120 С. После окончания стерилизации среду охлаждали до 26 С, после чего засевали вегетативным мицелием, выросшим в колбах на качалке. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. Перед посевом добавляли стерильный этиловый спирт и проводили отбор среды для анализа на Стерильность РН Процесс ферментации проводили при температуре в аппарате 25-26 С, непрерывно продувая стерильный воздух через барботер в количестве 1 объем на 1 объем среды в минуту,непрерывно перемешивая на мешалке со скоростью 200 об./мин. Ежесуточно отбирали пробу, определяя состояние мицелия, рН, стерильность, фибринолитическую активность культуральной жидкости. Процесс ферментации вели в течение 96 2 ч. По окончании ферментации культуральную жидкость из аппарата сливали и фильтро 4 вали через капроновое сито и четыре слоя фильтрующей ткани (бязь). При недостаточном осветлении культуральную жидкость сепарировали. Прозрачный желтоватый фильтрат собирали в сборник для приема нативного раствора,замеряли объем и отбирали пробу на активность. Нативный раствор замораживали при температуре -18 С. Размораживание нативного раствора проводили при комнатной температуре и концентрировали на колонке с мембранами ПА-10 и плоскорамнике с мембранами ПА-100. Концентрированно проводили до объема соответствующего 8-10 исходного объема культуральной жидкости. В концентрате и фильтрате, полученном в процессе концентрации, определяли белок,фибринолитическую активность. Концентрированную культуральную жидкость охлаждали до 0 С и проводили осаждение белка. Для чего к охлажденному раствору добавляли охлажденный до -20 С этиловый спирт из расчета три объема спирта на один объем культурального концентрата. Смесь осторожно перемешивали в течение 5-10 мин и оставляли для отстаивания в течение ночи при температуре +4C. Отделяли выпавший в осадок белок и центрифугировали при 2000 об./мин. Осадок очищали методом диализа в течение 24 ч при температуре 2-4 С. Нерастворимую часть осадка отбрасывали. Для увеличения удельной фибринолитической активности препарата проводили дополнительную очистку на колонке с сефадексом G100. Удельная фибринолитическая активность препарата при этом значительно увеличивалась,составляла 74900 условных единиц (УЕ). В полученном препарате определяли белок(спектрофотометрически) и фибринолитическую активность по зонам лизиса фибриновых пластинок. В результате получали препарат, выделенный из культуральной жидкости гриба T.rozeumLK.ех. штамм Д, представляющий комплекс протеаз, обладающий фибринолитической активностью: лизировал стандартные фибриновые пластины, с содержанием белка 0,2-0,6 мг/мл и удельной активностью 2000-4600 УЕ, пригодный для получения лекарственных форм. Пример конкретного выполнения способа Использовали гриб Trichothecium rozeumLK, ex. штамм "Д", выделенный из лесных орехов (типичный представитель вида), и характеризующийся образованием широкорастущих,интенсивно спорулирующих колоний яркооранжевого цвета. Штамм "Д" был выделен в лаборатории антибиотиков МГУ в 1970 году в качестве продуцента трихоцетина. 1. Культивирование штамма продуцента. 1.1.Получение рабочей партии культуры. Рабочую партию готовили из исходной культуры Trichotecium roseum Lk, ex., штамм Д, которая хранилась на скошенном агаре Чапека при Т=+4 С следующего состава (г/дм 3): Пищевой сахар Натрий азотнокислый NaNO3 Калий фосфорнокислый 2-х замещенный Для приготовления 1 дм 3 среды используемые соли растворяли в 700 мл водопроводной воды, далее добавляли агар-агар и нагревали, доводя до растворения агара. Горячую жидкую среду разливали во флаконы объемом 0,5 дм 3 по 0,3 дм 3 и стерилизовали при Т = 120 С в течение 30 мин. После стерилизации среду разливали в пробирки и раскладывали с уклоном, в результате чего при охлаждении и застывании агара получали скошенные поверхности питательной среды. Пробирки со скошенным агаром засевали культурой гриба путем смыва конидий в стерильных условиях из исходной пробирки, вблизи горящего факела. Затем пробирки инкубировали при температуре 25-26 С в течение 7-9 сут. и выставляли на дневной свет, при комнатной температуре на 3-4 сут. В течение этого времени культура приобрела характерную для нее розовую окраску, зависящую от образования в конидиях и мицелии пигментов-каротиноидов. Спустя две недели выросшие культуры просматривали и проводили отбор косяков с наиболее розовой окраской. Далее отобрали два косяка из числа приготовленных косяков и провели проверку на отсутствие посторонней микрофлоры путем добавки в пробирки 5 мл сусла и последующей выдержки в термостате при температуре 24-25 С в течение 5 сут; на отсутствие бактерий путем высева из культуры в пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и мясопептонным агаром (МПА) с выдержкой в течение 5 сут. при температуре 37 С; на отсутствие дрожжей путем заливки в пробирки стерильного сусла и последующей выдержки при температуре 28 С в течение 7 сут. 1.2. Выращивание посевного мицелия в качалочных колбах. Выращивание посевного мицелия проводили в трех колбах объемом 1 дм 3 . Для этого готовили полусинтетическую среду следующего состава (в г/дм 3 ):K2 НРО 4 Хлористый калий KСl Пищевой сахар Кукурузный экстракт (50%) Молочная кислота (100%) Вода водопроводная Соли растворяли в 1000 мл водопроводной воды, затем добавляли кукурузный экстракт,молочную кислоту, сахар и доводили объем до 1,5 дм 3. РН среды устанавливали