Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие комбинацию мотивов и обладающие повышенной активностью

007232 Область, к которой относится изобретение В общих чертах, настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, к их композициям и к способам применения указанных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот. Предшествующий уровень техники Известны два основных класса иммуностимулирующих последовательностей, которые имеют различные профили иммуностимулирующей активности (Krieg A.M. (2001) Trends Microbiol 9:24 9-52). Существуют так называемые CpG-олигодезоксинуклеотиды (ODN) класса В, которые являются сильными активаторами В-клеток, либо CpG-ODN класса А, которые являются сильными активаторами природных клеток-киллеров (NK). Помимо этих иммуностимулирующих последовательностей известны по меньшей мере два класса нейтрализующих последовательностей, включая последовательности CpG, в которых CG расположен после С или перед G (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:12631-12636), и последовательности ДНК, в которых CG метилирован. Нейтрализующим мотивом является мотив, который обладает определенной степенью иммуностимулирующей активности, если он присутствует в том или ином нестимулирующем мотиве, но который способствует снижению иммуностимулирующего потенциала других мотивов, если он присутствует в контексте других иммуностимулирующих мотивов. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к новому классу иммуностимулирующих нуклеиновых кислот. В некоторых случаях эти нуклеиновые кислоты имеют CG-богатый палиндром, либо CG-богатый нейтрализующий мотив. Заявителями ранее были идентифицированы и описаны олигодезоксинуклеотиды (ODN), содержащие нейтрализующие мотивы, состоящие из повторов последовательности CG, таких как CGCGCG или динуклеотид CG, который следует за С (т.е. CCG) и/или который находится перед G (т.е. CGG, CCGG). Эти нейтрализующие мотивы, очевидно, вызывают некоторое ослабление стимулирующего действия CpGсодержащего ODN на множество процессов, таких как секреция IL-6, IL-12, IFN-, TNF- и индукция антиген-специфического иммунного ответа (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:12631-6). Настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении заявителем того факта,что некоторые ODN, содержащие комбинацию стимулирующего мотива и нейтрализующего мотива,являются чрезвычайно иммуностимулирующими. Настоящее изобретение также частично основано на неожиданном обнаружении заявителями того факта, что ODN, имеющий определенные CG-богатые палиндромные последовательности, включая палиндромные последовательности, содержащие нейтрализующие мотивы, являются чрезвычайно иммуностимулирующими. Таким образом, нейтрализующий мотив, присутствующий в окружении палиндромной последовательности, может быть, но необязательно,чрезвычайно иммуностимулирующим. Кроме того, иммуностимулирующий ODN настоящего изобретения обладает иммуностимулирующим действием, ассоциированным с уже известными CpG-ODN двух различных классов, т.е. тех CpGODN, которые специфически активируют В-клетки (CpG-ODN класса В), и тех CpG-ODN, которые специфически активируют NK-клетки и индуцируют продуцирование интерферона (IFN)- (CpG-ODN класса А). Таким образом, новый иммуностимулирующий ODN настоящего изобретения имеет определенный спектр иммуностимулирующих эффектов, отличающихся от эффектов либо CpG-ODN класса А,либо CpG-ODN класса В. Новый класс иммуностимулирующих ODN настоящего изобретения был назван CpG-ODN типа С. Как будет более подробно описано ниже, в некоторых вариантах ODN настоящего изобретения включают комбинацию мотивов, где одним из мотивов является CG-богатый палиндром или нейтрализующий мотив, а другим мотивом является стимулирующий мотив, например мотив CpG или последовательность TCGTCG. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, имеющей длину в 14-100 нуклеотидов. Эта нуклеиновая кислота имеет формулу: 5'X1DCGHX2-3'. X1 и Х 2 независимо представляют собой любую последовательность длиной от 0 до 10 нуклеотидов. D представляет собой любой нуклеотид, кроме С. С представляет собой цитозин. G представляет собой гуанин. Н представляет собой любой нуклеотид кроме G. Последовательность нуклеиновой кислоты также включает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из Р и N, расположенных непосредственно со стороны 5'-конца по отношению к X1, либо непосредственно со стороны 3'-конца по отношению к Х 2. N представляет собой последовательность, нейтрализующую В-клетки, которая начинается с тринуклеотида CGG и имеет длину по меньшей мере в 10 нуклеотидов. Р представляет собой GC-богатый палиндром, содержащий последовательность, имеющую длину по меньшей мере в 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой 5'-NX1DCGHX2-3', 5'-Х 1DСGНХ 2N-3', 5' -PX1DCGHX2-3', 5'-X1DCGHX2P-3', 5'Х 1DСGНХ 2 РХ 3-3', 5'-X1DCGHPX3-3', 5'-DCGHX2PX3-3', 5'-TCGHX2PX3-3' или 5'-DCGHPX3-3'. X3 представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 10 нуклеотидов. В других вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой 5'-DCGHP-3'. Необязательно D и/или Н представляют собой тимин (Т).-1 007232 В других вариантах осуществления изобретения Н представляет собой Т, а Х 2 представляет собойCG, CGT, CGTT, CGTTT или CGTTTT. В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения Н представляет собой Т, а Х 2 представляет собой CG или CGTTTT. В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения С является неметилированным. В некоторых вариантах осуществления изобретения N включает по меньшей мере четыре динуклеотида CG и не более двух тринуклеотидов CCG. Необязательно Р включает по меньшей мере один инозин. Нуклеиновая кислота может также включать поли-Т-последовательность у 5'-конца или 3'-конца. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте длиной в 13-100 нуклеотидов. Эта нуклеиновая кислота имеет формулу 5'-N1PyGN2P-3'. G представляет собой гуанин.N1 представляет собой любую последовательность длиной в 1-6 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения N1 по меньшей мере на 50% состоит из пиримидинов и предпочтительно по меньшей мере на 50% состоит из Т. В других вариантах изобретения N1 включает по меньшей мере один CG-мотив, по меньшей мере один TCG-мотив, по меньшей мере один CI-мотив, по меньшей мере один TCI-мотив, по меньшей мере один IG-мотив или по меньшей мере один TIG-мотив. В других вариантах осуществления изобретения N1 представляет собой TCGG или TCGH. Н представляет собой любой нуклеотид, кроме G. Ру представляет собой пиримидин. В некоторых вариантах осуществления изобретения Ру представляет собой неметилированный С.N2 представляет собой любую последовательность длиной в 0-30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения N2 по меньшей мере на 50% состоит из пиримидинов или по меньшей мере на 50% состоит из Т. В других вариантах осуществления изобретения N2 не включает ни поли-G-,ни поли-А-мотивов. Р представляет собой GC-богатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения Р является полностью палиндромной. В других вариантах осуществления изобретения Р представляет собой палиндром, имеющий 1-3 последовательно расположенных промежуточных нуклеотидов. Такими необязательными промежуточными нуклеотидами могут быть TG. В других вариантах осуществления изобретения Р включает по меньшей мере 3, 4 или 5 нуклеотидов С и по меньшей мере 3,4 или 5 нуклеотидов G. В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения Р представляет собой по меньшей мере один инозин. В одном из вариантов осуществления изобретения GC-богатый палиндром, в основном по меньшей мере на две трети состоит из G и С. В другом варианте осуществления изобретения GC-богатый палиндром содержит основания, которые по меньшей мере на 81% состоят из G и С. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром имеет длину по меньшей мере в 12 нуклеотидов.GC-богатый палиндром может состоять исключительно из С и G. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром может включать по меньшей мере один нуклеотид, который не является ни С, ни G. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром включает по меньшей мере один тример CGG, по меньшей мере один тример CCG или по меньшей мере один тетрамер CGCG. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром включает по меньшей мере четыре динуклеотида CG. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения GCбогатый палиндром имеет центральный динуклеотид CG. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром представляет собойNO:68) или CGACGTACGTCG (SEQ ID N0:69). В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром не являетсяID NO:34) . В некоторых вариантах осуществления изобретения N1PyGN2 представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT,TTTCGT и TCGTCGT. В соответствии с другими своими вариантами настоящее изобретение относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте длиной в 13-100 нуклеотидов. Эта нуклеиновая кислота имеет формулу: 5'N1PyG/IN2P-3'. G/I представляет собой один нуклеотид, которым является либо G, либо I. G представляет собой гуанин, а I представляет собой инозин.N1 представляет собой любую последовательность длиной в 1-6 нуклеотидов. Ру представляет собой пиримидин. N2 представляет собой любую последовательность длиной в 0-30 нуклеотидов.-2 007232 Р представляет собой палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения Р представляет собой GC-богатый палиндром. В других вариантах осуществления изобретения Р представляет собой IC-богатый палиндром. В некоторых вариантах осуществления изобретения N1PyIN2 представляет собой TCITCITTTT (SEQID NO:47). Описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь остов любого состава. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет остов, полностью резистентный к действию нуклеазы. Такой нуклеазо-резистентный остов может состоять из фосфортиоатных связей. В других вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет полностью фосфодиэфирный остов. В еще одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет химерный остов. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь между CG-, CI- или IG-мотивами. Альтернативно, ODN настоящего изобретения может быть получен вместе с микрочастицами, в виде эмульсии или с применением других средств для предотвращения его быстрого разложения in vivo. Молекулы иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, описанные в настоящей заявке, имеют разные длины. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет длину в 13-100, 13-40, 13-30, 14-100, 14-40 или 14-30 нуклеотидов, либо любую длину,являющуюся промежуточной между вышеуказанными длинами. Настоящее изобретение также относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте, имеющей одну из нижеследующих последовательностей: В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет одну из следующих последовательностей: В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота включает последовательность TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451, SEQ IDNO:11). В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет последовательность TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451). В других своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, и фармацевтически приемлемый носитель. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования экспрессии интерферона типа 1 (IFN). Этот способ предусматривает контактирование клетки, способной экспрессировать IFN типа 1, с эффективным количеством описанной здесь иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты для индуцирования экспрессии IFN типа 1. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способу активации природных киллеров (NK-клеток). Этот способ предусматривает контактирование NK-клеток с эффективным количеством описанной здесь иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты для активации NK-клеток. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения инфекции путем введения индивидууму с развивающейся инфекцией или с риском развития такой инфекции эффективного количества описанной здесь иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в целях лечения или профилактики данной инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный индивидуум инфицирован или подвержен риску инфекции, выбранной из группы, состоящей из вирусной, бактериальной, грибковой или паразитарной инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает отдельное введение иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения для лечения или профилактики данной инфекции. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения в некоторых его вариантах указанный способ, кроме того, предусматривает введение индивидууму антибиотика, который может быть антибактериальным агентом, антивирусным агентом, противогрибковым агентом или антипаразитарным агентом. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способу лечения аллергического состояния путем введения индивидууму, страдающему аллергией или подверженному риску развития такой аллергической реакции, эффективного количества описанной здесь иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в целях лечения или профилактики данного аллергического состояния. В некоторых вариантах осуществления изобретения таким аллергическим состоянием может быть аллергическая астма. В одном из вариантов осуществления изобретения таким аллергическим состоянием является астма. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает введение одной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в целях лечения или профилактики данного аллергического состояния. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения в некоторых его вариантах указанный способ, кроме того, предусматривает введение индивидууму с астмой/аллергией лекарственного средства, например, стероидов, антигистаминных препаратов и индукторов простагландина. