Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)

007811 Настоящее изобретение относится к новым инсерционным сайтам, которые могут быть использованы для интеграции экзогенных ДНК-последовательностей в геном MVA. Предшествующий уровень техники Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) представляет собой член семейства ортопоксвирусов и был генерирован посредством проведения примерно 570 серийных пассажей штамма Анкара вируса коровьей оспы (CVA) на фибробластах куриного эмбриона (для обзора см. Mayr A. et al.(1975), Infection 3, 6-14). В результате таких пассажей полученный вирус MVA содержит геномную информацию, на 31 тысячу пар оснований, меньшую, чем CVA, и имеет в высокой степени ограниченный круг клеток-хозяев (Meyer H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991. MVA характеризуется своей исключительно высокой степенью аттенюации, а именно пониженной вирулентностью или инфекционностью, но при этом он обладает превосходной иммуногенностью. При тестировании на различных животных моделях было подтверждено, что вирус MVA является невирулентным даже у индивидов с низким иммунитетом. Еще более важно отметить, что превосходные свойства штамма MVA были продемонстрированы при проведении широкомасштабных клинических испытаний (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I.,Abt. Org. В 167, 375-390 (1987. В этих испытаниях, проводимых с участием свыше 120000 человек,включая пациентов с высоким риском инфицирования, не наблюдалось каких-либо побочных эффектов(Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974. Кроме того, было обнаружено, что MVA блокируется на поздней стадии цикла репликации вируса в клетках млекопитающих (Sutter G.Moss В. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). В соответствии с этим можно утверждать, что MVA полностью реплицирует свою ДНК, синтезирует ранние,промежуточные и поздние генные продукты, но он не способен к сборке зрелых инфекционных вирионов, которые могут высвобождаться из инфицированной клетки. По этой причине, а именно из-за ограниченной репликации, было высказано предположение, что MVA служит в качестве вектора для экспрессии генов. Совсем недавно MVA был использован для генерирования рекомбинантных вакцин, экспрессирующих антигенные последовательности, встроенные либо в сайт гена тимидинкиназы (tk) (патент США 5185146), либо в сайт природной делеции в геноме MVA (PCT/EP96/02926). Хотя инсерционный локус tk широко используется для генерирования рекомбинантных поксвирусов, а в частности, для генерирования рекомбинантных вирусов коровьей оспы (Mackett et al. (1982)PNAS USA 79, 7415-7419), однако, эта технология не может быть применена для MVA. Scheiflinger и др. показали, что MVA является гораздо более чувствительным к модификациям генома, чем другие поксвирусы, которые могут быть использованы для генерирования рекомбинантных поксвирусов. В частности,Scheiflinger и др. показали, что один из сайтов, который наиболее часто используется для интеграции гетерологичной ДНК в геномы поксвирусов, а именно локус гена тимидинкиназы (tk), не может быть использован для генерирования рекомбинантного MVA. Было установлено, что все полученные tk(-) рекомбинантные MVA являются в высокой степени нестабильными, и после очистки у них сразу делетируется инсертированная ДНК вместе с частями геномной ДНК MVA (Scheiflinger et al. (1996), Arch. Virol. 141: pp 663-669). Такая нестабильность, а, следовательно, и высокая вероятность геномной рекомбинации является известной проблемой, с которой сталкиваются вирусологи, работающие с поксвирусами. Действительно,MVA продуцируется в процессе длительного пассирования, и этот факт указывает на то, что вирусный геном CVA является нестабильным при его размножении in vitro в клетках культивированных тканей. Из генома этого MVA было делетировано несколько тысяч нуклеотидов (31 т.п.н.), а поэтому он отличается от исходного генома CVA 6-тью крупными и многочисленными мелкими делециями. Недавно была описана геномная организация MVA (Antoine et al. (1998), Virology 244, 365-396). Геном MVA размером 178 т.п.н. является плотно упакованным и содержит 193 отдельных открытых рамки считывания (ОРС), которые кодируют белки длиной по меньшей мере в 63 аминокислоты. По сравнению с высокоинфекционным вирусом натуральной оспы, а также с прототипом вируса коровьей оспы, а именно штаммом Копенгаген, большинство ОРС MVA являются фрагментированными или усеченными (Antoine et al. (1998), Virology 244, 365-396). Однако все ОРС, за очень редким исключением, включая фрагментированные и усеченные ОРС, транскрибируются и транслируются в белки. В нижеследующем описании используется номенклатура Антуана и др., а там, где это необходимо, также используется номенклатура, основанная на гидролизе рестриктирующим ферментом HindIII. До настоящего времени продуцирование стабильных рекомбинантных MVA осуществлялось путем инсерции экзогенной ДНК лишь в природные делеционные сайты генома MVA (PCT/EP96/02926). К сожалению, в геноме MVA имеется лишь ограниченное число природных делеционных сайтов. Кроме того, было показано, что другие инсерционные сайты, такие, например, как локус гена tk, почти не пригодны для генерирования рекомбинантного MVA (Scheiflinger et al. (1996), Arch. Virol. 141:pp.663-669). Цели настоящего изобретения Целью настоящего изобретения является идентификация дополнительных инсерционных сайтов генома MVA и получение инсерционных векторов, направляющих инсерцию экзогенных ДНКпоследовательностей в указанные только что идентифицированные инсерционные сайты генома MVA.-1 007811 Другой целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного MVA, который содержит экзогенные ДНК-последовательности, стабильно интегрированные в новые инсерционные сайты указанного генома MVA. Подробное описание настоящего изобретения Авторы настоящего изобретения идентифицировали новые сайты для инсерции экзогенных ДНКпоследовательностей в геном модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA). Новые инсерционные сайты локализуются в межгенных областях (IGR) вирусного генома, где указанные IGR, в свою очередь, локализуются между двумя смежными открытыми рамками считывания (ОРС) генома MVA или фланкированы этими рамками считывания. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к рекомбинантному MVA, содержащему гетерологичную ДНК-последовательность, встроенную в IGR вирусного генома. В соответствии с настоящим изобретением одна или несколько экзогенных ДНК-последовательностей может быть встроена в одну или несколько IGR. Было неожиданно обнаружено, что экзогенные ДНК-последовательности действительно остаются стабильными при их встраивании в IGR генома MVA. Как уже указывалось выше, считается, что геномMVA является крайне нестабильным. Очевидно, что гены или ДНК-последовательности, не имеющие важного значения для размножения вируса, делетируются или фрагментируются. Хотя было обнаружено- и также неожиданно - что стабильные рекомбинантные MVA продуцируются в том случае, когда гетерологичные ДНК-последовательности встраиваются в природные делеционные сайты генома MVA(PCT/EP96/02926), однако, с другой стороны, было также обнаружено, что гены определенного круга хозяев, как, например, локус tk, широко используемые для генерирования других рекомбинантных поксвирусов, не являются подходящими инсерционными сайтами в MVA. Тот факт, что Vero-MVA имеет одну дополнительную геномную делецию (РСТ/ЕР 01/02703), также дает основание предполагать, что указанный геном является динамичным в том смысле, что в нем легко делетируются гены, которые не требуются для размножения. Поэтому можно сделать вывод, что гетерологичные ДНКпоследовательности, встраивающиеся в область между ОРС и не играющие важной роли для размножения вируса, должны также делетироваться вирусом. Хотя нуклеотидные последовательности ОРС кодируют аминокислотную последовательность, образующую пептид, полипептид или белок, однако, IGR, расположенные между двумя ОРС, не обладают кодирующей способностью, но могут включать регуляторные элементы, сайты связывания, промоторные и/или энхансерные последовательности, играющие важную роль в регуляции транскрипции экспрессии вирусного гена, или участвующие в такой регуляции. Таким образом, IGR может участвовать в регуляции жизненного цикла вируса. Однако авторы настоящего изобретения также показали, что новые инсерционные сайты имеют неожиданное преимущество, заключающееся в том, что экзогенные ДНКпоследовательности могут быть стабильно встроены в геном MVA, и такое встраивание не оказывает никакого негативного влияния на обычные свойства и экспрессию гена MVA и не приводит к изменению его свойств и экспрессии. Новые инсерционные сайты являются особенно ценными, поскольку они не влияют ни на ОРС, ни на кодирующую последовательность MVA. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что уровень экспрессии чужеродного гена, встроенного в IGR, превышает уровень экспрессии чужеродного гена, встроенного в делеционный сайт генома MVA(см. также пример 1). Нуклеотидная последовательность ОРС обычно начинается с инициирующего кодона и заканчивается стоп-кодоном. В зависимости от ориентации двух смежных ОРС, IGR, т.е. область между этими ОРС, фланкируется либо двумя стоп-кодонами двух смежных ОРС, либо двумя инициирующими кодонами двух смежных ОРС, либо стоп-кодоном первой ОРС и инициирующим кодоном второй ОРС, либо инициирующим кодоном первой ОРС и стоп-кодоном второй ОРС. В соответствии с этим, сайт инсерции экзогенной ДНК-последовательности в IGR может быть расположен ниже или со стороны 3'-конца от стоп-кодона первой ОРС. В случае если имеется смежная ОРС,также называемая второй ОРС, то она имеет такую же ориентацию, как и первая ОРС, и этот инсерционный сайт, расположенный ниже стоп-кодона первой ОРС, находится выше или со стороны 5'-конца от инициирующего кодона второй ОРС. В случае если вторая ОРС имеет противоположную ориентацию по отношению к первой ОРС, при которой эти две смежных ОРС направлены навстречу друг к другу, то инсерционный сайт расположен ниже стоп-кодонов обеих ОРС. В качестве третьей альтернативы рассматривается случай, где две смежных ОРС считываются в противоположном направлении, но ориентированы так, что эти смежные ОРС направлены в противоположные стороны по отношению друг к другу, и такая ориентация аналогична расположению, характеризующемуся тем, что инициирующие кодоны двух ОРС являются смежными друг с другом, и в этом случае экзогенную ДНК встраивают в область, расположенную выше этих двух инициирующих кодонов. ОРС в геноме MVA находится в двух кодирующих направлениях. Следовательно, полимеразная активность направлена слева направо, то есть в прямом направлении, и, соответственно, справа налево (в обратном направлении). Такая практика является общепринятой в поксвирусологии, и она лежит в осно-2 007811 ве стандартной классификации вирусов коровьей оспы, используемой для идентификации ОРС по их ориентации и положению на различных рестрикционных HindIII-фрагментах генома. В соответствии с номенклатурой, различные HindIII-фрагменты обозначаются заглавными буквами с нижними выносными элементами в соответствии со снижением их размера. ОРС пронумерованы слева направо на каждом НindIII-фрагменте, и ориентация ОРС показана заглавными буквами L (что означает, что транскрипция происходит справа налево) или R (что означает, что транскрипция происходит слева направо). Кроме того, в более поздних публикациях, посвященных структуре генома MVA, где используется другая номенклатура, ОРС просто пронумерованы слева направо до конца генома, а их ориентация показана заглавными буквами L или R (Antoine et al. (1998), Virology 244, 365-396). В качестве примера, ОРС 14L,согласно старой номенклатуре, соответствует ОРС 064L по номенклатуре Antoine et al. Если не оговорено особо, в настоящем изобретении используется номенклатура Antoine et al. В соответствии с настоящим изобретением гетерологичные ДНК-последовательности могут быть встроены в одну или в несколько IGR между двумя смежными ОРС, выбранными из группы, включающей в себя В соответствии со старой номенклатурой ОРС 006L соответствует C10L, 019L соответствует C6L,020L соответствует N1L, 021L соответствует N2L, 023L соответствует K2L, 028R соответствует K7R,029L соответствует F1L, 037L соответствует F8L, 045L соответствует F15L, 050L соответствует E3L,052R соответствует E5R, 054R соответствует E7R, 055R соответствует E8R, 056L соответствует E9L,062L соответствует I1L, 064L соответствует I4L, 065L соответствует I5L, 081R соответствует L2R, 082L соответствует L3L, 086R соответствует J2R, 088R соответствует J4R, 089L соответствует J5L, 092R соответствует H2R, 095R соответствует H5R, 107R соответствует D10R, 108L соответствует D11L, 122R соответствует A11R, 123L соответствует A12L, 125L соответствует A14L, 126L соответствует A15L, 135R соответствует A24R, 136L соответствует A25L, 137L соответствует A26L, 141L соответствует A30L,148R соответствует A37R, 149L соответствует A38L, 152R соответствует A40R, 153L соответствуетA41L, 154R соответствует A42R, 157L соответствует A44L, 159R соответствует A46R, 160L соответствует A47L, 165R соответствует A56R, 166R соответствует A57R, 167R соответствует B1R, 170R соответствует B3R, 176R соответствует B8R, 180R соответствует B12R, 184R соответствует B16R, 185L соответствует B17L и 187R соответствует B19R. Предпочтительно гетерологичную последовательность встраивают в IGR, фланкированную двумя смежными ОРС, выбранными из группы, включающей в себя 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L. Гетерологичными или экзогенными ДНК-последовательностями являются последовательности, которые в природе обычно не ассоциированы с поксвирусом, используемым в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения экзогенная ДНК-3 007811 последовательность содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность. Указанная кодирующая последовательность функционально присоединена к транскрипционному регуляторному элементу, а предпочтительно, к поксвирусному транскрипционному регуляторному элементу. Кроме того,могут быть также использованы комбинации поксвирусных транскрипционных регуляторных элементов и, например, внутренних сайтов связывания с рибосомой. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения экзогенная ДНКпоследовательность может также содержать две или несколько кодирующих последовательностей, присоединенных к одному или нескольким транскрипционным регуляторным элементам. Предпочтительно,чтобы такая кодирующая последовательность кодировала один или несколько белков, полипептидов,пептидов, чужеродных антигенов или антигенных эпитопов, и, в частности, чтобы она содержала гены,представляющие интерес с терапевтической точки зрения. Такими представляющими терапевтический интерес генами согласно изобретению могут быть гены, происходящие от генов патогенных или инфекционных микроорганизмов, которые вызывают заболевание, или от генов, гомологичных указанным генам. В соответствии с этим, в контексте настоящего изобретения, такие представляющие терапевтический интерес гены презентируются иммунной системе организма для воздействия на специфическую иммунную систему, а предпочтительно, для индуцирования специфического иммунного ответа и, тем самым, для вакцинации или профилактической защиты организма от инфицирования микроорганизмом. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющие терапевтический интерес гены выбирают из генов инфекционных вирусов,таких как, не ограничиваясь ими, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус гепатита В или С или вирусы иммунодефицита, такие как ВИЧ. Генами, происходящими от вируса денге, предпочтительно, являются гены NS1 и РrМ, где указанные гены могут происходить от одного, двух, трех или всех четырех серотипов вируса денге. Ген NS1 предпочтительно происходит от серотипа 2 вируса денге и предпочтительно встраивается в IGR между ОРС 064L-065L (14L-15L). Гены РrМ, предпочтительно происходящие от всех 4 серотипов вируса денге,предпочтительно встраивают в IGR между ОРС, выбранными из 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L,148R-149L. Более предпочтительно, чтобы ген РrМ, происходящий от серотипа 1 вируса денге (PrM1),был встроен в IGR 148R-149L, РrМ 2 был встроен в IGR ОРС 007R-008L; РrМ 3 был встроен в IGR ОРС 044L-045L, а РrМ 4 был встроен в IGR 136L-137L. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения гетерологичная ДНК-последовательность происходит от ВИЧ и кодирует env ВИЧ, где указанный ген env ВИЧ, предпочтительно встраивают в IGR между ОРС 007R-008L. Кроме того, представляющие терапевтический интерес гены согласно изобретению также включают в себя ассоциированные с заболеванием гены, которые оказывают терапевтическое действие на пролиферативные расстройства, рак или болезни обмена веществ. Так, например, представляющий терапевтический интерес ген, ассоциированный с раком, может быть раковым антигеном, который обладает способностью индуцировать специфическую противораковую иммунную реакцию. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, кодирующая последовательность включает в себя по меньшей мере один маркерный или селективный ген. Селективные гены сообщают клетке резистентность к конкретному веществу, что позволяет осуществлять конкретный метод отбора. Специалистам-практикам известны различные селективные гены, которые могут быть использованы в поксвирусной системе. Такими генами, среди прочих, являются ген резистентности к неомицину (NPT) или ген фосфорибозилтрансферазы (gpt). Маркерные гены индуцируют цветовую реакцию в трансдуцированных клетках и могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток. Специалистам-практикам известны различные маркерные гены, которые могут быть использованы в поксвирусной системе. Такими генами, среди прочих, являются ген, кодирующий, например, -галактозидазу (-gal), -глюкозидазу (-glu), зеленый флуоресцирующий белок (EGFP) или синий флуоресцирующий белок. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения экзогенная ДНКпоследовательность содержит спейсерную последовательность, которая отделяет поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНКпоследовательности от стоп-кодона и/или инициирующего кодона смежных ОРС. Эта спейсерная последовательность, расположенная между стоп/старт-кодонами смежной ОРС и инсертированной кодирующей последовательностью в экзогенной ДНК, имеет то преимущество, что она стабилизирует инсертированную экзогенную ДНК, а следовательно, и любой полученный рекомбинантный вирус. Размер спейсерной последовательности варьируется, если только данная последовательность не имеет собственных кодирующих или регуляторных функций. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения спейсерная последовательность,отделяющая поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНК-последовательности от стоп-кодона смежной ОРС, имеет длину по меньшей мере в один нуклеотид. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения спейсерная последовательность,-4 007811 отделяющая поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНК-последовательности от инициирующего кодона смежной ОРС, имеет длину по меньшей мере в 30 нуклеотидов. В частности, в случае, когда типичный промоторный элемент вируса коровьей оспы идентифицирован выше инициирующего кодона, инсерция экзогенной ДНК не может отделять промоторный элемент от инициирующего кодона смежной ОРС. Типичный промоторный элемент вируса коровьей оспы может быть идентифицирован путем сканирования, например, последовательности "ТАААТ" на поздние промоторы (DavisonMoss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) и А/Тбогатый домен на ранние промоторы. Спейсерная последовательность, состоящая примерно из 30 нуклеотидов, предпочтительно должна иметь такую длину, чтобы она не оказывала негативного влияния на поксвирусный промотор, расположенный выше инициирующего кодона ОРС. Кроме того, в соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, расстояние между инсертированной экзогенной ДНК и инициирующем кодоном смежной ОРС должно составлять примерно 50 нуклеотидов, а более предпочтительно, примерно 100 нуклеотидов. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения указанная спейсерная последовательность включает в себя дополнительный поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент, способный регулировать транскрипцию смежной ОРС. Типичным штаммом MVA, который может быть использован в соответствии с настоящим изобретением для генерирования рекомбинантного MVA, является MVA-575, который был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных под номером депозита ЕСАСС V00120707. Другим предпочтительным штаммом MVA является MVA-Vero или его производное. ШтаммыMVA-Vero были депонированы в Европейской коллекции клеточных культур животных под номерами депозитов ЕСАСС V99101431 и 01021411. Безопасность MVA-Vero обусловлена его биологическими,химическими и физическими свойствам, описанными в Международной патентной заявке РСТ/ЕР 01/02703. По сравнению с другими штаммами MVA, штамм MVA-Vero включает в себя одну дополнительную геномную делецию. В еще одном варианте более предпочтительным штаммом MVA является штамм MVA-BN. MVABN был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных под номером депозита ЕСАСС V00083008. Вирус MVA-BN является в высокой степени аттенюированным вирусом, который также происходит от модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (см. также РСТ/ЕР 01/13628). Используемый в настоящем изобретении термин "производные" вируса означает потомство вирусов, обладающих такими же отличительными признаками, что и родительский вирус, но обнаруживающие различия в одном или нескольких частях его генома. Термин "производное MVA" означает вирус,обладающий такими же функциональными свойствами, что и MVA. Так, например, производное MVABN обладает свойствами MVA-BN. Одним из таких свойств MVA-BN или его производных является его аттенюация и неспособность реплицироваться в человеческих клетках HaCat. Рекомбинантный MVA согласно изобретению может быть использован в качестве лекарственного средства или вакцины. То есть, в соответствии с настоящим изобретением, он может быть использован для введения экзогенной кодирующей последовательности в клетку-мишень, где указанная последовательность является либо гомологичной, либо гетерологичной геному клетки-мишени. Введение экзогенной кодирующей последовательности в клетку-мишень может быть осуществленоin vitro для продуцирования белков, полипептидов, пептидов, антигенов или антигенных эпитопов. Этот метод предусматривает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным MVA согласно изобретению,культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и выделение полипептида,пептида, белка, антигена, эпитопа и/или вируса, продуцируемых указанной клеткой-хозяином, и/или обогащение ими данной клетки. Кроме того, способ введения одной или нескольких гомологичных или одной или нескольких гетерологичных последовательностей в клетки может быть использован для in vitro и in vivo терапии. Для invitro терапии выделенные клетки, которые были предварительно (ex vivo) инфицированы рекомбинантным MVA согласно изобретению, вводят в живой организм животного для воздействия на его иммунную систему, а предпочтительно для индуцирования иммунного ответа. Для in vivo терапии рекомбинантный поксвирус согласно изобретению непосредственно вводят в живой организм животного для воздействия на его иммунную систему, предпочтительно для индуцирования иммунного ответа. В этом случае клетки, окружающие участок инокуляции, а также клетки, в которые транспортируется вирус, например, через кровоток, непосредственно инфицируют in vivo рекомбинантным MVA согласно изобретению. После инфицирования эти клетки синтезируют белки, пептиды или антигенные эпитопы терапевтических генов, которые кодируются экзогенными кодирующими последовательностями, а затем презентируют их или их части на клеточной поверхности. Специализированные клетки иммунной системы распознают презентированные таким образом гетерологичные белки, пептиды или эпитопы и "запускают" вырабатывание специфического иммунного ответа. Поскольку MVA весьма ограничен в своем росте и поэтому он является в высокой степени аттенюированным, этот вирус может быть использован для лечения млекопитающих широкого ряда, включая человека, а также включая животных или человека с нарушением иммунной системы. Настоящее-5 007811 изобретение также относится к фармацевтическим композициям и вакцинам для индуцирования иммунного ответа в живом организме животного, включая человека. В общих чертах, фармацевтическая композиция может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых и/или апробированных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов,разбавителей и/или стабилизаторов. Такими добавками могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества или т.