Способ лечения атеросклероза

009661 Настоящее изобретение касается подходов к терапии атеросклероза и связанных с ним состояний человека. Аутоантитела к таким липидам, как холестерин [Swartz G.M., Jr., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995), 15, 990-999]. Ни антитела, ни LDL не являются по отдельности патогенными факторами, но им является только иммунный комплекс из них обоих [Tertov V.V. et al. Atherosclerosis (1990), 81, 183-189, Orekhov A.N. etal. Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211]. Иммунные комплексы, включающие немодифицированные липопротеины плазмы, как известно,имеют низкую атерогенность. Однако если липопротеины становятся модифицированными, в частности окисленными, эти иммунные комплексы становятся высокоатерогенными [Orekhov A.N. et al. Biobhem.Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211, Orekhov A.N. et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (1991), 11,316-326]. Окисление липидов плазмы, которое принимает форму пероксидирования (окисления в перекисное соединение), обычно рассматривается как ответственное за развитие атеросклероза и является постоянно наблюдаемой и отмечаемой в публикациях клинической особенностью этой болезни [Goto Y.In: Lipid Peroxides in Biology and Medicine, Ed. Yagi K., Academic Press, New York, London, Tokyo (1982),295-303, Halliwell B. and J.M.C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford,1989, Schultz D et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (2000), 20, 1412-1413]. Однако до настоящего момента причина этого пероксидирования в плазме была неясной. Настоящее изобретение связано с обнаружением того, что специфическая подгруппа аутоантител способна как связывать, так и окислять липиды и липопротеины. Эти каталитические антитела (абзимы) реагируют с липопротеином низкой плотности и окисляют его с возникновением атерогенных факторов и являются первым опубликованным примером антилипидных абзимов. В различных аспектах настоящее изобретение касается использования антител, окисляющих липиды, в качестве терапевтической мишени при лечении атеросклеротических расстройств. Терапевтическое действие может проявляться в снижении активности опосредованного антителами окисления липидов в сосудистой системе индивида и, таким образом, уменьшением или облегчением симптомов атеросклеротических расстройств. Активность опосредованного антителами окисления липида может быть понижена путем введения ингибитора антител окисления липида указанному индивиду или путем введения агента, который снижает количество или уровень антител, окисляющих липиды, в сосудистой системе индивида, как описано ниже. В одном аспекте настоящего изобретения предложено использование ингибитора антител, окисляющих липиды, в производстве лекарства для использования в способе лечения атеросклеротического состояния индивида. Способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое расстройство, может, таким образом,включать снижение активности опосредованного антителами пероксидирования липидов в сосудистой системе указанного индивида. Активность опосредованного антителами окисления липидов может быть снижена путем ингибирования окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, например, путем использования ингибитора или путем понижения количества или уровня окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, как описано ниже. Антитело, окисляющее липиды, представляет собой молекулу, которая является элементом суперсемейства иммуноглобулина, которое обладает способностью связывания и каталитической активностью. После очистки, например, с использованием белка G, окисляющее липид антитело проявляет как связывание с антигеном, так и каталитическую активность (т.е. окисление липида). И связывание, и каталитическое действие могут быть характерными свойствами окисляющего липиды антитела. В альтернативном случае, активность в отношении окисления липида может быть обусловлена каталитической молекулой, которая сильно связана с антителом и очищается совместно с ним в комплексе (например, при использовании колонки с белком G/белком А или белком L). Эта каталитическая молекула может представлять собой иммуноглобулин или не являться иммуноглобулином, представляя собой молекулу типа фермента или иона металла. После очистки комплекс проявляет способность к связыванию вследствие наличия антитела и каталитическую активность ввиду наличия каталитической молекулы. Окисляющее липиды антитело может, в альтернативном варианте, инициировать окисление липида по другому механизму, например, путем изменения окружения антигена липида (например, через активацию моноцитов) или путем изменения липида или липопротеина, что способствует окислению липида. Каталитическое антитело может быть специфическим для конкретного эпитопа, который несут ряд-1 009661 антигенов, и может поэтому связываться с различными антигенами, которые имеют один и тот же эпитоп. Антитело может не проявлять какое-либо заметное связывание с другими эпитопами. Антитело, таким образом, как говорят, специфически связывается с эпитопом или с антигеном, включающим эпитоп. Эпитоп, который опознается антителом, может быть включен в молекулу хозяина и антигена от инфекционного агента, например бактерии, грибка, вируса или простейших одноклеточных (протозоа). Окисляющее липиды антитело, произведенное хозяином в качестве ответной реакции на инородный антиген, например при патогенной инфекции, может таким образом включаться в перекрестную реакцию с липидами или липопротеинами хозяина или другими антигенами. Окисляющее липид антитело может, таким образом, связываться как с молекулой хозяина, так и с инородным антигеном, и может катализировать окисление одной или обеих из этих молекул. Молекула антитела может окислять, в особенности окислять в перекисное соединение, липидную часть липопротеинов плазмы, в особенности - липопротеинов низкой плотности. Антиген, который связан с окисляющим липиды антителом, может быть элементом семейства молекул, обладающих высокой степенью идентичности последовательностей (т.е. гомологи), которые найдены в ряде инфекционных агентов (например, в двух или более видах грамотрицательных бактерий),или антиген может быть специфичным для конкретного инфекционного агента (т.е. не иметь гомологов в других видах). Кроме того, тот же самый эпитоп может присутствовать в антигенах различных инфекционных агентов, которые иным путем не имеют высоких уровней идентичности последовательностей (т.е. не являются гомологами). Примеры антигенов, которые являются общими для ряда инфекционных агентов, включают аполипопротеин В, OmpA, липополисахарид, hsp60 MQMP, (Р)ОМР, р 54 и липид А. Молекулы антител, которые катализируют окисление липида, называются здесь каталитическими молекулами антител, антилипидными абзимами, абзимами или окисляющими липиды антителами. Как описано выше, такие каталитические антитела могут иметь внутреннюю, или характерную активность оксидазы липида или другую активность, которая приводит к окислению липида, или могут быть естественным образом ассоциированы (т.е. связаны или присоединены нековалентным образом в их естественном состоянии внутри тела) с молекулой, обладающей активностью оксидазы липида. Атеросклеротические расстройства, пригодные для лечения описанными здесь способами, могут включать атеросклероз, ишемическую (коронарную) болезнь сердца: ишемию миокарда (стенокардию),инфаркт миокарда; аневризматическую болезнь; атероматозную периферическую сосудистую болезнь: болезнь подвздошной аорты, хроническую и критическую ишемию нижних конечностей, висцеральную ишемию, болезнь почечной артерии, церебрально-васкулярную болезнь, инсульт, атеросклеротическую ретинопатию, тромбоз и отклонения в свертывании крови и гипертонию. Такие состояния могут быть медицинскими или ветеринарными состояниями. Индивиды, которые могут быть объектами воздействия методов согласно настоящему изобретению,включают людей и животных, в том числе домашних животных, таких как собаки, кошки, лошади и попугаи, животные на ферме, такие как овцы и крупный рогатый скот, и редких или экзотических животных типа слонов и тигров. Ссылки на человеческое здесь следует понимать как включающие и животное, за исключением тех случаев, когда из конкретного контекста следует иное. Ингибитор или другой агент, как описано здесь, можно использовать в способе, который включает операцию оценки состояния индивида в отношении атеросклеротического расстройства. Это может быть достигнуто путем определения активности опосредованного антителами окисления липида в образце,полученном от индивида, как описано ниже. Индивид, в котором идентифицировано наличие окисляющих липиды антител, свидетельствующих об атеросклеротическом состоянии, может быть подвергнут терапевтическому лечению в соответствии с предложенными способами для облегчения данного состояния или его симптомов. Уровень или количество окисляющих липиды абзимов является показателем серьезности состояния и может использоваться для определения специфического режима лечения, как описано здесь. Ингибитор или другой агент можно, таким образом, использовать в способе, который включает испытание способности антитела из образца, полученного от индивида, окислять липид, и введение ингибитора или другого агента для снижения опосредованной антителами активности окисления липидов в сосудистой системе индивида. Способ может дополнительно включать определение опосредованной антителами активности окисления липидов в образце, полученном от индивида после указанного снижения опосредованной антителами активности окисления липидов. Опосредованную антителами активность окисления липидов можно определять так, как описано ниже. Экспериментальные данные, приведенные в настоящем изобретении, также показывают, что подгруппа антител, которые возникают в качестве реакции на инфекции хламидии (Chlamydia), являются аутоантителами, которые вступают в перекрестную реакцию с антигенами хозяина и ответственны за окисление липидов плазмы в перекисные соединения. Показано, что каталитические антихламидийные антитела против хламидии присутствуют в антилипопротеиновых фракциях IgG, извлекаемых из атеросклеротических повреждений человека и сыворотки крови пациентов с клиническими осложнениями-2 009661 атеросклероза, но отсутствуют среди IgG, которые извлекают из сыворотки крови здоровых людей. Каталитические антитела, которые связывают и окисляют липид, как описано здесь, могут поэтому обладать реактивностью по отношению к клеткам Chlamydia, т.е. связываться с ними. Пока атеросклероз в прошлом связывали с присутствием в артериальных стенках бактерий Chlamydia pneumoniae [Roivainen M. et al. Circulation (2000), 101,252-257, Siscovick D.S. et al. J. Infect. Dis. (2000),181, Suppl. 3, S417-420], серологические тесты для обнаружения в плазме или сыворотке пациентов специфичных антихламидийных антител [Mendall M. et al. (1995) J. Infect. 30 121-128, Wang S.-P. et al. (1970) 70, 367-374] не могли использоваться для идентификации или диагностики пациента с атеросклерозом. Значительная часть популяции имеет историю инфекции Chlamydia и, следовательно, имеет в своей сыворотке специфичные антихламидийные антитела без какого-либо клинического проявления атеросклероза [Davidson M. et al. Circulation (1998), 98, 628-633m, Song Y.G. et al. Yonsei Med. J. (2000), 41, 319327]. Само по себе присутствие в плазме или сыворотке антихламидийных антител поэтому не является показателем атеросклероза. Однако каталитические антихламидийные антитела, которые вступают в перекрестную реакцию с антигенами человека и катализируют окисление липопротеинов плазмы, как показано здесь, являются полезными в качестве мишеней при лечении атеросклеротических заболеваний. Окисляющее липиды антитело может, таким образом, связываться с антигеном клеток Chlamydia или быть реактивным к нему, т.е. молекулы антител могут быть антихламидийными абзимами или молекулами антител. Антигеном Chlamydia, как описано здесь, может быть любой иммуноген или иммуногенный компонент клетки Chlamydia, т.е. молекулы из Chlamydia, которые вызывают или способны вызывать иммунную реакцию в млекопитающем по отношению к клеткам Chlamydia, например Hsp60 (Huittinen et al.(2001) Eur Resp. J. 17 (6) 1078-1082, Kinnunen А. et al. (2001) Scand. J. Immunol. 54 (1-2) 76-81). Предпочтительно антиген представляет собой белок или липидный антиген, т.