Применение противоопухолевых комбинаций рапамицина с гемцитабином или 5-фторурацилом

010184 Данное изобретение относится к противоопухолевым комбинациям, более конкретно к использованию комбинаций ингибитора mTOR (например, 42-сложного эфира рапамицина с 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой (CCI-779 и антиметаболического противоопухолевого средства для лечения опухолей. Предпосылки создания изобретения Рапамицин является макроциклическим триеновым антибиотиком, продуцируемым StreptomycesSehdal et al., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1978); патент США 3929992 и патент США 3993749). Кроме того, один рапамицин (патент США 4885171) или в сочетании с пицибанилом (патент США 4401653), как было показано, обладают противоопухолевой активностью. Иммунодепрессивные эффекты рапамицина были описаны в FASEB 3, 3411 (1989). Циклоспорин А иFK-506, другие макроциклические молекулы, также, как было показано, эффективны в качестве иммунодепрессивных средств и поэтому пригодны для профилактики отторжения трансплантатов (FASEB 3, 3411al. (Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977 открыли, что рапамицин эффективен на модели экспериментального аллергического энцефаломиелита, модели множественного склероза; на модели адъювантного артрита, модели ревматоидного артрита и эффективно подавлял образование IgE-подобных антител. Рапамицин также пригоден для профилактики или лечения системной красной волчанки (патент США 5078999), воспаления легких (патент США 5080899), инсулинозависимого сахарного диабета (патент США 5321009), кожных болезней, таких как псориаз (патент США 5286730), заболеваний кишечника (патент США 5286731), пролиферации клеток гладких мышц и утолщения интимы после повреждения сосудов (патенты США 5288711 и 5516781), Т-клеточной лейкемии/лимфомы взрослых (европейская патентная заявка 525960 А 1), воспаления глаз (патент США 5387589), злокачественных карцином (патент США 5206018), воспалительных заболеваний сердца (патент США 5496832) и анемии (патент США 5561138). 42-Сложный эфир рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой(CCI-779) является сложным эфиром рапамицина, который демонстрирует значительное подавляющее действие на рост опухоли как на моделях in vitro, так и in vivo. Получение и использование сложных гидроксиэфиров рапамицина, включая CCI-779, описаны в патенте США 5362718.CCI-779 проявляет цитостатические, в противоположность цитотоксическим, свойства и может замедлять развитие опухолей или отдалять время рецидива опухоли. Как считают, CCI-779 имеет механизм действия, который подобен механизму действия сиролимуса. CCI-779 связывается и образует комплекс с цитоплазматическим белком FKBP, который подавляет фермент mTOR (мишень действия рапамицина у млекопитающих, также известная как связанный с FKBP12-рапамицином белок (FRAP. Подавление активности mTOR-киназы угнетает ряд путей передачи сигналов, включая стимулируемую цитокинами клеточную пролиферацию, трансляцию мРНК для нескольких ключевых белков, которые регулируютG1-фазу клеточного цикла и индуцируемую ИЛ-2 транскрипцию, приводя к подавлению развития клеточного цикла от G1 до S. Механизм действия CCI-779, который приводит к блокированию G1-S фазы,является новым для противоракового лекарства.In vitro CCI-779, как было показано, подавляет рост ряда гистологически отличающихся опухолевых клеток. Среди наиболее чувствительных к CCI-779 отмечают линии клеток рака центральной нервной системы (ЦНС), лейкемии (Т-клеточная), рака молочных желез, рака простаты и меланомы. Данное соединение останавливает деление клеток в фазе G1 клеточного цикла. Исследование in vivo на голых мышах показало, что CCI-779 обладает активностью против ксенотрансплантатов человеческих опухолей разных гистологических типов. Глиомы были особенно чувствительны к CCI-779, и данное соединение было активно на модели ортотопической глиомы на голых мышах. Вызванная фактором роста (тромбоцитарным) стимуляция линии клеток человеческой глиобластомы заметно подавлялась CCI-779 in vitro. CCI-779 также подавлял рост нескольких опухолей человеческой поджелудочной железы, а также одну из двух линий клеток рака молочных желез, изучаемого invivo. Описание изобретения Данное изобретение связано с применением комбинаций ингибитора mTOR и антиметаболического противоопухолевого средства в качестве противоопухолевой комбинированной химиотерапии. В частности, эти комбинации пригодны для лечения рака почек, рака мягких тканей, рака молочной железы, нейроэндокринной опухоли легких, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, немелкоклеточного рака легких, рака простаты, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, мелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака толстой кишки, рака пищевода, рака желудка, лейкемии, колоректального рака и первичного рака невыясненной природы. Данное изобретение связано также с комбинациями ингибитора mTOR и антиметаболического