п. Подходящими носителями обычно являются крупные молекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или т.п. Для получения вакцин рекомбинантный поксвирус согласно изобретению превращают в его физиологически приемлемую форму. Это может быть осуществлено исходя из опыта изготовления вакцин на основе поксвируса, используемых для вакцинации против натуральной оспы (как описано Stickl H. et al., [1974] Dtsch.med. Wschr. 99, 2386-2392). Так, например, очищенный вирус хранят при -80 С с титром 5x108 ТСID50/мл,полученным примерно в 10 мМ трис, 140 мМ NaCl, pH 7,4. Например, для приготовления вакцинных препаратов для инъекций, 102-108 частиц вируса лиофилизуют в 100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в присутствии 2% пептона и 1% человеческого альбумина в ампуле, предпочтительно в стеклянной ампуле. Альтернативно, вакцинные препараты для инъекций могут быть приготовлены путем постадийной лиофилизации указанного вируса в данном препарате. Такой препарат может содержать другие добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон или другие добавки,такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, альбумин человеческой сыворотки), подходящие для in vivo введения. Затем стеклянную ампулу герметично закрывают и эта ампула может храниться в течение нескольких месяцев при температуре в пределах от 4 С до комнатной температуры. Однако, если нет необходимости в хранении при этих температурах, то такую ампулу предпочтительно хранить при температуре ниже -20 С. Для вакцинации или терапии лиофилизат может быть растворен в 0,1-0,5 мл водного раствора,предпочтительно, физиологического раствора или трис-буфера, и введен либо системно, либо местно, то есть парентерально, подкожно, внутримышечно, путем скарификации или любым другим способом введения, известным практикующему врачу. Способ введения, доза и частота введения могут быть оптимизированы методами, известными специалистам. Однако в большинстве случаев пациенту вводят повторную инъекцию через определенный промежуток времени примерно от 1 месяца до 6 недель после первой вакцинации. Кроме того, настоящее изобретение относится к плазмидным векторам, которые могут быть использованы для генерирования рекомбинантного MVA настоящего изобретения, а также оно относится к некоторым ДНК-последовательностям. Обычно, IGR, локализованная между двумя смежными ОРС или фланкированная этими двумя смежными ОРС, включает нуклеотидные последовательности, в которые может быть встроена нужная экзогенная ДНК-последовательность. В соответствии с этим, плазмидный вектор настоящего изобретения включает ДНК-последовательность, происходящую от последовательности генома MVA или от гомологичной ей последовательности, где указанная ДНК-последовательность включает полный или неполный фрагмент последовательности IGR, локализованный между двумя смежными ОРС вирусного генома, или фланкированный этими двумя смежными ОРС. Предпочтительно, чтобы плазмидный вектор содержал инсертированный в указанную последовательность, происходящую от IGR, по крайней мере,один сайт клонирования для инсерции нужной экзогенной ДНК-последовательности, а предпочтительно для инсерции поксвирусного транскрипционного регуляторного элемента, функционально присоединенного к указанной гетерологичной ДНК-последовательности. Плазмидный вектор может содержать, но необязательно, кассету репортерных генов и/или селективных генов. Такой плазмидный вектор также предпочтительно содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих указанный полный или неполный фрагмент последовательности IGR. Были идентифицированы некоторые IGR, которые не включают нуклеотидные последовательности. В этих случаях плазмидный вектор включает ДНК-последовательности, фланкирующие IGR, то есть ДНК-последовательности двух смежных ОРС. При этом предпочтительно, чтобы сайт клонирования для инсерции гетерологичной ДНК-последовательности был встроен в IGR. IGR-фланкирующие ДНКпоследовательности используют для направления инсерции экзогенных ДНК-последовательностей в соответствующую IGR в геноме MVA. Такой плазмидный вектор может, кроме того, включать полный или неполный фрагмент последовательности IGR, который содержит сайт клонирования для инсерции гетерологичной ДНК-последовательности и, необязательно, кассету репортерных и/или селективных генов.IGR-ДНК-последовательности, а также IGR-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС, предпочтительно, выбирают, соответственно, из IGR и ОРС, выбранных из группы, содержащей Более предпочтительно эти последовательности выбирают, соответственно, из IGR и ОРС, выбранных из группы, включающей 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148L-149L. Происходящие от IGR последовательности предпочтительно выбирают из группы, содержащей нуклеотидные последовательности: 527-608 последовательности Seq ID No. 32; 299-883 последовательности Seq ID No. 33; 339-852 последовательности Seq ID No. 34; 376-647 последовательности Seq ID No. 35; 597-855 последовательности Seq ID No. 36; 400-607 последовательности Seq ID No. 37.IGR-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС, предпочтительно, выбирают из группы, содержащей следующие нуклеотидные последовательности 1-525 и 609-1190 последовательности Seq ID No. 32; 101-298 и 884-1198 последовательности Seq ID No. 33; 1-338 и 853-1200 последовательности Seq ID No. 34; 1-375 и 648-1200 последовательности Seq ID No. 35; 1-596 и 856-1200 последовательности Seq ID No. 36; 1-399 и 608-1081 последовательности Seq ID No. 37. Эти ДНК-последовательности, предпочтительно, происходят от последовательности генома MVA или от гомологичной ей последовательности, депонированой в ЕСАСС под номером депозитаV00083008. Для генерирования плазмидного вектора согласно изобретению, последовательности выделяют и клонируют в стандартный клонирующий вектор, такой как pBlueScript (Stratagene), где эти последовательности фланкируют экзогенную ДНК, встроенную в геном MVA. Такой плазмидный вектор может содержать, но необязательно, кассету селективных или репортерных генов, которая может быть делетирована из конечного рекомбинантного вируса благодаря включенной в указанную кассету повторяющейся последовательности. Способы введения экзогенных ДНК-последовательностей в геном MVA посредством плазмидного вектора и методы получения рекомбинантного MVA хорошо известны специалистам, и кроме того, они могут быть найдены в нижеследующих руководствах: в руководстве Molecular Cloning: (A laboratory manual. Second Edition. By J. Sambrook, Fritsh, E.F.Maniatis Т., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) описаны методы и "ноу-хау" для стандартных методов молекулярной биологии, таких как клонирование ДНК, выделение РНК, Вестерн-блот-анализ, OТПЦР и ПЦР-амплификация; в руководстве Virology Methods Manual (Edited by Brian W.J. ManyHillar O. Kangro. AcademicPress. 