Применение доцетаксела для лечения печеночно-клеточного рака

1 Настоящее изобретение относится к лечению печеночно-клеточного рака. Печеночно-клеточный рак (или злокачественная гепатома) (НСС) является одним из наиболее распространенных видов рака в странах юго-восточной Азии и Африки. На Тайване НСС является главной причиной смерти пациентов мужского пола, имеющих злокачественные опухоли. Выживаемость пациентов с НСС очень мала. Это является, главным образом,следствием отсутствия эффективных способов лечения. Облучение и химиотерапия до настоящего времени не дают удовлетворительных результатов; оперативное или хирургическое вмешательство является наиболее эффективным лечением НСС. Однако хирургическое вмешательство подходит только пациентам с малыми операбельными опухолями. В последнее время возобновился интерес к антимитотическим лекарственным средствам,таким как паклитаксел. Паклитаксел впервые был выделен из коры тиса. Противоопухолевое действие паклитаксела известно с 1971 г. Паклитаксел ингибирует деление опухолевых клеток, оказывая действие на сборку микротрубочек. Анализ in vitro с использованием опухолевых клеток показал, что паклитаксел подавляет клетки, главным образом, в фазе G2/M клеточного цикла (Schiff PB and Horwitz SB, Proc. Natl.Acad. Sci. 77, 1561 - 1565, 1980). Недавние исследования показали, что паклитаксел эффективен в отношении клеток различных злокачественных опухолей, таких как опухоль головного мозга, рак желудка и предстательной железы,рак молочной железы, меланома и рак яичников. Однако, паклитаксел неэффективен в отношении печеночно-клеточного рака. В BritishJournal of Cancer, 78 (1), 34-39, 1998, сообщается о II фазе клинических испытаний паклитаксела на пациентах с НСС. В этой статье сделан вывод о том, что паклитаксел не оказывает противоопухолевого действия у пациентов с HCC. Как объяснялось выше, обнаружено было,что цитотоксический эффект паклитаксела зависит от клеточного цикла; причем, он подавляет клеточный цикл, главным образом, на фазеG2/M. Однако в настоящее время установлено,что доцетаксел может достигать цитотоксического эффекта в отношении клеток НСС, независимо от клеточного цикла. Это указывает на то, что цитотоксический эффект доцетаксела в отношении клеток НСС достигается с помощью механизма, отличного от механизма действия паклитаксела. Кроме того, активность доцетаксела в отношении клеток НСС in vitro значительно выше активности паклитаксела в концентрациях до 1 мкМ. Учитывая высоко цитотоксическую природу таксоидов, повышенная активность при низкой концентрации наводит на мысль о том, что доцетаксел, в отличие от паклитаксела, найдет практическое применение 2 в клинической практике для лечения печеночноклеточного рака. Соответственно, настоящее изобретение предлагает применение доцетаксела или его гидрата в производстве лекарственных средств для использования при лечении печеночноклеточного рака. Настоящее изобретение предоставляет также способ лечения пациентов, страдающих печеночно-клеточным раком, который включает введение пациенту эффективного количества доцетаксела или его гидрата. Настоящее изобретение предоставляет также способ улучшения состояния пациента, страдающего печеночноклеточным раком, который включает введение указанному пациенту эффективного количества доцетаксела или его гидрата. Доцетаксел представляет известное соединение. Его формула Способы получения доцетаксела описаны в ЕР-А-253738 и ЕР-А-336841. Доцетаксел можно применять, например, в безводной форме или в форме гидрата. В настоящем документе ссылки на доцетаксел включают ссылки на его гидраты. Гидраты доцетаксела можно получать растворением безводного доцетаксела в органическом растворителе, таком как ацетон, этанол,ацетонитрил или N,N-диметилформамид, и перекристаллизацией гидрата доцетаксела добавлением полученного таким способом раствора к воде. Гидрат доцетаксела обычно представляет