противоопухолевого средства и с их применением в качестве противоопухолевой комбинированной химиотерапии, при которой дозировка либо ингибитораmTOR, либо антиметаболического противоопухолевого средства, либо их обоих применяется в терапев-1 010184 тически субэффективных дозах. В соответствии с данным изобретением термин лечение означает лечение млекопитающего,имеющего опухолевое заболевание, путем введения данному млекопитающему эффективного количества комбинации ингибитора mTOR и антиметаболического противоопухолевого средства с целью подавления роста опухоли у такого млекопитающего, ликвидации опухоли или временного облегчения состояния млекопитающего. В соответствии с данным изобретением термин обеспечение в отношении обеспечения комбинации означает или непосредственное введение комбинации, или введение пролекарства, производного или аналога одного компонента или обоих компонентов комбинации, из которого в организме будет образовываться эффективное количество комбинации.mTOR является мишенью действия рапамицина у млекопитающих, известной также как связанный с FKBP12-рапамицином белок (FRAP). Подавление активности mTOR-киназы угнетает ряд путей передачи сигнала, включая вызываемую цитокинами пролиферацию клеток, трансляцию мРНК для нескольких ключевых протеинов, которые регулируют G1-фазу клеточного цикла, и вызываемую ИЛ-2 транскрипцию, приводящую к подавлению развития клеточного цикла от G1 до S.mTOR регулирует активность по меньшей мере двух белков, участвующих в трансляции специфических регуляторных протеинов клеточного цикла (Burnett, P.E., PNAS 95: 1432 (1998) и Isotani, S., J.Biol. Chem. 274: 33493 (1999. Один из этих белков, р 70s6-киназа, фосфорилируется mTOR по серину 389, а также треонину 412. Это фосфорилирование можно наблюдать в клетках, обработанных фактором роста с помощью вестерн-блоттинга цельных клеточных экстрактов этих клеток со специфическими антителами к фосфосериновому остатку 389. В соответствии с данным изобретением ингибитор mTOR означает соединение или лиганд, который подавляет репликацию клеток блокированием развития клеточного цикла от G1 до S путем подавления фосфорилирования серина 389 в р 70s6-киназе mTOR. Следующая стандартная процедура фармакологического испытания может использоваться для определения того, является ли соединение ингибитором mTOR, которому дано определение здесь. Обработка стимулированных фактором роста клеток ингибитором mTOR, подобным рапамицину, полностью блокирует фосфорилирование серина 389, что показано методом вестерн-блоттинга, и как таковая представляет собой хорошее исследование на подавление mTOR. Так, цельные клеточные лизаты из клеток,стимулированных фактором роста (например, IGF1) в культуре в присутствии ингибитора mTOR, не должны давать полосу на акриламидном геле, которую можно пометить специфическими антителами к серину 389 в p70s6K. Материалы. Буфер для образца для NuPAGE LDS(Novex CatNP0007) Восстанавливающее средство для образца для NuPAGE (Novex CatNP0004) 4-12% бис-трис гель для NuPAGE(Novex CatNP0321) Движущийся буфер для NuPAGE с MOPS и SDS(Novex CatLC2001) Переносящий буфер для NuPAGE(Amersham CatRPN3114H) Реагент для проявления Вестерн-блоттинга ECL(Cell Signalling Cat9205) Вторичное антитело Козьи антитела против конъюгата кроличий IgG-HRP (Santa Cruz Catsc-2004) Методы. А. Получение клеточных лизатов. Линии клеток выращивали на оптимальной основной среде, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой и пенициллином/стрептомицином. Для исследования на фосфорилирование клетки субкультивировали в 6-ячеечных планшетах. После того, как клетки полностью прикреплялись, их в каждом случае лишали сыворотки. Обработка ингибиторами mTOR колебалась в пределах от 2 до 16 ч. После обработки лекарственным препаратом клетки промывали 1 раз ЗФФР (забуференный фосфатом физиологический раствор без Mg и Ca) и затем лизировали в 150-200 мкл буфера для образца дляNuPAGE LDS на лунку. Лизаты в течение короткого интервала времени обрабатывали ультразвуком и затем центрифугировали в течение 15 мин при 14000 об./мин. Лизаты хранили при -80 С до использования. Процедура испытания может быть также проведена путем инкубации клеток в ростовой среде в течение ночи, после чего они полностью прилипали. Результаты при обоих сочетаниях условий должны быть для ингибитора mTOR одинаковыми. В. Анализ методом вестерн-блоттинга. 1) Готовят суммарные образцы белка путем внесения 22,5 мкл лизата в пробирку и затем добавляют 2,5 мкл NuPAGE восстанавливающего средства для образца для NuPAGE. Прогревают образцы при 70 С в течение 10 мин. Проводят электрофорез, используя гели NuPAGE и буферы для NuPAGE SDS.-2 010184 2) Переносят гель на нитроцеллюлозную мембрану с помощью переносного буфера для NuPAGE. Мембрану блокируют в течение 1 ч блокирующим буфером (забуференный трис-буфером физиологический раствор с 0,1% Tween и 5% нежирного молока). Промывают мембраны 2 отмывающим буфером(забуференный трис-буфером физиологический раствор с 0,1% Tween). 