е. он включает или представляет собой группу или фрагмент липида. Липидным антигеном может быть, например, липид, липопротеин или другой компонент клетки, связанный с липидом, который связывает антихламидийные антитела, и термин липидный антиген относится к любому из этих компонентов. Такой антиген может быть очищен, и/или выделен, или находиться внутри клетки Chlamydia. Известны соответствующие способы очистки и/или выделения такого липопротеина, например ВЭЖХ (HPLC). Показано, что антитела, вырабатываемые в ответ на аполипопротеин В человека, являются реактивными к клеткам Chlamydia (см. пример 7). В некоторых вариантах осуществления изобретения окисляющее липид антитело, как описано здесь, может, таким образом, быть реактивным по отношению к аполипопротеину В человека. Клетка Chlamydia может представлять собой клетку вида, принадлежащего к группе Chlamydia psittaci. Группа Chlamydia psittaci включает Chlamydia psittaci и Chlamydia pneumoniae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, клетка Chlamydia представляет собой клеткуChlamydia psittaci овцы. Соответствующие рецептуры живой Chlamydia psittaci овцы в лиофилизированной форме являются коммерчески доступными (Intervet). Ингибитор окисляющего липиды антитела может ингибировать связывание окисляющего липиды антитела с антигеном липида (т.е. блокировать связывающий сайт абзима) или может ингибировать окислительную активность антитела в отношении липида (т.е. блокировать каталитически активные центры). Ингибиторы, которые блокируют каталитически активные центры абзимов, могут включать хелатирущие металл агенты, примеры которых показаны в табл. 7. Ионы металлов переменной валентности в каталитическом центре абзима подвергают целенаправленному воздействию таких хелатных агентов,чтобы нейтрализовать каталитические свойства абзима. Хелатирующие металл агенты, которые ингибируют абзимы, включает аспирин. Другие такие ингибиторы включают антагонисты субстрата, которые предотвращают связывание абзима с его целевым эпитопом (эпитопами) в организме хозяина. Связывающими антагонистами могут быть либо пептид, липид, полисахарид, либо любой другой синтетический или природный продукт, который аналогичен эпитопу абзима. Такой антагонист может быть смоделирован на антигене липида, который может быть, например, антигеном хозяина, т.е. антигеном человека или патогенным антигеном. Активный центр абзима может быть изменен другими способами для того, чтобы инактивировать его каталитические свойства. Например, активный центр абзима может содержать фото- (УФ-) чувствительную группу (группы), которая может быть модифицирована экстракорпоральным (УФ) облучением плазмы/сыворотки, чтобы инактивировать свойства этих молекул окислять липиды до перекисных соединений. Примеры ингибиторов, которые блокируют места связывания абзимов, включают молекулы антиидиотипических антител, включая Fab/Fv или другие фрагменты и производные антител, или молекулы пептида, представляющие фрагмент (фрагменты) комплементарного контура их активных центров (т.е. которые аналогичны антиидиотипической молекуле антитела), что позволяло бы им ингибировать связывание абзимов с их целевыми антигенами. Соответствующие молекулы антитела могут быть получены-3 009661 путем использования поликлональной или моноклональной стратегии или фагового отображения. Могут использоваться другие соединения с антагонистическими свойствами, чтобы конкурировать с антигеном за сайт связывания абзима, например пептид, липид, полисахариды или любой другой синтетический или встречающийся в природе продукт, который аналогичен эпитопу, с которым связывается абзим. Для того чтобы разрушить связывание, можно также использовать другие соединения или химические и физические процедуры, например облучение, как описано выше, которые могут модифицировать сайты связывания абзимов. Представленные здесь данные показывают, что антибактериальное лекарственное средство азитромицин (azithromycin) является ингибитором активности абзима. Таким образом, предполагаемые ингибиторы могут включать обе молекулы, структурно связанные с азитромицином и антимикробными агентами, такими как эритромицин, рокситомицин (roxithromycin), офлоксацин (ofloxacin), клинафлоксацин(clinafloxacin), ципрофлоксацин (ciprofloxacin), клиндамицин (clindamycin), азитромицин (azithromycin),доксициклин (doxycycline), миноциклин (minocycline) и тетрациклин. В ряде аспектов изобретения предложено использование азитромицина в производстве медикамента для использования в лечении атеросклероза, а также использование азитромицина в сочетании со вторым ингибитором абзима, например хелатирущим металлы агентом типа аспирина, в производстве медикамента для использования в лечении атеросклероза. Например, азитромицин и хелатирующий агент,такой как аспирин, можно объединить в одной композиции или вводить одновременно или последовательно. В ряде аспектов изобретения предложено использование азитромицина в способе ингибирования окисляющего липиды антитела, как описано здесь, и способ ингибирования окисляющего липиды антитела, включающий приведение указанного антитела в контакт с молекулой азитромицина. Активность опосредованного антителами окисления липида в перекисное соединение в сосудистой системе индивида можно снижать путем снижения количества или уровня окисляющих липиды антител в сосудистой системе индивида, например, используя специфические терапевтические агенты, как описано здесь. Способ лечения атеросклеротических расстройств может включать отщепление или удаление антител, которые окисляют липиды, из сосудистой системы нуждающегося в этом индивида. Агенты, подходящие для использования в таких способах, описаны ниже. В ряде аспектов изобретения предложено использование агента, который снижает уровень абзимов в сосудистой системе индивида, в производстве медикамента для использования в способе лечения атеросклеротического состояния в указанном индивиде и способ лечения атеросклеротического состояния,включающий снижение уровня абзимов в сосудистой системе индивида. Такой способ может включать операцию определения присутствия или количества окисляющих липиды антител, как описано здесь, в образце, полученном от индивида, до и/или после операции устранения или удаления. Антитела, которые окисляют липиды, т.е. абзимы, могут быть удалены из сосудистой системы, т.е. из циркуляции, любым из множества способов. Клетки, ответственные за производство абзимов, можно ингибировать, нейтрализовать или устранить, например, используя специфические антитела против этой субпопуляции клеток В. Ингибирование производства абзимов может быть достигнуто как путем связывания антитела, так и путем воздействия цитотоксических агентов, загружаемых на эти антитела и дотавляемых в клетки В. Производство специфических антиабзимных антиидиотипичных антител может быть активизировано. Это может быть достигнуто, например, путем идентификации подходящих антиидиотипичных антител при использовании методики, связанной с проявляемым фагами антителом, и введения этих антител или кодирующей их нуклеиновой кислоты в индивида, или путем имплантации рекомбинантных клеток хозяина, которые производят антиидиотипические антитела. Агент для сокращения уровней абзима может представлять собой химический, физический или биологический объект, который внедрен в хозяина и самостоятельно или совместно с гомеостазом/метаболизмом хозяина, прямо или косвенно инактивирует, или нейтрализует, или устраняет циркуляцию абзимов. Например, можно использовать полимер или другое вещество, которые несут аналогичные эпитопу мишени с высоким сродством и поэтому способны к связыванию циркулирующих абзимов,но также способны быть поглощенными и переваренными фагоцитными клетками, таким образом удаляя связанные абзимы из циркуляции. Плазму пациента можно подвергнуть диализу через сорбенты или мембраны для специфического удаления абзимов из циркуляции, или плазму можно подвергнуть экстракорпоральной обработке химическими или физическими средствами для осуществления инактивации абзимов. Сорбент может, например, быть загружен специфическим эпитопом или хелатообразователем для специфического удаления абзимов из циркуляции путем использования экстракорпоральных систем диализа. В других вариантах осуществления сыворотку или плазму можно облучать экстракорпорально, как описано выше, чтобы инактивировать абзимы. Специфические противомикробные средства, например противохламидийные бактерицидные аген-4 009661 ты, можно использовать для удаления окисляющих липиды антител из сосудистой системы путем устранения бактериальной инфекции из организма "хозяина". Такие противомикробные средства могут также мобилизовать собственные механизмы гомеостаза тела для прекращения/блокировки/устранения производства окисляющих липиды антител. Примеры соответствующих противомикробных средств представлены в табл. 8. Способ может включать сочетание одного или более из вышеупомянутых подходов, которые могут применяться к индивиду одновременно или последовательно. Например, активность окисления липидов антителами можно снижать или устранить, например, путем использования первого ингибитора, такого как антиоксидант, при одновременном или последовательном введении другого ингибитора, такого как хелатирующий металлы агент. Подходящие сочетания ингибиторов включают, как описано здесь, аспирин и азитромицин. В альтернативном варианте одновременно или последовательно с антимикробным средством можно вводить ингибитор, такой как антиоксидант, чтобы снизить находящееся в циркуляции количество или уровень окисляющих липиды антител. Комбинации агентов, специфически направленных против абзимов, таких как антихламидийные абзимы, можно, таким образом, использовать одновременно или последовательно для лечения атеросклеротического состояния. Точный выбор агентов, доз, продолжительности и других параметров может быть определен практикующим врачом в соответствии с индивидуальным случаем. Эта эффективность специфического лечения может быть определена для каждого индивидуального случая путем контроля изменений активности абзимов в сыворотке подвергнутых лечению пациентов при использовании описанных здесь способов. В некоторых обстоятельствах продуцирование абзимов может быть вызвано в ответной реакции на патогенную инфекцию, при этом абзимы, произведенные против патогенов, вступают в перекрестную реакцию с антигенами организма хозяина и вызывают окисление липидов. В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое состояние, включающий введения индивиду двух или более агентов, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, хелатирующих агентов и антимикробных соединений. В одном из аспектов изобретения предложено использование антимикробного агента в производстве медикамента для использования в способе лечения атеросклеротического состояния индивида. Подходящее антимикробное соединение может быть выбрано из группы, состоящей из эритромицина, рокситомицина, офлоксацина, клинафлоксацина, ципрофлоксацина, клиндамицина, азитромицина,доксициклина, миноциклина и тетрациклина. Некоторые противомикробные соединения, включая азитромицин, как показано здесь, также ингибируют антитела, окисляющие липиды. Предпочтительно противомикробные вещества вводят в сочетании с ингибитором абзимов, таким как антиоксидант или хелатирующий металлы агент. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего атеросклеротическое состояние, включающий введение индивиду двух или более агентов, выбранных из группы, состоящей из антиоксидантов, хелатирующих соединений и противомикробных соединений. Подходящие антиоксиданты, хелатирующие соединения и противомикробные соединения описаны здесь в другом месте. Способ может включать определение активности окисления липидов антителами образца, полученного от индивида до, во время и/или после указанного лечения. Еще одним классом агентов, пригодных для снижения уровней абзимов, являются вакцины и иммунотерапевтические агенты на основе антигенов клетки хламидии. Введение вакцины, включающей клетки хламидии, как показано здесь, снижает или устраняет активность абзимов (см. табл. 10 - "после вакцинации"). Вакцины хламидии можно поэтому использовать для снижения содержания или устранения абзимов в сосудистой системе людей и животных, имеющих атеросклероз, или для блокирования производства абзимов. В следующих аспектах настоящего изобретения предложена вакцина хламидии, в частности вакцина Chlamydia pneumoniae, для использования в лечении атеросклеротического расстройства, причем способ лечения атеросклеротического расстройства включает введение вакцины хламидии индивиду, нуждающемуся в этом, и использование вакцины хламидии, как описано, при получении лекарства для использования при лечении атеросклеротического состояния. Вакцина представляет собой невирулентный материал, включающий один или более антиген от патогена, такого как хламидия, в частности Chlamydia pneumoniae, который стимулирует активный иммунитет индивида и защищает от инфекции этим патогеном или другими близкородственными патогенами. Вакцина хламидии может представлять собой невирулентную клетку хламидии, в частности клеткуChlamydia pneumoniae, например, убитую нагреванием или обработанную водным раствором формальдегида клетку хламидии или компонент, вытяжку или фракцию такой клетки. Ветеринарные вакцины хламидии известны в технике, и рецептуры на основе живых Chlamydia psittaci овцы в лиофилизованной форме являются коммерчески доступными (Intervet).