Пегилированные соединения glp-1

012442 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к полиэтиленгликоль (PEG)-модифицированным соединениям глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1) и относится к композициям и способам, пригодным для лечения состояний или расстройств, на которые оказывает благоприятное действие понижение глюкозы крови,уменьшение потребления пищи, уменьшение желудочного или кишечного опорожнения, увеличение количества и/или функции бетаклеток, и/или ингибирование апоптоза -клеток или снижение желудочной или кишечной перистальтики. Уровень техникиGLP-1 индуцирует многочисленные биологические эффекты, такие как стимулирование секреции инсулина, ингибирование секреции глюкагона, ингибирование желудочного опорожнения, ингибирование желудочной перистальтики или кишечной перистальтики, усиление утилизации глюкозы и стимулирование потери веса. Более того, GLP-1 может действовать для предотвращения истощения панкреатических -клеток, которое происходит при прогрессировании инсулиннезависимого сахарного диабета(NIDDM). Существенной особенностью GLP-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина без ассоциированного риска гипогликемии. GLP-1 индуцирует секрецию инсулина, только когда повышены уровни глюкозы, в отличие от других способов лечения, которые действуют с помощью увеличения экспрессии инсулина независимо от того, повышены ли уровни глюкозы. Пригодность терапии, затрагивающей пептиды GLP-1, была ограничена тем фактом, что GLP-1(1-37) является низкоактивным, а два природных усеченных пептида, GLP-1 (7-37) OH и GLP-1 (7-36)NH2, быстро выводятся in vivo и имеют чрезвычайно короткие периоды полувыведения in vivo. Известно,что эндогенно вырабатываемая дипептидил пептидаза IV (DPP-IV) инактивирует циркулирующие пептиды GLP-1 с помощью удаления N-терминальных остатков гистидина и аланина и является главной причиной короткого периода полувыведения in vivo. В то время как в результате различных подходов получены соединения GLP-1 с более длинным периодом полувыведения или большей эффективностью, чем у нативного GLP-1, необходимы дополнительные соединения, чтобы дополнительно уменьшить клиренс и увеличить период полувыведения, таким образом оптимизируя способность GLP-1 быть пригодным в качестве лекарственного средства, которое можно вводить минимальное количество раз в течение длительного периода времени. Международные заявкиPCT/US2004/006082 и PCT/US2000/11814 описывают ковалентное присоединение одной или более молекул PEG к различным соединениям GLP-1 и эксендина. Эти соединения могут иметь период полувыведения более 24 ч, предусматривая меньше введений пегилированного соединенияGLP-1 для поддержания высокого уровня соединения в крови в течение длительного периода времени. Дальнейшее исследование выявило проблему, заключающуюся в том, что во время длительного хранения возникает отделение PEG от пегилированного соединения GLP-1 или эксендина. В результате свободный GLP-1 или пептид эксендин увеличивает инициальный пик концентрации профиля воздействия за пределы терапевтического окна. При этом имеется возможность увеличения побочных эффектов,таких как тошнота и рвота. Настоящее изобретение стремится преодолеть проблемы, связанные с длительным хранением и возможностью отделения PEG от пегилированного соединения GLP-1 или эксендина с помощью введения двух участков пегилирования в соединении GLP-1 или эксендина и затем пегилирования этих двух участков пегилирования одновременно. У этого подхода по крайней мере четыре преимущества. Во-первых,пегилирование соединений существенно повысит периоды полувыведения соединений in vivo. Вовторых, пегилирование соединений замедлит скорость поглощения соединения и таким образом уменьшит начальный пик лекарственного препарата, который, как полагают, отвечает за побочные эффекты. В-третьих, линейные PEG могут использоваться непосредственно для пегилирования и упростят процедуру синтеза. В-четвертых, тандемное пегилирование облегчит проблемы, связанные с длительным хранением и возможностью отделения PEG от пегилированного соединения GLP-1 или эксендина путем уменьшения вероятности, что оба PEG будут отделены от одной и той же молекулы GLP-1 или пептида эксендина. Кроме того, введение двух участков пегилирования в соединение GLP-1 или эксендина в С-концевой области соединения и затем пегилирование этих двух участков пегилирования одновременно имеют результат пегилированного соединения, имеющего большую активность, чем те пегилированные соединения, в которых по крайней