3) Блот/мембраны инкубируют с первичным антителом Р-р 70 S6K (Т 389) (1:1000) в блокирующем буфере в течение ночи при 4 С на вращающей платформе. 4) Блоты промывают 3 в течение 10 мин каждый отмывающим буфером и инкубируют с вторичным антителом (1:2000) в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. 5) После связывания вторичного антитела блоты промывают 3 в течение 10 мин каждый отмывающим буфером и 2 в течение 1 мин каждый забуференным трис-буфером физиологическим раствором с последующим хемилюминесцентным (ECL) определением и затем подвергают воздействию хемилюминесцентных пленок. В соответствии с данным изобретением термин рапамицин определяет класс иммунодепрессивных соединений, которые содержат основное рапамициновое ядро (показано ниже). Рапамицины согласно изобретению включают в себя соединения, которые могут быть химически или биологически модифицированы как производные рапамицинового ядра, при этом все еще сохраняя иммуносупрессивные свойства. Соответственно, термин рапамицин включает в себя сложные эфиры, простые эфиры, оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина, а также рапамицины, в которых функциональные группы на рапамициновом ядре были модифицированы, например, путем восстановления или окисления. Термин рапамицин включает в себя также фармацевтически приемлемые соли рапамицинов, которые способны к образованию таких солей благодаря содержанию либо кислотной, либо основной групп. Предпочтительно, чтобы сложные эфиры и простые эфиры рапамицина являлись эфирами по гидроксильным группам в 42- и/или 31-положении рапамицинового ядра, сложными и простыми эфирами по гидроксильной группе в 27-положении (после химического восстановления 27-кетона) и чтобы оксимы, гидразоны и гидроксиламины являлись производными кетона в 42-положении (после окисления 42 гидроксильной группы) и 27-кетона рапамицинового ядра. Предпочтительные 42- и/или 31-сложные эфиры и простые эфиры рапамицина описаны в следующих патентах, которые включены сюда в виде ссылки: сложные алкиловые эфиры (патент США 4316885), аминоалкиловые сложные эфиры (патент США 4650803); фторированные сложные эфиры (патент США 5100883); амиды сложных эфиров (патент США 5118677); карбаматные эфиры (патент США 5118678); простые силиловые эфиры (патент США 5120842); сложные аминоэфиры (патент США 5130307); ацетали (патент США 551413); аминодисложные эфиры (патент США 5162333); сульфонатные и сульфатные эфиры (патент США 5177203); сложные эфиры (патент США 5221670); алкоксильные сложные эфиры (патент США 5233036); О-арил-, -алкил, -алкенил и -алкиниловые простые эфиры (патент США 5258389); карбонатные эфиры (патент США 5260300); арилкарбонил и алкоксикарбонилкарбаматы (патент США 5262423); карбаматы (патент США 5302584); сложные гидроксиэфиры (патент США 5362718); затрудненные сложные эфиры (патент США 5385908); гетероциклические сложные эфиры (патент США 5385909); гемдизамещенные сложные эфиры (патент США 5385910); эфиры аминоалкановых кислот (патент США 5389639); фосфорилкарбаматные эфиры (патент США 5391730); карбаматные эфиры (патент США 5411967); карбаматные эфиры (патент США 5434260); амидинокарбаматные эфиры (патент США 5463048); карбаматные эфиры (патент США 5480988); карбаматные эфиры (патент США 5480989); карбаматные эфиры (патент США 5489680); затрудненные N-оксидсложные эфиры(патент США 5491231); биотиновые сложные эфиры (патент США 5504091); О-алкиловые эфиры (патент США 5665772) и сложные эфиры рапамицина и ПЭГ (патент США 5780462). Получение этих сложных эфиров и простых эфиров описано в патентах, перечисленных выше. Предпочтительные 27-сложные эфиры рапамицина описаны в патенте США 5256790, который включен сюда в виде ссылки. Получение этих сложных эфиров и простых эфиров описано в патентах,-3 010184 перечисленных выше. Предпочтительные оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина описаны в патентах США 5373014, 5378836, 5023264 и 5563145, которые включены сюда в виде ссылки. Получение этих оксимов,гидразонов и гидроксиламинов описано в перечисленных выше патентах. Получение 42-оксорапамицина описано в 5023263, который включен сюда в виде ссылки. Особенно предпочтительные рапамицины включают в себя рапамицин (патент США 3929992), CCI779 (рапамицин-42-сложный эфир с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой; патент США 5362718) и 42-О-(2-гидрокси)этилрапамицин (патент США 5665772). Когда применимо, могут быть получены фармацевтически приемлемые соли рапамицина с органическими и неорганическими кислотами, например уксусной, пропионовой, молочной, лимонной, винной,янтарной, фумаровой, малеиновой, малоновой, миндальной, яблочной, фталевой, хлористо-водородной,бромисто-водородной, фосфорной, азотной, серной, метансульфоновой, нафталинсульфоновой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, камфорсульфоновой и подобными известными приемлемыми кислотами, когда рапамицин содержит