Способ получения обогащенной igg-композиции из плазмы
Номер патента: 23446
Опубликовано: 30.06.2016
Авторы: Буттервек Харальд Арно, Плевляковиц Азра, Гундингер Томас, Сфатос Соня, Граузенбургер Райнхард, Шварц Ханс-Петер, Брукшвайгер Леопольд, Кельбль Бернхард, Нюрнбергер Юлиа, Тешнер Вольфганг
Формула / Реферат
1. Способ получения из криосупернатантной плазмы обогащенной IgG-композиции, содержащий следующие этапы:
(а) осаждение криосупернатантной фракции плазмы на первом этапе осаждения от приблизительно 6 до приблизительно 10% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта, причем первый супернатант содержит IgG;
(б) осаждение IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения от приблизительно 20 до приблизительно 25% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 6,7 до приблизительно 7,3 с получением второго осадка, причем второй осадок содержит IgG;
(в) суспендирование второго осадка в экстракционном буфере с получением суспензии;
(г) осаждение IgG из суспензии, полученной на этапе (в), на третьем этапе осаждения от приблизительно 22 до приблизительно 28% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 6,7 до приблизительно 7,3 с получением третьего осадка, причем третий осадок содержит IgG;
(д) суспендирование третьего осадка в водном растворе с получением суспензии, причем суспензия имеет растворимую часть, содержащую IgG, и нерастворимую часть;
(е) отделение растворимой части от суспензии, образованной на этапе (д), с получением обогащенной IgG-композиции,
при этом по меньшей мере один из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения или третьего этапа осаждения содержит добавление спирта распылением.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что все этапы осаждения: первый этап осаждения, второй этап осаждения и третий этап осаждения, содержат добавление спирта распылением.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рН по меньшей мере на одном из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения или третьего этапа осаждения достигается добавлением рН-модифицирующего раствора после добавления спирта.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что рН на всех этапах осаждения: первом этапе осаждения, втором этапе осаждения и третьем этапе осаждения, достигается добавлением рН-модифицирующего раствора после добавления спирта.
5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что добавление рН-модифицирующего раствора содержит добавление рН-модифицирующего раствора распылением.
6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что рН на этапе осаждения модифицируется до и после добавления спирта, во время и после добавления спирта или до, во время и после добавления спирта.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что рН по меньшей мере на одном из этапов осаждения поддерживается в течение всего этапа осаждения непрерывной корректировкой рН.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап ионообменной хроматографической очистки после третьего этапа осаждения спиртом.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что содержит как этап анионообменной хроматографической очистки, так и этап катионообменной хроматографической очистки после третьего этапа осаждения спиртом.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап нанофильтрации и/или этап ультрафильтрации/диафильтрации после третьего этапа осаждения спиртом.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что обогащенная IgG-композиция, полученная на этапе (е), содержит по меньшей мере 85, предпочтительно 90% от содержания IgG, обнаруживаемого в криосупернатантной фракции плазмы, используемой на этапе (а).
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что чистота γ-глобулинов в финальной IgG-композиции равна по меньшей мере приблизительно 95%, предпочтительно 98%, более предпочтительно 99%.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержит следующие этапы:
(а) осаждение криосупернатантной фракции плазмы на первом этапе осаждения от приблизительно 6 до приблизительно 10% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта, причем первый супернатант содержит IgG, путем:
(1) охлаждения смеси объединенных порций донорской плазмы при температуре между 2 и 10°С;
(2) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (1), путем центрифугирования;
(3) добавления этанола в жидкий супернатант, полученный на этапе (2), до конечной концентрации этанола между 5 и 10% (об./об.), таким образом образуя смесь;
(4) охлаждения смеси, полученной на стадии (3), до между -4 и 0°С;
(5) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (4), путем центрифугирования; и выделения супернатанта;
(б) осаждение IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения от приблизительно 20 до приблизительно 25% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 6,7 до приблизительно 7,3 с получением второго осадка, причем второй осадок содержит IgG, путем:
6) доведения рН криосупернатантной фракции плазмы до приблизительно 7,0;
7) доведения концентрации этанола в криосупернатантной фракции плазмы, полученной на этапе 6), до приблизительно 25% (об./об.) при температуре от приблизительно -7 до приблизительно -9°С с получением смеси;
8) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе 7);
(в) суспендирование второго осадка в экстракционном буфере с получением суспензии, путем:
9) суспендирования осадка, полученного на этапе 8), экстракционным буфером, содержащим фосфат и ацетат, причем рН буфера корректируется от 300 до 700 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с образованием суспензии;
10) смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией, полученной на этапе 9), по меньшей мере приблизительно в течение 30 мин;
11) фильтрования суспензии на фильтр-прессе с получением фильтрата;
12) промывания фильтр-пресса по меньшей мере 3 мертвыми объемами фильтр-пресса при помощи буфера, содержащего фосфат и ацетат, причем рН буфера корректируется от 50 до 200 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с образованием промывочного раствора;
13) комбинирования фильтрата, полученного на этапе 11), с промывочным раствором, полученным на этапе 7), с получением раствора, а также обработка раствора детергентом;
(г) осаждение IgG из суспензии, полученной на этапе (в), на третьем этапе осаждения от приблизительно 22 до приблизительно 28% (об./об.) спиртом при рН от приблизительно 6,7 до приблизительно 7,3 с получением третьего осадка, причем третий осадок содержит IgG, путем:
14) доведения рН раствора, полученного на этапе 13), до приблизительно 7,0 и добавления этанола до конечной концентрации приблизительно в 25% (об./об.) с получением осадка;
15) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе 14);
(д) суспендирование третьего осадка в водном растворе с получением суспензии, причем суспензия имеет растворимую часть, содержащую IgG, и нерастворимую часть, путем:
16) суспендирования осадка в водном растворе, содержащем растворитель или детергент, и выдерживания раствора в течение по меньшей мере 60 мин;
(е) отделение растворимой части от суспензии, образованной на этапе 16);
(ж) пропускание растворимой части, отделенной на этапе (е), через катионообменную хроматографическую колонку и элюирование белков, абсорбированных колонкой, в элюат;
(з) пропускание элюата, полученного на этапе (ж), через анионообменную хроматографическую колонку с получение эффлюента;
(и) пропускание эффлюента, полученного на этапе (з), через нанофильтр с получением нанофильтрата;
(к) пропускание нанофильтрата, полученного на этапе (и), через ультрафильтрационную мембрану с получением ультрафильтрата;
(л) диафильтрация ультрафильтрата, полученного на этапе (к), против диафильтрационного буфера с получением диафильтрата с содержанием белка от приблизительно 8 до приблизительно 12% (мас./об.) с получением композиции концентрированного IgG,
при этом по меньшей мере один из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения или третьего этапа осаждения содержит добавление спирта распылением.
Текст
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОЙ IgG-КОМПОЗИЦИИ ИЗ ПЛАЗМЫ Изобретение относится к области производства иммуноглобулинов для внутривенного введения. Раскрыт способ получения из криосупернатантной плазмы обогащенной IgG-композиции,содержащий этапы осаждения криосупернатантной фракции плазмы на первом этапе осаждения спиртом получением первого осадка и первого супернатанта, содержащего IgG; осаждения IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения спиртом с получением второго осадка,содержащего IgG; суспендирования второго осадка в экстракционном буфере с получением суспензии; осаждения IgG из указанной суспензии спиртом с получением третьего осадка,содержащего IgG; суспендирования третьего осадка в водном растворе с получением суспензии,имеющей растворимую часть, содержащую IgG, и нерастворимую часть; и отделения растворимой части от указанной суспензии с получением обогащенной IgG-композиции, при этом по меньшей мере один из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения или третьего этапа осаждения содержит добавление спирта распылением. Изобретение может быть использовано для улучшения способов производства иммуноглобулинов для внутривенного введения. Уровень техники Иммуноглобулиновые продукты из человеческой плазмы впервые были использованы для лечения иммунодефицита в 1952 г. Первоначально методами выбора были внутримышечное или подкожное введение иммуноглобулина изотипа G (IgG). Для эффективного лечения различных заболеваний были необходимы введения больших количеств IgG, однако были разработаны продукты для внутривенного введения, имеющие меньшие концентрации IgG (50 мг/мл). Как правило, иммуноглобулин для внутривенного введения (IVIG) содержит смешанные иммуноглобулины G (IgG) плазмы более чем тысячи доноров крови. Как правило, в них содержится более 95% немодифицированного IgG с интактными Fc-зависимыми эффекторными функциями, и лишь следовые количества иммуноглобулина A (IgA) или иммуноглобулина М (IgM), IVIG являются стерильными, очищенными IgG-продуктами, используемыми в основном для лечения трех основных категорий медицинских состояний: (1) иммунодефицитные состояния, такие как агаммаглобулинемия, сцепленная с Х-хромосомой, гипогаммаглобулинемия (первичные иммунодефицитные состояния) и приобретенные состояния ослабленного иммунитета (вторичные иммунодефицитные состояния), характеризующиеся низкими уровнями антител; (2) воспалительные и аутоиммунные заболевания и (3) острые инфекции. В частности, у многих людей с первичными иммунодефицитными нарушениями отмечается нехватка антител, необходимых для противостояния инфекции. В определенных случаях для поддержки при этих иммунодефицитных состояниях могут осуществляться инфузии очищенного IgG, как правило,внутривенно (т.е. IVIG-терапия). Некоторые первичные иммунодефицитные состояния часто лечатся таким образом, включая агаммоглобулинемию, сцепленную с Х-хромосомой (XLA), вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит (CVID), гипер-IgM синдром (HIM), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) и некоторые недостаточности IgG-подкласса (Blaese and Winkelstein, J. PatientFamily Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007). Хотя IVIG-терапия может быть очень эффективна для удержания под контролем первичных иммунодефицитных состояний, эта терапия лишь временно заменяет антитела, не производящиеся в организме, а не излечивает болезнь. Соответственно пациенты, зависящие от IVIG-терапии, нуждаются в повторных дозах, как правило, раз в месяц в течение всей жизни. Эта необходимость обуславливает большой запрос в продолжительном производстве IVIG-композиций. Однако в отличие от других биологических препаратов, получаемых экспрессией рекомбинантных ДНК-векторов in vitro, внутривенные иммуноглобулины выделяются из донорской человеческой крови и плазмы. Поэтому количество продуктов внутривенных имуноглобулинов не может быть увеличено простым повышением объема производства. А точнее, количество доступных в продаже внутривенных иммуноглобулинов ограничено доступными источниками донорской человеческой крови и плазмы. Несколько факторов влияют на нужду во внутривенных иммуноглобулинах, включая принятиеIVIG-терапии, идентификацию дополнительных показаний, при которых IVIG-терапия эффективна, и повышение диагностики у пациентов состояний с назначением внутривенных иммуноглобулинов. Известно, что общая потребность во внутривенных иммуноглобулинах увеличилась более чем в четыре раза с 1990 г. и растет в настоящее время со скоростью приблизительно 7-10% в год (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). Например, Австралийская Национальная Служба Крови сообщила о том, что потребность во внутривенных иммуноглобулинах увеличилась в Австралии на 10,6% в течение 2008-2009 гг. фискального года (National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009). В частности, из-за повышения общей потребности и колебаний в доступных поставках иммуноглобулиновых продуктов некоторые страны, включая Австралию и Англию, ввели программы управления спросом для обеспечения поставок при нехватке этих продуктов пациентам, наиболее нуждающимся в них. Сообщалось о том, что в 2007 г. было фракционировано 26,5 млн литров плазмы, было выделено 75,2 метрических тонн внутривенных иммуноглобулинов со средним выходом 2,8 г с 1 л (Robert P., выше). В том же отчете были приведены оценки того, что общий выход внутривенных иммуноглобулинов достигнет приблизительно 3,43 г с 1 л к 2012 г. Тем не менее, вследствие продолжающегося роста общей потребности во внутривенных иммуноглобулинах, прогнозируемого на уровне приблизительно 7-13% в год между настоящим временем и 2015 г., для удовлетворения глобального спроса требуется дальнейшее повышение выхода внутривенных иммуноглобулинов. Поставщиками внутривенных иммуноглобулинов используется ряд способов получения внутривенных иммуноглобулинов. Одна из общих проблем нынешних способов получения IVIG - значительная потеря IgG при процессе очистки, оцениваемая по меньшей мере в 30-35% от общего содержания IgG в исходном материале. Одно из затруднений - обеспечить надлежащую инактивацию вирусов и отсутствие примесей, способных вызвать нежелательные реакции, при поднятии выхода IgG. На нынешних уровнях производства внутривенных иммуноглобулинов то, что может считаться небольшим повышением выхода, на самом деле, имеет большое значение. Например, на уровне производства 2007 г. 2%-ное повышение эффективности, равное дополнительным 56 мг с 1 л, дало бы дополнительные 1,5 метрические тонны внутривенных иммуноглобулинов. В четвертом выпуске серии оригинальных работ о приготовлении и свойствах белков плазмы Cohnet al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475) впервые описали способы спиртового фракционирования белков плазмы (способ 6), который позволяет выделять фракцию, обогащенную IgG, из человеческой плазмы. Несколькими годами позже Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550) на основе способов Cohn разработали способ (способ 9), обеспечивавший выделение более чистого препарата IgG. Хотя эти способы лежали в основании целой отрасли производства полученных из плазмы факторов крови, по ним не было возможно получать IgG-препараты с достаточно высокими концентрациями для лечения ряда иммунных заболеваний, включая синдром Кавасаки, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру и первичные иммунодефицитные состояния. В связи с этим были разработаны дополнительные способы, использующие различные техники, такие как ионообменная хроматография, для обеспечения большей чистоты и более высокой концентрации IgG-составов. Норре et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), Falksveden (патент Швеции 348942) и Falksveden и Lundblad (Methods ofPlasma Protein Fractionation 1980) были одними из первых, кто предложил использовать ионообменную хроматографию для этой цели. В различных современных способах используется этап осаждения, такой как каприлатное осаждение (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84): 193-201) и осаждение этанолом Фракции Cohn (I+)II+III (Tanaka etal., Braz J. Med. Biol. Res 2000 (33) 37-30) вместе с колоночной хроматографией. Teschner et al. (Vox Sang,2007 (92):42-55) недавно описали способ производства 10% IVIG-препарата, при котором вначале от объединенной плазмы отделяется криоосадок, а затем производится модифицированное фракционирование по Cohn-Oncley с холодным этанолом с последующими обработкой интермедиата растворителем/детергентом, ионообменной хроматографией, нанофильтрацией и, необязательно, ультрафильтрацией/диафильтрацией. Тем не менее, несмотря на повышенные чистоту, безопасность и выход, обеспечиваемыми этими способами производства IgG, значительное количество IgG все еще утрачивается во время процесса очистки. Например, Teschner et al. сообщали о том, что по их способу достигается повышение выхода IgG на 65% (Teschner et al., выше). Как сообщалось на различных конференциях, посвященных препаратам плазмы, средние выходы крупномасштабного производства IgG, такого как у Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics и Finnish Red Cross, вырьируются от приблизительно 61 до приблизительно 65% в конечном контейнере. Это означает, что по меньшей мере приблизительно треть IgG, присутствующего в объединенной фракции плазмы, утрачивается при производственном процессе. По этой причине существует необходимость в усовершенствованных и более эффективных способах производства IVIG-препаратов. Настоящее изобретение удовлетворяет этим и другим требованиям,предлагая способы производства IVIG, обеспечивающие выходы, по меньшей мере на 6-10% превышающие выходы, достигаемые в настоящее время, а также IVIG-композиции, полученные по ним. Краткое описание изобретения В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются способы получения из плазмы обогащенных IgG-композиций (например, IVIG-композиций). Способы, предложенные здесь, выгодно отличаются тем, что они обеспечивают существенное улучшение в сравнении с нынешним состоянием в области способов производства IVIG-композиций. Например, способы, предложенные здесь, позволяют повысить выход IgG в финальной общей композиции без утраты чистоты, необходимой для внутривенного введения. В одном аспекте предлагается способ получения из плазмы обогащенной IgG-композиции, включающий этапы: (а) осаждения криосупернатантной плазменной фракции на первом этапе осаждения при помощи приблизительно 6-10%-ного спирта при рН приблизительно 7,0-7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта, (б) осаждения IgG из первого супернатанта на втором этапе осаждения при помощи приблизительно 20-25%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением второго осадка,(в) ресуспендирования второго осадка с получением суспензии, (г) осаждения IgG из суспензии, полученной на этапе (в), на третьем этапе осаждения при помощи приблизительно 22-28%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением третьего осадка, (д) ресуспендирования третьего осадка с получением суспензии и (е) отделения растворимой фракции из суспензии, полученной на этапе (д), с получением обогащенной IgG-композиции, отличающийся тем, что по меньшей мере один из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения, третьего этапа осаждения включает добавление спирта путем распыления. В одном варианте воплощения спирт добавляется на первом этапе осаждения путем распыления. В ином варианте воплощения спирт добавляется на втором этапе осаждения путем распыления. В еще одном варианте воплощения спирт добавляется на третьем этапе осаждения путем распыления. В определенных вариантах воплощения рН одного или более растворов может корректироваться добавлением изменяющего рН агента путем распыления. В родственных вариантах воплощения рН на по меньшей мере одном из первого этапа осаждения, второго этапа осаждения или третьего этапа осаждения достигается