Синтетические пептиды, обладающие поверхностной активностью, и их применение для приготовления синтетического сурфактанта

1 В настоящем изобретении предложены новые синтетические пептиды, обладающие поверхностной активностью. В частности, в настоящем изобретении предложены аналоги белка С сурфактанта (SP-C), которые при комбинировании с подходящими липидами особенно эффективны в снижении поверхностного натяжения на границе раздела воздух-жидкость. Таким образом, пептиды по данному изобретению могут применяться в комбинации с липидами и, возможно, в комбинации с белком В сурфактанта (SP-B) или его активным аналогом либо заменителем SP-B для приготовления синтетических сурфактантов, полезных при лечении респираторного дистресс-синдрома(РДС), других дефицитов сурфактанта или дисфункции, связанной с лгочными заболеваниями, такими как пневмония, бронхит, астма, синдром мекониевой аспирации, а также с другими заболеваниями, такими как серозный средний отит (экссудативный отит). Предпосылки изобретения Лгочный сурфактант понижает поверхностное натяжение на границе раздела воздухжидкость альвеолярной выстилки, предохраняя легкие от спадания в конце выдоха. Дефицит сурфактанта представляет собой широко распространенное нарушение у недоношенных детей и является причиной респираторного дистресс-синдрома (РДС), который можно эффективно лечить естественными сурфактантами,выделенными из легких животных (Fujiwara, Т.Practice Amsterdam, Elsevier, pp. 561-592). Главными составляющими этих препаратов сурфактанта являются фосфолипиды, такие как 1,2 дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин(ДПФХ), фосфатидилглицерин (ФГ) и гидрофобные белки В и С сурфактанта (SP-B и SP-C). Гидрофильные белки сурфактанта SP-A и SP-D,которые являются коллагеновыми лектинами Стипа (Са 2+-зависимые), хотя и действуют прежде всего в системе защитных сил организма, их обычно не включают в препараты сурфактанта ввиду используемых способов экстракции органическими растворителями.SP-B и SP-C составляют только около 1-2 мас.% сурфактанта, но тем не менее способны значительно улучшать поверхностную активность по сравнению с чистыми липидными препаратами (Curstedt Т. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262; Takahashi A., Nemoto Т. andFujiwara T. (1994) Acta Paediatr. Jap. 36, 613618). Были определены первичные и вторичные структуры SP-B и SP-C и третичная структураSP-C в растворе (см. 4). SP-B состоит из двух идентичных полипептидных цепей из 79 аминокислот, связанных межцепочечным дисульфидным мостиком (Curstedt Т. et al. (1990) Proc.J., Curstedt T. and Jrnvall H. (1991) Biochemistry 30, 6917-6921). Каждая мономерная цепь имеет три межцепочечных дисульфидных мостика и по меньшей мере четыре амфипатические спирали, имеющие одну полярную и одну неполярную поверхность, через которые SP-B может взаимодействовать с двумя липидными бислоями и обеспечивать их пространственную близость (Andersson M. et al. (1995) FEBS Lett. 362,328-332). SP-C представляет собой липопротеин, состоящий из 35 аминокислотных остатков с-спиральным доменом между остатками с 9 по 34 (Johansson J. et al. (1994) Biochemistry 33,6015-6023). Спираль состоит в основном из остатков валина и включена в липидный бислой и ориентирована параллельно липидным ацильным цепям (Vandenbussche, et al. (1992) Eur. J.Biochem. 203, 201-209). Две пальмитоильные группы ковалентно связаны с остатками цистеина в 5 и 6 положениях N-терминальной части пептида (Curstedt T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 87, 2985-2989). Два консервативных положительно заряженных остатка аргинин и лизин в 11 и 12 положениях возможно взаимодействуют с отрицательно заряженными группами головки липидов мембран и таким образом увеличивают ее ригидность. Эта ригидность липид-пептидного взаимодействия может уменьшаться к С-терминальному концу, так как он содержит только небольшие или гидрофобные остатки, благодаря которым эта часть потенциально более подвижна в фосфолипидном бислое. Считается, что SP-C влияет на толщину и текучесть липидного окружения через очень стабильную поливалиновую спираль (JohanssonJ. and Curstedt Т. (1997) Eur. J. Biochem. 