-5 009661 Подходящая вакцина хламидии, в частности вакцина Chlamydia pneumoniae, может находиться в составе лекарственной (т.е. не ветеринарной) рецептуры. Такая рецептура пригодна для введения человеку. Как описано выше, способы данного изобретения могут включать оценку индивида в отношении атеросклеротического расстройства до, во время и/или после лечения путем определения активности окисления липидов антителами образца, полученного от индивида. Активность окисления липида является показателем индивида, имеющего атеросклеротическое состояние и таким образом являющегося кандидатом для лечения в соответствии с предложенными способами. Активность окисления липидов может быть определена путем испытания способности антитела из образца, полученного от индивида, к окислению липида. Например, антитело из серологического образца может быть захвачено с использованием иммобилизованного антиидиотипического антитела и определена активность захваченного антитела в отношении окисления липида. Присутствие в образце антитела, которое окисляет липиды, является показателем индивида, имеющего атеросклеротическое расстройство или страдающего от него или имеющего риск появления такого расстройства в будущем. Такой индивид может быть подходящим образом подвергнут лечению с использованием описанных здесь способов. Количество, уровень или активность таких антител являются показателями серьезности расстройства, т.е. увеличенные количества и/или активность антител являются показателем увеличения серьезности расстройства. Таким образом могут быть определены наличие и/или серьезность атеросклеротического расстройства индивида. Окисляющее липид антитело может связываться с антигеном хламидии. Может быть определено связывание с антигеном хламидии молекулы антитела из образца, полученного от индивида и обладающего активностью окисления липидов (т.е. окисляющего липиды) или окисление липидов антителом, полученным от индивида, который связывается с антигеном хламидии. В альтернативном варианте может быть определено как связывание с антигеном хламидии, так и активность окисления липида молекулой антитела из образца, полученного от индивида. Подходящий образец может представлять собой сыворотку, плазму, кровь или другой биологический образец, предпочтительно серологический или плазменный образец. Антитело или молекула антитела, как описано здесь, предпочтительно представляет собой молекулу IgG. Методика определения связывания не является признаком настоящего изобретения, и специалисты способны выбрать соответствующую методику в соответствии с их предпочтениями и общими знаниями. Активность окисления липида, включая активность окисления липида в пероксидные соединения,может быть определена путем определения окисление липида организма хозяина (т.е. липида из образца), липида от инородного антигена типа клетки хламидии, или липида из другого источника, который может, например, быть добавлен в качестве части метода испытания. Окисление липида может быть определено путем измерения накопления продуктов или побочных продуктов, таких как совместно окисленные репортерные молекулы или исчезновения или расхода субстратов, таких как немодифицированные липиды, или косубстратов, таких как кислород. Много способов определения окисления липида в пероксидное соединение известны в технике и являются подходящими для использования в соответствии с настоящим изобретением. Точная методика определения окисления липида не является признаком настоящего изобретения, и специалисты способны выбрать подходящую методику в соответствии с их предпочтениями и общими знаниями. Подходящие способы, например, описаны в CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research(CRC Руководство по методам исследования радикала кислорода), CRC Press, Boca Raton, Florida (1985),Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990);(1996). В предпочтительных вариантах осуществления окисление определяют путем определения образования (т.е. присутствия или количества) продукта окисления липида. Могут быть определены продукты и/или интермедиаты окисления липидов, в которых было инициировано окисление, или могут быть определены продукты окисления и/или интермедиаты липидов, в которых распространяется окисление. Соответствующие продукты окисления липидов могут включать альдегиды типа малонового диальдегида (МДА, MDA), перекиси (липида), диеновые соединения или газообразные углеводороды. Продукты окисления липидов могут быть определены любым подходящим способом. Например, продукты окисления липида до пероксидных соединений могут быть определены путем использования ВЭЖХ(1996), 119-131), УФ-спектроскопии (Kinter, M. Quantitative analysis of 4-hydroxy-2-nonenal. Ibid., 133145), или газовой хроматографии с масс-спектрометрией (Morrow, J.D., and Roberts, L.J. F2-Isoprostanes:prostaglandin-like products of lipid peroxidation. Ibid., 147-157). Окисление липида в пероксидное соединение может приводить к окислению белков, углеводов,нуклеиновых кислот и других типов молекул. Продукты такого окисления также могут использоваться-6 009661 для косвенного измерения активности абзимов. Кроме того, окисление в пероксидное соединение может приводить к изменениям в свойствах репортерных молекул, связанным с распространяющимся окислением липида. Как описано ниже, репортерные молекулы могут быть инкапсулированы в этих липидах,например как липосомы, и высвобождение репортерной молекулы из липосомы является показателем окисления. Соответствующие репортерные вещества и молекулы могут включать неповрежденные светящиеся бактерии, люминол, люцигенин (lucigenin), фолазин (pholasin) и люциферин. Такие вещества могут, например, быть соединены с молекулами, включающими Н 2 О 2/О 2-/О 2, такими как пероксидаза, эстераза,оксидаза, люцифераза, каталаза, пероксид дисмутазы, перилен, NAD+, и акридиниевые сложные эфиры бис(трихлорфенил)оксалата (Campbell А.K. Chemiluminescence. VCH, Ellis Horwood Ltd., England, 1988). Другие материалы, восприимчивые к свободнорадикальным цепным реакциям, также можно использовать для определения окисления липида. Например, окисление липида в пероксидные соединения,как цепной процесс, инициирует и ускоряет полимеризацию акриламида. Таким образом, окисление липида может быть определено путем определения сополимеризации 14 С-акриламида (Козлов Ю.П. (1968) Роль свободных радикалов в нормальных и патологических процессах. Докторская диссертация. МГУ, Москва, 1968). Так как окисление липидов и липопротеинов в пероксидные соединения является процессом, протекающим с участием свободных радикалов, содержание абзимов, окисляющих липиды, может быть измерено путем обнаружения этих радикалов. Радикалы могут быть обнаружены или определены путем использования внутренней низкоуровневой хемилюминесценции (с использованием сенсибилизаторов или без них) (Владимиров В.А. и Аршаков А.И. Окисление липидов в пероксидные соединения в биологических мембранах. Наука, Москва (1972); Vladimirov, Y.A. Intrinsic low-level chemiluminescence. In:Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65-82), электронного парамагнитного резонанса (со спиновыми ловушками (Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radicalmetabolites with electron spin resonance. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York,Tokyo (1996), 11-24) или без спиновых ловушек (Петяев М.М. Биофизические подходы в диагностике рака. Медицина, Москва (1972 или другими способами, известными в технике. Окисление липидов также может быть определено путем определения расхода жирных кислот или других субстратов этой реакции. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения определяют образование малонового диальдегида (МДА) с помощью реакции с 1 mM 2-тиобарбитуровой кислоты путем определения поглощения при 525 нм. Липид, подвергаемый окислению антихламидийным абзимом, может включать липидную часть липопротеина, жирной кислоты, фосфолипида, холестерина, сложного эфира холестерина или триглицерида. Как описано выше, активность окисления липида абзимом может также приводить к окислению белка(протеина), углевода и/или нуклеиновой кислоты, например белковой и/или углеводной части липопротеина. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления определяют окисление липида хламидии,потому что это предусматривает удобный одностадийный анализ, который можно использовать для определения, например, присутствия или отсутствия антихламидийного абзима. Окисление липида хламидии происходит в присутствии специфического к Chlamydia антитела, который связывает и окисляет антиген хламидии, включающий липид. Атеросклеротическое состояние в индивиде может быть оценено путем контактирования образца,полученного от индивида, с антигеном клетки хламидии, и определения окисления липида в указанном образце. Определение окисления липида может включать определение количества, уровня или степени окисления, которое вызвано контактом с антигеном Chlamydia. Предпочтительно, антиген клетки хламидии представляет собой антиген липида, и определяют окисление антигена липида. Антиген может быть очищен и/или изолирован или, более предпочтительно, он может быть включен в клетку хламидии. Атеросклеротическое состояние индивида можно, таким образом, оценить путем контактирования образца, полученного от индивида, с клеткой хламидии, и определение окисления липида указанной клетки. Окисление липида, например в образце, в присутствии клетки или антигена хламидии можно сравнивать с окислением липида в отсутствие клетки или антигена хламидии. Увеличение окисления липида является показателем присутствия антилипидного абзима. Окисление липида/липопротеина в пероксидные соединения представляет собой цепную свободнорадикальную реакцию и способно к самораспространению от одной молекулы к другой, к содержащей липид мицелле или к целой клетке (после присоединения к ее мембране через рецепторы или неспецифическую абсорбцию) (Chemical and Biochemical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase. Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam (1980); Lipid Peroxides in Biology and Medicine. AcademicTaylor and Francis, Washington (1997. В некоторых вариантах выполнения описанных здесь способов распространение окисления в пероксидные соединения используется для облегчения обнаружения абзимов, окисляющих липиды. Например, микроконтейнер, такой как липосома, пузырек или микрокапсула, которая имеет мембрану из материала, восприимчивого к свободнорадикальному разложению, например фосфолипидную мембрану, может быть нагружена красителем, флуорохромом или другим репортерным веществом или индикаторным материалом, например таким как эозин, флуорескамин (Fluorescamine), родамин В или малахитовая зелень, и использована для обнаружения окисляющего липид абзима. Таким образом, окисление липида в описанных здесь способах может быть определено путем определения высвобождения инкапсулированного репортерного вещества. Нагруженный микроконтейнер может быть смешан с образцом плазмы или сыворотки. Затем к смеси добавляют антиген хламидии, преимущественно включенный в клетку хламидии или в ее часть. После этого любые окисляющие липид абзимы в образце связываются с антигеном и инициируют окисление в пероксидные соединения. Атеросклеротическое состояние может быть оценено путем контактирования образца, полученного от индивида, с антигеном клетки хламидии в присутствии микроконтейнера, восприимчивого к окислению липида и содержащему репортерное вещество, и определения высвобождения указанного репортерного вещества из микроконтейнера. Инициирование окисления липида/липопротеина путем взаимодействия антигена хламидии с абзимом будет самораспространяться и охватывать покрытие микроконтейнера. Это повреждает покрытие и вызывает высвобождение репортерного вещества в окружающий раствор. Затем обнаруживают это высвобождение. Если интенсивность сигнала, произведенного высвобождением репортера, недостаточна для получения регистрируемого или обнаруживаемого сигнала, в реакционную смесь может быть включен агент распространения свободных радикалов или сенсибилизатор, например свободные ионы и комплексыFe2+/Co+ или других металлов кратковременной валентности. Эти и другие сенсибилизаторы служат для размножения количества свободных радикалов в системе. Высвобождение инкорпорированного материала из микроконтейнера ведет к изменениям в физических/химических свойствах реакционной смеси, которые могут быть зарегистрированы визуально (или другими обычными средствами). Альтернативно, поврежденные/фрагментированные/растворенные микроконтейнеры могут быть отделены от немодифицированных активным центрифугированием или пассивной седиментацией. Вместо липосом или других микроконтейнеров (нагруженных репортерными веществами) в качестве цели для распространения окисления липидов/липопротеинов в пероксидные соединения, вызванного антилипидными абзимами, могут использоваться эритроциты от самой пробы крови. Бактерии или антигены хламидии можно вводить или приводить в контакт с пробой крови, возможно в присутствии сенсибилизатора, для обеспечения распространения реакции окисления в пероксидные соединения. Окисление липида можно определять путем определения гемолиза эритроцитов в пробе крови. Любое инициирование окисления липида/липопротеина взаимодействием антигена хламидии с абзимом в образце приведет к самораспространению и распространению на мембрану клетки эритроцита,приводя к повреждению и в конечном счете лизису (растворению) клетки. Появление гемолиза в образце цельной крови в качестве реакции на добавление бактерий/антигенов Chlamydia поэтому является показателем присутствия окисляющих липиды абзимов. Гемолиз может быть определен любым подходящим способом. Атеросклеротическое состояние может быть оценено путем контактирования образца, получаемого от индивида и включающего эритроциты с антигеном клетки хламидии, и определения гемолиза указанных эритроцитов. Липосомы или другие микроконтейнеры могут быть нагружены, например, веществом, который может проявлять цвет, отличающийся от красного цвета гемоглобина. В альтернативном варианте центрифугирование исследуемых образцов или даже пассивная седиментация позволяет отделить неповрежденные микроконтейнеры/эритроциты. Высвобождение репортерного красителя или гемолиз являются показателями присутствия окисляющих липиды антител в анализируемом материале. Интенсивность сигнала коррелирует с их активностью/концентрацией. Так как цельная кровь может быть проанализирована с использованием описанных выше способов,они не включают операцию центрифугирования и могут использоваться вне лаборатории или в домашних условиях. Присутствие или серьезность атеросклероза можно, например, определить путем сравнения наблюдаемого репортерного сигнала или гемолиза с известными значениями для пациентов, страдающих атеросклерозом, и нормальных индивидов. Такое сравнение может быть выполнено с использованием диаграммы, шкалы, графика или калибровки, которая указывает количество или уровень репортерного сигнала или гемолиза при конкретных стадиях или степени серьезности атеросклероза. Окисление липида в пероксидные соединения является окислительно-восстановительным процессом, который также может быть измерен путем использования объединенной окислительно-8 009661 восстановительной системы (редокс-системы). Соответствующие редокс-системы включают физические и химические системы. Например, сенсорный чип можно использовать для обнаружения изменений в редокс-потенциале связанной с ним реакции окисления липида. Ряд сенсорных чипов на основе редоксферментов или редокс-медиаторов известен в технике. Оба эти типа сенсоров можно приспособить/использовать для обнаружения связанных с ними молекул свободных радикалов или редоксмолекул (Hall E.A.H. Biosensors. Redwood Press Ltd., Great Britain, 1990). Накопление Н 2 О 2, произведенного окислением липида в перекисные соединения, может быть измерено, например, путем добавления связанной с ним реакции на основе пероксидазы, в которой пероксид водорода будет использоваться для окисления другого ее субстрата (субстратов) и производить окрашенный продукт. Накопление О 2-, произведенного окислением липида в пероксидные соединения, может быть определено путем использования O2 чувствительных молекул типа цитохрома С или рибофлавина (витамина В 2). В альтернативном варианте при окислении липида в пероксидные соединения расходуется молекулярный кислород, и, следовательно, можно использовать любую О 2-зависимую химическую реакцию или физический процесс, например, кислородный электрод или полярографию. (Polarography. Ed. KolthoffI.M., Lingane J.J. Interscience Publishers, New York, London, 19520.) Аспекты настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы со ссылками на сопутствующие фигуры чертежей, описанные выше, и пояснены нижеприведенными экспериментальными примерами и таблицами, предназначенными для иллюстрации, но не налагающими ограничений. Дальнейшие аспекты и варианты выполнения будут очевидны для специалистов. Все документы, упомянутые в данном описании, включены в него путем ссылки. На фиг. 1 представлены результаты реакции агглютинации между 100:1 Chlamydia овцы и IgG, экстрагируемым из атеросклеротического повреждения человека. На фиг. 2 представлена зависимость окисления Chlamydia овцы в пероксидные соединения от концентрации IgG атеросклеротического повреждения человека. Концентрация Chlamydia была постоянной,pH составлял 5,7. На фиг. 3 представлена зависимость кинетики Михаэлиса-Ментена (Michaelis-Menten) окисления липида в пероксидные соединения в Chlamydia овцы с 1,8 мкг IgG из атеросклеротического повреждения человека; кажущееся KM=13,3-16,1 на 1 мкл суспензии Chlamydia; pH 5,7. На фиг. 4 показано влияние добавления суспензии Chlamydia овцы на окисление липида в пероксидное соединение в сыворотке человека. 10 мкл бактериальной суспензии было добавлено к 990 мкл разбавленной 1:1 сыворотки; pH 5,7; все смешанные образцы были подвергнуты инкубации при 37 С в течение 18 ч (номера сывороток - те же, что в табл. 5). На фиг. 5 показана корреляция между степенью стеноза коронарной артерии и активностью окисляющих липиды антихламидийных антител у пациентов, страдающих ИБС. Серьезность стеноза представлена в значениях шкалы, которая была рассчитана как интегральный параметр стеноза коронарных артерий, оцениваемых с помощью ангиографии. На фиг. 6 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрации триглицеридов в сыворотке пациента, страдающего ИБС. На фиг. 7 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и общей концентрацией холестерина в сыворотке пациента, страдающего ИБС. На фиг. 8 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрациейLDL-холестерина в сыворотке пациента, страдающего ИБС. На фиг. 9 показана корреляция между степенью стеноза мозговой артерии и активностью окисляющих липиды антихламидиевых антител в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ). Серьезность стеноза представлена в значениях шкалы, которая была рассчитана как интегральный параметр стеноза мозговых артерий, оцениваемых с помощью ангиографии. На фиг. 10 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрацией триглицеридов в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ). На фиг. 11 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и общей концентрацией холестерина в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ). На фиг. 12 показана зависимость между степенью стеноза коронарной артерии и концентрациейLDL-холестерина в сыворотке пациента, страдающего ишемической церебральной болезнью (ИЦБ). На фиг. 13 представлена перекрестная реакция антител антиаполипопротеина В с Chlamydia. На фиг. 14 показано влияние инактивации абзима на свертывание крови. Табл. 1 содержит данные, показывающие влияние IgG фракции, которую извлекают из атеросклеротического повреждения человека на окисление в перекисное соединение липида бактерий Chlamydia;pH 5,7; все измерения сделаны трехкратно. Табл. 2 содержит данные, показывающие способность к перекрестной реакции для поврежденияIgG между липопротеинами сыворотки человека и вытяжкой Chlamydia psittaci овцы. Табл. 3 содержит данные, показывающие влияние Chlamydia кошки на окисление в пероксидные-9 009661 соединения липида в сыворотке человека; все измерения сделаны трехкратно. Табл. 4 содержит данные, показывающие роль IgG в инициировании окисления липида в пероксидное соединение Chlamydia овцы в плазме человека; все измерения сделаны трехкратно. Табл. 5 содержит данные, показывающие влияние добавления Chlamydia овцы в контрольную сыворотку и в сыворотку пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза. В табл. 6 показано ингибирование активности окисления липида атеросклеротического повреждения IgG с помощью ингибиторов-антиоксидантов. В табл. 7 представлены примеры хелатирующих металлы агентов, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. В табл. 8 представлены примеры противомикробных веществ, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. В табл. 9 представлены примеры антиоксидантов, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. В табл. 10 представлены уровни окисляющих липиды антихламидийных антител в здоровой и инфицированной овце (числа в скобках представляют % увеличения/уменьшения по отношению к контрольным). В табл. 11 показано ингибирование абзимов при использовании хелатирующих металлы агентов. В табл. 12 показано ингибирование in vitro активности абзима при использовании хелатирующих металл агентов. В табл. 13 показано влияние аспирина на активность антихламидийных абзимов у пациентов с коронарной болезнью сердца. В табл. 14 показано влияние аспирина на активность антихламидийных абзимов у пациентов с "немой" ишемией миокарда. В табл. 15 показана активность абзимов у пациентов, подвергнутых лечению антимикробным агентом. В табл. 16 показана активность абзимов у пациентов, подвергнутых ежедневному лечению антимикробным агентом совместно с аспирином. В табл. 17 показано клиническое состояние пациентов, подвергнутых лечению только антимикробным агентом. В табл. 18 показаны средние уровни абзима в группах индивидов, страдающих от состояний, связанных с атеросклерозом. В табл. 19 показаны индивидуальные уровни абзимов у пациентов, страдающих от стенокардии и получавших или не получавших аспирин. В табл. 20 показана индукция абзимов у кроликов, инокулированных Chlamydia. В табл. 21 показано влияние обработанной формалином хламидии (Chlamydia) на кроликов, имеющих индуцированные абзимы. В табл. 22 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, подвергнутых лечению азитромицином, 500 мг ежедневно (терапия группы А). В табл. 23 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, подвергнутых лечению азитромицином, 500 мг, плюс аспирин, 250 мг, ежедневно (терапия группы В). В табл. 24 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов, подвергнутых лечению азитромицином, 500 мг ежедневно плюс антиоксиданты (терапия группы С). В табл. 25 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов терапии группы D, подвергнутых лечению аспирином, 250 мг ежедневно (терапия группы D). В табл. 26 показана активность антихламидийных абзимов у пациентов контрольной группы. В табл. 27 показаны сводные результаты антиабзимной терапии. В табл. 28 показана оценка тяжести стенокардии (angina pectoris) с помощью модифицированной анкеты Роуза-Блэкберна (Rose-Blackburn) до и после лечения. В табл. 29 показаны подсчеты абзимов и результатов теста Роуза-Блэкберна до и после лечения пациентов с ИБС, показавших отрицательную реакцию на наличие антихламидийного IgG. В табл. 30 показаны ингибиторные свойства азитромицина при воздействии на абзимы. В табл. 31 показано влияние различных лекарств на активность антихламидийного абзима. В табл. 32 показано влияние антиабзимной терапии на тромбоз и свертывание крови. Эксперименты Материалы и методы. Образцы. Использовались по 3 образца сыворотки от 22 пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза, показанных