мере один из участков пегилирования находится не в С-концевой области пептида. Более того, присоединение линкера, включающего два участка пегилирования в С-концевой области соединения GLP-1 и затем пегилирование этих двух участков пегилирования одновременно приводит к получению пегилированных соединений GLP-1, имеющих большую активность,чем те пегилированные соединения, в которых участки пегилирования присоединены в С-концевой области соединения GLP-1 без линкера. Такие пегилированные соединения GLP-1 могут терапевтически использоваться для лечения субъектов с расстройствами, включающими диабет, тучность, нарушения желудочной и/или кишечной перистальтики, дефицит бетаклеток (например, недостаточность или нефункционирующие -клетки) и-1 012442 нарушения желудочного и/или кишечного опорожнения, но не ограничены этим, с особым преимуществом, состоящим в том, что пегилированные соединения GLP-1 изобретения требуют меньшего количества доз в течение периода 24 ч, увеличивая и удобство для субъекта, нуждающегося в такой терапии, и вероятность согласия субъекта с условиями дозирования. Сущность изобретения Описанное здесь изобретение предоставляет соединения GLP-1, ковалентно связанные с двумя молекулами полиэтиленгликоля (PEG) или его производным, где каждый PEG присоединен к остатку цистеина, что имеет результатом пегилированные соединения GLP-1 с элиминационным периодом полувыведения по крайней мере 1 ч, или по крайней мере 3, 5, 7, 10, 15, 20 ч, или по крайней мере 24 ч. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения имеют значение клиренса 200 мл/ч/кг или меньше,или 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или меньше, или меньше чем 50, 40 или 20 мл/ч/кг. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения включают аминокислотную последовательность формулыXaa46 является Cys или Cys-NH2; одна молекула PEG ковалентно присоединена к Cys45 и одна молекула PEG ковалентно присоединена к Cys46 или Cys46-NH2. Предпочтительно для пегилированных соединений GLP-1 формулы I Хаа 8 является Gly или Val;Xaa22 является Gly или Glu; Хаа 33 является Val или Ile и Хаа 46 является Cys или Cys-NH2. Также предпочтительными являются пегилированные соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Хаа 22 является Glu; Хаа 33 является Val или Ile и Хаа 46 является Cys или Cys-NH2. Также предпочтительными являются пегилированные соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val;Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Val и Хаа 46 является Cys. Также предпочтительными являются пегилированные соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val;Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Val и Хаа 46 является Cys-NH2. Также предпочтительными являются пегилированные соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val;Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys. Также предпочтительными являются пегилированные соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val;Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2. Полиэтиленгликоль (PEG) полимеры, используемые в изобретении, имеют молекулярные массы между 500 и 100000 Да, или между 5000 и 40000 Да, или между 20000 и 60000 Да, или между 20000 и 40000 Да, и могут быть линейными или разветвленными молекулами, и могут быть производными полиэтиленгликоля, как описано в данной области техники. Ковалентно связанная с соединениями GLP-1 молекула PEG в настоящем изобретении не предполагается быть ограниченной определенным видом. Предпочтительно, чтобы PEG являлся линейным метокси-PEG-малеимидом с молекулярной массой 20 кДа. Более предпочтительно, чтобы PEG являлся Настоящее изобретение охватывает способ стимулирования рецептора GLP-1 у субъекта, нуждающегося в такой стимуляции, где вышеуказанный способ включает стадию введения субъекту эффективного количества описанного здесь пегилированного соединения GLP-1. Субъекты, нуждающиеся в стимуляции рецептора GLP-1, включают субъектов с инсулиннезависимым сахарным диабетом, стрессиндуцированной гипергликемией, ожирением, расстройствами желудочной и/или кишечной перистальтики или опорожнения, включая, например, субъектов с синдромом раздраженной кишки, дефицитом-клеток и функциональной диспепсией. Подробное описание изобретения Глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1) является пептидом из 37 аминокислот, секретируемымL-клетками кишечника в ответ на прием пищи. Многочисленные аналоги и производные GLP-1 были описаны в данной области техники. Настоящее изобретение