в пределах 5,25,4 путем добавления 20%-ного раствора гидрбксида натрия. Среду разливают в три колбы по 500 мл и автоклавировали при температуре 120 С в течение 30 мин. После стерилизации рН среды должно быть в пределах 5,80,5. После охлаждения колбы со стерильной питательной средой засевали конидиями гриба. Для засева одной колбы использовали конидии с одного скошенного агара. Посевной мицелий выращивали на качалках, делающих 200 мин-1 в течение 36-48 ч при температуре 25-26 С. 1.3. Выращивание посевного мицелия в инокуляторе. Выращивание посевного мицелия проводили в инокуляторе объемом 0,025 м 3. Для инкубирования готовили полусинтетическую среду следующего состава (г/дм 3): Аммоний сернокислый NH4)2SO4) Магний сернокислый (MgSO4) Калий фосфорнокислый 2-х замещенный(K2 НРО 4) Хлористый калий (KСl) Пищевой сахар Кукурузный экстракт (50%) Молочная кислота Вода водопроводная Соли растворяли в 10 дм 3 водопроводной воды, затем добавляли кукурузный экстракт,молочную кислоту, сахар и доводили объем до 15 дм 3. РН среды устанавливали в пределах 5,2 5,4, 20%-ным раствором гидроксида натрия. Среду заливали в инокулятор и стерилизовали горячим паром при температуре 120 С в течение 1,5 ч. После стерилизации рН среды должно быть в пределах рН= 5,0-5,4. В это время готовили фильтр тонкой очистки воздуха. Проверили его на герметичность,выдерживая при давлении воздуха 0,1 - 0,15 МПа в течение 45-60 мин. При этом давление в фильтре должно уменьшится более чем на 0,05 МПа. Стерилизовали фильтр паром при давлении 0,14 - 0,15 МПа в течение 1 -1,5 ч. Затем в течение часа продували теплым воздухом. После охлаждения в аппарат со стерильной питательной средой, соблюдая правила асепти 7 ки, добавили посевной материал, полученный на предыдущей стадии, в количестве 1,5 дм 3 (510% от объема среды) и подавали стерильный воздух. Культивирование проводили при следующем режиме: перемешивание со скоростью не менее 200 мин-1; время культивирования 36-48 ч; температура 25-26 С; давление 0,1 МПа. Получили посевной материал, удовлетворяющий следующим требованиям: рост культуры хлопьевидный или мелкозернистый. При отстаивании в пробирке объем мицелия составлял половину общего объема со средой; мицелий был выращен в течение 36-48 ч и был стадийно молодым. Посторонняя микрофлора отсутствовала. Провели контроль под микроскопом на отсутствие посторонней микрофлоры, а также путем предварительного посева культуральной жидкости (КЖ) на косяки с мясопептонным агаром(МПА). По истечении 12 ч при Т=37 С выявили отсутствие посторонней микрофлоры. Для обнаружения дрожжей или других посторонних грибных организмов делали высев КЖ на косяки с суслоагаром. Для этого косяки помещали в термостат при Т=24-26 С на 2-3 сут. По истечении указанного времени содержимое косяков просматривали под микроскопом и визуально. Выросший вегетативный мицелий гриба использовали для ферментации на следующей стадии. После окончания культивирования аппарат заполняли горячей водой. Воду нагревали подачей пара в рубашку реактора до температуры(1022)С при давлении 0,1-0,12 МПа. Кипятили в течение часа при постоянном перемешивании. Слили жидкость через систему трубопровода. Реактор повторно заполнили водой. Содержимое реактора перемешали и слили в канализацию, повторяя указанную процедуру 2-3 раза. Непосредственно перед загрузкой питательной среды в реактор провели стерилизацию аппарата и обвязки горячим паром, при температуре 1201 С и давлении 0,30,02 МПа в течение 1,5 ч. 1.4. Глубинное культивирование препарата. Глубинное культивирование и ферментацию препарата осуществляли в аппарате Р 8 рН 0,160-1-10, из нержавеющей стали с турбинной мешалкой. В подготовленном к работе турбинном ферментере готовили питательную среду следующего состава (г/дм 3): Аммоний хлористый (NH4Cl) Магний хлористый (MgCl) Калий азотнокислый (KNO3) Натрий фосфорнокислый 1-замещенный 8 Этиловый спирт (96%) Молочная кислота Глицерин Вода водопроводная Питательная среда готовится с таким расчетом, чтобы коэффициент заполнения аппарата был равен 0,7. Порядок приготовления средыследующий: реактор заполняли водопроводной водой на 50%, добавляли соли, кукурузный экстракт, глицерин, и, в последнюю очередь, тонкой струй при непрерывном перемешивании молочную кислоту. Затем доводили водой объем до 95 л и устанавливали рН среды в 6,0 20%ным раствором гидроксида натрия. После этого крышку плотно закрыли и стерилизовали среду в течение 40 мин при температуре 120 С и давлении пара на линии не менее 0,28 МПа. Затем среду охладили до 25-26 С подачей холодной водопроводной воды в рубашку аппарата. Добавили стерильный этиловый спирт после стерилизации в охлажденную среду, соблюдая условия асептики. Получили среду, отвечающую следующим требованиям: стерильность; рН= 5,6-5,8; содержание сахара не менее 3,5%; содержание общего азота не менее 40 мг/дм 3. Затем в ферментер загрузили вегетативный мицелий гриба Trichotecium roseum, полученный с предыдущей стадии в количестве 15 дм 3(10-15% от объема загружаемой среды) и подали стерильный воздух, подготовленный как описано выше. Ферментацию препарата проводили при следующем режиме: перемешивание со скоростью не менее 200 мин-1; время культивирования 96 ч; температура 26-26 С; давление 0,110,01 МПа; расход воздуха 1 дм 3/ мин. Для предотвращения сильного пенообразования добавляли небольшими порциями стерильное подсолнечное масло. На одну загрузку должно расходоваться не более 0,25% пеногасителя от объема питательной среды, при этом добавку пеногасителя желательно проводить только исключительно в крайних случаях, т.