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли. Этот способ предусматривает введение данному индивидууму, страдающему злокачественной опухолью или подверженному риску заболевания злокачественной опухолью, эффективного количества описанной здесь иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в целях лечения или профилактики зло-4 007232 качественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание злокачественной опухолью выбрано из группы, состоящей из базально-клеточной карциномы, злокачественной опухоли желчных путей; злокачественной опухоли мочевого пузыря; злокачественной опухоли костей; злокачественной опухоли головного мозга и ЦНС; злокачественной опухоли молочной железы; злокачественной опухоли шейки матки; хориокарциномы; злокачественной опухоли толстой и прямой кишки; злокачественной опухоли соединительной ткани; злокачественной опухоли пищеварительной системы; злокачественной опухоли эндометрия; злокачественной опухоли пищевода; злокачественной опухоли глаза; злокачественной опухоли головы и шеи; злокачественной опухоли желудка; внутриэпителиального новообразования; злокачественной опухоли почек; злокачественной опухоли гортани; лейкоза; злокачественной опухоли печени; злокачественной опухоли легких (например, мелкоклеточного и немелкоклеточного); лимфомы, включая лимфому Ходжкина и неходжинскую лимфому;меланомы; миеломы; нейробластомы; злокачественной опухоли ротовой полости (например, губы, языка, рта и глотки); злокачественной опухоли яичника; злокачественной опухоли поджелудочной железы; злокачественной опухоли предстательной железы; ретинобластомы; рабдомиосаркомы; злокачественной опухоли прямой кишки; злокачественной опухоли почек; злокачественной опухоли дыхательных путей; саркомы; злокачественной опухоли кожи; злокачественной опухоли желудка; злокачественной опухоли яичек; злокачественной опухоли щитовидной железы; злокачественной опухоли матки; злокачественной опухоли системы мочеиспускания и других карцином и сарком. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает введение одной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в целях лечения злокачественной опухоли. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения в его некоторых вариантах указанный способ, кроме того, предусматривает введение данному индивидууму лекарственного средства против злокачественной опухоли или проведение лечения, например химиотерапии, лучевой терапии. Каждое из ограничений настоящего изобретения может включать различные его варианты. Поэтому предполагается, что каждое из таких ограничений настоящего изобретения, включающее любой один элемент или комбинацию элементов, может быть включено в каждый из аспектов настоящего изобретения. Краткое описание графического материала Нижеследующий графический материал представлен лишь в иллюстративных целях и не требуется для понимания или осуществления настоящего изобретения. Фиг. 1 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), индуцированного в человеческих МКПК после их 24-часового культивирования отдельно, в присутствии IL-2 или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях. Фиг. 2 представляет собой гистограмму, где указаны количества МСР-1 (пг/мл), индуцированные в человеческих МКПК после их 24-часового культивирования отдельно, в присутствии IL-2 или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях. Фиг. 3 представляет собой гистограмму, где указаны количества IP-10 (пг/мл), индуцированного в человеческих МКПК после их 24-часового культивирования отдельно, в присутствии IL-2 или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях. Фиг. 4 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), индуцированные в человеческих МКПК после их 48-часового культивирования отдельно (N/A) или в присутствии указанного ODN при 1,0 мкг/мл. Фиг. 5 представляет собой гистограммы, иллюстрирующие поверхностное окрашивание В-клеток на CD86 (MFI) после их 48-часового культивирования отдельно (N/A) или в присутствии указанногоODN при 0,25 мкг/мл (панель А) или при 1,0 мкг/мл (панель В). Фиг. 6 представляет собой гистограммы, где указаны результаты 72-часового анализа на пролиферацию В-клеток (им./мин, включение 3 Н-тимидина), взятых отдельно (N/A) или в присутствии указанного ODN при 0,25 мкг/мл (панель А) или при 1,0 мкг/мл (панель В). Фиг. 7 представляет собой гистограммы, где указаны количества IL-10 (пг/мл), индуцированного в человеческих МКПК после их 24-часового культивирования отдельно (N/A) или в присутствии указанного ODN при 0,25 мкг/мл (панель А) или при 1,0 мкг/мл (панель В). Фиг. 8 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), индуцированного в МКПК, взятых от двух доноров (D127, заштрихованные гистограммы, и D124, незаштрихованные гистограммы) после их 24-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях (1 или 6 мкг/мл). Фиг. 9 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую активацию В-клеток, измеренную по проценту СD86-положительных клеток в человеческих МКПК, культивированных в течение 24-ч отдельно (w/o) или в присутствии указанных концентраций ODN (0,4, 1,0 или 10,0 мкг/мл). Фиг. 10 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК, взятыми от двух доноров (D141, незаштрихованные гистограммы, и D142, заштрихованные гис-5 007232 тограммы) после их 24-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях (1 или 6 мкг/мл). Фиг. 11 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК, взятых от двух доноров (D141, незаштрихованные гистограммы, и D142, заштрихованные гистограммы) после их 48-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях (1 или 6 мкг/мл). Фиг. 12 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК, взятых от двух доноров (D141, заштрихованные гистограммы, и D142, незаштрихованные гистограммы) после их 24-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN при 6 мкг/мл. Фиг. 13 представляет собой серию из трех гистограмм, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК после их 24-часового культивирования отдельно (n/а) или в присутствии указанногоODN в указанных концентрациях (1, 3 или 10 мкг/мл на панелях А, В и С, соответственно). Фиг. 14 представляет собой гистограмму, где указан процент CD3+-клеток, дающих положительную окраску по IFN- после их 48-часового культивирования отдельно (NA) или в присутствии указанногоODN. Фиг. 15 представляет собой гистограмму, где указана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) окрашивания IFN- в Т-клетках после их 48-часового культивирования отдельно (NA) или в присутствии указанного ODN. Фиг. 16 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК, после их 24-часового культивирования отдельно (N/А) или в присутствии указанного ODN при 1,0 мкг/мл. Фиг. 17 представляет собой две гистограммы, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого человеческими МКПК, после их 24- или 48-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN в указанной концентрации (1 или 6 мкг/мл). На панели А представлены результаты для МКПК, взятых от двух доноров и объединенных. На панели В представлены результаты для МКПК,полученных от двух доноров (D141 и D142). Фиг. 18 представляет собой гистограмму, где указан процент СD86-положительных В-клеток после их 24-часового культивирования отдельно (w/o) или в присутствии указанного ODN в указанных концентрациях (0,4 и 1,0 мкг/мл). Фиг. 19 представляет собой серию из трех гистограмм, где указана концентрация IFN- (пг/мл) в супернатантах культуры человеческих МКПК после их инкубирования отдельно (w/o), с ЛПС или с указанными ODN в указанных концентрациях (0,2-1,0 мкг/мл) в течение 6 ч (панель А), 24 ч (панель В) или 48 ч (панель С). Фиг. 20 представляет собой гистограмму, где указано количество IFN- (пг/мл), генерируемого в двухстадийной реакции смешанных лимфоцитов (СКЛ), где лимфоциты, полученные от двух доноров,культивировали в течение 24 ч, либо отдельно (w/o), либо в присутствии указанного ODN при концентрации 6 мкг/мг, а затем смешивали. Фиг. 21 представляет собой серию из трех гистограмм, где указана концентрация IL-10 (пг/мл) в супернатантах культуры человеческих МКПК после их инкубирования отдельно (w/o), с ЛПС или с указанными ODN в указанных концентрациях (0,2-1,0 мкг/мл) в течение 6 ч (панель А), 24 ч (панель В) или 48 ч (панель С). Фиг. 22 представляет собой гистограмму, где указано количество IP-10 (пг/мл) в супернатантах МКПК после их 24-часового инкубирования отдельно (n/a), в присутствии контроля (IL-2, ODN 1585NO:36) или в присутствии различных указанных ODN при 0,6 мкг/мл (незаштрихованные гистограммы),или при 3,0 мкг/мл (заштрихованные гистограммы). Фиг. 23 представляет собой две гистограммы, где указаны количества IFN- (пг/мл) в супернатантах МКПК после их 24-часового инкубирования отдельно (n/a), в присутствии контроля (IL-2, ODN 1585 и ODN 2118) или в присутствии различных указанных ODN при 0,6 мкг/мл (панель А) или при 3,0 мкг/мл(панель В). Фиг. 24 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл) в супернатантах МКПК после их 24-часового инкубирования отдельно (n/a), в присутствии контроля (IL-2, ODN 1585 иODN 2118) или в присутствии различных указанных ODN при 0,6 мкг/мл (незаштрихованные гистограммы) или при 3,0 мкг/мл (заштрихованные гистограммы). Фиг. 25 представляет собой гистограмму, где указаны количества IL-6 (пг/мл) в супернатантах МКПК после их 24-часового инкубирования отдельно (n/a), в присутствии контроля (IL-2, ODN 1585 иODN 2118) или в присутствии различных указанных ODN при 0,6 мкг/мл (незаштрихованные гистограммы) или при 3,0 мкг/мл (заштрихованные гистограммы).-6 007232 Фиг. 26 представляет собой гистограмму, где указаны количества IFN- (пг/мл), секретируемого МКПК после их 24-часового инкубирования отдельно (w/o), или в присутствии указанных ODN в указанных концентрациях (3,0 и 6,0 мкг/мл). Подробное описание изобретения Было обнаружено, что некоторые олигодезоксинуклеотиды (ODN), которые содержат по меньшей мере два различных мотива, обладают уникальным и желательным стимулирующим действием на клетки иммунной системы. Некоторые из этих ODN имеют традиционную "стимулирующую" последовательность CpG и "GC-богатый" или "нейтрализующий В-клетки" мотив. Эти нуклеиновые кислоты с комбинацией мотивов обладают иммуностимулирующими эффектами, которые по своему действию являются промежуточными между эффектами, ассоциированными с традиционными CpG-ODN "класса В", являющимися сильными индукторами активации В-клеток и активации дендритных клеток (DC), и эффектами, ассоциированными с недавно описанными иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами(CpG-ODN "класса А"), являющимися сильными индукторами активации IFN- и природных клетоккиллеров (NK), но относительно слабыми индукторами активации В-клеток и DC (Krieg A.M. et al. (1995)Nature 374:546-9; Ballas Z.K. et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-5; Yamamoto S. et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-6). Предпочтительные CpG-ODN класса В часто имеют фосфортиоатные остовы, а предпочтительные CpG-ODN класса А имеют смешанные или химерные остовы, тогда как иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты нового класса, содержащие комбинацию мотивов, могут иметь стабилизированные, например, фосфортиоатные, химерные или фосфодиэфирные остовы. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, принадлежащим к новому классу иммуностимулирующих нуклеиновых кислот с комбинацией мотивов. Домен, стимулирующий В-клетки, имеет формулу: 5'-X1DCGHX2-3'. D представляет собой любой нуклеотид, кроме С. С представляет собой цитозин. G представляет собой гуанин. Н представляет собой любой нуклеотид, кроме G.X1 и Х 2 представляют собой любую последовательность нуклеиновой кислоты длиной от 0 до 10 нуклеотидов. X1 может включать CG, а в данном случае предпочтительно представляет собой Т, расположенный непосредственно перед указанным CG. В некоторых вариантах осуществления изобретенияDCG представляет собой TCG. X1 предпочтительно имеет длину от 0 до 6 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения Х 2 не содержит ни мотива поли-G, ни мотива поли-А. В других вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет поли-Тпоследовательность у 5'-конца или у 3'-конца. Используемый здесь термин "поли-А" или "поли-Т" означает последовательность из четырех или более смежных нуклеотидов А или Т, соответственно, например, 5'-АААА-3' или 5'-ТТТТ-3'. Используемый здесь термин "поли-G-конец" означает последовательность из четырех или более смежных нуклеотидов G, например 5'-GGGG-3', расположенных у 5'-конца или 3'-конца нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин "поли-G-нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту,имеющую формулу 5'-X1X2GGGX3X4-3', где X1, X2, Х 3 и Х 4 представляют собой нуклеотиды, а предпочтительно по меньшей мере один из Х 3 и Х 4 представляет собой G. В данной формуле некоторые предпочтительные конструкции домена, стимулирующего В-клетки,включают TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT и TCGTCGT. Второй мотив указанной нуклеиновой кислоты представляет собой либо Р, либо N и расположен непосредственно со стороны 5'-конца по отношению к X1, либо непосредственно со стороны 3'-конца по отношению к Х 2.N представляет собой последовательность, нейтрализующую В-клетки, которая начинается с тринуклеотида CGG и имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. Мотив, нейтрализующий В-клетки,включает по меньшей мере одну последовательность CpG, в которой CG расположен после С или передG (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sex., USA, 95:12631-12636), или представляет собой CGсодержащую последовательность ДНК, в которой нуклеотид С мотива CG является метилированным. Используемый здесь термин "CpG" означает 5'-цитозин (С), расположенный перед 3'-гуанином (G) и связанный с ним фосфатной связью. По меньшей мере, нуклеотид С мотива 5'-CG-3' должен быть неметилированным. Нейтрализующие мотивы представляют собой мотивы, которые обладают определенной степенью иммуностимулирующей способности, если они присутствуют в том или ином нестимулирующем мотиве, но которые снижают иммуностимулирующий потенциал других мотивов, если они присутствуют в окружении других иммуностимулирующих мотивов. Р представляет собой GC-богатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов. Используемый здесь термин "палиндром" и эквивалентный термин "палиндромная последовательность" означает инвертированный повтор, т.е. такую последовательность, какABCDEE'D'С'В'А', где А и А', В и В' и т.п. представляют собой основания, способные образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика. Используемый здесь термин "GC-богатый палиндром" означает палиндром, состоящий по меньшей мере на две трети из G и С. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый домен пред-7 007232 почтительно находится со стороны 3'-конца по отношению к "домену, стимулирующему В-клетки". В случае, когда GC-богатый палиндром имеет длину в 10 оснований, то этот палиндром содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае, когда GC-богатый палиндром имеет длину в 12 оснований, то этот палиндром также содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае, когда GC-богатый палиндром имеет длину в 14 оснований, то по меньшей мере десятью основаниями этого палиндрома являются G и С. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром состоит исключительно из G и С. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром, по меньшей мере, на 81 процент состоит из G и С. В случае, когда GC-богатый палиндром имеет длину в 10 оснований, то такой палиндром состоит исключительно из G и С. В случае, когда GC-богатый палиндром имеет длину в 12 оснований, то предпочтительно, чтобы по меньшей мере десятью основаниями (83%) этого палиндрома были G и С. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром длиной в 12 оснований состоит исключительно из G и С. В случае 14-мерного GC-богатого палиндрома по меньшей мере двенадцатью основаниями (86%) этого палиндрома являются G и С. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром длиной в 14 оснований состоит исключительно из G и С. Нуклеотиды С GC-богатого палиндрома могут быть неметилированы, либо они могут быть метилированы. В основном, этот домен имеет по меньшей мере 3 С и G, а более предпочтительно 4 каждого из них,а наиболее предпочтительно 5 или более каждого из них. Число С и G в этом домене необязательно должно быть одинаковым. Предпочтительно, чтобы С и G располагались так, чтобы они были способны образовывать самокомплементарный дуплекс или палиндром, такой как CCGCGCGG. Этот дуплекс может прерываться нуклеотидами А или Т, но предпочтительно, чтобы такая самокомплементарность, по меньшей мере, частично сохранялась, как, например, в мотивах CGACGTTCGTCG (SEQ ID NO:80) илиCGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO:81). Если комплементарность не сохраняется, то предпочтительно,чтобы некомплементарными парами оснований были TG. В предпочтительном варианте осуществления изобретения присутствует не более, чем 3 смежных основания, которые не являются частью палиндрома,предпочтительно, не более, чем 2 основания, а наиболее предпочтительно только 1 основание. В некоторых вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром включает по меньшей мере один тример CGG, по меньшей мере один тример CCG, или по меньшей мере один тетрамер CGCG. В других вариантах осуществления изобретения GC-богатый палиндром не является CCCCCCGGGGGG (SEQ IDID NO:34). По меньшей мере один из G в GC-богатой области может быть заменен инозином (I). В некоторых вариантах осуществления изобретения Р включает более чем один I. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота имеет одну из нижеследующих формул 5'-NX1DCGHX2-3', 5'-X1DCGHX2N-3', 5'-PX1DCGHX2-3', 5'X1DCGHX2P-3', 5'-X1DCGHX2PX3-3', 5'-X1DCGHPX3-3', 5'-DCGHX2PX3-3', 5'-TCGHX2PX3-3', 5'DCGHPX3-3' или 5'-DCGHP-3'. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, определенным формулой: 5'-N1PyGN2P-3'. N1 представляет собой любую последовательность длиной от 1 до 6 нуклеотидов. Ру представляет собой пиримидин. G представляет собой гуанин. N2 представляет собой любую последовательность длиной от 0 до 30 нуклеотидов. Р представляет собой GCбогатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов.N1 может включать CG, и в этом случае Т находится предпочтительно перед этим CG. В некоторых вариантах осуществления изобретения N1PyG представляет собой TCG (такой как ODN 5376, который имеет 5'-TCGG), а наиболее предпочтительно TCGN2, где N2 не является G.N1PyGN2P может включать один или несколько инозиновых (I) нуклеотидов. В N1 либо С, либо G может быть заменен инозином, но CpI является более предпочтительным, чем IpG. В случае инозиновых замен, таких как IpG, оптимальная активность может быть достигнута с использованием "полумягкого" или химерного остова, где связью между IG или CI является фосфодиэфирная связь. N1 может включать по меньшей мере один мотив CI, TCI, IG или TIG. В некоторых вариантах осуществления изобретения N1PyGN2 представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT,TTTCGT и TCGTCGT. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, которые определены формулой: 5'-N1PyG/IN2P-3'. N1 представляет собой любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. Ру представляет собой пиримидин. G/I означает один нуклеотид, которым может быть либо G, либо I. G представляет собой гуанин, а I представляет собой инозин. N2 представляет собой любую последовательность длиной в 0-30 нуклеотидов. Р представляет собой GC или ICбогатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения N1PyIN2 представляет собой TCITCITTTT (SEQ ID-8 007232 Некоторыми из неограничивающих примеров иммуностимулирующих нуклеиновых кислот с комбинацией мотивов, описанных вышеуказанными формулами, являются Используемые здесь термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" являются взаимозаменяемыми и означают множество нуклеотидов (т.е. молекул, содержащих сахар (например рибозу или дезоксирибозу), связанных с фосфатной группой и заменяемым органическим основанием, которое представляет собой либо замещенный пиримидин (например, цитозин (С), тимин (Т) или урацил (U, либо замещенный пурин (например аденин (А) или гуанин (G. Эти используемые здесь термины означают олигорибонуклеотиды, а также олигодезоксирибонуклеотиды (ODN). Эти термины также означают полинуклеозиды (т.е. полинуклеотид без фосфата) и любой другой полимер, содержащий органическое основание. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномной ДНК или кДНК), но предпочтительно они могут быть синтезированными(например, получены методом синтеза нуклеиновых кислот). Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" также охватывают нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с заменами или модификациями, например, в основаниях и/или сахарах. Так, например, они включают нуклеиновые кислоты, имеющие на своем остове сахара, которые ковалентно связаны с низкомолекулярными органическими группами, не являющимися гидроксильной группой в 3'положении и не являющимися фосфатной группой в 5'-положении. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут включать 2'-О-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать сахара, например арабинозу вместо рибозы. Так, например, по составу своего остова нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными, т.е. они могут содержать любую возможную комбинацию связанных друг с другом полимерных звеньев, таких как "пептидные нуклеиновые кислоты" (которые имеют аминокислотный остов, связанный с основаниями нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновые кислоты по составу своего остова являются гомогенными. Нуклеиновые кислоты также включают замещенные пурины и пиримидины, такие как основания, модифицированные С-5-пропином (Wagner R.W. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:840-4). Пуринами и пиримидинами являются, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин,тимидин, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие природные и неприродные нуклеотидные основания, замещенные и незамещенные ароматические группы. Другие такие модификации хорошо известны специалистам. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды настоящего изобретения, в отличие от природных РНК и ДНК, могут содержать различные химические модификации и замены, включая фосфодиэфирный межнуклеозидный мостик, -D-рибозное звено и/или природное нуклеозидное основание (аденин, гуанин,цитозин, тимин, урацил). Примеры химических модификаций известны специалистам и описаны, например, Uhlmann E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs "Synthesis andS.T. et al., (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129Hunziker J. et al. (1995) Mod. Synth. Methods. 7:331-417. Олигонуклеотид настоящего изобретения может содержать одну или несколько модификаций,где каждая модификация локализована в конкретном фосфодиэфирном межнуклеозидном мостике и/или-9 007232 в конкретном -D-рибозном звене и/или в конкретном положении природного нуклеозидного основания,в отличие от олигонуклеотида с той же самой последовательностью, которая состоит из природных ДНК или РНК. Так, например, настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который может содержать одну или несколько модификаций, где каждая модификация независимо выбрана из:b) замены -D-рибозного звена модифицированным сахарным звеном; иc) замены природного нуклеозидного основания модифицированным нуклеозидным основанием. Более подробные примеры химических модификаций олигонуклеотида описаны ниже. Сахаро-фосфатное звено (т.е. -D-рибоза и фосфодиэфирный межнуклеозидный мостик, вместе образующие сахаро-фосфатное звено) в сахаро-фосфатном остове (т.е. в остове, состоящем из сахарофосфатных звеньев) может быть заменено другим звеном, где это другое звено является, например, подходящим для конструирования олигомера "морфолино-производное" (как описано, например, в работеStirchak E.P. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-41), например, путем замены звеном "морфолинопроизводное"; или для конструирования полиамид-нуклеиновой кислоты ("ПНК", как описано NielsenP.E. et al. (1994) Bioconjug Chem. 5:3-7), например, путем замены звеном ПНК-остова, например 2 аминоэтилглицином.-рибозное звено или -D-2'-дезоксирибозное звено может быть заменено модифицированным сахарным звеном, где указанное модифицированное звено выбрано, например, из -D-рибозы, -D-2'дезоксирибозы, L-2'-дезоксирибозы, 2'-F-2'-дезоксирибозы, 2'-О-(C1-С 6)-алкилрибозы, предпочтительно 2'-О-метилрибозы, 2'-O-(С 2-С 6)-алкенилрибозы, 2'-[О-(C1-С 6)-алкил-O-(C1-С 6)-алкил]рибозы, 2'-NH2-2'дезоксирибозы, -D-ксилофуранозы, -арабинофуранозы, 2,4-дидезоксиD-эритрогексопиранозы и карбоциклических аналогов (описанных, например, Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114:8320) и/или аналогов Сахаров с незамкнутой цепью (описанных, например, Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) и/или аналогов бициклосахаров (описанных, например, Tarkov M. et al. (1993) Helv. Chim. Acta 76:481). Природное нуклеозидное основание может быть заменено модифицированным нуклеозидным основанием, где указанное модифицированное нуклеозидное основание выбрано, например, из гипоксантина, урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(C1-С 6)алкилурацила, 5-(С 2-С 6)-алкенилурацила, 5-(С 2-С 6)-алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5 хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(C1-C6)-алкилцитозина, 5-(С 2-С 6)алкенилцитозина, 5-(С 2-С 6)-алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, N2 диметилгуанозина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7 деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина или других модификаций природных нуклеозидных оснований. Этот список приводится лишь в иллюстративных целях и не должен рассматриваться как ограничение изобретения. Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота, стимулирующая иммунную систему" и эквивалентный термин "иммуностимулирующая нуклеиновая кислота" означает молекулу рибонуклеиновой кислоты или дезоксирибонуклеиновой кислоты, ее производное или аналог, характеризующиеся своей способностью индуцировать функциональную активность клетки иммунной системы. Такой функциональной активностью клетки иммунной системы может быть, например, продуцирование цитокина или хемокина, экспрессия маркера клеточной поверхности, секреция антитела, пролиферация или другая активность, продуцируемая в ответ или направленная на антиген или антиген-несущую мембраноассоциированную мишень. Используемые в настоящем изобретении нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы de novo с помощью ряда процедур, хорошо известных специалистам, например Р-цианоэтилфосфорамидитным методом (Beaucage S.L.Caruthers М.Н. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859) и нуклеозид Н-фосфонатным методом (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27:4051-4; Froehler et al. (1986) Nucl. Acid. Res. 14:5399407; Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27:4055-8; Gaffney et. al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:2619-22). Эти химические методы могут быть осуществлены с помощью ряда автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, имеющихся в продаже. Такие нуклеиновые кислоты называют синтетическими нуклеиновыми кислотами. Альтернативно, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть продуцированы в промышленном масштабе в плазмидах (см. Sambrook Т. et al., "Molecular Cloning: ALaboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) и выделены в виде более мелких фрагментов или введены целиком. Нуклеиновые кислоты могут быть получены из существующих последовательностей нуклеиновых кислот (например, из геномной ДНК или кДНК) известными методами, такими как методы с использованием рестриктирующих ферментов, экзонуклеаз или эндонуклеаз. Нуклеиновые кислоты, полученные таким способом, называют выделенными нуклеиновыми кислотами. Выделенной нуклеиновой кислотой обычно называют нуклеиновую кислоту, не содержащую компонентов, с которыми она обычно ассоциируется в природе. В качестве примера можно указать, что выделенной нуклеиновой кислотой может быть нуклеиновая кислота, выделенная из клетки, из ядра, из- 10007232 митохондрий или из хроматина. Нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения, содержащими комбинацию мотивов, являются как синтетические, так и выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие комбинацию мотивов. Для использования in vivo иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, содержащие комбинацию мотивов, могут быть, но необязательно, относительно резистентными к деградации (например, стабилизированными). Термин "стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является относительно резистентной к in vivo-деградации (например, под действием экзонуклеазы или эндонуклеазы). Стабилизация нуклеиновой кислоты может осуществляться с помощью модификации фосфатного остова. Предпочтительные стабилизированные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения имеют модифицированный остов. Было продемонстрировано, что модификация остова нуклеиновой кислоты приводит к усилению активности иммуностимулирующих нуклеиновых кислот с комбинацией мотивов при их введении in vivo. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты с комбинацией мотивов, имеющие фосфортиоатные связи, в некоторых случаях дают максимальную активность и защищают нуклеиновую кислоту от деградации под действием внутриклеточных экзонуклеаз и эндонуклеаз. Другими модифицированными нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, модифицированные фосфодиэфиром; комбинации нуклеиновых кислот, модифицированных фосфодиэфиром и фосфортиоатом (т.