к операциям шунтирования коронарной артерии и брюшной аорты в Центре сердечнососудистой хирургии Клинического Госпиталя 1 в Ростове-на-Дону, Россия. Из этих пациентов 20 были мужчины и 2 женщины, в возрасте от 47 до 66 лет. Один из этих пациентов, номер 6/6 а, имел острый инфаркт миокарда в момент испытания, и следовательно, данные этого пациента не были включены в некоторые окончательные вычисления. Контрольная группа включала- 10009661 клинически здоровых добровольцев, 5 из которых были мужчины и 5 женщины, в возрасте от 40 до 55 лет. Части атером брюшной аорты от 7 из этих пациентов были использованы для извлечения фракцииIgG с использованием в качестве сорбента белка А, как описано ниже. Экстракция IgG из атеросклеротического повреждения. Части аорты (массой во влажном состоянии приблизительно 200-400 мг) были разрезаны на части приблизительно 10 мг каждая, помещены в 5,0 мл PBS с 1% неионным ПАВ Igepal CA-630 и гомогенизированы механическим гомогенизатором (Ultra-Turrax) на полной мощности с 15 мм зондом три раза по 3 секунды каждый, с 20-секундными интервалами охлаждения. После гомогенизации нерастворимые компоненты были отделены центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин, и надосадочные жидкости были использованы для анализа. Надосадочную жидкость обрабатывали белком А, присоединенным к поперечносшитой 4% гранулированной агарозе при 37 С в течение 30 мин. Фракцию иммуноглобулина, присоединенную к гранулам, затем подвергали вращению при 5000g в течение 10 мин и декантировали надосадочную жидкость. Чтобы удалить любые липопротеины, присоединенные к осажденным иммуноглобулинам, образцы были снова суспендированы с помощью 10% Igepal СА-630. Затем их подвергали центрифугированию при 5000g в течение 10 мин, и надосадочную жидкость декантировали. Для удаления ПАВ осуществляли три последовательных промывки в избытке фосфатного буфера с центрифугированием в том же режиме. Удаление липопротеина из фракции иммуноглобулина было подтверждено отсутствием холестерина в этой фракции. Определение антихламидиевых абзимов. Кровь была отобрана из локтевой вены утром после голодания в течение ночи, сыворотка была отделена и заморожена при -20 С до испытания. Присутствие антихламидийных антител было измерено в реакции агглютинации (свертывания) с клетками Chlamydia овцы и путем анализов методом ELISA (на основе рекомбинантного антигена). Для реакции агглютинации постепенные разбавления исследуемой сыворотки были инкубированы 106 живых клеток Chlamydia овцы в течение 24 ч при 37 С. Появление агрегатов было обнаружено и оценено при 700 нм. Анализ методом ELISA выполнен в соответствии с инструкциями изготовителя(Medac). Титр 1:64 рассматривался как сероположительный. Определение окисления липидов в пероксидные соединения. Окисление липида в пероксидные соединения оценивали по уровню концентрации МДА, которая была измерена спектрофотометрическим методом [Draper, H.H. et al. Free Radic. Biol. Med. (1993) 15,353]. Этот метод основан на образовании окрашенного продукта при взаимодействии малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой. Реакционная способность в перекрестной реакции между липопротеинами сыворотки и Chlamydia.IgG фракцию, включающую антихламидийные абзимы, экстрагировали из атеросклеротического повреждения человека, как описано выше. 100 мкл этой фракции (содержащей 1 мкг/мл) был предварительно инокулирован 890 мкл цельной или обезжиренной сыворотки от здорового донора в течение 1 ч в 37 С; pH 5,7. Липопротеины (и связанный материал) были удалены из сыворотки путем препаративного ультрацентрифугирования в растворе KBr в соответствии с ранее описанным методом [Havel R.J. et al. J. Clin.Invest. (1955) 34, 1345-1353.22]. Затем к сыворотке добавили 10 клеток Chlamydia psittaci (Intervet) в 10 мкл объеме. Степень окисления, индуцированного контактом с клетками хламидии, определяли с использованием описанного выше метода. В присутствии связывания между антихламидийными абзимами и липопротеинами плазмы не наблюдается никакого дополнительного окисления при контакте с клетками хламидии, поскольку антихламидийные абзимы удалены путем ультрацентрифугирования. В отсутствие связывания между антихламидийными абзимами и липопротеинами плазмы наблюдается окисление при контакте плазмы с клетками хламидии, потому что антихламидийные абзимы все еще присутствуют в образце. Анализ антихламидийных абзимов. При анализе антихламидийных абзимов использовали следующие реактивы: 1) живые Chlamydia овцы (лиофилизованная форма); 2) PBS (для растворения бактерий); 3) 0,05 М ацетатный буфер, pH 4,0; 4) 40% трихлоруксусная кислота; 5) 1 мМ 2-тиобарбитуровая кислота. Присутствие или количество каталитических антихламидийных антител в образце было установлено следующим образом. 1. Образцы исследуемой сыворотки разбавили 1:1 0,05 М ацетатным буфером с pH 4,0, чтобы ко- 11009661 нечная величина pH этих образцов составляла 5,6-5,8. 2. 990 мкл разбавленной сыворотки смешивали с 10 мкл коммерческой вакцины живой Chlamydia овцы. 3. Образцы затем инкубировали в течение ночи (12-16 ч) при 37 С. 4. К каждому образцу добавляли 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты и 250 мкл 1 мкМ 2 тиобарбитуровой кислоты. 5. Все образцы помещали в водяную баню и кипятили 30 мин. 6. Образцы охлаждали и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. 7. Надосадочные жидкости собирали и измеряли их поглощение при =525 нм для определения концентрации малоновых диальдегидов (МДА, MDA), которые являются продуктами окисления липида в пероксидные соединения. Результаты Пример 1.IgG экстрагировали из атеросклеротического повреждения пациента с использованием метода, описанного выше. Было установлено, что в этой фракции IgG присутствуют антихламидийные антитела(фиг. 1). Была определена способность извлеченной фракции IgG окислять липид. Показано, что фракцияIgG вызывает окисление в пероксидные соединения липидов штаммов Chlamydia psittaci, полученных как от кошек, так и от овец (табл. 1). Кинетический анализ этой реакции окисления в пероксидные соединения показал, что реакция имела ферментативный характер (фиг. 2, 3). Бактерию хламидии можно поэтому рассматривать как субстрат для их антител, извлекаемых из атеросклеротического повреждения человека. Эпитопы для антихламидийных абзимов были далее исследованы с использованием неионных ПАВ. Обработка Chlamydia средствами Triton Х-100 или Igepal CA-630 предотвращает окисление липидов в бактериях экстрагированными абзимами. Подобные результаты были получены и при обработке липопротеинов низкой плотности сыворотки крови человека. Это дает указание на то, что эпитопы для каталитических антител являются конформационными,и/или целостность антигена важна для инициирования окисления липидов как в липопротеинах, так и вChlamydia. Затем была определена способность антихламидийных абзимов вступать в перекрестную реакцию с липопротеинами плазмы. IgG, экстрагированный из атеросклеротического повреждения, был предварительно инкубирован с сывороткой пациента, чтобы позволить антилипопротеиновым антителам в экстракте взаимодействовать с немодифицированными липопротеинами. Затем липопротеины и связанные с ними антитела были удалены ультрацентрифугированием. Было установлено, что каталитические антихламидийные антитела были удалены с липопротеином(табл. 2). Это показывает, что каталитические антихламидийные антитела вступают в перекрестные реакции как с липопротеинами сыворотки, так и с бактериями штаммов Chlamydia овцы. Далее было исследовано присутствие антихламидийных антител в сыворотке пациентов, страдающих атеросклерозом. Наблюдалось, что добавление Chlamydia овцы к сыворотке пациентов вызывает увеличение окисления липидов в пероксидные соединения в пределах образца. Подобный же эффект наблюдали со штаммом Chlamydia кошки (табл. 3). Наблюдаемые эффекты были следствием присутствия окисляющих липиды антихламидийных антител во фракции IgG сыворотки пациента (табл. 4). Поэтому наблюдали, что каталитические антитела из сыворотки пациентов, страдающих атеросклерозом, вступают в перекрестную реакцию как с липопротеинами, так и с Chlamydia овцы. Корреляционный анализ концентрации антихламидийных и антилипопротеиновых антител в сыворотке человека показал, что оба эти параметра имеют статистически значимую положительную корреляцию с высоким коэффициентом корреляции 0,82. Это дополнительно указывает на то, что одно и то же антитело обладает обоими видами связывающей активности. При исследованиях пациентов, страдающих атеросклерозом, с использованием метода анализа,описанного выше, каталитические антихламидийные антитела были найдены у 81% пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза и только у 10% из контрольной группы (фиг. 4, табл. 5). Это показывает, что данные антитела являются патогенным маркером этой болезни. Это исследование впервые демонстрирует существование антилипидных/липопротеиновых абзимов в биологических системах. Их появление при атеросклерозе, но не в норме, указывает, что эти абзимы играют важную роль в патогенезе этой болезни и ее осложнений. Оно также может установить взаимосвязь таких основных биохимических/иммунологических расстройств, как активация окисления липида в пероксидные соединения, появление антилипопротеиновых антител и хламидийная инфекция, причем все они вовлекаются в развитие атеросклероза. Присутствие в плазме индивида окисляющих липиды антихламидийных антител указывает на то,что уже начались патологические изменения, характерные для этого заболевания. Так как эти абзимы ответствены за окисление липида/липопротеина, и этот процесс обычно коррелирует со степе- 12009661 нью/интенсивностью генерализации атеросклероза, то уровень/активность антилипидных абзимов отражает тяжесть этого заболевания. Изменения в профиле липопротеина и повышение общего холестерина в плазме/сыворотке являются единственными специфическими факторами риска, установленными для атеросклероза. Однако эти изменения могут быть обнаружены только у 10-15% всех пациентов с клиническими осложнениями этой болезни. Обнаружение окисляющего липиды антихламидийного антитела является вторым специфичным маркером атеросклероза, но имеет намного более высокое диагностическое значение, чем измерение описанных выше параметров липида. Приведенные здесь способы поэтому являются широко применимыми в диагностике и профилактике атеросклероза и связанных с ним состояний. Пример 2. Ингибирование окисления липида в пероксидные соединения. Образцы для испытаний, полученные от человека. Антитела экстрагировали из обширных атеросклеротических повреждений аорты человека, отобранных у четырех пациентов-мужчин, возрастной диапазон 53-64 года, в ходе операции шунтирования стеноза брюшной аорты в Центре Сердечно-сосудистой хирургии клинического госпиталя 1 в Ростовена-Дону, России. После отбора эти образцы немедленно помещали в 30% (мас./об.) раствор NaCl и выдерживали при 0-4 С в течение 1-2 недель до начала испытаний. В контрольных экспериментах было показано, что в течение этого периода активность таких ферментов как трипсин, каталаза, перекись дисмутазы, глутатион-пероксидаза, креатинкиназа и лактатдегидрогеназа, наряду с уровнем фрагментации иммуноглобулина (IgG) и степенью окисления липида в пероксидные соединения (концентрация малоновых альдегидов) в значительной мере не изменялись. Части аорты (влажной массой приблизительно 200-400 мг) были разрезаны на части приблизительно 10 мг каждая, помещены в 5,0 мл PBS с 1% неионным ПАВ Igepal CA-630 и гомогенизированы механическим гомогенизатором (Ultra-Turrax) при полной мощности с 15 мм зондом три раза по 3 секунды каждый с 20-секундными интервалами охлаждения. После гомогенизации нерастворимые компоненты были отделены центрифугированием при 5000g в течение 10 мин, и надосадочные жидкости использовали для анализа. Экстракция антител. Антитела экстрагировали и анализировали отдельно от повреждений из четырех частей брюшной аорты, полученных от четырех различных пациентов. Первой стадией была обработка надосадочной жидкости белком А, присоединенным к поперечносшитой 4% гранулированной агарозе, при 37 С в течение 30 мин. После этого фракцию иммуноглобулина, присоединенную к гранулам, подвергали вращению при 5000g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость декантировали. С целью удаления любых липопротеинов, присоединенных к осажденным иммуноглобулинам, образцы были вновь суспендированы с помощью 