описывает модификации соединений GLP-1,которые имеют результатом продленный элиминационный период полувыведения и/или сниженный клиренс. Включение остатков цистеина в специфические аминокислотные участки пептида предоставляют тиоловую группу, с которой полиэтиленгликоль (PEG) или производное PEG может быть ковалентно связано, имея результатом пегилированное соединение GLP-1. Применяемый здесь термин "соединение GLP-1" включает нативный GLP-1, [GLP-1 (7-37) ОН илиGLP-1 (7-36) NH2], аналоги GLP-1, производные GLP-1, биологически активные фрагменты GLP-1, удлиненный GLP-1 или аналог или фрагмент удлиненного пептида GLP-1, аналоги эксендина-4 и производные эксендина-4. Предпочтительно, чтобы аналог GLP-1 имел последовательность аминокислот GLP-1 (7-37) ОН или удлиненного пептида GLP-1 так, чтобы 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот отличались от аминокислоты в соответствующей позиции GLP-1 (7-37) ОН или фрагмента GLP-1 (7-37) ОН, или был модифицирован так, чтобы 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот отличались от аминокислоты в соответствующей позиции удлиненного пептида GLP-1. Термин "пегилированный", относящийся к соединению GLP-1 настоящего изобретения, относится к соединению GLP-1, которое химически модифицировано с помощью ковалентного присоединения двух молекул полиэтиленгликоля или его производного. Кроме того, предполагается, что термин "PEG" относится к полиэтиленгликолю или его производному, как известно в данной области техники (например,патенты США 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 643025; 6448369; 6495659; 6515100 и 6514491). Предпочтительно, чтобы в пегилированных соединениях GLP-1 настоящего изобретения PEG(или его производном) ковалентно присоединяли к двум внедренным остаткам цистеина в соединенииGLP-1. Предпочтительно, чтобы два внедренных остатка цистеина в соединении GLP-1 находились в позиции 45 и 46. Термин "инсулинотропная активность" относится к способности стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенные уровни глюкозы, вызывая, таким образом, поглощение глюкозы клетками и уменьшение уровней глюкозы в плазме. Инсулинотропная активность может быть оценена с помощью способов, известных в данной области техники, включающих использование экспериментов in vivo и анализов in vitro, которые измеряют связывающую активность рецептора GLP-1 или активацию рецептора, например анализы, использующие клетки панкреатического островка или клетки инсулиномы, как описано в ЕР 619322 (Gelfand, et al.) и патенте США 5120712 соответственно. Инсулинотропную активность у людей обычно измеряют с помощью измерения уровней инсулина или уровней С-пептида. В целях настоящего изобретения используется сигнальный анализ рецептора GLP-1 in vitro для определения, покажет ли пегилированное соединение GLP-1 настоящего изобретения инсулинотропную активность in vivo. Инсулинотропная активность является активностью, которая может использоваться для демонстрации того, что пегилированное соединение GLP-1 является биологически активным. Все иллюстрируемые пегилированные соединения GLP-1 изобретения имеют инсулинотропную активность (пример 6). Применяемый здесь термин "эффективность in vitro" является мерой способности пептида активировать рецептор GLP-1 в клеточном анализе. Эффективность in vitro выражается как ЕС 50, которая является эффективной концентрацией соединения, имеющей результатом 50% активность в эксперименте ответа на однократную дозу. В целях настоящего изобретения эффективность in vitro определяют с использованием флюоресцентного анализа, в котором используют клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие человеческий рецептор GLP-1. Эти клетки HEK-293 стабильно интегрируют вектор ДНК, имеющий cAMP-ответный элемент (CRE), запускающий экспрессию гена люциферазы. Взаимодействие соединения GLP-1 или пегилированного соединения GLP-1 с рецептором инициирует сигнал, который приводит к активации сАМР-ответного элемента и последующей экспрессии люциферазы. Значения ЕС 50 для пегилированных соединений GLP-1, перечисленных в примере 3, определяли с использованием люциферазного анализа, описанного выше. Относительные значения эффективности in vitro могут быть-3 012442 установлены с помощью использования Val8-GLP-1 (7-37) ОН или нативного GLP-1 в качестве контроля,присваивая контролю референсное значение 100%. Термин "период полувыведения из плазмы" относится ко времени, в течение которого половина соответствующих молекул циркулируют в плазме до их выведения. Используемым в