собой дигидрат, тригидрат или тетрагидрат. В частности, было найдено, что тригидрат является особенно стабильным, и тригидрат доцетаксела, соответственно, является предпочтительным. Тригидрат доцетаксела можно получить с помощью способов, описанных в ЕР-А-770070. Доцетаксел оказался неожиданно активным в отношении печеночно-клеточных раков. В частности, его можно использовать для лечения печеночно-клеточных раков, фиброламеллярных вариантов и смешанных печеночноклеточных холангиокарцином. Согласно настоящему изобретению доцетаксел можно вводить любым обычным путем,известным для введения доцетаксела. Так, его можно, например, вводить парентерально. Обычно его вводят внутривенно, предпочтительно внутривенной инфузией. В настоящем изобретении доцетаксел обычно изготавливают в виде готовой формы фармацевтически приемлемой композиции, содержащей доцетаксел и фармацевтически при 3 емлемый носитель или разбавитель. Подходящие носители и разбавители включают нетоксичные растворители и суспензионные среды,например стерильные водные среды. Предпочтительно композициям придают форму водных растворов или суспензий, например растворов,подходящих для инъекции или инфузии, которые могут содержать эмульгирующие агенты,красящие агенты, консерванты или стабилизаторы. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, включают стерильные водные или неводные растворы или суспензии. Подходящие стерильные неводные растворы и суспензии включают растворы и суспензии в природных растительных маслах,таких как оливковое масло, кунжутное масло или жидкая нефть, или в инъецируемых органических сложных эфирах, таких как этилолеат. Подходящие стерильные водные растворы включают растворы доцетаксела в воде. Обычно рН стерильных водных растворов, подходящих для парентерального введения, устанавливают соответствующим образом. Далее, таким стерильным водным растворам обычно придают изотоничность, например, с помощью достаточного количества хлорида натрия или глюкозы. Особенно предпочтительно, чтобы растворы,подходящие для введения путем инфузии, имели величину рН, сходную с рН крови, и были изотоническими. Стерилизацию можно осуществлять нагреванием или любыми другими средствами, которые не оказывают неблагоприятного действия на композицию. Фармацевтические композиции, содержащие доцетаксел, подходящие для применения по настоящему изобретению, могут дополнительно включать поверхностно-активный агент. Предпочтительными поверхностно-активными агентами являются полисорбаты, полиоксиэтиленгликолевые сложные эфиры и сложные простые эфиры полиэтиленгликоля и касторовых масел. Примеры подходящих поверхностно-активных агентов и фармацевтических композиций, содержащих поверхностно-активные агенты, можно найти в AU-A-666859. Доцетаксел можно также изготавливать для применения по настоящему изобретению в виде лиофилизованной композиции. Такие лиофилизованные композиции имеют хорошую физическую и химическую стабильность и могут, следовательно, храниться в течение длительных периодов времени. Лиофилизованные композиции, содержащие доцетаксел, можно получать лиофилизацией водного раствора доцетаксела с помощью обычных приемов. Они могут дополнительно включать агенты, придающие массу, такие как лактоза. Они могут также включать агенты, корригирующие тоничность, такие как сахара и полимеры. Примеры подходящих агентов, корригирующих тонич 004804 4 ность, включают глюкозу, декстрозу и маннит, а также полимеры, например поливинилпирролидон. Лиофилизованную композицию можно повторно растворять перед употреблением в любой совместимой и фармацевтически приемлемой инъецируемой среде. Лиофилизат можно преимущественно брать в дважды дистиллированную воду для инъекций в объеме, эквивалентном первоначальному объему лиофилизуемого раствора. Фармацевтическая композиция, содержащая доцетаксел, подходящая для применения по настоящему изобретению, обычно содержит по меньшей мере 0,01 мас.