Применение эффекторов глутаминил- и глутаматциклаз

009291 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к глутаминилциклазе (QC, КФ 2.3.2.5), которая катализирует внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, pGlu) с выделением в свободном состоянии аммиака и внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глутамата с образованием пироглутаминовой кислоты с выделением в свободном состоянии воды. При создании настоящего изобретения были идентифицированы QC млекопитающих в качестве металлоферментов, выявлены новые физиологические субстраты QC в организме млекопитающих и разработаны пути применения эффекторов QC и фармацевтических композиций, содержащих эффекторыQC, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции QC-активности. Кроме того, установлено, что взаимодействие с металлом является важным подходом для создания ингибиторов QC. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов QC-активности в сочетании с ингибиторами DP IV (дипептидилпептидаза IV) или DP IV-подобных ферментов для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC и/или DP IV. Предложен также способ скрининга для идентификации и отбора эффекторов QC-активности. Предпосылки создания изобретения Глутаминилциклаза (QC, КФ 2.3.2.5) катализирует внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (5-оксопролин, pGlu) с выделением в свободном состоянии аммиака. QC впервые была выделена Messer из латекса тропического растенияCarica papaya в 1963 г. (Messer M. Nature 4874, 1963, с. 1299). Спустя 24 года соответствующая ферментативная активность была обнаружена в гипофизе животных (Busby W.Н.J. и др. J. Biol. Chem. 262, 1987,cc. 8532-8536; Fischer W.Н. и Spiess J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, cc. 3628-3632). Для QC млекопитающих превращение Gln в pGlu с помощью QC было обнаружено для предшественников TRH (тиреолиберин) и GnRH (гонадолиберин) (Busby W.H.J. и др. J. Biol. Chem. 262, 1987, cc. 8532-8536; Fischer W.H. и Spiess J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, cc. 3628-3632). Кроме того, предварительные эксперименты по выявлению локализации QC позволили выявить ее совместную локализацию с предполагаемыми продуктами катализа в бычьем гипофизе, что является дополнительным доказательством ее функции в синтезе пептидных гормонов (Bockers Т.М. и др. J. Neuroendocrinol. 7, 1995, cc. 445-453). В противоположность этому, физиологическая функция растительной QC все еще остается неясной. Предполагается, что фермент из С. papaya играет роль в защите растений от патогенных микроорганизмов (El Moussaoui А. и др. Cell Mol. Life Sci. 58, 2001, cc. 556-570). В настоящее время на основе сравнительного анализа последовательностей были выявлены предполагаемые QC из других растений (Dahl S.W. и др., Protein Expr.Purif. 20, 2000, cc. 27-36). Однако физиологическая функция этих ферментов все еще остается неясной. Известные выделенные из растений и животных QC обладают строгой специфичностью в отношении L-глутамина в N-концевом положении субстратов, и установлено, что их кинетические характеристики описываются уравнением Михаэлиса-Ментена (Pohl Т. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991,cc. 10059-10063; Consalvo A.P. и др., Anal. Biochem. 175, 1988, cc. 131-138; Gololobov M.Y. и др., Biol.Chem. Hoppe. Seyler. 377, 1996, cc. 395-398). Однако сравнение первичной структуры QC из С. papaya и высококонсервативных QC млекопитающих не выявило никакой гомологии последовательностей (DahlS.W. и др., Protein Expr. Purif. 20, 2000, cc. 27-36). В то время, как растительные QC, вероятно, принадлежат к новому семейству ферментов (Dahl S.W. и др., Protein Expr. Purif. 20, 2000, cc. 27-36), установлено,что QC млекопитающих обладают выраженной гомологией последовательностей с бактериальными аминопептидазами (Bateman R.С. и др., Biochemistry 40, 2001, cc. 11246-11250), что позволило сделать заключение о различном эволюционном происхождении QC из растений и животных. В ЕР 02011349.4 описаны полинуклеотиды, кодирующие глутаминилциклазу насекомых, а также кодируемые ими полипептиды. В этой заявке описаны также клетки-хозяева, которые содержат экспрессионные векторы, несущие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Выделенные полипептиды и клетки-хозяева, содержащие QC насекомых, применяют в методах скрининга агентов, которые снижают глутаминилциклазную активность. Установлено, что такие агенты можно применять в качестве пестицидов. Болезнь Альцгеймера (АБ) характеризуется аномальным накоплением внеклеточных амилоидных бляшек, непосредственно связанных с дистрофичными нейронами, реактивными астроцитами и микроглией (Terry R.D. и Katzman R., Ann. Neurol. 14, 1983, cc. 497-506; Glenner G.G. и Wong C.W., Biochem.H. и др., Am. J. Pathol. 152, 1998, cc. 983-992; Selkoe D.J., Physiol. Rev. 81, 2001, cc. 741-766). Амилоид-пептиды (А-пептиды) являются основными компонентами старческих бляшек, и считается, что они непосредственно участвуют с патогенезе и развитии АБ, эта гипотеза подтверждается генетическими исследованиями (Glenner G.G. и Wong C.W., Biochem. Biophys. Res. Comm. 120, 1984, cc. 885-890; BorcheltD.J., Physiol. Rev. 81, 2001, cc. 741-766 ). A образуется в результате протеолитического процессинга амилоидного белка-предшественника (АРР) (Kang, J. и др., Nature 325, 1987, cc. 733-736; Selkoe D.J.,-1 009291Trends Cell Biol. 8, 1998, cc. 447-453), который последовательно расщепляется -секретазой на N-конце и(А 1-42/40), в старческих бляшках присутствует множество гетерогенных укороченных на N-конце форм. Установлено, что такие укороченные пептиды обладают более высокой нейротоксичностью in vitro и у них существенно быстрее происходит агрегация по сравнению с полноразмерными изоформами (Pike С.J. и др., J. Biol. Chem. 270, 1995, cc. 23895-23898). Известно, что у пациентов на ранней стадии семейной АБ(СБА) происходит сверхпроизводство укороченных на N-конце пептидов (Saido Т.С. и др., Neuron. 14,1995, cc. 457-466; Russo С. и др., Nature 405, 2000, cc. 531-532), эти пептиды появляются в раннем возрасте в головном мозге пациентов, страдающих синдромом Дауна (ДС), и их количество увеличивается с возрастом (Russo С. и др. FEBS Lett. 409, 1997, cc. 411-416, Russo С. и др., Neurobiol. Dis. 8, 2001, cc. 173-180;Tekirian T.L. и др., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 1998, cc. 76-94). И, наконец, их количество отражает развитие более серьезной формы заболевания (Russo С. и др., FEBS Lett. 409, 1997, cc. 411-416). Дополнительные посттрансляционные процессы могут также модифицировать N-конец в результате изомеризации или рацемизации аспартата в положении 1 и 7 и циклизации глутамата на остатках 3 и 11. Пироглутаматсодержащие изоформы в положении 3 [pGlu3]A3-40/42] представляют собой доминирующие формы на их долю приходится примерно 50% общего количества укороченных на N-конце видов А в старческих бляшках (Mori Н. и др., J. Biol. Chem. 267, 1992, cc. 17082-17086, Saido Т.С. и др., Neuron. 14, 1995, cc. 457-466; Russo С. и др., FEBS Lett. 409, 1997, cc. 411-416; Tekirian Т.L. и др., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 1998, cc. 76-94; Geddes J.W. и др., Neurobiol. Aging 20, 1999, cc. 75-79; Harigaya Y. и др., Biochem.Biophys. Res. Commun. 276, 2000, cc. 422-427), и они присутствуют также в преамилоидных повреждениях (Lalowski М. и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc. 33623-33631). Накопление пептидов AN3(pE), вероятно, является следствием структурной модификации, которая усиливает агрегацию и придает устойчивость к большинству аминопептидаз (Saido Т.С. и др., Neuron. 14, 1995, cc. 457-466; Tekirian Т.L. и др., J.Neurochem. 73, 1999, сс. 1584-1589). Эти данные являются ключом к объяснению основной роли пептидов AN3(pE) в патогенезе АБ. Однако пока имеется относительно мало сведений об их нейротоксичности и способности к агрегации (Не W. и Barrow С.J., Biochemistry 38, 1999, cc. 10871-10877; Tekirian Т.L. и др., J. Neurochem. 73, 1999, cc. 1584-1589). Более того, совершенно нет данных о действии этих изоформ на глиальные клетки и о глиальном ответе на эти пептиды, хотя связь активированной глии со старческими бляшками точно установлена и глия может активно участвовать в накоплении амилоидных отложений. В современных исследованиях изучали токсичность, агрегацию и катаболизм пептидов А 142, А 1-40, [pGlu3]A3-42 и [pGlu3]А 3-40 в культурах клеток нейронов и глии, и было установлено, что модификация пироглутамата усиливает токсичные свойства А-пептидов и ингибирует также их расщепление культивируемыми астроцитами. Shirotani с соавторами изучали образование пептидов [pGlu3]A в первичных кортикальных нейронах, зараженных вирусом Синбис in vitro. Эти авторы сконструировали путем аминокислотной замены и делеции комплементарные ДНК амилоидного белка-предшественника,которые кодировали потенциальный предшественник [pGlu3]A. Для одного из искусственных предшественников, у которого на N-конце находился остаток глутамина вместо глутамата, присутствующего во встречающемся в естественных условиях предшественнике, сделано предположение о спонтанном превращении или ферментативном превращении с помощью глутаминилциклазы в пироглутамат. Механизм циклизации N-концевого глутамата в положении 3 во встречающемся в естественных условиях предшественнике пептида [pGlu3]Ap in vivo не выяснен (Shirotani K., Tsubuki S., Lee H.J., Maruyama K. и Saido Т.С., Neurosci. Lett. 327, 2002, сс. 25-28). Дипептидилпептидаза IV (DP IV) представляет собой осуществляющую расщепление в положении после пролина (в меньшей степени после аланина, после серина или после глицина) сериновую протеазу,обнаруженную в различных тканях организма, включая почку, печень и кишечник, и она отщепляет Nконцевые дипептиды от пептидной цепи. В настоящее время установлено, что DP IV играет важную роль в метаболизме нейропептидов, Т-клеточной активации, прикреплении раковых клеток к эндотелию и в проникновении ВИЧ в лимфоидные клетки (см. WO 02/34242, WO 02/34243, WO 03/002595 и WO 03/002596). Известно, что ингибиторы DP IV можно применять для лечения нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета (международная заявка на патент, публикация WO 99/61431, Pederson R.А. и др., Diabetes 47, 1998, cc. 1253-1258 и Pauly R.Р. и др., Metabolism 48, 1999, cc. 385-389). В частности, вWO 99/61431 описаны ингибиторы DP IV, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего L-треоизолейцилтиазолидин, L-аллоизолейцилтиазолидин, L-треоизолейцилпирролидин, L-аллоизолейцилтиазолидин, L-аллоизолейцилпиролидин и их соли. Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, N-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, N-(N'-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, N-(замещенный глицил)тиазолидины,N-(замещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в US 6380398, US 6011155; US 6107317; US 6110949; US 6124305; US 6172081; WO-2 009291 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 С 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 и WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250,WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 и WO 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего, касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к новым физиологическим субстратам QC в организме млекопитающих, таким как А 3-40/42, [Gln3]А 3-40/42, [Glu11]A11-40/42, [Gln11]А 11-40/42, [Gln1]гастрин,[Gln1]нейротензин, [Gln1]FPP, [Gln1]CCL 2, [Gln1]CCL 7, [Gln1]CCL 8, [Gln1]CCL 16, [Gln1]CCL 18,[Gln1]фракталкин, [Gln1]орексин A, [Gln3]глюкагон 3-29 и [Gln5]субстанция P5-11, и к применению эффекторов QC и фармацевтических композиций, содержащих эффекторы QC, для лечения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC. С помощью экспериментов по ингибированию установлено, что человеческая QC представляет собой металлзависимую трансферазу. Апофермент QC может проявлять наибольшую реакционную способность в присутствии ионов цинка, и металлсвязывающий мотив цинкзависимых аминопептидаз присутствует также в человеческой QC. Соединения, которые взаимодействуют с активным сайтом связывания металла, являются эффективными ингибиторами. При создании изобретения неожиданно было установлено, что рекомбинантная человеческая QC, а также активность QC в экстрактах, выделенных из головного мозга, катализирует циклизацию как Nконцевого глутаминила, так и глутамата. В этом исследовании убедительно доказано, что для катализируемого циклазой Glu1-превращения оптимальным является значение рН, близкое к 6,0, а для Gln1 превращения в pGlu-производное оптимальным является значение рН, близкое к 8,0. Поскольку образование пептидов, родственных pGlu-A, можно подавлять путем ингибирования рекомбинантной человеческой QC и QC-активности экстрактов, выделенных из гипофиза свиньи, фермент QC является мишенью для разработки пути лечения болезни Альцгеймера. Путем введения млекопитающим эффекторов QC-активности можно предупреждать, или облегчать,или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка,связанный или не связанный с заражением Heliobacter pylori, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит,атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма. Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов QC-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток. Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов QC-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников. Путем введения ингибиторов QC можно также подавлять мужскую фертильность. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение эффекторов QC-активности в сочетании с ингибиторами DP IV или ферментов, подобных DP IV, для лечения или облегчения состояний, которые можно лечить путем модуляции активности QC и/или DP IV. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для парентерального, энтерального или орального введения, которые содержат по меньшей мере один эффекторQC необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами или которые содержат по меньшей мере один эффектор QC в сочетании по меньшей мере с одним ингибитором DP IV необязательно в сочетании с общепринятыми носителями и/или эксципиентами. Разработаны также способы скрининга для идентификации и отбора эффекторов QC. Краткое описание чертежей Эти и другие аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы ниже со ссылкой на чертежи,на которых показано: на фиг. 1 - кривые, характеризующие процесс циклизации H-Gln-Ala-OH, катализируемой человеческой QC, по снижению абсорбции при 340 нм. Образцы содержали 0,3 мМ НАДН/Н+, 14 мМ -кетоглутаровую кислоту, 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы и 1 мМ H-Gln-Ala-OH. На кривых А-Г представлены результаты, полученные с использованием различных концентраций QC: А, 10 мед. (0,001 стандартной единицы)/мл, Б, 5 мед./мл, В, 2,5 мед./мл. На кривой Г представлены результаты, полученные без QC. Обнаружена линейная зависимость полученной активности от концентрации QC (вклейка); на фиг. 2 - зависимость от рН активности человеческой QC и QC из папайи (вставка), которую опре-3 009291 деляли в условиях скорости реакции первого порядка с использованием в качестве субстрата Gln-NA. Для человеческой QC использовали буферную систему, обеспечивающую постоянную ионную силу, предложенную Ellis и Morrison, в состав которой входили 25 мМ MES, 25 мМ уксусная кислота и 50 мМ Трис(Ellis K.J. и Morrison J.F., Methods Enzymol. 87, 1982, cc. 405-426). Из-за некоторого ингибирующего действия Трис на фермент QC из папайи изучали с использованием 50 мМ Mops-буфера. Ионную силу доводили до 0,05 М, добавляя NaCl. Профили скорости реакции оценивали путем аппроксимации с использованием модели, основанной на концепции диссоциирующих групп. Для QC из папайи при аппроксимации данных с использованием модели однократной диссоциации установлено, что значение pKa составляло 7,130,03; на фиг. 3 - данные о воздействии значений рН на стабильность QC из латекса папайи и человеческойQC. Маточный раствор фермента разбавляли в 20 раз 0,1 М буфером с различными значениями рН (натрийцитратый буфер, рН 4-7 и натрийфосфатный буфер, рН 7-10). Растворы ферментов инкубировали при 30 С в течение 30 мин и затем оценивали ферментативную активность согласно стандартному протоколу; на фиг. 4 - результаты сравнения констант специфичности kcat/KM для набора субстратов, содержащих глутамат в положении второй аминокислоты. В то время, как при переходе от ди- к трипептидам было обнаружено повышение специфичности человеческой QC, никаких изменений в этом варианте не обнаружено для QC из папайи. Представленные диаграммы получены на основе параметров, приведенных в табл. 3; на фиг. 5 - данные об образовании pGlu-Lys(pGlu)-Arg-Leu-Ala-NH2 из Н-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-AlaNH2, катализируемом человеческой QC. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении m/z, обусловленному выбросом аммиака. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 38 нМ QC в 40 мМ трис/HCl, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали массспектрометрическому анализу. Очень близкая зависимость обнаружена и для QC из папайи; на фиг. 6 - данные об образовании pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 из Н-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2,катализируемом QC из папайи. Превращение субстрата оценивали по зависящему от времени изменению в соотношении m/z, обусловленному выбросом метиламина. Образец имел следующий состав: 0,5 мМ субстрат, 0,65 мкМ QC из папайи в 40 мМ Трис/HCl, рН 7,7. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу. Никакого превращения субстрата не обнаружено в образцах без QC из папайи или при добавлении к субстрату вплоть до 1,5 мкМ человеческой QC (данные не представлены); на фиг. 7 - данные об образовании [Gln3]-A3-11 из [Gln3]A1-11, катализируемом DP IV. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором(1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 8 - данные о предупреждении расщепления [Gln3]A1-11 с помощью ингибитора DP IV Valпирролидида (Val-Pyrr). В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки,смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 9 - данные об образовании [pGlu3]A3-11 из [Gln3]А 3-11, катализируемом QC. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором(1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 10 - данные об ингибировании образования [pGlu3]A3-11 из [Gln3]А 3-11 с помощью ингибитора QC 1,10-фенантролина. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки,смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 11 - данные об образовании [pGlu3]А 3-11 из [Gln3]A1-11 после последовательного катализа с помощью DP IV и QC. В указанные моменты времени образцы изымали из лабораторной пробирки,смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 12 - данные об ингибировании образования [pGlu3]А 3-11 из [Gln3]A1-11 с помощью ингибитора QC 1,10-фенантролина в присутствии каталитически активных DP IV и QC. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1,об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 13 - данные о снижении образования [pGlu3]А 3-11 из [Gln3]A1-11 с помощью ингибитораDP IV Val-Pyrr в присутствии каталитически активных DP IV и QC. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 14 - данные об образовании [pGlu3]А-пептид 3-11 из [Gln3]A1-11 после последовательного катализа аминопепетидазой(ами) и QC, которые присутствовали в гомогенате гипофиза свиньи. В указанные моменты времени образцы изымали из аналитической пробирки, смешивали с матричным раствором (1:1, об./об.) и затем подвергали масс-спектрометрическому анализу; на фиг. 15 А и Б - масс-спектры А 3-11a и А 3-21 а, инкубированных в присутствии рекомбинантной человеческой QC, которую кипятили в течение 10 мин перед применением. На фиг. 15 В и Д представлены масс-спектры А 3-11 и А 3-21 а в присутствии активной человеческой QC, что приводило к образованию-4 009291 на фиг. 16 - скорости реакции катализируемого QC из папайи превращения GluNA в зависимости от концентрации субстрата. Начальные скорости оценивали в 0,1 М пирофосфатном буфере, рН 6,1(квадраты), 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5 (кружки) и 0,1 М боратном буфере, рН 8,5 (треугольники). Значения кинетических параметров: KM=1,130,07 мМ, kcat=1,130,04 мин-1 (рН 6,1); KM=1,450,03 мМ,kcat=0,920,01 мин-1 (рН 7,5); KM=1,760,06 мМ, kcat=0,560,01 мин-1 (рН 8,5); на фиг. 17 - зависимость от рН превращения Gln-NA (кружочки) и Glu-NA (квадраты), которую определяли в условиях скорости реакции первого порядка (SKM). Использовали концентрацию субстрата 0,01 и 0,25 мМ, соответственно. Для обоих вариантов использовали трехкомпонентную буферную систему, включающую 0,05 М уксусную кислоту, 0,05 М пирофосфорную кислоту и 0,05 М трицин. Все буферы доводили до одинаковой проводимости путем добавления NaCl для того, чтобы избежать различий в ионной силе. Данные аппроксимировали с помощью уравнений, позволивших установить для двух диссоциирующих групп значения pKa 6,910,02 и 9,50,1 для Gln-NA и 4,60,1 и 7,550,02 для GluNA. Значения pKa для аминогрупп соответствующего субстрата, которые определяли титрованием, составили 6,970,01 (Gln-NA) и 7,570,05 (GluNA). Все определения осуществляли при 30 С; на фиг. 18 - кривые, характеризующие процесс катализируемой человеческой QC циклизации H-GlnAMC в присутствии имидазола, дипиколиновой кислоты и без ингибитора. Гиперболическая форма кривой в присутствии дипиколиновой кислоты свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта QC; на фиг. 19 - зависящая от времени инактивация QC с помощью гетероциклического хелатора 1,10 фенантролина. После инкубации фермента QC с ингибитором в отсутствие субстрата (сплошная линия) обнаружена пониженная ферментативная активность по сравнению с образцами, которые не подвергали предварительной инкубации с ингибитором (пунктирная линия), что свидетельствует об удалении иона металла из активного сайта QC; на фиг. 20 - реактивация человеческой QC ионами одновалентных и двухвалентных металлов. QC инактивировали добавлением 2 мМ дипиколиновой кислоты в 50 мМ бис-трис-буфере, рН 6,8. Затем фермент подвергали диализу в противотоке 50 мМ бис-трис-буфера, рН 6,8, содержащего 1,0 мМ ЭДТК. Для реактивации фермента осуществляли инкубацию инактивированного образца фермента с ионами металлов в концентрации 0,5 мМ в присутствии 0,5 мМ ЭДТК для того, чтобы избежать неспецифической реактивации следами ионов металлов, присутствующих в буферных растворах. В качестве контролей использовали содержащие фермент образцы, которые не инактивировали, но так же, как и инактивированный фермент, подвергали диализу в противотоке раствора ЭДТК (+ЭДТК), и образцы фермента,которые подвергали диализу в противотоке буферных растворов, не содержащих ЭДТК (-ЭДТК); на фиг. 21 - сравнительный анализ последовательностей человеческой QC (hQC) и других представителей семейства М 28 металлопептидаз Clan MH. Сравнительный анализ множества последовательностей осуществляли с помощью программы ClustalW в ch.EMBnet.org с принимаемыми по умолчанию параметрами. Превращение связанных с ионом цинка остатков обнаружено для человеческой QC (hQC;N-ацетилированном-альфа-связанном кислотном дипептидазном домене (NAALADase I) (остатки 274587) человеческой глутаматкарбоксипептидазы II (hGCP II; Swiss-Prot Q04609). Аминокислоты, участвующие в связывании металла, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. В случае человеческой QC эти остатки, вероятно, являются двойниками пептидаз. Пептидные последовательности Упомянутые и применяемые согласно настоящему описанию пептиды имеют следующие последовательности.Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к эффекторам глутаминилциклазы (QC), предназначенным: а) для лечения болезней у млекопитающих, которые можно лечить путем модуляции активностиQC in vivo; б) и/или для модуляции физиологических процессов, основанных на действии pGlu-содержащих пептидов, обусловленном модуляцией активности QC. Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям, предназначенным для ингибирования глутаминилциклазы (QC, КФ 2.3.2.5) и/или QC-подобных ферментов в организме млекопитающего и к применению ингибиторов QC-активности для лечения патологических состояний, связанных с QC-активностью. В настоящем изобретении предложен также новый способ лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. N-концы амилоидных -пептидов, отложение которых происходит в головном мозге при болезни Альцгеймера и синдроме Дауна, несут пироглутаминовую кислоту. Образование pGlu представляет собой важное событие в развитии и прогрессировании заболевания, так как известно, что амилоидные-пептиды характеризуются повышенной тенденцией к агрегации -амилоидов и токсичностью, чем,вероятно, обусловлено начало и развитие болезни (Russo С. и др., J. Neurochem. 82, 2002, cc. 1480-1489). В противоположность этому, во встречающихся в естественных условиях А-пептидах (3-40/42) в качестве N-концевой аминокислоты присутствует глутаминовая кислота. К настоящему времени отсутствуют данные о превращении Glu в pGlu. Кроме того, пока не обнаружена спонтанная циклизация Gluпептидов в pGlu-пептиды. Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является выяснение роли QC в болезни Альцгеймера и синдроме Дауна. Эта задача решается с помощью синтеза А 3-11 и А 1-11, которые содержат аминокислоту глутамин вместо глутаминовой кислоты в положении 3, определения особенностей этих модифицированных амилоидных -пептидов в качестве субстратов для QC,DP IV и DP IV-подобных ферментов и аминопептидаз и применения ингибиторов QC для предупреждения образования pGlu из N-концевого глутаминильного остатка выведенных из амилоида -пептидов 111 и 3-11. Результаты описаны в примере 8. Примененный метод описан в примере 3. К настоящему времени отсутствуют какие-либо сведения об участии QC в развитии заболевания,поскольку N-концевой аминокислотой в А (3-40/42 или 11-40/42) является глутаминовая кислота. ОднакоQC является единственным известным ферментом, который обладает способностью образовывать pGlu на N-конце пептидов. Другие объекты настоящего изобретения касаются следующих данных и открытий: а) побочная реакция катализируемой QC циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,б) глутаминовая кислота -амилоидного белка-предшественника (АРР) или образованные из нее амилоидные -пептиды превращаются в глутамин после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а на второй стадии QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида,в) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а затем QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида,г) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный -белок, что приводит к замене Glu в положении 3 на Gln. После трансляции и процессинга N-конца QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,д) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому QC катализирует циклизацию N-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида.QC участвует в имеющей решающее значение стадии во всех 5 перечисленных выше случаях, а именно в образовании пироглутаминовой кислоты, которая способствует агрегации амилоидных -пептидов. Таким образом, ингибирование QC приводит к предупреждению осаждения бляшкообразующих А 3-40/41/43 или А 11-40/41/43, вызывая появление и прогрессирование болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, в независимости от механизма, посредством которого происходит циклизация.-6 009291 Глутамат обнаружен в положениях 3, 11 и 22 амилоидного -пептида. Среди прочего описана мутация, приводящая к замене глутаминовой кислоты (Е) на глутамин (Q) в положении 22 (соответствующая амилоидному белку-предшественнику АРР 693, Swissprot P05067), в качестве мутации, приводящей к цереброартериальному амилоидозу датского типа. Установлено, что -амилоидные пептиды, несущие остаток пироглутаминовой кислоты в положении 3, 11 и/или 22, являются более цитотоксическими и гидрофобными по сравнению с А 1-40/42/43(Huse J.T. и др., J. Biol. Chem. 277 (18), 2002, cc. 16278-16284), и/или процессинга с помощью аминопептидазы. Во всех случаях циклизация может происходить согласно описанным выше механизмам а)-д). Таким образом, к настоящему времени отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие ферментативный путь превращения Glu1-пептидов в pGlu-пептиды с помощью неизвестной глутамилциклазы (ЕС), что соответствует механизму a) (Garden R.W., Moroz Т.P., Gleeson J.M., Floyd P.D., Li L.J.,Rubakhin S.S. и Sweedler J.V. J. Neurochem. 72, 1999, cc. 676-681; Hosoda R. и др. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 1998, cc. 1089-1095). К настоящему времени не была обнаружена такая ферментативная активность,которая может осуществлять циклизацию Glu1-пептидов, протонированных на N-конце и несущих отрицательно заряженный остаток Glu1-карбоксилата, при слабых щелочных значениях рН.QC-активность в отношении Gln1-субстратов очень резко снижалась при значениях рН ниже 7,0. В противоположность этому, установлено, что превращение Glu1 может происходить в кислых реакционных средах (Iwatsubo Т., Saido Т.С., Mann D.M., Lee V.