к. подсолнечное масло осложняет выделение и очистку препарата. Режим ферментации контролируют термометром сопротивления (температуру), манометром (давление). Контроль за процессом проводили путем ежесуточного отбора пробы. В пробах определяли состояние мицелия, рН среды, стерильность, фибринолитическую активность культуральной жидкости. Процесс ферментации проводили в течение 96 ч. По истечении этого времени фермен 9 тационная жидкость удовлетворяла следующим требованиям: фибринолитическая активность составила 320 мм 2; содержание белка - 0,32 мг/мл. После ферментации аппарат заполняли горячей водой, промывали и стерилизовали, как описано выше. 2. Выделение препарата. 2.1 По окончании процесса ферментации проводили отделение мицелия от культуральной жидкости. Культуральную жидкость из аппарата сливали и фильтровали через капроновое сито и четыре слоя фильтрующей ткани (бязь). Культуральная жидкость удовлетворяла следующим требованиям: была прозрачной слегка желтого цвета; активность 250-600 мм 2 или 800-3000 ФЕ; белок - 0,32 мг/см 3. 2.2 Мембранное концентрирование культуральной жидкости. Освобожденную от биомассы культуральную жидкость перекачивали по системе трубопровода в реактор, соединенный с ультрафильтрационной установкой и приступали к процессу фильтрации при давлении 0,20,02 МПа и температуре 10-15 С. Концентрировали культуральную жидкость до объема 505 дм 3. К указанному объему сконцентрированной культуральной жидкости добавляли дробно по 302 дм 3 дистиллированной воды и приступали к диализу раствора. Процесс вели до конечного объема 4510 дм 3 диализата, корректировали рН фосфатным буфером и охлаждают до 0-+4 С. Концентрат удовлетворял следующим требованиям: рН 7,0-7,5; активность; содержание белка. Пермиат, не обладающий фибринолитической активностью, сливали в канализацию. По окончании работы мембранный блок,насосный агрегат, соединительные коммуникации обрабатывали 0,05 н. раствором гидроксида натрия. Заправку новых мембран производили по мере снижения качества процесса ультрафильтрации. 2.3. Фракционирование культуральной жидкости. Немедленно после концентрирования в реактор, при включенном перемешивающем устройстве, приливали из сборника охлажденный до -20 С 96%-ный этиловый спирт, из расчета 3 части этилового спирта на одну часть белкового концентрата. Скорость прибавления этилового спирта 300-350 см 3/мин. Температура поддерживалась в пределах 0 - +4 С, РН= 6,4-6,8. По окончании осаждения мешалку отключили и оставили взвесь на 24 ч при температуре -5 С. Непосредственно после работы реактор мыли и обрабатывали раствором гидроксида натрия. 10 2.4. Отделение белкового осадка сепарированием. Белковую взвесь из реактора, при перемешивании, подавали на сепаратор со скоростью 40 дм 3/ч. Центрифугат, лишенный фибринолитической активности, направляли на регенерацию этилового спирта. По окончании сепарирования основного раствора через сепаратор пропускали 3-4 л дистиллированной воды. Сепаратор отключали и промывали. 2.5. Доочистка белкового раствора ультрафильтрацией. Осадок из барабана тщательно собирали и переносили на капроновое сито, укрепленное на стеклянной емкости. Осадок растирали, добавляя постепенно небольшое количество дистиллированной воды. Барабан и тарелки ополаскивали дистиллированной водой, смывая остатки белка в мкость. После получения однородной густой суспензии объм доводили до 1,1-1,2 дм 3. Полученный белковый раствор заливали в ультрафильтрационную ячейку по 1,60,1 дм 3,заправленную фильтром ПА 10. Диализ проводили 3-мя объемами дистиллированной апирогенной воды. Затем раствор сливали в емкость и центрифугировали на центрифуге при скорости 2500 мин-1, температуре 6-10 С в течение 30 мин. Препарат субстанция удовлетворяла следующим требованиям: цвет светло-желтый; содержание белка не ниже 0,4 мг/см 3; активность не ниже 22000 ФЕ. Полученную на данной стадии препаратсубстанцию замораживали. 3. Получение инъекционной формы препарата. Для полученияинъекционной формы препарата субстанцию размораживали при комнатной температуре. Затем образовавшийся в процессе размораживания осадок убирали путем центрифугирования на центрифуге в течение 30 мин при 5000 мин-1, температуре 6-10 С. Надосадочную жидкость собирали в сборник, отбирали 10 мл пробы для проведения контроля по показателям: значение рН= 7,0-7,5; белок - не ниже 0,4 мг/мл; активность - не менее 22000 ФЕ; цветность - не выше эталона 5 б; прозрачность - соответствие эталону 2. Для увеличения удельной фибринолитической активности препарата проводили дополнительную очистку на колонке с сефадексом G100. Удельная фибринолитическая активность препарата при этом увеличивалась и составляла 74900 усл. единиц. Добавляли глицин в количестве 1% при интенсивном перемешивании, им же корректировали рН до 7,0-7,5. Затем разводили апирогенной дистиллированной водой до активности 15 000 ФЕ или 30 000 ФЕ. 11 Провели стерилизующую фильтрацию,розлив готового препарата. Отличительной особенностью полученного препарата от других фибринолитических ферментов, образуемых грибами, является способность активизировать плазминоген. В повышении фибринолитической активности крови значительную роль играют именно активирующие