подходящую основную группу. Соли могут быть также образованы с органическими и неорганическими основаниями, такими как соли щелочных металлов (например, натрия, лития или калия), соли щелочно-земельных металлов, соли аммония, соли алкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода, или соли диалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкильной группе, и соли триалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкильной группе,когда рапамицин содержит подходящую кислотную группу. Предпочтительно, чтобы ингибитор mTOR, используемый в противоопухолевых комбинациях согласно изобретению, являлся рапамицином, и более предпочтительно, чтобы ингибитор mTOR являлся рапамицином, CCI-779, или 42-О-(2-гидрокси)этилрапамицином. Как описано здесь, CCI-779 оценивали как типичный представитель ингибиторов mTOR в комбинациях ингибитора mTOR плюс антиметаболита согласно изобретению. Получение CCI-779 описано в патенте США 5362718, который включен сюда в виде ссылки. КогдаCCI-779 используют в качестве противоопухолевого средства, подразумевается, что первоначальные дозы для в/в вливания будут заключены примерно между 0,1 и 100 мг/м 2 при применении в режиме суточной дозировки (ежедневно в течение 5 дней, каждые 2-3 недели) и примерно между 0,1 и 1000 мг/м 2 при режиме дозирования 1 раз в неделю. Пероральное или внутривенное вливание являются предпочтительными путями введения, причем внутривенное введение является более предпочтительным. В соответствии с данным изобретением термин антиметаболит означает вещество, которое структурно сходно с необходимым природным промежуточным соединением (метаболитом) в биохимическом пути, приводящем к синтезу ДНК или РНК, которые используются организмом хозяина в этом пути, но действует так, что подавляет завершение этого пути (т.е. синтез ДНК или РНК). Более конкретно, антиметаболиты обычно действуют путем: (1) конкуренции с метаболитами в отношении каталитического или регуляторного сайта ключевого фермента в синтезе ДНК или РНК или (2) замены метаболита, который в норме включается в ДНК или РНК, и, тем самым, получения ДНК или РНК, которая не может поддерживать репликацию. Главные виды антиметаболитов включают в себя: (1) аналоги фолиевой кислоты, которые являются ингибиторами дигидрофолатредуктазы (ДГФР); (2) пуриновые аналоги,которые имитируют природные пурины (аденин или гуанин), но структурно отличаются, так что они конкурентно или необратимо подавляют ядерный процессинг ДНК или РНК; и (3) пиримидиновые аналоги, которые имитируют природные пиримидины (цитозин, тимидин и урацил), но структурно отличаются, так что они конкурентно или необратимо подавляют ядерный процессинг ДНК или РНК. Типичные примеры антиметаболитов включают флоксурадин (2'-дезокси-5-фторуридин); тиогуанин(2,4-диамино-5-метил-6-[(3,4,5-триметоксианилино)метил]хиназолина моно-D-глюкуронат); кладрибин (2-хлор-6-амино-9-(2-дезокси-(бета)-Dэритропентофуранозил)пурин). Примеры антиметаболитов согласно изобретению 5-Фторурацил (5-ФУ; 5-фтор-2,4(1 Н,3 Н)пиримидиндион) является доступным для приобретения в виде крема для местного применения (FLUOROPLEX (фтороплекс) или EFUDEX (эфудекс, раствора для местного применения (FLUOROPLEX (фтороплекс) или EFUDEX (эфудекс и в виде инъекционного препарата, содержащего 50 мг/мл 5-фторурацила (ADRUCIL (адруцил) или фторурацил). Гемцитабин (2'-дезокси-2',2'-дифторцитидина моногидрохлорид бета)-изомер доступен для приобретения в виде жидкого инъекционного препарата, содержащего между 200 мг и 1 г/флакон (GEMZAR (гемзар. В следующей далее таблице кратко обобщены некоторые из рекомендуемых дозировок для перечисленных выше антиметаболитов. Данное изобретение включает в себя применение ингибитора mTOR плюс антиметаболита, в котором биохимическое модифицирующее средство также является частью химиотерапевтического режима. Термин биохимическое модифицирующее средство является хорошо известным и понимается специалистами в данной области как дополнение к антиметаболической терапии, которое служит для потенцирования противоопухолевой активности, а также в качестве противодействия побочным действиям антиметаболита. Лейковорин и левофолинат обычно используют в качестве биохимических модифицирующих средств при терапии метотрексатом и 5-ФУ. Лейковорин (5-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота) доступен для приобретения в виде инъекционной жидкости, содержащей от 5 до 10 мг/мл или 50-350 мг/флакон (лейковорина кальция, илиWELLCOVORIN, велковорин) и в виде 5-25 мг пероральных таблеток (лейковорин кальция). Левофолинат (фармакологически активный изомер 5-формилтетрагидрофолевой кислоты) доступен для приобретения в виде инъекционного препарата, содержащего 25-75 мг левофолината (ISOVORIN(изоворин или 2,5-7,5 мг таблеток для перорального приема (ISOVORIN (изоворин. Предпочтительные комбинации ингибитора mTOR плюс антиметаболита согласно изобретению включают в себя CCI-779 плюс гемцитабин; CCI-779 плюс 