244,675-693). Уровень техники Поскольку препараты сурфактанта, полученные из животной ткани, проявляют некоторые недостатки, такие как наличие их в ограниченных количествах и возможность того, что они содержат инфекционные агенты и вызывают иммунные реакции, были предприняты попытки создать синтетические сурфактанты (Johansson J. and Curstedt Т. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675-693; Johansson J. et al. (1996) Acta Paediatr. 85, 642-646), обычно из синтетических липидов и гидрофобных белков. В предыдущей работе продемонстрировано, что синтетический SP-C не может складываться подобно природному пептиду в спиральную конформацию, необходимую для оптимальной поверхностной активности (Johansson J. et al. (1995) Biochem. J. 307, 535-541),и поэтому не взаимодействует соответствующим образом с липидами сурфактанта. Следовательно, синтетические аналоги SPC не складываются подобно природному пептиду и не взаимодействуют соответствующим образом с липидами сурфактанта. Чтобы обойти 3 эту проблему, было предпринято несколько попыток модифицирования последовательности,например, заменяя все остатки Val спиральных участков в природном SP-C на Leu, который в значительной степени способствует спиральной конформации. Соответствующий трансмембранный аналог SP-C (Leu) показал хорошее распределение на границе раздела воздух-жидкость при комбинировании со смесью ДПФХ:ФГ:ПК(дипальмитоил-sn-глицеро-3 фосфохолин : фосфатидилглицерин : пальмитиновая кислота) (68:22:9) (мас./мас./мас.). Однако максимальная величина поверхностного натяжения при сжатии циклической поверхности(maх) была значительно выше, чем эта же величина у природного сурфактанта. Кроме того,было невозможно приготовить липидопептидные смеси со значениями концентраций большими, чем около 20 мг/мл, вероятно, из-за образования пептидных олигомеров (Nilsson G.et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124). Другие исследователи синтезировали биоактивные полилейциновые аналоги SP-C различной длины (Takei Т. et al. (1996) Biol. Pharm. Bull. 19,1550-1555). В последних исследованиях не сообщалось ни о самоолигомеризации, ни о проблемах, связанных с приготовлением образцов с высокой концентрацией липидов. В различных публикациях рассматривается задача получения пептидных аналогов природных пептидов сурфактанта, с предложением ряда различных решений. Среди этих публикаций, WO 9321225, ЕР 733645, WO 9617872, где от имени Tokyo Tanabe описаны пептиды, аналогичные природному SP-C, которые в общем отличаются от природного пептида в отношении последовательности N-терминальной части. В заявках на патенты Scripps Research Institute WO 8906657 и WO 9222315 описаны аналоги SP-B, имеющие чередующиеся гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки. Среди прочих, заявлены пептиды с чередующимися остатками лейцина и лизина (КL4).Clercx A. et al., Eur. J. Biochem 229, 465-72,1995, описали пептиды различной длины, соответствующие N-терминальному концу свиногоSP-C, a также гибридные пептиды, имеющие происхождение от свиного SP-C и бактериородопсина.Johansson J. et al., Biochem. J. 307, 535:41,1995, описали синтетические пептиды, которые отличаются от природного свиного SP-C заменой некоторых аминокислот. В WO 89/04326 от имени California Biotechnology - Byk Gulden и WO 91/18015 от имени California Biotechnology - Scios Nova раскрыты аналоги SP-C, содержащие первичную Nтерминальную последовательность, в которой два Cys природного SP-C заменены двумя Ser. 4 Описание изобретения Обнаружено, что пептидные аналоги SP-C,которые сочетают следующие признаки: 1) замена остатков Val другими нейтральными и гидрофобными остатками; 2) замена остатковCys остатками Ser; 3) замена некоторых нейтральных аминокислотных остатков большими или полярными остатками, проявляют особенно благоприятные свойства по снижению поверхностного натяжения. В частности, было обнаружено, что последний признак позволяет избежать самоолигомеризации вследствие положительных зарядов, обусловленных полярными остатками, или стерического затруднения, обусловленного большими заместителями. Таким образом, в