Способы защиты от радиационного поражения с применением α-тимозина

008059 Предпосылки создания изобретения Перекрестная ссылка на родственную заявку В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки US с регистрационным номером 60/428746, зарегистрированной 25 ноября 2002 г. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области защиты субъекта, такого как млекопитающее, и/или его клеток от радиационного поражения или к лечению поражения, вызванного радиацией. Описание уровня техники Люди и их клетки могут подвергаться воздействию радиации в ходе терапии рака и непреднамеренному или намеренному воздействию радиации, такому как при ядерных авариях, во время войны или террористической ядерной атаке. Существуют различные препараты, известные специалистам в этой области, и было сделано много попыток лечить поражение, вызванное воздействием радиации. В этой области техники сохраняется необходимость в создании улучшенных способов и композиций для лечения или предупреждения поражения, вызванного воздействием радиации. Сущность изобретения Согласно настоящему изобретению способ защиты субъекта и/или клеток субъекта от радиационного поражения включает введение нуждающемуся в такой терапии субъекту защищающее от облучения и/или лечащее облучение количество -тимозинового пептида. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что -тимозиновые пептиды защищают субъекта и/или клетки субъекта от радиационного поражения. Изобретение применимо к условиям, при которых субъект или клетки подвергаются воздействию радиации, и субъекта обрабатывают перед воздействием таким, как в ходе терапии рака. Изобретение также может быть применимо в условиях, при которых субъект подвергается воздействию радиации и получает лечение после воздействия (такого, как при ядерных авариях, во время войны или террористической ядерной атаки). Изобретение применимо для защиты или лечения поражения, вызванного как ионизирующим, так и неионизирующим излучением. Тимозины представляют собой класс полипептидных модификаторов иммунитета, вырабатываемых вилочковой железой - тимусом. Было показано, что тимозины запускают события созревания в лимфоцитах, усиливают функцию Т-клеток и способствуют восстановлению иммунных дефектов. Тимозин 1(иногда упоминаемый как ТА 1) представляет собой 28-аминокислотный пептид тимуса с молекулярной массой 3100, обладающий иммуномодулирующими свойствами, гомологичный природному продукту,изначально выделенному из тимозиновой фракции 5 тимуса теленка. Его биологические воздействия включают усиление функций Т-лимфоцитов и включают модуляцию интерлейкина-2 (IL-2), стимуляцию продукции интерферона, индукцию Т-лимфоцитов и активность NK-клеток и стимуляцию тимопоэза. Было показано, что тимозин 1 положительно регулирует экспрессию класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС). В соответствии с одним вариантом воплощения в изобретении представлен способ лечения для защиты клеток или субъекта от радиационного поражения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, композиции, содержащей защищающее от радиации количество -тимозинового пептида.-Тимозиновые пептиды охватывают пептиды тимозина 1 (TA1), включающие природный ТА 1, а также синтетический ТА 1 и рекомбинантный ТА 1, имеющий аминокислотную последовательность природного ТА 1, аминокислотные последовательности, в основном, подобные ему, или сокращенную форму его последовательности и их биологически активные аналоги, имеющие замещенные последовательности, с делециями, удлиненные, с заменой или иначе модифицированные последовательности, которые обладают биологической активностью, в основном, подобной активности ТА 1, например, производный от ТА 1 пептид, имеющий достаточную аминокислотную гомологию с ТА 1, так что он функционирует, в основном, таким же путем и, в основном, с той же активностью, что и ТА 1. Предпочтительным тимозиновым пептидом является тимозин 1. Введение может проводиться любым подходящим способом, включая инъекцию, периодическую инфузию, непрерывную инфузию и тому подобное. По причине того, что время полувыведения из плазмы подкожно инъецированного ТА 1 составляет только примерно 2 ч, в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения -тимозиновый пептид, такой как ТА 1, вводится пациенту таким образом, чтобы поддерживать, в основном, непрерывно эффективное количество -тимозинового пептида в системе кровообращения пациента в течение существенно более длительного периода лечения. Хотя намного более длительные периоды лечения и рассматриваются в соответствии с настоящим изобретением, варианты воплощения изобретения включают,в основном, непрерывное поддержание эффективного количества -тимозинового пептида в системе кровообращения пациента в течение периодов лечения по крайней мере около 6, 10, 12 ч или дольше. В других вариантах воплощения изобретения периоды лечения продолжаются, по меньшей мере, в течение примерно суток и даже в течение многих суток, например недели или дольше. Однако предполагается,что периоды лечения, определенные выше, в течение которых эффективные количества -тимозинового-1 008059 пептида, в основном, непрерывно поддерживаются в системе кровообращения пациента, могут быть отделены периодами без лечения подобной или различной длительности. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения -тимозиновый пептид непрерывно вливают пациенту, например, путем внутривенной инфузии, в течение такого периода лечения, чтобы, в основном, непрерывно поддерживать эффективное количество -тимозинового пептида в системе кровообращения пациента. Инфузия может быть осуществлена любым подходящим способом, таким как с помощью мининасоса. Альтернативно инъекционный режим введения -тимозинового пептида может быть установлен таким образом, чтобы, в основном, непрерывно поддерживать эффективное количество -тимозинового пептида в системе кровообращения пациента. Соответствующие инъекционные режимы могут включать инъекцию каждые 1, 2, 4, 6 ч и т.д., чтобы, в основном, постоянно поддерживать эффективное количество -тимозинового пептида в системе кровообращения пациента в течение периода лечения. Хотя и подразумевается, что в ходе непрерывной инфузии -тимозинового пептида введение будет существенно более длительным, в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения непрерывная инфузия -тимозинового пептида осуществляется в течение периода по меньшей мере около 1 ч. Более предпочтительно непрерывная инфузия осуществляется в течение более длительных периодов, таких как периоды в течение по меньшей мере примерно 6, 8, 10, 12 ч или дольше. В других вариантах воплощения изобретения непрерывная инфузия осуществляется в течение по меньшей мере примерно одних суток и даже в течение многих суток, как, например, в течение 1 недели или больше. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения -тимозиновый пептид находится в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекции, солевой раствор в физиологических концентрациях или подобное. Настоящее изобретение включает также введение физиологически активного конъюгата, содержащего -тимозиновый пептид, соединенный с веществом, которое увеличивает время полувыведения тимозинового пептида в сыворотке пациента, когда упомянутый конъюгат вводят пациенту. Вещество может представлять собой, в основном, неантигенный полимер. Подходящие полимеры могут иметь молекулярную массу в диапазоне примерно 200-300000, предпочтительно в диапазоне примерно 1000100000, более предпочтительно в диапазоне примерно 5000-35000 и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 10000-30000, при этом молекулярная масса примерно 20000 является особенно предпочтительной. Включенные полимерные вещества предпочтительно являются также растворимыми в воде при комнатной температуре. Не ограничивающий изобретение перечень таких полимеров включает в себя гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль (PEG) или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры при условии, что растворимость в воде блок-сополимеров сохраняется. Среди, по существу, неантигенных полимеров рассматриваются моноактивированные полиалкиленоксиды с концевым алкилом (PAO's), такие как полиэтиленгликоли с концевым монометилом (mPEG's). Кроме mPEG, могут также быть полезными полимеры с концевым (С 1-С 4)алкилом. В качестве альтернативы полимерам РАО могут применяться фактически неантигенные вещества,такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, углеводные полимеры и тому подобное. Специалисты обычной квалификации в этой области поймут, что предшествующий перечень является просто иллюстративным и что рассматриваются все полимерные материалы,имеющие свойства, описанные в данном контексте. Для целей настоящего изобретения термин фактически неантигенные означает все вещества, понимаемые в данной области, как являющиеся нетоксичными и не вызывающими заметную иммуногенную реакцию у млекопитающих. Полимер может быть линейным или разветвленным. Полиэтиленгликоль (PEG) является особенно предпочтительным полимером. Полимер может быть конъюгирован с -тимозиновым пептидом любым подходящим способом. Иллюстративные способы конъюгации полимеров с пептидами раскрыты в патентах US 4179337,4766106, 4917888, 5122614 и 6177074, а также в публикации международной заявки РСТ WO 95/13090,которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Тимозин 1 имеет пять отдельных сайтов, возможных для конъюгации аминогруппы с полимером,и полимер(ы) может быть конъюгирован с одним или множеством сайтов. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения PEG с молекулярной массой 40000 конъюгируют с N-концом -тимозинового пептида, такого как тимозин 1 (TA1). Это может быть осуществлено с помощью твердофазного пептидного синтеза или гранул на нерастворимой полимерной основе, как известно в данной области, с соответствующими защитными группами боковых цепей. После завершения синтеза -тимозинового пептида на гранулах защищенный пептид отщепляют от гранул, оставляя N-конец со свободной аминогруппой, которая реагирует с полиэтиленгликолем молекулярной массы 40000. Затем защитные группы боковых цепей удаляют с образованием конъюгата в соответствии с данным вариантом воплощения изобретения.