1996) описаны методы обработки и модификации вирусов; в руководстве Molecular Virology (A Practical Approach. Edited by A.J. DavisonR.M. Elliott. ThePractical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Chapter 9) описана экспрессия генов векторами вируса коровьей оспы; в руководстве Current Protocols in Molecular Biology. (Publisher: John Wiley and Son Inc. 1998. Chapter 16, section IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector) описаны методы иMVA настоящего изобретения, а предпочтительно MVA, депонированный в ЕСАСС под номером депозита V00083008, может быть продуцирован путем трансфекции клетки плазмидным вектором настоящего изобретения, инфицирования указанной трансфицированной клетки вирусом MVA, а затем идентификации, выделения и, необязательно, очистки MVA настоящего изобретения. ДНК-последовательности настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации или выделения MVA или его производных согласно изобретению, а также для идентификации клеток или индивидуумов, инфицированных MVA настоящего изобретения. Эти ДНК-последовательности, например, используются для генерирования ПЦР-праймеров, гибридизационных зондов, либо они используются в технологии создания массивов. Краткое описание графического материала Фиг. 1: pестрикционная карта векторных конструкций pBNX39 (фиг. 1a), pBNX70 (фиг. 1b) иpBN84 (фиг. 1 с), содержащих примерно 600 п.н. последовательностей MVA, фланкирующих сайт инсерции, находящийся за 14L ОРС. Эти плазмиды, кроме того, включают экзогенную ДНК (Ecogpt и hBFP,соответственно), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р, между фланкирующими последовательностями Flank 1 (F1 14L-15L) и Flank 2 (F2 14L-15L). "F1rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 1, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. pBN84 (фиг. 1 с), кроме того, кодирует белок NS1 вируса денге (NS1DEN). Далее используются следующие сокращения: AmpR = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов. Фиг. 2: pестрикционная карта векторных конструкций pBNX51 (фиг. 2 а), pBNX67 (фиг. 2b) иMVA; Flank 2: F2136-137 соответствует положению 129931-130540 генома MVA). Вектор pBNX67 (фиг. 2b), кроме того, включает экзогенную ДНК (ген NPTII = ген резистентности к неомицину), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. "F2rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. pBN27 (фиг. 2 с), кроме того, кодирует белок РrМ 4 вируса денге, находящийся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: AmpR = ген резистентности к ампициллину; п.н. - пары нуклеотидов, IRES = внутренний сайт связывания с рибосомой; EGFP = ген-усилитель для белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра. Фиг. 3: pестрикционная карта векторных конструкций pBNX79 (фиг. 3 а), pBNX86 (фиг. 3b) и pBNX88(фиг. 3 с), pBN34 (фиг. 3d) и pBN56 (фиг. 3 е), содержащих примерно 600 п.н. последовательностей MVA,фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 007R и 008L (Flank 1: F1 IGR 07-08 начинается в положении 12200 генома MVA; Flank 2: F2 IGR 07-08 заканчивается в положении 13400 генома MVA)."F2rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. Кроме того, векторы pBNX88 (фиг. 3 с) и pBNX86 (фиг. 3b) содержат экзогенную ДНК (BFP + gpt и NPTII + EGFP, соответственно), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. "F2rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. pBN56 (фиг. 3 е), кроме того, кодирует белок env ВИЧ-1, a pBN34 (фиг. 3d),содержит кодирующую последовательность РrМ 2 вируса денге, находящуюся под контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: AmpR = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов. Фиг. 4: pестрикционная карта векторных конструкций pBNX80 (фиг. 4 а), pBNX87 (фиг. 4b) и pBN47(фиг. 4 с), содержащих примерно 600/640 п.н. последовательностей MVA, фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 0044L и 045L (Flank 1: Fl IGR 44-45 начинается в положении 36730 генома MVA;Flank 2: F2 IGR 44-45 заканчивается в положении 37970 генома MVA). Вектор pBNX87 (фиг. 4b), кроме того,содержит экзогенную ДНК (ген NPTII + EGFP), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. "F2rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. pBN47 (фиг. 4 с), кроме того, кодирует РrМ 3 вируса денге, находящийся под контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: AmpR = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов. Фиг. 5: pестрикционная карта векторных конструкций pBNX90 (фиг. 5 а), pBNX92 (фиг. 5b) иpBN54 (фиг. 5 с), содержащих примерно 596/604 п.н. последовательностей MVA, фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 148R и 149L (Flank 1: Fl IGR 148-149 начинается в положении 136900 генома MVA; Flank 2: F2 IGR 148-14 9 заканчивается в положении 138100 генома MVA). Вектор pBNX92(фиг. 5b), кроме того, содержит экзогенную ДНК (gpt + BFP), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. pBN54 (фиг. 5 с),кроме того, кодирует PrM1 вируса денге. "F2rpt" означает повторяющуюся последовательность Flank 2,позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. Далее используются следующие сокращения: AmpR = ген резистентности к ампициллину; п.н. - пары нуклеотидов. Фиг. 6: cхематическое представление межгенных сайтов инсерции MVA (GenbankU94848). Фиг. 7: ПЦР-анализ IGR 14L-15L в рекомбинантном MVA с геном NS1 вируса денге, встроенным вIGR 14L-15L. Дорожка "BN" соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием "пустого" вектора MVA-BN. С использованием рекомбинантного NS1-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (1, 2, 3, 4: различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы, Н 2O = негативный контроль (вода). Фиг. 8; 8 а: ПЦР-анализ IGR 136-137 в рекомбинантном MVA с геном РrМ 4 вируса денге, встроенным в IGR 136-137. Дорожка "BN" соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием "пустого" вектора MVA-BN. С использованием рекомбинантного PrM4-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (mBN23, 1/10, 1/100: различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы,Н 2O = негативный контроль (вода), pBN27 = плазмида позитивного контроля. Фиг. 8b: кривая многостадийного роста для "пустого" вектора MVA-BN и рекомбинантный MVA с геном РrМ 4 вируса денге, встроенным в IGR 136-137 (MVA-mBN23). Фиг. 9; 9 а: ПЦР-анализ IGR 07-08 в рекомбинантном MVA с геном РrМ 2 вируса денге, встроенным в IGR 07-08. Дорожка 3 соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием "пустого" вектораMVA-BN. С использованием рекомбинантного PrM2-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожка 2). М = маркер молекулярной массы, дорожка 1 = негативный контроль (вода). Фиг. 9b: кривая многостадийного роста для "пустого" вектора MVA-BN и рекомбинантный MVA с геном РrМ 2 вируса денге, встроенным в IGR 07-08 (MVA-mBN25). Фиг. 10: ПЦР-анализ IGR 07-08 в рекомбинантном MVA с геном env вируса ВИЧ, встроенным вMVA-BN. С использованием рекомбинантного PrM2-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожки 1, 2, 3). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода), + = плазмида позитивного контроля. Фиг. 11; 11 а: ПЦР-анализ IGR 44-45 в рекомбинантном MVA с геном РrМ 3 вируса денге, встроенным в IGR 44-45. Дорожка BN соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием "пустого" вектора MVA-BN. С использованием рекомбинантного РrМ 3-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожки 1-4, различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода). Фиг. 11b: кривая многостадийного роста для "пустого" вектора MVA-BN и рекомбинантный MVA с геном РrМ 3 вируса денге, встроенным в IGR 44-45 (MVA-mBN28). Фиг. 12; 12 а: ПЦР-анализ IGR 148-149 в рекомбинантном MVA с геном PrM1 вируса денге, встроенным в IGR 148-149. Дорожка BN соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием "пустого" вектора MVA-BN. С использованием рекомбинантного PrM1-MVA был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожка 1). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода), + = плазмида позитивного контроля. Фиг. 12b: кривая многостадийного роста для "пустого" вектора MVA-BN и рекомбинантный MVA с геном PrM1 вируса денге, встроенным в IGR 44-45 (MVA-mBN33). Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано на нижеследующих примерах. Для каждого специалиста очевидно, что приведенные ниже примеры не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения не должен выходить за рамки объема прилагаемой формулы изобретения. Пример 1. Инсерционные векторы pBNX39, pBNX70 и pBN84. Для инсерции экзогенных последовательностей в межгенную область, смежную с 065L ОРС (этот инсерционный сайт находится в положении генома 56760) MVA, конструировали вектор, содержащий примерно 1200 п.