е. химерных нуклеиновых кислот); и нуклеиновые кислоты,модифицированные метилфосфонатом, метилфосфортиоатом, фосфордитиоатом, п-этокси и их комбинации. Модифицированные остовы, такие как фосфортиоаты, могут быть синтезированы с использованием автоматизированного оборудования с применением либо фосфорамидатных, либо Н-фосфонатных химических методов. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США 4469863, а алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная группа является алкилированной, как описано в патенте США 5023243 и в заявке на Европатент 092574) могут быть получены методом автоматического твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реагентов. Были описаны методы получения других модификаций и замен в ДНК-остове. Uhlmann E.Peyman A.(1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165. Другими стабилизированными нуклеиновыми кислотами являются неионные ДНК-аналоги, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный кислород фосфоната заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфир и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная группа является алкилированной. Было также показано, что нуклеиновые кислоты, содержащие диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, у одного или у обоих концов являются в основном резистентными к деградации под действием нуклеазы. В других вариантах осуществления изобретения иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут иметь фосфодиэфирные или химерные, например мягкие или полумягкие остовы. Химерный остов включает комбинации фосфодиэфирных и модифицированных каркасных связей. Химерным олигонуклеотидом может быть, например, мягкий олигонуклеотид или полумягкий олигонуклеотид. Мягкий олигонуклеотид представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированный остов, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфирподобные межнуклеозидные связи присутствуют только по меньшей мере в одном внутреннем динуклеотиде "пиримидиновый нуклеозид - гуанозин (YG)", или являются, по меньшей мере, смежным с указанным внутренним динуклеотидом. Этот по меньшей мере один внутренний динуклеотид YG сам имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфирподобную межнуклеозидную связь. Такой фосфодиэфирной или фосфодиэфирподобной межнуклеозидной связью, являющейся непосредственно смежной по меньшей мере с одним внутренним динуклеотидом YG, может быть связь, находящаяся со стороны 5'-, 3'- или и 5'- и 3'-концов по отношению по меньшей мере к одному внутреннему динуклеотиду YG. Предпочтительно фосфодиэфирная или фосфодиэфирподобная межнуклеозидная связь, являющаяся непосредственно смежной по меньшей мере с одним внутренним динуклеотидом YG, сама является внутренней межнуклеозидной связью. Таким образом, для последовательности N1YGN2, где каждый из N1 и N2 независимо представляет любой один нуклеотид; динуклеотид YG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфирподобную межнуклеозидную связь, и кроме того, (a) N1 и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфирподобной межнуклеозидной связью, если N1 представляет собой внутренний нуклеотид, (b) G и N2 связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфирподобной межнуклеозидной связью, если N2 представляет собой внутренний нуклеотид, или (с) N1 и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфирподобной межнуклеозидной связью,если N1 представляет собой внутренний нуклеотид, и G и N2 связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфирподобной межнуклеозидной связью, если N2 представляет собой внутренний нуклеотид. Полумягкий олигонуклеотид представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированный остов, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфирподобные межнуклеозидные связи присутствуют только по меньшей мере в одном внутреннем динуклеотиде "пиримидиновый нуклеозид - гуанозин (YG)". Полумягкие олигонуклеотиды могут иметь ряд преимуществ по сравнению с иммуностимулирующими олигонуклеотидами, имеющими полностью стабилизированные остовы. Так, например, полумягкие олигонуклеотиды, по сравнению с соответствующими полностью- 11007232 стабилизированными иммуностимулирующими олигонуклеотидами, могут обладать повышенной иммуностимулирующей активностью. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть использованы для лечения индивидуума с индуцированием у него иммунного ответа или для лечения иммунопатологического заболевания, такого как злокачественная опухоль или аллергические расстройства. Используемый здесь термин "индивидуум" относится к человеку или позвоночному животному, включая, но не ограничиваясь ими, собак,кошек, лошадей, коров, свиней, овец, коз, кур, обезьян, кроликов, крыс, мышей и т.п. Используемые здесь термины "лечить", "лечение" и "подвергаемый лечению" относятся к профилактическому лечению, которое способствует повышению резистентности индивидуума к развитию заболевания, или, другими словами, способствует снижению вероятности развития или замедлению развития данного заболевания у индивидуума, а также к лечению индивидуума с уже имеющимся заболеванием для борьбы с таким заболеванием, например, для его ослабления или полного излечения, либо для профилактики прогрессирования данного заболевания. Так, например, в случае инфекционного заболевания, эти термины относятся к профилактическому лечению, которое способствует повышению резистентности индивидуума к микроорганизму, или, другими словами, снижению вероятности развития инфекционного заболевания, вызванного данным микроорганизмом, а также к лечению инфицированного индивидуума для борьбы с таким инфекционным заболеванием, например, для его ослабления или полного излечения, либо для профилактики прогрессирования данного заболевания. В случае такого заболевания, как злокачественная опухоль, эти термины относятся к профилактике или к замедлению развития злокачественной опухоли, ослаблению симптомов злокачественной опухоли и/или к ингибированию или замедлению роста развивающейся злокачественной опухоли. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве профилактических средств для индуцирования иммунитета у индивидуума с риском развития у него инфекции, вызванной инфекционным микроорганизмом, или у индивидуума с риском развития у него аллергического расстройства или злокачественной опухоли. Используемый здесь термин "индивидуум с риском заболевания" относится к индивидууму, который подвержен риску заражения вызывающим инфекцию патогеном, к индивидууму, который подвержен воздействию аллергена, или к индивидууму, подверженному риску развития у него злокачественной опухоли. Так, например, индивидуумом с риском заболевания может быть индивидуум, который планирует поездку в регион, где обнаружен конкретный тип инфекционного агента или аллергена, либо им может быть индивидуум, принимающий, по своему образу жизни или по назначению врача, водные процедуры, которые могут содержать инфекционные микроорганизмы,либо им может даже быть любой индивидуум, проживающий в регионе, в котором был идентифицирован инфекционный микроорганизм или аллерген, и индивидуум, подверженный непосредственному воздействию инфекционного агента или аллергена. Таким индивидуумом может быть также индивидуум,подверженный риску поражения биологическим оружием, такой как военный, или индивидуум, живущий в зоне риска террористического акта. Индивидуумами с риском развития инфекции также является основное население, которому медицинские учреждения рекомендуют вакцинацию конкретными инфекционными микроорганизмами-антигенами. Если таким антигеном является аллерген, и у данного индивидуума развиваются аллергические реакции на данный конкретный антиген, а также если такой индивидуум подвержен действию данного антигена, т.е. во время созревания пыльцы, то такой индивидуум имеет риск воздействия на него данного антигена. Индивидуумами с риском развития злокачественной опухоли являются индивидуумы с генетической предрасположенностью к злокачественной опухоли или индивидуумы, прошедшие ранее курс лечения злокачественной опухоли, а также индивидуумы, подверженные воздействию канцерогенов, таких как табак, асбест и других химических токсинов, или подверженные избыточному солнечному излучению или излучению другого типа. Нуклеиновые кислоты могут быть также использованы в качестве терапевтических средств для лечения инфекционного заболевания,злокачественной опухоли и аллергических расстройств. Термин "инфицированный индивидуум" относится к индивидууму, который был подвержен воздействию инфекционного патогена и содержит определенное количество острой или хронической инфекции, вызываемой данным патогеном. Нуклеиновые кислоты могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как антиген или противомикробное лекарственное средство, в целях продуцирования иммунного ответа, способного снижать уровень инфекционного патогена или полностью уничтожать данный инфекционный патоген. Указанный способ предусматривает введение индивидууму, подверженному риску инфекции, эффективного количества иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащей комбинацию мотивов, в целях лечения данной инфекции. Указанный способ может быть использован для лечения вирусных,бактериальных, грибковых и паразитарных инфекций у человека и у позвоночного, отличного от человека. Используемый здесь термин "инфекция" и эквивалентный ему термин "инфекционное заболевание" означает заболевание, возникающее в результате присутствия чужеродного микроорганизма в организме индивидуума. Чужеродным микроорганизмом может быть вирус, бактерия, грибок или паразит.- 12007232 Примерами инфекционных вирусов являются: Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такого как ВИЧ-1 (также обозначаемых HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или ВИЧ-III); и другие изоляты, такие как ВИЧ-LP; Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита А; энтеровирусы,человеческие вирусы Коксаки, риновирусы, ECHO-вирусы); Calciviridae (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирус лошадиного энцефалита, вирусы коревой краснухи);Arenaviridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита В) ; Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (папиломавирусы, полиомавирусы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), герпесвирусы); Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней); и неклассифицированные вирусы (например, этиологические агенты губчатой энцефалопатии, агент, вызывающий гепатит дельта (предположительно представляющий собой дефектный сателлит вируса гепатита В), патогены, вызывающие не-А, не-В гепатит (класс 1 = передается внутренним путем; класс 2 = передается парентерально (т.е. гепатит С); вирусы Норуолк и родственные вирусы,и астровирусы). Примерами инфекционных бактерий являются: Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacteroidespneumophilia, Leptospira, Listeria monocytogenes, Mycobacteria spp. (например, M. tuberculosis, M. avium,M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasturella multocida, pathogenic Campylobacter sp., Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus (anaerobic spp.), Streptococcus (группа viridans), Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В),Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (стрептококки группы А), Treponema pallidium и Treponema pertenue. Примерами инфекционных грибков являются: Candida albicans, Cryptococcus neoformans,Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis и Blastomyces dermatitidis. Другими инфекционными микроорганизмами (т.е. простейшими) являются Plasmodium spp., такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax и Toxoplasmagondii. Вышеуказанные списки вирусов, бактерий, грибков и других инфекционных микроорганизмов приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают настоящего изобретения. Другие важные, с медицинской точки зрения, микроорганизмы широко описаны в литературе, см. например, работу C.G.A.Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain, 1983, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Хотя многие из вышеописанных микробных патогенов ассоциируются с расстройствами у человека, однако настоящее изобретение также может быть использовано для лечения позвоночных, не относящихся к человеку. У этих позвоночных также могут развиваться инфекции, которые могут быть предотвращены или подвергнуты лечению описанными здесь иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами. Так, например, помимо лечения инфекционных заболеваний человека, способы настоящего изобретения могут быть также использованы для лечения инфекций у животных. Инфекционными вирусами как человека, так и других позвоночных являются ретровирусы, РНКвирусы и ДНК-вирусы. Эта группа ретровирусов включает как простые ретровирусы, так и сложные ретровирусы. Простые ретровирусы включают подгруппы ретровирусов типа В, ретровирусов С-типа и ретровирусов D-типа. Примером ретровируса В-типа является мышиный вирус опухоли молочной железы(RSV), вирус лейкоза птиц (ALV) и вирус миелобластоза птиц (AMV, и группу В С-типа (включая вирус лейкоза кошек (FeLV), вирус лейкоза гиббонов (GALV), вирус некроза селезенки (SNV), вирус ретикулоэндотелиоза (RV) и вирус саркомы обезьян (SSV. Ретровирусы D-типа включают обезьяний вирус Мейсона-Пфицера (MPMV) и обезьяний ретровирус типа 1 (SRV-1). Сложные ретровирусы включают подгруппы лентивирусов, вирусов Т-клеточного лейкоза и пенящих вирусов. Лентивирусы включают ВИЧ-1, а также ВИЧ-2, SIV, вирус висны, вирус кошачьего иммунодефицита (FIV) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV). Вирусами Т-клеточного лейкоза являются HTLV-I, HTLV-II, вирус Т- 13007232 клеточного лейкоза обезьян (STLV) и вирус коровьего лейкоза (BLV). Пенящими вирусами являются пенящий вирус человека (HFV), обезьяний пенящий вирус (SFV) и коровий пенящий вирус (BFV). Примерами других РНК-вирусов, которые являются инфекционными агентами у позвоночных животных, являются, но не ограничиваются ими, члены семейства Reoviridae, включая вирусы родаOrthoreovirus (множество серотипов ретровирусов млекопитающих и птиц), вирусы рода Orbivirus (вирус синего языка, вирус Югинанги, вирус Кемерово, вирус африканской болезни лошадей и вирус колорадской клещевой лихорадки), вирусы рода Rotavirus (ротавирус человека, вирус телячьей диареи Небраска,обезьяний ротавирус, коровий или овечий ротавирус, птичий ротавирус); члены семейства Picornaviridae,включая вирусы рода энтеровирусов (полиовирус, вирус Коксаки А и В, энтероцитопатогенные "сиротские" вирусы человека (ЕСНО-вирусы), вирус гепатита А, обезьяньи