% терапевтически активного продукта. Обычно фармацевтическая композиция содержит от 0,01 до 1000 мг, предпочтительно от 0,1 до 500 мг терапевтически активного продукта. Предпочтительно раствор, подходящий для внутривенной инъекции, содержит от 38 до 42, более предпочтительно около 40 мг/мл активного продукта. Обычно такие растворы помещают во флаконы с содержанием 20 или 80 мг активного продукта. Предпочтительно раствор, подходящий для инфузии, содержит от 0,1 до 11, предпочтительно от 0,1 до 10, более предпочтительно от 0,3 до 0,9 мг/мл активного продукта. Лечение доцетакселом согласно настоящему изобретению можно осуществлять одновременно с другими видами лечения, включая лечение другими антинеопластическими лекарственными средствами, моноклональными антителами, иммунной терапией или облучением или модификаторами биологического ответа. Подходящие модификаторы биологического ответа включают лимфокины и цитокины, такие как интерлейкины, интерфероны (,или ) иTNF (факторы некроза опухолей). Другие химиотерапевтические агенты, которые полезны для лечения заболеваний, являющихся следствием патологической пролиферации клеток,включают алкилирующие агенты, например,азотистые горчичные соединения, такие как мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан и хлорамбуцил, алкилсульфонаты, такие как бусульфан, нитрозомочевины, такие как кармустин,ломустин, семустин и стрептозоцин, триазены,такие как дакарбазин, антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты, например, метотрексат, аналоги пиримидина, такие как фторурацил и цитарабин, аналоги пурина, такие как меркаптопурин и тиогуанин, природные продукты, например, алкалоиды vinca, такие как винбластин, винкристин и виндезин, эпиподофиллотоксины, такие как этопозид и тенипозид,антибиотики, такие как дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, блеомицин, пликамицин и митомицин, ферменты, такие как Lаспарагиназа, различные агенты, такие как координационные комплексы платины, например, 5 цисплатин, замещенные мочевины, такие как гидроксимочевина, производные метилгидразина, такие как прокарбазин, адренокортикальные супрессанты, такие как митотан и аминоглютетимид, гормоны и антагонисты, такие как адренокортикостероиды, такие как преднизон, прогестины, такие как капроат гидроксипрогестерона, ацетат метоксипрогестерона и ацетат мегестрола, эстрогены, такие как диэтилстильбэстрол и этинилэстрадиол, антиэстрогены, такие как тамоксифен, и андрогены, такие как пропионат тестерона и флюоксиместерон. Одновременное лечение циклофосфамидом, 5-фторурацилом, этопозидом, винорелбином или метотрексатом является предпочтительным, поскольку между этими соединениями и доцетакселом может достигаться синергизм. Кроме того, 2-метоксиэстрадиол является активным в отношении печеночно-клеточных раков, и, было найдено, что он хорошо переносится мышами при ежедневном введении в течение 1 месяца (Klauber et al., Cancer Research, 57, 8186,1997). Одновременное лечение 2 метоксиэстрадиолом поэтому также является предпочтительным, особенно, когда требуется постоянное лечение. В настоящем изобретении доцетаксел вводят при дозировке, которая обеспечивает лечение печеночно-клеточного рака. Дозировка варьирует в зависимости от пути введения и физических характеристик пациента. Подходящие дозы включают дозы, которые являются терапевтически эффективными для лечения заболеваний, являющихся следствием аномальной пролиферации клеток. Доцетаксел можно вводить с частотой, необходимой для получения желаемого терапевтического эффекта. Обычная доза доцетаксела для лечения людей составляет от 50 до 150, предпочтительно 60-100, более предпочтительно около 100 мг доцетаксела/м 2 поверхности кожи пациента. Когда доцетаксел вводят с помощью инфузии,скорость инфузии обычно составляет от 1 до 200, предпочтительно около 100 мг/м 2 доцетаксела в час. Указанную выше дозу можно при необходимости повторять. Обычно ее повторяют ежедневно или еженедельно. Предпочтительно ее повторяют каждые 3 недели. Например, доцетаксел можно вводить в дозе около 100 мг/м 2 в виде внутривенной инфузии на протяжении 1 ч каждые 3 недели. Следующий пример иллюстрирует настоящее изобретение. Пример Материалы и методы Если не указано иное, используемые методы являются стандартными биохимическими приемами. Используемые клеточные линии все имеются в продаже. 