10% Igepal CA-630. Затем их центрифугировали при 5000g в течение 10 мин, и надосадочная жидкость была декантирована. Для удаления ПАВ выполняли три последовательных промывки в избытке фосфатного буфера с центрифугированием в том же режиме. Удаление липопротеина из фракции иммуноглобулина было подтверждено отсутствием в этой фракции холестерина. Липопротеины. Липопротеины низкой плотности (ЛНП, LDL) с d=1,030-1,050 были получены из плазмы здоровых доноров последовательным препаративным ультрацентрифугированием в растворе KBr в соответствии с ранее описанным методом [Havel R.J. et al. J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353]. LDL в этих препаратах может быть уже связан с иммуноглобулинами плазмы. Эти иммуноглобулины могут потенциально препятствовать реакции между LDL и их антителами,присоединенными к белку А, или могут быть связаны самим этим белком. Во избежание этих возможных артефактов, перед титрованием липопротеинов антителами повреждения при исследованиях сродства было важно удалять LDL с присоединенным антителом, используя количество гранул белка А с агарозой, соответствующее насыщению. Чтобы определить уровень LDL (выраженный в виде концентрации холестерина), калибровочную кривую проводили для каждой новой партии липопротеинов и в течение каждого нового эксперимента. Окисление LDL в пероксидные соединения с помощью IgG из повреждения. Образцы LDL с исследуемыми антиоксидантами или без них (контрольные опыты) были инкубированы с IgG из повреждений в течение 16 ч при 37 С и при pH 5,6. Степень окисления липида в перекисные соединения, выраженная в виде концентрации малонового диальдегида (МДА, MDA), была измерена согласно следующей процедуре. К 1,0 мл каждого образца были добавлены 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты и 250 мкл 1 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты. После кипячения образцов в водяной бане в течение 30 мин их охлаждали и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. Надосадочные жидкости собирали и измеряли их поглощение при =525 нм. Результаты этого эксперимента представлены в табл. 6. Установлено, что ряд ингибиторов, обладающих активностью антиоксиданта, снижают активность окисления липидов антителами, выделенными из атеросклеротических бляшек, до величин ниже предела- 13009661 обнаружения в этом анализе. Поэтому все эти соединения ингибируют активность окисляющего липиды антитела. Выделенные абзимы испытывали in vitro в отношении каталитической активности, как описано здесь, в присутствии различных ингибиторов-антиоксидантов следующих классов: агенты, хелатирующие железо (Fe2+) - тетрациклин; агенты, хелатирующие медь (Cu2+) - DDC, аспирин и пеницилламин (penicillamine); общие агенты, хелатирующие металлы - CN-, N3, DTPA (хелатирует только свободные ионы) и пиколиновая кислота. Результаты представлены в табл. 11. Эти результаты показывают, что ингибирование абзима происходит путем хелатирования меди, а не хелатирования железа. Показано, что три отдельных агента, хелатирующих медь, блокируют активность,и эти результаты позволяют предположить, что абзимы контактируют со связанным ионом меди как каталитическим центром. Пример 3. Клинический пример снижения активности окисления липидов у антихламидийных антител. Пациент - A.M.П., белый мужчина, возраст 43 года, имел клинические признаки, похожие на ранние стадии стенокардии с жалобами на кратковременные неспровоцированные боли в груди в сочетании с одышкой. Однако ЭКГ не обнаруживала никаких патологических изменений в сердце. Результаты испытания крови 27 декабря 2000 г. установили нормальные уровни общего холестерина и LDL-холестерина; каждый из титров антихламидийных антител IgG и IgA составил 1:64 (ELISA,Medac). Однако были обнаружены окисляющие липиды антихламидийные абзимы, и их активность составила 32 мкМ MDA (среднее число по трем измерениям) в 1 мл его сыворотки. Было рекомендовано следующее ежедневное лечение курсом в течение трех месяцев: тетрациклина гидрохлорид 500 мг в сочетании с коктейлем антиоксидантов - витамин Е 20 мг, витамин А 1,5 мг, витамин В 6 3,2 мг, аскорбиновая кислота 180 мг, глюконат цинка 30 мг, L-селенометионин 100 мкг. Через три месяца после начала терапии жалобы на боли в груди и одышку исчезли. В конце марта,по окончании лечения и почти точно через 3 месяца после начала лечения, анализ сыворотки пациента не показал никаких изменений в титрах антихламидийных антител IgG и IgA (1:64 (ELISA, Medac. В то же время присутствие антихламидийных абзимов обнаружено не было. Двумя неделями позже исследование повторили с тем же результатом. Пример 4. Влияние Chlamydia овцы на окисление в перекисное соединение липида сыворотки крови овец. Овец подвергали вакцинированию клетками хламидии с использованием стандартных методик и исследовали на активность абзима. Результаты представлены в табл. 10. Перед вакцинацией овцы были свободны от болезней и здоровы и не показали никаких значительных изменений между уровнями анализов с хламидиями и без них. После вакцинации овцы показывали очень высокие уровни антихламидийных антител, но незначительные или нулевые уровни абзимов. После аборта (самопроизвольного типа) - представлены овцы с хламидийной болезнью, у которых произошел выкидыш ввиду закупорки сосудистой системы в матке: у них уровень активности абзима,подтвержденный добавлением Chlamydia, значительно выше, чем без Chlamydia. Эти результаты показывают, что введение хламидийной вакцины может снижать или предотвращать производство окисляющих липиды антител. Пример 5. Связь активности абзима и стеноза артерий. Была исследована активность окисляющих липиды антихламидийных антител и степень артериального стеноза в двух различных клинических группах. Первой была группа пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС, IHD), а второй - группа пациентов с ишемической церебрально-васкулярной болезнью (ИЦБ, ICD). Стеноз коронарной артерии. Предварительные результаты испытания показали положительную и значимую корреляцию между активностью антихламидийных абзимов и серьезностью стеноза коронарных артерий пациентов с ИБС(фиг. 5). Не наблюдалось связи между степенью коронарного стеноза и такими липидами сыворотки, как триглицериды, общий холестерин и холестерин липопротеинов низкой плотности, или LDL-холестерин(фиг. 6, 7, 8). Стеноз церебральной артерии. В группе пациентов с ИЦБ наблюдалась положительная значимая корреляция между уровнем абзимов и артериальным стенозом (фиг. 9). Как и у пациентов с ИБС, в этой группе не наблюдалось связи между степенью артериального стеноза и сывороточными триглицеридами, общим холестерином и LDL-холестерином (фиг. 10, 11, 12). В этих экспериментах установлена положительная связь между антихламидийной активностью абзима и степенью стеноза как в сердечных, так и в мозговых артериях, и показано, что эти антитела вклю- 14009661 чаются как в инициирование, так и в развитие атеросклероза. Пример 6. Ингибирование абзимов с использованием ацетилсалициловой кислоты (аспирина). Данные, представленные в табл. 13 и 14, показывают, что активность антихламидийных абзимов,окисляющих липиды, можно ингибировать ацетилсалициловой кислотой (аспирином) путем его введения людям. Трем пациентам с коронарной болезнью сердца (КБС, CHD), кровь которых имела значительный уровень абзимной активности этих абзимов, давали суточную дозу 250 мг аспирина. Через неделю исследования крови этих патентов показали значительное ингибирование активности абзима: 5-кратное снижение у одного пациента и снижение до не поддающегося определению низкого уровня у двух других (табл. 13). Для исключения возможности того, что введение аспирина в вышеупомянутых экспериментах совпало с естественной очисткой тел пациентов от абзимов, и для исследования in vivo влияния аспирина на антихламидийные окисляющие липиды абзимы, был проведен следующий эксперимент. Был идентифицирован пациент F с немой ишемией миокарда, регулярно принимавший аспирин 250 мг ежедневно. Был определен уровень абзимов в крови пациента F, и было установлено, что он является почти необнаружимым. Пациент F прекратил прием аспирина в течение недели, и в его крови снова был определен уровень абзима. В сыворотке пациента F был обнаружен значительный уровень окисляющих липиды абзимов. Пациент F возобновил предыдущий режим приема аспирина 250 мг ежедневно, и после 7 дня был определен уровень абзимов. Уровень этих абзимов был значительно понижен (табл. 14) относительно уровня, когда пациент не получал аспирин. В ходе этих экспериментов пациент не имел никаких дыхательных расстройств или признаков любых других патологических состояний. Это показывает, что зарегистрированные изменения активности абзима были связаны с приемом аспирина этим пациентом. В заключение следует отметить, что настоящие данные показывают, что ацетилсалициловая кислота ингибирует окисляющие липиды антихламидийные антитела in vivo, и, в частности, у пациентов с клиническими осложнениями атеросклероза. Пример 7. Антитела, вступающие в перекрестные реакции с клетками хламидии. Коммерчески доступный препарат антител, специфичных к Аро-В человека, был исследован на способность вступать в перекрестную реакцию с Chlamydia psittaci овцы (Intervet). Наблюдали, что препарат анти-аро-В антитела содержит фракцию, которая также связывается сChlamydia овцы (фиг. 13). В соответствии с этим, Аро-В имеет эпитоп, который является идентичным эпитопу, существующему на мембране хламидии. Антитела, которые связывают этот эпитоп, вступают в перекрестную реакцию с клетками Chlamydia и аро-В человека. Пример 8. Влияние антихламидийных агентов на активность абзимов in vivo. Пациенты, в возрасте от 45 до 62 лет, с устойчивой стенокардией, получали либо 500 мг азитромицина один раз в сутки в течение 15 суток и 30 суток, либо 500 мг азитромицина в сочетании с 250 мг аспирина ежедневно в течение 15 суток. Активность абзима до и после лечения показана для первой группы в таблице 15, а для второй группы в табл. 16. Показано, что активность абзима значительно снижена в обеих группах пациентов после 15 суток,причем снижение является особенно большим в группе, получавшей азитромицин и аспирин. Также наблюдалось снижение уровней LDL. Ни у одного из пациентов не было зарегистрировано никаких побочных реакций. В ходе лечения также наблюдалось улучшение клинического состояния пациентов (табл. 17). Прием антихламидийного лекарственного средства азитромицина в течение двух недель, в особенности в сочетании с аспирином, снижал активность абзима и улучшал клиническое состояние пациентов,страдающих от стенокардии. Пример 9. Активность абзимов in vivo. Были определены уровни абзимов в пяти группах людей с использованием описанных здесь методов. Контрольная группа была здоровой, как было определено существующими методами. Группа с немой ишемией включала лиц, у которых наличие ишемии было показано с помощью теста упражнение/ЭКГ, но которым не было известно о каких-либо проблемах с их здоровьем. Были также исследованы группы лиц, страдающих устойчивой или неустойчивой стенокардией и перенесших инфаркт миокарда. Средний уровень абзимов в каждой группе показан в табл. 18, где n - число лиц в каждой группе. Лица рассматривались как положительные на абзимы, если наблюдалось 15% увеличение окисления липидов при добавлении клеток Chlamydia с использованием описанных здесь методов. Процент лиц из каждой группы, положительных в отношении абзимов, также показан в табл. 18. Ни одна из величин в таблице не была откорректирована для лиц, принимавших аспирин. Показано, что уровень активности абзима и доля лиц, дающих положительный результат теста на- 15009661 абзимы, коррелирует с серьезностью состояния индивида. Наблюдается, что активность абзима резко снижается после сердечного приступа (сравнить значения для неустойчивой стенокардии и инфаркта миокарда в острой фазе). Затем, после сердечного приступа, активность абзима у выживших пациентов постепенно повышается. Это является показателем активной роли абзимов в индукции инфаркта миокарда. Абзимы могут формировать часть механизма агглютинации (свертыванию) тромболитических сгустков, которые блокируют кровеносные сосуды и приводят к возникновению инфаркта. Эта агглютинация в сгустки снижает обнаруживаемую активность абзима в сосудистой системе. Поскольку сгусток после инфаркта растворяется, определяемая активность абзима увеличивается. Пример 10. Влияние аспирина на активность абзимов in vivo. Активность абзима определяли в группах лиц, страдающих устойчивой или неустойчивой стенокардией класса I, II и III, с использованием описанных здесь методов. Лицам также задавали вопрос,принимают ли они аспирин. Лица были разделены на подгруппы в зависимости от того, что они сообщили о приеме аспирина, и результаты показаны в табл. 19. Эти результаты не корректируются для лиц,принимавших аспирин, но не сообщивших об этом. Числа, показанные в табл. 19, являются величинами активности абзима у лиц в каждой группе (т.