н. фланкирующих последовательностей, смежных с указанным инсерционным сайтом. Эти фланкирующие последовательности были разделены на два фланга, где на одном фланге присутствует примерно 610 п.н. 065L ОРС (альтернативная номенклатура: 14L ОРС), а на другом фланге присутствует примерно 580 п.н. межгенной области, находящейся за 065L ОРС, а также части ближайшей ОРС. Между этими фланкирующими последовательностями находится, соответственно, ген Ecogpt (gpt означает ген фосфорибозилтрансферазы, выделенный из E.coli) и ген BFP (ген белка, флуоресцирующего в синем диапазоне спектра), находящиеся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора. Кроме того, там присутствует по крайней мере один сайт клонирования для инсерции дополнительных генов или последовательностей, встраиваемых в межгенную область, находящуюся за 14L ОРС. Приме-9 007811 ры векторных конструкций настоящего изобретения описаны на фиг. 1 а) и b) (pBNX39, pBNX70). В векторе pBN84 (фиг. 1 с), кодирующая область для NS1 вируса денге встроена в сайт клонирования pBNX70(фиг. 1b). Генерирование рекомбинантного MVA посредством гомологичной рекомбинации Чужеродные гены могут быть встроены в геном MVA посредством гомологичной рекомбинации. Для этой цели нужный чужеродный ген клонируют в плазмидный вектор, описанный выше. Этот вектор трансфицируют в MVA-инфицированные клетки. Рекомбинация происходит в цитоплазме инфицированных и трансфицированных клеток. С помощью селективной и/или репортерной кассеты, которая также содержится в инсерционном векторе, были идентифицированы и выделены клетки,содержащие рекомбинантные вирусы. Для гомологичной рекомбинации, клетки ВНК (почек детеныша хомячка) или клетки CEF (первичные фибробласты куриного эмбриона) высевали в 6-луночные планшеты с использованием DMEM (модифицированной по способу Дульбекко среды Игла, Gibco BRL) + 10% фетальная телячья сыворотка(FCS) или VP-SFM (Gibco BRL) + 4 ммоль/л L-глутамина для осуществления продуцирования в бессывороточной среде. Клетки должны находиться еще в фазе роста, а поэтому они должны достигать 60-80% конфлюентности на день трансфекции. Перед посевом клетки подсчитывали, поскольку для определения множественности заражения (m.o.i.) при инфицировании необходимо знать число клеток. Для инфицирования маточный раствор MVA разводили в среде DMEM/FCS или в среде VP-SFM/Lглутамин так, чтобы разведение 500 мкл содержало соответствующее количество вируса, которое давало бы m.o.i.= 0,1-1,0. Предполагается, что клетки начинают делиться сразу после посева. Затем среду удаляли из клеток и эти клетки инфицировали 500 мкл разведенного вируса в течение 1 ч в шейкере при комнатной температуре. Инокулят удаляли и клетки промывали DMEM/VP-SFM. Инфицированные клетки оставляли в 1,6 мл DMEM/FCS и VP-SFM/L-глутамин, соответственно, для запуска реакции трансфекции(Qiagen Effectene Kit). Для осуществления трансфекции использовали трансфекционный набор "Effectene" (Qiagen). Смесь для трансфекции приготавливали из 1-2 мкг линеаризованного инсерционного вектора (общее количество для множественной трансфекции) с добавлением буфера ЕС до конечного объема 100 мкл. После этого добавляли 3,2 мкл энхансера, интенсивно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем, после интенсивного встряхивания пробирки с маточным раствором, добавляли 10 мкл Effectene, и раствор тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого добавляли 600 мкл DMEM/FCS и VP-SFM/L-глутамин, соответственно, и смесь перемешивали, после чего всю смесь для трансфекции добавляли к клеткам, которые были уже покрыты средой. Для перемешивания реакционной смеси для трансфекции чашки слегка покачивали. Инкубирование проводили при 37 С в присутствии 5% СO2 в течение ночи. На следующий день среду удаляли и заменяли свежей средой DMEM/FCS или средой VP-SFM/L-глутамин. Инкубирование продолжали вплоть до дня 3. Для сбора клеток эти клетки соскабливали в среду, а затем клеточную суспензию переносили в подходящую пробирку и замораживали при -20 С для кратковременного хранения или при -80 С для длительного хранения. Встраивание Ecogpt в инсерционный сайт 14L MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом, и,кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBNX39 (фиг. 1a), содержащим ген Ecogpt(Ecogpt или ген, укороченный до gpt, представляют собой ген фосфорибозилтрансферазы) в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на метаболическое действие фосфорибозилтрансферазы при добавлении микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина. Микофеноловая кислота (МРА) ингибирует инозин-монофосфат-дегидрогеназу, что приводит к блокированию синтеза пурина и ингибированию репликации вируса в большинстве клеточных линий. Такое блокирование может быть предотвращено путем экспрессии Ecogpt с конститутивного промотора и продуцирования субстратов ксантина и гипоксантина. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров, селективно амплифицирующих предполагаемый инсерционный сайт. Для амплификации инсерционного сайта 14L использовали пару праймеров BN499 (САА СТС ТСТ ТСТTGA ТТА СС, SEQ ID NO: 1) и BN500 (CGA TCA AAG ТСА АТС TAT G, SEQ ID NO: 2). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 328 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA, который имеет встроенную экзогенную ДНК в инсерционном сайте 14L, этот фрагмент соответственно увеличивается. Встраивание NS1 в инсерционный сайд IGR064L-065L (14L-15L) MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом, и,кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN84 (фиг. 1 с), содержащим ген Ecogpt для отбора и ген BFP (ген белка, флуоресцирующего в синем диапазоне спектра) в качестве репортерного- 10007811 гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 7 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на метаболическое действие фосфорибозилтрансферазы при добавлении микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина. Микофеноловая кислота (МРА) ингибирует инозинмонофосфат-дегидрогеназу, что приводит к блокированию синтеза пурина и ингибированию репликации вируса в большинстве клеточных линий. Такое блокирование может быть предотвращено путем экспрессииEcogpt с конститутивного промотора и продуцирования субстратов ксантина и гипоксантина. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров, селективно амплифицирующих предполагаемый инсерционный сайт. Для амплификации инсерционного сайта 14L использовали пару праймеров BN499 (САА СТС ТСТ ТСТTGA ТТА СС, SEQ ID NO: 1) и BN500 (CGA TCA AAG ТСА АТС TAT G, SEQ ID NO: 2). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 328 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA с NS1, который имеет встроенную кодирующую область гена NS1 вируса денге в инсерционном сайте 14L, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 1683 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 7, ясно указывают на стабильную инсерцию NS1 в инсерционном сайте 14L после проведения 17 раундов амплификации вируса. Тестирование rесМVА, включающего NS1 (MVA-BN22) in vitro Колбу Т 25, содержащую монослои клеток ВНК примерно с 80%-ной конфлюентностью, инокулировали 100 мкл вирусного штамма, разведенного 1 х 107 в среде МЕМ с 1% FCS, и покачивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем в каждую колбу добавляли 5 мл МЕМ с 3% FCS и инкубировали при 30 С в СO2-инкубаторе. Через 48 ч содержимое колбы собирали. После этого из колбы удаляли супернатант и центрифугировали при 260 х g в течение 10 мин при 4 С. Супернатанты хранили в аликвотах при -80 С. Осадок 2 раза промывали 5 мл 1xPBS, а затем ресуспендировали в 1 мл гипотонического буфера Даунса с 1% ТХ 100. Клеточные лизаты собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 16000 х g, после чего супернатанты хранили в микроцентрифужных пробирках при -80 С. Колбы инокулировали MVA, включающем GFP, и MVA, включающем ген NS1 в делеционном сайте (MVA-BN07), а ложноинфицированные колбы обрабатывали аналогичным образом, как описано выше. Клеточный/вирусный лизат и супернатант обрабатывали в невосстанавливающем/восстанавливающем буфере для образцов при нагревании/без нагревания. Белки разделяли с помощью электрофореза в 10% ПААГ с ДСН и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Блоты зондировали в течение ночи сывороткой, взятой у выздоравливающих пациентов (PPCS) при разведении 1:500. После 3-кратной промывки 1X PBS блоты инкубировали с ПХ-конъюгированными антителами против человеческих IgG (DAKO) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки блотов вышеописанным способом проявляли окраску с использованием 4-хлор-1-нафтола. Результаты Вестерн-блот-анализа показали, что NS1 в MVA-BN22 экспрессировался в больших количествах. NS1 экспрессировался в нужной конформации, в виде димера - без нагревания, и в виде мономера - при нагревании. Экспрессию NS1 сравнивали с экспрессией MVA-BN22 и MVA-BN07. Клетки ВНК инокулировали теми же б.