добавлением рН-модифицирующего раствора после добавления спирта или до и после добавления спирта, во время и после добавления спирта или до, во время и после добавления спирта. В еще одном родственном варианте воплощения рН на этапе осаждения может поддерживаться для полно-2 023446 ты реакции осаждения длительным корректированием рН. В одном определенном варианте воплощения рН на первом этапе осаждения корректируется после добавления спирта добавлением рН-модифицирующего агента путем распыления. В ином варианте воплощения рН на втором этапе осаждения корректируется после добавления спирта добавлением рНмодифицирующего агента путем распыления. В еще одном варианте воплощения рН на третьем этапе осаждения корректируется после добавления спирта добавлением рН-модифицирующего агента путем распыления. Дополнительно способы приготовления, предложенные здесь, могут, помимо этого, включать этап ионообменной хроматографии (например, анионообменной и/или катионообменной хроматографии),этап нанофильтрации, этап ультрафильтрации/диафильтрации или любой иной подходящей техники очистки для дальнейшего повышения чистоты или качества IVIG-препаратов. В другом аспекте предлагается способ получения обогащенной IgG-композиции из плазмы, содержащий этапы: (а) корректирования рН криосупернатантной плазменной фракции до или приблизительно до 7,0, (б) корректирования концентрации этанола в криосупернатантной плазменной фракции этапа (а) до или приблизительно до 25% (об./об.) при температуре, между или равной приблизительно -7 С и приблизительно -9 С, с получением смеси, (в) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе(б), (d) ресуспендирования осадка, полученного на этапе (в), в буфере, содержащем фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, равным или приблизительно равным 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением суспензии, (д) смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией, полученной на этапе (г), в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, (е) фильтрования суспензии на фильтр-прессе с получением фильтрата, (ж) промывания фильтрпресса по меньшей мере 3 мертвыми объемами фильтр-пресса буфера, содержащего фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, равным или приблизительно равным 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением промывного раствора, (з) смешивания фильтрата, полученного на этапе (е), с промывным раствором, полученным на этапе (ж), с получением раствора, и обработки раствора поверхностно-активным веществом, (и) доведения рН раствора, полученного на этапе (з), до уровня в или приблизительно в 7,0 и добавления этанола до финальной концентрации, равной или приблизительно равной 25%, с получением осадка, (к) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (и), (л) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или поверхностно-активное вещество, и выдерживания раствора по меньшей мере в течение 60 мин, (м) прохождения раствора с этапа (л) через катионообменную хроматографическую колонну и элюирования в элюат белков, абсорбированных в колонне, (н) прохождения элюата, полученного на этапе (м), через анионообменную хроматографическую колонну для получения эффлюента, (о) прохождения эффлюента с этапа (н) через нанофильтр для получения нанофильтрата, (п) прохождения нанофильтрата, полученного на этапе (о), через ультрафильтрационную мембрану для получения ультрафильтрата; и (р) диафильтрации ультрафильтрата, полученного на этапе (п), против диафильтрационного буфера для получения диафильтрата с концентрацией белка между приблизительно 8 и приблизительно 12% (в/об.) с получением композиции концентрированного IgG. В ином аспекте в настоящем изобретении предлагаются водные IgG-композиции, полученные способами, описанными здесь. В общем, IgG-композиции имеют высокую чистоту (например, по меньшей мере 95, 98, 99% или большее содержание IgG), содержат белки в концентрациях приблизительно от 20 г/л приблизительно до 200 г/л и содержат чрезвычайно низкие уровни обычных загрязнителей IVIG, таких как IgG, IgM, Фибриноген, Трансферрин, антикардиолипиновые антитела обладают низкой амидолитической активностью, активностью активатора прекалликреина и т.п. В еще одном аспекте предлагаются фармацевтические IgG-композиции и составы, пригодные для использования в IVIG-терапии. Фармацевтические составы имеют высокую чистоту (например, по меньшей мере 98, 99% или большее содержание IgG), содержат белки в концентрациях приблизительно от 20 до приблизительно 200 г/л и содержат чрезвычайно низкие уровни обычных загрязнителей IVIG,таких как IgG, IgM, фибриноген, трансферрин, антикардиолипиновые антитела, обладают низкой амидолитической активностью, PKA и т.п. В общем, фармацевтические композиции правильно составлены для внутривенного введения (например, для IVIG-терапии), подкожного введения иди внутримышечного введения. В другом аспекте в настоящем изобретении предлагаются способы лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у людей, нуждающихся в этом, способы, включающие введение фармацевтической композиции, описанной здесь. Неограничивающие примеры заболеваний и состояний, которые могут лечиться или контролироваться способами, предложенными здесь, включают аллогенную пересадку костного мозга, хроническую лимфоцитную лейкемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), ВИЧ у детей, первичные иммунодефицитные состояния, болезнь Кавасаки, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (ХВДП), пересадку почки реципиенту с высоким уровнем антител или от АВО-несовместимого донора, синдром хронической усталости, колит, вызванный Clostridiumdifficile, дерматомиозит и полимиозит, офтальмопатию Грейвса,синдром Гийена-Барре, мышечную дистрофию, миозит с включенными тельцами, синдром Ламберта-3 023446 Итона, красную волчанку, мультифокальную моторную нейропатию, множественный склероз (МС), тяжелую миастению, неонатальную аллоиммунную тромбоцитопению, инфекцию Парвовирусом В 19, пузырчатку, послетрансфузионную пурпуру, отторжение трансплантата почки, самопроизвольный аборт/выкидыш, синдром мышечной скованности, опсоклонус Миоклонус, тяжелый сепсис и септический шок у критически больных взрослых, токсический эпидермальный некролиз, хронический лимфолейкоз, множественную миелому, агаммаглобулинемию, сцепленную с Х-хромосомой, гипогаммаглобулинемию, первичный иммунодефицит, рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - концентрация IgG, определенная ELISA ( ) и нефелометрическимспособами, и общее содержание белка ( ), присутствующее в фильтрате смыва фракции II+III как функция количества мертвых объемов буфера, использованного для промывания фильтровального устройства после фильтрования; фиг. 2 - средняя активность активатора прекалликреина в растворимых фракциях осадка G после экстракции и осветления при рН 3,8-5,0, при добавлении уксусной кислоты в присутствии и в отсутствие обработки Аэросилом (кремния диоксидом); фиг. 3 - среднее содержание фибриногена в растворимых фракциях осадка G после экстракции и осветления при рН 3,8-5,0, при добавлении уксусной кислоты в присутствии и в отсутствие обработки Аэросилом (кремния диоксидом); фиг. 4 - средняя амидолитическая активность в растворимых фракциях осадка G после экстракции и осветления при рН 3,8-5,0, при добавлении уксусной кислоты в присутствии и в отсутствие обработки Аэросилом (кремния диоксидом); фиг. 5 - амидолитическая активность в растворимых фракциях осадка G, экстрагированных и осветленных при рН 3,8-7,8 после инкубирования в течение двух недель при 4 С ( ) или в течение дополнительной недели при комнатной температуре ( ); фиг. 6 - активность активатора прекалликреина в растворимых фракциях осадка G, экстрагированных и осветленных при рН 3,8-7,8; фиг. 7 - разность в чистоте фильтрата модифицированной фракции II+III с обработкой высоко дисперсным кремнеземом и без нее. Хроматограмма электрофореза на ацетате целлюлозы фильтрата модифицированной фракции II+III, (А) - осветленного только фильтровальным порошком и (В) - осветленного после обработки высокодисперсным кремнеземом; фиг. 8 - сдвиг рН с 6,9 супернатанта фракции II+III после добавления спирта-осадителя при крупномасштабном производстве IgG; фиг. 9 - количество ледяной уксусной кислоты versus рН в экстракционном буфере осадка модифицированной фракции II+III; фиг. 10 - количество ледяной уксусной кислоты versus рН в пост-промывочном буфере фильтра суспензии модифицированной фракции II+III. Определения При использовании здесь "антитело" обозначает полипептид, в большей степени кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина, либо его фрагменты, которые специфически связываются с аналитом (антигеном) и распознают его. Распознанные гены иммуноглобулина включают гены каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константных областей, а также большое число вариабельных генов иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются на типы каппа и лямбда. Тяжелые цепи подразделяются на типы гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Структурная единица примерного иммуноглобулина (антитела) составлена из двух пар полипептидных цепей, в каждой из пар имеется одна "легкая" (приблизительно 25 кДа) и одна "тяжелая" цепь(приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, в первую очередь, ответственную за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) обозначают эти легкую и тяжелую цепи соответственно. При использовании здесь термин "ультрафильтрация (УФ)" охватывает множество способов мембранной фильтрации, при которых гидростатическое давление продавливает жидкость через полупроницаемую мембрану. Суспендированные твердые частицы и растворенные высокомолекулярные молекулы удерживаются, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества проходят через мембрану. Этот процесс разделения часто используется для очистки и концентрирования растворов макромолекулярных (103-106 Да) веществ, в частности белковых растворов. Доступны разные мембраны для ультрафильтрации, в зависимости от размера удерживаемых молекул. Ультрафильтрация, как правило,характеризуется размером пор мембран 1-1000 кДа и рабочими давлениями 0,01-10 бар и особенно пригодна для отделения коллоидных веществ типа белков от низкомолекулярных веществ типа Сахаров и солей. При использовании здесь термин "диафильтрация" проводится с теми же мембранами, что и ульт-4 023446 рафильтрация, и представляет собой фильтрацию в тангенциальном потоке. При диафильтрации буфер вводится в рециркуляционный бак, а фильтрат удаляется из работы блока. В процессах, при которых продукт находится в ретентате (например, IgG), диафильтрация вымывает компоненты продукта в фильтрат, обменивая буферы и понижая концентрацию нежелательных видов. При использовании здесь термин "приблизительно" обозначает примерный интервал выше или ниже на 10% от указанной величины. Например, выражение "приблизительно 20%" охватывает интервал 18-22%. При использовании здесь термин "смешивание" обозначает действие по вызыванию равного распределения двух или более раздельных соединений или веществ путем любого перемешивания. В результате "смешивания" в значении, используемом в данной заявке, не требуется полное равное распределение всех компонентов раствора или суспензии. При использовании здесь термин "растворитель" охватывает любое жидкое вещество, способное растворять или диспергировать одно и более других веществ. Растворитель может быть неорганической природы, таким как вода, либо может быть органической жидкостью, такой как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т.д. При использовании термина "обработка растворителем/детергентом" растворитель обозначает органический растворитель (например, три-N-бутилфосфат),входящий в состав смеси растворителя и детергента, используемой для инактивации вирусов с липидной оболочкой, находящихся в растворе. При использовании здесь термин "детергент" используется в данной заявке взаимозаменяемо с термином "сурфактант" или "поверхностно-активное вещество". Сурфактанты, как правило, являются амфифильными органическими соединениями, т.е. содержащими обе гидрофобные группы ("хвосты") и гидрофильные группы ("головные части"), которые делают сурфактанты растворимыми как в органических растворителях, так и в воде. Сурфактанты могут классифицироваться в зависимости от наличия формально заряженных групп в их головных частях. Неионные сурфактанты не имеют заряженных групп в их головных частях, а в ионных сурфактантах головные части несут суммарный заряд. Цвиттерионные сурфактанты содержат головную часть с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры обычных сурфактантов включают: анионные (основанные на сульфатном, сульфонатном или карбоксилатном анионах): перфтороктаноат (PFOA или PFO), перфтороктансульфонат (PFOS), натрия додецилсульфат (SDS), аммония лаурилсульфат и другие алкилсульфатные соли, натрия лауретсульфат (также известный как натрия лаурилового эфира сульфат или SLES), алкилбензолсульфаонат; катионные (основанные на катионах четвертичного аммония): цетилтриметиламмония бромид (СТАВ),также называемый как гексадецилтриметиламмония бромид, и другие соли алкилтриметиламмония, цетилпиридиния хлорид (СРС), полиэтоксилированные жирные амины (РОЕА), бензалкония хлорид(ВАС), бензетония хлорид (BZT); длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: включая каприлат, каприловую кислоту, гептаноат, гексановую кислоту, гептановую кислоту, нонановую кислоту, декановую кислоту и т.д.; цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин; кокоамфоглицинат; неионные: алкилполи(этиленоксид),алкилфенолполи(этиленоксид),кополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксид) (в продаже известны как Полоксамеры или Полоксамины),алкилполиглюкозиды, включая октилглюкозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиновый спирт), кокамид МЕА, кокамид DEA, полисорбаты (Твин 20, Твин 80 и т.д.), детергенты Тритон и додецилдиметиламина оксид. При использовании здесь термин терапия со "внутривенными иммуноглобулинами" или "IVIG" относится в общем к терапевтическому способу внутривенного, подкожного или внутримышечного введения композиции IgG иммуноглобулинов пациенту для лечения количества состояний, таких как иммунодефицитные, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. IgG-иммуноглобулины, как правило, смешаны и приготовлены из плазмы. Могут использоваться целые антитела или фрагменты.IgG-иммуноглобулины могут находиться в больших концентрациях (например, более 10%) для подкожного введения или входить в состав для внутримышечного введения. Это особенно часто используется для специальных IgG-препаратов, изготовленных с превышающими средние титрами к специфическим антигенам (например, фактору Rho D, коклюшному токсину, столбнячному токсину, ботулиновому токсину, бешенству и т.д.). Для простоты обсуждения в данной заявке каждая IgG-композиция, составленная для подкожного или внутримышечного введения, также включена в термин "IVIG". Под "терапевтически эффективным количеством или дозой" или "достаточным/эффективным количеством или дозой" понимается доза, которая производит эффекты, для которых она вводится. Точная доза будет зависеть от цели лечения и будет определена специалистом в области техники по известным методикам (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, WilliamsWilkins). При использовании в данной заявке термин "распыление" обозначает способ доставки жидкого вещества в систему, например, во время этапа спиртового осаждения, такого как модифицированное фракционирование I по Cohn или этап осаждения II+III, в виде мелких капель или тумана из жидкого вещества. Распыление может быть достигнуто при помощи любого устройства, находящегося под давлением,-5 023446 такого как контейнер (например, аэрозольный баллон), оснащенный распылительной головкой или наконечником, и работающего в ручном или автоматическом режиме для превращения жидкости в мелкий туман. Как правило, распыление проводится в то время, когда система, в которую вводится жидкое вещество, постоянно двигается или иначе перемешивается, для того, чтобы обеспечить быстрое и равномерное распределение жидкости в системе. Детальное описание изобретенияI. Обзор. По стандартной практике в современной медицине стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно IgG) используются для лечения медицинских состояний трех основных классов: иммунодефицитных состояний, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также острых инфекций. Один из обычно используемых IgG-продуктов - иммуноглобулин для внутривенного введения или IVIG - составляется для внутривенного введения, например, с концентрацией в или приблизительно в 10% IgG. Концентрированные иммуноглобулины также могут быть составлены для подкожного или внутримышечного введения, например, с концентрацией в или приблизительно в 20% IgG. Для простоты обсуждения в данной заявке каждая IgG композиция, составленная для подкожного или внутримышечного введения, также включена в термин "IVIG". В определенных аспектах в настоящем изобретении предлагаются способы производства IVIG, повышающие итоговый выход продукта, а также позволяющие получить IVIG-композиции такого же или более высокого качества, а в некоторых случаях - более высоких концентраций. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагаются модифицированные способы разделения по Cohn, позволяющие снизить потерю IgG на одном или более этапов осаждения. В ином аспекте в настоящем изобретении предлагаются водные IgG композиции, полученные согласно улучшенным производственным способам, предложенным здесь. Преимуществом служит то, что эти композиции менее дороги в производстве в сравнении с продуктами, доступными в продаже в настоящее время в связи с повышенным выходом, который может быть достигнут способами, предложенными здесь. Помимо этого, эти композиции так же чисты, если не более чисты, как и композиции, произведенные промышленными методами. Важно, что эти композиции пригодны для использования в IVIGтерапии иммуннодефицитных состояний, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, и острых инфекций. В одном варианте воплощения концентрация IgG-композиции равна или примерно равна 10%IgG для внутривенного введения. В другом варианте воплощения концентрация IgG-композиции равна или примерно равна 20% для подкожного или внутримышечного введения. В ином аспекте в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции и составыIgG-композиций, полученные согласно улучшенным производственным принципам, представленным здесь. В определенных вариантах воплощения эти композиции и составы обладают улучшенными свойствами в сравнении с иными IVIG-композициями, имеющимися сейчас в продаже. Например, в определенных вариантах воплощения композиции и составы, предложенные здесь, стабильны в течение длительного периода времени. В еще одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения иммунодефицитных состояний, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, и острых инфекций, содержащий введениеIgG-композиции, изготовленной по улучшенным способам, представленным здесь.II. Способы производства IVIG. В общем, иммуноглобулиновые препараты по настоящему изобретению могут быть изготовлены из любых подходящих исходных материалов, например, восстановленной плазмы или исходной плазмы. В типичном примере кровь или плазма берется у здоровых доноров. Обычно кровь берется у того же вида животного, что и субъект, которому будет вводиться иммуноглобулиновый препарат (его обычно называют "гомологичными" иммуноглобулинами). Иммуноглобулины выделяются из крови при помощи пригодных процедур, таких как, например, осаждение (спиртовое разделение или разделение с полиэтиленгликолем), хроматографические методы (ионообменная хроматография, аффинная хроматография, иммуноаффинная хроматография и т.д.), ультрацентрифугирование и электрофорезное приготовление, и т.д.