М. и Trojanowski J.Q., Am. J. Pathol. 149, 1996, cc. 18231830; Russo C., Saido T.C., DeBusk L.M., Tabaton M., Gambetti P. и Teller J.K., FEBS Lett. 409, 1977, cc. 411416; Russo C., Salis S., Dolcini V., Venezia V., Song X.H., Teller J.K. и Schettini G., Neurobiol. Dis. 8, 2001,cc. 173-180; Tekirian T.L., Saido T.C., Markesbery W.R., Russell M.J., Wekstein D.R., Patel E. и Geddes J.W.,J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 1998, cc. 76-94; Russo C., Violani E., Salis S., Venezia V., Dolcini V.,Damonte G., Benatti U., DArrigo C., Patrone E., Carlo P. и Schettini G., J. Neurochem. 82, 2002, cc. 14801489; Hosoda R., Saido T.C., Otvos L., Jr., Arai Т., Mann D.M., Lee V.M., Trojanowski J.Q. и Iwatsubo Т., J.L.J., Rubakhin S.S. и Sweedler J.V., J. Neurochem. 72, 1999, cc. 676-681). При создании настоящего изобретения изучался вопрос о том, может ли QC распознавать и участвовать в превращении выведенных из амилоида- пептидов в слабокислых условиях. Для этой цели синтезировали и исследовали в качестве потенциальных субстратов фермента пептиды [Gln3]А 1-11 а, А 3-11 а,[Gln3]A3-11a, A3-21a, [Gln3]A3-21a и [Gln3]A3-40. Эти последовательности были выбраны для имитации встречающихся в естественных условиях укороченных на N-конце и на С-конце пептидов [Glu3]A и пептидов [Gln3]A, которые могут присутствовать в результате посттрансляционного амидирования Glu. При создании настоящего изобретения было установлено, что QC из папайи и человеческая QC катализируют циклизацию как глутаминила, так и глутамила. По-видимому, первичной физиологической функцией QC является прекращение созревания гормонов в эндокринных клетках посредством циклизации глутамина до или во время процесса секреции гормона. Известно, что такие секреторные пузырьки характеризуются кислым значением рН. Таким образом, побочная активность фермента в узком диапазоне значений рН от 5,0 до 7,0 может представлять собой открытую при создании настоящего изобретения глутамилциклазную активность, которая трансформирует также пептиды Glu-A. Однако из-за существенно меньшей скорости Glu-циклизации по сравнению с Gln-конверсией вопрос о том, может ли циклизация глутамила играть важную физиологическую роль, является спорным. При этом циклизация глутамила участвует в патологии нейродегенеративных заболеваний. При создании настоящего изобретения при изучении зависимости этой ферментативной реакции от значений рН установлено, что непротонированный N-конец играет ключевую роль для циклизации Gln1-пептидов и,соответственно, значение pKa субстрата идентично значению pKa при QC-катализе (см. фиг. 17). Таким образом,QC стабилизирует внутримолекулярное нуклеофильное воздействие непротонированной -аминогруппы на-карбонильный углерод, который приобретает электрофильные свойства в результате амидирования (схема 1). В отличие от одновалентного заряда, присутствующего в пептидах, несущих N-концевой глутамин,N-концевой остаток Glu в содержащих Glu пептидах в большинстве случаев несет двухвалентных заряд при нейтральных значениях рН. Для глутамата характерно значение pKa примерно 4,2 и 7,5 для -карбоксильного остатка и для -аминогруппы, соответственно. То есть при нейтральных и щелочных значениях рН хотя азот-аминогруппы является частично или полностью непротонированным и нуклеофильным, -карбоксильная группа является непротонированной и поэтому не проявляет никакой электрофильной, характерной для карбонила, активности. Поэтому внутримолекулярная циклизация представляется невозможной. Однако при значениях рН примерно 5,2-6,5, с учетом соответствующих значений pKa, обе функциональные группы присутствуют в неионизированной форме в концентрациях примерно 1-10% (-NH2) или 10-1% (-СООН) от общей массы N-концевого содержащего Glu пептида. В результате при слабокислых значениях рН присутствуют виды N-концевых Glu-пептидов, в которых обе группы являются неза-7 009291 ряженными, и поэтому представляется возможным, что QC может стабилизировать промежуточное звено внутримолекулярной циклизации с образованием pGlu-пептида. То есть, если -карбоксильная группа является протонированной, то углерод карбонила является достаточно электрофильным, что позволяет осуществлять нуклеофильное воздействие на него непротонированной -аминогруппы. При таких значения рН ион гидроксила функционирует в качестве уходящей группы (схема 3). Эти предположения подтверждаются данными о зависимости от рН, полученными для катализируемого QC превращения GluNA (см. пример 11). В отличие от превращения с помощью QC глутамина Gln-NA, оптимум рН катализа сдвигается в кислотный диапазон значений рН, примерно рН 6,0, т.е. диапазон значений рН, при котором одновременно присутствует значительное количество видов молекул субстрата, которые несут протонированную -карбоксильную и непротонированную -аминогруппу. Кроме того, характеризующее кинетическую реакцию конкретное значение pKa, составляющее 7,550,02, очень хорошо согласуется со значением, установленным для -аминогруппы Glu-NA с помощью титрования (7,570,05). С физиологической точки зрения, при рН 6,0 константа скорости реакции второго порядка (или константа специфичности kcat/KM) катализируемой QC циклизации глутамата может быть примерно в 8000 раз ниже, чем константа, характеризующая циклизацию глутамина (фиг. 17). Однако не связанное с ферментом превращение обоих модельных субстратов Glu-NA и Gln-NA является очень незначительным, что согласуется с данными о незначительном образовании pGlu-пептида, полученными при создании настоящего изобретения. Следовательно, из соотношения констант скорости ферментативной и неферментативной реакций (при сравнении констант скорости реакции второго порядка для ферментативного катализа с соответствующими константами скорости реакции первого порядка для неферментативной циклизации коэффициент каталитической эффективности составляет 109-1010 М-1 для Gln- и Glu-превращения, соответственно) можно оценить, что для образования pGlu с помощью QC может быть достигнуто ускорение по меньшей мере в 108 раз. Из этих данных можно сделать вывод о том, что in vivo возможным является только ферментативный путь, приводящий к образованию pGlu. Поскольку QC присутствует в больших количествах в головном мозге, а также принимая во внимание высокую скорость превращения, составляющую 0,9 мин-1, которая в последние годы установлена для созревания 30 мкМ (Gln-)TRH-подобного пептида (Prokai L., Prokai-Tatrai K., Ouyang X., Kim H.S., WuW.M., Zharikova А. и Bodor N., J. Med. Chem. 42, 1999, cc. 4563-4571), можно предсказать, что время полужизни соответствующего глутаматного субстрата при его циклизации составляет примерно 100 ч, что совпадает с предложенными в настоящем описании реакционными условиями. Кроме того, принимая во внимание компартментализацию и локализацию в головном мозге QC/EC в пути секреции, in vivo в неповрежденных клетках фактические концентрации фермента и субстрата и условия реакции могут оказаться еще более оптимальными для ферментативной циклизации. А также, если N-концевой Glu заменяют на Gln, то можно ожидать еще более быстрое образование pGlu, опосредуемое QC. In vitro обе реакции подавлялись при внесении ингибиторов QC/EC-активности (фиг. 9, 10 и 15). В целом, при создании настоящего изобретения установлено, что человеческая QC, которая присутствует в больших количествах в головном мозге, вероятно, катализирует образование амилоидогенных пептидов pGlu-A из предшественников Glu-A и Gln-A, на долю которых приходится более чем 50% отложений бляшек при болезни Альцгеймера. Эти данные позволили установить, что QC/EC участвуют в образовании старческих бляшек и вследствие этого представляют собой новую мишень для разработки лекарственных средств, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера. Второй вариант осуществления настоящего изобретения касается того, что выведенные из амилоида- пептиды являются субстратом для дипептидилпептидазы IV (DP IV) или подобных DP IV ферментов, предпочтительно дипептидилпептидазы II (DP II). DP IV, DP II или другие подобные DP IV ферменты высвобождают дипептид из N-конца модифицированного амилоидного -пептида (1-11), что приводит к образованию амилоидного -пептида (3-11), у которого в качестве N-концевого аминокислотного остатка присутствует глутамин. Эти результаты представлены в примере 8. Перед расщеплением с помощью DP II, DP IV или другого подобного DP IV фермента пептидная связь между аспарагиновой кислотой (остаток 1 амилоидного -пептида) и аланином (остаток 2 амилоидного -пептида) может быть изомеризована с образованием изоаспартильного остатка, что описано в литературе (Kuo Y.-M., Emmerling M.R., Woods A.S., Cotter R.J., Roher A.E., BBRC 237, 1997, сс. 188-191;Shimizu Т., Watanabe A., Ogawara M., Mori H. и Shirasawa Т., Arch. Biochem. Biophys. 381, 2000, cc. 225-234). Эти изоаспартильные остатки придают амилоидному -пептиду устойчивость к расщеплению аминопептидазой, и в результате коровые бляшки содержат более высокие количества изоAsp1-амилоидных-пептидов, что позволяет предположить пониженное превращение на N-конце. Однако в настоящем изобретении впервые продемонстрировано, что под воздействием дипептидилпептидаз может высвобождаться N-концевой дипептид Н-изоAsp1-Ala2-ОН, прежде всего, в кислотных условиях. Кроме того, при создании изобретения было установлено, что изомеризация может предшествовать также расщеплению -секретазой и что изомеризация может ускорять протеолитическое расщепление, что приводит к выделению в свободном состоянии N-концевой изоаспартильной связи изоAsp1 амилоидных -пептидов, которые, в свою очередь, являются объектом для обновления с помощью DP II,-8 009291Y.-M., Emmerling M.R., Woods A.S., Cotter R.J., Roher A.E., BBRC 237, 1997, cc. 188-191). Таким образом,ингибирование образования изоаспартила может приводить к снижению расщепления -секретазой и, в свою очередь, к пониженному образованию амилоидных -пептидов. Кроме того, блокада превращения изоAsp1-амилоидного -пептидов путем ингибирования DP II, DP IV или подобных DP IV ферментов должна препятствовать катализируемому QC/EC образованию [pGlu3]A из [Glu3]A. Согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения комбинацию ингибиторов активности DP IV и ингибиторов QC можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Совместное действие DP IV и/или подобных DP IV ферментов и QC иллюстрируют следующие факты: а) DP IV и/или подобные DP IV ферменты расщепляют А 1-40/42, при этом высвобождается дипептид, содержащий H-Asp-Ala-OH и А 3-40/42,б) побочная реакция катализируемой QC циклизации глутаминовой кислоты с образованием пироглутаминовой кислоты происходит с очень низкой скоростью,в) глутаминовая кислота превращается в глутамин на N-конце после трансляции с помощью неизвестной ферментативной активности, а затем QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида,г) глутаминовая кислота превращается в глутамин после трансляции с помощью химического катализа или автокатализа, а на второй стадии QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида,д) в гене АРР присутствуют мутации, которые кодируют амилоидный -белок, что приводит к замене Glu в положении 3A Gln. После трансляции и процессинга N-конца QC катализирует циклизацию глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты,е) глутамин включается в возникающую пептидную цепь АРР вследствие функционального нарушения неизвестной ферментативной активности, и поэтому QC катализирует циклизацию N-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты после процессинга N-конца амилоидного -пептида.QC-активность в отношении N-концевого Gln может запускаться также действием различных пептидаз. Аминопептидазы могут удалять последовательно Asp и Ala из N-конца A1-40/41/43, демаскируя тем самым аминокислоту в положении 3, которая может подвергаться циклизации. Дипептидилпептидазы, такие как DP I, DP II, DP IV, DP 8, DP 9 и DP 10, в одну стадию осуществляют удаление дипептидаAsp-Ala. Таким образом, ингибирование аминопептидазной или дипептидилпептидазной активности можно применять для предупреждения образования А 3-40/41/43. Совместное действие ингибиторов DP IV и/или подобных DP IV ферментов и снижающих активность эффекторов QC можно проиллюстрировать следующим образом: а) ингибиторы DP IV и/или подобных DP IV ферментов ингибируют превращение А 1-40/42 в А 3-40/42,б) тем самым предотвращается воздействие на N-концевую глутаминовую кислоту и не происходит ее превращение в глутамин либо ферментативным путем, либо с помощью химического катализа, что в дальнейшем делает возможным образование пироглутаминовой кислоты,в) ингибиторы QC предупреждают также образование пироглутаминовой кислоты из любых молекул А 3-40/42 с модифицированными остатками и тех модифицированных молекул А 3-40/42, которые образуются в результате мутаций гена АРР. При создании настоящего изобретения аналогичное совместное действие DP IV или подобных DPIV ферментов и QC было продемонстрировано также для других пептидных гормонов, таких как глюкагон, СС-хемокины и вещество Р. Глюкагон представляет собой состоящий из 29 аминокислот полипептид, который выделяется из альфа-клеток панкреатических островков, и его функцией является поддержание нормальной глицемии путем стимуляции печеночного гликогенолиза и глюконеогенеза. Несмотря на важность этого вопроса, сохраняются противоположные мнения о механизме, ответственном за клиренс глюкагона в организме. Pospisilik с соавторами изучали ферментативный метаболизм глюкагона с помощью высокочувствительных методов масс-спектрометрии для идентификации продукта на молекулярном уровне. Инкубация глюкагона с очищенной свиной дипептидилпептидазой IV (DP IV) приводила к последовательному производству глюкагона 3-29 и глюкагона 5-29. В человеческой сыворотке расщепление до глюкагона 3-29 сопровождалось быстрой N-концевой циклизацией глюкагона, что препятствовало дальнейшему опосредуемому DP IV гидролизу. Биологический анализ глюкагона после его инкубации с очищенной DP IV или нормальной крысиной сывороткой продемонстрировал значительное снижение гипергликемической активности, в то время как аналогичная инкубация с крысиной сывороткой с дефицитом DP IV не приводила ни к какому снижению биологической активности глюкагона. Расщепление, для оценки которого применяли масс-спектрометрию и биологический анализ, блокировали с помощью специфического ингибитора DP IV изолейцилтиазолидина. Эти результаты свидетельствуют о том, что DP IV представляет собой основной фермент, участвующий в расщеплении и инактивации глюкагона. Эти данные нашли важное применение для определения уровней глюкагона в