-2 008059 Выделение, характеристика и применение -тимозинового пептида - тимозина 1 (ТА 1) описано,например, в патенте US 4079127, патенте US 4353821, патенте US 4148788 и патенте US 4116951. Подходящие дозы -тимозиновых пептидов могут быть введены в таких больших дозах, как 16 мг/кг массы тела или больше. Предпочтительные дозы -тимозинового пептида находятся в диапазоне от примерно 0,001 мг/кг массы тела в день до примерно 10 мг/кг массы тела в день, при иллюстративной дозе, составляющей примерно 0,02 мг/кг массы тела в день. В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения защищающие от радиации эффективные количества составляют дозы, которые включают -тимозиновый пептид в количестве в диапазоне примерно 0,1-10 мг, предпочтительно примерно 1-5 мг. Дальнейшие иллюстративные дозы включают тимозиновый пептид в количестве примерно 1,6 и 3,2 мг. Приведенные выше дозы отражают только наличие -тимозинового пептида в композиции, а не массу конъюгированного с ним полимера. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения -тимозиновый пептид присутствует в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекции. Однако фармацевтические стандартные лекарственные формы, содержащие -тимозиновый пептид, могут быть разработаны любым подходящим способом для введения любым подходящим путем. При введении субъекту перед воздействием радиации -тимозиновый пептид предпочтительно вводят субъекту, по меньшей мере, приблизительно за 3 ч до облучения. В некоторых вариантах воплощения изобретения -тимозиновый пептид вводят субъекту множество раз перед облучением, например,2, 3, 4 или большее число раз перед облучением. При введении субъекту после облучения -тимозиновый пептид предпочтительно вводят как можно скорее после радиации и предпочтительно вводят множество раз после облучения. Например, тимозиновый пептид может быть введен незамедлительно после облучения и каждые 2, 3, 4, 5 или 6 ч,трижды в день, дважды в день, ежедневно, 3 раза в неделю, дважды в неделю, 1 раз в неделю и т.д. Введение может проводиться с помощью инъекции, инфузии или другим способом. В соответствии с данным вариантом воплощения изобретение представляет собой способ лечения,при котором -тимозиновый пептид вводят данному субъекту, чтобы вызвать заживление радиационного поражения клеток субъекта. Субъект, который должен подвергаться лечению, может быть любым млекопитающим субъектом,на которого воздействовала или должна воздействовать радиация, таким, как люди или пациенты. Изобретение далее проиллюстрировано на следующем примере, который, как подразумевается, не является ограничивающим объем притязаний изобретения. Пример 1. Радиационное воздействие может поражать или убивать клетки. В связи с этим стволовые и клоногенные клетки тонкой кишки были подвергнуты воздействию радиации, обработке и контролю, чтобы наблюдать эффективность лечения. Считается, что имеется от четырех до шестнадцати действенных (активных) стволовых клеток в каждой крипте тонкой кишки. Имеется также дополнительный резерв клоногенных клеток, которые способны регенерировать крипту, когда все действенные стволовые клетки убиты. Выживание этих клоногенных клеток является поэтому ключом к выживанию крипты и восстановлению интактной эпителиальной выстилки после цитотоксического повреждения (только одной клоногенной клетке необходимо выжить, чтобы обеспечить выживание крипты и, следовательно, сохранение интактного эпителия). Факторы роста и родственные молекулы могут быть использованы, чтобы манипулировать чувствительностью этих клеток к цитотоксическим агентам и таким образом уменьшать тяжесть воспаления желудочно-кишечной и ротовой слизистой оболочки. Факторы, введенные перед цитотоксическим повреждением, могут увеличить число клоногенных клеток (увеличивая, таким образом, вероятность клоногенного выживания) или действовать так, чтобы остановить клеточный цикл в таких клетках (таким образом, делая их более устойчивыми к повреждению или гибели). Факторы, введенные после цитотоксического повреждения, могут инициировать раннюю амплификацию или пролиферацию стволовых клеток и в результате ускорить процесс регенерации. Комбинация обоих протоколов могла бы обеспечить высшую степень защиты эпителия. Поэтому данный проект исследует эффективность тимозина или защиту клоногенных клеток и, следовательно, крипт от вызванного радиацией поражения. Использовали 36 взрослых мышей линии BDF1 (возрастом 10-12 недель). Животных разделяли на 6 групп и обрабатывали следующим образом: (1) контрольные мыши, (2) облученные, не обработанные мыши, (3) мыши, получавшие 3 мг/кг тимозина внутрибрюшинно, за 3 ч перед облучением, (4) мыши,получавшие наполнитель внутрибрюшинно, за 3 ч перед облучением, (5) мыши, получавшие 3 мг/кг тимозина внутрибрюшинно, 3 раза ежедневно в течение 3 дней перед облучением, (6) мыши, получавшие наполнитель внутрибрюшинно, 3 раза ежедневно в течение 3 дней перед облучением. Инъекции проводили в 9:00 (трехкратная обработка) или 12:00 (однократная обработка). В 3:00 в день 3 индуцировали кишечное повреждение, давая однократную дозу в 13 Гр (грэй) рентгеновского облучения.