(1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); патенты США под номерами 5122373 и 5177194, раскрытие которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки для всех целей). Во множестве случаев иммуноглобулины изготавливаются из гамма-глобулин-содержащих продуктов, полученных способами спиртового разделения и/или ионообменной и аффинной хроматографии,хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, очищенная фракция Cohn II часто используется в качестве исходного материала для выделения иммуноглобулинов. Исходная паста фракции Cohn II, как правило, содержит приблизительно 95% IgG и включает четыре подтипа IgG. Различные подтипы присутствуют во фракции II приблизительно в тех же соотношениях, что и в смешанной человеческой плазме, из которой их получают. Фракцию II далее очищают перед добавлением в продукт,предназначенный для введения. Например, паста фракции II может быть растворена в холодном очищенном водном растворе спирта, а примеси будут удалены при осаждении и фильтровании. После последне-6 023446 го фильтрования суспензия иммуноглобулинов может быть подвергнута диализу или диафильтрации(например, на ультрафильтрационных мембранах с номинальным пределом молекулярного веса ниже или равным 100000 Да) для удаления спирта. Раствор может быть сконцентрирован или разбавлен для получения желаемой концентрации белка и может быть дополнительно очищен техниками, хорошо известными специалистам в области техники. Помимо этого, для обогащения каждым из конкретных подтипов иммуноглобулинов могут быть использованы дополнительные препаративные этапы. Например, хроматография на протеине А, протеине G или протеине Н с сефарозой может применяться для обогащения смеси иммуноглобулинов IgG либо конкретных подтипов IgG. Общие сведения см. в Harlow and Lane,Using Antibodies,Cold Spring HarborPress (1988) и патенте США 5180810, раскрытие которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки для всех целей. В отличие от способов, описанных выше, в одном аспекте настоящего изобретения предлагаются способы приготовления концентрированных IgG-композиций, в которых используется криосупернатантный исходный материал. В общем, в способах, предложенных здесь, используются и этапы модифицированного спиртового фракционирования по Cohn-Oncley, и ионообменная хроматография для обеспечения больших выходов IgG с сохранением такого же уровня качества, если не с повышением, что и у доступных ныне в продаже IVIG-препаратов. Например, в определенных вариантах воплощения предлагаются способы, обеспечивающие получение финальной нефасованной IgG-композиции, содержащей близко 75% от содержания IgG в сырье плазмы. Эти способы обеспечивают по меньшей мере 10-12% повышение общего выхода IgG в сравнении с имеющимися в отрасли в настоящее время способамиочистки. Например, имеются оценки того, что производственный процесс GAMMAGARD LIQUID обеспечивает конечный выход между приблизительно 60 и 65% содержания IgG от содержания в исходном материале. При этом способы, предложенные здесь, обеспечивают значительное улучшение в сравнении с имеющимися технологиями очистки IgG. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагается очищенная IgG-композиция,содержащая по меньшей мере 70% от содержания IgG в сырье плазмы. В ином варианте воплощения предлагается очищенная IgG-композиция, содержащая по меньшей мере 75% от содержания IgG в сырье плазмы. В иных вариантах воплощения очищенная IgG композиция, предложенная здесь, будет содержать по меньшей мере приблизительно 65% от содержания IgG в сырье плазмы или по меньшей мере приблизительно 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75% или более от содержания IgG в сырье плазмы. А. Способы с модифицированным спиртовым осаждением/фракционированием ионообменной хроматографией. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются улучшенные способы производства IgG композиций, пригодных для использования в IVIG-терапии. В целом эти способы дают IgG-препараты с большими выходами и сравнимой, если не большей, чистотой, что и имеющиеся в настоящее время способы, применяемые для производства имеющихся в продаже продуктов IVIG. В одном конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ изготовления композиции концентрированного IgG из плазмы, например 10% IVIG, способ, включающий проведение по меньшей мере одного этапа спиртового осаждения и по меньшей мере одного этапа ионообменной хроматографии. В частности, несколько этапов улучшенного вышерасположенного процесса отличаются от более ранних процессов, например, использованием 25%-ного этанола при низких температурах, добавлением этанола распылением, корректировкой рН распылением и применением тонкоизмельченных частиц диоксида кремния. В определенном варианте воплощения способ включает этапы: (а) осаждения криосупернатантной плазменной фракции на первом этапе осаждения при помощи приблизительно 6-10%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением супернатанта, обогащенного IgG, (б) осаждения IgG из супернатанта при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта при более низкой температуре и рН приблизительно 6,7-7,3 с получением первого осадка, (в) ресуспендирования первого осадка, полученного на этапе (б), с получением суспензии, (г) обработки детергентом суспензии, полученной на этапе (в), (д) осаждения IgG из суспензии при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением второго осадка, (е) ресуспендирования второго осадка, полученного на этапе (д), (ж) обработки суспензии, полученной на этапе (е), растворителем и/или детергентом, и (з) проведения по меньшей мере одного разделения ионообменной хроматографией с получением композиции с концентрированным IgG. В одном варианте воплощения способ, помимо этого, включает обработку суспензии, полученной на этапе (в), тонкоизмельченным диоксидом кремния (SiO2) и фильтрование раствора перед этапом (г). В одном варианте воплощения предлагается способ получения обогащенной концентрированнойIgG-композиции из плазмы, способ, содержащий этапы: (а) доведения рН криосупернатантной плазменной фракции до или приблизительно до 7,0, (б) доведения концентрации этанола в криосупернатантной плазменной фракции этапа (а) до или приблизительно до 25% (об./об.) при температуре, между или рав-7 023446 ной приблизительно -5 и приблизительно -9 С, с получением, таким образом, смеси, причем концентрация этанола может корректироваться распылением, (в) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (б), (г) ресуспендирования осадка, полученного на этапе (в), в буфере, содержащем фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом приблизительно 400-700 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением суспензии, (д) смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией, полученной на этапе (г), в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, (е) фильтрования суспензии на фильтр-прессе с получением фильтрата, (ж) промывания фильтр-пресса по меньшей мере 3 мертвыми объемами фильтр-пресса буфера, содержащего фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, равным или приблизительно равным 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением промывочного раствора, (з) смешивания фильтрата, полученного на этапе (е), с промывочным раствором, полученным на этапе (ж), с получением раствора, и обработки раствора поверхностно-активным веществом, (и) доведения рН раствора, полученного на этапе (з) , до уровня или приблизительно 7,0 и добавления этанола до финальной концентрации, равной или приблизительно равной 25%, с получением осадка, причем концентрация этанола и/или рН могут корректироваться распылением, (к) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (и), (л) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или поверхностно-активное вещество, и выдерживания раствора по меньшей мере в течение 60 мин, (м) прохождения раствора с этапа (л) через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования в элюат белков, абсорбированных в колонке, (н) прохождения элюата, полученного на этапе (м), через анионообменную хроматографическую колонку для получения эффлюента (т.е. фильтрата), (о) прохождения эффлюента с этапа (н) через нанофильтр для получения нанофильтрата, (п) прохождения нанофильтрата, полученного на этапе (о), через ультрафильтрационную мембрану для получения ультрафильтрата; и (р) диафильтрации ультрафильтрата, полученного на этапе (п), против диафильтрационного буфера для получения диафильтрата с концентрацией белка между приблизительно 8% и приблизительно 22% (в./об.) с получением композиции концентрированногоIgG. В одном варианте воплощения температура на этапе (б) равна или приблизительно равна -7 С. В одном конкретном варианте воплощения суспензионный буфер на этапе (г) корректируется приблизительно 600 мл ледяной уксусной кислоты. В определенных вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате составляет приблизительно 8-12%, например приблизительно 8 или приблизительно 9, 10, 11 либо 12%. В предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 10%. В другом предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 11%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 12%. В других вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна приблизительно 13-17%, например, приблизительно 13% либо приблизительно 14, 15, 16 или 17%. В еще одних вариантах воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна приблизительно 18-22%, например, приблизительно 18% либо приблизительно 19, 20, 21 или 22%. В предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 20%. В другом предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 21%. В еще одном предпочтительном варианте воплощения концентрация белка в диафильтрате будет равна или приблизительно равна 22%. В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения способы, предложенные здесь, могут включать усовершенствования двух и более этапов процесса разделения, описанного выше. Например, воплощения могут включать усовершенствования первого этапа осаждения, модифицированного этапа осаждения фракции II+III, модифицированного этапа растворения фракции II+III и/или модифицированного этапа фильтрования суспензии фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствование первого этапа осаждения заключается в корректировке рН раствора после добавления спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование первого этапа осаждения заключается в поддержании рН раствора при добавлении спирта. В другом родственном варианте воплощения усовершенствование первого этапа осаждения заключается в поддержании рН раствора в течение периода инкубирования осаждения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В определенных вариантах воплощения первый этап осаждения может быть усовершенствован внедрением более чем одного из этих улучшений. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на данном этапе, будут понятны из раздела, представленного ниже, в котором обсуждается первый этап осаждения - модифицированное разделение I. Внедрением одного или более усовершенствований, описанных выше, понижается количество потерянного IgG в осажденной фракции на первом этапе осаждения и/или понижается часть IgG, которая необратимо денатурируется во время этапа осаждения. В одном варианте воплощения усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракцииII+III заключается в добавлении спирта путем распыления. В ином варианте воплощения усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III заключается в добавлении рНмодифицирующего агента путем распыления. В другом варианте воплощения усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III заключается в корректировке рН раствора после добавле-8 023446 ния спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III заключается в поддержании рН раствора при добавлении спирта. В другом родственном варианте воплощения усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III заключается в поддержании рН раствора в течение периода инкубирования осаждения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В другом аспекте этап осаждения модифицированной фракции II+III усовершенствован повышением концентрации спирта до или приблизительно до 25%. В еще одном варианте воплощения этап осаждения модифицированной фракции II+III усовершенствован понижением температуры инкубирования до приблизительно -7 С-(-9 С). В определенных вариантах воплощения этап осаждения модифицированной фракции II+III может быть усовершенствован внедрением более чем одного из этих улучшений. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на данном этапе, будут понятны из раздела, представленного ниже, в котором обсуждается второй этап осаждения - модифицированное разделение II+III. Внедрением одного или более усовершенствований, описанных выше, понижается количество потерянного IgG в супернатантной фракции на этапе осаждения модифицированной фракции II+III и/или понижается часть IgG, которая необратимо денатурируется во время этапа осаждения. В одном варианте воплощения усовершенствование этапа растворения модифицированной фракцииII+III достигается повышением содержания ледяной уксусной кислоты в буфере для растворения до приблизительно 0,06%. В другом варианте воплощения усовершенствование этапа растворения модифицированной фракции II+III достигается поддержанием рН раствора в течение периода инкубирования растворения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В другом варианте воплощения усовершенствование этапа растворения модифицированной фракции II+III достигается смешиванием тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией фракции II+III до фильтрования. В определенных вариантах воплощения этап растворения модифицированной фракции II+III может быть усовершенствован внедрением более чем одного из этих улучшений. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на данном этапе, будут понятны из раздела, представленного ниже, в котором обсуждается этап растворения модифицированной фракции II+III - экстракция осадка модифицированной фракции II+III. При внедрении одного или более усовершенствований, описанных выше, повышается количество IgG, извлекаемого в суспензии фракции II+III и/или снижается количество примесей в суспензии фракции II+III. Примерное усовершенствование, сделанное на этапе фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III, реализовано пост-промывкой фильтра по меньшей мере приблизительно 3,6 мертвых объемов буфера для растворения, содержащего или приблизительно содержащего 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. Дальнейшие усовершенствования, которые могут быть реализованы на данном этапе, будут понятны из раздела, представленного ниже, в котором обсуждается этап фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III - предварительная обработка и фильтрование суспензии модифицированной фракции II+III. При внедрении одного или более усовершенствований, описанных выше, снижается количество IgG, утрачиваемого на этапе фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В одном варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения и этапа осаждения модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения и этапа растворения модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III и этапа растворения модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование этапа растворения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения, этапа осаждения модифицированной фракции II+III и этапа растворения модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения, этапа осаждения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения, этапа растворения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование этапа осаждения модифицированной фракции II+III, этапа растворения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения способ может содержать усовершенствование первого этапа осаждения, этапа осаждения модифицированной фракции II+III, этапа растворения модифицированной фракции II+III и этапа фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах воплощения одно усовершенствование процесса в способах очисткиIgG, предложенных здесь, содержит добавление распылением одного и более растворов, которые, иначе,вводились во фракцию плазмы струйным добавлением. Например, в определенных вариантах воплощения усовершенствование процесса содержит добавление спирта (например, этанола) во фракцию плазмы для целей осаждения одного и более видов белков путем распыления. В других вариантах воплощения растворы, которые могут добавляться к фракции плазмы распылением, включают, не ограничиваясь перечисленным, рН-модифицирующий раствор, раствор растворителя, раствор детергента, буфер для разбавления, раствор для изменения проводимости и т.п. В предпочтительном варианте воплощения один и более этапов спиртового осаждения проводятся добавлением спирта к фракции плазмы путем распыления. Во втором предпочтительном варианте воплощения один и более этапов корректировки рН проводятся добавлением рН-модифицирующего раствора к фракции плазмы путем распыления. В определенных вариантах воплощения другое усовершенствование процесса, которое может быть скомбинировано с любым другим усовершенствованием процесса, содержит корректировку рН осаждаемой фракции плазмы после и/или одновременно с добавлением осаждающего агента (например, спирта или полиэтиленгликоля). В определенных вариантах воплощения предлагается усовершенствование процесса, при котором рН активно осаждаемой фракции плазмы поддерживается в течение всего этапа инкубирования или выдерживания осаждения длительными контролем и корректировкой рН. В предпочтительных вариантах воплощения корректировка рН производится добавлением рН-модифицирующего раствора путем распыления. В других вариантах воплощения другое усовершенствование процесса, которое может быть скомбинировано с любым другим усовершенствованием процесса, содержит использование этапа обработки тонкоизмельченным кремнеземом для удаления примесей. 1. Приготовление криосупернатантной плазмы. Исходный материал, используемый для изготовления концентрированных IgG-композиций, как правило, состоит либо из восстановленной плазмы (т.е. плазмы, выделенной из цельной крови ex vivo) или исходной плазмы (т.