человеческой плазме (Pospisilik и др., Regul. Pept., 12; 96(3), январь 2001, cc. 133-41). Хемотаксический белок человеческих моноцитов (МСР)-2 впервые был выделен из стимулирован-9 009291 ных клеток остеосаркомы в качестве хемокина, производимого вместе с МСР-1 и МСР-3. Von Coillie с соавторами (Van Coillie E. и др., Biochemistry 37, 1998, cc. 12672-12680) клонировали из библиотеки кДНК человеческих яичек кДНК МСР-2 с удлинением на 5'-конце. Она кодировала состоящий из 76 остатков белок МСР-2, но отличалась от известной полученной из костного мозга последовательности кДНК МСР-2 кодоном 46, который кодировал Lys вместо Gln. Осуществляли анализ биологической активности этого варианта MCP-2Lys46, полученного в результате полиморфизма одного нуклеотида(SNP), и MCP-2Gln46. Кодирующие области субклонировали в бактериальном экспрессионном вектореpHEN1 и после трансформации им Escherichia coli из периплазмы выделяли два варианта белка МСР-2. С помощью расщепления по Эдману подтвердили наличие на NH2-конце остатка Gln вместо pGlu. rMCP2Gln46 и rMCP-2Lys46 и копии с циклическим NH2-концом оценивали на клетках моноцитов в опытах по мобилизации кальция и оценке хемотаксиса. Никаких различий в биологической активности не обнаружено между изоформами rMCP-2Gln46 и rMCP-2Lys46. Однако для обоих вариантов МСР-2 установлено, что наличие NH2-концевого пироглутамата имело решающее значение для хемотаксиса, но не было важно для мобилизации кальция. Укорочение NH2-конца rMCP-2Lys46 с помощью сериновой протеазыGln-Pro, в то время как синтетический МСР-2, несущий на NH2-конце pGlu, остался неповрежденным. Укороченный с помощью CD26/DPP IV rMCP-2Lys46(3-76) оказался практически полностью неактивным как в опытах по оценке хемотаксиса, так и в опытах по оценке передачи сигнала. Эти данные свидетельствуют о том, что NH2-концевой pGlu в МСР-2 является не только необходимым для хемотаксической активности, но также защищает белок от расщепления с помощью CD26/DPPIV (van Coillie E. и др., Biochemistry, 37, 1998, cc. 12672-80). При создании настоящего изобретения с помощью анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) установлено, что образование N-концевого остатка пироглутамата в глюкагоне 3-29 (Pospisilik и др., 2001) и в изоформах МСР-2 (van Coillie и др., 1998), катализируется QC. Кроме того, с помощью ЖХ/МС доказано, что после катализируемого DP IV удаления двух дипептидов Lys-Pro и Arg-Pro из N-конца вещества Р оставшееся [Gln5]вещество Р 5-11 трансформируется с помощью QC с образованием [pGlu5]вещества Р 5-11. Ингибиторы DP IV описаны в WO 99/61431. В частности, описаны ингибиторы DP IV, содержащие аминокислотный остаток и тиазолидиновую или пирролидиновую группу, и их соли, прежде всего Lтреоизолейцилтиазолидин, L-аллоизолейцилтиазолидин, L-треоизолейцилпирролидин, L-аллоизолейцилтиазолидин, L-аллоизолейцилпирролидин и их соли. Дополнительными примерами низкомолекулярных ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются такие агенты, как тетрагидроизохинолин-3-карбоксамидные производные, N-замещенные 2-цианпиролы и -пирролидины, N-(N'-замещенный глицил)-2-цианпирролидины, N-(замещенный глицил)тиазолидины,N-(замещенный глицил)-4-циантиазолидины, аминоацилборпролильные ингибиторы, сконденсированные с циклопропилом пирролидины и гетероциклические соединения. Ингибиторы дипептидилпептидазы IV описаны в US 6380398, US 6011155; US 6107317; US 6110949; US 6124305; US 6172081; WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 С 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 и WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250,WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 и WO 03/024965, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, прежде всего касательно этих ингибиторов, их определения, применения и получения. Предпочтительными для применения в сочетании с эффекторами QC являются такие ингибиторыChem. Lett. 6, 1996, cc. 1163-1166 и cc. 2745-2748 , FE-999011, описанный у Sudre и др., Diabetes 51, 2002,cc. 1461-1469 (фирма Ferring), и соединения, описанные в WO 01/34594 (фирма Guilford), при их использовании в дозах, которые указаны в приведенных выше ссылках. Более предпочтительными ингибиторами DP IV, которые можно применять в сочетании с эффекторами QC, являются дипептидные соединения, в которых аминокислоту предпочтительно выбирают из встречающихся в естественных условиях аминокислот, таких, например, как лейцин, валин, глутамин,глутаминовая кислота, пролин, изолейцин, аспарагины и аспарагиновая кислота. Подобные дипептидам соединения, применяемые согласно изобретению, в концентрации (в пересчете на дипептидные соединения) 10 мкМ снижают активность в плазме дипептидилпептидазы IV или ферментов-аналогов DP IV по меньшей мере на 10%, прежде всего по меньшей мере на 40%. Часто in vivo требуется также снижение активности по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%. Предпочтительные соединения могут- 10009291 обладать также способностью снижать активность, максимум, на 20 или 30%. Предпочтительными дипептидными соединениями являются N-валилпролил, О-бензоилгидроксиламин, аланилпирролидин, изолейцилтиазолидин, например L-аллоизолейцилтиазолидин, L-треоизолейцилпирролидин и их соли, прежде всего фумараты, и L-аллоизолейцилпирролидин и его соли. Особенно предпочтительными соединениями являются глутаминилпирролидин и глутаминилтиазолидин, Н-Asnпирролидин, H-Asn-тиазолидин, H-Asp-пирролидин, H-Asp-тиазолидин, H-Asp(NHOH)-пирролидин, HAsp(NHOH)-тиазолидин, H-Glu-пирролидин, H-Glu-тиазолидин, H-Glu(NHOH)-пирролидин, Н-Glu(NHOH)тиазолидин, H-His-пирролидин, H-His-тиазолидин, H-Pro-пирролидин, H-Pro-тиазолидин, H-Ile-азидидин, H-Ile-пирролидин, H-L-алло-Ile-тиазолидин, H-Val-пирролидин и Н-Val-тиазолидин и их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в WO 99/61431 и ЕР 1304327. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение эффекторов QC в сочетании с напоминающими субстрат пептидными соединениями, которые можно использовать для конкурентной модуляции катализа, осуществляемого дипептидилпептидазой IV. Предпочтительными пептидными соединениями являются 2-аминооктановая кислота-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-HypIle, Ile-Pro-алло-Ile, Ile-Pro-трет-бутил-Gly, Ile-Pro-Val, Nle-Pro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, PhgPro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, трет-бутил-Gly-Pro-D-Val, трет-бутил-Gly-ProGly, трет-бутил-Gly-Pro-Ile, трет-бутил-Gly-Pro-Ile-амид, трет-бутил-Gly-Pro-трет-бутил-Gly, трет-бутилGly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-алло-Ile, Val-Pro-алло-Ile, Val-Proтрет-бутил-Gly, Val-Pro-Val и их фармацевтически приемлемые соли, в которых трет-бутил-Gly обозначаетa Ser(Bzl) и Ser(P) обозначают бензилсерин и фосфорилсерин, соответственно. Tyr(P) обозначает фосфорилтирозин. Эти соединения описаны в WO 03/002593. Другими предпочтительными ингибиторами DP IV, которые можно применять согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами QC, являются пептидилкетоны, например гидробромид 2-метилкарбонил-1-N-[(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,гидробромид 2-метилкарбонил-1-N-[(L)-валинил-(L)-пролил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,гидробромид 2-[(ацетилоксиметил)карбонил]-1-N-[(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-N-[(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,2-[(2,6-дихлорбензил)тиометил]карбонил-1-N-[(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидин,гидробромид 2-[бензоилоксиметил)карбонил]-1-N-[глицил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,трифторацетат 2-[([1,3]-тиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-N-[(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,трифторацетат 2-[(бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-N-[N-(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина,трифторацетат 2-[(-бензотиазолетиазол-2-ил)карбонил]-1-N-[(L)-аланилглицил]-(2S)-пирролидина,трифторацетат 2-[(пиридин-2-ил)карбонил]-1-N-[N-(L)-аланил-(L)-валинил]-(2S)-пирролидина и другие их фармацевтически приемлемые соли. Эти соединения описаны в WO 03/033524. Кроме того, согласно настоящему изобретению в сочетании с эффекторами QC можно применять замещенные аминокетоны. Предпочтительными замещенными аминокетонами являются хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-пентанаминия,хлорид 1-циклопентил-3-метил-1-оксо-2-бутанаминия,хлорид 1-циклопентил-3,3-диметил-1-оксо-2-бутанаминия,хлорид 1-циклогексил-3,3-диметил-1-оксо-2-бутанаминия,хлорид 3-(циклопентилкарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиния,хлорид N-(2-циклопентил-2-оксоэтил)циклогексанаминия и другие их фармацевтически приемлемые соли. Ранее считалось, что из редкой группы специфических для пролина протеаз DP IV является единственным связанным с мембраной ферментом, специфическим для пролина в качестве предпоследнего остатка на аминоконце полипептидной цепи. Однако были выявлены другие молекулы, даже не обладающие структурной гомологией DP IV, но обладающие соответствующей ферментативной активностью. ПодобныеDP IV-ферменты, которые были выявлены к настоящему времени, представляют собой, например, протеин , участвующий в активации фибробластов, дипептидилпептидазу IV , белок, подобный дипептидиламинопептидазе, N-ацетилированная -связанная кислотная дипептидаза, пролиндипептидаза покоящихся клеток, дипептидилпептидаза II, аттрактин и белок, родственный дипептидилпептидазе IV (DPP 8),DPL1 (DPX, DP6), DPL2 и DPP 9, которые описаны в обзорных статьях Sedo и Malik (Sedo и Malik, Biochim.Biophys. Acta., 36506, 2001, cc. 1-10) и Abbott и Gorrell (Abbott C.A. и Gorrell M.D. в: Ectopeptidases, под ред. Langner и Ansorge, изд-во Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2002, cc. 171-195). В настоящее время описано клонирование и характеристики дипептидилпептидазы 10 (DPP 10) (Qi S.Y. и др.,Biochemical Journal Immediate Publication, публикация 28 марта 2003 г., рукопись BJ20021914).- 11009291 Эффекторы в контексте настоящего описания обозначают молекулы, которые связываются с ферментом и понижают или повышают его активность in vitro и/или in vivo. Некоторые ферменты несут сайты связывания для небольших молекул, которые влияют на их каталитическую активность; молекулустимулятор называют активатором. Ферменты могут нести даже несколько сайтов, которые распознаются более чем одним активатором или ингибитором. Ферменты могут обнаруживать концентрации различных молекул и использовать эту информацию для изменения собственной активности. Эффекторы могут модулировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут принимать как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами,ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы воздействуют не только на активные сайты ферментов, но также на регуляторные сайты или аллостерические сайты, последнее понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте (Darnell J., Lodish H. и Baltimore D., Molecular CellBiology, 2-ое изд., изд-во Scientific American Books, New York, 1990, с 63). В пептидах, предлагаемых в настоящем изобретении, каждый аминокислотный остаток обозначен однобуквенным или трехбуквенным кодом, который соответствует тривиальному названию аминокислоты, общепринятые обозначения которых представлены ниже. Понятие QC в контексте настоящего описания обозначает глутаминилциклазу (QC) и QC-подобные ферменты. QC и QC-подобные ферменты имеют идентичную или сходную ферментативную активность, обозначенную далее как QC-активность. Следует отметить, что QC-подобные ферменты могут принципиально отличаться от QC по молекулярной структуре. Понятие QC-активность в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию N-концевых остатков глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты (pGlu), или Nконцевого L-гомоглутамина, или Lгомоглутамина с образованием циклического пирогомоглутаминового производного с выделением в свободном состоянии аммиака (см. ниже схемы 1 и 2). Схема 1 Циклизация глутамина с помощью QC Понятие ЕС в контексте настоящего описания обозначает побочную активность QC и QC-подобных ферментов, таких как глутаматциклаза (ЕС), которая обозначена далее как ЕС-активность. Понятие ЕС-активность в контексте настоящего описания обозначает внутримолекулярную циклизацию N-концевых глутаматных остатков с образованием пироглутаминовой кислоты (pGlu) с помощью QC (см. ниже схему 3). Понятие металлзависимый фермент в контексте настоящего описания обозначает фермент(ы), который(ые) связывает(ют) ион металла для того, чтобы осуществлять присущую ему(им) каталитическую функцию и/ или для которого(ых) требуется связывание иона металла для формирования каталитически активной структуры. Молекулы, которые связываются с ферментами и понижают или повышают их активность, называют эффекторы. Эффекторы могут модифицировать ферментативную активность, поскольку ферменты могут иметь как активную, так и неактивную конформацию: активаторы являются позитивными эффекторами; ингибиторы являются негативными эффекторами. Эффекторы связываются с регуляторными сайтами или аллостерическими сайтами (от греческого другая форма), это понятие применяют для того, чтобы подчеркнуть, что регуляторный сайт представляет собой элемент фермента, отличный от каталитического сайта, и для того, чтобы отделить эту форму регуляции от конкуренции между субстратами и ингибиторами на каталитическом сайте. Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения предпочтительными могут являться либо активаторы, либо ингибиторы. Схема 3N-концевая циклизация незаряженных глутамильных пептидов с помощью QC (ЕС) Следующим объектом настоящего изобретения является идентификация новых физиологических субстратов QC. Их идентифицировали, осуществляя эксперименты по циклизации, описанные в примере 5, с использованием пептидов млекопитающих. Предварительно человеческую QC и QC из папайи выделяли согласно процессу, описанному в примере 1. Применяемые методы описаны в примере 2, а применяемый пептидный синтез изложен в примере 6. Результаты исследования представлены в табл. 1. Таблица 1 Новые физиологические субстраты глутаминилциклазы(, количественное определение проведено с помощью MALDI-TOF-экспериментов)- 13009291 Все анализы осуществляли в оптимальном диапазоне активности и стабильности либо человеческой, либо растительной QC, что продемонстрировано в примере 4. Аминокислотные последовательности физиологически активных пептидов, несущих N-концевой остаток глутамина и, следовательно, являющихся субстратами для фермента QC, представлены в табл. 2. Таблица 2 Аминокислотные последовательности физиологически активных пептидов с N-концевыми остатками глутамина Согласно четвертому варианту осуществления изобретения были идентифицированы в качестве новых физиологических субстратов QC пептиды [Gln1]гастрин (длиной 17 и 34 аминокислоты), [Gln1]нейротензин и [Gln1]FPP. Гастрин, нейротензин и FPP несут остаток pGlu в N-концевом положении. Установлено, что у всех пептидов этот N-концевой остаток pGlu образован из N-концевого глутамина с помощью QC-катализа. В результате эти пептиды активизируются с точки зрения их биологической функции при превращении N-концевого остатка глутамина в pGlu. Клетки, обладающие способностью к трансдукции через эпителий, прежде всего несущие гастрин(G) клетки, осуществляют координацию секреции желудочной кислоты и поступающей в желудок пищи. В современных исследованиях установлено, что из предшественника гастрина образуются продукты с множеством видов активности и что существует целый ряд важных моментов в биосинтезе гастрина. Участвующие в биосинтезе предшественники и промежуточные продукты (прогастрин и Gly-гастрины),возможно, представляют собой факторы роста; их продукты, амидированные гастрины, регулируют пролиферацию эпителиальных клеток, дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ECL-клеток) и экспрессию генов,связанных с синтезом и хранением гистамина в ECL-клетках, а также острую стимуляцию секреции кислоты. Гастрин стимулирует также производство представителей семейства эпидермального фактора роста (EGF), которые, в свою очередь, ингибируют функцию париетальных клеток, но стимулируют рост поверхностных эпителиальных клеток. Концентрации гастрина в плазме у пациентов, зараженныхHelicobacter pylori, у которых, как известно, существует повышенный риск возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, повышены (Dockray G.J., J. Physiol. 15, 1999, cc 315-324). Известно, что пептидный гормон гастрин, который выделяется из антральных G-клеток, стимули- 16009291 рует синтез и высвобождение гистамина из ECL-клеток в кислородпродуцирующую слизистую черезCCK-2-рецепторы. Мобилизованный гистамин индуцирует секрецию кислоты в результате связывания с Н(2)-рецепторами, локализованными на париетальных клетках. В современных исследованиях сделано предположение о том, что гастрин, как в виде полностью амидированной, так и в виде менее процессированных форм (прогастрин и удлиненный глицином гастрин), также является фактором роста в желудочно-кишечном тракте. Было установлено, что основное трофическое действие амидированного гастрина связано с кислородпродуцирующей слизистой желудка, где он вызывает повышенную пролиферацию стволовых клеток желудка и ECL-клеток, что приводит к увеличению массы париетальных и ECL-клеток. С другой стороны, основной мишенью трофического действия менее процессированного гастрина(например, удлиненного глицином гастрина), вероятно, является слизистая ободочной кишки (Koh T.J. иChen, D., Regul. Pept. 93, 2000, cc. 37-44). Согласно пятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов QC для стимуляции пролиферации клеток желудочно-кишечного тракта, прежде всего пролиферации слизистых клеток желудка, пролиферации эпителиальных клеток, дифференцировки продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток (ECL) и экспрессии генов, связанных с синтезом и хранением гистамина вECL-клетках, а также для стимуляции острой секреции кислоты у млекопитающих путем поддерживания или повышения концентрации активного [pGlu1]гастрина. Согласно шестому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов QC для лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и рака желудка, связанного или не связанного с Heliobacter pylori, у млекопитающих путем снижения скорости превращения неактивного [Gln1]гастрина в активный [pGlu1]гастрин. Нейротензин (НТ) представляет собой нейропептид, участвующий в патофизиологии шизофрении,который специфически модулирует системы нейротрасмиттеров (нейромедиаторов), регуляция которых,как продемонстрировано ранее, нарушается при этом заболевании. Клинические исследования, при которых определяли концентрации НТ в спинно-мозговой жидкости (СМЖ), позволили выявить группу страдающих шизофренией пациентов с пониженными концентрациями НТ в ЦСЖ, которые восстанавливались при эффективном лечении с помощью антипсихотических лекарственных средств. Известны также данные, которые являются важным подтверждением роли НТ-систем в механизме действия антипсихотических лекарственных средств. Поведенческие и биохимические реакции при введении НТ в центральную нервную систему очень сходны с реакциями на системное введение антипсихотических лекарственных средств, и антипсихотические лекарственные средства повышают нейротрансмиссию НТ. Совокупность этих данных привела к гипотезе о том, что НТ функционирует в качестве эндогенного антипсихотического агента. Кроме того, обычные и атипичные антипсихотические лекарственные средства по-разному изменяют нейротрансмиссию НТ в области черного тела и в мезолимбических допаминсодержащих конечных областях, и эти эффекты обусловливают способность вызывать побочные действия и эффективность, соответственно (Binder Е.В. и др., Biol. Psychiatry, 50, 2001, cc. 856-872). Согласно седьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение повышающих активность эффекторов QC для приготовления антипсихотических лекарственных средств и/или для лечения шизофрении у млекопитающих. Эффекторы QC либо поддерживают, либо повышают концентрацию активного [pGlu1]нейротензина. Стимулирующий оплодотворение пептид (FPP), трипептид, родственный тиреотропин-рилизингфактору (TRH), обнаружен в семенной плазме. Современные исследования in vitro и in vivo позволили установить, что FPP играет важную роль в регуляции фертильности спермы. В частности, FPP, прежде всего, стимулирует включение не способных к оплодотворению (неактивных) сперматозоидов и существенно быстрее делает их фертильными, а затем поддерживают эту способность посредством того, что сперматозоиды не подвергаются спонтанной потере акросомы и вследствие этого не теряют способность к оплодотворению. Аденозин, который, как известно, регулирует путь трансдукции сигнала аденилилциклазы (АС)/цАМФ, приводит к аналогичным реакциям и фактически усиливает их. Установлено, что иFPP, и аденозин стимулируют производство цАМФ в неактивных клетках, но ингибируют его в активных клетках, причем FPP-рецепторы каким-то образом взаимодействуют с аденозиновыми рецепторами и G-протеинами для осуществления регуляции АС. Эти события влияют на состояние фосфорилирования тирозина различных белков, некоторые из которых важны для начального включения, другие, вероятно, участвуют в самой реакции акросомы. Кальцитонин и ангиотензин II, также обнаруженные в семенной плазме, оказывают аналогичные действия in vitro на неактивные сперматозоиды и могут усиливать реакции на FPP. Эти молекулы оказывают аналогичные действия in vivo, оказывая влияние на фертильность путем стимуляции и затем поддержания способности к оплодотворению. Любое уменьшение доступности FPP, аденозина, кальцитонина и ангиотензина II или дефекты в их рецепторах участвуют в развитии мужского бесплодия (Fraser L.R. и Adeoya-Osiguwa S.А., Vitam. Horm. 63, 2001, сс. 1-28). Согласно восьмому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение понижающих активность эффекторов QC для приготовления препятствующих оплодотворению лекарственных средств и/или для снижения фертильности у млекопитающих. Понижающие активность эффек- 17009291 торы QC снижают концентрацию активного [pGlu1]FPP, что приводит к предупреждению способности к оплодотворению спермы и к дезактивации сперматозоидов. В противоположность этому, установлено,что повышающие активность эффекторы QC могут стимулировать фертильность особей мужского пола и их можно применять для лечения бесплодия. Согласно девятому варианту осуществления настоящего изобретения были идентифицированы дополнительные физиологические субстраты QC. Они представляют собой [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7,[Gln1]CCL8, [Gln1]CCL16, [Gln1]CCL18 и [Gln1]фракталкин (более подробные характеристики приведены в табл. 2). Эти полипептиды играют важную роль в таких физиологических состояниях, как подавление пролиферации миелоидных клеток-предшественников, неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, псориаза, ревматоидного артрита, атеросклероза, гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий. В настоящее время в клинических опытах изучено несколько цитотоксических вакцин на основе пептидов Т-лимфоцитов против гепатита В, вируса иммунодефицита человека и меланомы. Одной из перспективных вакцин против миеломы, которую применяют индивидуально или в сочетании с другими опухолевыми антигенами, является декапептид ELA. Этот пептид является аналогом иммунодоминантного пептида антигена Melan-A/MART-1 с N-концевой глутаминовой кислотой. Известно, что аминогруппа и гамма-карбоксильная группа глутаминовых кислот, а также аминогруппа и гамма-карбоксамидная группа глутаминов легко конденсируются с образованием пироглутаминовых производных. Для решения указанных проблем, связанных со стабильностью, было разработано несколько пептидов, представляющих интерес с фармацевтической точки зрения, которые содержали пироглутаминовую кислоту вместо N-концевого глутамина или глутаминовой кислоты без потери фармакологических свойств. Однако по сравнению с ELA у производного пироглутаминовой кислоты (PyrELA), а также N-концевого кэппированного ацетилом производного (AcELA) не удалось сохранить цитотоксическую активность,присущую Т-лимфоцитами (CTL). Несмотря на то, что в PyrELA и AcELA были внесены кажущиеся очень небольшими модификации, эти два производных, вероятно, обладают более низкой аффинностью по сравнению с ELA к специфическому классу I главного комплекса гистосовместимости. Следовательно, для того, чтобы полностью сохранить активность ELA, следует избегать образования PyrELA (Beck А. и др., J. Pept. Res. 57(6), 2001, cc. 528-38.). В последние годы установлено, что при меланомах происходит также сверхэкспрессия глутаминилциклазы (QC) (Ross D.T. и др., Nat. Genet. 24, 2000, cc. 227-235). Согласно десятому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов QC для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патофизиологических состояний, например для подавления пролиферации миелоидных клеток-предшественников,неоплазии, воспалительных реакций хозяина, рака, злокачественного метастаза, меланомы, псориаза,ревматоидного артрита, атеросклероза, нарушенных гуморальных и клеточно-опосредуемых иммунных ответов, процессов адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий. Согласно одиннадцатому варианту осуществления настоящего изобретения был идентифицирован[Gln1]орексин в качестве физиологического субстрата QC. Орексин А представляет собой нейропептид,который играет важную роль в регуляции всасывания пищи и нарушения сна, вероятно, в результате координации комплекса поведенческих и физиологических реакций этих комплементарных связанных с гомеостазом функций. Он играет также существенную роль в связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, функции вегетативной нервной системы, гормональном балансе и регуляции общей воды организма. Согласно двенадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов QC для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушенного всасывания пищи и сна, нарушенной связанной с гомеостазом регуляции энергетического метаболизма, нарушенной функции вегетативной нервной системы, нарушенного гормонального баланса и нарушенной регуляции общей воды организма. Экспансия полиглутамина в некоторые белки приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Кеннеди. Их механизм пока остается неясным. Биохимические свойства полиглутаминовых повторов предполагает наличие одного из возможных объяснений: эндолитическое расщепление связи глутаминил-глутаминил с последующим образованием пироглутамата может принимать участие в патогенезе в результате повышения катаболитической стабильности, гидрофобности, амилоидогенеза и нейротоксичности полиглутаминильных белков (Saido T., Med. Hypotheses, 54(3), март 2000, cc. 427-429). Таким образом, согласно тринадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложено применение эффекторов QC для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Паркинсона и болезни Гентингтона. Согласно четырнадцатому варианту осуществления настоящего изобретения предложен общий путь снижения или ингибирования ферментативной активности QC. Предложены также репрезентативные ингибиторы. Первоначально в качестве ингибиторов QC млекопитающих был описан только 1,10-фенантролин и восстановленный 6-метилптерин (Busby W.H.J. и др., J. Biol. Chem. 262, 1987, cc. 8532-8536). ЭДТК не ингибирует QC, из чего было сделано заключение, что QC не представляет собой металлзависимый фермент (Busby W.H.J. и др., J. Biol. Chem. 262, 1987, cc. 8532-8536, Bateman R.C.J. и др., Biochemistry 40, 2001,cc. 11246-11250, Booth R.E. и др., ВМС Biology 2, 2004). Однако при создании настоящего изобретения- 18009291 установлено, что человеческая QC и другие QC животного происхождения являются металлзависимыми ферментами, что доказано по характеристикам ингибирования QC 1,10-фенантролином, дипиколиновой кислотой, 8-гидроксихинолином и другими хелаторами (фиг. 18, 19) и по реактивации QC ионами переходных металлов (фиг. 20). И, наконец, зависимость от металлов вытекает при сравнении с последовательностями других зависимых от металлов ферментов, что свидетельствует о превращении хелатирующих аминокислотных остатков также и в человеческой QC (фиг. 21). Взаимодействие соединений с ионом металла, связанным с активным сайтом, представляет собой общий путь ингибирования QC-активности. При создании настоящего изобретения установлено, что имидазольные производные являются эффективными ингибиторами QC. С помощью непрерывного анализа (подробно описанного в примере 2) проанализирован целый ряд имидазольных производных в плане их способности ингибировать человеческую QC в качестве представителя высококонсервантивных QC млекопитающих. Таким образом, в настоящем изобретении предложены имидазольные производные, а также гистидин и его производные в качестве понижающих активность эффекторов QC и описаны их характеристики с точки зрения типа ингибирования и эффективности. Структуры и значения Ki представлены в табл. 3 и 4. Результаты подробно описаны в примере 7. Таблица 3 Константы ингибирования имидазольных производных в катализируемой человеческой QC реакции Таблица 4 Ингибирование QC L-гистамином и его двумя биологическими метаболитами- 20009291 При создании изобретения в процессе изучения ферментативной активности неожиданно было установлено, что помимо N-концевого глутаминильного остатка, N-концевые -гомоглутаминильные остатки удовлетворяют характеристикам в качестве субстратов QC из растений и млекопитающих. N-концевой -гомоглутаминильный остаток превращался в 5-членное лактамовое кольцо посредством реакции, катализируемой человеческой QC и QC из папайи, соответственно. Результаты описаны в примере 5. Применяемый метод проиллюстрирован в примере 2, а пептидный синтез осуществляли согласно методу, описанному в примере 6. Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам скрининга эффекторов QC. Предпочтительный способ скрининга для идентификации модифицирующих активность эффекторов QC из группы соединений, предусматривает стадии, которые заключаются в том, что: а) приводят в контакт соединения с QC в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание; б) добавляют субстрат QC; в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную QC-активность; и г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активности QC для идентификации модифицирующего активность эффектора. Другой предпочтительный способ скрининга аналогичен методу идентификации и отбора эффекторов, которые взаимодействуют непосредственно или опосредованно с ионом металла, связанным с активным сайтом QC, и он предусматривает стадии, которые заключаются в том, что: а) приводят в контакт соединения с QC в условиях, которые позволяют осуществлять их связывание; б) добавляют субстрат QC, который подвергается превращению с помощью QC; в) оценивают превращение субстрата или необязательно определяют остаточную QC-активность; и г) количественно оценивают изменения в превращении субстрата и/или ферментативной активностиQC, где изменения можно использовать для идентификации модифицирующего активность эффектора. Предпочтительными для применения в вышеуказанных методах скрининга являются QC млекопитающих или QC из папайи. Особенно предпочтительной является QC млекопитающих, так как эффекторы, идентифицированные с помощью указанных способов скрининга, можно использовать для лечения болезней млекопитающих, прежде всего человека. Эти агенты, отобранные с помощью описанных выше способов скрининга, могут осуществлять снижение превращения по меньшей мере одного из субстратов QC (негативные эффекторы, ингибиторы) или путем увеличения превращения по меньшей мере одного субстрата QC (позитивные эффекторы, активаторы). Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть превращены в кислотно-аддитивные соли, прежде всего фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли. Соли соединений, предлагаемых в изобретении, могут находиться в форме неорганических или органических солей. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно превращать и применять в форме кислотно-аддитивных солей, прежде всего в форме фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Фармацевтически приемлемая соль, как правило, находится в форме, в которой основная боковая цепь протонирована неорганической или органической кислотой. Репрезентативными органическими или неорганическими кислотами являются соляная, бромисто-водородная, перхлорная, серная, азотная,фосфорная, уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная,винная, лимонная, бензойная, миндальная, метансульфоновая, гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, щавелевая, памоновая, 2-нафталинсульфоновая, паратолуолсульфоновая, циклогексансульфамовая, салициловая, сахариновая или трифторуксусная кислота. Подразумевается, что все формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, в виде кислотно-аддитивных солей подпадают под объем настоящего изобретения. Учитывая близкое сходство соединений в свободной форме и соединений в форме соли, следует иметь в виду, что когда в настоящем описании упоминается соединение, то при этом подразумевается соответствующая его соль, при условии, что существует возможность ее получения и применения в определенных условиях. Если соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют по меньшей мере один хиральный центр, то они могут существовать в виде энантиомеров. Если соединения имеют два или более хиральных центра, то они могут, кроме того, существовать в виде диастереоизомеров. Следует иметь в виду, что все такие изомеры и их смеси подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений могут существовать в полиморфной форме, и такие соединения подпадают под объем настоящего изобретения. Кроме того, некоторые соединения могут образовывать сольваты с водой (т.е. гидраты) или с обычными органическими растворителями, и подразумевается, что такие сольваты также подпадают под объем настоящего изобретения. Соединения, включая их соли, можно получать также в форме гидратов или в форме, содержащей другие растворители, применяемые для их кристаллизации.- 21009291 Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента QC у индивидуума, нуждающегося в этом, который заключается в том, что вводят любое из соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, или содержащих их фармацевтических композиций в количестве и согласно схеме приема лекарственного средства, терапевтически эффективных для лечения состояния. Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение соединений, предлагаемых настоящем изобретении, и их соответствующих фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения состояния у индивидуума, опосредуемого модуляцией активности фермента QC. Соединение можно вводить пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая (но не ограничиваясь ими) внутривенное, оральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, парентеральное введение и их комбинации. Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются фармацевтические композиции, представляющие собой лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение, предлагаемое в изобретение, или его соль необязательно в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или растворителями. Фармацевтические композиции могут находиться, например, в форме препаратов для парентерального или энтерального введения и содержать соответствующие носители или могут находиться в форме препаратов для орального введения, которые могут содержать соответствующие носители, пригодные для орального введения. Предпочтительно они находятся в форме препаратов для орального введения. Эффекторы QC-активности, вводимые согласно изобретению, можно применять в составе фармацевтических препаратов или комплексов препаратов в качестве ингибиторов или в сочетании с ингибиторами, субстратами, псевдосубстратами, ингибиторами экспрессии QC, связывающимися белками или антителами к таким белковым ферментам, которые снижают концентрацию белка QC в организме млекопитающих. Соединения, предлагаемые в изобретении, позволяют осуществлять регулирование лечения применительно к конкретным пациентам и заболеваниям, в частности при их использовании можно избегать индивидуальной непереносимости, аллергии и побочных действий. Соединения обладают также различной зависимостью активности от времени. Таким образом, у врача, осуществляющего лечение, имеется возможность различного подхода к индивидуальному состоянию пациента: он может точно регулировать, с одной стороны, быстроту начала действия и, с другой стороны, продолжительность действия и, прежде всего, интенсивность действия. Предпочтительный способ, предлагаемый в изобретении, представляет собой новый подход к лечению или предупреждению состояния, опосредуемого модуляцией активности фермента QC у млекопитающих. Его преимущество заключается в том, что он является простым, пригодным для коммерческого применения и удобным для применения, прежде всего, при лечении заболеваний, которые обусловлены нарушением баланса концентрации физиологически активных субстратов QC, например перечисленных в табл. 1 и 2, прежде всего, для лечения млекопитающих, прежде всего, для лечения человека. Соединения предпочтительно можно вводить, например, в форме фармацевтических композиций,которые содержат действующее вещество в сочетании с общепринятыми добавками, такими как разбавители, эксципиенты и/или носители, известне в данной области техники. Их можно вводить, например,парентерально (например, i.v. в физиологическом растворе) или энтерально (например, орально в виде композиции со стандартными носителями). В зависимости от их эндогенной стабильности и биологической доступности можно вводить одну или несколько доз соединений в день для достижения требуемой нормализации уровней глюкозы в крови. Такие дозы для человека могут составлять, например, от примерно 0,01 до 250,0 мг в день, предпочтительно от примерно 0,01 до 100 мг соединения на кг веса тела. Путем введения млекопитающим эффекторов QC-активности можно предупреждать, или облегчать,или лечить такие состояния, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, язвенная болезнь и рак желудка,связанный или не связанный с заражением Heliobacter pylori, патогенные психические состояния, шизофрения, бесплодие, неоплазия, воспалительные реакции хозяина, рак, псориаз, ревматоидный артрит,атеросклероз, нарушенные гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы, нарушенные процессы адгезии и миграции лейкоцитов в эндотелий, нарушенное всасывание пищи, нарушение сна, нарушенная связанная с гомеостазом регуляция энергетического метаболизма, нарушенная функция вегетативной нервной системы, нарушенный гормональный баланс и нарушенная регуляция общей воды организма. Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов QC-активности можно стимулировать пролиферацию клеток желудочно-кишечного тракта, предпочтительно пролиферацию слизистых клеток желудка, эпителиальных клеток, острую секрецию кислоты и дифференцировку продуцирующих кислоту париетальных клеток и секретирующих гистамин энтерохромаффиноцитподобных клеток. Кроме того, введение млекопитающему эффекторов QC-активности может приводить к потере функции сперматозоидов, подавляя тем самым мужскую фертильность. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ регуляции и контроля мужской фертильности и применение понижающих QC-активность эффекторов для приготовления контрацептивных лекарственных средств для особей- 22009291 мужского пола. Кроме того, путем введения млекопитающему эффекторов QC-активности можно подавлять пролиферацию миелоидных клеток-предшественников. Соединения, применяемые согласно изобретению, можно включать хорошо известным методом в состав стандартных композиций, таких, например, как таблетки, капсулы, драже, пилюли, суппозитории,гранулы, аэрозоли, сиропы, жидкие, твердые и кремообразные эмульсии и суспензии и растворы, с использованием инертных нетоксичных фармацевтически приемлемых носителей и добавок или растворителей. В каждой из таких композиций обладающие терапевтической эффективностью соединения предпочтительно присутствуют в концентрации примерно от 0,1 до 80 мас.%, более предпочтительно от 1 до 50 мас.% в пересчете на общую массу смеси, т.е. в количествах, достаточных для обеспечения требуемого диапазона доз. Субстанции можно применять в качестве лекарственных средств в форме драже, капсул, жевательных капсул, таблеток, капель, сиропов или также в виде суппозиториев или в виде назальных спреев. Композиции можно предпочтительно приготавливать, например, путем разбавления действующего вещества растворителями и/или носителями необязательно с применением эмульгаторов и/или диспергаторов, например, в том случае, когда в качестве разбавителя используют воду, необязательно можно применять в качестве вспомогательных растворителей органические растворители. Примерами эксципиентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются вода, нетоксичные органические растворители, такие как парафины (например, фракции нефтепродуктов), растительные масла (например, рапсовое масло, арахисовое масло, кунжутное масло), спирты (например, этиловый спирт, глицерин), гликоли (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль); твердые носители, такие, например, как природные измельченные в порошок минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты), сахара (например, сахар-сырец, лактоза и декстроза); эмульгаторы, такие как неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты,простые эфиры полиоксиэтилена и жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты), диспергаторы(например, лигнин, сульфитный щелок, метилцеллюлоза, крахмал и поливинилпирролидон) и замасливатели (например, стеарат магния, тальк, стеариновая кислота и лаурилсульфат натрия) и необязательно корригенты. Введение можно осуществлять стандартным методом, предпочтительно энтерально или парентерально, прежде всего, орально. При энтеральном введении таблетки могут содержать в дополнение к указанным носителям дополнительные добавки, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, наряду с различными добавками, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал,желатин и т.п. Кроме того, дополнительно в процессе таблетирования можно применять замасливатели,такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. В случае водных суспензий и/или эликсиров,предназначенных для орального введения, можно добавлять к действующим веществам помимо вышеуказанных эксципиентов различные корригенты или красители. В случае парентерального введения можно применять растворы действующих веществ с использованием пригодных жидких носителей. Было установлено, что, как правило, в случае внутривенного введения предпочтительно вводить количества, составляющие примерно от 0,01 до 2,0 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1,0 мг/кг веса тела в день, и в случае энтерального введения доза составляет примерно от 0,01 до 2 мг/кг, предпочтительно примерно от 0,01 до 1 мг/кг веса тела в день. Тем не менее, в некоторых случаях необходимо отступать от указанных количеств в зависимости от веса тела экспериментального животного или пациента или от пути введения, а также в зависимости от вида животного и его индивидуальной реакции на лекарственное средство или от интервала, с которым осуществляют введение. Следовательно, в определенных случаях может оказаться достаточным применять дозы, меньшие, чем указанные выше минимальные количества, в то время как в других случаях указанный верхний предел может быть превышен. В случаях, когда требуется вводить относительно большие количества, может оказаться целесообразным разделять эти количества на несколько однократных доз, вводимых в один день. Для применения для лечения человека можно использовать тот же самый диапазон доз. Вышеуказанные комментарии применимы также и в этом случае. Примеры фармацевтических композиций 1. Капсулы, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении, на капсулу. Для получения примерно 10000 капсул приготавливают раствор, имеющий следующий состав. Соединение, предлагаемое в изобретении 1,0 кг Глицерин 0,5 кг Полиэтиленгликоль 3,0 кг Вода 0,5 кг 5,0 кг Раствор вносят в мягкие желатиновые капсулы хорошо известным методом. Капсулы можно применять путем разжевывания или проглатывания. 