5-фторурацил; и CCI-779 плюс 5-фторурацил плюс лейковорин. Предпочтительно, чтобы комбинация CCI-779 плюс гемцитабин использовалась для лечения рака поджелудочной железы и чтобы комбинация CCI-779 плюс 5-фторурацил (с лейковорином или без него) использовалась для лечения колоректального рака. Противоопухолевая активность комбинации CCI-779 плюс антиметаболит подтверждена in vitro иin vivo стандартными методами фармакологического испытания с использованием комбинаций CCI-779 плюс гемцитабин и CCI-779 плюс 5-фторурацил в качестве типичных примеров комбинаций согласно изобретению. Далее кратко описаны использованные методики и полученные результаты. Линии человеческой рабдомиосаркомы Rh30 и Rh1 и линию человеческой глиобластомы SJ-GBM2 использовали для изучения in vitro комбинаций с CCI-779 и антиметаболическими средствами. В исследованиях in vivo использовали линию человеческой нейробластомы (NB1643) и линию (опухоли) человеческого толстого кишечника GC3. Кривые зависимости доза-ответ строили для каждого из лекарств, представляющих интерес. Линии клеток Rh30, Rh1 и SJ-G2 высевали на планшеты с шестью ячейками, 6103, 5103 и 2,5104 клеток/ячейку, соответственно. После 24-часового периода инкубации добавляли лекарства или 10% ФБР+RPMI 1640 в случае Rh30 и Rh1, или 15% ФБР+ДМЭ в случае SJ-G2. После 7-дневного выдерживания на содержащей лекарство среде выделяли ядра путем обработки клеток гипотоническим раствором с последующей обработкой детергентом. Затем ядра подсчитывали с помощью счетчика Коултера. Результаты экспериментов наносили на график и определяли IC50 (концентрация лекарственного вещества,дающая 50% подавление роста) для каждого лекарства путем экстраполяции. Так как IC50 слегка менялась от эксперимента к эксперименту, при изучении взаимодействия использовали два значения, которые заключены в скобки для IC50 для каждого лекарства. Максимальная степень взаимодействия между двумя лекарствами происходит, когда они присутствуют в соотношении 1:1, если изобола имеет стандартную форму. Поэтому каждую из трех приблизительных концентраций IC50 CCI-779 смешивали в соотношении 1:1 с каждой из трех примерных IC50 гемцитабина или 5-ФУ. Это давало в результате девять комбинаций лекарств 1:1 в каждом эксперименте плюс три концентрации IC50 для CCI-779 и каждого лекарства. Эта методика обычно дает в результате для каждого лекарства по меньшей мере одну комбинацию, содержащую значение IC50. Комбинацию 1:1 концентраций IC50 для CCI-779 и каждого химиотерапевтического лекарственного средства затем использовали для расчета аддитивности, синергизма или антагонизма, используя формулу Беренбаума: х/Х 50+у/Y50'=1, 1, 1. Если три концентрации CCI-779,испытанные отдельно, не давали IC, которая подходила бы под пару любой из трех IC другого соединения, испытанного отдельно, проверяли все комбинации 1:1, чтобы увидеть, попадают ли их IC между соответствующими IC лекарственных средств, испытанных по одному. Если они попадают, эффект считают аддитивным. Результаты, полученные по стандартной методике фармакологического испытания in vitro, показали, что ни в одном случае комбинации не давали менее 50% подавления роста, показывая, что комбинации были, по меньшей мере, аддитивными и не давали данных об антагонизме. Самок мышей CBA/CaJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) 4-недельного возраста лишали иммунной защиты путем тимэктомии с последующим, через 3 недели, облучением всего тела (1200 cGy) при использовании источника 137Cs. Мыши получали 3106 имеющих ядро клеток костного мозга через 6-8 ч облучения. Кусочки опухоли размером примерно 3 мм 3 имплантировали в области дорзальной латеральной части бока мышей, чтобы вызвать рост опухолей. Имеющих опухоли мышей по случайной выборке разделяли на группы по 7 штук перед началом терапии. Каждая мышь, имеющая опухоль, получала лекарство, когда размер опухоли составлял примерно 0,20-1 см по диаметру. Размер опухоли определяли с 7-дневными интервалами, используя цифровой кронциркуль Вернье, связанный с компьютером. Объемы опухолей рассчитывали, принимая, что опухоли являются сферическими, используя формулу[(/6)d3], где d является средним диаметром. CCI-779 давали в режиме 5 последовательных дней на протяжении 2 недель с повторением этого цикла каждые 21 день в течение 3 циклов. Это приводило к тому,что CCI-779 давали в дни 1-5, 8-12 (цикл 1); 21-25, 28-32 (цикл 2); и 42-46, 49-53 (цикл 3). Режим введения другого химиотерапевтического средства для каждого исследования был следующим: гемцитабин в дни 1, 4, 8 только в течение первого цикла. Комбинацию CCI-779 и гемцитабина оценивали по методике испытания на ксенотрансплантатах клеток человеческой толстой кишки (GC3) у мышей. При этой методике испытания CCI-779 давали ежедневно 5 на протяжении 2 последовательных недель каждые 21 день в течение 3 циклов, и гемцитабин давали в дни 1, 4 и 8 только в течение первого цикла. Присутствие CCI-779 не повышало регрессии