о.е. и собирали через 48 ч. Результаты показали, что уровень экспрессии NS1 в BN22 значительно превышает уровень экспрессии в BN07. Результаты Вестерн-блот-анализов также показали, что в супернатанте с конструкцией BN22 секретировалось большее количество NS1, чем в супернатанте сBN07. Эти результаты также показали, что NS1, экспрессированный в инфицированных клетках BN22, является антигенным и распознается сывороткой, полученной от выздоравливающих пациентов. Отсюда следует вывод, что NS1 экспрессируется в больших количествах и в правильной конформации в BN22-инфицированных клетках ВНК. И димер, и мономер являются антигенными и распознаются сывороткой, взятой у выздоравливающих пациентов. Пример 2. Инсерционный вектор pBNX67 и pBN27. Последовательности MVA, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 129940) и расположенные между ОРС 136L и 137L, выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID NO: 6) для выделения Flank 2; ПЦР-фрагмент, включающий Flank 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами SacII и XbaI и лигировали в SacII/XbaI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой какpBlueScript (Stratagene). Полученную плазмиду гидролизовали ферментами XhoI/ApaI, дефосфорилировали и лигировали вXhoI/ApaI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Flank 2. Необязательно, повторяющуюся последовательность Flank 2, которая была выделена посредствомID NO: 7) и oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO: 8), и которая была гидролизована ферментами HindIII/PstI, встраивали в HindIII/PstI-сайт полученного вектора. Этот вектор (pBNX51) показан на фиг. 2 а. Репортерная кассета, содержащая синтетический промотор, ген NPTII (ген резистентности к неомицину), область poly-A, IRES, ген EGFP, (Ps-NPTII-polyA-IRES-EGFP), гидролизовали ферментамиEc1136II/XhoI и встраивали в HindIII/XhoI-сайт указанного инсерционного вектора, где HindIII-сайт затупляли по концам ДНК-полимеразой Т 4 (Roche). Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 2b (pBNX67). Для конструирования pBN27 (фиг. 2 с), РrМ серотипа 4 вируса денге встраивали в одиночный PacIсайт pBNX67. Создание рекомбинантного MVA посредством гомологичной рекомбинации Вектор pBNX67 (фиг. 2b) может быть использован в целях генерирования рекомбинантного MVA в соответствии с вышеупомянутым протоколом, например, с использованием pBN27 (фиг. 2 с) для гомологичной рекомбинации, в результате чего может быть получен рекомбинантный MVA, несущий РrМ 4 вируса денге в межгенной области между двумя смежными ОРС. Встраивание РrМ 4 в инсерционный сайт IGR136-137 MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN27 (фиг. 2 с), содержащим ген NPT для отбора и EGFP (ген-усилитель белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра) в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 4 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на G418. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта IGR136-137 использовали пару праймеров, BN900(cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO: 9) и BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID NO: 10). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 88 нуклеотидов(нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA с РrМ 4, который имеет встроенную кодирующую область РrМ 4 вируса денге в инсерционном сайте IGR136-137, этот фрагмент предположительно имеет длину 880 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 8 а, ясно указывают на стабильную инсерцию РrМ 4 в инсерционном сайте IGR136-137 после проведения 22 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный MVA обнаруживал такую же способность к росту, как и MVA-BN. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках CEF), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 8b). Пример 3. Инсерционный вектор pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 и pBN56. Последовательности MVA, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 12800) и расположенные между ОРС 007R и 008L выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID NO: 14) для выделения Flank 2. ПЦР-фрагмент, включающий Flank 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами SacII и SacI и лигировали в SacII/SacI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой какpBlueScript (Stratagene). Полученную плазмиду гидролизовали ферментами XhoI/ApaI, дефосфорилировали и лигировали вXhoI/ApaI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Flank 2. Необязательно, повторяющуюся последовательность Flank 2, которая была выделена посредством ПЦР с использованием праймеров IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC;SEQ ID NO: 13) и IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEQ ID NO: 15), и которая была гидролизована ферментами BamHI/PstI, встраивали в BamHI/PstI-сайт полученного вектора. Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область poly-A, необязательно элемент IRES, и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть затуплен по концам ДНК-полимеразой Т 4 (Roche) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 3 а (pBNX79). В результате встраивания кассеты для отбора на NPT/EGFP получали вектор pBNX86 (фиг. 3b), а в результате встраивания кассеты для отбора на gpt/BFP получали вектор pBNX88 (фиг. 3 с), соответственно. Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в PacI-сайт. Для конструирования pBN34(фиг. 3d), РrМ 2 вируса денге клонировали в pBNX88 (фиг. 3 с), а для синтеза pBN56 (фиг. 3 е), кодирующую область env ВИЧ клонировали в PacI-сайт в pBNX86 (фиг. 3b). Создание рекомбинантного MVA посредством гомологичной рекомбинации Векторы pBNX86 (фиг. 3b) и pBNX88 (фиг. 3 с), соответственно, могут быть использованы в целях генерирования рекомбинантного MVA в соответствии с вышеупомянутым протоколом. С использованием pBN34 (фиг. 3d) для гомологичной рекомбинации получали рекомбинантный MVA, несущий РrМ 2 вируса денге в межгенной области между двумя смежными ОРС. Рекомбинация pBN56 (фиг. 3 е) с геномом MVA-BN приводила к получению рекомбинантного MVA, который содержит ген env ВИЧ в соответствующей IGR. Встраивание РrМ 2 в инсерционный сайт IGR07-08 MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN34 (фиг. 3d), содержащим ген gpt для отбора и ген BFP в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора в присутствии микофеноловой кислоты, как описано в примере 1. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта IGR07-08 использовали пару праймеров, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO: 16) и BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO: 17). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 190 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA для РrМ 2, который имеет встроенную кодирующую область РrМ 2 вируса денге в инсерционном сайте IGR07-08, этот фрагмент предположительно имеет длину 950 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 9 а, ясно указывают на стабильную инсерцию РrМ 2 в инсерционном сайте IGR07-08 после проведения 20 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный MVA обнаруживал такую же способность к росту, как и MVA-BN. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках CEF) , но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 9b). Встраивание env ВИЧ в инсерционный сайт IGR07-08 MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN56 (фиг. 3 е), содержащим ген NPT для отбора и ген EGFP в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 6 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на G418. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта IGR07-08, использовали пару праймеров, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO: 16) и BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO: 17). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 190 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA с env, который имеет встроенную кодирующую область env ВИЧ в инсерционном сайте IGR07-08, этот фрагмент предположительно имеет длину 2,6 т.п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 10, ясно указывают на стабильную инсерцию env в инсерционном сайте IGR07-08 после проведения 20 раундов амплификации вируса. Пример 4. Инсерционный вектор pBNX80, pBNX87 и pBN47. Последовательности MVA, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 37330) и расположенные между ОРС 044L и 045L выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:IGR 44/45 F2end (CAGGGCCCTAAATGCGCTTCTCAAT, SEQ ID NO: 21) для выделения Flank 2. ПЦР-фрагмент, включающий Flank 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами SacII и SacI и лигировали в SacII/SacI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой какpBlueScript (Stratagene). Полученную плазмиду гидролизовали ферментами XhoI/ApaI, дефосфорилировали и лигировали вXhoI/ApaI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Flank 2. Необязательно, повторяющуюся последовательность Flank 2, которая была выделена с помощью ПЦР с использованием праймеров IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT, SEQ ID NO: 20) и IGR 44/45 F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG, SEQ ID NO: 22), и которая была гидролизована ферментами BamHI/PstI, встраивали в BamHI/PstI-сайт полученного вектора. Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область poly-A, необязательно элемент IRES и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть- 13007811 затуплен по концам ДНК-полимеразой Т 4 (Roche) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Что касается кассеты репортерных генов, то предпочтительными сайтами клонирования являются сайты рестриктирующих ферментов EcoRI,EcoRV, HindIII, AvaI или XhoI, расположенные между Flank 2 и Flank 2-повторами. Для конструированияpBNX87 (фиг. 4b) кассету для отбора на NPT/EGFP встраивали в pBNX80 (фиг. 4 а). Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в PacI-сайт. Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 4 а и b (pBNX80, pBNX87). Этот вектор был использован для генерирования, в соответствии с вышеупомянутым протоколом,рекомбинантного MVA, несущего экзогенную последовательность в межгенной области между двумя смежными ОРС. Для конструирования pBN47 (фиг. 4 с), РrМ серотипа 3 вируса денге клонировали вpBNX87 (фиг. 4b). Встраивание РrМ 3 в инсерционный сайт IGR44-45 MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN47 (фиг. 4 с), содержащим ген NPT для отбора и ген EGFP в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на G418. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта IGR44-45 использовали пару праймеров, BN904 (cgttagaacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO: 23) и BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO: 24). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 185 нуклеотидов(нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA с РrМ 3, который имеет встроенную кодирующую область РrМ 3 вируса денге в инсерционном сайте IGR44-45, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 850 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 11 а, ясно указывают на стабильную инсерцию РrМ 3 в инсерционном сайте IGR44-45 после проведения 19 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный MVA обнаруживал такую же способность к росту, как и MVA-BN. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках CEF), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 11b). Пример 5. Инсерционный вектор pBNX90, pBNX92 и pBN54. Последовательности MVA, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 137496) и расположенные между ОРС 148R и 149L выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:IGR 148/149 F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG, SEQ ID NO: 28) для выделения Flank 2. ПЦР-фрагмент, включающий Flank 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами SacII и XbaI и лигировали в SacII/XbaI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой какpBlueScript (Stratagene). Полученную плазмиду гидролизовали ферментами HindIII/ApaI, дефосфорилировали и лигировали в HindIII/ApaI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Flank 2. Необязательно, повторяющуюся последовательность Flank 2, которая была выделена с помощью ПЦР с использованием праймеров IGR 148/149 F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC, SEQ ID NO: 27) и IGR 148/149 F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC, SEQ IDNO: 29), и которая была гидролизована ферментами BamHI/PstI, встраивали в BamHI/PstI-сайт полученного вектора. Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область poly-A, необязательно элемент IRES и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть затуплен по концам ДНК-полимеразой Т 4 (Roche) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Для конструирования pBNX92 (фиг. 5b) экспрессирующую кассету, содержащую gpt/BFP, встраивали в указанный сайт клонирования. Что касается кассеты репортерных генов, то предпочтительными сайтами клонирования являются сайты рестриктирующих ферментов PstI, EcoRI, BcoRV и HindIII, расположенные между Flank 2 и Flank 2-повторами. Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в PacI-сайт. Для конструирования pBN54 (фиг. 5 с) в указанный PacI-сайт встраивали PrM1 вируса денге. Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 5 а) и b) (pBNX90, pBNX92).- 14007811 Этот вектор был использован для генерирования, в соответствии с вышеупомянутым протоколом,рекомбинантного MVA, несущего экзогенную последовательность в межгенной области между двумя смежными ОРС. При конструировании рекомбинантного MVA, экспрессирующего ген PrM1 вируса денге (фиг. 5 с), использовали pBN54 (фиг. 5 с) для гомологичной рекомбинации. Встраивание PrM1 в инсерционный сайт IGR148-149 MVA В первом раунде клетки инфицировали MVA в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором pBN54 (фиг. 5 с), содержащим ген gpt для отбора и ген BFP в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора в присутствии микофеноловой кислоты. Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта IGR148-149 использовали пару праймеров, BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO: 30) и BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID NO: 31). В случае амплификации ДНК вируса MVA в "пустом" векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 450 нуклеотидов(нк), а в случае амплификации рекомбинантного MVA с PrM1, который имеет встроенную кодирующую область PrM1 вируса денге в инсерционном сайте IGR148-149, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 1200 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 12 а, ясно указывают на стабильную инсерциюPrM1 в инсерционном сайте IGR148-149 после проведения 23 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный MVA обнаруживал такую же способность к росту, как и MVA-BN. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках CEF), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 12b).