-3 008059 Через 4 дня после облучения животных забивали. Тонкую кишку удаляли и фиксировали в фиксаторе Карноя, чтобы обработать для гистологического анализа. Вырезали секции в 3 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. Выжившие крипты с одной или несколькими клоногенными клетками были ясно видны в облученных секциях. В иных, чем эти, областях мезенхима была полностью обнажена, у данных животных развилась бы диарея и гибель из-за воспаления слизистой оболочки, если бы им дали жить более 4 дней. Для каждого животного анализировали десять кишечных окружностей (60 на группу). Окружность является эквивалентом данной длины кишки и, следовательно, удобной начальной единицей длины. Число выживающих крипт на окружность посчитывали и определяли среднюю величину на группу. Считали только крипты, содержащие 10 или более сильно окрашенных гематоксилином и эозином клеток(исключая клетки Панета), и только интактные периметры, не содержащие пейеровых бляшек (пейеровы бляшки влияют как на число крипт в нормальной окружности, так и на способность крипт переносить инсульт). Среднюю ширину крипт (измеренную в ее самом широком месте) также измеряли для того, чтобы скорректировать оценочные ошибки из-за различия в размерах крипт. Коррекцию проводили следующим образом: скорректированное число крипт на окружность равно средней ширине крипт в необработанном контроле на среднюю ширину крипт у обработанных животных, умноженной на среднее число выживающих крипт в обработанной группе. Все животные перенесли обработку и не проявляли заметных побочных эффектов. При однократной дозе в группе, получавшей тимозин, уровни выживания были подобны таковым в группе, получавшей однократную дозу наполнителя. Одно животное в группе, получавшей наполнитель, было слегка менее чувствительным к радиации, имея больше выживших крипт (7,9, скорректированное число), увеличивающих скорректированное среднее значение для группы от 2,4 до 3,5. Если данное животное исключить, то это напоминало бы защитный эффект с одной дозой тимозина (2,4 против 3,3). Однако, поскольку имеется подобное изменение в выживании крипт в группе, получавшей только облучение в 13 Гр, а группа, получавшая тройную дозу наполнителя, имеет среднее значение 3,0, эффект обработки однократной дозой мог быть небольшим или незначительным. Обработка тройной дозой тимозина представляет особый интерес. Было отмечено скорректированное значение выживающих крипт 5,3 по сравнению с 3 в контроле, приравниваемое к защитному фактору 1,77 (77%-ное увеличение выживающих крипт). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения для защиты клеток субъекта от радиационного поражения, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, композиции, содержащей защищающее от радиации количество -тимозинового пептида. 2. Способ по п.1, в котором -тимозиновым пептидом является тимозин 1. 3. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят упомянутому субъекту в количестве примерно 0,001-10 мг/кг массы тела. 4. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят упомянутому субъекту в дозе примерно 1-5 мг. 5. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят в дозе примерно 1,6 мг. 6. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят в дозе примерно 3,2 мг. 7. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят по меньшей мере примерно за 3 ч до облучения. 8. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят множество раз перед облучением. 9. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят по меньшей мере примерно 3 раза перед облучением. 10. Способ по п.1, в котором -тимозиновый пептид вводят упомянутому субъекту, чтобы способствовать заживлению радиационного повреждения клеток упомянутого субъекта. 11. Способ по п.10, в котором -тимозиновым пептидом является тимозин 1. 12. Способ по п.10, в котором -тимозиновый пептид вводят упомянутому пациенту в дозе примерно 0,001-10 мг/кг массы тела пациента. 13. Способ по п.10, в котором -тимозиновый пептид вводят упомянутому пациенту в дозе примерно 1-5 мг. 14. Способ по п.10, в котором -тимозиновый пептид вводят в дозе примерно 1,6 мг. 15. Способ по п.10, в котором -тимозиновый пептид вводят в дозе примерно 3,2 мг. 16. Способ по п.1, в котором упомянутый -тимозиновый пептид вводят посредством инъекции или инфузии. 17. Способ по п.10, в котором упомянутый -тимозиновый пептид вводят посредством инъекции или инфузии.-4 008059 18. Способ по п.16, в котором упомянутый -тимозиновый пептид конъюгируют с полимером, чтобы увеличить время полувыведения пептида из плазмы упомянутого субъекта. 19. Способ по п.17, в котором упомянутый -тимозиновый пептид конъюгируют с полимером, чтобы увеличить время полувыведения пептида из плазмы упомянутого субъекта.