опухоли, наблюдаемой при первом цикле лечения гемцитабином. Однако в группах, получавших CCI-779,-6 010184 было увеличено время, необходимое для того, чтобы первоначальный объем опухоли до лечения достиг 2-3 (по сравнению с одним гемцитабином), что показывает, по меньшей мере, преимущество аддитивности, получаемое от комбинированного лечения. По результатам этих стандартных методов фармакологического испытания комбинации ингибитораmTOR плюс антиметаболического химиотерапевтического средства пригодны в качестве противоопухолевой терапии. Более конкретно, эти комбинации пригодны для лечения почечной карциномы, саркомы мягких тканей, рака молочных желез, нейроэндокринной опухоли легкого, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, немелкоклеточного рака легких, рака простаты, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, мелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака толстого кишечника, рака пищевода, рака желудка, лейкемии, колоректального рака и первичного рака невыясненной природы. Так как эти комбинации содержат по меньшей мере два активных противоопухолевых вещества, применение таких комбинаций также обеспечивает использование комбинаций каждого из данных лекарственных средств, в которой одно или оба из средств используются в субтерапевтических эффективных дозировках, и, тем самым, уменьшается токсичность, связанная с отдельным терапевтическим средством. При проведении химиотерапии многие средства, имеющие разные механизмы действия, обычно используют в виде части химиотерапевтического коктейля. Ожидается, что комбинации согласно изобретению будут использоваться в виде части химиотерапевтического коктейля, который может содержать одно или более из дополнительных противоопухолевых средств, в зависимости от природы опухоли, которую нужно лечить. Например, данное изобретение охватывает также применение комбинации ингибитора mTOR/антиметаболита, применяемой в сочетании с другими химиотерапевтическими средствами, такими как алкилирующие средства (т.е. цисплатин, карбоплатин, стрептазоин, мелфалан, хлорамбуцил, кармустин, метхлорэтамин, ломустин, бисульфан, тиотепа, ифофамид или циклофосфамид); гормональные средства (т.е. эстрамустин, тамоксифен, торемифен, анастрозол или летрозол); антибиотики (т.е. пликамицин, блеомицин, митоксантрон, идарубицин, дактиномицин, митомицин, доксорубицин или даунорубицин); иммуномодуляторы (т.е. интерфероны, ИЛ-2 или БЦЖ); антимитотические средства(т.е. винбластин, винкристин, тенипозид или винорелбин); ингибиторы топоизомеразы (т.е. топотекан,иринотекан или этопозид) и другие средства (т.е. гидроксимочевина, тразтузумаб, алтретамин, ретуксимаб, паклитаксел, доцетаксел, L-аспарагиназа или гемтузумаб озогамицин). Согласно изобретению комбинированный режим может соответствовать одновременному или чередующемуся приему, причем ингибитор mTOR дают в разное с антиметаболитом время в течение курса химиотерапии. Эта разница во времени может колебаться в пределах нескольких минут, часов, дней, недель или более между введением двух средств. Поэтому термин комбинация не обязательно означает введенные в одно и то же время или в виде объединенной дозы, но означает, что каждый из компонентов вводят во время желаемого периода лечения. Данные средства можно также вводить разными путями. Например, при комбинации ингибитора mTOR плюс антиметаболит предполагается, что ингибиторmTOR будет вводиться перорально или парентерально, причем предпочтительно парентерально, тогда как антиметаболит можно вводить парентерально, перорально или другими приемлемыми способами. Что касается комбинации CCI-779 с гемцитабином, предпочтительно, чтобы гемцитабин вводился парентерально. Что касается комбинации CCI-779 с 5-ФУ и лейковорином, предпочтительно, чтобы 5-ФУ и лейковорин вводились парентерально. Эти комбинации можно вводить ежедневно, 1 раз в неделю или даже 1 раз в месяц. Что типично для режимов химиотерапии, курс химиотерапии может быть повторен через несколько недель и может следовать одним и тем же временным рамкам в отношении введения двух лекарственных средств или может быть изменен на основании реакции пациента. Соответственно, данное изобретение также представляет продукт, состоящий из ингибитора mTOR и антиметаболического противоопухолевого средства в виде комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного применения при лечении опухоли у млекопитающего. Что типично для химиотерапии, режимы дозирования тщательно регулирует лечащий врач на основании многих факторов, включая тяжесть заболевания, реакцию на заболевание, любую связанную с лечением токсичность, возраст, состояние здоровья пациента и другие сопутствующие заболевания или лечение. На основании результатов, полученных с характерными примерами комбинаций CCI-779 плюс антиметаболит, предполагается, что первоначальная дозировка для в/в вливания ингибитора mTOR будет заключена примерно между 0,1 и 100 мг/м 2, причем предпочтительнее примерно между 