е. класс I, принимающие аспирин и не принимающие аспирина, и т.д.). Эти результаты показывают, что уровни абзимов соответствуют серьезности болезни. Лица, принимающие аспирин, в целом имеют более низкую активность абзима, чем не принимающие аспирина лица с теми же клиническими признаками. Пример 11. Модель атеросклеротических расстройств животных. Кролики были инфицированы Chlamydia psittaci (штамм Lori) интратрахеальным путем с помощью 1,5 мл 10% суспензии эмбриона цыпленка, содержащего 1107,5 клеток Chlamydia. Сыворотку кроликов собрали в день 0 (перед инфицированием) и затем каждые 14 суток после этого, используя стандартный путь отбора крови из сердца. Затем сыворотку использовали в стандартном анализе ELISA для измерения титра антихламидийного IgG. В тех же образцах сыворотки измеряли уровень абзимов Chlamydia путем использования стандартного анализа, описанного выше. Появление абзимов коррелирует с появлением антихламидийныхIgG антител. Результаты для 4 кроликов (3 инфицированных и 1 контрольного) показаны в табл. 20. Эти результаты показывают, что модель на животных с высокими уровнями абзимов может быть получена путем инфицирования хламидией. Эти модели полезны при отслеживании прогрессирования болезни, вызванной абзимами, и при определении различных параметров, таких как скорость очищения. Модели также полезны при испытании соединений в качестве потенциальных лекарств для снижения уровней абзимов и сопутствующего улучшения симптомов. Пример 12. Антихламидийные абзимы у кроликов. Образование окисляющих липиды антихламидийных антител было продемонстрировано на модели с использованием кроликов, полученной, как описано выше, путем интратрахеального инфицированияChlamydia Psittaci. Результаты показаны в табл. 21. Кролики были инфицированы интратрахеально с помощью 1,5 мл 10% суспензии эмбриона цыпленка, содержащего 1107,5 Chlamydia Psittaci (штамм Lori), и кровь отбирали из сердец кроликов. Уровни абзимов показаны на 7-й день после подкожного введения вакцины обработанных формалином 1107,5 Chlamydia Psittaci (штамм Lori) (см. табл. 21). Появление абзимов совпало с накоплением антихламидийного IgG, обнаруженного в соответствии с анализом ELISA. Введение тех же бактерий, но в виде препарата, обработанного формалином, на 14-й день с момента инфицирования (кролик 3) вело к увеличению титров антихламидийных IgG в анализеELISA на 7-й день после этой инокуляции. В то же время в сыворотке этого кролика наблюдалось 2 кратное снижение активности абзима, от 131 до 64 мкМ МДА/мл. Такого снижения активности абзима не наблюдалось у двух других кроликов, которые не получали эту инокуляцию. Таким образом, наблюдалось, что инокуляция препаратом вакцины антигена Chlamydia снижает присутствие/активность антихламидийных абзимов. Пример 13. Антиабзимная терапия при ишемической болезни сердца. Группа из 30 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) была отобрана для экспериментальной терапии с целью снижения/устранения активности антихламидийных абзимов в их сыворотке(группа терапии), а группа из 20 соответственных пациентов не подвергалась терапии (не получавшая лечения контрольная группа пациентов). Исследование проводилось в Саратовском кардиологическом центре (Российская Федерация) с июня до августа 2002 г. Группа терапии включала 23 мужчины и 7 женщин, имеющих средний возраст 551,1 лет. Контрольная группа пациентов для контроля уровня абзимов включала 20 пациентов с ИБС, из которых 15 были мужчины, а 5 женщины, их средний возраст составлял 531,2 лет. Каждый пациент давал письмен- 16009661 ное согласие на его/ее участие в исследовании. Все пациенты страдали стенокардией II-III класса согласно классификации Канадского Кардиологического Общества. 15 пациентов в группе терапии и 10 в контрольной группе пациентов имели в прошедшем году историю инфаркта миокарда. Диагноз ИБС для других 15 пациентов в первой группе и 10 в контрольной группе пациентов был подтвержден коронарной ангиографией, которая обнаружила 70% или более артериальных стенозов. Помимо степени генерализации или тяжести атеросклероза, все группы были согласованы не только по возрасту, полу и факторам риска, но также и по лекарствам, нитратам, -блокаторам, ингибиторы ангиотензин-преобразующего фермента и т.д. Прогрессирование клинического состояния пациентов было проверено при помощи модифицированного Протокола Брюса (Bruce Protocol) для исследования ЭКГ при использовании упражнения на бегущей дорожке/напряжения и при помощи анкеты Роуза-Блэкберна (Rose-Blackburn Questionnaire) (Cardiovascular Survey Methods. WHO, Geneva, 1968). Основным параметром отбора пациента для исследования был уровень антихламидийной активности абзима в избытке 15 мкМ малонового диальдегида (MDA) на 1 мл сыворотки. Группа терапии была разделена на 4 терапевтических подгруппы. 1) Группа терапии А - получали неспецифичный ингибитор антихламидийных абзимов, азитромицин, который также обладает антимикробными свойствами, в предписанной дозе 500 мг ежедневно. 2) Группа терапии В - был предписан совместный прием азитромицина, в той же дозе, вместе с ацетилсалициловой кислотой (аспирином). Последняя имеет очевидную способность к специфическому блокированию абзимов путем хелатирования ионов меди в их активном центре. Доза аспирина составляла 250 мг в сутки. 3) Группа терапии С - был предписан совместный прием двух типов неспецифичных ингибиторов абзимов со свойствами антиоксиданта, антимикробного азитромицина в той же дозе, как в предыдущих группах, и витаминов Е, А, С. Суточная доза витамина Е составляла 30 мг, витамина А 1500 EU, а витамина С 90 мг. 4) Группа терапии D - пациенты этой группы получали только аспирин, 250 мг ежедневно. Кровь пациентов всех трех групп исследовали каждые две недели. Терапии продолжали в зависимости от эффективности подавления/устранения антихламидийной активности абзима, и представлены результаты исследований, проводимых в срок до 60 суток после начала приема плацебо/терапии. Титр антихламидийных антител был измерен в группе терапии с использованием описанного ранее метода (см. табл. 28). Также была измерена тяжесть клинических симптомов (см. табл. 28). Результаты контроля подавления антихламидийной активности абзима представлены в следующих таблицах (табл. 22-27). Во-первых, было отмечено, что через две недели терапии во всех группах наблюдалось значительное снижение активности абзима. Наиболее значительным оно было в группе терапии В, где использование неспецифичного ингибитора азитромицина было объединено с использованием специфичного ингибитора аспирина (табл. 23). Действительно, уровень активности в этой группе достиг уровня клинически здоровых личностей (см. сводную таблицу 28). Важным наблюдением было то, что в этой группе у пациента TGB7 установлено большое увеличение уровня абзимов (которое коррелировало с ухудшением клинических симптомов) на 45-й день (две звездочки в табл. 23), а затем после следующих 15 суток лечения пациент начал чувствовать себя лучше и количество абзимов снизилось до 0. TGB7 также показал увеличение уровней АроВ (звездочка в табл. 7) в то же время в течение 45 суток, когда наблюдалось увеличение в уровне абзимов. Наименее эффективная терапия была в группе терапии А (только азитромицин - табл. 22), где у 27% пациентов (3 из 11, отмеченные звездочкой) не наблюдалось никаких изменений в активности абзимов через 15 суток. Однако непрерывное снижение у большинства пациентов было реверсировано для двух из них в первой группе на 30-й день исследования (TGA2 и TGA6, табл. 1, отмечено двумя звездочками). Это наблюдение, наряду с тем фактом, что имелись некоторые пациенты с остаточным, хотя и пониженным, значительным уровнем активности абзима, привело к увеличению длительности лечения в течение следующих 30 суток, приводя к значительному уменьшению этой активности у всех пациентов. При терапии группы А клинические симптомы пациентов TGA2 и TGA6 улучшились в течение 15 суток и коррелировали со снижением уровня абзимов, однако клинические симптомы ухудшались и уровень абзимов увеличился около 30-го дня исследования (две звездочки - табл. 22). В группе терапии С (азитромицин и антиоксиданты) у одного из пациентов (TGCl) не проявилось никакого уменьшения активности абзимов (звездочка - табл. 24). Использование одного аспирина в предписанной дозе, без азитромицина, вело к снижению активности абзимов, но в меньшей степени, чем наблюдалось для сочетания лекарств (группа терапии D табл. 25). Применение антиабзимной терапии значительно улучшило клиническое состояние большинства пациентов, которое было оценено с помощью модифицированной анкеты Роуза-Блэкберна (табл. 27) и проверено с использованием ЭКГ с бегущей дорожкой/нагрузкой. В то же самое время не имелось ника- 17009661 кой положительной клинической динамики, отмеченной в контрольной группе, ни для одного из пациентов. В табл. 27 PCG обозначает контрольную группу пациентов,обозначает результаты, полученные иммунофлуоресцентным анализом,обозначает результаты, полученные иммуноферментативным анализом,обозначает результаты, полученные иммунотурбидиметрическим анализом.обозначает статистически значимое различие. Не наблюдалось никаких статистически значимых изменений для следующих параметров коагуляции: время свертывания крови каолином, время активированного частичного тромбопластина, протромбиновое время. Не зарегистрировано никаких изменений в уровне серологического креатинина и ферментов печени аланин-аминотрансфераза (Alanine aminotransferase) и аспартат-аминотрансфераза (Aspartate aminotransferase). Никто из пациентов в группах экспериментальной терапии не имел положительных изменений в клиническом состоянии в течение многих месяцев/лет до их отбора для исследования. Поэтому это отсутствие позитивной динамики может использоваться в качестве внутреннего контроля для значительного клинического прогресса наблюдаемых пациентов. Первоначальные интенсивные режимы ингибитора абзимов, обладающего антимикробными свойствами, полностью устранили присутствие антихламидийных IgG. Атакой на антихламидийные абзимы были достигнуты значительные улучшения в отношении концентраций липида и тромбоза (табл. 27). Поэтому можно предположить, что развивающиеся аномалии в липидном метаболизме и системе коагуляции при атеросклерозе являются вторичными по отношению к появлению этих окисляющих липиды каталитических антител. Наблюдаемый положительный эффект азитромицина нельзя объяснить его антибактериальными свойствами, потому что только у 15 пациентов из 30 (у 50%) отобранных для исследований ранее имелась положительная реакция на присутствие хламидийной инфекции. Уровень антихламидийного IgG в сыворотке других 8 пациентов был незначительным, ниже 1:32 при иммунофлуоресцентном анализе. У остальных 7 пациентов реакция была отрицательной. Диагностический тест показывает, является ли пациент носителем абзимов и не обязательно коррелирует с положительной реакцией пациента на Chlamydia IgG антитела. Поэтому терапию не следует назначать на основе серопозитивности к Chlamydia. Это показывает, что для осуществления изобретения полезно, когда диагностический тест связан с использованием правильной терапии, с последующими многократными прогностическими тестами для контроля за очищением от абзимов при проведении лечения. Некоторые ИБС-пациенты при терапевтико-диагностическом исследовании были негативны по отношению к антихламидийным IgG антителам, но имели положительную реакцию на абзимы. Показатели в отношении абзимов и теста Роуза-Блэкберна для этих пациентов до и после лечения показаны в табл. 29. Эти пациенты были подвергнуты лечению, и активность абзимов у них снижалась, с последующим улучшением клинических симптомов. Эти результаты показывают, что наличие у пациента абзимов не обязательно коррелирует с положительной реакцией пациента на Chlamydia IgG антитела. Атеросклеротическое состояние не может быть диагностировано или назначена терапия на основе серопозитивности