качестве альтернативы термином является "элиминационный период полувыведения." Термин "удлиненный" или "более длинный", используемый в контексте периода полувыведения из плазмы или элиминационного периода полувыведения, показывает, что есть статистически существенное увеличение периода полувыведения пегилированного соединения GLP-1 относительно такового у эталонной молекулы (например, непегилированной формы пептида или нативного пептида), определенного при аналогичных условиях. Предпочтительно, чтобы пегилированное соединение GLP-1 настоящего изобретения имело элиминационный период полувыведения по крайней мере 1 ч, более предпочтительно по крайней мере 3, 5, 7, 10, 15, 20 ч и наиболее предпочтительно по крайней мере 24 ч. Период полувыведения, представленный здесь в примерах 4 и 5, является элиминационным периодом полувыведения; это то, что соответствует терминальной прямо пропорциональной величине элиминации. Специалисты в данной области техники определяют, что период полувыведения является производным параметром, который изменяется в зависимости и от клиренса, и от объема распределения. Клиренс является показателем способности тела элиминировать лекарственный препарат. Ожидалось бы увеличение периода полувыведения при уменьшении клиренса вследствие, например, модификаций лекарственного препарата. Однако эта взаимная связь точна только тогда, когда нет изменения в объеме распределения. Полезная приблизительная взаимосвязь между терминальным прямо пропорциональным периодом полувыведения (t1/2), клиренсом (С) и объемом распределения (V) выражается с помощью уравнения t1/20,693 (V/C). Клиренс показывает не количество выводимого лекарственного препарата, а скорее объем биологической жидкости, такой как кровь или плазма, которая должна была бы полностью освобождена от лекарственного препарата, чтобы составить элиминацию. Клиренс выражается как объем в единицу времени. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения имеют значение клиренса 200 мл/ч/кг или меньше, или 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или меньше, или 50, 40 или 20 мл/ч/кг или меньше (пример 4 и 5). В настоящем изобретении аминокислоту Cys включили в положения 45 и 46 соединений GLP-1. Получающуюся молекулу пегилировали по аминокислотам Cys, имея результатом модифицированную молекулу, которая сохраняет всю или часть биологической активности, имея более длинный период полувыведения, чем немодифицированная молекула или нативная молекула. Соединения GLP-1 для использования в настоящем изобретении могут быть получены с использованием стандартных способов жидкофазных или твердофазных методов пептидного синтеза. Как только соединение GLP-1 готовят и очищают, его пегилируют с помощью ковалентно присоединененных к соединению GLP-1 двух молекул PEG. В данной области техники описано широкое разнообразие способов для ковалентного сопряжения PEG и пептидов (для обзора см. статью Roberts M. et al.Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). Пегилирование пептидов на углеродном конце может быть выполнено с помощью ферментативного сцепления с использованием рекомбинантного пептидаGLP-1 в качестве предшественника или альтернативных способов, известных и описанных в данной области техники (например, патент США 4343898 или International Journal of PeptideProtein Research. 43:121-38, 1994). Один способ получения пегилированных соединений GLP-1 настоящего изобретения предполагает использование PEG-малеимида для непосредственного присоединения PEG к тиоловой группе пептида. Внедрение тиоловой функциональной группы может быть достигнуто с помощью добавления или вставления остатка Cys на пептид или в него в позициях, описанных выше. Тиоловая функциональная группа также может быть внедрена в боковую цепь пептида (например, ацилирование лизина-аминогруппы тиолсодержащей кислоты). Способ пегилирования настоящего изобретения использует реакцию Майкла для формирования устойчивого тиоэфирного линкера. Реакция является очень специфической и идет при мягких условиях в присутствии других функциональных групп. PEG-малеимид использовали в качестве реактивного полимера для приготовления строго определенных биологически активных сопряжений PEG-белка. Предпочтительно, чтобы в процедуре использовали молярный избыток тиолсодержащего соединения GLP-1 относительно малеимида PEG для ведения реакции к завершению. Реакции предпочтительно выполняют при рН между 4,0 и 9,0 при комнатной температуре в течение от 1 до 40 ч. Избыток непегилированного тиолсодержащего пептида легко