2. Таблетки или таблетки с покрытием или драже, содержащие по 100 мг соединения, предлагаемого в изобретении.- 23009291 Для приготовления 100000 таблеток используют следующее количество ингредиентов. Соединение, предлагаемое в изобретении, тонкоизмельченное 10,00 кг Глюкоза 4,35 кг Лактоза 4,35 кг Крахмал 4,50 кг Целлюлоза, тонкоизмельченная 4,50 кг Указанные выше компоненты смешивают и затем добавляют раствор, содержащий Поливинилпирролидон 2,0 кг Полисорбат 0,1 кг Вода Примерно 5,0 кг и гранулируют хорошо известным методом путем пропускания влажной массы через решетчатую мельницу, после чего добавляют 0,2 кг стеарата магния и сушат. Конечную смесь для таблеток массой 30,0 кг подвергают обработке с получением выпуклых таблеток массой 300 мг. В идеальном случае, на таблетки можно наносить покрытие или сахарное покрытие хорошо известным методом. Целесообразно, чтобы фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержали комбинацию по меньшей мере одного эффектора QC-активности и по меньшей мере одного ингибитора DP IV. Такие фармацевтические композиции можно применять для лечения болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. Пример 1. Получение человеческой QC и QC из папайи. Штаммы-хозяева и среды. Штамм Pichia pastoris Х 33 (АОХ 1, АОХ 2), который применяли для экспрессии человеческой QC,выращивали, трансформировали и анализировали согласно инструкциям производителя (фирма Invitrogen). Среды, необходимые для P. pastoris, т.е. забуференную глицерином (BMGY) сложную среду или метанольную (BMMY) сложную среду и базальную (минимальную) соляную среду для ферментации, готовили согласно рекомендациям производителя. Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих человеческую QC. Все процедуры клонирования осуществляли с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии в дрожжах использовали вектор pPICZB (фирма Invitrogen). Вектор pQE-31(фирма Qiagen) применяли для экспрессии человеческой QC в Е. coli. кДНК зрелой QC, начинающуюся с кодона 38, сливали в рамке считывания с плазмидой, кодирующей метку 6xHis. После амплификации с использованием праймеров pQCyc-1 и pQCyc-2 (табл. 1) и субклонирования фрагмент встраивали в экспрессионный вектор, используя сайты рестрикции SphI и HindIII. Трансформация P. pastoris и экспрессия в небольших объемах (маломасштабная экспрессия). Плазмидную ДНК амплифицировали в штамме Е. coli JM109 и очищали согласно рекомендациям производителя (фирма Qiagen). В применяемой для экспрессии плазмиде pPICZB существуют 3 сайта рестрикции, пригодных для линеаризации. Поскольку SacI и BstXI осуществляют расщепление внутри кДНК QC, для линеаризации был выбран сайт PmeI. 20-30 мкг плазмидной ДНК линеаризовали с помощью PmeI, осаждали этанолом и растворяли в стерильной деионизированной воде. Затем 10 мкг ДНК использовали для трансформации компетентных клеток P. pastoris путем электропорации согласно инструкциям производителя (фирма BioRad). Отбор осуществляли на планшетах, содержащих 150 мкг/мл зеоцина. Одна трансформация с использованием линеаризованной плазмиды позволяла получать несколько сотен трансформантов. Для тестирования рекомбинантных клонов дрожжей в отношении экспрессии QC рекомбинанты выращивали в течение 24 ч в 10-мл конических пробирках, содержащих 2 мл среды BMGY. Затем дрожжи центрифугировали и ресуспендировали в 2 мл среды BMMY, содержащей 0,5% метанола. Эту концентрацию поддерживали, добавляя метанол каждые 24 ч в течение вплоть до 72 ч. Затем определялиQC-активность в супернатанте. Присутствие слитого белка подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга,используя антитело к 6xHis-метке (фирма Qiagen). Клоны, проявляющие наиболее высокую QCактивность, отбирали для дополнительных экспериментов и ферментации. Крупномасштабная экспрессия в ферментере. Экспрессию QC осуществляли в 5-л реакторе (модель Biostat В, фирма В. Braun biotech.), практически в соответствии с руководством Pichia fermentation process guidelines (фирма Invitrogen). В целом,метод состоял в следующем: клетки выращивали в базальной солевой среде для ферментации, дополненной следовыми количествами солей и глицерином в качестве единственного источника углерода (рН 5,5). В процессе фазы начальной загрузки продолжительностью примерно 24 ч и последующей фазы с периодической подпиткой продолжительностью примерно 5 ч проходило накопление клеточной массы. После достижения массы клеток во влажном состоянии 200 г/л осуществляли индукцию экспрессии QC,применяя трехстадийную метанольную подпитку, так, чтобы полное время ферментации составляло примерно 60 ч. Затем клетки удаляли из содержащего QC супернатанта путем центрифугирования при 6000xg, 4C в течение 15 мин. Значение рН доводили до 6,8, добавляя NaOH и образовавшийся мутный раствор центрифугировали при 37000x g, 4C в течение 40 мин. Если раствор оставался мутным, приме- 24009291 няли дополнительную стадию фильтрации через целлюлозную мембрану (размер пор 0,45 мкм). Очистка меченной с помощью 6 остатков гистидина (6xHis) QC, экспрессированной в P. pastoris. Меченную с помощью His QC сначала очищали с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (ИМАХ). Для осуществления общепринятой очистки 1000 мл супернатанта культуры вносили на содержащую Ni2+ хелатирующую сефарозную FF колонку (1,6 х 20 см, фирма Pharmacia),которую уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером, рН 6,8, содержащим 750 мМ NaCl, со скоростью потока 5 мл/мин. После промывки колонки уравновешивающим буфером, взятым в объеме, равном 10 объемам колонки, и уравновешивающим буфером, содержащим 5 мМ гистидин, взятым в объеме, равном 5 объемам колонки, связанный белок элюировали путем замены на 50 мМ фосфатный буфер, рН 6,8, содержащий 150 мМ NaCl и 100 мМ гистидин. Полученный элюат подвергали диализу в противотоке 20 мМ бистрис/HCl-буфера, рН 6,8, при 4 С в течение ночи. Затем QC дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии на колонке типа Mono Q6 (фирма BioRad), уравновешенной буфером для диализа. Содержащую QC фракцию вносили на колонку при скорости потока 4 мл/мин. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером, содержащим 100 мМ NaCl. Элюцию осуществляли с использованием двух градиентов с использованием уравновешивающего буфера, содержащего 240 и 360 мМ NaCl,взятого в объеме, равном 30 или 5 объемом колонки, соответственно. Собирали фракции объемом 6 мл и чистоту анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Фракции, содержащие гомогенную QC, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации. Для длительного хранения (-20 С) добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Проводили количественную оценку белка методами Бредфорда или Гилла и Гиппеля (Bradford М.М., Anal. Biochem. 72, 1976, cc. 248-254; Gill S.C. и von Hippel P.H., Anal.Biochem. 182, 1989, cc. 319-326). Экспрессия и очистка QC в E. coli. Конструкцией, кодирующей QC, трансформировали клетки линии M15 (фирма Qiagen) и выращивали на планшетах в селективной агаровой LB-среде при 37 С. Для экспрессии белка при комнатной температуре использовали LB-среду, содержащую 1% глюкозы и 1% этанола. Когда значение оптической плотности (ОП 600) культуры достигало примерно 0,8, экспрессию индуцировали в течение ночи с помощью 0,1 мМ ИПТГ (изопропилтиогалактозид). После одного цикла замораживания и оттаивания клетки лизировали при 4 С, добавляли 2,5 мг/мл лизоцима в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 300 мМ NaCl и 2 мМ гистидин, в течение примерно 30 мин. Раствор осветляли путем центрифугирования при 37000xg, 4C в течение 30 мин с последующей фильтрацией с использованием стеклянной фритты (отделение ДНК) и двух дополнительных стадий фильтрации с использованием целлюлозных фильтров для неочищенных и тонких осадков. Супернатант (примерно 500 мл) вносили на Ni2+-колонку для аффинной хроматографии (1,6x20 см) со скоростью потока 1 мл/мин. Элюцию QC осуществляли с помощью 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 150 мМ NaCl и 100 мМ гистидин. Содержащую QC фракцию концентрировали ультрафильтрацией. Очистка QC из латекса папайи.QC из латекса папайи получали, используя систему BioCAD 700E (фирма Perseptive Biosystems,Висбаден, Германия) с использованием модифицированной версии ранее описанного метода (Zerhouni S. и др., Biochim. Biophys. Acta. 138, 1989, cc. 275-290). 50 г латекса растворяли в воде и центрифугировали согласно описанному методу. Для инактивации протеаз применяли S-метилметантиосульфонат и полученный неочищенный экстракт подвергали диализу. После диализа весь супернатант вносили на колонку(21x2,5 см внутренний диаметр (i.d. из SP-сефарозы, которую можно применять при высокой скорости потока (Fast Flow, FF), уравновешенную 100 мМ натрийацетатным буфером, рН 5,0 (скорость потока 3 мл/мин). Элюцию осуществляли в три стадии, повышая концентрацию натрийацетатного буфера, при скорости потока 2 мл/мин. На первой стадии использовали линейный градиент от 0,1 до 0,5 М ацетатного буфера, взятого в объеме, равном 0,5 объема колонки. На второй стадии использовали линейное повышение концентрации от 0,5 до 0,68 М в 4 объемах колонки. Во время последней стадии элюции использовали 0,85 М буфер в 1 объеме колонки. Объединяли фракции (6 мл) с наиболее высокой ферментативной активностью. При ультрафильтрации осуществляли замену концентрации и буфера на 0,02 М трис/HCl,рН 8,0 (фирма Amicon; мембрана с пределом пропускания молекулярной массы 10 кДа). Добавляли сульфат аммония к концентрированному ферменту из папайи, полученному после стадии ионообменной хроматографии, до получения конечной концентрации 2 М. Этот раствор вносили наFast Flow-колонку (21x2,5 см i.d.), заполненную бутилсефарозой 4 (скорость потока 1,3 мл/мин), уравновешенную 2 М сульфатом аммония, 0,02 М трис/HCl, рН 8,0. Элюцию осуществляли в три стадии понижающимися концентрациями сульфата аммония. На первой стадии использовали линейный градиент от 2 до 0,6 М сульфата аммония, 0,02 М трис/HCl, рН 8,0 в объеме, равном 0,5 объема колонки, при скорости потока 1,3 мл/мин. На второй стадии использовали линейный градиент от 0,6 до 0 М сульфата аммония,0,02 М трис/HCl, рН 8,0 в объеме, равном 5 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Последнюю стадию элюции осуществляли, используя 0,02 М трис/HCl, рН 8,0, в объеме, равном 2 объемам колонки, при скорости потока 1,5 мл/мин. Все содержащие QC-активность фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. Полученную гомогенную QC хранили при -70 С. Конечные концентрации белка определяли методом Брэдфорда, осуществляя сравнение со стандартными кривыми, получен- 25009291 ными для бычьего сывороточного альбумина. Пример 2. Анализы глутаминилциклазной активности. Флуорометрические анализы. Все измерения осуществляли с использованием ридера для биологических анализов (BioAssayReader) типа HTS-7000Plus для микропланшетов (фирма Perkin Elmer) при 30 С. Активность QC оценивали флуорометрически с использованием в качестве субстрата H-Gln-NA. Образцы содержали 0,2 мМ флуорогенный субстрат, 0,25 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма Unizyme, Хорсгольм, Дания) в 0,2 М трис/HCl, рН 8,0, содержащем 20 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленнойQC в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 320/410 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность QC определяли из стандартной кривой для -нафтиламина в условиях анализа. За единицу принимали количество образовавшего в результате катализа QC 1 мкМ в мин pGlu-NA из H-Gln-NA в указанных условиях. Во втором флуорометрическом анализе активность QC определяли, используя в качестве субстратаH-Gln-AMC. Реакции осуществляли при 30 С с помощью ридера типа NOVOStar для микропланшетов(фирма BMG labtechnologies). Образцы содержали различные концентрации флуорогенного субстрат,0,1 ед. пироглутамиламинопептидазы (фирма Qiagen) в 0,05 М трис/HCl, рН 8,0, содержащем 5 мМ ЭДТК, и аликвоту соответствующим образом разбавленной QC в конечном объеме 250 мкл. Длины волны возбуждения/испускания составляли 380/460 нм. Предназначенные для анализа реакции инициировали, добавляя глутаминилциклазу. Активность QC определяли из стандартной кривой для 7-амино-4 метилкумарина в условиях анализа. Результаты кинетических анализов обрабатывали с помощью программы GraFit. Спектрофотометический анализ QC. Этот новый анализ применяли для оценки кинетических параметров большинства субстратов QC. Активность QC активность анализировали спектрофотометрически с помощью непрерывного анализа,разработанного посредством адаптации ранее описанного дискретного анализа (Bateman R.