6 Культура клеток. В экспериментах, подробно описанных ниже, используются клеточные линии гепатомы человека Нер 3 В (номер в АТСС НВ 8064),HepG2 (номер в АТСС НВ 8065) и HA22T/VGH и клеточная линия гепатомы мышей Нера 1-6. Данные клетки культивировали в DMEM(GIBCO, BRL), содержащей 10% плодной бычьей сыворотки (Hyclone), 0,01 мг/мл гентамицина и 0,1 мМ аминокислоты, не являющейся незаменимой. Клетки выращивали в инкубаторе в атмосфере СO2 5% при 37 С и 95% фильтрованном воздухе. Обработка лекарственным средством. В экспериментах, подробно описанных ниже, указанные выше клетки гепатомы обрабатывали различными концентрациями паклитаксела (0,001-10 мкМ) и доцетаксела (0,001-10 мкМ) в течение 24 и 72 ч. Паклитаксел растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO), а доцетаксел растворяли в этаноле в качестве основных растворов. Конечная концентрация носителя составляла менее 0,1%. Изучение жизнеспособности клеток: исследование МТТ. Клетки культивировали в 96-луночном планшете для культивирования клеток(COSTAR) при плотности 4 х 104 клеток/мл. После обработки лекарственным средством в течение 24 или 72 ч среду отбрасывали и заменяли равным объемом (100 мкл) свежей среды,содержащей МТТ (0,456 мг/мл; бромид 3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия) и инкубировали в течение 1,5 ч при 37 С. Свежую среду затем удаляли и добавляли 100 мклDMSO. Жизнеспособность клеток определяли колориметрическим сравнением путем считывания величин ОП с ридера-микропланшет(SPECTRA MAX 250) с длиной волны поглощения 570 нм. Результаты представлены на фиг. 1, на которой закрашенные кружки представляют данные после обработки в течение 24 ч, а незакрашенные кружки представляют данные после обработки в течение 72 ч. Данные представляют среднюю величинустандартная ошибка средней величины от двух повторностей трех независимых экспериментов. Анализ вытеснения йодида пропидия (PI). Клетки выращивали в колбах 5 см 2(CORNING) и обрабатывали паклитакселом и доцетакселом, как описано выше. Затем добавляли йодид пропидия (10 мкг/мл) и инкубировали в течение 15 мин при 37 С. Затем перед сбором прилипших клеток среду собирали. Собирали как суспендированные, так и прилипшие клетки и ресуспендировали их в 500 мкл PBS для анализа проточной цитометрии, как описано ниже. Сигналы дебриса удаляли отсечением сигналов FSC-SSC. 7 Анализ содержания ДНК с помощью проточной цитометрии. Лизирующий буфер (0,5% Triton X-100, 0,2 мкг/мл Na2EDTA2H2O и 1% альбумин бычьей сыворотки в PBS) добавляли к клеточным осадкам, которые затем оставляли на льду на 15 мин. Затем к смеси добавляли 100% метанол, предварительно охлажденный до -20 С, после чего центрифугировали при 300 хg в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а клеточный осадок промывали PBS. Промытый осадок окрашивали раствором для окрашивания ДНК (50 мкг/мл йодида пропидия и 5 килоединиц/мл РНКазы А) в течение 30 мин при 4 С в темноте. Содержание ДНК каждой клетки измеряли с использованием проточного цитометра BectonDickinson FACSCalibur, как описано ниже. Проточная цитометрия. Клетки (10000) анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur, с использованием аргон-ионного лазера (15 мВт) с падающим лучом при 488 нм. Для анализа вытеснения PI красную флуоресценцию собирали через фильтр 585 нм и сигналы дебриса удаляли отсечением сигналов FSC-SSC. Данные собирали и анализировали с использованием программы FACS/CELLQuest на компьютереPower