отделяют от пегилированного продукта с помощью традиционных способов сепарации. Типовые условия, требуемые для пегилирования соединений GLP-1, сформулированы в примере 1 и 2. Пегилирование цистеина может быть выполнено с использованием PEG-малеимида или раздвоенного PEG-малеимида. Предпочтительным PEG является линейный метокси-РЕС-малеимид с молекулярной массой 20 кДа.PEG в его типичной форме является линейным полимером с терминальными гидроксильными группами и имеет формулу HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, где n составляет от приблизительно 8 до приблизительно 4000. Терминальный водород может быть заменен защитной группой, такой как алкильная или арильная группа. Предпочтительно, чтобы PEG имел по крайней мере одну гидроксигруппу,-4 012442 более предпочтительно, чтобы она являлась терминальной гидроксигруппой. Эта та самая гидроксигруппа, которую предпочтительно активируют для проведения реакции с пептидом. Есть много форм PEG,пригодных для настоящего изобретения. В данной области техники существуют многочисленные производные PEG, являющиеся подходящими для использования в изобретении (например, патенты США 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 6437025; 6448369; 6495659; 6515100 и 6514491 иGLP-1 в настоящем изобретении, не предполагается быть ограниченной определенным видом. Молекулярная масса PEG составляет предпочтительно от 500 до 100000 Да, и более предпочтительно от 20000 до 60000 Да, и наиболее предпочтительно от 20000 до 40000 Да. PEG может быть линейным или разветвленным. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения имеют биологическую активность invitro, которая составляет по крайней мере 0,5% таковой у нативного GLP-1 или Val8-GLP-1 (7-37) ОН. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения имеют биологическую активность in vitro,которая составляет по крайней мере 1% таковой у нативного GLP-1 или Val8-GLP-1 (7-37) ОН. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения имеют биологическую активность in vitro, которая составляет по крайней мере 3% таковой у нативного GLP-1 или Val8-GLP-1 (7-37) ОН. Такая биологическая активность может быть определена с помощью анализа эффективности in vitro, как описано здесь(пример 3), или с помощью других анализов GLP-1, известных в данной области техники. Хотя некоторые пегилированные соединения GLP-1 изобретения могут иметь биологическую активность ниже таковой у нативного GLP-1 или Val8-GLP-1 (7-37) ОН, измеренной в специфическом анализе; это уменьшение активности компенсируется с помощью удлиненного периода полувыведения соединения и/или более низкого значения клиренса. Введение пегилированных соединений GLP-1 может производить врач, компетентный в данной области, посредством любого способа введения, эффективность которого известна. Одним таким способом является периферический парентеральный. Парентеральное введение обычно понимается в медицинской литературе как инъекция лекарственной формы в тело с помощью стерильного шприца или некоторого другого механического устройства, такого как инфузионный насос. Периферические парентеральные способы введения могут включать внутривенный, внутримышечный, подкожный и интраперитонеальный пути введения. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения также можно вводить с помощью перорального, ректального, назального способа введения или способа введения через нижние дыхательные пути, которые являются непарентеральными способами введения. Из этих непарентеральных способов введения предпочтительными являются способ введения через нижние дыхательные пути и пероральный способ введения. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения могут использоваться для лечения широкого спектра заболеваний и состояний. Пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения, прежде всего, проявляют свои биологические эффекты при воздействии на рецептор, называемый"рецептор GLP-1." Субъекты с заболеваниями и/или состояниями, которые благоприятно реагируют на стимуляцию рецептора GLP-1 или на введение соединений GLP-1, могут поэтому лечиться пегилированными соединениями GLP-1 настоящего изобретения. Говорят, что эти субъекты "нуждаются в лечении соединениями GLP-1" или "нуждаются в стимуляции рецептора GLP-1". Сюда включены субъекты с инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, инсультом(WO 00/16797), инфарктом миокарда (WO 98/08531), ожирением (WO 98/19698), катаболическими изменениями после хирургического вмешательства (патент США 6006753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженной кишки (WO 99/64060). Также сюда включены субъекты, требующие профилактического лечения соединением GLP-1, например субъекты с риском развития инсулиннезависимого сахарного диабета (WO 00/07617). Субъекты с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенной гликемией натощак, субъекты, масса тела которых составляет приблизительно на 25% больше нормальной массы тела для данного роста и телосложения субъекта, субъекты с частичной панкреатэктомией,субъекты, имеющие одного или более родителей с инсулиннезависимым сахарным диабетом, субъекты,перенесшие гестационный диабет, и субъекты, перенесшие острый или хронический панкреатит, имеют риск развития инсулиннезависимого сахарного диабета. Эффективное количество пегилированных соединений GLP-1, описанное здесь, является количеством, которое приводит к желательному терапевтическому и/или профилактическому эффекту, не вызывая недопустимых побочных эффектов при введении субъекту, нуждающемуся в стимуляции рецептора"Желательный терапевтический эффект" включает одно или более из следующего: 1) улучшение симптома(ов), связанного с заболеванием или состоянием; 2) отсрочка начала симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; 3) увеличенная продолжительность жизни по сравнению с отсутствием лечения и 4) лучшее качество жизни по сравнению с отсутствием лечения. Например, "эффективное количество" пегилированного соединения GLP-1 для лечения диабета является количеством, которое имело бы результатом больший контроль концентрации глюкозы крови,-5 012442 чем при отсутствии лечения, таким образом приводя к отсрочке начала диабетических осложнений, таких как ретинопатия, нейропатия или заболевание почек. "Эффективное количество" пегилированного соединения GLP-1 для предотвращения диабета является количеством, которое задержало бы, по сравнению с отсутствием лечения, начало повышений уровней глюкозы крови, которые требуют лечения антигипергликемическими лекарственными препаратами, такими как сульфонилмочевина, тиазолидинедион,метформин, инсулин и/или бисгуанидин. Как правило, пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения вводят так, что уровни в плазме находятся в пределах диапазона от приблизительно 5 до приблизительно 200 пмоль/л. Оптимальные уровни в плазме для Val8-GLP-l (7-37) ОН установлены в пределах между 30 и приблизительно 200 пмоль/л. Доза пегилированного соединения GLP-1, эффективная для нормализации глюкозы крови пациента,будет зависеть от множества факторов, в которые включены без ограничения пол субъекта, вес и возраст,серьезность неспособности регулировать глюкозу крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль пегилированного соединения GLP-1, эффективность и композиция. Типичный диапазон доз для пегилированных соединений GLP-1 настоящего изобретения варьирует от приблизительно 0,01 до приблизительно 1000 мг/день для взрослого. Предпочтительно, чтобы дозировка варьировалась от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг/день, более предпочтительно от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мг/день. Предпочтительно, чтобы пегилированные соединения GLP-1 настоящего изобретения вводили или один раз каждые две недели, или один раз в неделю. В зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, может быть необходимо вводить пегилированные соединения GLP-1 более часто, например от двух до трех раз в неделю."Субъект" является млекопитающим, предпочтительно человеком, но также может быть животными, например домашними животными (например, собаками, кошками и т.п.), сельскохозяйственными животными (например, коровами, овцами, свиньями, лошадьми и т.п.) и лабораторными животными (например, крысами, мышами, морскими свинками и т.п.). Пептиды, используемые для производства пегилированных соединений GLP-1 настоящего изобретения, могут быть приготовлены с использованием стандартных способов жидкофазных или твердофазных методов пептидного синтеза. Изобретение иллюстрировано с помощью следующих примеров, которые не предполагаются быть ограничивающими. Примеры Пример 1. Пегилирование родственных GLP-1 аналогов. Реакции пегилирования проводят при условиях, которые допускают формирование тиоэфирной связи. В частности, рН-раствор варьирует от приблизительно 4 до 9, и диапазон концентраций тиолсодержащего пептида варьирует от 1 до 10 молярных избытков концентрации метокси-PEG2-MAL. Реакции пегилирования обычно проводят при комнатной температуре. Пегилированный пептид GLP-1 затем изолируют с использованием обратнофазовой