соответствии с первым аспектом, в настоящем изобретении предложены аналоги SP-C, имеющие следующую общую формулу (I), с использованием однобуквенного аминокислотного кодаZ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из S, С, F, где остатки Ser или Cys возможно связаны посредством эфирной или тиоэфирной связи с ацильными группами, содержащими 12-22 связанных атомов углерода; а представляет собой целое число от 1 до 19;b представляет собой целое число от 1 до 19; с представляет собой целое число от 1 до 21;d представляет собой целое число от 0 до 20; е представляет собой 0 или 1;(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислотных остатка, предпочтительно от 10 до 22. Предпочтительные пептиды формулы (I) имеют следующие последовательности: 5 В соответствии с предпочтительными воплощениями, пептиды формул (Ia)-(If) имеют следующие последовательности соответственно: В наиболее предпочтительном воплощении данного изобретения остатки Ser ковалентно связаны с ацильными группами, содержащими 12-22 атомов углерода. Пептиды формулы (I) могут быть приготовлены синтетическими способами или с использованием рекомбинантных технологий. Обычные синтетические способы описаны,например, Schroeder et al., "The peptides", vol. 1,Academic Press, 1965; Bodanszky et al., "PeptideMerrifield, "The peptides; Analysis, Synthesis, Biology", vol. 2, chapter 1, Academic Press, 1980. Указанные способы включают в себя синтез пептидов на тврдой фазе, в растворе, синтетические способы органической химии или их любые комбинации.S- или О-ацилированные пептиды предпочтительно синтезируют путем обработки неацилированных пептидов хлорангидридом в чистой трифторуксусной кислоте, как описаноYousefi-Salakdeh et al. Biochem J 1999, 343, 557562. После синтеза и очистки определяли биохимические и биофизические характеристики синтетических пептидов, как показано в ниже следующем разделе "Примеры". Активность пептидов по данному изобретению в снижении поверхностного натяжения оценивалась в комбинации с липидами и фосфолипидами, SP-B, аналогами SP-B или заменителями SP-B. В частности, пептиды комбинировали с ДПФХ (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3 фосфохолин)/ФГ(пальмитиновая кислота) с SP-B или без него,его активным аналогом и полимиксинами. Результаты тестов на поверхностную активность пульсирующего пузырька (pulsatingbubble surface activity tests) ясно показывают,что синтетические пептиды по настоящему изобретению сильно уменьшают минимальное и максимальное поверхностное натяжение при сжатии циклической поверхности (min и mах) до значений, сравнимых со значениями, полученными при использовании сурфактантов из естественных источников. Добавление SP-B или его активного аналога к смеси пептиды/липиды-фосфолипиды дава 004058 6 ло особенно благоприятные результаты. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полимиксины, в частности полимиксин В, действуют как заменители SP-B, и их добавление давало результаты, сопоставимые с результатами, достигнутыми с SP-B. В соответствии со вторым аспектом, в настоящем изобретении предложен синтетический сурфактант, содержащий один или более чем один пептид формулы (I), в смеси с липидами и/или фосфолипидами и, возможно, SP-B, его активного производного или полимиксинов. Подходящие липиды/фосфолипиды могут быть выбраны из группы, состоящей из фосфатидилхолинов (предпочтительно ДПФХ), ФГ, ПК,триацилглицеринов, сфингомиелина. В еще более предпочтительном воплощении настоящего изобретения могут использоваться смеси сурфактантов, содержащие пептид,в котором пальмитоильные цепи О-ковалентно связаны с остатками Ser. Было обнаружено, что смеси сурфактантов, содержащие дипальмитоилированную форму упомянутого пептида (SPC(Leu, проявляют более высокую стабильность поверхностной пленки и увеличенный размер связанного с поверхностью липидного резервуара, по сравнению со смесями, содержащими соответствующий непальмитоилированный пептид, как определено измерениями,проведнными в системе с фиксированным пузырьком (captive bubble system). В образцах,содержащих 5% дипальмитоилированного пептида, min составляло менее 1,5 мН/м, и пленки были очень стабильные, так как увеличение поверхностного натяжения составляло менее 0,5 мН/м в течение 10 мин при постоянном объеме пузырька. Напротив, min для непальмитоилированных пептидов составляло приблизительно 5 мН/м, и пленки были менее стабильными, что наблюдалось по частому разрушению пузырьков при малых поверхностных натяжениях. Кроме того, после обеднения подфаз для образцов, которые содержат непальмитоилированный пептид, способность к достижению околонулевого стабильного поверхностного натяжения была утрачена после нескольких стадий адсорбции, в то время как с дипальмитоилированным пептидом качество пленки не ухудшалось даже после более чем 10 стадий растяжения и включения материала резервуара, эквивалентного более чем двум монослоям. Улучшенная поверхностная активность дипальмитоилированных пептидов была также продемонстрирована пульсирующим пузырьковым сурфактометром(pulsating bubble surfactometer). Кроме того, было установлено, что присутствие ацильных групп уменьшает тенденцию к образованию олигомеров. Это открытие является очень важным, так как в процессе приготовления синтетических сурфактантов было обнаружено, что олигомеризация пептидов препятствует приго 7 товлению смесей при концентрациях выше чем 20 мг/мл (Nilsson et al. Eur J Biochem 1998, 255,116-124). Синтетический сурфактант может быть приготовлен путем смешивания растворов или суспензий пептидов и липидов и последующего высушивания смеси. При необходимости, сухую смесь можно суспендировать, диспергировать или вводить как таковую субъектам, нуждающимся в лечении дефицита сурфактанта. Синтетический сурфактант предпочтительно вводить эндотрахеально или в виде аэрозоля. Последняя форма введения требует комбинации маленьких частиц сурфактанта с подходящим инертным пропеллентом. Другие формы введения, такие как распыление или разбрызгивание стабильных растворов/суспензий сурфактанта также включены в объем настоящего изобретения. В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложено применение описанных пептидов для приготовления сурфактантного агента, который может использоваться во всех случаях дефицита сурфактанта у взрослых или новорожденных или дисфункции, связанной с лгочными заболеваниями, такими как пневмония, бронхит, астма, синдром мекониевой аспирации, а также с другими заболеваниями, такими как серозный средний отит (экссудативный отит). Обычно, сурфактантный агент может применяться предпочтительно при эндотрахеальном введении в лечении респираторного дистресс-синдрома, который часто возникает у недоношенных детей. Следующие примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение. Пример 1. Синтез и очистка пептидов. Аналог SP-C, SP-C(LKS) (фиг. 1) был синтезирован путем применения поэтапной твердофазной технологии и химической технологии с использованием трет-бутилоксикарбонилов(Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57,957-989) на аппаратуре Applied Biosystems 430A. Гидролиз связи между смолой и пептидом и удаление защитных групп боковых цепей осуществляли в смеси безводный фтороводород/метоксибензол/диметилсульфид,10:1:1(об./об./об.) в течение 1,5 ч при 0 С. Защитные группы и поглотители удаляли путем повторной экстракции диэтиловым эфиром, и пептид последовательно экстрагировали из смолы смесью дихлорметан/трифторуксусная кислота (ТФУ),3:1 (об./об.) с последующим выпариванием в роторном испарителе. Неочищенный пептидный экстракт вновь растворяли до концентрации 100 мг/мл в смеси хлороформ/метанол, 1:1 (об./об.),содержащей 5% Н 2 О. Аликвоту в 10 мг наносили на колонку с сефадексом Sephadex LH-60 (401 см) в том же растворителе (Curstedt Т. et al. 8 фракции по 2,5 мл и измеряли оптические плотности при 214 и 280 нм. Идентификацию и количественное определение проводили путем аминокислотного анализа. В случае ацилирования, очищенный пептид (обычно около 5 мг) сушат, растворяют в дистиллированной ТФУ (100 мкл) и добавляют хлорангидрид (10-20 экв. по отношению к пептиду). Через 10 мин реакцию останавливают 80% водным этанолом (1,9 мл). Очистку ацилпептидов осуществляют, используя хроматографию на Lipidex 5000 в смеси этиленхлорид/метанол, 