2,5 и 70 мг/м 2. Также предпочтительно, чтобы ингибитор mTOR вводился в/в, обычно за 30 мин, и вводился примерно 1 раз в неделю. Первоначальные дозы антиметаболического компонента будут зависеть от используемого компонента и будут основываться, в первую очередь, на опыте врача в отношении выбранных лекарственных средств. На основании результатов, полученных с комбинациями CCI-779 плюс антиметаболит, предполагают, что для комбинации ингибитора mTOR плюс гемцитабин первоначальная дозировка ингибитораmTOR для в/в вливания будет заключена примерно между 0,1 и 100 мг/м 2, причем предпочтительнее примерно между 2,5 и 70 мг/м 2, а первоначальная дозировка гемцитабина для в/в вливания будет заключена примерно между 400 и 1500 мг/м 2, причем предпочтительнее примерно между 800 и 1000 мг/м 2.-7 010184 Первоначально планируется, что пациенты будут получать 30-минутное вливание ингибитора mTOR с последующим непосредственно или предшествующим 30-минутным вливанием гемцитабина в дни 1 и 8 из 21-дневного цикла лечения. После одного или более циклов лечения дозировки могут быть повышены или снижены, в зависимости от полученных результатов и наблюдаемых побочных эффектов. На основании полученных результатов, когда CCI-779 используют в комбинации с 5-ФУ и лейковорином, предполагается, что при режиме ингибитор mTOR плюс 5-ФУ плюс лейковорин первоначальная дозировка для в/в вливания ингибитора mTOR будет заключена примерно между 0,1 и 100 мг/м 2,причем предпочтительнее примерно между 2,5 и 70 мг/м 2, первоначальная дозировка для в/в вливания лейковорина будет составлять от 50 до 500 мг/м 2, причем предпочтительнее будет составлять примерно 200 мг/м 2; и первоначальная дозировка 5-ФУ для в/в вливания будет составлять примерно от 500 до 7500 мг/м 2, причем предпочтительнее примерно от 1000 до 5000 мг/м 2. Исходно предполагают введение комбинации в соответствии со следующим режимом: пациенты будут получать 1-часовое в/в вливание лейковорина 1 раз в неделю во время каждого 6-недельного цикла лечения; сразу после введения каждой дозы лейковорина вводят 5-ФУ в виде 24-часового непрерывного в/в вливания. Ингибитор mTOR будет вводиться, начиная с 8 дня цикла 1, и будет даваться 1 раз в неделю в виде 30-минутного в/в вливания. За каждым 6-недельным циклом лечения следует 1 неделя отдыха перед началом следующего 6-недельного цикла лечения. После 1 цикла лечения или более дозировки могут быть повышены или снижены, в зависимости от полученных результатов и наблюдаемых побочных эффектов. Что касается коммерчески доступных антиметаболитов, можно использовать существующую дозированную форму с дозами, разделенными, как необходимо. Альтернативно, такие средства или антиметаболиты, которые недоступны для приобретения, могут быть получены в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Пероральные препараты, содержащие активные соединения согласно изобретению, могут включать в себя любые обычно применяемые пероральные формы, включая таблетки,капсулы, защечные формы, лепешки, пастилки и пероральные жидкости, суспензии или растворы. Капсулы могут содержать смеси активного(ых) соединения(ий) с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы (например, кукурузный, картофельный или крахмал тапиоки), сахара, искусственные подсластители, порошковые целлюлозы, такие как кристаллические или микрокристаллические целлюлозы, муку, желатин, камеди и т.д. Подходящие таблеточные композиции могут быть изготовлены обычным прессованием, методами влажной грануляции или сухой грануляции, и при этом можно использовать фармацевтически приемлемые разбавители, связывающие вещества, смазывающие вещества, дезинтеграторы, поверхностно-модифицирующие вещества (включая поверхностно-активные вещества (ПАВ, суспендирующие вещества или стабилизаторы, включая, но не ограничиваясь этим, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, камедь акации, ксантановую камедь, цитрат натрия, комплексные силикаты, карбонат кальция,глицин, декстрин, сахарозу, сорбит, двузамещенный фосфат кальция, сульфат кальция, лактозу, каолин,маннит, хлорид натрия, тальк, сухие крахмалы и порошковый сахар. Предпочтительные поверхностномодифицирующие вещества включают в себя неионные и анионные поверхностно-модифицирующие вещества. Типичные примеры поверхностно-модифицирующих веществ включают в себя, но не ограничиваются этим, полоксамер 188, бензалкония хлорид, кальция стеарат, цетостеариловый спирт, цетомакрогольный эмульгирующий воск, сложные эфиры сорбита, коллоидную двуокись кремния, фосфаты,додецилсульфат натрия, алюмосиликат магния и триэтаноламин. Среди пероральных препаратов, названных здесь, могут использоваться стандартные формы с замедленным или регулируемым высвобождением для изменения всасывания активного(ых) соединения(ий). Пероральный препарат может также представлять собой введение активного ингредиента в воде или фруктовом соке, содержащем соответствующие солюбилизаторы или эмульгаторы, когда необходимо. В