ионообменной хроматографии HPLC или эксклюзионной хроматографии (SEC). Пегилированные аналоги GLP-1 характеризуют с использованием аналитическихRP-HPLC, HPLC-SEC, SDS-PAGE и/или масс-спектрометра MALDI. Тиолсодержащие пептиды GLP-1 реагируют с полиэтиленгликоль-малеимидом (PEG-малеимид) для создания производных с ковалентно присоединенным с помощью тиоэфирной связи PEG. Например,соединение GLP-1 длиной 46 аа; 7,5 мг, 1,8 мкмоль растворяют в 2 мл 200 ммоль фосфатного буфера,содержащего 20 ммоль EDTA, рН 7,4. Раствор затем очищают аргоном. К этому раствору добавляют 40 мг метокси-PEG-MAL, линейный или раздвоенный PEG-малеимид (Shearwater Polymers, Inc.,Huntsville, Alabama) (соотношение PEG к пептиду 0,55:1 моль/моль). Реакция выполняется в течение 2 ч. Затем 25 мг пегилированного пептида очищают с помощью RP-HPLC, характеризуют с помощью эксклюзионной HPLC и тестируют на активность in vitro. Пример 2. Реакция 220 кДа-PEG-малеимида с аналогами GLP. Аналоги GLP-1 выборочно пегилируют на внедренных остатках цистеина, используя малеимидактивированные линейные 20 кДа-mPEG (NOF, Inc.). Для реакции пегилирования пептид, который пегилируют, растворяют в 100 ммоль NH4Ac буфера, содержащего 10 ммоль EDTA при рН 6,8 и добавлении большой части 20 кДа-mPEG в 1,25-кратном молярном избытке. Реакция предусматривает размешивание при комнатной температуре в течение от 1 до 4 ч и использование катионообменной хроматографииSP-Sepharose для отделения пегилированного соединения от свободного PEG и свободного пептида. Конъюгат обессоливают с помощью RP-HPLC и лиофилизируют. Пример 3. Анализ активности in vitro. Клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие человеческий рецептор GLP-1 с использованиемCRE-люциферазной системы, засеивают по принципу 30000 клеток/лунка/80 мкл среды DMEM F12 с низким содержанием сыворотки в 96-луночные планшеты. На следующий день после засеивания 20 мкл определенных количеств тестового белка, растворенного в 0,5% BSA, смешивают и инкубируют с клетками в течение 5 ч. Как правило, 10 растворений, содержащих от 0,001 до 10 нмоль готовят для тестовых соединений GLP-1, 0,0003 и 3 нмоль готовят для стандарта Val8-GLP-1 (7-37) ОН перед добавлением к-6 012442 клеткам для создания кривой дозовой зависимости, по которой определяют значения ЕС 50. После инкубации 100 мкл реактива люциферазы добавляют непосредственно в каждый планшет и осторожно смешивают в течение 2 мин. Планшеты помещают в люминометр Tri-lux и вычисляют световой выход, получающийся в результате экспрессии люциферазы. Среднее значение ЕС 50 для пегилированного соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Хаа 22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 являетсяCys-NH2, составляет 0,360,04 нмоль. Пример 4. Фармакокинетический анализ дериватизованного пептида GLP-1. Пегилированное соединение GLP-1 формулы I, где Xaa8 является Val; Хаа 22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2, вводят с помощью внутривенного (в/в) или подкожного (п/к) способов введения в дозе 0,1 мг/кг самцам крыс SD. У животных (3 крысы на группу) забирают кровь в разное время между 0 и 192 ч после введения дозы. Из каждого образца забирают плазму и анализируют с помощью N-терминального специфического радиоиммунного анализа. Фармакокинетические параметры вычисляют с использованием модель-независимых (некомпартментных) методов (WinNonlin Pro). В/в введенный пегилированный аналог GLP-1 имеет элиминационный период полувыведения приблизительно 1,2 дня, в то время как п/к введенный пегилированный аналог GLP-1 имеет элиминационный период полувыведения приблизительно 1,1 дня. С в/в или п/к введением 0,1 мг/кг не связаны никакие неблагоприятные клинические наблюдения. У соединения наблюдаются длительный элиминационный период полувыведения, медленный клиренс и подкожная биодоступность (приблизительно 30%). Наглядные данные представлены в табл. 1. Таблица 1 Средние (SD) значения фармакокинетического параметра для пегилированного соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Xaa46 является Cys-NH2, после внутривенного или подкожного введения 0,1 мг/кг самцам крыс SD Максимальная наблюдаемая концентрация в плазме. Время максимальной наблюдаемой концентрации в плазме. с Область под кривой зависимости концентрация в плазме-время, измеренная от 0 до последнего отмеченного пункта.e Общий клиренс тела как функция биодоступности.f Объем распределения как функция биодоступности. Когда Val8-GLP (7-37) ОН подобным образом вводят в/в 344 крысам Fischer в дозе 10 мкг/кг, получают