Macintosh 7600/120. Апоптотические клетки и клетки на конкретных фазах клеточного цикла определяли с помощью программыModFit LT. Результаты проточной цитометрии представлены в табл. 1 и 2 и на фиг. 2. Табл. 1 дает величины проницаемости клеточной мембраны клеток гепатомы после обработки паклитакселом и доцетакселом. Табл. 2 подробно дает процентное содержание апоптотических клеток(суб-G0/G1), обнаруженных после обработки паклитакселом и доцетакселом. Фиг. 2 показывает гистографический анализ ДНК, детализирующий влияние паклитаксела и доцетаксела на прогресс клеточного цикла. Таблица 1 Проницаемость клеточной мембраны клеток гепатомы после обработки паклитакселом и доцетакселом Данные представляют среднюю величинустандартная ошибка средней величины от двух повторностей по меньшей мере трех независимых экспериментов. Клетки обрабатывали 8 лекарственными средствами в течение 24-72 ч, а проницаемость мембран измеряли с помощью проточноцитометрического анализа вытеснения пропидия в жизнеспособных гепатомных клетках. Данные представляют процентное содержание клеток с интактной клеточной мембраной по сравнению с контролем. Таблица 2 Апоптоз, индуцированный паклитакселом и доцетакселом Числа представляют % апоптотических клеток (суб-G0/G1) по результатам определения с помощью проточной цитометрии. Оценка фрагментации ДНК с помощью электрофореза. Оценку фрагментации ДНК осуществляли по методу Hermann et al., Nucleic Acids Res., 22,5506-5507, 1994. Вкратце, на клетки НЕР G2 (2 х 107) обрабатывали в течение 72 ч паклитакселом и доцетакселом, как описано выше, и центрифугировали. Полученные таким способом клеточные осадки ресуспендировали в буфере для лизисаNP-40 (1% NP-40 в 20 мМ EDTA, 50 мМ ТрисHCl, рН 7,5). После лизиса клеток в течение нескольких секунд собирали надосадочные жидкости (5 минут при 1600 хg). Экстракцию повторяли с тем же самым буфером для лизиса. К надосадочным жидкостям добавляли SDS (конечная концентрация 1%) и РНКазу (конечная концентрация 2,5 мкг/мкл) и инкубировали в течение 2 ч при 56 С, после чего расщепляли протеиназой K (2,5 мкг/мкл) в течение 2 ч при 37 С. Затем смеси добавляли к 10 М ацетату аммония перед 100% осаждением этанолом в течение 30 мин при -20 С. ДНК собирали центрифугированием (10 мин при 12000 хg) с последующим электрофорезом на 1,5% агарозном геле. Результаты представлены на фиг. 3. На фиг. 3 М означает маркер 100 пар оснований. Полоса 1 показывает контроль среды. Полосы 2 и 3 показывают средние группы обработки паклитакселом (0,1 и 1 мкМ). Полосы 4 и 5 показывают средние группы обработки доцетакселом 9 Результаты Изучение жизнеспособности клеток. Фиг. 1 показывает дозозависимое влияние паклитаксела и доцетаксела на жизнеспособность клеток клеточных линий гепатомы (НерG2, Нер 3 В, HA22T/VGH и Нера 1-6) . Как видно из фиг. 1, почти в каждом случае доцетаксел достигал пониженной жизнеспособности при 0,01 и 0,1 мкМ. В случае клеток Нер G2 после обработки паклитакселом или доцетакселом жизнеспособность клеток показала тенденцию к снижению. Жизнеспособность клеток Нер G2 составляла 61,81 и 39,45% от контроля для групп паклитаксела (10 мкМ) через 24 и 72 ч соответственно. В случае клеток Нер G2, обработанных доцетакселом, максимальное снижение жизнеспособности наблюдалось при 1 мкМ доцетаксела, а при 10 мкМ доцетаксела никакого дальнейшего снижения жизнеспособности не наблюдалось. Жизнеспособность составляла 65,03 и 48,99% для клеток, обработанных 1 мкМ доцетакселом в течение 24 и 72 ч соответственно. Заслуживает внимание тот факт, что в случае клеток Нер 3 В значительное снижение жизнеспособности (37,06%) наблюдалось после обработки 0,01 мкМ доцетакселом в течение 72 ч. В случае клеток Нера 1-6, обработанных доцетакселом, максимальная цитотоксичность(65,34 и 30,71%) наблюдалась в группах, обработанных 1 мкМ доцетакселом в течение 24 и 72 ч соответственно. Анализ вытеснения йодида пропидия (PI). Табл. 1 показывает, что проницаемость мембраны клеток Нер G2 и Нер 3 В после обработки паклитакселом и доцетакселом зависела от дозы и времени. В случае клеток HA22T/VGH после обработки паклитакселом (0,01-1 мкМ) в течение 72 ч по сравнению с группами доцетаксела наблюдалось меньшее увеличение проницаемости мембран. Примечательно, что после обработки 0,01 мкМ доцетакселом в течение 72 ч только 55,44% клеток имели интактные мембраны, тогда как после той же дозы паклитаксела интактные мембраны имели 92,58% обработанных клеток. Анализ клеточного цикла. Фиг. 2 показывает, что обработка клеток Нер G2 в течение 24 ч 1 мкМ паклитакселом приводит к явному подавлению на фазе G2/M. Сходные ДНК гистограммы наблюдались через 72 ч после воздействия. Как показано в табл. 2, апоптотические клетки (суб-G0/G1) были обнаружены после обработки 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мкМ доцетакселом в течение 24 ч с процентными степенями апоптоза 31,02, 45,24, 38,77 и 28,33% соответственно. Через 72 ч после обработки доцетакселом 10 составлял 21,92, 42,45, 42,44 и 56,66% соответственно. В случае клеток Нер 3 В, обработка 0,1 или 1 мкМ паклитакселом в течение 24 ч приводила к подавлению на фазе G2/M, а инкубация с 0,1 или 1 мкМ паклитакселом в течение 72 ч приводила к увеличению процентных количеств субG0/G1 до 38,37 или 47,01% соответственно. Напротив, клетки Нер 3 В, обработанные 0,01, 0,1 или 1 мкМ доцетакселом в течение 24 или 72 ч,имели более высокий процент популяций субG0/G1 59,14, 58,69 и 65,74% в случае 24 часового воздействия и 64,12, 81,66 и 79,33% в случае 72-часового воздействия. В случае клеток HA22T/VGH возрастающие концентрации паклитаксела (от 0,001 до 1 мкМ) коррелировали с увеличением процента клеток G2/M при 24-часовой обработке. В группах с обработкой 0,1 или 1 мкМ паклитакселом в течение 72 ч никакой значительной популяции суб-G0/G1 не наблюдалось. Напротив, достоверно установлено, что клетки HA22T/VGH,обработанные 0,01 мкМ доцетакселом в течение 24 ч, имели более высокое процентное содержание суб-G0/G1 (41,75%), чем при обработке 0,1 мкМ (18,61%) или 1 мкМ (22,94%) доцетакселом. Когда клетки обрабатывали доцетакселом в течение 72 ч, были обнаружены значительные процентные доли суб-G0/G1 в клеткахHA22T/VGH, обработанных 0,01 мкМ (56,64%),0,1 мкМ (58,61%) и 1 мкМ (60,98%) доцетакселом. В случае клеток Нера 1-6 обработка паклитакселом (0,01, 0,1 или 1 мкМ) в течение 24 ч приводила к повышенному образованию популяций суб-G0/G1 (24,02, 55,64 или 64,38% соответственно), а подавление на фазе G2/M наблюдалась в группах с обработкой 0,1 и 1 мкМ паклитакселом. Когда клетки Нера 1-6 обрабатывали 0,1 и 1 мкМ паклитакселом в течение 72 ч,большинство клеток погибало, и никакого явного профиля клеточного цикла не наблюдалось. Обработка доцетакселом (0,01, 0,1 и 1 мкМ) клеток Нера 1-6 приводила к образованию клеток суб-G0/G1 (52,81, 50,76 и 53,8% в случае 24 часового воздействия и 31,25, 53,95 и 62,49% в случае 72-часового воздействия соответственно). Анализ фрагментации ДНК. Фиг. 3 показывает, что обработка паклитакселом (0,1 и 1 мкМ) и доцетакселом (0,1 и 1 мкМ) индуцировала фрагментацию ДНК в клетках Нер G2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение доцетаксела или его гидрата в качестве активного ингредиента для производства лекарственного средства для лечения печеночно-клеточного рака. 2. Применение по п.1, где гидратом является тригидрат. 3. Применение по п.1 или 2, где лекарственное средство предназначено для парентерального введения. 4. Применение по п.3, где лекарственное средство предназначено для интраперитонеального, подкожного, внутривенного, внутримы 12 шечного или интрастернального введения и содержит от 38 до 42 мг/мл активного соединения. 5. Применение по п.3, где лекарственное средство предназначено для введения путем инфузии и содержит от 0,1 до 11 мг/мл активного соединения.