энтеровирусы, вирусы мышиного энцефаломиелита (ME), мышиный полиовирус, коровьи энтеровирусы, энтеровирусы свиней, вирусы рода Cardiovirus (вирус энцефаломиокардита (ЕМС), вирус Менго), вирусы рода Rhinovirus (человеческие риновирусы, включающие по меньшей мере 113 подтипов; другие риновирусы), вирусы родаApthovirus (вирус ящура (FMDV; члены семейства Calciviridae, включая вирус везикулярной экзантемы свиней, вирус Сан-Мигель морских львов, кошачий пикорнавирус и вирус Норуолк; члены семействаTogaviridae, включая вирус рода Alphavirus (вирус восточного энцефалита лошадей, вирус лесов Семлики, вирус Синдбис, вирус Чикунгунья, вирус о'ньонг-ньонг, вирус реки Росс, вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, вирус западного лошадиного энцефалита), вирус рода Flavivirus (вирус желтой лихорадки, вызываемый москитами, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита СанЛуис, вирус энцефалита долины Муррея, вирус лихорадки западного Нила, вирус Кунджин, вирус центрально-европейского клещевого энцефалита, вирус дальневосточного клещевого энцефалита, вирус кьясанурской лесной болезни, вирус Louping III, вирус Повассан, вирус омской геморрагической лихорадки), вирусы рода Rubivirus (вирус коревой краснухи) , вирусы рода Pestivirus (вирус, вызывающий заболевания слизистых оболочек, вирус холеры свиней, вирус болезни Борде); члены семейства Bunyaviridae,включая вирус рода Bunyvirus (вирусы Буньямвера и родственные вирусы, группа вирусов калифорнийского энцефалита), вирусы рода Phlebovirus (вирус флеботомной сицилийской лихорадки, вирус лихорадки долины Рифт), вирусы рода Nairovirus (вирус Конго-крымской геморрагической лихорадки, вирус болезни Найроби овец) и вирусы рода Uukuvirus (вирус Уукуниеми и родственные вирусы); члены семейства Orthomyxoviridae, включая вирусы рода Influenza (вирус гриппа типа А, множество подтипов вируса человека); вирус гриппа свиней и вирус гриппа птиц и лошадей; вирус гриппа типа В (множество подтипов вируса человека) и вирус гриппа типа С (возможен отдельный род); члены семействаParamyxoviridae, включая вирусы рода Paramyxovirus (вирус парагриппа типа 1, вирус Сендай, вирус гемадсорбции, вирусы парагриппа типа 2-5, вирус ньюкаслской болезни, вирус паротита), вирусы родаMorbillivirus (вирус кори, вирус подострого склерозирующего панэнцефалита, вирус чумы собак, вирус чумы рогатого скота), вирусы рода Pneumovirus (респираторно-синцитиальный вирус (RSV), коровий респираторно-синцитиальный вирус и вирус пневмонии); члены семейства Rhabdoviridae, включая вирусы рода Vesiculovirus (VSV), вирус Чандипура, вирус Фландерс-Харт Парк), вирусы рода Lyssavirus (рабивирус), рабдовирусы рыб и два предполагаемых рабдовируса (вирус Марбурга и вирус Эбола); члены семейства Arenaviridae, включая вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCM), сложный вирус Такарибе и вирус Ласса; члены семейства Coronoaviridae, включая вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус гепатита, кишечный коронавирус человека и вирус кошачьего инфекционного перитонита (кошачий коронавирус). Репрезентативными ДНК-вирусами, которые являются инфекционными агентами у позвоночных животных, являются, но не ограничиваются ими, члены семейства Poxviridae, включая вирусы рода Orthopoxvirus (вирус первичной натуральной оспы, вирус вторичной натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вакцинный вирус, вирус коровьей оспы, вирус оспы буйволов, вирус оспы кроликов, вирус эктромелии), вирусы рода Leporipoxvirus (вирус миксомы, вирус фибромы), вирусы рода Avipoxvirus (вирус оспы домашней птицы, другие вирусы оспы птиц), вирусы рода Capripoxvirus (вирус оспы овец, вирус оспы коз), вирусы рода Suipoxvirus (вирус оспы свиней), вирусы рода Parapoxvirus (вирус контагиозного пустулярного дерматита, коровий псевдопоксвирус, вирус коровьего папулезного стоматита); члены семейства Iridoviridae (вирус африканской лихорадки свиней, лягушачий вирус 2 и 3, вирус лимфоцистоза рыб); члены семейства Herpesviridae, включая альфа-герпесвирусы (вирусы простого герпеса типа 1 и 2, вирус ветряной оспы, вирус, вызывающий выкидыш у лошадей, герпесвирус лошадей 2 и 3, псевдорабивирус, вирус инфекционного коровьего кератоконъюктивита, вирус инфекционного коровьего ринотрахеита, вирус кошачьего ринотрахеита, вирус инфекционного ларинготрахеита), бета-герпесвирусы (человеческий цитомегаловирус и цитомегаловирусы свиней и обезьян); гамма-герпесвирусы (вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус болезни Марека, герпесвирус саймири, герпесвирус, вызывающий ателиоз,герпесвирус Сильвия, вирус герпеса морских свинок, вирус опухоли Люкке); члены семействаAdenoviridae, включая вирусы рода Mastadenovirus (человеческие вирусы подгрупп А, В, С, D, Е и неклассифицированные вирусы; обезьяньи аденовирусы (по меньшей мере 23 серотипа), вирус инфекционного гепатита собак и аденовирусы крупного рогатого скота, свиней, овец, лягушек и множество других видов; вирусы рода Aviadenovirus (аденовирусы птиц) и некультивируемые аденовирусы; члены семейства Papoviridae, включая вирусы рода Papillomavirus (человеческие папилломавирусы, коровьи папал- 14007232 ломавирусы, вирус кроличьей папилломы Шоупа и различные патогенные папилломавирусы других видов); вирусы рода Polyomavirus (полиомавирус, обезьяний вирус вакуолизации (SV-40), кроличий вирус вакуолизации (RKV), вирус К, вирус ВК, вирус JC и другие полиомавирусы приматов, такие как вирус лимфотропной папилломы); члены семейства Parvoviridae, включая вирусы рода аденоассоциированных вирусов, вирусы рода Parvovirus (вирус панлейкопении кошек, коровий парвовирус, собачий парвовирус,вирус болезни алеутских норок, и т.п.). И наконец ДНК-вирусами могут быть вирусы, которые не входят в вышеуказанные семейства вирусов, например, такие как вирус Куру и вирус болезни КрейтцфельдаЯкоба, а также агенты хронической инфекционной нейропатии (CHINA-вирус). Нуклеиновые кислоты могут быть введены индивидууму вместе с антимикробным агентом. Используемый здесь термин "антимикробный агент" означает природное, синтетическое или полусинтетическое соединение, способное уничтожать или подавлять инфекционные микроорганизмы. Тип антимикробного агента, подходящего для использования в настоящем изобретении, зависит от типа микроорганизма, которым инфицирован данный индивидуум или которым рискует быть инфицированным данный индивидуум. Антимикробными агентами являются, но не ограничиваются ими, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты и противопаразитарные агенты. Такие термины,как "противоинфекционный агент", "антибактериальный агент", "противовирусный агент", "противогрибковый агент", "противопаразитарный агент" и "паразитоцид" имеют значения, хорошо известные специалистам и определенные в общедоступной медицинской литературе. Короче говоря, антибактериальными агентами, которые уничтожают или ингибируют бактерии, являются антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, обладающие аналогичными функциями. Антибиотики представляют собой низкомолекулярные соединения, продуцируемые в виде вторичных метаболитов клетками, такими как микроорганизмы. В общих чертах, антибиотики ингибируют одну или несколько бактериальных функций или структур, которые являются специфичными для данного микроорганизма и которые отсутствуют в клетках-хозяевах. Противовирусные агенты могут быть выделены из природных источников или синтезированы, и могут быть использованы для уничтожения или ингибирования вирусов. Противогрибковые агенты используются для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также условно-патогенных и первичных системных грибковых инфекций. Противопаразитарные агенты уничтожают паразитов или ингибируют их функции. Антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют рост или функции бактерий. Большим классом антибактериальных агентов являются антибиотики. Антибиотики, которые являются эффективными для уничтожения или ингибирования бактерий широкого ряда, называются антибиотиками широкого спектра действия. Другими типами антибиотиков являются антибиотики, которые направлены преимущественно против бактерий, принадлежащих к классу грамположительных или грамотрицательных бактерий. Антибиотики такого типа называются антибиотиками узкого спектра действия. Другие типы антибиотиков являются антибиотиками, которые являются эффективными против одного микроорганизма или заболевания, но не являются эффективными против бактерий другого типа, называются антибиотиками ограниченного спектра действия. Антибактериальные агенты иногда классифицируют по их основному механизму действия. В общих чертах, антибактериальными агентами являются ингибиторы синтеза клеточных стенок, ингибиторы синтеза клеточных мембран, ингибиторы синтеза белков, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот или функциональные ингибиторы и конкурентные ингибиторы. Противовирусными агентами являются соединения, предотвращающие инфицирование клеток вирусами или репликацию вируса в этой клетке. В отличие от антибактериальных лекарственных средств,противовирусных лекарственных средств существует гораздо меньше, поскольку процесс репликации вируса настолько тесно ассоциирован с репликацией ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические противовирусные агенты, в большинстве случаев, являются токсичными для данного хозяина. Процесс инфицирования вирусом имеет несколько стадий, которые могут быть блокированы или ингибированы противовирусными агентами. Такими стадиями являются присоединение вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулин или связывающие пептиды), утрата вирусом оболочки (например, амантадин), синтез или трансляция вирусной мРНК (например, интерферон), репликация вирусной РНК или ДНК (например,нуклеозидные аналоги), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеазы) и активная репликация ("бадинг") и высвобождение вируса. Нуклеотидными аналогами являются синтетические соединения, которые аналогичны нуклеотидам,но имеют неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. После включения нуклеотидных аналогов в клетку, они фосфорилируются с образованием трифосфата, который конкурирует с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. После включения трифосфатной формы нуклеотидного аналога в растущую цепь нуклеиновой кислоты происходит необратимое связывание с вирусной полимеразой, в результате чего рост цепи прекращается. Нуклеотидными аналогами являются, но не ограничиваются ими, ацикловир (используемый для лечения заболевания, вызываемого вирусом простого герпеса и ветряной оспы), ганцикловир (используемый для лечения заболевания, вызываемого цитомегаловирусом), идоксуридин, рибавирин (используемый для лечения заболевания, вызываемого респираторно-синцитиальным вирусом), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин и зидовудин- 15007232 Противогрибковые агенты могут быть использованы для лечения и профилактики инфекционных грибковых заболеваний. Противогрибковые агенты иногда классифицируются по механизму их действия. Некоторые противогрибковые агенты функционируют как ингибиторы синтеза клеточной стенки посредством ингибирования глюкозосинтазы. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими,базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые агенты функционируют посредством дестабилизации целостности мембраны. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими, имидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконакол, а также FK 463,амфотерицин В, BAY 38-9502, МК 991, прадимицин, UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые агенты функционируют посредством разрушения хитина (например, хитиназы) или иммуносупрессии (крем 501). Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть использованы отдельно или в комбинации с терапией против злокачественной опухоли для лечения злокачественной опухоли. Этот способ предусматривает введение индивидууму, страдающему злокачественной опухолью или подверженному риску заболевания злокачественной опухолью, эффективного количества иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащей комбинацию мотивов, в целях лечения злокачественной опухоли. Термин "индивидуум, страдающий злокачественной опухолью" относится к индивидууму, у которого были детектированы клетки злокачественной опухоли. Опухоль может быть злокачественной или незлокачественной. Раком или опухолями являются, но не ограничиваются ими, злокачественная опухоль желчных путей; злокачественная опухоль головного мозга; злокачественная опухоль молочной железы; злокачественная опухоль шейки матки; хориокарцинома; злокачественная опухоль толстой кишки; злокачественная опухоль эндометрия, злокачественная опухоль пищевода; злокачественная опухоль желудка; внутриэпителиальное новообразование; лимфомы; злокачественная опухоль печени; злокачественная опухоль легких (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный); меланомы; нейробластомы; злокачественная опухоль ротовой полости; злокачественная опухоль яичника; злокачественная опухоль поджелудочной железы; злокачественная опухоль предстательной железы; злокачественная опухоль прямой кишки; саркомы; злокачественная опухоль кожи; злокачественная опухоль яичек; злокачественная опухоль щитовидной железы; злокачественная опухоль почек, а также другие карциномы и саркомы. В одном из вариантов осуществления изобретения, злокачественной опухолью является лейкозный ретикулоэндотелиоз, хронический миелогенный лейкоз, Т-клеточный лейкоз кожи, множественная миелома,фолликулярная лимфома, злокачественная меланома, плоскоклеточная карцинома, почечно-клеточная карцинома, карцинома предстательной железы, карцинома мочевого пузыря или карцинома толстой кишки. Злокачественная опухоль является одной из главных причин смерти домашних питомцев (т.е. кошек и собак). Злокачественными опухолями, обычно диагностируемыми у собак и кошек, являются, но не ограничиваются ими, лимфосаркома, остеосаркома, опухоли молочной железы, мастоцитома, опухоль головного мозга, меланома, плоскоклеточная аденокарцинома, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез, бронхеолярная аденокарцинома, фиброма, миксохондрома, саркома легких, нейросаркома, остеома, папиллома, ретинобластома, саркома Юинга, опухоль Вильямса, лимфома Беркитта,микроглиома, нейробластома, остеокластома, неоплазия полости рта, фибросаркома, остеосаркома и рабдомиосаркома. Другими новообразованиями у собак являются генитальная плоскоклеточная карцинома,опухоль, передаваемая при половом контакте, опухоль яичек, семинома, опухоль из клеток Сертоли, гемангиоперицитома, гистоцитома, хлорома (гранулоцитарная саркома), папиллома роговицы, плоскоклеточная карцинома роговицы, гемангиосаркома, мезотелиома плевры, базально-клеточная опухоль, тимома, опухоль желудка, карцинома надпочечника, папилломатоз полости рта, гемангиоэндотелиома и цистаденома. Другими злокачественными опухолями, диагностируемыми у кошек, являются фолликулярная лимфома, лимфосаркома кишечника, фибросаркома и плоскоклеточная карцинома легких. Известно, что у хорька, популярного во все времена домашнего животного, развивается инсулинома, лимфома, саркома, нейрома, островково-клеточная опухоль поджелудочной железы, лимфома слизистой желудка(MALT) и аденокарцинома желудка. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть также введены в сочетании с терапией против злокачественной опухоли. Терапия против злокачественной опухоли включает введение лекарственных средств против злокачественной опухоли, лучевую терапию и хирургические операции. Используемый здесь термин "лекарственное средство против злокачественной опухоли" означает агент, который вводят индивидууму для лечения злокачественной опухоли. В настоящей заявке описаны различные типы лекарственных средств для лечения злокачественной опухоли. В целях описания настоящего изобретения лекарственные средства против злокачественной опухоли классифицируются как химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, вакцины против злокачественной опухоли, средства гормональной терапии и модификаторы биологического ответа. Использование иммуностимулирующих нуклеиновых кислот в комбинации с иммунотерапевтическими агентами, такими как моноклональные антитела, может способствовать увеличению продолжительности жизни посредством ряда механизмов, включая значительное усиление антитело-зависимой- 16007232 клеточной цитотоксичности (ADCC), активацию NK-клеток и увеличение уровней IFN-. ADCC может быть достигнута с использованием иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты в комбинации с антителом, специфичным для клеточной мишени, такой как клетка злокачественной опухоли. При введении иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты индивидууму в комбинации с антителом иммунная система этого индивидуума индуцирует гибель опухолевой клетки. Антителами, используемыми в ADCCпроцедуре, являются антитела, которые взаимодействуют с клеткой в организме. Многие такие антитела против клеточных мишеней были описаны в литературе, и многие из них являются коммерчески доступными. Нуклеиновые кислоты при их использовании в комбинации с моноклональными антителами позволяют снижать дозы антитела, необходимые для достижения биологического эффекта. Другими типами химиотерапевтических агентов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются аминоглутетимид; аспарагиназа; бусульфан; карбоплатин; хлоромбуцил; цитрабин-HCl; дактиномицин; даунорубицин-НСl; эстрамустин, фосфат натрия; этопозид (VP16-213); флоксуридин; фторурацил (5-FU); флутамид; гидроксимочевина (гидроксикарбамид); ифосфамид; интерферон альфа-2 а, альфа-2b; ацетат лейпролида (аналог LHRH-рилизинг-фактора); ломустин (CCNU); мехлоретамин-HCl (азотный аналог горчичного газа); меркаптопурин; месна; митотан (o.p.-DDD); митоксантронНСl; октреотид; пликамицин; прокарбазин-HCl; стрептозоцин; цитрат тамоксифена; тиогуанин; тиотепа; сульфат винбластина; амсакрин (м-AMSA); азацитидин; эритропоэтин; гексаметилмеламин (НММ); интерлейкин-2, митогуазон (метил-GAG, бис-гуанилгидразон метилглиоксаля, MGBG); пентостатин (2'дезоксикоформицин); семустин (метил-CCNU); тенипозид (VM-26) и сульфат виндезина. Вакцины против злокачественной опухоли представляют собой лекарственные средства, предназначенные для стимуляции эндогенного иммунного ответа против клеток злокачественной опухоли. Имеющиеся в настоящее время вакцины преимущественно активируют гуморальную иммунную систему(т.е. антителозависимый иммунный ответ). Другие вакцины, находящиеся в настоящее время на стадии разработки, направлены на активацию клеточноопосредованной иммунной системы, включая цитотоксические Т-лимфоциты, способные уничтожать опухолевые клетки. Вакцины против злокачественной опухоли обычно усиливают презентацию антигенов злокачественной опухоли антигенпрезентирующим клеткам (например, макрофагам и дендритным клеткам) и/или другим иммунным клеткам, таким как Тклетки, В-клетки и NK-клетки. В некоторых случаях вакцины против злокачественной опухоли могут быть использованы вместе с адъювантами, такими как адъюванты, описанные выше. Некоторые клетки злокачественной опухоли являются антигенными, а поэтому они могут быть использованы иммунной системой для нацеливания. В одном из аспектов настоящего изобретения комбинированное введение иммуностимулирующих нуклеиновых кислот и лекарственных средств против злокачественной опухоли, а в частности, средств, которые классифицируются как средства иммунотерапии против злокачественной опухоли, может быть использовано для стимуляции специфического иммунного ответа против антигена злокачественной опухоли. Используемые здесь термины "антиген злокачественной опухоли" и "опухолевый антиген" являются взаимозаменяемыми и означают антигены, которые дифференциально экспрессируются клетками злокачественной опухоли, а поэтому они могут быть использованы для нацеливания на клетки злокачественной опухоли. Антигенами злокачественной опухоли являются антигены, которые могут потенциально стимулировать возможные опухольспецифические иммунные ответы. Некоторые из этих антигенов кодируются, но необязательно экспрессируются, нормальными клетками. Эти антигены могут быть охарактеризованы как антигены, которые являются обычно молчащими (т.е. не экспрессируются) в нормальных клетках антигены, которые экспрессируются только на конкретных стадиях дифференцировки, и антигены, которые временно экспрессируются, например,такие как эмбриональные и фетальные антигены. Другие антигены злокачественной опухоли кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активированный онкоген ras) , генысупрессоры (например, мутант р 53) и гибридные белки, образующиеся в результате внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Другие антигены злокачественной опухоли могут кодироваться вирусными генами, например, такие как антигены, присутствующие на опухолевых РНК- и ДНК-вирусах."Опухольассоциированные" антигены присутствуют как в опухолевых, так и в нормальных клетках, но в опухолевых клетках они присутствуют в различных количествах или в различных формах. Примерами таких антигенов являются онкофетальные антигены (например, карциноэмбриональный антиген), антигены, специфичные для дифференцировки клеток (например, антигены Т и Tn), и онкогенные продукты(например, HER/neu). Антигены злокачественной опухоли, такие как антигены, присутствующие в вакцинах против злокачественной опухоли, или антигены, используемые для получения иммунотерапевтических средств против злокачественной опухоли, могут быть получены из неочищенных экстрактов клеток злокачественной опухоли, как описано у Cohen P.A. et al. (1994) Cancer Res. 54:1055-8, или путем частичной очистки антигенов с использованием техники рекомбинантных ДНК, или путем синтеза известных антигенов de novo. Антигены злокачественной опухоли могут быть использованы в форме иммуногенных частей конкретного антигена или, в некоторых случаях, в качестве антигена может быть использована целая клетка или опухолевая масса. Такие антигены могут быть выделены или получены рекомбинантными методами или любыми другими известными методами.- 17007232 Другие вакцины, полученные в форме дендритных клеток, которые были обработаны антигенами злокачественной опухоли in vitro, процессируют антигены и способны экспрессировать антигены злокачественной опухоли на своей поверхности в присутствии молекул МНС для эффективной презентации антигена другим клеткам иммунной системы. Дендритные клетки осуществляют связь между природной и приобретенной иммунной системой путем презентации антигенов и путем экспрессии рецепторов, распознающих эти антигены, которые позволяют детектировать микробные молекулы, такие как ЛПС в их локальном окружении. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты с комбинацией мотивов могут быть использованы для лечения аллергий, включая астму. Для лечения аллергии иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты с комбинацией мотивов могут быть использованы либо отдельно, либо в комбинации с лекарственными средствами против астмы/аллергии. Такой способ предусматривает введение индивидууму,страдающему аллергическими или астматическими состояниями или подверженному риску развития у него таких состояний, эффективного количества иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащей комбинацию мотивов, в целях лечения такого аллергического или астматического состояния. Используемый здесь термин "аллергия" означает приобретенную гиперчувствительность к определенному веществу (аллергену). Аллергическими расстройствами являются экзема, аллергический ринит или острый ринит, сенная лихорадка, бронхиальная астма, крапивница (сыпи) и пищевые аллергии, а также другие атопические нарушения. "Индивидуумом, страдающим аллергией", является индивидуум,который страдает аллергией или который подвержен риску возникновения у него аллергической реакции в ответ на воздействие аллергена. Термин "аллерген" означает вещество, которое может индуцировать аллергический или астматический ответ у восприимчивого индивидуума. Список аллергенов является огромным и может включать пыльцу, яды насекомых, перхоть животных, пыль, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Примерами природных аллергенов животного и растительного происхождения являются белки,специфичные для следующих видов животных и растений: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoid.esalba); Phleum (например, Phleum pratense); Phalaris (например, Phalaris arundinacea); Paspalum (например,Paspalum notatum); Sorghum (например, Sorghum halepensis) и Bromus (например, Bromus inermis). Используемый здесь термин "астма" означает расстройство дыхательной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и повышенной реактивностью дыхательных путей к вдыхаемым агентам. Астма часто, хотя и не всегда, ассоциируется с атопическими или аллергическими симптомами. Используемое здесь "лекарственное средство против астмы/аллергии" представляет собой рассматриваемую композицию, которая ослабляет симптомы, ингибирует астматическую или аллергическую реакцию или предупреждает развитие аллергической или астматической реакции. Различные типы лекарственных средств для лечения астмы и аллергии описаны в руководстве Guideline For The Diagnosisand Management of Asthma, Expert Panel Report 2, NIH Publication No 97/4051, July 19, 1997, которое во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Ниже приводится краткий список лекарственных средств, описанных в публикации NIH. В большинстве вариантов осуществления изобретения лекарственное средство против астмы/аллергии может быть, до некоторой степени, использовано для лечения как астмы, так и аллергии. Некоторые лекарственные средства против астмы/аллергии предпочтительно используются в комбинации с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами для лечения астмы. Такие лекарственные средства называются противоастматическими лекарственными средствами. Противоастматическими лекарственными средствами являются, но не ограничиваются ими, ингибиторы PDE-4, бронходилататор/агонисты бета-2, открыватели К+-каналов, антагонисты VLA-4, антагонисты нейрокинов, ингибиторы синтеза ТХА 2, ксантатины, анатагонисты арахидоновой кислоты, ингибиторы 5-липоксигеназы, антагонисты рецептора тромбоксина А 2, антагонисты тромбоксана А 2, ингибиторы белков, активирующих 5 липоксигеназу, и ингибиторы протеазы.- 18007232 Другие лекарственные средства против астмы/аллергии предпочтительно используются в комбинации с иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами для лечения аллергии. Такие лекарственные средства называются противоаллергическими лекарственными средствами. Противоаллергическими лекарственными средствами являются, но не ограничиваются ими, антигистамины, стероиды, иммуномодуляторы и индукторы простагландина. Антигистамины представляют собой соединения, которые подавляют гистамин, высвобождаемый тучными клетками или базофилами. Эти соединения хорошо известны специалистам и широко используются для лечения аллергии. Антигистаминами являются, но не ограничиваются ими, лоратидин, цетиризин, буклизин, аналоги цетеризина,фексофенадин, терфенадин, деслоратадин, норастемизол, эпинастин, эбастин, астемизол, левокабастин,азеластин, траниласт, терфенадин, мизоластин, бетатастин, CS 560 и HSR 609. Индукторами простагландина являются соединения, индуцирующие активность простагландина. Простагландины функционируют как регуляторы релаксации гладких мышц. Индукторами простагландина являются, но не ограничиваются ими, S-5751. Стероидами являются, но не ограничиваются ими, беклометазон, флутиказон, трамцинозол, будесонид, кортикостероиды и будесонид. Комбинация иммуностимулирующих нуклеиновых кислот и стероидов является особенно подходящей для лечения индивидуумов молодого возраста (например, детей). До настоящего времени использование стероидов для лечения детей было ограничено, и это обусловлено тем, что в некоторых случаях, как сообщалось специалистами, лечение стероидами ассоциируется с замедлением роста у детей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть использованы в комбинации со замедляющими рост стероидами, и, тем самым, можно значительно уменьшить "стероидный эффект". Комбинация этих двух агентов дает возможность снижать требуемые дозы стероидов. Иммуномодуляторами являются, но не ограничиваются ими, иммуномодуляторы группы, состоящей из противовоспалительных агентов, антагонистов лейкотриена, мутеинов IL-4, растворимых рецепторов IL-4, иммуносупрессантов (таких как вакцина, стимулирующая толерантность к пептиду), анти-IL4 антител, антагонистов IL-4, анти-IL-5 антител, гибридных белков "растворимого рецептора IL-13 - Fc",анти-IL-9 антител, антагонистов CCR3, антагонистов CCR5, ингибиторов VLA-4 и негативных регуляторов IgE. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для индуцирования IFN типа 1, т.е. IFN- и IFN-. Этот способ предусматривает контактирование клетки, способной экспрессировать IFN типа 1 с эффективным количеством иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащей комбинацию мотивов, с индуцированием экспрессии IFN типа 1 данными клетками. Недавно было установлено, что главной клеткой-продуцентом IFNу человека является плазмацитоидная дендритная клетка (pDC). Клетки такого типа очень редко встречаются (0,2-0,4%) среди МКПК и характеризуются тем, что они имеют негативный по линии дифференцировки фенотип (т.