е. плазмы, полученной при плазмаферезе). Процесс очистки, как правило, начинается с оттаивания ранее замороженной объединенной плазмы, проанализированной ранее на безопасность и параметры качества. Оттаивание обычно проводится при температуре не выше 6 С. После полного оттаивания при низкой температуре замороженной плазмы проводится центрифугирование в холоде(например, 6 С) для отделения твердых криопреципитатных частиц от жидкого супернатанта. Альтернативно этап отделения может быть произведен путем фильтрования вместо центрифугирования. Жидкий супернатант (также называемый "криосупернатантной плазмой" после удаления из свежеразмороженной плазмы нерастворимых при низкой температуре белков) передается на следующий этап. Различные дополнительные действия могут быть предприняты в этот момент для выделения ингибиторов разрушения фактора восемь (FEIBA), комплекса фактора IX, концентрата фактора VII или комплекса антитромбина III. 2. Первый процесс осаждения - модифицированное фракционирование I. На этом этапе криосупернатантную плазму, как правило, охлаждают до приблизительно 01 С, рН доводят до приблизительно 7,0-7,5, предпочтительно до приблизительно 7,1-7,3, наиболее предпочтительно до приблизительно 7,2. В одном варианте воплощения рН криосупернатантной плазмы дводоят до рН, равного или приблизительно равного 7,2. Затем при перемешивании плазмы добавляют предварительно охлажденный этанол до целевой концентрации этанола, равной или приблизительной равной 8% об./об. Одновременно с этим далее понижают температуру до приблизительно -4-0 С. В предпочтительном варианте воплощения температуру понижают до или приблизительно до -2 С для осаждения таких примесей как 2-макроглобулин, 1A- и 1 С-глобулин, фибриноген и фактор VIII. Как правило, процесс осаждения включает время выдержки в течение по меньшей мере приблизительно 1 ч, хотя могут использоваться и более короткие или длинные периоды выдержки. Затем центрифугированием, фильтрованием или иным пригодным способом собирают супернатант (супернатант I), в идеале содержащий присутствующие в криосупернатантной плазме IgG полностью. По сравнению с обычными способами, применяемыми для первого этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), в настоящем изобретении предлагаются в некоторых воплощениях способы, которые повышают выходы IgG во фракции супернатант I. В одном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается добавлением спирта распылением. В другом варианте воплощения повышенный выход IgG достигается добавлением рН-модифицирующего агента распылением. В еще одном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается корректировкой рН раствора после добавления спирта. В родственном варианте воплощения повышенный выход IgG достигается корректировкой рН раствора во время добавления спирта. В одном конкретном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее коли- 10023446 чество IgG теряется в осажденной фракции во время первого этапа осаждения. Например, в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в осажденной фракции во время первого этапа осаждения в сравнении с количеством IgG, которое утрачивается во время первого этапа осаждения по 6 протоколу способа по Cohn. В определенных вариантах воплощения усовершенствование процесса реализуется доведением рН раствора до приблизительно 7,0-7,5 после добавления спирта-осадителя. В других вариантах воплощения рН раствора доведением до приблизительно 7,1-7,3 после добавления спирта-осадителя. В еще одних вариантах воплощения рН раствора доводится до приблизительно 7,0 или до приблизительно 7,1, 7,2, 7,3,7,4 либо 7,5 после добавления спирта-осадителя. В конкретном варианте воплощения рН раствора доводится до приблизительно 7,2 после добавления спирта-осадителя. В связи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в осажденной фракции во время первого этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируется до, а не после добавления спирта-осадителя. В одном варианте воплощения рН поддерживается при желаемом рН в течение периода выдержки или инкубирования осаждения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. В других определенных вариантах воплощения улучшение процесса реализуется добавлением спирта-осадителя и/или раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В связи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в осажденной фракции во время первого этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения,при котором спирт и/или раствор для корректировки рН вводятся струйным добавлением. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. В еще одних определенных вариантах воплощения усовершенствование процесса реализуется доведением рН раствора до приблизительно 7,0-7,5. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора доводится до приблизительно 7,1-7,3. В других вариантах воплощения рН раствора доводится до или приблизительно до 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 либо 7,5 после добавления спирта-осадителя и добавлением раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В конкретном варианте воплощения рН раствора корректируется до или приблизительно до 7,2 после добавления спирта-осадителя и добавлением раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. 3. Второй процесс осаждения - модифицированное фракционирование II+III. Для дальнейшего повышения содержания IgG и чистоты фракционирования супернатант I подвергают второму этапу осаждения, представляющему собой модифицированное фракционирование фракцииII+III по Cohn-Oncley. В общем, рН раствора доводится до рН приблизительно 6,6-6,8. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора доводится до или приблизительно до 6,7. Затем к раствору при перемешивании добавляется спирт, предпочтительно этанол, до итоговой концентрации приблизительно 20-25% (об./об.), чтобы осадить фракцию IgG. В предпочтительном варианте воплощения спирт добавляется до итоговой концентрации или приблизительно 25% (об./об.), чтобы осадить фракцию IgG. Как правило, в таких условиях не осаждаются примеси, такие как 1-липопротеин, 1-антитрипсин, Gcглобулины, 1 Х-гликопротеин, гаптоглобулин, церулоплазмин, трансферрин, гемопексин, фракция фактора Кристмаса, тироксинсвязывающий глобулин, холинэстераза, гипертензиноген и альбумин. До или одновременно с добавлением спирта раствор дополнительно охлаждается до приблизительно -7 С-(-9 С). В предпочтительном варианте воплощения раствор охлаждается до температуры включительно или приблизительно -7 С. По завершении добавления спирта рН раствора незамедлительно доводится до приблизительно 6,8-7,0. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора доводится до или приблизительно до 6,9. Как правило, процесс осаждения включает время выдержки в течение по меньшей мере приблизительно 10 ч, хотя могут использоваться и более короткие или длинные периоды выдержки. Затем центрифугированием, фильтрованием или иным пригодным способом отделяют осадок(модифицированная фракция II+III), в идеале содержащий по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% присутствующего в криосупернатантной плазме IgG. По сравнению с обычными способами, применяемыми для второго этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), в настоящем изобретении предлагаются в некоторых воплощениях способы, которые повышают выходы IgG в осадке модифицированной фракции II+III. В родственном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагаются способы, которые понижают потерю IgG в модифицированном супернатанте II+III. По сравнению с обычными способами, применяемыми для второго этапа фракционирования криосупернатантной плазмы (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), в настоящем изобретении предлагаются в некоторых воплощениях способы, которые повышают выходы IgG в осадке модифицированной фракцииII+III. В одном варианте воплощения усовершенствование реализуется добавлением спирта путем распыления. В ином варианте воплощения усовершенствование реализуется добавлением рНмодифицирующего агента путем распыления. В другом варианте воплощения усовершенствование реализуется корректировкой рН раствора после добавления спирта. В родственном варианте воплощения усовершенствование реализуется корректировкой рН раствора во время добавления спирта. В другом варианте воплощения усовершенствование реализуется повышением концентрации спирта (например,этанола) до приблизительно 25% (об./об.). В еще одном варианте воплощения усовершенствование реализовано понижением температуры на этапе осаждения до приблизительно -7 С-(-9 С). В предпочтительном варианте воплощения усовершенствование реализуется повышением концентрации спирта (например, этанола) до приблизительно 25% (об./об.) и понижением температуры до приблизительно -7 С-(9 С). Для сравнения, и Cohn et al., и Oncley et al. проводили осаждение при -5 С, a Oncley et al. использовали 20% спирт для снижения количества примесей в осадке. Преимуществом способов, представленных здесь, служит то, что они позволяют достичь максимального выхода IgG без высокого загрязнения конечного продукта. Было открыто, что если рН раствора доводится до рН приблизительно 6,9 до добавления спиртаосадителя, то рН раствора сдвигается от 6,9 до приблизительно 7,4-7,7, в частности, вследствие осаждения белка (см. фиг. 8). По мере того как рН раствора сдвигается от 6,9, условия для осаждения IgG становятся менее благоприятными, а для осаждения определенных примесей - более благоприятными. Преимуществом служит то, что изобретатели обнаружили, что корректировка рН раствора после добавления спирта-осадителя обеспечивает большее процентное количество IgG в осадке фракции II+III. Соответственно в одном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции во время модифицированного этапа осаждения фракции II+III. Другими словами, повышенное процентное количество исходного IgG присутствует в осадке фракции II+III. В определенных вариантах воплощения усовершенствование процесса реализуется корректировкой рН раствора до приблизительно 6,7-7,1 сразу после или во время добавления спиртаосадителя. В другом варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется поддержанием рН раствора на уровне приблизительно 6,7-7,1 продолжительно во время инкубационного периода осаждения. В других вариантах воплощения рН раствора доводится до приблизительно 6,8-7,0 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя, либо до рН приблизительно 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 или 7,1 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя. В конкретном варианте воплощения рН раствора доводится до приблизительно 6,9 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя. В определенных вариантах воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 6,8-7,0 продолжительно во время инкубационного периода осаждения, либо на уровне РН приблизительно 6,9 продолжительно во время инкубационного периода осаждения. В связи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции во время второго этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируется до, а не после добавления спирта-осадителя, или аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора не поддерживается в течение всего инкубационного периода осаждения. В одном варианте воплощения рН поддерживается на желаемом уровне рН в течение периода выдержки или инкубирования осаждения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. В другом варианте воплощения улучшение процесса реализуется добавлением спирта-осадителя и/или раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В связи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции во время второго этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения, при котором спирт и/или раствор для корректировки рН вводятся струйным добавлением. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. В другом варианте воплощения усовершенствование процесса реализовано проведением этапа осаждения при температуре приблизительно -7 С-(-9 С). В одном варианте воплощения этап осаждения проводится при температуре, равной или приблизительно равной -7 С. В ином варианте воплощения этап осаждения проводится при температуре, равной или приблизительно равной -8 С. В другом варианте воплощения этап осаждения проводится при температуре, равной или приблизительно равной -9 С. В определенных вариантах воплощения концентрация спирта на этапе осаждения равна приблизительно 23-27%. В предпочтительном варианте воплощения концентрация спирта равна приблизительно 24-26%. В другом предпочтительном варианте воплощения концентрация спирта равна или приблизительно равна 25%. В других вариантах воплощения концентрация спирта может быть равна или приблизительно равна 23, 24, 25, 26 или 27%. В конкретном варианте воплощения второй этап осаждения проводится при температуре, равной или приблизительно равной -7 С, и концентрации спирта, равной или приблизительно равной 25%. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. Эффект от повышения концентрации спирта на втором осаждении от 20%, как было у Oncley et al.,supra, до 25% и от понижения инкубационной температуры от -5 С, как было в способах Cohn и Oncley,до или приблизительно до -7 С, заключается в 5-6% повышении содержания IgG в осадке модифицированной фракции II+III. В другом варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется доведением рН раствора до приблизительно 6,7-7,1, предпочтительно до или приблизительно до 6,9, сразу же после или во время добавления спирта-осадителя, поддержанием рН раствора на уровне РН приблизительно 6,7-7,1, предпочтительно на уровне или приблизительно на уровне 6,9, непрерывной корректировкой рН во время инкубационного периода осаждения, а также добавлением спирта-осадителя и/или раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В другом варианте воплощения усовершенствование процесса реализовано проведением этапа осаждения при температуре приблизительно -7 С-(-9 С), предпочтительно при или приблизительно при -7 С, и осаждением IgG спиртом с концентрацией приблизительно 23-27%, предпочтительно равной или приблизительно равной 25%. В еще одном конкретном варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется включением всех усовершенствований модифицированной фракции II+III, представленных выше. В предпочтительном варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется осаждением IgG при температуре,равной или приблизительно равной -7 С, этанолом с концентрацией, равной или приблизительно равной 25%, добавляемым распылением с последующим доведением рН раствора до или приблизительно до 6,9,после добавления спирта-осадителя. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживается на или приблизительно на уровне 6,9 в течение всего периода инкубирования или выдерживания осаждения. 4. Экстракция осадка модифицированной фракции II+III. Чтобы растворить IgG, содержащийся в осадке модифицированной фракции II+III, используется буфер холодной экстракции для ресуспендирования осадка фракционирования II+III в типичном соотношении 1 часть осадка на 15 частей экстракционного буфера. Могут использоваться другие соотношения ресуспендирования, например, от приблизительно 1:8 до приблизительно 1:30, либо от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:20, либо от приблизительно 1:12 до приблизительно 1:18, либо от приблизительно 1:13 до приблизительно 1:17, либо от приблизительно 1:14 до приблизительно 1:16. В определенных вариантах воплощения соотношение ресуспендирования может быть равно приблизительно 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27,1:28, 1:29, 1:30 или выше. Растворы, пригодные для экстракции модифицированного осадка II+III, обычно будут иметь рН приблизительно 4,0-5,5. В определенных вариантах воплощения раствор будет иметь рН приблизительно 4,5-5,0, в других вариантах воплощения экстракционный раствор будет иметь рН приблизительно 4,0,4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 либо 5,5. В предпочтительном варианте воплощения рН экстракционного буфера будет равно или приблизительно равно 4,5. В другом предпочтительном варианте воплощения рН экстракционного буфера будет равно или приблизительно равно 4,7. В ином предпочтительном варианте воплощения рН экстракционного буфера будет равно или приблизительно равно 4,9. В общем, эти требования по рН могут быть удовлетворены при использовании буферного агента, выбранного из, например, ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буферов, как правило, варьируются в интервале приблизительно 5-100 мМ, либо приблизительно 10-50 мМ, либо приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100мМ буферного агента. Экстракционный буфер будет предпочтительно иметь проводимость от приблизительно 0,5 мСсм 1 до приблизительно 2,0 мСсм 1. Например, в определенных вариантах воплощения проводимость экстракционного буфера будет равна приблизительно 0,5 мСсм 1 либо приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или приблизительно 2,0 мСсм 1. Специалисту в данной области техники известно, как получить экстракционные буферы с необходимой проводимостью. В одном конкретном варианте воплощения примерный экстракционный буфер может содержать одноосновный натрия фосфат в концентрации, равной или приблизительно равной 5 мМ, и ацетат в концентрации, равной или приблизительно равной 5 мМ с рН, равным или приблизительно равным 4,50,2,и проводимостью, равной или приблизительно равной 0,7-0,9 мС/см. В общем, экстракцию проводят при приблизительно 0-10 С или при приблизительно 2-8 С. В определенных вариантах воплощения экстракцию можно проводить при приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 или 10 С. В конкретном варианте воплощения экстракцию проводят при приблизительно 2-10 С. Как правило, процесс экстракции продолжается приблизительно 60-300 мин либо приблизительно 120-240 мин, либо приблизительно 150-210 мин при непрерывном перемешивании. В определенных вариантах воплощения экстракционный процесс будет продолжаться приблизительно 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или приблизительно 300 мин. В предпочтительном варианте воплощения экстракционный процесс будет продолжаться по меньшей мере 160 мин при непрерывном перемешивании. Было обнаружено, что при использовании экстракционного буфера, содержащего 5 мМ одноосновного натрия фосфата, 5 мМ ацетата и 0,051-0,06% ледяной уксусной кислоты (об./об.), может быть достигнуто значительное повышение выхода финальной IgG-композиции без подвергания риску чистоты конечного продукта. Корреляция количества уксусной кислоты с рН экстракционного буфера показана на фиг. 9. В предпочтительном варианте воплощения осадок фракции II+III экстрагируется при соотношении пасты к буферу, равном или приблизительно равном 1:15, при рН, равном или приблизительно равном 4,50,2. Преимуществом служит то, что было обнаружено, что в сравнении с используемым в настоящее время производственным процессом GAMMAGARD LIQUID (BaxterHealthcare), в котором применяется экстракционный буфер, содержащий 5 мМ одноосновного натрия фосфата, 5 мМ ацетата и 0,051% ледяной уксусной кислоты (об./об.), при повышении содержания ледяной уксусной кислоты до или приблизительно до 0,06% (об./об.), может быть достигнуто значительное повышение выхода финальной IgGкомпозиции. По сравнению со способами, ранее применяемыми для экстракции осадка, полученного на втором этапе осаждения (GAMMAGARD LIQUID), в настоящем изобретении предлагаются в некоторых воплощениях способы, которые повышают выходы IgG в суспензии модифицированной фракцииII+III. В одном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество IgG теряется в нерастворенной фракции осадка модифицированной фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствование процесса реализовано экстракцией осадка модифицированной фракции II+III в соотношении 1:15 (осадок к буферу) раствором, содержащим 5 мМ одноосновного натрия фосфата, 5 мМ ацетата и 0,06% ледяной уксусной кислоты (об./об.). В другом варианте воплощения усовершенствование реализуется поддержанием рН раствора в течение всей продолжительности процесса экстракции. В одном варианте воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 4,1-4,9 в течение всей продолжительности процесса экстракции. В предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 4,2-4,8 в течение всей продолжительности процесса экстракции. В более предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 4,3-4,7 в течение всей продолжительности процесса экстракции. В ином предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 4,4-4,6 в течение всей продолжительности процесса экстракции. В другом предпочтительном варианте воплощения рН раствора поддерживается на уровне, равном или приблизительно равном 4,5, в течение всей продолжительности процесса экстракции. В другом аспекте усовершенствование относится к способу, по которому большее количество IgG переходит в раствор из осадка фракции II+III на этапе растворения фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется растворением осадка фракции II+III в буфере для растворения, содержащем 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. В другом варианте воплощения усовершенствование относится к способу, по которому количество примесей снижается после растворения IgG из осадка фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствование процесса реализовано смешиванием тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией фракции II+III в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин. 5. Подготовка и фильтрование суспензии модифицированной фракции II+III. Для удаления нерастворенной фракции осадка модифицированной фракции II+III (т.