некоторых случаях может быть желательно вводить данные соединения непосредственно в дыхательные пути в виде аэрозоля. Данные соединения можно также вводить парентерально или внутрибрюшинно. Растворы или суспензии данных активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемой соли могут быть приготовлены в воде, соответственно, смешанной с ПАВ, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть изготовлены в глицерине, жидких пропиленгликолях и их смесях в маслах. При обычных условиях хранения и использования эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы легко было вводить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть законсервированной против загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или содержащей дисперсию средой, например водой, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем), их подходящими смесями и растительными маслами.-8 010184 Для целей данного открытия, как понятно, трансдермальные введения включают в себя все варианты введения через поверхность тела и внутреннюю выстилку полостей тела, включая эпителиальные или слизистые ткани. Такие введения могут проводиться с использованием данных соединений или их фармацевтически приемлемых солей в лосьонах, кремах, пенках, пластырях, суспензиях, растворах и суппозиториях (ректальных и вагинальных). Трансдермальное введение может осуществляться посредством использования трансдермального пластыря, содержащего активное соединение и носитель, который является инертным по отношению к активному соединению, является нетоксичным для кожи и дает возможность обеспечения средству системного всасывания в кровоток через кожу. Носитель может иметь ряд форм, таких как кремы и мази,пасты, гели и окклюзивные средства. Кремы и мази могут быть вязкими жидкостями или полутвердыми эмульсиями типа масло-в-воде или вода-в-масле. Также могут быть пригодны пасты, состоящие из абсорбирующих порошков, диспергированных в вазелине или гидрофильном вазелине, содержащем активный ингредиент. Ряд окклюзивных средств может быть использован для высвобождения активного ингредиента в кровоток, такие как полупроницаемая мембрана, закрывающая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без него, или матрица, содержащая активный ингредиент. Другие окклюзивные устройства известны из литературы. Суппозиторные препараты могут быть изготовлены из традиционных материалов, включая масло какао, с добавлением воска для изменения температуры плавления суппозитория и глицерина или без добавления. Также можно использовать водорастворимые основы для суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли с разным молекулярным весом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение рапамицина или его производных и антиметаболического противоопухолевого средства, выбранного из 5-фторурацила и гемцитабина, для получения по меньшей мере одного лекарственного средства для комбинированного лечения опухоли у млекопитающего введением комбинации рапамицина или его производного и антиметаболического противоопухолевого средства, выбранного из 5 фторурацила и гемцитабина. 2. Применение по п.1, где указанная комбинация для лечения дополнительно включает биохимически модифицирующее средство, выбранное из лейковорина и левофолината. 3. Применение по п.1 или 2, где указанное лекарственное средство содержит либо рапамицин или его производное, либо антиметаболит, либо и то, и другое в субтерапевтически эффективных количествах. 4. Применение по любому из пп.1-3, где указанное лекарственное средство содержит рапамицин в субтерапевтически эффективном количестве. 5. Применение по любому из пп.1-4, где указанное лекарственное средство содержит антиметаболит в субтерапевтически эффективном количестве. 6. Применение по любому из пп.1-5, где опухоль выбрана из рака почек; саркомы мягких тканей; рака молочной железы; нейроэндокринной опухоли легкого; рака шейки матки; рака матки; рака головы и шеи; глиомы; немелкоклеточного рака легкого; рака простаты; рака поджелудочной железы; меланомы; мелкоклеточного рака легкого; рака яичников; рака толстого кишечника; рака пищевода; рака желудка; колоректального рака или первичного рака невыясненной природы. 7. Применение по любому из пп.1-6, где антиметаболит является гемцитабином. 8. Применение по любому из пп.1-7, где опухоль представляет собой рак поджелудочной железы. 9. Применение по любому из пп.1-8, где антиметаболитом является 5-фторурацил. 10. Применение по любому из пп.1-6, где рапамицин, 5-фторурацил и лейковорин вводят в комбинации. 11. Применение по п.9 или 10, где опухоль представляет собой колоректальный рак. 12. Применение по любому из пп.1-11, где указанное лекарственное средство содержит рапамицин. 13. Применение по любому из пп.1-11, где производным рапамицина является 42-О-(2 гидрокси)этилрапамицин. 14. Применение по любому из пп.1-11, где производным рапамицина является 42-сложный эфир рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой.