Производное инсулина, обладающее сахароснижающей активностью при пероральном применении, способ его получения и лекарственные формы на его основе

ПРОИЗВОДНОЕ ИНСУЛИНА, ОБЛАДАЮЩЕЕ САХАРОСНИЖАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ НА ЕГО ОСНОВЕ Производное инсулина, обладающее сахароснижающей активностью при пероральном применении, способ его получения и лекарственные формы на его основе. Изобретение относится к фармации и медицине, а именно к орально вводимым составам биологически активного вещества, в частности супрамолекулярного ансамблям ацилированных олигопептидов инсулина для лечения сахарного диабета, его осложнений. Данная система позволяет 24 ч при пероральном однократном применении удерживать уровень глюкозы в крови на физиологическом уровне(сверхэффект), а компоненты системы приобретают устойчивость к действию ферментов и имеют малые размеры, способны легко всасываться из кишечника. Суть изобретения: в качестве основных действующих агентов используют супрамолекулярную композицию - ансамбль из ацилированных олигопептидов - продуктов ферментативного гидролиза инсулина. Композиция может производиться промышленностью в достаточных количествах с учетом доступности всех компонентов композиции. Мартынов Артур Викторович (UA),Фарбер Борис Славинович, Фарбер Софья Борисовна (RU) Васильева Г.С. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ФАРБЕР БОРИС СЛАВИНОВИЧ; ФАРБЕР СОФЬЯ БОРИСОВНА (RU) Область техники Изобретение относится к фармации и медицине, а именно к орально, ректально, аэрозольно и парентерально вводимым составам биологически активного вещества, в частности олигопептидов инсулина для лечения сахарного диабета, его осложнений и для усиления регенерации тканей при ожогах, синдроме диабетической стопы. Предшествующий уровень техники Сахарный диабет - одно из наиболее распространенных тяжелых заболеваний, в основе которого лежит абсолютный или относительный недостаток гормона поджелудочной железы - инсулина. Инсулинотерапия (введение инсулина извне) является единственным и традиционным методом лечения заболевания, позволяющим восполнить недостаток инсулина в организме. Наиболее распространенный способ введения инсулина - подкожная инъекция. Этот способ неудобен, травмирует психику больных (особенно детей), причиняет физические и моральные страдания, но самое главное, может сам по себе обострять патологию заболевания. Последнее связано с тем, что при подкожной инъекции инсулина нормальная концентрация глюкозы в крови достигается за счет систематической гиперинсулинемии периферических тканей, в то время как печень (основное место активности эндогенного, вырабатываемого в организме инсулина) испытывает недостаток инсулина. Единственный способ предотвратить осложнения, неизбежно сопутствующие инъекционной инсулинотерапии, по возможности добиться полной имитации природного пути поступления гормона в живом организме - смоделировать физиологическую разницу в уровне инсулина в портальной и периферической системах кровообращения. И с этой точки зрения, пероральный (через рот) путь доставки инсулина наиболее благоприятен. Главными препятствиями, возникающими на пути создания пероральных форм инсулина, является низкая устойчивость гормона к действию протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта, а также низкая проницаемость инсулина через эпителиальную ткань кишечной стенки в кровоток, обусловленная как низкой липофильностью, так и размерами макромолекул гормона. За последние десятилетия были предприняты многочисленные попытки создания пероральных форм инсулина, однако до сих пор не удалось разработать эффективно действующий препарат, способный конкурировать по терапевтическому действию с инсулином, вводимым инъекционным путем. Среди лекарственных форм препаратов перорального применения наиболее заманчивой и перспективной является твердая форма, поскольку она наиболее комфортна и удобна как для употребления больными, так и для хранения, к тому же, технологии производства таких форм относительно недороги и достаточно отработаны. Известно твердое инсулинсодержащее лекарственное средство, состоящее из ядра, содержащего инсулин и вспомогательные вещества, и оболочки из биодеградируемого пленкообразующего полимерного материала [1]. Средство изготавливают введением в твердую желатиновую капсулу или таблетку 140 мг кристаллического инсулина и 200 мг стехиометрической смеси 5-метоксисалициловой кислоты и бикарбоната натрия. Затем капсулу (таблетку) покрывают сополимером гидроксиэтилметакрилата и стирола, сшитым дивинилазобензолом. Оболочка устойчива к действию среды желудка и тонкого кишечника, но распадается в толстом кишечнике под действием присутствующих там микроорганизмов. Недостатком этого средства является низкая эффективность и неопределенное время достижения максимального эффекта. Пероральное введение крысам указанного средства, содержащего 1 ед. инсулина, приводит к уменьшению концентрации глюкозы в крови на 20% через 9 ч после введения. В то же время подкожное введение раствора инсулина в дозе 0,1 или 1,0 ед. приводит к снижению уровня глюкозы в крови на 39 и 63% соответственно. Максимальный гипогликемический эффект для отдельных животных достигается в период от 1 до 9 ч, а у некоторых животных эффект уменьшения концентрации глюкозы отсутствует и через 10 ч после введения лекарственного средства. Известно твердое инсулинсодержащее лекарственное средство в форме нанокапсул, представляющих собой микрочастицы диаметром порядка 300 нм, состоящие из биодеградируемого (под действием микрофлоры кишечника) полиалкилцианоакрилата с иммобилизованным внутри него инсулином [2]. Недостатками этого средства является низкая эффективность и неопределенное время достижения максимального эффекта. Так, например, при пероральном введении его крысам в дозах 12,5, 25 и 50 ед/кг инсулина клинический эффект (50-60%-ое уменьшение уровня глюкозы в крови) наблюдается лишь на второй день после введения нанокапсул. Существует необходимость разработки композиций инсулина для перорального введения, которые в известной степени защищены от воздействия враждебной окружающей среды желудка. Хотя предпринимаются многочисленные попытки разработать такие композиции, заявитель не знает ни одной, которая на сегодняшний день поставлялась бы в значительной мере на рынок. Заявитель осведомлен лишь о следующих предложениях. Известен патент США, описывающий способ перорального применения инсулина [3], в котором применяется система микроэмульсий на основе системы масло/вода, также содержащие несколько эмульгаторов, а инсулин растворен в водной фазе. Однако отмеченные системы имеют ряд недостатков: время начала действия перорально принятого инсулина начинается через 1-2 ч и нормы так и не достига-1 023447 ет, эмульсии имеют тенденцию к расслоению, утрате активности за счет спонтанного протеолиза инсулина в связи с отсутствием протекторов, а применяемый инсулин никоим образом не защищен от действия внешних факторов - ферментов, температуры, света. Падения уровня глюкозы до 3-5 mg/dL не удалось авторам добиться вообще, так что заменить парентеральный инсулин данные системы не смогли. Таким образом, актуальным является создание пероральных препаратов, способных не просто заменить пролонгированный парентеральный инсулин, но и пролонгировать его эффекты как минимум до 24 ч. Раскрытие изобретения Целью изобретения является создание супрамолекулярного ансамбля избыточно негативно заряженных олигопептидов гидролизата инсулина, обладающего сахароснижающей активностью при пероральном применении, и лекарственной формы на его основе, способной снижать уровень глюкозы в крови до нормы и удерживать этот уровень как минимум сутки. Поставленная цель достигается тем, что получают фармацевтическую композицию в качестве основных действующих веществ, которая содержит квазиживую самоорганизующуюся систему - супрамолекулярный ансамбль пептидов - продуктов ферментативного гидролиза инсулина трипсином, папаином,химотрипсином, которые затем ацилируются ангидридами дикарбоновых кислот - янтарной, уксусной,малеиновой, и дополнительно содержит фармацевтически приемлемые вспомогательные формообразующие вещества. Такая композиция может быть введена в мазь, аэрозоль и использована перорально. Содержание ацилированных пептидов может колебаться в пределах от 0,0001 до 3,0 мас.%. В организме человека такие олигопептиды устойчивы к действию ферментов, защищены от дальнейшего гидролиза ацилированием, а маленькие размеры пептидов позволяют им свободно всасываться. Кроме того, такая система пептидов, которые были ранее целым (молекулой инсулина), но с измененными зарядами, способна к самоорганизации на инсулиновых рецепторах в инсулиноподобную супрамолекулярную структуру. Отрицательный заряд олигопептидов и устойчивость их к ферментативному гидролизу способствуют 24-часовому (и более) пролонгированию действия и удержанию уровня глюкозы в крови на физиологическом уровне. Лучший вариант осуществления изобретения Пример 1. Синтез квазиживой системы на основе сукцинилированных пептидов инсулина. Кристаллический инсулин (Elli Lilli) в количестве 100 мг растворяли в 1 мл 0,1 М соляной кислоты и затем энзиматически гидролизовали инкубацией с протеиназой K при комнатной температуре 1 ч. Затем при перемешивании раствора медленно добавляют измельченный до порошка янтарный ангидрид(7,5 мг) и инкубируют при перемешивании 60 мин. Полученные пептиды были очищены от солей на хроматографической колонке Сефадекс G-25, где в качестве элюента применяли ТРИС-гидрохлорид. Выход белка контролировали по поглощению элюата в у/ф области при 280 нм. Обессоленные пептиды разливали в ампулы и лиофилизировали. Полученные пептиды далее использовали для получения различных лекарственных форм и изучения их активности. Пример 2. Получение пероральных форм сукцинилированных пептидов инсулина. Полученные в примере 1 пептиды растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида с образованием раствора, эквивалентного 4,3 мг белка/мл, добавляли 2% стабилизатора полисорбата, в качестве консервантов можно использовать аскорбинат натрия, бензалкония хлорид, метил- и пропилпарабены, а для усиления всасывания пептидов - до 3% ПЭО-400. Полученный раствор в 5-кратной (по отношению к инъекционной форме) дозе вводили животным перорально. Пример 3. Изучение сахароснижающего действия супрамолекулярного ансамбля пептидов инсулина (СМАИ) при пероральном применении на модели аллосканового диабета у крыс. Эксперименты были проведены на половозрелых крысах-самцах Вистар, содержание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Экспериментальных животных (n=40) делили на 4 группы: "К" - крысы, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,1 мл физ.раствора(n=10); "СМ" - крысы, получавшие по той же схеме по 0,1 мл СМАИ (n=10); "Ал" - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os no 0,1 мл физ.раствора (n=10);"Ал+СМАИ" - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие по той же схеме по 0,1 мл СМАИ (n=10). Экспериментальный сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением диабетогенной дозы аллоксана - 17 мг/100 г массы тела. Все исследования проводили натощак, крысам давали только воду. В разные периоды эксперимента в крови животных измеряли содержание глюкозы с использованием биосенсорного датчика уровня глюкозы One touch Ultra (USA) и одноразовых индикаторных электродов к нему. Данные представлены в табл. 1. Таблица 1. Динамика уровня глюкозы в крови крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом после однократного перорального приема супрамолекулярного ансамбля пептидов инсулина Примечания:- Статистически значимые отличия между группой Ал+СМАИ и Ал (р 0,05);- Статистически значимые отличия между группами Ал и К (р 0,05). Для статистической обработки использовали метод однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения. Как видно из табл. 1, пероральное применение супрамолекулярного ансамбля (самоорганизующейся квазиживой системы) из ацилированных фрагментов инсулина приводит к нормализации уровня глюкозы в крови экспериментальных крыс с аллоксановым диабетом. Уже через 60 мин после перорального приема СМАИ уровень глюкозы возвращается к норме и держится на приемлемом для диабетических крыс уровне в течение 24 ч. Данного суперэффекта от применения перорального инсулина или его производных и пролонгирование сахароснижающего эффекта на 24 ч при однократном применении ранее не удавалось вызвать никому. С целью изучения влияния СМАИ на поддержание уровня глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом был проведен эксперимент с глюкозной нагрузкой. Пример 4. Изучение сахароснижающего действия супрамолекулярного ансамбля пептидов инсулина (СМАИ) при пероральном применении на модели аллосканового диабета у крыс на фоне глюкозной нагрузки Эксперименты были проведены на половозрелых крысах-самцах Вистар. Экспериментальных животных (n=40) делили на 4 группы: "К" - крысы, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,1 мл физ.раствора (n=10); "СМ" - крысы, получавшие по той же схеме по 0,1 мл СМАИ (n=10); "Ал" крысы с аллоксановым диабетом, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os no 0,1 мл физ. раствора (n=40); "Ал+СМАИ" - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие по той же схеме по 0,1 мл СМАИ (n=10). Экспериментальный сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением диабетогенной дозы аллокеана - 17 мг/100 г массы тела. Один раз в сутки крысам вводили 1 мл 5% глюкозы внутрибрюшинно и кормили 3 раза в день. В разные периоды эксперимента в крови животных измеряли содержание глюкозы с использованием биосенсорного датчика уровня глюкозы One touch Ultra(USA) и одноразовых индикаторных электродов к нему. Данные представлены в табл. 2. Таблица 2. Динамика уровня глюкозы в крови крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом после однократного перорального приема супрамолекулярного ансамбля пептидов инсулина на фоне глюкозной и пищевой нагрузки Примечания:- Статистически значимые отличия между группой Ал+СМАИ и Ал (р 0,05);- Статистически значимые отличия между группами Ал и К (р 0,05). Для статистической обработки использовали метод однофакторного дисперсионного анализа и множественного сравнения. Как видно из табл. 2, пероральное применение супрамолекулярного ансамбля (самоорганизующейся квазиживой системы) из ацилированных фрагментов инсулина приводит к нормализации уровня глюкозы в крови экспериментальных крыс с аллоксановым диабетом. Уже через 60 мин после перорального приема СМАИ уровень глюкозы возвращается к норме (7,4 1,4) и держится на приемлемом для диабетических крыс уровне в течение 24 ч независимо от приема пищи и инъекций глюкозы. Данного суперэффекта на фоне глюкозной нагрузки от применения перорального инсулина или его производных и пролонгирование сахароснижающего эффекта на 24 ч при однократном применении ранее получить также не удавалось никому. Промышленная применимость Изобретение относится к фармации и медицине, а именно к орально, ректально, аэрозольно и парентерально вводимым составам биологически активного вещества, в частности олигопептидов инсулина для лечения сахарного диабета, его осложнений и для усиления регенерации тканей при ожогах, синдроме диабетической стопы. Данная система позволяет более 24 ч при пероральном применении удерживать уровень глюкозы в крови на физиологическом уровне, а компоненты системы устойчивы к действию ферментов и имеют малые размеры, способны легко всасываться из кишечника, через кожу и слизистые при любом способе применения системы. Использованные источники информации[3] US Patent 5824638. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция, обладающая сахароснижающей активностью при пероральном применении и лекарственные формы на ее основе, отличающаяся тем, что содержит супрамолекулярный ансамбль пептидов ферментативного гидролизата инсулина, олигопептиды которого обработаны ангидридами поликарбоновых кислот или хлорангидридами карбоновых кислот. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве инсулина используют свиной инсулин. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве инсулина используют человеческий генно-инженерный инсулин. 4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что ферментативный гидролизат получают путем обработки инсулина трипсином. 5. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что ферментативный гидролизат получают путем обработки инсулина химотрипсином. 6. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что ферментативный гидролизат получают путем обработки инсулина папаином. 7. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что ферментативный гидролизат получают путем обработки инсулина протеиназой К. 8. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве ангидрида поликарбоновой кислоты используют янтарный ангидрид. 9. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве ангидрида поликарбоновой кислоты используют малеиновый ангидрид. 10. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве хлорангидрида карбоновой кислоты используют монохлоруксусную кислоту. 11. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что пептиды - продукты ферментативного гидролиза инсулина модифицируют при соотношении ацилирующий (алкилирующий) агент:белок в пределах от 0,1:1 до 3:1. 12. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что изготавливается при таком соотношении компонентов, мас.%: супрамолекулярный ансамбль пептидов 0,0001-3,0, остальное вспомогательные вещества до 100. 13. Фармацевтическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что изготавливается как жидкая лекарственная форма (эмульсия, раствор водный, неводный). 14. Фармацевтическая композиция по п.13, которая отличается тем, что содержит гидрофобную основу. 15. Фармацевтическая композиция п.14, которая отличается тем, что содержит гидрофильную основу. 16. Фармацевтическая композиция по п.15, которая отличается тем, что содержит дифильную основу. 17. Фармацевтическая композиция по п.16, которая отличается тем, что выполнена как аэрозоль,либо аэрогель для перорального применения (нанесения на щеку с внутренней стороны).