е. фильтровального остатка модифицированной фракции II+III) суспензию фильтруют, как правило, глубинным фильтрованием. Глубинные фильтры, которые могут использоваться в способах, предложенных здесь,включают металлические, стеклянные, керамические, органические (например, с диатомовой землей) глубинные фильтры и т.п. Примеры подходящих фильтров включают, не ограничиваясь перечисленным,фильтры Cuno 50SA, Cuno 90SA и Cuno VR06 (Cuno). Альтернативно этап отделения может быть произведен путем центрифугирования вместо фильтрования. Хотя усовершенствования производственного процесса, описанные выше, минимизируют потериIgG на первых этапах процесса очистки, критически важных примесей, включая активность активатора прекалликреина, амидолитическая активность и содержание фибриногена, гораздо больше, например,при экстракции пасты II+III при рН 4,5 или 4,6 в сравнении с экстракцией при рН около 4,9-5,0 (см. примеры 2-5). Было обнаружено, что чистота IgG-композиции может быть существенно повышена добавлением подготовительного этапа до фильтрования/центрифугирования, что позволяет противодействовать попаданию примесей при экстракции способами, описанными здесь. В одном варианте воплощения этот этап подготовки включает добавление частиц тонкоизмельченного диоксида кремния (например, высокодисперсного кремнезема Aerosil) с последующим 40-80-минутным инкубационным периодом, во время которого суспензию постоянно перемешивают. В определенных вариантах воплощения инкубационный период будет равен приблизительно 50-70 мин, либо приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80 или более минут. Обычно обработка будет проводиться при приблизительно 0-10 С или при приблизительно 2-8 С. В определенных вариантах воплощения обработку можно проводить при приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 С. В конкретном варианте воплощения обработку проводят при приблизительно 2-10 С. Влияние обработки высокодисперсным кремнеземом продемонстрировано результатами в примере 17. В этом примере осадок фракции II+III суспендируют и разделяют на два образца, один из которых осветляется только фильтровальным порошком перед фильтрованием (фиг. 7 А), а другой обрабатывается высокодисперсным кремнеземом перед добавлением фильтровального порошка и фильтрованием (фиг. 7 В). Как следует из хроматограмм и количественных данных, образец фильтрата, предварительно обработанного высокодисперсным кремнеземом, обладает более высокой чистотой IgG в сравнении с образ- 14023446 цом, обработанным только фильтровальным порошком (68,8% vs. 55,7%; табл. 17 и 18 для сравнения соответственно). В определенных вариантах воплощения высокодисперсный кремнезем добавляется в концентрации от приблизительно 20 г/кг пасты II+III до приблизительно 100 г/кг пасты II+III (т.е. для осадка модифицированной фракции II+III, экстрагированного в соотношении 1:15, высоко дисперсный кремнезем следует добавлять в концентрации от приблизительно 20 г/16 кг суспензии II+III до приблизительно 100 г/16 кг суспензии II+III, либо в итоговой концентрации от приблизительно 0,125% (вес./вес.) до приблизительно 0,625% (вес./вес В определенных вариантах воплощения высокодисперсный кремнезем может добавляться в концентрации приблизительно 20 г/кг пасты II+III либо приблизительно 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 г/кг пасты II+III. В одном конкретном варианте воплощения высокодисперсный кремнезем (например, Aerosil 380 или аналогичный) добавляется к суспензии модифицированной фракции II+III до итоговой концентрации приблизительно в 40 г/16 кг II+III. Смешивание происходит при приблизительно 2-8 С в течение по меньшей мере 50-70 мин. В определенных вариантах воплощения фильтровальный порошок, например, Celpure С 300(Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals) будет добавляться после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации. Фильтровальный порошок может добавляться до итоговой концентрации от приблизительно 0,1 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III либо от приблизительно 0,2 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, либо от приблизительно 0,3 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,05 кг/кг пасты II+III. В определенных вариантах воплощения фильтровальный порошок будет добавляться до итоговой концентрации приблизительно 0,1 кг/кг пастыII+III либо приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 кг/кг пасты II+III. Значительная часть IgG утрачивалась на этапе фильтрации производственного процесса GAMMAGARD LIQUID. Было обнаружено, что текущие способы послефильтрационной промывки, в которых используется 1,8 мертвых объемов суспензионного буфера для промывания узлов и линий фильтрпресса, недостаточны для максимального извлечения IgG на этом этапе. Неожиданно было обнаружено,что по меньшей мере 3,0 мертвых объемов, предпочтительно 3,6 мертвых объемов, суспензионного буфера требуется для эффективного извлечения общего IgG из осветленной суспензии модифицированной фракции II+III (см. пример 12 и фиг. 1). В определенных вариантах воплощения фильтр-пресс может быть промыт любым пригодным суспензионным буфером. В конкретном варианте воплощения промывочный буфер будет содержать, например, 5 мМ одноосновного натрия фосфата, 5 мМ ацетата и 0,015% ледяной уксусной кислоты (об./об.). В одном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество IgG теряется на этапе фильтрования суспензии фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется пост-промывкой фильтра по меньшей мере 3,6 мертвых объемов буфера для растворения, содержащего 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. Связь количества ледяной уксусной кислоты и рН пост-промывочного буфера представлена на фиг. 10. В одном варианте воплощения рН пост-промывочного экстракционного буфера равен приблизительно 4,6-5,3. В предпочтительном варианте воплощения рН пост-промывочного экстракционного буфера равен приблизительно 4,7-5,2. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН пост-промывочного экстракционного буфера равен приблизительно 4,8-5,1. В еще одном предпочтительном варианте воплощения рН постпромывочного экстракционного буфера равен приблизительно 4,9-5,0. По сравнению со способами, ранее применяемыми для осветления суспензии, полученной на втором этапе осаждения (GAMMAGARD LIQUID), в настоящем изобретении предлагаются в некоторых воплощениях способы, которые повышают выходы IgG и чистоту суспензии фракции II+III. В одном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество IgG теряется в фильтровальном осадке модифицированной фракции II+III. В другом аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество примесей обнаруживается в осветленной суспензии фракции II+III. В одном варианте воплощения усовершенствования процесса реализованы включением обработки высокодисперсным кремнеземом до осветления фильтрованием или центрифугированием суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах воплощения обработка высокодисперсным кремнеземом будет включать добавление в количестве от приблизительно 0,1 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,07 кг/кг пасты II+III либо от приблизительно 0,2 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,06 кг/кг пасты II+III, либо от приблизительно 0,3 кг/кг пасты II+III до приблизительно 0,05 кг/кг пастыII+III, либо приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 кг/кг пасты II+III, и смесь будет инкубирована приблизительно 50-70 мин или приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или более минут при температуре приблизительно 2-8 С. В другом варианте воплощения усовершенствования процесса реализуются включением обработки кремнеземом, нанесенным на пленку, что понижает уровни остаточного фибриногена, амидолитической активности и/или активности активатора прекалликреина. В другом варианте воплощения усовершенствования процесса реализуются промыванием глубинного фильтра приблизительно 3-5 объемами мертвого объема фильтра по завершении этапа фильтрова- 15023446 ния суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах воплощения фильтр будет промыт приблизительно 3,5-4,5 объемами либо по меньшей мере приблизительно 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9,3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 объемами мертвого объема фильтра. В конкретном варианте воплощения фильтр-пресс будет промыт по меньшей мере приблизительно 3,6 мертвых объемов суспензионного буфера. 6. Обработка детергентом. Для удаления дополнительных примесей из фильтрата модифицированной фракции II+III образец далее подвергается обработке детергентом. Способы обработки детергентом фракций плазмы хорошо известны в данной области техники. В общем, может использоваться любая стандартная обработка неионным детергентом совместно со способами, предложенными здесь. Например, образец протокола обработки детергентом приведен ниже. Вкратце, Полисорбат-80 добавляется к фильтрату модифицированной фракции II+III до конечной концентрации приблизительно 0,2% (в./об.) при перемешивании, образец выдерживают по меньшей мере 30 мин при температуре приблизительно 2-8 С. Затем смешивают раствор с натрия цитратом дегидратом до конечной концентрации приблизительно 8 г/л, образец инкубируют по меньшей мере 30 мин при постоянном перемешивании при температуре приблизительно 2-8 С. В определенных вариантах воплощения могут использоваться любые пригодные не ионные детергенты. Примеры подходящих неионных детергентов включают, не ограничиваясь перечисленным, Октилглюкозид, Дигитонин, С 12 Е 8, Люброл, Тритон Х-100, Нонидет Р-40, Твин-20 (т.е. Полисорбат-20),Твин-80 (т.е. Полисорбат-80), алкилполи(этиленоксид), детергент Brij, алкилфенолполи(этиленоксид),полоксамер, октилглюкозид, децилмальтозид и т.п. В одном варианте воплощения улучшение процесса реализуется добавлением детергентных реактивов (например, Полисорбата-80 и натрия цитрата дегидрата) распылением, а не струйным добавлением. В других вариантах воплощения детергентные реактивы могут добавляться в твердом виде к фильтрату модифицированной фракции II+III при перемешивании образца для обеспечения быстрого распределения добавок. В определенных вариантах воплощения предпочтительно добавлять твердые реактивы путем рассыпания твердых веществ над большой площадью фильтрата, чтобы не происходило местного излишнего повышения концентрации, как при струйном добавлении. 7. Третий процесс осаждения - осаждение G. Чтобы удалить некоторые остаточные малые белки, такие как альбумин и трансферрин, производится третье осаждение при концентрации спирта 25%. Вкратце, рН обработанного детергентом фильтрата II+III доводят до приблизительно 6,8-7,2, предпочтительно до приблизительно 6,9-7,1, наиболее предпочтительно до приблизительно 7,0, при помощи подходящего раствора для изменения рН (например, 1 М натрия гидроксидом или 1 М уксусной кислотой). Затем к раствору добавляют холодный спирт до итоговой концентрации приблизительно 25% (об./об.) и инкубируют при перемешивании смесь при приблизительно -6 С-(-10 С) в течение по меньшей мере 1 ч для образования третьего осадка (т.н. осадкаG). В одном варианте воплощения смесь инкубируют в течение по меньшей мере 2 ч или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более часов. В предпочтительном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере 2 ч. В более предпочтительном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере 4 ч. В еще более предпочтительном варианте воплощения смесь инкубируют по меньшей мере 8 ч. В одном аспекте усовершенствование относится к способу, по которому меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции на третьем этапе осаждения. В определенных вариантах воплощения усовершенствование процесса реализуется доведением рН раствора до приблизительно 6,8-7,2 сразу после или во время добавления спирта-осадителя. В другом варианте воплощения усовершенствование процесса реализуется поддержанием рН раствора на уровне приблизительно 6,8-7,2 продолжительно во время инкубационного периода осаждения. В других вариантах воплощения рН раствора доводится до приблизительно 6,9-7,1 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя, либо до рН приблизительно 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 или 7,2 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя. В конкретном варианте воплощения рН раствора доводится до приблизительно 7,0 сразу же после или во время добавления спирта-осадителя. В определенных вариантах воплощения рН раствора поддерживается на уровне приблизительно 6,9-7,1 продолжительно во время инкубационного периода осаждения либо на уровне РН приблизительно 7,0 продолжительно во время инкубационного периода осаждения. В связи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции во время третьего этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора корректируется до, а не после добавления спирта-осадителя, или аналогичным этапом осаждения, при котором рН раствора не поддерживается в течение всего инкубационного периода осаждения. В одном варианте воплощения рН поддерживается на желаемом уровне рН в течение периода выдержки или инкубирования осаждения путем продолжающейся корректировки рН раствора. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. В другом варианте воплощения улучшение процесса реализуется добавлением спирта-осадителя и/или раствора, используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. В свя- 16023446 зи с этим в определенных вариантах воплощения меньшее количество IgG теряется в супернатантной фракции во время третьего этапа осаждения в сравнении с аналогичным этапом осаждения, при котором спирт и/или раствор для корректировки рН вводятся струйным добавлением. В одном варианте воплощения спирт является этанолом. 8. Суспендирование и фильтрование осадка G (PptG). Чтобы растворить IgG, содержащийся в осадке G, используется буфер холодной экстракции для ресуспендирования PptG. Вкратце, осадок G растворяют в соотношении 1 к 3,5 в воде для инъекций (WFI) при приблизительно 0-8 С для получения величины AU280-320 приблизительно 40-95. Итоговый рН раствора, который перемешивается по меньшей мере 2 ч, затем доводится до или приблизительно до 5,20,2. В одном варианте воплощения эта корректировка рН проводится 1 М уксусной кислотой. Для повышения растворимости IgG проводимость суспензии повышается до приблизительно 2,5-6,0 мС/см. В одном варианте воплощения проводимость повышается добавлением натрия хлорида. Суспендированный раствор PptG затем фильтруется через пригодный глубинный фильтр с номинальным размером пор приблизительно 0,1-0,4 мкм для удаления нерастворившихся частиц. В одном варианте воплощения номинальный размер пор глубинного фильтра равен приблизительно 0,2 мкм (например, фильтр CunoVR06 или аналогичный) для получения осветленного фильтрата. В другом варианте воплощения суспендированный раствор PptG центрифугируют для восстановления осветленного супернатанта. Постпромывка фильтра производится раствором натрия хлорида с проводимостью приблизительно 2,5-6,0 мС/см. Типичные подходящие растворы для экстракции осадка G включают воду для инъекций и буферы с низкой проводимостью. В одном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет проводимость ниже приблизительно 10 мС/см. В предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет проводимость ниже приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мС/см. В предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет проводимость ниже приблизительно 6 мС/см. В другом предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет проводимость ниже приблизительно 4 мС/см. В ином предпочтительном варианте воплощения буфер с низкой проводимостью имеет проводимость ниже приблизительно 2 мС/см. 9. Обработка "растворителем/детергентом". Чтобы инактивировать различные вирусные загрязнители, которые могут присутствовать в продуктах, полученных из плазмы, осветленный фильтрат PptG далее подвергается обработке растворителем/детергентом (S/D). Способы обработки детергентом фракций плазмы хорошо известны в данной области техники (см. Pelletier J.P. et al., Best Pract Res Clin. Haematol. 2006; 19(1):205-42). В общем, может использоваться любая стандартная обработка растворителем/детергентом совместно со способами, предложенными здесь. Например, образец протокола обработки растворителем/детергентом приведен ниже. Вкратце, Тритон Х-100, Твин-20 и три(п-бутил)фосфат (TNBP) добавляются к осветленному фильтрату PptG до конечных концентраций приблизительно 1,0, 0,3 и 0,3% соответственно. Затем смесь перемешивают при температуре приблизительно 18-25 С в течение по меньшей мере 1 ч. В одном варианте воплощения улучшение процесса реализуется добавлением S/D-реактивов (например, Тритон Х-100, Твин-20 и TNBP) распылением, а не струйным добавлением. В других вариантах воплощения детергентные реактивы могут добавляться в твердом виде к осветленному фильтрату PptG при перемешивании образца для обеспечения быстрого распределения S/D-компонентов. В определенных вариантах воплощения предпочтительно добавлять твердые реактивы путем рассыпания твердых веществ над большой площадью фильтрата, чтобы не происходило местного излишнего повышения концентрации, как при струйном добавлении. 10. Ионообменная хроматография. Для дальнейших очистки и концентрирования IgG из обработанного растворителем/детергентом фильтрата PptG могут быть выполнены катионообменная и/или анионообменная хроматография. Способы очистки и концентрирования IgG с использованием ионообменной хроматографии хорошо известны в данной области техники. Например, в патенте США 5886154 описан способ, по которому осадок фракции II+III экстрагируется при низком рН (приблизительно 3,8-4,5) с последующим осаждением IgG каприловой кислотой и финальным проведением двух этапов анионообменной хроматографии. В патенте США 6069236 описана схема хроматографической очистки IgG, в которой вовсе не используется спиртовое осаждение. В международной публикацииWO 2005/073252 описан способ очистки IgG,включающий экстракцию осадка фракции II+III, обработку каприловой кислотой, обработку ПЭГ и один этап анионообменной хроматографии. В патенте США 7186410 описан способ очистки IgG, включающий экстракцию либо фракции I+II+III, либо осадка фракции II с последующим одним этапом анионообменной хроматографии, проводимым при щелочном рН. В патенте США 7553938 описан способ,включающий экстракцию либо фракции I+II+III, либо осадка фракции II+III, каприлатную обработку и один или два этапа анионообменной хроматографии. В патенте США 6093324 описан способ очистки,включающий использование крупнопористой анионообменной смолы при рН приблизительно 6,0-6,6. В патенте США 6835379 описан способ очистки, основывающийся на катионообменной хроматографии без спиртового фракционирования. Раскрытие вышеперечисленных публикаций включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для всех целей. В одном варианте воплощения способов настоящего изобретения фильтрат PptG, прошедший обработку растворителем/детергентом, может быть подвергнут и катионообменной, и анионообменной хроматографии. Например, в одном варианте воплощения фильтрат PptG, прошедший обработку растворителем/детергентом, пропускается через катионообменную колонку, связывающую IgG, находящийся в растворе. Реактивы растворителя/детергента затем могут быть отмыты от абсорбированного IgG, который затем элюируется из колонки элюирующим буфером с высоким рН, имеющим рН приблизительно 8,0-9,0. Таким образом, этап катионообменной хроматографии может использоваться для удаления из препарата реактивов растворителя/детергента, концентрирования IgG-содержащего раствора, либо для обеих этих целей. В определенных вариантах воплощения рН элюирующего буфера может составлять рН приблизительно 8,2-8,8 либо приблизительно 8,4-8,6, либо приблизительно 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6,8,7, 8,8, 8,9, либо 9,0. В предпочтительном варианте воплощения рН элюирующего буфера равен приблизительно 8,50,1. В определенных вариантах воплощения рН элюата из катионообменной колонки может быть доведен до более низких значений, например приблизительно 5,5-6,5, и разбавлен пригодным буфером для понижения проводимости раствора. В определенных вариантах воплощения рН катионообмеиного элюата может быть доведен до уровня рН приблизительно 5,7-6,3 либо приблизительно 5,9-6,1, либо уровня рН приблизительно 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 либо 6,5. В предпочтительном варианте воплощения рН элюата доводится до уровня рН приблизительно 6,00,1. Затем элюат загружается в анионообменную колонну, связывающую ряд примесей, находящихся в препарате. Элюат колонки, содержащий фракцию IgG, собирается при загрузке и промывке колонки. В определенных вариантах воплощения этапы ионообменной хроматографии по настоящему изобретению могут проводиться в колонке, в колбе или в комбинации этих двух режимов. В определенных вариантах воплощения улучшение процесса реализуется добавлением раствора,используемого для корректировки рН, распылением, а не струйным добавлением. 