глубоко различные значения клиренса и элиминационного периода полувыведения: клиренс: 1449 мл/ч/кг;t1/2: 0,05 ч. Пример 5. Фармакокинетический анализ дериватизованного пептида GLP-1. Пегилированное соединение GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Xaa22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2, вводят с помощью подкожного (п/к) способа введения в дозе 0,01 мг/кг самцам яванского макака. У животных забирают кровь в разное время между 0 и 168 ч после введения дозы. Из каждого образца забирают сыворотку и анализируют с помощью N-терминального специфического радиоиммунного анализа. Фармакокинетические параметры вычисляют с использованием модель-независимых методов (WinNonlin Pro). Наглядные данные представлены в табл. 2.-7 012442 Таблица 2 Средние (SD) значения фармакокинетического параметра для пегилированного соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Хаа 22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2, после подкожного введения 0,01 мг/кг самцам яванского макакаa Максимальная наблюдаемая сывороточная концентрация.b Время максимальной наблюдаемой сывороточной концентрации.c Область под кривой зависимости сывороточная концентрация-время, измеренная от 0 до последнего отмеченного пункта.d Оценка элиминационного периода полувыведения. е Общий клиренс тела как функция биодоступности.f Объем распределения в стационарном состоянии как функция биодоступности. Пример 6. Фармакодинамический анализ дериватизованного пептида GLP-1. Пегилированное соединение GLP-1 формулы I, где Xaa8 является Val; Хаа 22 является Glu; Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2, вводят с помощью подкожного (п/к) способа введения в дозе 0,01 мг/кг самцам яванского макака. Ступенчатую внутривенную инфузию глюкозы проводят непосредственно после п/к введения индифферентного контрольного вещества (физиологический раствор с фосфатным буфером) и спустя 1, 5, и 7 дней после п/к введения 0,01 мг/кг пегилированного аналога GLP-1. Процедуры ступенчатой внутривенной инфузии глюкозы проводят седатированным обезьянам после 16-часового голодания. Образцы крови берут за 10 мин до начала инфузии глюкозы и непосредственно перед началом инфузии глюкозы для определения исходного уровня. Затем инициируют ступенчатую инфузию глюкозы (20% декстроза) величиной 10 мг/кг/мин в течение 20 мин, с последующей инфузией 25 мг/кг/мин в течение дополнительных 20 мин. Образцы крови берут через 10-минутные интервалы в течение периода инфузии. Уровни инсулина определяют с помощью иммунохимического анализа. Инсулинотропная активность демонстрируется в течение по крайней мере 7 дней (относительно плацебо; р 0,0001) после одной п/к инъекции 0,01 мг/кг пегилированного аналога GLP-1. Наглядные данные представлены в табл. 3. Таблица 3 Средние (SD) значения фармакодинамического параметра для пегилированного соединения GLP-1 формулы I, где Хаа 8 является Val; Xaa22 является Glu; Xaa33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2 после подкожного введения 0,01 мг/кг самцам яванского макака. AUC инсулина ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пегилированные соединения GLP-1, включающие аминокислотную последовательность формулыXaa46 является Cys или Cys-NH2 и где одна молекула PEG ковалентно присоединена к Cys45 и одна молекула PEG ковалентно присоединена к Cys46 или Cys46-NH2. 2. Пегилированное соединение GLP-1 по п.1, в котором Хаа 8 является Gly или Val и Хаа 22 является-9 012442 5. Пегилированное соединение GLP-1 по п.4, в котором Хаа 8 является Val, Хаа 22 является Glu, Хаа 33 является Ile и Хаа 46 является Cys-NH2. 6. Пегилированное соединение GLP-1 по любому из пп.1-5, в котором молекулы PEG имеют молекулярные массы между 5000 и 40000 Да. 7. Пегилированное соединение GLP-1 по любому из пп.1-5, в котором молекулы PEG имеют молекулярные массы между 20000 и 60000 Да. 8. Пегилированное соединение GLP-1 по любому из пп.1-5, в котором молекулы PEG имеют молекулярные массы между 20000 и 40000 Да. 9. Пегилированное соединение GLP-1 по любому из пп.1-5, в котором молекулы PEG имеют молекулярные массы приблизительно 20000 Да. 10. Пегилированное соединение GLP-1 по п.9, в котором молекулы PEG являются линейными метокси-PEG-малеимидами. 11. Пегилированное соединение GLP-1 по любому из пп.1-10 для использования в качестве лекарственного средства. 12. Применение пегилированного соединения GLP-1 по любому из пп.1-10 для изготовления лекарственного средства для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета или ожирения.