в отношении хламидии. Однако показано, что абзимы являются полезными в качестве диагностического маркера атеросклеротических состояний и могут быть связаны с назначением соответствующей терапии, сопровождаемой неоднократными прогностическими тестами для контроля очищения от абзимов. Пример 14. Антиабзимные/антиоксидантные свойства азитромицина. Ингибирущая активность азитромицина в отношении абзимов, выделенных из атеросклеротического повреждения, была измерена, как описано выше. Результаты показаны в табл. 30. Каждое число является средним значением двукратного/трехкратного измерения, и рассчитано как разность между уровнем накопления MDA в исследуемой сыворотке до и после добавления 0,5 иммунизирующей дозы вакциныChlamydia овцы ('Intervet'). Влияние DMSO вычислено из показаний, обозначенных . Установлено, что азитромицин является сильным in vitro ингибитором активности абзимов. Эта активность может быть причиной наблюдаемых in vivo биологических эффектов, вызываемых азитромицином, таких как быстрое уменьшение активности абзимов после приема азитромицина. Пример 15. Целостность мембраны Chlamydia и активность абзимов. Активность абзимов была измерена, как описано выше, с использованием образцов Chlamydia pneumoniae или Chlamydia Psittaci, обработанных формалином, сернокислым аммонием или SDS. В этих реакциях в испытательной системе не происходит никакой реакции окисления липидов. Обработка бактерий Chlamydia разобщающими агентами (агент, вызывающий диссоциацию комплексов), включая неионные ПАВ 1% Triton Х-100 и Igepal CA-630, 10% раствор DMSO, которые сохраняют присутствие в системе мембранных липидов, но разрушают целостность бактериальной мембраны,полностью остановила развитие реакции окисления липида. Эти эксперименты показывают, что липиды важны для инициирования и развития реакции (реакций) окисления липидов в пероксидные соединения, развивающейся в исследуемой системе. В частности, установлена роль липополисахарида, разрушаемого при вышеупомянутой обработке.- 18009661 Пример 16. Истории болезней. Больной 1. У пациента, 64-летнего мужчины, ишемическия болезнь сердца была диагностирована 3 года назад,когда у него появились первые симптомы стенокардии. Диагноз был подтвержден коронарной ангиографией, которая установила стеноз двух артерий: 75% правой коронарной артерии и 100% окклюзии передней интравентрикулярной (внутрижелудочковой) артерии. Он был отобран для терапевтико-диагностического исследования на том основании, что в его сыворотке были обнаружены абзимы. Ему была назначена комбинация двух ингибиторов абзима, азитромицина, в дозе 500 мг ежедневно, и аспирина, в дозе 250 мг ежедневно. Его уровень антихламидийных IgG был высоким, с титром 1:256. Перед лечением его клиническое состояние, оцениваемое по результатам модифицированного протокола Роуза-Блэкберна, было равно 19 (баллов). Активность абзима составляла 25 мкМ MDA/мл, уровень общего холестерина 226 мг/дл, триглицериды - 90 мг/дл, холестерин липидов высокой плотности(HDL) - 56 мг/дл, холестерин липидов низкой плотности (LDL) - 73 мг/дл, АроА - 139 мг/дл, АроВ - 81 мг/дл, аланин-аминотрансфераза (ALT) - 25 ед./л (U/L), аспартат-аминотрансфераза (AST) - 29 ед./л(U/L), креатинин - 0,71 мг/дл. В ходе лечения не наблюдалось никаких значительных побочных реакций. При первом посещении после начала терапии, через 15 суток, пациент сообщил о некотором улучшении в отношении признаков его болезни. Это улучшение продолжалось до 30-го дня терапии. Это было подтверждено увеличением допустимого времени в ходе испытания с использованием ЭКГ и упражнения на бегущей дорожке в соответствии с модифицированным Протоколом Брюса. В то время в его сыворотке не было обнаружено ни активности абзимов, ни присутствия антихламидийных IgG. Уровень липидных параметров также улучшился: общий холестерин снизился до 172 мг/дл, триглицериды - до 80 мг/дл, холестерин HDL - 52 мг/дл, холестерин LDL - 64 мг/дл, АроА 110 мг/дл, АроВ - 67 мг/дл. Уровни ALT, AST и креатинина остались теми же - 25 U/ml, 27 U/ml и 0,7 мг/дл соответственно. По достижении 45-го дня с начала терапии пациент сообщил, что за неделю до этого, на 38-й день с начала, его состояние стало ухудшаться - частота и интенсивность приступов стенокардии внезапно увеличилась. Это совпало с повышением активности абзимов, которая достигла 80 мкМ MDA/мл. Однако важно отметить, что не были зарегистрированы никакие "традиционные" антихламидийные IgG. Одновременно также ухудшились параметры липидного обмена: общий холестерин увеличился до 185 мг/дл, триглицериды - 143 мг/дл, холестерин LDL - 74 мг/дл, АроА - 115 мг/дл, АроВ - 87 мг/дл. Уровни холестерина HDL и АроА остались, по существу, теми же - 50 мг/дл и 115 мг/дл, соответственно. Важное наблюдение состояло в том, что уровень ферментов печени также изменился, ALT увеличился до 35 U/L, a AST - до 39 U/L; концентрация креатинина составила 0,8 мг/дл. Однако продолжавшаяся терапия, по-видимому, привела к полному подавлению/устранению активности абзимов, которое также сопровождалось улучшением в отношении концентрации некоторых липидных параметров: полный холестерин понизился до 165 мг/дл, триглицериды - до 100 мг/дл. Концентрация холестерина HDL была 47 мг/дл, холестерина LDL - 72 мг/дл, АроА - 112 мг/дл. Уровни ALT,AST и креатинина составили 24 U/мл, 25 U/мл и 0,7 мг/дл соответственно. В то же время уровень АроВ остался таким же, как перед началом лечения, составляя 80 мг/дл. Первоначально улучшенное клиническое состояние также вернулось к уровню, на котором оно было перед началом терапии, а показатель Роуза-Блэкберна был равен 19. Для стабилизации пониженного уровня абзимов в попытке улучшить клинические параметры пациента, ему было рекомендовано продолжить предписанную антиабзимную терапию. У этого пациента с 15-го дня с начала терапии и далее не было обнаружено никаких антихламидийных IgG, а продолжающееся использование азитромицина было направлено на регулирование подавленного уровня вступающих в перекрестные реакции абзимов, которые связывают и окисляют липопротеины, а не на бактериальную инфекцию per se. Больной 2. У пациента, 46-летнего мужчины, была диагностирована ИБС, когда он поступил с острым инфарктом миокарда 21 февраля 2002 г. Перед этим он не имел никакой истории сердечной болезни. В мае того же года коронарная ангиография не показала никакого стеноза/сужения его коронарных артерий. Этот пациент был отобран для терапевтико-диагностического исследования на том основании, что в его сыворотке была обнаружена значительная активность антихламидийных абзимов. Она составила 140 мкМ MDA/мл. Была предписана комбинация двух типов ингибиторов абзима, азитромицина в дозе 500 мг ежедневно, и коктейля антиоксидантов - витаминов Е, А, С. Суточная доза витамина Е была 30 мг,витамина А - 1500 ЕС и витамина С - 90 мг. В сыворотке этого пациента до начала лечения или в ходе него не было определено никакого обнаруживаемого уровня "традиционных" антихламидийных IgA, IgG или IgM. Перед лечением его клиническое состояние, оцениваемое по результатам модифицированного протокола Роуза-Блэкберна, было равно 17. Уровень общего холестерина был 205 мг/дл, триглицеридов - 19009661 129 мг/дл, холестерина HDL - 39 мг/дл, холестерина LDL - 80 мг/дл, АроА -152 мг/дл, АроВ - 221 мг/дл. В ходе лечения не было замечено никаких значительных отрицательных реакций. Пациент начал чувствовать некоторое улучшение в признаках болезни после первых двух недель лечения. Этот прогресс продолжался в течение всего периода терапии, 60 суток. Это было подтверждено значительным увеличением допустимого времени в ходе испытания с упражнением на бегущей дорожке и ЭКГ, выполненного в соответствии с модифицированным протоколом Брюса. В конце периода наблюдения, через 60 суток, в его сыворотке не было обнаружено ни активности абзимов, ни присутствия антихламидийных IgG. Эти изменения в активности абзимов совпали со значительным улучшением клинического состояния пациента. Его показатели по модифицированному протоколу Роуза-Блэкберна снизились с 17 до лечения до 13 после него. Пример 17. Влияние антиабзимной терапии на тромбоз. Одним из показателей атеросклеротических расстройств является то, что пациенты часто поступают с аберрациями во времени, требуемом для формирования тромбов в их крови (в целом у пациентов оно увеличивается). Множество путей может приводить к образованию тромбов, и поэтому имеются четыре признанных в международной практике вида испытания на время свертывания крови. Первое называется "Время активированного частичного тромбопластина" (Activated Partial Thromboplastin Time,APTT) и проводится путем прибавления тромбопластина и кальция для измерения внутренней траектории. Второе, называемое "протромбиновое время" (РТ), представляет собой простое измерение внешней траектории. "Время свертывания крови кремнеземом" (SCT) - это измерение свертывания, вызванного мелкими частицами (кремнезема), а "Время свертывания крови каолином" (KCT) - это измерение свертывания, вызванного более крупными частицами (каолина). Для всех этих испытаний быстрое время свертывания крови является показателем более высокого риска тромбоза. Перед началом лечения у всех пациентов во всех группах терапии были измерены времена свертывания крови с использованием всех четырех методов и рассчитано среднее значение со средней погрешностью. Измерения были повторены через 60 суток. В качестве контрольных были использованы пациенты нашей контрольной группы пациентов (измерения проводились один раз - их значения для этих пациентов не изменялись значительно с течением времени), а также нами была сформирована контрольная группа клинически здоровых людей. Результаты лечения представлены в табл. 32. Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом АРТТ было 22,40,89(сопоставимо с значением для контрольной группы 25,21,37) и значительно отличалось от значения 49,17 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 46,96,45, и поэтому оно было в пределах "нормального интервала" времен свертывания крови, т.е. было нормализовано. Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом РТ было 13,50,94 (сопоставимо с значением для контрольной группы 17,34,05) и было ниже, чем значение 23,74,01 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 25,34,05, и поэтому оно было в пределах "нормального интервала" времен свертывания крови, т.е. было нормализовано. Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом SCT было 15115,0 (сопоставимо с значением для контрольной группы 13711,5) и было значительно ниже, чем значение 24810,0 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 23517,9, и поэтому оно было в пределах "нормального интервала" времен свертывания крови, т.е. было нормализовано. Среднее значение для пациентов перед лечением при испытании методом КСТ было 51,24,59 (сопоставимо с значением для контрольной группы 50,32,16) и значительно отличалось от значения 13323,7 для группы клинически здоровых людей. После лечения среднее значение этой величины у пациентов было 12634,2, и поэтому оно было в пределах "нормального интервала" времен свертывания крови, т.е. было нормализовано. Эти результаты показывают, что антиабзиная терапия может использоваться для нормализации времени свертывания крови (при использовании всех международно признанных видов анализа времени свертывания крови) и снижает риск тромбоза и, следовательно, сердечного приступа и инсульта. Результаты экспериментов in vitro, показанных на фиг. 14, указывают, что добавление фракции атеромы IgG, содержащей антихламидийные абзимы, в концентрации от 0,5 до 10 мг белка, оказывает активирующий эффект на свертывание плазмы при воздействии каолина. Предварительная инкубация абзимов с диэтилдитиокарбаматом или с азидом натрия, которые ингибируют эти антитела посредством связывания с Cu2+ в их активном центре, привела к снижению влияния абзима на свертывание плазмы. Эти данные указывают, что антихламидийные абзимы могут непосредственно влиять на тромбоз плазмы человека и являются важным фактором в развитии ишемической болезни сердца. Антиоксиданты, одобренные для использования человеком в наиболее развитых странах. Таблица 7 Каждое число является средним значением двукратного/трехкратного измерения и рассчитано как разность между уровнем накопления МДА в исследуемой сыворотке до и после добавления 0,5 иммунизирующей дозы вакцины Chlamydia овцы ('Intervet').- 29009661 Таблица 19 Ишемическая болезнь сердца (всего): 168/235=71%