11. Нанофильтрация и ультра/диафильтрация. Для дальнейшего снижения вирусной нагрузки в IgG композиции, предложенной здесь, эффлюент из анионообменной колонки может быть подвергнут нанофильтрации на подходящем приборе для нанофильтрации. В определенных вариантах воплощения прибор для нанофильтрации будет иметь средний размер пор приблизительно 15-200 нм. Примерами нанофильтров, пригодных для использования в этих целях, служат, не ограничиваясь перечисленными, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, ViresolveNFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N и 75N (Planova). В конкретном варианте воплощения средний размер пор нанофильтра может составлять приблизительно 15-72 нм либо приблизительно 19-35 нм, либо приблизительно 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте воплощения нанофильтр будет иметь средний размер пор приблизительно 35 нм, например, как фильтр Asahi PLANOVA 35N или аналогичный. Необязательно, могут проводиться ультрафильтрация/диафильтрация для дальнейшего концентрирования нанофильтрата. В одном варианте воплощения используется мембрана с открытыми каналами, а также специально разработанный промывной раствор, благодаря чему в составе полученных IgGкомпозиций вблизи окончания производственного процесса содержится вдвое больше белка (200 мг/мл) в сравнении с получаемыми по нынешним технологиям IVIG (например, GAMMAGARD LIQUID) без влияния на выход и стабильность хранения. С большинством доступных в продаже ультрафильтрационных мембран концентрация 200 мг/мл IgG не может быть достигнута без потерь большей части белка. Такие мембраны быстро блокируются, поэтому достаточной пост-промывки трудно достичь. Поэтому следует использовать конфигурации мембран с открытыми каналами. Даже с мембранами с открытыми каналами следует использовать особенным образом разработанную процедуру пост-промывки, чтобы достичь требуемой концентрации без значительных потерь белка (потерь меньше 2%). Еще более удивителен тот факт, что большая концентрация белка 200 мг/мл не влияет на способность к вирусной активации во время этапа хранения при низком рН. Следом за нанофильтрацией фильтрат может быть дополнительно концентрирован ультрафильтрацией/диафильтрацией. В одном варианте воплощения нанофильтрат может быть концентрирован ультрафильтрацией до концентрации белка приблизительно в 2-10% (в./об.). В определенных вариантах воплощения ультрафильтрацию проводят в кассете с открытоканальным ситом и ультрафильтрационной мембраной с номинальным молекулярным весом отсечения (NMWCO) менее чем приблизительно 100 кДа или менее чем приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или менее кДа. В предпочтительном варианте воплощения ультрафильтрационная мембрана имеет NMWCO не более чем 50 кДа. По завершении этапа ультрафильтрации концентрат может быть дополнительно концентрирован диафильтрацией против раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введений. В определенных вариантах воплощения диафильтрационный раствор может содержать стабилизирующий и/или буферный агент. В предпочтительном варианте воплощения стабилизирующим и буферным агентами является глицин в подходящей концентрации, например, приблизительно 0,20-0,30 М либо приблизительно 0,22-0,28 М, либо приблизительно 0,24 М-0,26 мМ, либо в концентрации приблизительно 2,0,- 18023446 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В предпочтительном варианте воплощения диафильтрационный буфер содержит или приблизительно содержит 0,25 М глицина. Как правило, минимальный объем обмена равен по меньшей мере приблизительно 3 исходным объемам концентрата или по меньшей мере приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более исходных объемов концентрата. Раствор IgG может быть сконцентрирован до конечной концентрации белка приблизительно 525% (в./об.) либо приблизительно 6-18% (в./об.), либо приблизительно 7-16% (в./об.), либо приблизительно 8-14% (в./об.), либо приблизительно 9-12%, либо до конечной концентрации приблизительно 5 или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% или выше. В одном варианте воплощения конечная концентрация белка по меньшей мере в приблизительно 23% достигается без добавления пост-промывочной фракции к концентрированному раствору. В другом варианте воплощения конечная концентрация белка по меньшей мере в приблизительно 24% достигается без добавления постпромывочной фракции к концентрированному раствору. Конечная концентрация белка по меньшей мере в приблизительно 25% достигается без добавления пост-промывочной фракции к концентрированному раствору. Как правило, к концу процесса концентрирования рН раствора будет равно приблизительно 4,6-5,1. В одном приблизительном варианте воплощения рН IgG-композиции доводится до приблизительно 4,5 перед ультрафильтрацией. Раствор концентрируют до концентрации белка в 52% в./об. посредством ультрафильтрации. UF-мембрана имеет номинальный молекулярный вес отсечения (NMWCO) в 50000 Да или ниже (полиэфирсульфоновая мембрана Millipore Pellicon). Концентрат диафильтруют против десяти объемов 0,25 М раствора глицина, рН 4,50,2. В течение операции ультрафильтрации/диафильтрации температура раствора поддерживается равной приблизительно 2-8 С. После диафильтрации раствор концентрируют до содержания белка по меньшей мере 11% (в./об.). 12. Составление. По завершении этапа диафильтрации концентрация белка в растворе доводится диафильтрационным буфером до конечной концентрации приблизительно 5-20% (в./об.) либо приблизительно 6-18%(в./об.), либо приблизительно 7-16% (в./об.), либо приблизительно 8-14% (в./об.), либо приблизительно 912%, либо до конечной концентрации приблизительно 5 или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. В предпочтительном варианте воплощения конечная концентрация белка в растворе равна приблизительно 9-11%, более предпочтительно приблизительно 10%. Составленный нефасованный раствор далее стерилизуется фильтрацией через мембранный фильтр с абсолютным размером пор не более приблизительно 0,22 микрон, например, приблизительно 0,2 мкм. Затем раствор асептически фасуется в финальные контейнеры для запечатывания, образцы берутся для тестирования. В одном варианте воплощения IgG-композиция далее доводится до приблизительно 10,20,2%(в./об.) диафильтрационным буфером. При необходимости рН доводится до приблизительно 4,4-4,9. Наконец, раствор подвергают стерильной фильтрации и инкубируют три недели при или приблизительно при 30 С. 13. Добавление спирта. Преимуществом служит то, что было обнаружено, что для целей фракционирования IgG из плазмы добавление спирта распылением вместо струйного добавления обеспечивает снижение потерь выходаIgG. He вдаваясь в теорию, при струйном добавлении к фракции плазмы временное локальное повышение концентрации спирта в месте притока спирта может приводить к денатурации белка и необратимой потере и/или осаждению IgG во время этапов, на которых IgG должен оставаться в супернатанте. Помимо этого, данные эффекты могут усиливаться при добавлении больших объемов спирта, например, при промышленном масштабе очистки, при котором фракционированию подвергается по меньшей мере 100 л объединенной плазмы. Влияние добавления спирта распылением проиллюстрировано в примере 14, в котором криосупернатантные образцы плазмы осаждались 8% этанолом, который вводился либо струйно (1 и 2), либо распылением (3 и 4). Как следует из табл. 14, практически 100% IgG, присутствующего в криосупернатантной плазме, переводится в супернатант при добавлении этанола распылением, в то время как при струйном добавлении спирта 4-5% IgG утрачивается. Это дает потерю IgG в приблизительно 0,20-0,25 г/л только на этом этапе. В пересчете на уровни производства 2007 года это соответствует потерям в 5,3 млн граммов (5300 кг) IgG. С учетом нынешней рыночной цены IVIG, которая варьируется от 50 до 100 за 1 г, 4-5% потери на этом этапе обозначают общие экономические потери вплоть до полумиллиарда долларов ежегодно. Соответственно в одном аспекте способов, предложенных здесь, один или более этапов осаждения проводятся добавлением спирта распылением. В определенных вариантах воплощения добавление распылением может проводиться с использованием любого устройства, находящегося под давлением, такого как контейнер (например, аэрозольный баллон), оснащенный распылительной головкой или наконечником и работающего в ручном или автоматическом режиме, для превращения жидкости в мелкий туман. В определенных вариантах воплощения добавление распылением проводится в то время, когда сис- 19023446 тема постоянно двигается или иначе перемешивается для того, чтобы обеспечить быстрое и равномерное распределение жидкости в системе. 14. Корректировка рН. Профили осаждения белка фракций плазмы высоко зависят от рН раствора, из которого осаждаются белки плазмы. Этот факт был использован учеными, фракционирующими белки плазмы после введения способов Cohn и Oncley в 1946 и 1949 гг. соответственно. Традиционно, рН фракции плазмы корректируется до добавления спирта для облегчения наивысших выходов интересующих компонентов. Преимуществом служит то, что было обнаружено, что корректировкой рН раствора сразу после добавления спирта или сопутствующих спирту добавок обеспечивается более определенное и воспроизводимое осаждение. Было обнаружено, что добавление этанола к фракциям плазмы приводит к флуктуациям рН раствора,обычно с подъемом рН раствора. В связи с этим при корректировании рН фракции плазмы до предопределенного уровня рН до, а не после добавления спирта, реакция осаждения будет протекать при неоптимальном рН. Аналогично осаждение белков из фракции плазмы будет влиять на электростатическое окружение и, таким образом, менять рН раствора. Соответственно по мере продвижения процесса осаждения рН раствора начнет отклоняться от предустановленной величины рН, позволяющей максимальное извлечение интересующих видов белка. Это особенно верно для процессов осаждения, в которых большая часть фракции белка осаждается, процессов осаждения, в которых используется высокое содержание спирта, и процессов осаждения, требующих длительного инкубационного периода. Влияние корректировки рН фракции плазмы продемонстрировано результатами в примере 16. В этом примере IgG осаждали из двух образцов фракции супернатант I после добавления спирта распылением. рН обоих образцов доводили до 6,7 перед добавлением спирта и до 6,9 после добавления спирта,но до 10-часового инкубационного этапа осаждения. В первом образце (референтном) рН не корректировали в течение 10 ч инкубации, а во втором образце (с длительной корректировкой) рН постоянно доводили до рН 6,9 в течение 10-часового инкубирования. Как показано в табл. 16, после удаления осадка модифицированной фракции II+III из образцов, в первом супернатанте содержалось 0,2 г IgG/л плазмы, а во втором образце, в котором рН поддерживался постоянным в течение инкубации осаждения, содержалось только 0,13 г IgG/л плазмы. Снижение потерь на 0,07 г IgG/л плазмы во втором образце отражает, в пересчете на уровни производства 2007 года, потери в 1,9 млн граммов (1900 кг) IgG. С учетом нынешней рыночной цены IVIG, которая варьируется от 50 до 100 за 1 г, 1,5% потери на этом этапе обозначают общие экономические потери вплоть до 200 млн долларов ежегодно. Соответственно в одном аспекте способов, предложенных здесь, рН фракции плазмы корректируется сразу же после добавления спирта. В родственных вариантах воплощения рН может корректироваться до и после добавления спирта либо во время и после добавления спирта, либо до, во время и после добавления спирта. В родственном варианте воплощения рН раствора длительно корректируется в течение одного или более процессов осаждения или инкубации. В определенных вариантах воплощения рН раствора длительно корректируется или поддерживается в то время, когда система постоянно двигается или иначе перемешивается, для того, чтобы обеспечить быстрое и равномерное распределение рНмодифицирующего агента в системе. Аналогично случаю струйного добавления спирта сейчас было обнаружено, что струйное добавление больших объемов рН-модифицирующего агента может вызывать временные локальные колебания рН, приводя к нежелательной денатурации или осаждению белка. Соответственно в одном варианте воплощения способов, предложенных здесь, рН-модифицирующие агенты могут вводиться на одном или более этапов фракционирования плазмы распылением. В ином варианте воплощения способов, предложенных здесь, рН фракции плазмы на этапе осаждения может корректироваться добавлением рНмодифицирующего агента путем распыления. В определенных вариантах воплощения добавление распылением может проводиться с использованием любого устройства, находящегося под давлением, такого как контейнер (например, аэрозольный баллон), оснащенный распылительной головкой или наконечником и работающего в ручном или автоматическом режиме, для превращения жидкости в мелкий туман. В определенных вариантах воплощения добавление распылением проводится в то время, когда система постоянно двигается или иначе перемешивается, для того, чтобы обеспечить быстрое и равномерное распределение жидкости в системе.IVIG-композиции, содержащие целые антитела, применяются для лечения определенных аутоиммунных состояний (см., например, патентные публикации США под номерами US 2002/0114802, US 2003/0099635 и US 2002/0098182.) IVIG-композиции, раскрытые по этим ссылкам, включают поликлональные антитела. 1. Водные IgG-композиции. В одном аспекте настоящее изобретение относится к водным IgG-композициям, полученным способами, предложенными здесь. В общем, IgG-композиции, полученные по новым способам, предложенным здесь, имеют большие содержание IgG и чистоту. Например, IgG-композиции, предложенные здесь,могут иметь содержание белка по меньшей мере приблизительно 3% (в./об.) и содержание IgG более приблизительно 90% чистоты. Эти высокочистые IgG-композиции пригодны для терапевтического введения, например, для IVIG-терапии. В одном варианте воплощения концентрация IgG-композиции примерно равна 10% и применяется она для внутривенного введения. В другом варианте воплощения концентрация примерно равна 20% и применяется она для подкожного или внутримышечного введения. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагается водная IgG-композиция,приготовленная по способу, который включает этапы: (а) осаждения криосупернатантной плазменной фракции на первом этапе осаждения при помощи приблизительно 6-10%-ного спирта, при рН приблизительно 6,7-7,3, с получением супернатанта, обогащенного IgG, (б) осаждения IgG из супернатанта при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта, при рН приблизительно 6,7-7,3, с получением первого осадка, (в) ресуспендирования первого осадка, полученного на этапе (б), с получением суспензии, (г) обработки детергентом суспензии, полученной на этапе (в), (д) осаждения IgG из суспензии при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением второго осадка, (е) ресуспендирования второго осадка, полученного на этапе (д), (ж) обработки суспензии, полученной на этапе (е), растворителем и/или детергентом, и (з) проведения по меньшей мере одного разделения ионообменной хроматографией с получением композиции с концентрированным IgG. В конкретном варианте воплощения предлагается IgG-композиция, полученная способом, содержащим этапы: (а) доведения рН криосупернатантной плазменной фракции приблизительно до 7,0, (б) доведения концентрации этанола в криосупернатантной плазменной фракции этапа (а) приблизительно до 25% (об./об.) при температуре между приблизительно -5 и приблизительно -9 С с получением смеси,(в) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (б), (г) ресуспендирования осадка, полученного на этапе (в), в буфере, содержащем фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, приблизительно равным 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением суспензии, (д) смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией, полученной на этапе (г),в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, (е) фильтрования суспензии на фильтр-прессе с получением фильтрата, (ж) промывания фильтр-пресса по меньшей мере 3 мертвыми объемами фильтрпресса буфера, содержащего фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, равным или приблизительно равным 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера с получением промывочного раствора, (з) смешивания фильтрата, полученного на этапе (е), с промывочным раствором, полученным на этапе (ж), с получением раствора и обработки раствора поверхностно-активным веществом, (и) доведения рН раствора, полученного на этапе (з), до уровня приблизительно 7,0 и добавления этанола до финальной концентрации, приблизительно равной 25%, с получением осадка, (к) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (и), (л) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или поверхностно-активное вещество, и выдерживания раствора по меньшей мере в течение 60 мин, (м) прохождения раствора с этапа (л) через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования в элюат белков, абсорбированных в колонке, (н) прохождения элюата, полученного на этапе (м), через анионообменную хроматографическую колонку для получения эффлюента, (о) прохождения эффлюента с этапа (н) через нанофильтр для получения нанофильтрата, (п) прохождения нанофильтрата, полученного на этапе (о), через ультрафильтрационную мембрану для получения ультрафильтрата;и (р) диафильтрации ультрафильтрата, полученного на этапе (п), против диафильтрационного буфера для получения диафильтрата с концентрацией белка между приблизительно 8% (в./об.) и приблизительно 12% (в./об.) с получением композиции концентрированного IgG. В определенныхвариантах воплощения водные IgG-композиции приготавливаются с использованием способов, предложенных здесь, которые включают усовершенствования двух и более этапов процесса разделения, описанного выше. Например, в определенных вариантах воплощения усовершенствования могут быть введены на первом этапе осаждения, этапе осаждения модифицированной фракцииII+III, этапе растворения модифицированной фракции II+III и/или этапе фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В одном варианте воплощения предлагается водная IgG-композиция, которая готовится способом очистки, предложенным здесь, причем способ содержит добавление распылением одного или более растворов, которые, иначе, вводились во фракцию плазмы струйным добавлением. Например, в определенных вариантах воплощения способ будет содержать введение спирта (например, этанола) во фракцию плазмы путем распыления. В других вариантах воплощения растворы, которые могут добавляться к фракции плазмы распылением, включают, не ограничиваясь перечисленным, рН-модифицирующий раствор, раствор растворителя, раствор детергента, буфер для разбавления, раствор для изменения проводимости и т.