е. не дает окраску на CD3, CD14, CD19 или CD56) и CD11c-негативный фенотип, но являются позитивными по CD4, CD123 (IL-3R) и по главному комплексу гистосовместимости класса II(МНС класса II). Grouard G. et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1101-11; Rissoan M.C. et al. (1999) Science 283:1183-6; Siegal F.P. et al. (1999) Science 284:1835-7; Cella M. et al. (1999) Nat. Med. 5:919-23. Методы измерения уровня IFN типа 1 хорошо известны специалистам и такими методами являются твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), биоанализ и сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Анализы такого типа могут быть осуществлены с использованием коммерчески доступных реагентов и наборов. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для активации NK-клеток. Этот способ предусматривает контактирование NK-клеток с эффективным количеством иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, содержащей комбинацию мотивов, с активацией NK-клеток. Активация NK-клеток может быть прямой или опосредованной. Опосредованной активацией является индуцирование цитокинов или других факторов, вызывающих последующую активацию NK-клеток. Активация NK-клеток может быть оценена различными методами,включая измерение литической активности, измерение уровня индукции маркеров активации, таких какCD69, и измерение уровня индукции некоторых цитокинов. NK-клетки, помимо присущей им способности спонтанно уничтожать некоторые опухоли-мишени, участвуют в ADCC и являются главными продуцентами IFN-, TNF-, GM-CSF и IL-3. Прототипической NK-чувствительной клеточной мишенью для мышиных NK-клеток является дрожжевая искусственная хромосома (YAC)-1 и тимома, происходящая от мыши, инфицированной штаммом А вируса Молони. Для человеческих NK-клеток стандартной мишенью является К 562, клеточная линия, происходящая от клеточной линии эритролейкоза. В микротитрационных планшетах постоянное число радиоактивно меченных мишеней (например, 51Cr-меченных К 562) инкубируют либо отдельно (спонтанно), либо с детергентом (максимум), либо с различными количествами эффекторных клеток (экспериментальных). Отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням называется отношением Е:Т. Обогащенные активированные NK-клетки обычно являются эффективными при отношениях- 19007232 Е:Т менее, чем 10:1, а нефракционированные МКПК или спленоциты являются эффективными при отношениях Е:Т 100:1 или более. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть также использованы в качестве адъювантов для индуцирования системного иммунного ответа и/или иммунного ответа, продуцируемого в слизистой оболочке. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, содержащие комбинацию мотивов, могут быть введены индивидууму, подвергнутому воздействию антигена, с продуцированием у него усиленного иммунного ответа на данный антиген. Так, например, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты с комбинацией мотивов могут быть использованы в качестве вакцинных адъювантов. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть введены в комбинации с адъювантами,не являющимися нуклеиновыми кислотами. Ненуклеиновокислотным адъювантом является любая молекула или соединение, за исключением описанных здесь иммуностимулирующих нуклеиновых кислот,которые могут стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Ненуклеиновокислотными адъювантами являются, например, адъюванты, которые продуцируют депо-эффект, иммуностимулирующие адъюванты и адъюванты, которые продуцируют депо-эффект и стимулируют иммунную систему. Используемым здесь ненуклеиновокислотым адъювантом для слизистой является адъювант, который не относится к иммуностимулирующей нуклеиновой кислоте и который способен индуцировать иммунный ответ слизистой у индивидуума при обработке поверхности его слизистой адъювантом в комбинации с антигеном. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций в фармацевтически приемлемом носителе. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут быть непосредственно доставлены индивидууму, либо они могут быть введены в комбинации с комплексом для доставки нуклеиновой кислоты. Комплекс для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, ассоциированную с нацеливающим средством (например, связанную с этим средством ионной или ковалентной связью, или инкапсулированную в этом средстве) (например, с молекулой, которая обеспечивает более высокую аффинность связывания с клеткой-мишенью (например, с В-клеточной поверхностью) и/или увеличение поглощения клетками-мишенями). Примерами комплексов для доставки нуклеиновой кислоты являются нуклеиновые кислоты, ассоциированные со стерином (например, с холестерином),липидом (например, с катионным липидом, виросомой или липосомой) или агентами, специфически связывающимися с клеткой-мишенью (например, с лигандом, распознаваемым рецептором клеточной поверхности). Предпочтительными комплексами могут быть комплексы, достаточно стабильные in vivo для предотвращения значительных уровней нуклеиновой кислоты, не связанной с клетками-мишенями перед ее интернализацией этими клетками-мишенями. Однако указанный комплекс может расщепляться в соответствующих условиях внутри клетки, в результате чего нуклеиновая кислота будет высвобождаться в функциональной форме. Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота и/или антиген, и/или другие терапевтические средства могут быть введены отдельно (например, в физиологическом растворе или в буфере) или с использованием любых носителей для доставки, известных специалистам. Так, например, были описаны следующие носители для доставки: кохлеат (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996), эмульсомы (Vancott et al., 1998,Lowell et al. , 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); липосомы (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b), микросферы (Gupta et al., 1998,Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); полимеры(Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); вирусоподобные частицы (Jiang et al., 1999,Leibl et al., 1998). Специалистам известны и другие носители для доставки. Дозы описанных здесь соединений для доставки через слизистую или для местной доставки индивидууму обычно составляют в пределах от 0,1 мкг до 100 мг на одно введение, в зависимости от частоты введения, которое может быть осуществлено ежедневно, раз в неделю или раз в месяц или через другие интервалы времени. В большинстве случаев дозы для введения через слизистую или для местного введения составляют в пределах примерно от 10 мкг до 5 мг на одно введение, а в основном примерно от 100 мкг до 1 мг, где такое введение может быть осуществлено 2-4 раза через промежутки времени в несколько дней или недель. В основном дозы иммуностимулирующего средства составляют в пределах от 1 мкг до 10 мг на одно введение, а в большинстве случаев в пределах от 10 мкг до 1 мг ежедневно или раз в неделю. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки в целях индуцирования у индивидуума ангигенспецифического иммунного ответа, где указанное соединение вводят вместе с антигеном, но не с другим терапевтическим агентом, обычно составляют в 5-10000 раз, а в основном в 10-1000 раз, а в большинстве случаев в 20-100 раз выше, чем эффективная доза для доставки через слизистую,используемую в качестве вакцинного адъюванта или в качестве иммуностимулятора. Дозы описанных здесь соединений для парентеральной доставки в целях индуцирования у индивидуума природного иммунного ответа, либо для усиления ADCC, либо для индуцирования антигенспецифического иммунного- 20007232 ответа при введении иммуностимулирующих нуклеиновых кислот в комбинации с другими терапевтическими агентами или в специальных носителях для доставки обычно составляют примерно от 0,1 мкг до 10 мг на одно введение, в зависимости от схемы введения, которое может быть осуществлено ежедневно,раз в неделю или раз в месяц или через другие интервалы времени. В большинстве случаев парентеральные дозы для таких целей составляют примерно от 10 мкг до 5 мг на одно введение, а в основном примерно от 100 мкг до 1 мг, где такое введение может быть осуществлено 2-4 раза через промежутки времени в несколько дней или недель. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения парентеральные дозы, вводимые в этих целях, могут в 5-10000 раз превышать типичные дозы, описанные выше. Используемый здесь термин "эффективное количество" означает количество, необходимое или достаточное для достижения нужного биологического эффекта. Так, например, эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты для лечения инфекции означает количество, необходимое для лечения данной инфекции. Путем комбинирования с описанными здесь способами и путем выбора конкретного соединения из различных активных соединений с учетом таких важных факторов, как эффективность, относительная доступность, масса тела пациента, тяжесть негативных побочных эффектов и предпочтительная схема введения, может быть разработана эффективная схема профилактического или терапевтического лечения, которое не будет вызывать значительных токсических эффектов, и также будет полностью эффективным для данного конкретного индивидуума. Эффективное количество соединения для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как конкретное заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретно вводимая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, антиген, масса индивидуума или тяжесть его заболевания или состояния. Каждый специалист может опытным путем определить эффективное количество конкретной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и/или антигена и/или другого терапевтического агента без излишнего экспериментирования. Для любого описанного здесь соединения терапевтически эффективное количество может быть сначала определено с использованием животных-моделей. Терапевтически эффективная доза может быть также определена, исходя из данных, полученных для человеческих CpG-олигонуклеотидов, которые были протестированы у человека (были проведены клинические испытания с участием человека) и для соединений, о которых известно, что они обладают аналогичными фармакологическими активностями,например, таких как другие адъюванты слизистой, например LT и другие антигены, используемые для введения в слизистую или для местного введения в целях вакцинирования. Для парентерального введения требуются более высокие дозы. Вводимая доза может быть скорректирована, исходя из относительной биологической доступности и эффективности вводимого соединения. Корректировка дозы для достижения максимальной эффективности методами, описанными выше, и другими известными методами,хорошо известными специалистам, может быть осуществлена любым специалистом. Композиции настоящего изобретения вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые обычно содержат фармацевтически приемлемые концентрации солей, забуферивающих агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов. Для терапевтического использования эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты может быть введено индивидууму любым способом, позволяющим осуществлять системную доставку указанной нуклеиновой кислоты на желаемую поверхность, например слизистую. Введение фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть осуществлено любым способом,известным специалистам. Предпочтительными способами введения являются, но не ограничиваются ими, пероральное введение, внутримышечное введение, интраназальное введение, внутритрахеальное введение, введение путем ингаляции, внутриглазное введение, подъязычное введение, вагинальное и ректальное введение. Для перорального введения соединения (т.е. иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антигены и другие терапевтические агенты) могут быть легко приготовлены путем объединения активного(ных) соединения(й) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными специалистам. С использованием таких носителей можно получать соединения настоящего изобретения в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема индивидуумом, подвергаемым лечению. Фармацевтические препараты для перорального введения могут быть получены в твердом наполнителе путем необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления, если это необходимо, подходящих добавок с получением сердцевины таблеток или драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин,трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий-замещенная карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). Если необходимо, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как структурированный поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Композиции для перорального введения могут быть также получены, но необязательно, в физиологическом растворе или в буферах для нейтрализации внутренней кислотности, либо они могут быть введены без каких-либо носителей.