С.J., J. Neurosci.Methods 30, 1989, cc. 23-28), основанного на использовании глутаматдегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента. Образцы содержали соответствующий субстрат QC, 0,3 мМ НАДН, 14 мМ кетоглутаровую кислоту и 30 ед./мл глутаматдегидрогеназы в конечном объеме 250 мкл. Реакции инициировали, добавляя QC, и оценивали по снижению абсорбции при 340 нм в течение 8-15 мин. Типичные зависимости образования продукта от времени представлены на фиг. 1. Начальные скорости оценивали и ферментативную активность определяли из стандартных кривых для аммиака в условиях анализа. Все образцы оценивали при 30 С с использованием ридера для микропланшетов либо типа SPECTRAFluor Plus, либо типа Sunrise (оба фирмы TECAN). Данные кинетических анализов обрабатывали с помощью программы GraFit. Анализ ингибирования. При анализа ингибирования состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него добавляли предполагаемый ингибитор. Для быстрой оценки ингибирования QC использовали образцы, содержащие 4 мМ соответствующий ингибитор и субстрат в концентрации, соответствующей 1 KM. Для более детального исследования ингибирования и определения значений Ki оценивали влияние ингибитора на вспомогательные ферменты. В каждом случае не было выявлено никакого влияния на какие-либо другие применяемые ферменты, что позволяет достоверно оценивать ингибированиеQC. Константу ингибирования определяли путем аппроксимации набора характеризующих процесс кривых с помощью общего уравнения для конкурентного ингибирования с использованием программы GraFit. Пример 3. Масс-спектрометрия типа MALDI-TOF. Масс-спектрометрию на основе определения пролета с использованием опосредуемой матрицей лазерной десорбции/ионизация осуществляли с помощью системы Hewlett-Packard G2025 LD-TOF с линейным анализатором времени пролета. Прибор был снабжен лазером на азоте, работающим при 337 нм,потенциальным источником ускорения (5 кВ) и трубой для измерения пролета длиной 1,0 м. Детектор был установлен для работы в моде с положительно заряженными ионами, и сигналы регистрировали и осуществляли их фильтрацию с помощью цифрового запоминающего осциллоскопа типа LeCroy 9350M,соединенного с персональным компьютером. Образцы (5 мкл) смешивали с равными объемами раствора матрицы. В качестве матрицы применяли раствор ДГАФ/ВКАЦ, полученный путем растворения 30 мг 2,6'-дигидроксиацетофенона (фирма Aldrich) и 44 мг вторичного кислого цитрата аммония (фирма Fluka) в 1 мл смеси ацетонитрил/0,1% ТФК в воде (1:1, об./об.). Небольшой объем (1 мкл) матричной аналитической смеси вносили в верхний конец зонда и сразу же испаряли в вакуумной камере (оборудование для анализа образцов типа Hewlett-Packard G2024A) для гарантии быстрой и гомогенной кристаллизации образца. Для продолжительной оценки Glu1-циклизации выведенные из А пептиды инкубировали в 100 мкл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2 или 0,1 М бис-трис-буфера, рН 6,5 при 30 С. Пептиды вносили в концентрации 0,5 мМ [А 3-11 а] или 0,15 мМ [А 3-21 а] и 0,2 ед. QC вносили в течение всех 24 ч. В случае А 3-21 а образцы для анализа содержали 1% ДМСО. В различные моменты времени образцы удаляли из аналитической пробирки, пептиды экстрагировали с помощью ZipTips (фирма Millipore) согласно ре- 26009291 комендациям производителя, смешивали с раствором матрицы (1:1 об./об.) и после этого определяли масс-спектры. Отрицательный контроль либо не содержал QC совсем, либо содержал дезактивированный тепловой обработкой фермент. Для исследования ингибиторов состав образца соответствовал описанному выше, за исключением того, что в него вносили ингибитор (5 мМ бензимидазол или 2 мМ 1,10 фенантролин). Пример 4. Зависимость от рН. Зависимость от рН катализа человеческой QC и QC из папайи изучали в условиях скорости реакции первого порядка, что отражает воздействие концентрации протонов на константу специфичности kcat/KM. Для этой цели применяли парный ферментативный анализ, основанный на использовании пироглутамиламинопептидазы в качестве вспомогательного фермента и Gln-NA в качестве субстрата. Известно, что пироглутамиламинопептидаза является активной и стабильной при рН 5,5-8,5 (Tsuru D. и др., J. Biochem.(Токио), 84, 1978, cc. 467-476). Следовательно, анализ позволяет оценивать катализ с помощью QC в этом диапазоне значений рН. Полученные профили скоростей аппроксимировали с помощью классических колоколообразных кривых, как проиллюстрировано на фиг. 2. Человеческая QC характеризуется зависимостью от рН в очень узком диапазоне с оптимумом примерно при рН 7,8-8,0. Скорости имеют тенденцию к снижению при более щелочных значениях рН. В противоположность этому, профиль скоростей, полученных для QC из папайи, свидетельствует об отсутствии снижения активности вплоть до рН 8,5 (фиг. 2, вставка). Однако оптимальным для проявления специфичности обоих ферментов является рН 8. При создании изобретения неожиданно было установлено, что анализ кривых свидетельствует об идентичных значениях pKa в кислотном диапазоне значений рН 7,170,02 и 7,150,02 для человеческойQC и QC из папайи, соответственно. Очевидно, что снижение активности человеческой QC при основных значениях рН, по-видимому,является результатом диссоциации группы, что характеризуется значением pKa примерно 8,5. Для QC из папайи не были получены данные при основных значениях рН, которые могли бы позволить достоверно определить второе значение pKa. Это подтверждается подгонкой данных к модели однократной диссоциации, дающей практически идентичное значение pKa (pKa 7,130,03), про сравнению с подгонкой данных к модели двойной диссоциации. Это свидетельствует о том, что оба значения pKa являются весьма различными. Стабильность при различных значениях рН. Стабильность глутаминилциклаз оценивали, осуществляя инкубацию ферментов растительного и животного происхождения при 30 С в течение 30 мин при различных значениях рН в диапазоне от 4 до 10. После этого активность QC определяли в стандартных условиях. Результаты представлены на фиг. 3.QC из латекса папайи оказалась стабильной в изученном диапазоне значений рН без заметной тенденции к снижению стабильности в кислом или основном диапазоне. В противоположность этому, для человеческой QC сопоставимая стабильность обнаружена только при рН 7-8,5, что свидетельствует о выраженном снижении стабильности при значениях рН выше 8 и ниже 6. Таким образом, значения рН,близкие к 8, вероятно, являются оптимальными для активности и стабильности растительной и человеческой QC и приемлемыми значениями рН для сравнения субстратной специфичности различных QC. Пример 5. Определение субстратной специфичности QC. Спектрофотометрический анализ. Осуществляли непрерывный спектрофотометрический анализ, описанный в примере 2. Согласно этому анализу об активности QC свидетельствует снижение абсорбции при 340 нм, вызванное высвобождением аммиака и последующим поглощением НАДН/Н+ из-за образования глутамата из -кетоглютаровой кислоты. Как видно из фиг. 1, были получены линейные графики и была выявлена линейная зависимость между измеренной активностью и концентрацией QC. Кроме того, кинетические параметры,полученные для Н-Gln-Gln-OH с использованием непрерывного описанного выше анализа (табл. 1), хорошо согласовались с данными, полученными с использованием дискретного анализа (KM=17518 мкМ,kcat=21,30,6 с-1). Помимо этого, кинетические параметры для превращения субстратов H-Gln-Ala-OH, HGln-Glu-ОН, H-Gln-Gln-OH, H-Gln-OtBu и H-Gln-NH2 с помощью QC из папайи, представленные в табл. 1,хорошо коррелируют с данными, которые были получены с помощью прямого метода при рН 8,8 и 37 С(Gololobov M.Y. и др., Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 377, 1996, cc. 395-398). Таким образом, очевидно, что новый непрерывный анализ позволяет получать надежные результаты. Ди-, трипептиды и дипептидные заместители. При использовании описанного выше нового непрерывного анализа примерно 30 соединений были изучены в качестве потенциальных субстратов QC из С. papaya и человеческой QC. Результаты представлены в табл. 5. Путем сравнения специфичности установлено, что практически все короткие пептидные субстраты более эффективно превращаются под действием QC из папайи по сравнению с человеческим ферментом. Заслуживает внимания тот факт, что для обоих ферментов более эффективными являются субстраты с крупными гидрофобными остатками во втором положении, что обнаружено по специфичности в отношении H-Gln-Tyr-Ala-OH, H-Gln-Phe-Ala-NH2 и H-Gln-Trp-Ala-NH2 при сравнении с другими трипептидами или по реактивности хромотропных субстратов H-Gln-AMC, H-Gln-NA и H-Gln- 27009291Tyr-OH по сравнению с дипептидными субстратами. Для QC из папайи эти данные согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими о том, что специфичность коррелирует с размером второго аминокислотного остатка (Gololobov M.Y. и др., Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 377, 1996, cc. 395398). Единственное выраженное различие в специфичности QC растительного и животного происхождения обнаружено в случае H-Gln-OtBu. В то время, как этот сложный эфир превращается при использовании QC из папайи со специфичностью, характерной для дипептидных субстратов, его превращение при использовании человеческой QC происходит на порядок медленнее. Олигопептиды. Помимо нескольких дипептидов и трипептидов была изучена способность QC из папайи и человеческой QC превращать целый ряд олигопептидов (табл. 5). Заслуживает внимания тот факт, что общее различие в специфичности между человеческой и растительной QC для ряда тетрапептидов оказалось не столь заметным, как для дипептидных и трипептидных субстратов. Это свидетельствует о том, что аминокислоты в 3-м и 4-м положениях все еще оказывают влияние на кинетические характеристики, прежде всего, человеческой QC. Однако исключением являются пептиды, несущие остаток пролина в положении второй аминокислоты, для которых обнаружено заметное снижение значений kcat/KM в ряду тетрапептидов, имеющих строение H-Gln-Xaa-Tyr-Phe-NH2 (табл. 5). Снижение специфичности более выражено для человеческойQC, и это приводит примерно к 8-кратным различиям в значении kcat/KM по сравнению с QC из папайи. Небольшое снижение специфичности человеческой QC обнаружено также в случае превращения субстратов с положительно заряженным С-концевым аминокислотным остатком глутамина, что обнаружено по специфичности в отношении H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2, H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 и H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 по сравнению с другими тетрапептидами. Очевидно, что пониженная специфичность, прежде всего, является следствием меньшего индекса превращения. Этот эффект не выявлен для растительного фермента. Таблица 5 Кинетические параметры пептидных субстратов для человеческой QC и QC из папайи (н.р. - отсутствие реактивности; н.и. - отсутствие ингибирования; н.д. - не делали;- для ингибирования субстрата) Результаты, полученные с использованием тетрапептидов, позволяли сделать еще одно заключение. Как уже отмечалось, QC из папайи обладает высокой селективностью в отношении дипептидов. Однако для некоторых тетрапептидов при использовании человеческой QC были получены более высокие значения констант специфичности, что видно из графика, представленного на фиг. 4, для построения которого использовали некоторые данные из табл. 5, касающиеся ряда пептидов, которые содержат глутамат в положении второй аминокислоты. Кроме того, по мере того, как длина цепи возрастает от ди- к трипептидам, селективность человеческой QC повышается, в отличие от результатов, полученных с использованием QC из папайи. Кроме того, наиболее высокая специфичность человеческой QC обнаружена в отношении пептидов, несущих крупные гидрофобные остатки аминокислот в 3-м и 4-м положениях, что свидетельствует о гидрофобных взаимодействиях с ферментом. При сравнении кинетических параметров, характеризующих взаимодействие с соответствующими пептидами, изменения, вероятно, прежде всего, связаны с более низкими значениями KM, установлено, что индексы превращения пептидов являются близкими. Таким образом, более высокая селективность человеческой QC в отношении пептидов с более длинной цепью, вероятно, является результатом более прочного связывания более гидрофобных субстратов с ферментом. Обнаруженные различия между человеческой и растительной QC в отношении пептидов, содержащих гидрофобные аминокислоты в 3-м и 4-м положении, также становятся очевидными при сравнении констант специфичности ферментов в отношении H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 и H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 илиH-Gln-Gln-OH и H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH. Было установлено также, что человеческая QC обладает большей селективностью в отношении гомологичных субстратов, содержащих N-концевой Gln и увеличенное количество С-концевых остатковAla (табл. 6). В то время, как селективность человеческой QC повышается с увеличением длины субстрата, такая тенденция не обнаружена для QC из папайи. Поскольку человеческая QC обладает меньшей специфичностью в отношении пептидов, которые имеют в последовательности остаток Ser, можно предположить, что природа боковой цепи также является важной (табл. 6). Таблица 6 Влияние длины субстрата на активность человеческой QC и QC из папайи Воздействие ионной силы на катализ. Другой параметр, действие которого на субстратную специфичность изучено, представляет собой ионную силу. Для этой цели определяли кинетические параметры для циклизации нескольких субстратов- 29009291 в присутствии 0,5 М KCl и без соли (табл. 7). При создании изобретения неожиданно было установлено,что специфичность в отношении субстратов с незаряженным каркасом при добавлении соли не изменялась в значительно степени как в случае QC из латекса папайи, так и человеческой QC. Однако константы специфичности человеческой QC в отношении H-Gln-Ala-OH и H-Gln-Glu-OH снижались при добавлении KCl. Как видно из индивидуальных кинетических параметров, это было обусловлено увеличением значения KM и только небольшим снижением значения kcat. В случае QC из папайи не обнаружено воздействия ни на один из изученных параметров. Это явление, вероятно, не связано с самим отрицательно заряженным субстратом, так как для отрицательно заряженного пептида H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 не обнаружено изменение этих параметров. Представляющее интерес действие соли дополнительно было выявлено для положительно заряженных субстратов H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2 и H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2. Установлено, что положительное действие на катализ, как для растительной, так и для человеческой QC,прежде всего, обусловлено более низким значением KM и несколько повышенным индексом превращения. Таблица 7 Влияние ионной силы на катализ человеческой QC и QC из папайи Физиологические субстраты. В проведенных ранее исследованиях уже доказано превращение [Gln1]-TRH и [Gln1]-GnRH с помощью QC с использованием бычьей QC и QC из гипофиза свиней (Busby W.H.J. и др., J. Biol. Chem. 262,1987, cc. 8532-8536; Fischer W.H. и Spiess J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, cc. 3628-3632). Помимо этих уже изученных гормонов гипофиза были синтезированы три потенциальных физиологических субстрата человеческой QC и изучено их превращение, а именно [Gln1]гастрин, [Gln1]нейротензин и[Gln1]FPP. Кинетические параметры, характеризующие их превращение, представлены в табл. 1. Представляет интерес тот факт, что превращение глутаминильных пептидов в соответствующие пироглутамильные пептиды характеризуется увеличением значения констант специфичности в зависимости от размера, т.е. первым в этом ряду стоит наиболее крупный пептид прогастрин, состоящий из 17 аминокислот, за ним следуют пронейротензин, про-GnRH, про-TRH и про-FPP. Эти результаты соответствуют