п. В предпочтительном варианте воплощения один или более этапов спиртового осаждения проводятся добавлением спирта к фракции плазмы путем распыления. Во втором предпочтительном варианте воплощения один или более этапов корректировки рН проводятся добавлением рНмодифицирующего раствора к фракции плазмы путем распыления. В определенных вариантах воплощения предлагается водная IgG-композиция, которая готовится способом очистки, предложенным здесь, причем способ содержит корректирование рН осаждаемой фракции плазмы после и/или одновременно с добавлением осаждающего агента (например, спирта или полиэтиленгликоля). В определенных вариантах воплощения предлагается усовершенствование процес- 21023446 са, при котором рН активно осаждаемой фракции плазмы поддерживается в течение всего этапа инкубирования или выдерживания осаждения длительными контролем и корректировкой рН. В предпочтительных вариантах воплощения корректировка рН производится добавлением рН-модифицирующего раствора путем распыления. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагаются водные IgG-композиции,содержащие белок в концентрации приблизительно 30-250 г/л. В определенных вариантах воплощения концентрация белка в IgG-композиции равна приблизительно 50-200 г/л либо приблизительно 70-150 г/л,либо приблизительно 90-120 г/л, либо любой подходящей концентрации в этих пределах, например, приблизительно 30 либо приблизительно 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115,120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225,230, 235, 240, 245, 250 или выше. В предпочтительном варианте воплощения концентрация водной IgGкомпозиции будет равна или приблизительно равна 10%. В особенно предпочтительном варианте воплощения концентрация композиции будет равна 10,20,2% (в./об.). В другом предпочтительном варианте воплощения концентрация водной IgG-композиции будет равна или приблизительно равна 20%. Способы, предложенные здесь, позволяют получить IgG-композиции с очень высокими степенями чистоты. В одном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 95% от общего количества белка в композиции, предложенной здесь, будет IgG. В других вариантах воплощения по меньшей мере приблизительно 96% белка является IgG либо по меньшей мере приблизительно 97, 98, 99, 99,5% или более от общего количества белка композиции будет IgG. В предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 97% от общего количества белка в композиции будет IgG. В другом предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 98% от общего количества белка в композиции будет IgG. В ином предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 99% от общего количества белка в композиции будет IgG. Аналогично, способы, предложенные здесь, позволяют получить IgG-композиции с чрезвычайно низкими уровнями загрязняющих агентов. Например, в табл. 19 предлагаются результаты анализа примесей трех нефасованных растворов IgG, приготовленных способами, предложенными здесь. В определенных вариантах воплощения предлагаются IgG-композиции, содержащие менее чем приблизительно 140 мг/л IgA. В других вариантах воплощения IgG-композиция будет содержать менее чем приблизительно 60 мг/л IgA, предпочтительно менее чем приблизительно 40 мг/л IgA, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 30 мг/л IgA. В другом варианте воплощения предлагаются IgG-композиции, содержащие менее чем приблизительно 50 мг/л IgM. В других вариантах воплощения IgG-композиция будет содержать менее чем приблизительно 25 мг/л IgM, предпочтительно менее чем приблизительно 10 мг/л IgM, более предпочтительно менее чем приблизительно 5 мг/л IgM, более предпочтительно менее чем приблизительно 4 мг/лIgM, более предпочтительно менее чем приблизительно 3 мг/л IgM, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 2,5 мг/л IgM. В другом варианте воплощения предлагаются IgG-композиции, содержащие менее чем приблизительно 100 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности. В других вариантах воплощения IgGкомпозиция будет содержать менее чем приблизительно 50 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности, предпочтительно менее чем приблизительно 25 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности,более предпочтительно менее чем приблизительно 20 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности,более предпочтительно менее чем приблизительно 15 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности,наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 10 PL-1 нмоль/мл мин амидолитической активности. В другом варианте воплощения предлагаются IgG-композиции, содержащие менее чем приблизительно 20 мг/л фибриногена. В других вариантах воплощения IgG-композиция будет содержать менее чем приблизительно 10 мг/л фибриногена, предпочтительно менее чем приблизительно 5 мг/л фибриногена, более предпочтительно менее чем приблизительно 2,5 мг/л фибриногена, более предпочтительно менее чем приблизительно 1 мг/л фибриногена, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,5 мг/л фибриногена, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,25 мг/л фибриногена. В еще одном варианте воплощения предлагаются IgG-композиции, состоящие преимущественно из мономеров/димеров IgG. В одном варианте воплощения предлагается IgG-композиция, в которой по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 или 99,9% IgG мономерны или димерны. В предпочтительном варианте воплощения предлагается IgG-композиция, в которой по меньшей мере 97% IgG мономерны или димерны. В более предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере 99% IgG мономерны или димерны. В более предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере 99,5% IgG мономерны или димерны. В более предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере 99,7% IgG мономерны или димерны. 2. Фармацевтические композиции. В ином аспекте в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции и составы,содержащие очищенный IgG, полученные способами, представленными здесь. В общем, фармацевтические композиции и составы IgG, полученные новыми способами, предложенными здесь, имеют большие содержание IgG и чистоту. Например, фармацевтические композиции и составы IgG, предложенные здесь, могут иметь содержание белка по меньшей мере приблизительно 7% (в./об.) и содержание IgG более чем приблизительно 95% чистоты. Эти высокочистые фармацевтические композиции и составыIgG пригодны для терапевтического введения, например, для IVIG-терапии. В предпочтительном варианте воплощения фармацевтическая IgG-композиция составлена для внутривенного введения (т.н. IVIGтерапии). В одном варианте воплощения фармацевтические композиции, предложенные здесь, готовятся составлением водной IgG-композиции, выделенной способом, предложенным здесь. Как правило, составленная композиция будет подвергнута по меньшей мере одному, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем этапам инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры этапов инактивации или удаления вирусов, которые могут использоваться со способами, предложенными здесь, включают обработку растворителем/детергентом (Horowitz et al.,Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 и Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, оба из которых включены в настоящую заявку недвусмысленным образом посредством ссылки во всей полноте для всех целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 и Yuasa et al.,J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8:2021-2024, оба из которых включены в настоящую заявку недвусмысленным образом посредством ссылки во всей полноте для всех целей), а также инкубирование с низким рН при высоких температурах (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 и Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19). В определенных вариантах воплощения предлагаются фармацевтические составы с содержаниемIgG от приблизительно 80 г/л IgG до приблизительно 120 г/л IgG. Как правило, подобные составы IVIG готовятся выделением IgG-композиции из плазмы способом, предложенным здесь, концентрированием композиции и составлением концентрированной композиции в раствор, пригодный для внутривенного введения. IgG-композиции могут быть концентрированы любым пригодным способом, известным специалисту в данной области техники. В одном варианте воплощения композицию концентрируют ультрафильтрацией/диафильтрацией. В некоторых вариантах воплощения прибор для ультрафильтрации, используемый для концентрирования композиции, будет оснащен ультрафильтрационной мембраной с номинальным молекулярным весом отсечения (NMWCO) менее чем приблизительно 100 кДа или менее чем приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или менее кДа. В предпочтительном варианте воплощения ультрафильтрационная мембрана имеет NMWCO не более чем 50 кДа. Обмен буфера может быть достигнут любым пригодным способом, известным специалисту в данной области техники. В конкретном варианте воплощения обмен буфера достигается диафильтрацией. В одном конкретном варианте воплощения предлагается фармацевтическая IgG-композиция, отличающаяся тем, что IgG-композиция была выделена из плазмы способом, который включает этапы: (а) осаждения криосупернатантной плазменной фракции на первом этапе осаждения при помощи приблизительно 6-10%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением супернатанта, обогащенногоIgG, (б) осаждения IgG из супернатанта при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением первого осадка, (в) ресуспендирования первого осадка, полученного на этапе (б), с получением суспензии, (г) обработки детергентом суспензии, полученной на этапе (в), (д) осаждения IgG из суспензии при помощи приблизительно 20-30%-ного спирта при рН приблизительно 6,7-7,3 с получением второго осадка, (е) ресуспендирования второго осадка, полученного на этапе (д),(ж) обработки суспензии, полученной на этапе (е), растворителем и/или детергентом, (з) проведения по меньшей мере одного разделения ионообменной хроматографией; (и) проведения обработки растворителем/детергентом; и (к) подвергания композиции нанофильтрации с получением композиции с концентрированным IgG. В конкретном варианте воплощения предлагается фармацевтическая композиция с IgG, отличающаяся тем, что IgG-композиция была выделена из плазмы способом, содержащим этапы: (а) доведения рН криосупернатантной плазменной фракции приблизительно до 7,0, (б) доведения концентрации этанола в криосупернатантной плазменной фракции этапа (а) приблизительно до 25% (об./об.) при температуре между приблизительно -5 и приблизительно -9 С с получением смеси, (в) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (б), (г) ресуспендирования осадка, полученного на этапе (в), в буфере, содержащем фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, приблизительно равным 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением суспензии, (д) смешивания тонкоизмельченного диоксида кремния (SiO2) с суспензией, полученной на этапе (г), в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, (е) фильтрования суспензии на фильтр-прессе с получением фильтрата, (ж) промывания фильтр-пресса по меньшей мере 3 мертвыми объемами фильтр-пресса буфера, содержащего фосфат и ацетат, рН которого был откорректирован объемом, равным или приблизительно равным 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, с получением промывочного раствора, (з) смешивания фильтрата, полученного на этапе (е), с промывочным раствором, полученным на этапе (ж), с получением раствора и обработки раствора поверхностно-активным веществом, (и) доведения рН раствора, полученного на этапе (з) , до уровня приблизительно 7,0 и добавления этанола до финальной концентрации, приблизительно равной 25%, с получением осадка, (к) разделения жидкости и осадка из смеси, полученной на этапе (и), (л) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или поверхностно- 23023446 активное вещество, и выдерживания раствора по меньшей мере в течение 60 мин, (м) прохождения раствора с этапа (л) через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования в элюат белков,абсорбированных в колонке, (н) прохождения элюата, полученного на этапе (м), через анионообменную хроматографическую колонку для получения эффлюента, (о) прохождения эффлюента с этапа (н) через нанофильтр для получения нанофильтрата, (п) прохождения нанофильтрата, полученного на этапе (о),через ультрафильтрационную мембрану для получения ультрафильтрата; и (р) диафильтрации ультрафильтрата, полученного на этапе (п), против диафильтрационного буфера для получения диафильтрата с концентрацией белка между приблизительно 8% (в./об.) и приблизительно 12% (в./об.) с получением композиции концентрированного IgG. В определенных вариантах воплощения предлагается фармацевтическая композиция IgG, отличающаяся тем, что IgG-композиция приготавливается с использованием способов, предложенных здесь,которые включают усовершенствования двух или более этапов процесса разделения, описанного выше. Например, в определенных вариантах воплощения усовершенствования могут быть введены на первом этапе осаждения, этапе осаждения модифицированной фракции II+III, этапе растворения модифицированной фракции II+III и/или этапе фильтрования суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах воплощения предлагается фармацевтическая IgG-композиция, отличающаяся тем, что IgG-композиция приготавливается способом очистки, предложенным здесь, причем способ содержит добавление распылением одного или более растворов, которые, иначе, вводились во фракцию плазмы струйным добавлением. Например, в определенных вариантах воплощения способ будет содержать введение спирта (например, этанола) во фракцию плазмы путем распыления. В других вариантах воплощения растворы, которые могут добавляться к фракции плазмы распылением, включают, не ограничиваясь перечисленным, рН-модифицирующий раствор, раствор растворителя, раствор детергента, буфер для разбавления, раствор для изменения проводимости и т.п. В предпочтительном варианте воплощения один или более этапов спиртового осаждения проводятся добавлением спирта к фракции плазмы путем распыления. Во втором предпочтительном варианте воплощения один или более этапов корректировки рН проводятся добавлением рН-модифицирующего раствора к фракции плазмы путем распыления. В определенных вариантах воплощения предлагается фармацевтическая IgG-композиция, отличающаяся тем, что IgG-композиция приготавливается способом очистки, предложенным здесь, причем способ содержит корректирование рН осаждаемой фракции плазмы после и/или одновременно с добавлением осаждающего агента (например, спирта или полиэтиленгликоля). В определенных вариантах воплощения предлагается усовершенствование процесса, при котором рН активно осаждаемой фракции плазмы поддерживается в течение всего этапа инкубирования или выдерживания осаждения длительными контролем и корректировкой рН. В предпочтительных вариантах воплощения корректировка рН производится добавлением рН-модифицирующего раствора путем распыления. В одном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая IgGкомпозиция, содержащая белок в концентрации приблизительно 70-130 г/л. В определенных вариантах воплощения концентрация белка в IgG-композиции равна приблизительно 80-120 г/л, предпочтительно приблизительно 90-110 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 100 г/л, либо любой подходящей концентрации в этих пределах, например, приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120,125 или 130 г/л. В предпочтительном варианте воплощения предлагается фармацевтическая композиция с концентрацией белка, равной или приблизительно равной 100 г/л. В особенно предпочтительном варианте воплощения концентрация белка фармацевтической композиции будет равна или приблизительно равна 102 г/л. В ином варианте воплощения в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая IgGкомпозиция, содержащая белок в концентрации приблизительно 170-230 г/л. В определенных вариантах воплощения концентрация белка в IgG-композиции равна приблизительно 180-220 г/л, предпочтительно приблизительно 190-210 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 200 г/л, либо любой подходящей концентрации в этих пределах, например, приблизительно 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210,215, 220, 225 или 230 г/л. В предпочтительном варианте воплощения предлагается фармацевтическая композиция с концентрацией белка, равной или приблизительно равной 200 г/л. Способы, предложенные здесь, позволяют получить фармацевтические IgG-композиции с очень высокими степенями чистоты. Например, в одном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 95% от общего белка в композиции, предложенной здесь, будет IgG. В других вариантах воплощения по меньшей мере приблизительно 96% белка является IgG либо по меньшей мере приблизительно 97, 98,99, 99,5%, или более от общего белка композиции будет IgG. В предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 97% от общего белка в композиции будет IgG. В другом предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 98% от общего белка в композиции будет IgG. В ином предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере приблизительно 99% от общего белка в композиции будет IgG. Аналогично способы, предложенные здесь, позволяют получить фармацевтические IgGкомпозиции с чрезвычайно низкими уровнями загрязняющих агентов. Например, в определенных вари- 24023446 антах воплощения предлагаются IgG-композиции, содержащие менее чем приблизительно 100 мг/л IgA. В других вариантах воплощения IgG-композиция будет содержать менее чем приблизительно 50 мг/лIgA, предпочтительно менее чем приблизительно 35 мг/л IgA, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 20 мг/л IgA. Фармацевтическая композиция, предложенная здесь, будет, как правило, содержать один или более буферизующих агентов или рН-стабилизирующих агентов, пригодных для внутривенного, подкожного и/или внутримышечного введения. Неограничивающие примеры буферных агентов, пригодных для составления IgG-композиции, предложенной здесь, включают глицин, цитрат, фосфат, ацетат, глутамат,тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, пропионат, карбонат или их комбинация, доведенная до необходимого рН. Как правило, буферного агента будет достаточно для поддержания подходящего рН состава в течение длительного периода времени. В предпочтительном варианте воплощения буферным агентом является глицин. В некоторых вариантах воплощения концентрация буферного агента в составе будет равна приблизительно 100-400 мМ, предпочтительно приблизительно 150-350 мМ, более предпочтительно приблизительно 200-300 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 250 мМ. В особенно предпочтительном варианте воплощения IVIG-композиция будет содержать приблизительно 200-300 мМ глицина, наиболее предпочтительно приблизительно 250 мМ глицина. В определенных вариантах воплощения рН состава будет приблизительно 4,1-5,6, предпочтительно приблизительно 4,4-5,3, наиболее предпочтительно приблизительно 4,6-5,1. В конкретных вариантах воплощения рН состава может быть равен приблизительно 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5 либо 5,6. В предпочтительном варианте воплощения рН состава будет приблизительно равен 4,6-5,1. В определенных вариантах воплощения фармацевтические композиции, предложенные здесь, могут, необязательно, дополнительно содержать агент для корректирования осмоляльности композиции. Неограничивающими примерами агентов осмоляльности являются маннитол, сорбитол, глицерин, сахароза, глюкоза, декстроза, левулоза, фруктоза, лактоза, полиэтиленгликоли, фосфаты, натрия хлорид, калия хлорид, кальция глюконоглюкогептонат, диметилсульфон и т.