свойства препарата. Фибринолитическая и тромболитическая активность триазы изучена в опытах in vitro и invivo и отражены в табл. 1-6. Препарат не обладает видовой специфичностью. Активаторные свойства препарата наблюдались с плазминогеном человека и животных. При изучении специфических свойств было отмечено, что нанесение раствора препарата на фибриновые пластины, приготовленные из бычьего или человеческого фибриногена, вызывает образование зон лизиса, что свидетельствует о том, что он обладает фибринолитическими свойствами. Полученный препарат представляют значительный интерес для медицины, так как его применение является эффективным и при лечении многих воспалительных заболеваний, в том числе и гнойно-некротических процессов, при которых противовоспалительные свойства в значительной степени определяются физическими свойствами матрицы, используемой в качестве носителя, а также ее химической природой. В качестве носителя биологически активных веществ могут использоваться растворимые и нерастворимые матрицы органического и неорганического происхождения. Изучение фибринолитических свойств субстанции и лекарственных форм препарата проводили путем внутривенного введения в v.jugularis белым крысам, 150 - 240 г. Препарат вводили в дозе 1 мг/кг веса. Пробы брали до введения препарата и через 5, 15,45, 90 и 120 мин после введения. В контрольной группе животным вводили физиологический раствор. Фибринолитическая активность изменялась сразу после введения препарата и сохранялась на высоком уровне в течение 1,5 ч. Наиболее высокого значения достигал активатор плазминогена. Через 15 мин происходило снижение активатора плазминогена и через 2 ч его количество падало до 70% от исходного уровня. Плазминовая активность максимального уровня достигала к 45 мин и превышала исходную активность в 1,5 раза. К 2 ч уровень плазминовой активности достигал 76% от исходного (табл. 6). Наиболее выражено повышение антиплазминов. В течение 2 ч после введения препарата отмечалось 2 пика их наиболее высокой активности. Постепенное снижение фибринолитической активности плазмы крови, наблюдаемое через 60 мин, может быть связано с участием антиплазминов в защитных реакциях организма, в 12 частности, в предупреждении разрушения фибриногена. Действие препарата определяли также на модели экспериментально полученных тромбов у крыс v.jugularis и собак. Депрессию функции вегетативной нервной системы у крыс вызывали введением 2,5% аминазина в дозе 0,06 на 200 г массы животного. После образования тромба в изолированном участке v.jugularis, вводили препарат в дозе 10 мг/кг. В табл. 8 представлены результаты опытов по лизису экспериментально вызванных тромбов у собак после введения препарата. Модель тромбоза у собак наиболее близка к тому, что может наблюдаться у человека. Были проведены испытания препарата в эксперименте на 10 собаках весом от 8 до 19 кг. Во всех случаях происходил лизис тромбов через 30-120 мин после введения препарата в дозе 0,8-1,0 мг/кг. Всего было проведено 10 экспериментов. Выжили все животные за исключением одного,погибшего в результате хирургического кровотечения. При операциях осуществляли внутренний наркоз с применением гексонала или тиопентала натрия, фентанила. В двух случаях использовалась ИВЛ. Образование тромбов и их лизис проводились в бедренной вене (v.feromales) - 4 случая; на бедренной артерии (a.femorales) - 4 случая; на обоих сосудах вместе - 1; аорто-аортальном шунте, образованном протезом "Гор-текс"-1(табл. 7). Данные, полученные при изучении фибринолитической активности в опытах in vitro, опыты на животных на экспериментальных моделях венозного и артериального тромбоза показали высокую фибринолитическую активность полученного предлагаемым способом препарата, что свидетельствует о перспективности использования его в качестве фибринолитического препарата. Изучение противовоспалительных свойств субстанции и лекарственных форм препарата проводили в эксперименте с белыми крысами. Моделью инфекционного процесса служила экспериментальная подкожная стафилококковая гранулема белых крыс, созданная модифицированным способом Г.Селье. Гранулему получали путем введения под кожу спины крыс в предварительно созданную воздушную полость 0,5 мл суточной культуры патогенного стафилококка на изотоническом растворе хлорида натрия (St. aureus, штамм Lepin, концентрация - 1010 микр.тел в мл). На третьи сутки после инфицирования под кожей возникла типичная инфекционная гранулема, представляющая шарообразное, эластичное образование диаметром 25-30 мм, тесно спаянное с кожей и подлежащими фасциями мышц спины. Типичная для гранулемы микроструктура подтверждена гистологически; бакте 13 риологическое исследование содержимого гранулемы показывает наличие чистой культуры стафилококка. Из взятых в опыт крыс для каждой из двух серий исследований было сформировано три группы по 16-20 животных в каждой. У всех животных каждой серии была проведена гранулотомия, крысам 1 и 2 групп и имплантация в полость гранулемы салфеток из ткани лекарственных модификаций МКЦ (первой группе - МКЦ, второй - иммобилизованный на МКЦ исследуемой субстанцией массой 15 мг). Рана ушивалась двумя шелковыми швами. Животным третьей группы на протяжении 10 дней после операции ежедневно в полость гранулемы вводили раствор субстанции. Все хирургические вмешательства проводили под гексеналовым наркозом (внутрибрюшинно, 80 мг/кг). Показателями терапевтической активности образцов субстанции служили: оценка общего состояния животных, температура и масса их тела, содержание лейкоцитов в периферической крови и лейкограмма. Кроме этого визуально оценивали состояние кожных покровов в районе инфекционного очага, через каждые сутки часть животных выводили из опыта, проводили ревизию раны, извлекали гранулему, измеряли ее геометрические размеры, проводили бактериоскопическое исследование ее содержимого. В данной серии экспериментов исследованиям подвергали образцы, которые представляли собой полоски трикотажного полотна массой около 15 мг с содержанием субстанции 195 мг/г(10518 ЕД/г). Срок разрешения гранулемы под влиянием имплантантов из ткани МКЦ в первой группе животных превышал две недели. При этом средняя скорость уменьшения в диаметре гранулемы составляет 1,5 мм/сутки. Необходимо отметить благоприятный процесс заживления раны, отсутствие при этом кровотечения, резких местных воспалительных явлений. Нормализация температуры тела происходит на пятые сутки послеоперационного периода, а уровня содержания лейкоцитов и их морфологического состава - на шестые сутки. Сочетание оперативного лечения гранулемы и имплантации в ее полость иммобилизованной на МКЦ субстанции является наиболее эффективным для избранной модели патологии. Так, процесс лизиса гранулемы практически заканчивается к седьмым суткам, т.е. скорость уменьшения в диаметре патологического образования составляет 3,5-4,5 мм/сутки. При этом не наблюдаются повторные кровотечения, нет изъязвлений на кожных покровах. На вторыетретьи сутки после операции происходит нормализация температуры тела, количественного и качественного состава лейкоцитов в периферической крови животных. 14 На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что лечение животных с экспериментальной подкожной гранулемой наиболее эффективно осуществляется при использовании субстанции. Изучение токсичности, кумулятивного действия и хронической токсичности проводили в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического комитета. При изучении токсичности препарата в хроническом эксперименте за животными проводилось систематическое наблюдение в течение всего периода введения препарата (20 дней) и восстановительного периода (1 месяц), часть животных (по 10 самок и 10 самцов крыс) опытных и контрольных групп выводили из эксперимента на 10-е,20-е сутки и по окончании восстановительного периода с целью определения состояния животных, динамику массы тела и отдельных внутренних органов, а также проводили биохимические, гематологические и гистологические исследования по общепринятым методикам, позволяющим оценить функциональное состояние основных органов и систем организма. Содержание общего белка в сыворотке крови определяли по биуретовой реакции, глюкозы орто-толуидиновым методом Гультмана,общего холестерина - методом Илька, амилазы(к.ф. 3.2.1.1.)амилокластическим методом. Активность аминотрансфераз (аспартатаминотрансфераза -АсАТ, к.т.2.6.1.1. и аланинаминотрансфераза -АлАТ, е.ф. 2.6.1.2.) определяли динитрофенилгидразиновым методом Райтмана и Френкеля, щелочной фосфатазы (к.ф. 3.1.3.1.)путем фотометрического изменения в щелочной среде при 405 нм количества п-нитрофенола,образующего при ферментативном гидролизе пнитрофенилфосфата. Определение уровней мочевины, кальция и общих липидов в сыворотке крови проводили с помощью наборов реактивов"Био-ЛА-Тест" путем фотометрического измерения окрашенных продуктов реакции. Формулу крови, количество лейкоцитов и эритроцитов, а также скорость оседания эритроцитов определяли по стандартной методике. Оценку влияния препарата на состояние гуморального иммунного ответа, изучение местного раздражающего, кожно-резорбтивного действия, аллергенных и анафилактогенных свойств препарата проводили согласно методическим рекомендациям Фармакологического комитета Минздрава СССР (24-2). Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили с привлечением программы Statgraphics (версия 4). Изучение острой токсичности препарата Изучение острой токсичности препарата проведено на 2 видах лабораторных животных: белых нелинейных мышах и белых крысах линии Вистар массой 240 г. Препараты вводили однократно в дозах; мышам внутрибрюшинно от 34,7 до 2222,0 мг/кг массы тела, внутривенно 15 от 34.7 до 1110,0 мг/кг массы тела животного; крысам внутривенно вводили от 21,25 до 333,0 мг/кг и от 13,0 до 833,0 мг/кг массы тела внутрибрюшинно. За состоянием и поведением животных в течение двух недель проводилось ежегодное наблюдение. Максимальные дозы препарата, вводимые крысам и мышам, не вызывали их гибели. Единичные случаи гибели мышей при введении низких концентраций препарата, очевидно, носят случайный характер и могут быть обусловлены какими-либо посторонними факторами. В связи с тем, что препарат обладает низкой токсичностью, ЛД 50 определить не удалось. Визуальные двухнедельные наблюдения за животными не выявили каких-либо существенных отклонений в общем состоянии и поведении животных по сравнению с контролем. Все животные были активны и подвижны, имели нормальную реакцию на тактильные, болевые и звуковые раздражители, охотно поедали корм и имели гладкий шерстный покров. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о низкой токсичности препарата. Изучение кумулятивного действия препарата При изучении кумулятивного действия препарата на крысах и мышах группы животных были разделены по полу. На каждой группе животные получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции препарата в течение 20 дней. Суммарная доза препарата, полученного животными, составляла для мышей от 694,0 до 44440,0 мг/кг массы для крыс - от 260,0 до 16660,0 мг/кг массы тела животного. В течение всего периода наблюдения гибели животных не отмечено. Полученные данные указывают на отсутствие у препарата способности вызывать кумулятивный эффект, индекс кумуляции установить не удалось. Изучение местного раздражающего действия Изучение местного раздражающего действия препарата проведено в остром опыте на 10 беспородных крысах линии Вистар стадного разведения массой 240-260 г, 8 морских свинках массой 260-280 г и 8 кроликах массой 2,5 кг в соответствии с методическими указаниями МЗ СССР. У животных на участках спины выстригали "окошечки" размером 5 о 5 или 7 о 8 см. На правый бок в "окошечки" наносили препарат в дозе 20 мг/cм 3 на левый бок - дистиллированную воду. Оценку местного раздражающего действия препарата на кожу проводили визуально по шкале, предложенной С.В. Суворовым,по окончании 4-х часовой экспозиции, через 1 и 16 ч после аппликации. Однократная и многократная (в течение 4 недель по 5 раз в неделю) аппликации препарата не выявили развития каких-либо клинических признаков интоксикации или раздражения кожных покровов у всех 3-х групп животных. Это свидетельствует о том. 16 что по степени выраженности раздражающего действия на кожу препарат относится к 0 классу. Изучение кожно-резорбтивного действия Ориентировочная оценка кожнорезорбтивного действия препарата проведена на 12 мышах массой 20-22 г и 8 крысах массой 220-240 г с помощью "пробирочного" метода. Учет реакции по окончании однократной экспозиции с препаратом (концентрация 40 мг/мл) в течение 4 ч не выявил у мышей каких-либо признаков интоксикации и раздражающего действия на кожу. На следующем этапе оценка кожнорезорбтивного действия препарата была проведена в подостром эксперименте на 16 крысах массой 220-240 г, 12 морских свинках массой 260-280 г и 8 кроликах массой 3,0 кг. На выстриженные участки кожи спины подопытных животных в течение 20 суток наносили препарат в дозе 20 мг/см 3. В течение всего периода наблюдения у подопытных животных не отмечали летального исхода или развития клинических признаков интоксикации, признаков раздражения кожных покровов также не выявлено. Полученные данные позволяют заключить,что препарат не обладает кожно-резорбтивным действием. Изучение аллергизирующих свойств препарата При изучении аллергизирующих свойств препарата использовали метод накожных аппликаций 1 В 1 и конъюктивальную пробу в соответствии с методическими рекомендациями МЗ СССР. Исследования проводили на крысах массой 240-250 г и морских свинках массой 220240 г по 10 животных каждого вида на дозу. Препарат испытывали в 3 дозах: 40 мг/мл, 4 мг/мл и 0,4 мг/мл. В результате наблюдения за животными не выявлено видимой реакции со стороны кожи после 10 и 20 накожных аппликаций препарата в указанных дозах. Реакцию учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб, предложенных С.В. Суворовым. Конъюнктивальную пробу проводили на морских свинках массой 240-260 г. При постановке пробы животным под верхнее веко вводили по 1 капле раствора препарата (40 мг/мл). Результаты постановки конъюнктивальной пробы, учтенные через 15 мин, 24 и 48 ч не выявили видимой реакции (покраснения) со стороны слезного протока, конъюнктивы и склеры. Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что препарат не обладает аллергизирующим действием и не вызывает реакции "немедленного" или "замедленного" типа. Изучение анафилактогенных свойств препарата Реакцию общей анафилаксии проводили на морских свинках массой 220-240 г. Животным подкожно вводили препарат в дозе 1000 единиц. Через 26 сут. препарат вводили внутрисердечно 17 в дозе 5000 единиц. Наблюдение проводили в течение 3 ч. Все животные оставались живы, не теряли активности. Отклонение от нормы в поведении не наблюдалось. Таким образом, можно заключить, что препарат не обладает анафилактогенностью. Изучение влияния препарата на иммунореактивность Для оценки возможного влияния препарата на иммунореактивность проведено изучение действия препарата на развития гуморального иммунного ответа у белых беспородных мышей при гриппозной инфекции. Мышам (массой 20-22 г) трехкратно, с интервалом 3 суток, внутривенно вводили препарат в дозах 15.0 мг/кг, 75 мг/кг и 375 мг/кг массы тела. Через сутки после последнего введения препарата животных инфицировали вирусом гриппа A Auru 68(H3No2) в дозе ДД 50 (титр ДД 50 = 10-4). На 16-е сутки после заражения,когда гибель животных в контрольной труппе достигала 45%, выжившие животные были выведены из эксперимента с нейраминидазой в разведении 1:50 в течение 18 ч, затем 1 ч выдерживали при 56 С для удаления неспецифических термостабильных и термолабильных ингибиторов. Наличие и уровень антигемагглютинирующих антител определяли в реакции торможения гемагглютинации. В реакции использовали 4 АЕ вирус гриппа и свежие эритроциты кур. Сенсибилизация животных препаратом не оказывала влияние на формирование антигемагглютинирующих антител к вирусу группы А. У инфицированных мышей, получавших исследуемый препарат, в сравнении с животными контрольное не отмечено достоверного увеличения или снижения титров агглютининов в сыворотке крови, что могло бы свидетельствовать о стимулирующем действии препарата. Таким образом, препарат не оказывает влияния на формирование гуморального иммунного ответа у мышей. Изучение хронической токсичности препарата В работе были использованы белые крысы линии Вистар стандартного разведения массой 220-230 г. Животные были разбиты на 4 группы,каждая из которых в свою очередь была разделена по полу на самцов и самок. Крысам первых трех групп в течение 20 сут. вводили препарат в дозе 15 мг/мл, 75 мг/мл, 375 мг/мл массы тела животного. Крысам 4-ой (контрольной) группы ежедневно в течение 20 дней в качестве плацебо(в тех же объемах) вводили изотонический раствор хлорида натрия. Восстановительный период после окончания введения препарата составлял один месяц. Из каждой группы животных на 10 и 20-сутки эксперимента и по окончании восстановительного периода из эксперимента выводилось по 10 самцов и самок для исследований. Состояние и поведение крыс опытных групп в течение всего периода наблюдения не 002561 18 зависимо от пола не отличалось от состояния и поведения самцов и самок контрольной группы. Крысы были активными, хорошо поедали корм и имели гладкий шерстяной покров. Прирост массы тела крыс был практически одинаковым в опытных и контрольных группах животных. При сравнении относительной массы внутренних органов опытных и контрольных групп, выведенных из эксперимента в разные сроки наблюдения, достоверных изменений не обнаружено. При исследовании морфологической картины крови крыс, получавших препарат в указанных дозах, не выявлено каких-либо достоверных изменений со стороны показателей крови и лейкоцитарной формулы. Лишь у животных получавших минимальную дозу препарата,на 10 сут. отмечено некоторое повышение СОЭ и снижение уровня гемоглобина на 20 сут. по сравнению с контрольными данными, не входящие, однако, за пределы физиологических норм для этого вида животных. Содержание общего белка, активность амилазы, аланин- и аспаратат-аминотрансфераз,щелочной фосфатазы в сыворотке крови животных опытных групп в наблюдаемые сроки существенно не отличались от аналогичных показателей у контрольной группы животных. Содержание общих липидов на 20 сут. при введении препарата в дозе 15 мг/кг и 75 мг/кг массы тела несколько возрастала по сравнению с контрольной группой, однако это увеличение статистически недостоверно. Показатели уровня холестерина, глюкозы, кальция и мочевины при введении препарата во всех трех дозах не отличались от показателей у контрольной группы животных, а отмеченные незначительные колебания ряда параметров находились в пределах физиологических норм. Морфологические и гистологические исследования как самцов, так и самок крыс, выведенных из эксперимента в разные сроки наблюдения и после завершения восстановительного периода, не выявили каких-либо признаков патологических изменений, свидетельствующих о токсическом действии препарата. Все исследованные внутренние органы (сердце, легкие, печень, селезенка, почки, надпочечники) и ЦНС(головной и спинной мозг) как опытных, так и контрольных животных не имели каких-либо структурных изменений и признаков лимфопролиферативной реакции, свидетельствующей о нарушениях в организме. Данные, полученные при морфологических и гистологических исследованиях, коррелируют с результатами биохимических исследований и подтверждают отсутствие токсического воздействия препарата на организм животных. Таким образом, исследования, проведенные с целью установления характера и выраженности повреждающего действия препарата ных животных на введение препарата, условиями содержания и кормления. При изучении ряда специфических видов токсичности установлено, что препарат не обладает куммулятивностью, раздражающим, кожно-резорбтивным, аллергизирующим и анафилактогенным свойствами, а также не оказывает влияния на иммунный ответ. Анализ результатов, полученных при проведении токсикологического изучения препарата, позволяет сделать заключение о том, что препарат характеризуется низкой токсичностью и в изученных концентрациях является безвредным для организма подопытных животных. Использованная литература 1. Р.А.Максимова, Л.И.Пох. Фибринолитическая активность Trichothecium rozeum на организм экспериментальных животных и оценки его безопасности показали следующие. При изучении острой токсичности установлено, что препарат обладает низкой токсичностью, ЛД 50 установить не удалось, максимальная доза, которая была введена мышам внутривенно составляла 1110,0 мг/кг, внутрибрюшинно -2222,0 мг/кг, крысам внутривенно 333,0 мг/кг и внутрибрюшинно - 830,0 мг/кг. При изучении препарата в хроническом эксперименте при ежедневном внутривенном введении в течение 20-ти дней в дозах 15 мг/кг,75 мг/кг и 375 мг/кг не выявлено каких-либо существенных структурных и функциональных изменений со стороны жизненно важных систем организма животных. Выявленные в единичных случаях отклонения некоторых биохимических и физиологических показателей не имели характера закономерности и, очевидно, обусловлены адаптационной реакцией организма подопыт серии Таблица 1. Характеристика полученных серий препарата по фибринолитической активности Активаторная активИсходный объем Объем после осаждения Белок Фибринолитическая ность (%) культуральной этанолом и диализа(л) Таблица 2. Влияние аэрации на продукцию фибринолитических ферментов при глубинном культивировании Т. roseum Условия культиви- Этапы культи- Концетрация белка Фибринолитическая Активаторная активность Удельная фибрино(%) литическая активность рования вирования (ч) Таблица 3. Изменения биохимических показателей культуральной жидкости Т. roseum в зависимости от времени культивирования п/п Объем (л) Этапы рН Концентрация Фибринолитическая Активаторная активность Таблица 4. Выделение фибринолитических ферментов из культуральной жидкости Т. roseum Удельная (ФА) Исследуемые образцы рн Концентрация Фибринолитическая Активаторная активность активность белка (мг/мл) активность (ФА) Культуральная жидкость После осаждения 3-х кратным объемом этанола и у/фильтр. Таблица 5. Выделение фибринолитических ферментов из культуральной жидкости Т. roseum, полученной при различных типах аэрации Концентрация ФибринолитичеАктиваторная Удельная активность Исследуемые образцы Содержание О 2 в л. рН на 1 л. культуральбелка (мг/мл) ская (мм 2) активность (%)(усл.ед ) ной жидкости Культуральная 6,14 0,13 390 44,4 9990 жидкость После осаждения 3-х 1,0 7,65 1,1 11,05 54,3 3345 кратным этанола и у/фильтр Культуральная 6,62 0,13 40,0 37,5 10246 жидкость После осаждения 3-х 0,5 7,72 0,86 1024 53,1 3965 кратным объемом этанола и у/фильтр Таблица 6. Показатели фибринолитической системы крови у экспериментальных животных после внутривенного введения препарата Условия опыта Фибринолити- ФА на фибриновых плаВремя лизиса Концентрация Количество Количество антистинах в мм 2 ческая активфибринового фибриногена активатора плазминов (с) ность (ФА)(мг%) плазминогена не прогретых прогретых сгустка эуглобу 2 цельной плазмы линов (мин)(%) 1 2 3 4 5 6 7 8 До введения 9,52,4 48,96,7 28,04,3 112,66,4 4326,0 24,34,6 21912,0 Через 5 мин 17,32,2 112,98,1 41,813,9 62,03,6 3704,8 82,23,9 46124,2 после введения До введения 7,91,6 76,613,1 39,26,1 1004,2 5127,9 43,411,9 21410,7 Через 15 мин 11,31,8 228,012,3 70,010,8 75,00,9 4869,7 152,812,5 101363,0 после введения До введения 8,61,6 69,313,4 36,56,7 84,112,4 5509,1 39,13,1 26837,0 Через 45 мин 13,61,4 172,316,4 89,316,8 32,01,0 4017,9 81,28,7 134633,4 после введения До введения 6,481,1 52,27,4 30,514,8 118,01,6 50313,4 20,74,2 1682,5 Через 90 мин 8,121,1 68,213,7 59,410,3 117,03,7 4401,2 22,07,6 181992,3 после введения До введения 6,481,1 52,27,4 30,54,8 1181,6 50313,4 20,74,2 1682,5 Через 120 мин 6,11,1 41,411,0 4554,8 16,1 4,6 2227160 26,34,8 1434,8 после введения До введения 5,151,7 63,715,3 26,210,4 385+28,4 41,56,0 2671,3 17511,0 Через 5 мин 64,416,0 28,810,5 376+31 38,84,5 2704,4 5,541,3 17512,1 после введения До введения 5,591,8 77,012,4 25,75,8 76,55,1 4707,1 57,015,0 20017,3 Через 15 мин 6,21,6 80,512,9 46512,7 24,43,0 81,02,3 62,212,1 135,25,2 после введения До введения 87,416,0 72,35,1 477143 66,05,4 20014,0 10,92,5 28,05,7 Через 45 мин 85,414,6 29,76,5 81,21,2 42415,2 67,715,1 18915,2 9,262,2 после введения До введения 31,57,5 20,4+2,5 13013,1 61411,5 16,54,9 20218,9 6,61,6 Через 120 мин 6,8 35,24,2 21,43,2 60215,3 16,15,8 2177,8 14410,0 после Таблица 7. Влияние препарата на лизис тромбов у крыс Количество Лизис тромбов Полный Частичный 24 16 8 Таблица 8. Влияние препарата на лизис тромбов у собак Доза пре- Локализа- Время ста- Размеры тромба Время лизиса Степень лизиса парата ция тромба билизации Полный Полный Полный 50 Полный Тромб образовать не удалось 45-50 40 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения фармацевтического препарата, обладающего тромболитической и противовоспалительной активностью из культуральной жидкости штамма продуцента Trichothecium roseum, включающий глубинное культивирование последнего на питательной среде, с аэрацией в процессе культивирования, для образования фибринолитических ферментов, отделение культуральной жидкости с последующей фильтрацией, фракционированием и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что глубинное культивирование проводят из исходной культуры Trichothecium roseum LK.ex., штамм Д в течение 96 2 ч на питательной среде,содержащей (г/дм 3): Аммоний сернокислый (NH4)2SO4 Магний сернокислый MgSO4K2 НРO4 Хлористый калий KСl Пищевой сахар Кукурузный экстракт (50%) Молочная кислота (100%) Вода водопроводная при рН среды 5,80,5 и температуре +2526 С,2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракционирование культуральной жидкости ведут путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта, охлажденного до - 20 С при рН = 6,4-6,8 и конечной температуре осаждения 6 -10 С,3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку препарата проводят методом диализа с дополнительной очисткой на колонке с сефадексом G-100.
МПК / Метки
МПК: A61P 7/02, A61K 36/06, A61K 38/48, A61P 29/00
Метки: способ, препарата, получения, активностью, противовоспалительной, фибринолитической, фармацевтического, обладающего
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/14-2561-sposob-polucheniya-farmacevticheskogo-preparata-obladayushhego-fibrinoliticheskojj-i-protivovospalitelnojj-aktivnostyu.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения фармацевтического препарата, обладающего фибринолитической и противовоспалительной активностью</a>
Предыдущий патент: Способ получения циталопрама
Следующий патент: Перфорированные микрочастицы и способ их использования
Случайный патент: Спироциклы в качестве ингибиторов 11-бета гидроксилстероиддегидрогеназы типа 1