1:4 (об./об.) с последующей обращнно-фазовой ВЭЖХ на колонке С 18, используя линейный градиент 2-пропанол/0,1% ТФУ,переходящий в 60% (водный) метанол/0,1% ТФУ или 75% (водный) этанол/0,1% ТФУ. Пример 2. Биохимическая характеристика. Степень чистоты пептида проверяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)(Phast-system, Pharmacia, Швеция) и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя колонку С 18 и линейный градиент 60% водный метанол/0,1% ТФУ и изопропанол/0,1% ТФУ (Gustafsson М. etal. (1997) Biochem. J. 326, 799-806). Молекулярные массы определяли посредством время-пролетной масс-спектрометрии с ионизацией путем лазерной десорбции (MALDITOF) (Lasermat 2000, Finnigan MAT), с калибровкой по вазоактивному интестинальному пептиду (Мr 3326,8). Вторичную структуру пептида исследовали, используя спектроскопию (Jasco-720 Jasco,Japan) кругового дихроизма (КД). После солюбилизации в трифторэтаноле (ТФЭ) спектр записывали в интервале от 260 до 184 нм со скоростью сканирования 20 нм/мин и разрешением 2 точки данных/нм. Рассчитывали остаточную молярную эллиптичность и выражали ее в кдегсм 2/дмоль. Молярные эллиптичности при 208 и 222 нм использовали для оценки процентного содержания спиральной структуры (Barrow C.J.et al. (1992) J. Mol. Biol. 225, 1075-1093). Исследования вторичной структуры SPC(LKS) с использованием КД-спектроскопии показали спектр, типичный для -спиральных пептидов, и процентное содержание спиралей, составляющее приблизительно 75%,было определено из минимумов 208 и 222 нм. Вторичная структура оставалась стабильной после поэтапного растворения в Н 2 О до концентрации ТФЭ 12% при условии, что пептид был солюбилизирован в чистом ТФЭ. Электрофорез SP-C(LKS) в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDSPAGE) показал наличие отдельной полосы, аналогичной полосе природного SP-C, в то время как SP-C(Leu), у которого отсутствует Lys в спиральной части, образует олигомеры. В соот 9 ветствии с нашим опытом, в отличие от SРС(Leu)/липидных смесей, которые трудно растворять при концентрации выше чем 20 мг/мл(Nilsson G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116124), возможно приготовление SР-С(LKS)/ липидной смеси с концентрацией липида 80 мг/мл и отношением полипептид/липид 0,03. Пример 3. Приготовление пептид/ липидных смесей. ДПФХ, ФГ и ПК были приобретены у(об./об.), смешивали в пропорциях ДПФХ: ФГ:ПК 68:22:9 (мас./мас./мас.) или ДПФХ/ФГ 7:3 (мас./мас.). Препараты сурфактанта готовили путем добавления только SP-C(LKS) или SPC(LKS) и SP-B к каждой липидной смеси до общего весового соотношения полипептид/липид 0-0,05. Смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали в 150 ммоль/л NaCl или в 10 ммоль/л буфере Hepes с рН 6,9, содержащем 140 ммоль/л NaCl и 2,0 ммоль/л СаСl2,при концентрациях липидов от 10 до 80 мг/мл. Затем проводили повторное замораживание и обработку ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) до по 10 лучения гомогенных суспензий. В некоторых случаях полученные суспензии инкубировали при 45 С в течение 1 ч. Препараты сурфактанта, суспендированные в 150 ммоль/л NaCl, имеют значение рН от 3,5 до 5,5. Более низкие значения рН от 3,5 до 4,5 наблюдались в препаратах, содержащих SPB. Так как природный SP-B очищали, используя подкисленные органические растворители(Curstedt T. et аl. (1987) Eur. J. Biochem. 168,255-262), в препаратах могут оставаться небольшие количества кислоты. Близкое к физиологическому значение рН было достигнуто путем суспендирования препарата сурфактанта в буфере Hepes с рН 6,9, содержащем 140 ммоль/лNaCl и 2 ммоль/л СаСl2 (табл. 1). По сравнению с соответствующими препаратами в незабуференном физиологическом растворе не наблюдалось изменений max или min при использовании в качестве липидной смеси ДПФХ/ФГ, 7:3(мас./мас.). Однако когда в липидную смесь была введена ПК, max или min увеличивались при более высоких значениях рН (табл. 1 и 2). Таблица 1 Поверхностные свойства препаратов искусственного сурфактанта в физиологическом солевом растворе Измерения были выполнены непосредственно после приготовления образцов или после инкубации в течение 1 ч при 45 С. Концентрация фосфолипидов составляла 10 мг/мл в 150 ммоль/л NaCl. Данные были получены в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37 С, 50% поверхностном сжатии и при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 3-5 измерений. Аббревиатуры определены в тексте. Препарат сурфактанта Поверхностное натяжение, мН/мmin 3 ДПФХ/ФГ/ПК 1 41(1) 1 41(1) 1 41(0) 3 ДПФХ/ФГ/ПК 45 С 1 41(1) 1 41(1) 1 41(1) 3 2 ДПФХ/ФГ/ПК 1 33(2) 1 33(2) 1 33(2) 3 2 ДПФХ/ФГ/ПК 45 С 1 34(1) 1 34(2) 1 25(2) 3 ДПФХ/ФГ 12 39(5) 14(4) 42(4) 9(5) 42(2) 3 ДПФХ/ФГ 45 С 8(3) 35(5) 9(3) 39(5) 6(4) 42(3) 3 2 ДПФХ/ФГ 2(1) 31(1) 2(1) 31(3) 2(1) 33(1) 3 2 ДПФХ/ФГ 45 С 3(3) 29(3) 1(1) 33(2) 1(0) 36(1) 3 1 ДПФХ/ФГ 1 24(4) 1(2) 26(4) 1 31(1) 3 0,5 ДПФХ/ФГ 45 С 4(2) 29(1) 4(3) 29(2) 3(1) 34(2) Таблица 2 Поверхностные свойства препаратов искусственного сурфактанта в забуференном солевом растворе Измерения были выполнены на образцах, содержащих фосфолипиды в концентрации 10 мг/мл в буфере Hepes (pH 6,9), в свою очередь содержащем 140 ммоль/л NaCl и 2,0 ммоль/л СаСl2. Данные получали в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37 С,50% поверхностном сжатии и при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 3-5 измерений. Аббревиатуры определены в тексте. Пример 4. Приготовление фосфолипидных смесей с SP-C(LKS) и полимиксином В. ДПФХ и ФГ были приобретены у Sigma(об./об.), смешивали в пропорциях ДПФХ/ФГ 7:3 (мас./мас.). К этим фосфолипидным смесям добавляли SP-C(LKS) до общего весового соотношения полипептид/фосфолипид 0,03. Эти смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали при комнатной температуре в 10 ммоль/л буфере Hepes (pH 6,9), содержащем 140 ммоль/л NaCl и 2,0 ммоль/л СаСl2, или в том же самом буфере, содержащем 0,01% полимиксин В (РхВ) (Sigma Chemical Co, St Louis, МО). Затем проводили повторное замораживание и обработку ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) до получения гомогенных суспензий. Окончательная концентрация фосфолипидов в обоих препаратах составляла 10 мг/мл. При добавлении РхВ значения min и max уменьшались, и была достигнута оптимальная поверхностная активность Таблица 3 Поверхностные свойства искусственного сурфактанта с полимиксином В и без него Данные были получены в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37 С и 50% поверхностном сжатии при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 5-11 измерений. Аббревиатуры определены в тексте. Препарат сурфактанта Поверхностное натяжение, мН/мmax 3 ДПФХ/ФГ 15(3) 39(4) 16(2) 42(3) 13(3) 44(3) 3 1 ДПФХ/ФГ 3(2) 29(3) 2(2) 31(4) 1(1) 34(2) Пример 5. Определение биофизических характеристик. Кинетику поверхностного распределения измеряли приблизительно при 34-37 С при помощи поверхностных весов Вильгельми(Wilhelmy surface balance) (Biegler, Vienna, Austria). Поверхностное натяжение определяли в течение 10 мин, используя платиновую пластину, соединенную с тензометром и введнную на 1 мм в нижний слой, состоящий из 20 мл 150 ммоль/л NaCl в тефлоновом жлобе. В этот нижний слой добавляли по каплям суспензии,всего в количестве 1 мг липидов, на расстоянии 4 см от платиновой пластины. Кинетические измерения 3% по массе SPC(LKS) в ДПФХ/ФГ, 7:3 (мас./мас.), используя весы Вильгельми, показали быстрое распределение, с поверхностным натяжением 28 мН/м,через 3 с (фиг. 2). Распределение было несколько медленнее при использовании 1%-ного по массе SP-C(LKS) в той же липидной смеси(данные не приводятся). Добавление 2%-ного по массе SP-B не изменяло существенно скорость распределения или состояние равновесия поверхностного натяжения (фиг. 2). После инкубации смеси в течение 1 ч при 45 С никаких улучшений не наблюдалось (данные не приводятся). Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве липидной смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) (данные не приводятся). Динамическое поверхностное натяжение регистрировали, используя пульсирующий пузырьковый сурфактометр (Surfactometer International, Toronto, Canada) при 37 С при 50% по верхностном сжатии пузырьковой поверхности и частоте 40 циклов в минуту. Все измерения проводили в течение 5 мин и при концентрации липидов 10 мг/мл. Также измеряли градиенты давления через поверхность пузырька в определенные интервалы времени и использовали их для расчета поверхностного натяжения при минимальном (min) и максимальном (max) размерах пузырька. В пульсирующем пузырьковом сурфакгометре 3%-ный по массе SP-C(LKS) в смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) обеспечивал поверхностное натяжение менее чем 1 мН/м при минимальном радиусе пузырька (min),в то время как с 3%-ным по массе SP-C(LKS) в смеси ДПФХ:ФГ, 7:3 (мас./мас.) при min наблюдалось поверхностное натяжение от 9 до 14 мН/м (табл. 1). Поверхностное натяжение при максимальном радиусе пузырька (max) составляло около 40 мН/м в обоих случаях. Добавление 2%-ного по массе SP-B давало значение max от 31 до 33 мН/м и значение min от 0 до 2 мН/м для обоих липидных препаратов. Эти значения абсолютно аналогичны значениям, полученным для препаратов сурфактанта, выделенных из естественных источников (Robertson В. et al.(1990) Prog. Respir. Res. 25, 237-246). Инкубация препаратов при 45 С в течение 1 ч не вызывала существенного влияния на поверхностную активность (табл. 1). Уменьшение количества SPB до 0,5% по массе в 3%-ном по массе SPC(LKS) в смеси ДПФХ:ФГ, 7:3 (мас./мас.) имело тенденцию к увеличению значения min, хотя результаты не достигали статистической значимости (табл. 1). В отличие от SP-B, добавление 13 2%-ного по массе пептида с чередующимися остатками лейцина и лизина (КL4) (Cochrane,C.G. and Revak, S.D. (1991) Science 254, 566-568) К 3%-ному по массе SP-C(LKS) в смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) не уменьшало значение max, которое оставалось относительно высоким, от 41 до 42 мН/м. Пример 6. Сравнение смесей, содержащих дипальмитоилированные и непальмитоилированные упомянутые пептиды. Препараты сурфактанта приготавливали путем добавления 3% мас./мас. SP-C(Leu) или дипальмитоилированного SP-C(Leu) к каждой 14 липидной смеси, образованной ДПФХ/ФГ/ПК 68:22:9 (мас./мас./мас.). Смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали в 150 ммоль/л NaCl при концентрации липидов 10 мг/мл. К образцам, в которых также использовался заменитель SP-B, добавляли 1% мас./мас. полимиксин В. Смеси, содержащие дипальмитоилированный SP-C(Leu), с полимиксином В или без него, обладают значительно улучшенными свойствами, особенно в уменьшении max через 5 мин и min в начальные интервалы времени. Таблица 4 Поверхностные свойства Значения поверхностного натяжения для смесей получали при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра. После уравновешивания в течение 2 мин регистрировали данные в различные моменты времени при 37 С, 50% поверхностном сжатии и с частотой 40 циклов в минуту. Препарат сурфактанта Поверхностное натяжение, мН/мmin 1 11 39 6,2 39 2 42 1 1 3 37 3 38 0 40 1 1 34 1 35 1 36 1 1 0 29 0 34 0 35 Пример 7. Определение in vivo. Воздействие терапии сурфактантами на механические свойства легких у новорожденных оценивали на 9 недоношенных новорожденных кроликах с гестационным возрастом 27 дней. Животные были подвергнуты трахеотомии при рождении и пятеро из них получили дважды через трахеотомическую канюлю 2,5 мл/кг искусственного сурфактанта, содержащего ДПФХ, ФГ и SP-C(LKS), с полимиксином В или без него, в пропорциях, приведнных выше. Общая концентрация фосфолипидов экзогенного материала сурфактанта составила 40 мг/мл. Двое животных, которые использовались в качестве отрицательного контроля, не получали материал через трахеальную трубку, а двое других, которые использовались в качестве положительного контроля, были подвергнуты лечению той же самой дозой модифицированного естественного сурфактанта (куросурф, Curosurf,Chiesi Farmaceutici Spa, Parma, Italy), разбавленного до 40 мг/мл. Одно животное лечили смесью ДПФХ и ФГ в физиологическом растворе(той же концентрации, как указано выше) в дозе 2,5 мл/кг. Все животные содержались в камерах плетизмографа при температуре 37 С и при параллельной вентиляции в течение 60 мин 100% кислородом, используя вентилятор с сервоприводом Servo Ventilator 900 В (Siemens-Elema,Solna, Швеция) при заданной частоте 40 мин и времени вдоха 50%. Дыхательные объемы измеряли пневмотахографом, соединенным с каждой камерой плетизмографа. Животных вентилировали стандартизированным дыхательным объе мом 8-10 мл/кг и без положительного давления в конце выдоха (ПДКВ). Эластичность легких и грудной клетки определяли как отношение между дыхательным объемом и пиковым давлением вдоха и выражали в мл/см H2O кг. По сравнению с контрольным животным,не подвергнутым лечению, у животных, подвергавшихся лечению искусственным сурфактантом, эластичность была существенно улучшена,особенно у животного, получившего сурфактант, содержащий полимиксин В. Примечательно, что улучшение было более существенным по сравнению с улучшением, которое наблюдалось после лечения аналогичной дозой модифицированного естественного сурфактанта (фиг. 3). Краткое описание фигур Фиг. 1 - аминокислотные последовательности и спирально-круговые представления SPC и его аналогов. Последовательность человеческого SP-C взята у Johansson J. et al. (1988) FEBS Lett. 232,61-64 и последовательность SP-C(Leu) у NilssonG., et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124. SPC(LKS) основана на первичной структуре SP-C,но все остатки Val в положениях с 16 по 28, за исключением положения 17, заменены на остатки Leu; остатки Lys, которые были введены в 17, 22 и 27 положениях, и пальмитоилированный Cys в 5 и 6 положениях, заменены на Ser. Фиг. 2 - поверхностное распределение препаратов искусственного сурфактанта. Кинетика распределения 3%-ного по массеSP-C(LKS) (заполненные квадраты, сплошная линия) и 3%-ного по массе SP-C(LKS) с добав 15 лением 2%-ного по массе SP-B (открытые треугольники, пунктирная линия). Все препараты исследовались при концентрации 10 мг/мл смеси ДПФХ/ФГ, 7:3 (мас./мас.) в 150 ммоль/лNaCl. Значения были получены при помощи весов Вильгельми, и каждая точка данных представляет собой среднее значение трех различных измерений. Фиг. 3 - результаты in vivo. Эластичность легких и грудной клетки у 5 недоношенных новорожденных кроликов (гестационный возраст 27 дней), которых вентилировали стандартизированным дыхательным объмом 8-10 мл/кг и без положительного давления в конце выдоха (ПДКВ). У животных,подвергнутых лечению, эластичность была значительно улучшена. Добавление полимиксина В(РхВ) увеличивает эффект искусственного сурфактанта. Концентрация фосфолипидов является одинаковой во всех препаратах сурфактанта,т.е. 40 мг/мл. Перечень последовательностейZ представляет собой S и, возможно, может быть связан через эфирную или тиоэфирную связи с ацильной группой, содержащей 1222 атома углерода;a представляет собой целое число от 1 до 19;b представляет собой целое число от 1 до 19; с представляет собой целое число от 1 до 21;d представляет собой целое число от 0 до 20; е представляет собой 0 или 1; 18 7. Аналоги SP-C по пп.1-6, в которых остатки Ser ацилированы предпочтительно пальмитоильными группами. 8. Аналоги SP-C по пп.1-7, в которых В представляет собой лизин или фенилаланин и X представляет собой лейцин, изолейцин или норлейцин. 9. Аналоги SP-C по п.8, выбранные из группы, состоящей из 10. Синтетический сурфактант, содержащий по меньшей мере один аналог SP-C формулы (I) в смеси с липидами и фосфолипидами. 11. Синтетический сурфактант по п.10, в котором смесь липидов/фосфолипидов содержит ДПФХ (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3 фосфохолин), ФГ (фосфатидилглицерин), ПК(пальмитиновую кислоту). 12. Синтетический сурфактант по пп.10-11,дополнительно содержащий SP-B или его активное производное либо полимиксин, предпочтительно полимиксин В. 13. Синтетический сурфактант по пп.10-12 в форме раствора, дисперсии, суспензии, сухого порошка. 14. Применение аналогов SP-C по пп.1-7 для приготовления синтетического сурфактанта,используемого во всех случаях дефицитов сурфактанта. 15. Применение синтетического сурфактанта по п.12, содержащего полимиксин, предпочтительно полимиксин В, для лечения всех случаев дефицитов или дисфункции сурфактанта или серозного среднего отита (экссудативного отита). 16. Применение по п.14 или 15, где дефицит сурфактанта представляет собой респираторный дистресс-синдром.