п. Как правило, составы, предложенные здесь, будут иметь осмоляльность, сопоставимую с физиологической осмоляльностью, - приблизительно 285-295 мОсмоль/кг (Lacy et al., Drug Information Handbook Lexi-Comp 1999:1254). В определенных вариантах воплощения осмоляльность состава будет приблизительно 200-350, предпочтительно приблизительно 240-300 мОсмоль/кг. В конкретных вариантах воплощения осмоляльность состава будет равна приблизительно 200 или 210, 220, 230, 240, 245, 250, 255, 260,265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 либо 350 мОсмоль/кг.IgG-составы, предложенные здесь, обычно стабильны в жидком виде в течение длительного периода времени. В определенных вариантах воплощения составы стабильны в течение по меньшей мере 3 месяцев при комнатной температуре или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, или 24 месяцев при комнатной температуре. Состав также будет обычно стабилен 6 или по меньшей мере приблизительно 18 месяцев в рефрижерируемых условиях (обычно приблизительно 28 С), либо в течение по меньшей мере приблизительно 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев в рефрижерируемых условиях.IV. Способы лечения. По стандартной практике в современной медицине стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно IgG) используются для лечения медицинских состояний трех основных классов: иммунодефицитных состояний, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также острых инфекций. Данные IgG-препараты могут быть особенно полезны для лечения множественного склероза (особенно рецидивирующе-ремиттирующего множественного склероза или РРМС), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Очищенный препарат IgG по данному изобретению пригоден для этих целей, а также иных клинически принятых способов использования препаратов IgG.FDA одобрила использование IVIG по множеству показаний, включая аллогенную пересадку костного мозга, хроническую лимфоцитную лейкемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру(ИТП), ВИЧ у детей, первичные иммунодефицитные состояния, болезнь Кавасаки, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (ХВДП), пересадку почки реципиенту с высоким уровнем антител или от АВО-несовместимого донора. В определенных вариантах воплощения IVIGкомпозиции, предложенные здесь, пригодны для лечения или контролирования этих заболеваний и состояний. Кроме того, не по одобренным показаниям IVIG часто назначаются пациентам для лечения или контролирования различных состояний, таких как синдром хронической усталости, колит, вызванный ной скованности, опсоклонус Миоклонус, тяжелый сепсис и септический шок у критически больных взрослых, токсический эпидермальный некролиз, хронический лимфолейкоз, множественную миелому,агаммаглобулинемию, сцепленную с Х-хромосомой, и гипогаммаглобулинемию. В определенных вариантах воплощения IVIG-композиции, предложенные здесь, пригодны для лечения или контролирования этих заболеваний и состояний. Наконец, предлагалось экспериментальное использование IVIG для лечения или контроля заболеваний, включая первичный иммунодефицит, РРМС, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (патентная заявка США 2009/0148463, которая включена сюда посредством ссылки во всей полноте для всех целей). В определенных вариантах воплощения IVIG-композиции, предложенные здесь, пригодны для лечения или контролирования первичного иммунодефицита, РРМС, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. В определенных вариантах воплощения, включающих ежедневное введение, эффективное количество для введения субъекту может быть определено врачом, исходя из индивидуальных отличий в возрасте, весе, тяжести заболевания, пути введения (например, внутривенный или подкожный) и ответа на терапию. В определенных вариантах воплощения иммуноглобулиновый препарат по этому изобретению может вводиться субъекту в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах воплощения иммуноглобулиновый препарат может вводиться в количествах по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 либо по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах воплощения иммуноглобулиновый препарат может вводиться субъекту в дозах вплоть до приблизительно 100, до приблизительно 150, до приблизительно 200, до приблизительно 250, до приблизительно 300, до приблизительно 400 мг/кг ежедневно. В иных вариантах воплощения дозы иммуноглобулинового препарата могут быть больше или меньше. Помимо этого, иммуноглобулиновые препараты могут вводиться одной или более дозами в день. Врачи, которым известны заболевания, которые лечатся препаратами IgG, могут определить нужную для пациента дозу в соответствии с критериями, известными в данной области техники. В соответствии с настоящим изобретением время, необходимое для завершения терапевтического курса, может быть определено врачом и может варьироваться от такого краткого срока как один день и вплоть до срока более чем месяц. В определенных вариантах воплощения терапевтический курс может составлять 1-6 месяцев. Эффективное количество IVIG-препарата вводится субъекту внутривенно. Термин "эффективное количество" относится к такому количеству IVIG-препарата, которое обеспечивает облегчение или ослабление заболевания или состояния субъекта. Эффективное количество для введения субъекту может быть определено врачом, исходя из индивидуальных отличий в возрасте, весе, заболевания или состояния, по поводу которых осуществляется лечение, тяжести заболевания и ответа на терапию. В определенных вариантах воплощения IVIG-препарат по этому изобретению может вводиться субъекту в дозе от приблизительно 5 до приблизительно 2000 мг/кг за введение. В определенных вариантах воплощения доза может составлять по меньшей мере приблизительно 5, или по меньшей мере приблизительно 10,или по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700,1800, 1900, или по меньшей мере приблизительно 2000 мг/кг. Дозировка и частота терапии IVIG будет зависеть от, среди прочих факторов, тяжести заболевания или состояния, по поводу которого производится лечение, и тяжести заболевания или состояния пациента. Как правило, при первичной дисфункции иммунитета назначается доза в приблизительно 100-400 мг/кг массы тела каждые 3-4 недели. При неврологических и аутоиммунных заболеваниях вводится плоть до 2 г/кг массы тела в течение трех-шести месяцев пятидневными ежемесячными курсами. Как правило, дополнительно производится поддерживающая терапия, включающая введение приблизительно 100-400 мг/кг массы тела приблизительно один раз каждые 3-4 недели. Обычно пациент будет получать дозу или лечение приблизительно один раз каждые 14-35 дней либо каждые 21-28 дней. Частота терапии будет зависеть от, среди прочих факторов, тяжести заболевания или состояния, по поводу которого производится лечение, и тяжести заболевания или состояния пациента. В предпочтительном варианте воплощения предлагается способ лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом, способ, включающий введение фармацевтической IVIG-композиции по настоящему изобретению. В родственном варианте воплощения в настоящем изобретении предлагаются IVIG-композиции для лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом, произведенные способом, предложенным здесь. В определенных вариантах воплощения иммунодефицит, аутоиммунное заболевание или острая инфекция выбраны из аллогенной пересадки костного мозга, хронического лимфоцитного лейкоза,идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), ВИЧ у детей, первичных иммунодефицитных состояний, болезни Кавасаки, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии(ХВДП), пересадки почки реципиенту с высоким уровнем антител или от АВО-несовместимого донора,синдрома хронической усталости, колита, вызванного Clostridiumdifficile, дерматомиозита и полимиози- 26023446 та, офтальмопатии Грейвса, синдрома Гийена-Барре, мышечной дистрофии, миозита с включенными тельцами, синдрома Ламберта-Итона, красной волчанки, мультифокальной моторной нейропатии, множественного склероза (МС), тяжелой миастении, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, инфекции Парвовирусом В 19, пузырчатки, послетрансфузионной пурпуры, отторжения трансплантата почки,самопроизвольного аборта/выкидыша, синдрома мышечной скованности, опсоклонуса Миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока у критически больных взрослых, токсического эпидермального некролиза, хронического лимфолейкоза, множественной миеломы, агаммаглобулинемии, сцепленной с Х-хромосомой,гипогаммаглобулинемии,первичного иммунодефицита,рецидивирующеремиттирующего рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Примеры Приведенные ниже примеры представлены лишь для иллюстрирования, а не для ограничения. Специалисты в данной области техники легко распознают множество некритичных параметров, которые могут быть изменены или модифицированы с получением практически таких же или сходных результатов. Пример 1. В данном примере продемонстрировано, что значительные количества фибриногена, амидолитической активности, активности активатора прекалликреина и липопротеинов могут быть удалены из экстрагированной суспензии пасты модифицированной фракции II+III обработкой Аэросилом до фильтрования. Высокодисперсный кремнезем (Аэросил 380) в настоящее время используется для адсорбирования фибриногена, амидолитической активности, активности активатора прекалликреина и липопротеинов. Чтобы более подробно исследовать влияние Аэросила, шесть суспензий модифицированной фракцииII+III были обработаны различными количествами Аэросила перед фильтрованием. Вкратце, буфер для растворения, содержащий 5 мМ натрия ацетата/5 мМ натрия дигидрофосфата с рН 4,5, использовался для ресуспендирования модифицированной пасты II+III, полученной так, как описано здесь, в соотношении 15 г буфера для растворения на 1 г пасты II+III. После добавления пасты суспензию перемешивали 1 ч при 2-8 С при контроле рН (пределы межоперационного контроля рН: 4,9-5,3). Нами было обнаружено,что рН этой суспензии в норме сдвигается до рН приблизительно 5,1 и, таким образом, дальнейшая корректировка рН не нужна. После дополнительной экстракции в течение по меньшей мере 120 мин в контейнеры был добавлен Аэросил 380 по 0-100 мг на 1 г пасты II+III и суспензии инкубировались 1 ч. Диатомовую землю добавляли до глубинной фильтрации с фильтром Cuno 50SA. После фильтрации фильтры были промыты экстракционным буфером, содержащим 8 гл 1 цитрата и 0,2% Полисорбата 80 (рН 5,0),смыв был добавлен к фильтрату. Комбинированные фильтрат и промывочный раствор затем были обработаны Полисорбатом 80 для дальнейшего растворения гидрофобных примесей, например липопротеинов, и IgG был осажден 25% этанолом (рН 7) при -8 С-(-10 С). Полученный осадок Ppt G был почти белым и содержал более чистый IgG. Осадок затем был растворен в очищенной воде в соотношении 7 г воды на 2 г осадка Ppt G. Для растворов IgG были определены извлечение IgG и содержание примесей после этапа фильтрации на Cuno. В частности, измерялись уровни амидолитической активности (PL-1), активности активатора прекалликреина и фибриногена (табл. 3). В частности, как показано в табл. 3, протоколы экстракции, в которых использовалось 40-60 мг Аэросила 380 на 1 г пасты II+III дали приемлемые уровни извлеченияIgG со значительным понижением амидолитической и активности активатора прекалликреина, а также значительное снижение уровня фибриногена в фильтрате. В сравнении с экстракциями, проводившимися без обработки Аэросилом, добавление 40 мг Аэросила 380 на 1 г пасты II+III обеспечило почти 90%-ное снижение активности активатора прекалликреина и содержания фибриногена и 60%-ное снижение амидолитической активности с поддержанием сходного извлечения IgG (73%). Таблица 1 Влияние количества Аэросила 380 на этапе Cuno фильтрации Пример 2. В данном примере продемонстрировано, что значительное количество фибриногена может быть удалено из экстрагированной суспензии пасты модифицированной фракции II+III обработкой Аэросилом до фильтрования. Одной целью данного эксперимента было определить условия, подходящие для эффективного извлечения фибриногена без существенных потерь IgG. Модифицированная паста II+III, приготовленная согласно способу, предложенному здесь, была растворена в буфере 5 мМ натрия ацетата/5 мМ одноосновного натрия фосфата с рН 4,5. Соотношение растворения составляло 15 кг буфера на 1 кг пасты II+III. Количество уксусной кислоты, добавленной к буферу, было выбрано так, чтобы рН после 60 мин перемешивания составлял 4,9. Чтобы полностью гомогенизировать суспензию, ее перемешивали вплоть до 20 ч при 2-8 С перед разделением на 6 порций по 50 мл, которые налили в стаканы вместимостью 100 мл, в которых уже присутствовали различные количества Аэросила 380 согласно табл. 2. Растворы суспензии II+III затем были перемешаны 80 мин в присутствии Аэросила, а затем обработаны и проанализированы. После перемешивания все образцы были центрифугированы в Heraeus Cryofuge 8500i при 4600 об/мин, в течение 30 мин при 4 С в пробиркахfalcon вместимостью 50 мл. В этом эксперименте измерения IgG проводились нефелометрическим тестом, который был выбран вследствие большей правильности в сравнении с тестом ELISA при высоких концентрациях, обнаруживаемых в растворах суспензии II+III. Для минимизации влияния неспецифической мутности образцы перед анализом были профильтрованы через фильтры 0,45 мкм. Для IgM, IgA и фибриногена были предпочтены тесты ELISA из-за низких концентраций этих примесей в суспензии. Результаты эксперимента показаны ниже в табл. 2. Для дальнейшей характеристики влияния обработки Аэросилом на удаление фибриногена и потерюIgG так, как описано в примере 1, были далее оттитрованы концентрации Аэросила в пределах 0 и 40 мг на 1 г модифицированной пасты II+III. Результаты, показанные в табл. 2, подтверждают высокую способность Аэросила к понижению уровня фибриногена в этой фракции. В частности, при использовании 40 мг на 1 г пасты II+III наблюдается почти 90%-ное снижение фибриногена, а извлечение IgG в фильтровальном слое снижается лишь на 10%. Таблица 2 Результаты варьирования условий растворения после экстракции II+III при помощи 5 мМ NaAc/5 мМ NaH2PO4, рН 4,5, с соотношением растворения 1 кг II+III на 15 кг буфера после центрифугирования Пример 3. В настоящем примере показаны условия, подходящие для высокоэффективной экстракции IgG из пасты модифицированной фракции II+III, в то же время ограничивающие уровни вредных примесей. В частности, исследовались параметры, включая концентрацию уксусной кислоты, используемой в буфере для растворения II+III и обработки Аэросилом экстрагированного раствора перед фильтрованием. Паста II+III была экстрагирована в 5 мМ натрия ацетата, 5 мМ натрия дигидрофосфата и различных количествах концентрированной уксусной кислоты, как показано в табл. 1, в течение 180 мин при 2-8 С с последующим добавлением Аэросила 380, как показано в табл. 1. Спустя 1 ч перемешивания, суспензия была осветлена фильтрованием на Cuno 50SA в присутствии диатомовой земли. Пост-промывка фильтра производилась с тем же буфером, что и экстракция, за исключением того, что использовалось другое количество уксусной кислоты, как указано в табл. 1, с использованием 40% объема суспензии до фильтрования. Проводилось осаждение осадка G в присутствии 25% этилового спирта; 8 гл 1 натрия цитрата и 0,2% Твин 80 (рН 7) при -8 С было представлено, и после выдерживания в течение 8 ч осуществлялось разделение центрифугированием на Heraeus Cryofuge 8500i в стаканах из нержавеющей стали при 4600 об/мин, в течение 30 мин при -10 С. Осадок был растворен в очищенной воде в соотношении 1:2.
МПК / Метки
МПК: A61K 38/17, A61K 9/08, C07K 16/00, A61K 9/00, A61K 47/18
Метки: igg-композиции, получения, плазмы, обогащенной, способ
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23446-sposob-polucheniya-obogashhennojj-igg-kompozicii-iz-plazmy.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения обогащенной igg-композиции из плазмы</a>
Способ получения антистафилококковой плазмы крови
Номер патента: 16268
Опубликовано: 30.03.2012
Авторы: Пешняк Жанна Витальевна, Потапнев Михаил Петрович, Мальцева Линура Марсовна, Смирнов Михаил Николаевич
МПК: G01N 33/53, A61K 38/20, A61K 39/085...
Метки: способ, антистафилококковой, получения, крови, плазмы
Формула / Реферат:
Способ получения антистафилококковой плазмы крови, включающий двукратную иммунизацию донора путем введения в его организм адсорбированного стафилококкового анатоксина в количестве 1 мл с интервалом 7 дней, после чего через каждые две недели после начала иммунизации осуществляют забор крови с последующим выделением из нее плазмы, отличающийся тем, что первую иммунизацию проводят адсорбированным стафилококковым анатоксином подкожно в область...
Способ получения изоиммунной плазмы крови
Номер патента: 17172
Опубликовано: 30.10.2012
Авторы: Потапнев Михаил Петрович, Мальцева Линура Марсовна, Пешняк Жанна Витальевна, Смирнов Михаил Николаевич
МПК: A61K 39/395, A61K 35/16
Метки: плазмы, получения, способ, крови, изоиммунной
Формула / Реферат:
Способ получения изоиммунной плазмы крови, включающий реиммунизацию изоиммунного донора путем введения в его организм размороженных криоконсервированных Rh0(D) аллоэритроцитов активных доноров группы крови 0 (I) или одноименной группы с кровью реиммунизированного донора, отрицательных по фактору Kell, сходных по антигенам систем MNS и Daffi, в количестве 3-5 мл внутривенно или внутримышечно, осуществление забора крови каждые две недели после...
Устройство для получения плазмы, способ ионизации, применение способа и применение устройства (варианты)
Номер патента: 6412
Опубликовано: 29.12.2005
Автор: Сеза Валентен
МПК: H05H 1/24, B01J 19/10
Метки: применение, устройства, варианты, способ, ионизации, получения, плазмы, способа, устройство
Формула / Реферат:
1. Устройство для получения плазмы путем реакции горения вещества или смеси веществ M, отличающееся тем, что содержит резонансную камеру (1), предназначенную для создания стационарной циркуляции потока вещества или смеси веществ (M), подаваемых в резонансную камеру (1) по меньшей мере через одно средство (2) питания и выходящих из резонансной камеры (1) по меньшей мере через один выход (3), выполненный в виде по меньшей мере одного вытянутого...
Фармацевтические композиции, содержащие белок плазмы
Номер патента: 4700
Опубликовано: 24.06.2004
Авторы: Хегедюш Лайош, Пааль Кристина, Петё Габор, Кремпельш Кристина
МПК: A61P 35/00, A61K 47/42
Метки: содержащие, фармацевтические, композиции, плазмы, белок
Формула / Реферат:
1. Растворимый в воде фармацевтический препарат в твердом состоянии или в виде истинного водного раствора, содержащий a) терапевтически активное соединение, обладающее низкой растворимостью в воде, менее 1x10-4 М/л, и существенным сродством связывания с белками плазмы (в дальнейшем "активное соединение"), означающим, что более чем 90% активного соединения связано с белком плазмы в водной среде при спонтанном равновесии и при комнатной...
Способ получения композиции сложного полиэфира, полученная композиция, содержащая ее пленка, раствор для получения композиции и способ его получения
Номер патента: 14016
Опубликовано: 30.08.2010
Авторы: Хельдманн Карл-Хайнц, Отто Бригитта, Зайдель Экхард
МПК: C08K 5/098, C08K 5/00, C08J 5/18...
Метки: композиция, композиции, получения, содержащая, полученная, пленка, сложного, способ, раствор, полиэфира
Формула / Реферат:
1. Способ получения композиции сложного полиэфира, включающий следующие стадии:A) этерификацию дикарбоновой кислоты алкандиолом или переэтерификацию диалкилового эфира дикарбоновой кислоты алкандиолом;B) предварительную поликонденсацию полученного диалкилового эфира дикарбоновой кислоты до форполиконденсата;C) поликонденсацию в расплаве форполиконденсата до сложного полиэфира, причем смесь, которую подвергают поликонденсации, содержит по меньшей...
Предыдущий патент: Способ и устройство для оптимизированной передачи сигналов дистанционного управления, в частности, воротами, дверями и шлагбаумами
Следующий патент: Производное инсулина, обладающее сахароснижающей активностью при пероральном применении, способ его получения и лекарственные формы на его основе
Случайный патент: Способ получения (3s,3s') 4,4'-дисульфандиилбис(3-аминобутан-1-сульфокислоты)