- 21007232 На сердцевину драже наносят подходящие покрытия. Для этих целей могут быть использованы концентрированные растворы Сахаров, которые могут, но необязательно, содержать аравийскую камедь,тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В покрытия таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или для характеризации различных комбинаций доз активных соединений. Фармацевтическими препаратами, которые могут быть использованы для перорального введения,являются пуш-фит-капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметично запаянные капсулы,изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Пуш-фит-капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими агентами,такими как крахмалы, и/или замасливателями, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Помимо этого, могут быть добавлены стабилизаторы. Могут быть также использованы микросферы для перорального введения. Такие микросферы хорошо известны специалистам. Все композиции для перорального введения должны быть приготовлены в дозах, подходящих для такого введения. Для трансбуккального введения композиции могут быть получены в форме таблеток или пастилок,изготовленных стандартным способом. Для введения путем ингаляции соединения настоящего изобретения могут быть легко доставлены в виде аэрозольного спрея, подаваемого из аэрозольной упаковки или ингалятора с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае использования аэрозольной упаковки стандартная лекарственная доза может быть определена с помощью дозирующего клапана, используемого для доставки определенного количества лекарственного средства. Могут быть получены капсулы и картриджи, например, из желатина, используемые для использования в ингаляторе или в инсуффляторе, и содержащие порошкообразную смесь указанного соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал. Если необходима системная доставка соединений, то они могут быть приготовлены в виде композиции для парентерального введения путем инъекции, например, путем инъекции ударной дозы или путем непрерывного вливания. Композиции для инъекции могут быть получены в виде стандартной лекарственной формы, например в ампулах или во флаконах для многократного введения с добавлением консервантов. Эти композиции могут быть также изготовлены в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и они могут содержать технологические агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений, полученных в водорастворимой форме. Кроме того, если это необходимо, то суспензии активных соединений могут быть получены в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящими липофильными растворами или носителями являются жирные масла, такие как кунжутное масло; или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость данной суспензии,такие как натрий-замещенная карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Данная суспензия может также содержать, но необязательно, подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Альтернативно, активные соединения могут быть получены в порошкообразной форме, которая перед ее использованием может быть разведена подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой. Указанные соединения могут быть также приготовлены в виде композиций для ректального или вагинального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, содержащие, например, стандартные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды. Помимо композиций, описанных ранее, данные соединения могут быть также приготовлены в виде депо-препарата. Такие препараты пролонгированного действия могут быть получены с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменных смол, или в виде слаборастворимых производных, например, слаборастворимой соли. Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые или гелевые носители или наполнители. Примерами таких носителей или наполнителей являются, но не ограничиваются ими,карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли. Подходящими формами жидких или твердых фармацевтических препаратов являются, например,водные или физиологические растворы для ингаляций, микроинкапсулированные препараты, препараты в виде кохлеата, препараты, нанесенные на микроскопические золотые частицы, препараты, содержащиеся в липосомах, в ингаляторах и аэрозолях, таблетки для имплантации в кожу, или препараты, высы- 22007232 хаемые на поврежденном участке с проникновением в кожу. Фармацевтическими композициями могут быть также гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытиями, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных соединений, в которых используются стандартные наполнители и добавки и/или вспомогательные вещества, описанные выше, такие как дезинтеграторы, связующие вещества, вещества для нанесения покрытия, вещества, способствующие набуханию, замасливатели, отдушки, подсластители и солюбилизаторы. Указанные фармацевтические композиции являются подходящими для использования в ряде систем для доставки лекарственных средств. Краткий обзор методов доставки лекарственных средств приводится в работе Langer (1990), Science 249:1527-33, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты и, необязательно, другие терапевтические средства и/или антигены могут быть введены per se (в чистом виде), либо в форме фармацевтически приемлемой соли. Если эти соли используются в медицине, то они должны быть фармацевтически приемлемыми, но для получения таких фармацевтически приемлемых солей обычно используются соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми. Такими солями являются, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих кислот: хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной, азотной, фосфорной,малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфоновой, винной, лимонной, метансульфоновой, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфоновой и бензолсульфоновой кислот. Кроме того, такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочно-земельных металлов, таких как натриевые, калиевые или кальциевые соли карбоновых кислот. Подходящими забуферивающими агентами являются уксусная кислота и соль (1-2% мас./об); лимонная кислота и соль (1-3% мас./об.); борная кислота и соль (0,5-2,5% мас./об.) и фосфорная кислота и соль (0,8-2% мас./об.). Подходящими консервантами являются хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимерозал (0,004-0,02% мас./об.). Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат эффективное количество иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и необязательно антигенов и/или других терапевтических агентов, необязательно включенных в фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает одни или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей,разбавителей или веществ, способствующих инкапсуляции, которые являются подходящими для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин "носитель" означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым может быть объединен активный ингредиент для облегчения введения. Компоненты фармацевтических композиций также должны быть такими, чтобы при смешивании с соединениями настоящего изобретения или друг с другом, они не вступали во взаимодействие друг с другом. Для лечения индивидуума может оказаться необходимым введение различных доз в зависимости от активности данного соединения, способа введения, цели иммунизации (т.е. профилактики или терапии),природы и тяжести заболевания, а также от возраста и массы пациента. Введение данной дозы может быть осуществлено путем одноразового введения отдельной стандартной лекарственной формы, либо нескольких дробных лекарственных форм. Обычно для усиления антигенспецифического ответа осуществляют многократное введение доз через определенные интервалы времени, т.е. через несколько недель или месяцев. Другими системами доставки могут быть системы доставки с высвобождением через определенные интервалы времени, с замедленным высвобождением или пролонгированным высвобождением. Такие системы позволяют избежать многократные введения соединений, что представляет значительное удобство для индивидуума и врача. Многие типы таких систем доставки являются доступными и известны специалистам. Такими системами являются системы на основе полимеров, таких как поли(лактидгликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы для вышеуказанных лекарственных средств, содержащих полимеры, описаны, например, в патенте США 5075109. Системами доставки также являются неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включая стеролы, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты, или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; гидрогелевые системы высвобождения; силастические системы; системы на основе пептидов; покрытия из воска; спрессованные таблетки, полученные с использованием стандартных связующих агентов и наполнителей; частично расплавленные имплантаты; и т.п. Конкретными примерами являются, но не ограничиваются ими, (а) эрозивные системы, в которых агент настоящего изобретения содержится внутри матрицы, такие как системы, описанные в патентах США 4452775, 4675189 и 5736152, и (b) диффузные системы, в которых активный компонент высвобождается с регулируемой скоростью из полимера, такого как полимеры, описанные в патентах США 3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того,могут быть использованы системы доставки с применением конструкций, некоторые из которых были адаптированы для имплантации. Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение изобретения. Полное содержание всех указанных работ(включая литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно рассматриваемые заявки), цитируемых в данной заявке, вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Примеры Пример 1. ODN 2395 представляет собой в высокой степени сильный активатор NK-клеток и продуцирования IFN-. Ранее авторами были обнаружены и описаны олигодезоксинуклеотиды (ODN), содержащие нейтрализующие мотивы, которые состоят из повторов последовательности CG, таких как CGCGCG, или в которых CG расположен после С и/или перед G. Эти нейтрализующие мотивы, очевидно, способствуют снижению стимулирующего действия ODN на множество процессов, таких как секреция IL-6, IL-12, IFN-, TNF- и индукция антиген-специфического иммунного ответа (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:12631-6). Во многих случаях присутствие нейтрализующего мотива в олигонуклеотиде вместе со стимулирующим мотивом, очевидно, предотвращает иммунную активацию. Одним из таких ODN, содержащих как стимулирующие, так и нейтрализующие мотивы, является ODN 2136, который имеет последовательность TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO:19). 3'-конец этого ODN содержит достаточно типичный нейтрализующий мотив, CGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO:37), происходящий от 3'-конца ингибирующего ODN 2010 (GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC, SEQ ID NO:38). Неожиданно было обнаружено,что ODN 2136 имеет высокую активность индуцирования литической активности NK-клеток (единиц лизиза, L.U.). Как показано в табл. 1, ODN 2136 при концентрации 3 мкг/мл является фактически более эффективным, чем описанный здесь стандартный стимулирующий В-клетки и NK-клетки фосфортиоатный ODN 2006 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, SEQ ID NO:39), используемый для индуцированияL.U. Еще более неожиданным оказался тот факт, что ODN 2006 индуцировал продуцирование лишь 2396 пг/мл IFN-, тогда как ODN 2136 индуцировал продуцирование 14278 пг/мл (фиг. 1). Этот неожиданный результат показал, что избегать присутствия этой нейтрализующей последовательности нет необходимости. Таблица 1. Человеческие ЛПК, культивированные в течение ночи с различными ODN Однако в попытке объяснить эти наблюдения был создан еще более сильный активатор NK-клеток и индуктор IFN- путем объединения 3'-конца ODN 2136 с 5'-концом ODN 2006. Неожиданно было обнаружено, что полученный ODN 2395 (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEQ ID NO:1) имел приобретенную модификацию в последнем основании на 3'-конце, т.е. вместо С присутствовал G. Это одна замена основания приводила к созданию полного палиндрома длиной в 12 оснований у 3'-конца ODN 2395,тогда как в ODN 2136 такой палиндром имеет длину лишь 10 оснований. В табл. 2 показан другой пример данных, где ODN 2395 является в высокой степени эффективным для индуцирования L.U. NK-клеток по сравнение с большинством других ODN, имеющих полностью фосфотиоатный остов. В этом анализе ODN 2395 был слабее, чем позитивный контроль, ODN 1585, который имеет химерный фосфортиоатный/фосфодиэфирный(ggGGTCAACGTTGAgggggG, SEQ ID N0:35) был описан в опубликованной ранее заявке РСТ WO 01/22990. При низких концентрациях 0,6 мгк/мл, протестированных в этом эксперименте, ODN 2136 не индуцировал L.U. выше фонового уровня 0,03, наблюдаемого в контроле, не содержащего ODN. На фиг. 2 и 3 показан уровень моноцитарного хемотаксического белка (МРС-1) и IFN-индуцибельного белка (IP10), соответственно, в супернатантах от NK-клеточных культур, табл. 2. МСР-1 представляет собой хемокин, который является лигандом для CCR2 и ассоциируется с иммунными ответами Th1- и Th2-типа.IP-10 представляет собой хемокин СХС, который является лигандом для CXCR3 и ассоциируется с Th1 ответами. Loetscher P. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:2986-91. Эти данные показали, что ODN 2395 явля- 25007232 ется относительно сильным индуктором продуцирования IP-10, но он индуцирует лишь средние уровни МСР-1. Таблица 2. Человеческие ЛПК, культивированные в течение ночи с различными ODN Исходя из этих и других данных, авторы пришли к выводу, что последовательность ODN 2395 является в значительной степени сильным активатором NK-клеток и продуцирования IFN-. Пример 2. ODN, родственные ODN 2395, также являются сильными активаторами NK-клеток и продуцирования IFN-. Для того, чтобы определить, может ли палиндром у 3'-конца ODN 2395 играть важную роль в его иммуностимулирующей активности, конструировали и синтезировали дополнительные ODN 2427-2433(SEQ ID NO:2-8). В табл. 3 приводится сравнение способности этих различных ODN активировать L.U.NK. Как было видно из полученных данных, наиболее сильную активность при концентрации 1 мкг/мл обнаруживал ODN 2429 (TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEQ ID NO:4), который индуцировал 2,85L.U. NK-активности. В этом эксперименте ODN 2006 показал очень слабую активность, а все другие протестированные олигонуклеотиды, кроме контрольного ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG,SEQ ID NO:36), который не содержал CG, были эффективнее, чем 2006. Такая активность ODN 2429 была, очевидно, обусловлена тем, что лишь он один содержал палиндром из 12 оснований, хотя этот палиндром отличался от палиндрома, который присутствовал в олигонуклеотиде 2395. ODN 2430(TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG, SEQ ID NO:5), который был вторым из наиболее эффективных ODN при концентрации 1 мкг/мл, имел аналогичную последовательность, за исключением того, что его палиндром был немного короче, т.е. имел длину 10 оснований. Остальные ODN не имели или имели более короткие палиндромные последовательности и индуцировали более низкую активность NK. На фиг. 4 проиллюстрирована способность указанных олигонуклеотидов индуцировать продуцирование IFN- по сравнению с позитивным контролем SOS ODN 2216 (GGGGGACGATCGTCGGGGG,SEQ ID NO:55), 2334 (GGGGGTCGACCGTCGACGTCGAGGGGG, SEQ ID NO:56) и 2336(GGGGGACGACGTCGTCGGGGGGG, SEQ ID N0:57). Все олигонуклеотиды, родственные ODN 2395,индуцировали более высокий уровень продуцирования IFN-, чем ODN 2006, хотя эти уровни были ниже уровней химерного ODN SOS. Ранговый порядок индуцирования экспрессии IFN- был приблизительно аналогичным соответствующему порядку, наблюдаемому для L.U. NK, при этом наиболее сильное действие наблюдалось у ODN 2395 и 2429. Пример 3. Сильное стимулирующее действие на NK-клетки и на продуцирование IFN- не коррелирует с действием на В-клетки Как показано на фиг. 5 А, ODN 2395 и родственные ему олигонуклеотиды, по своей способности индуцировать экспрессию CD86 В-клетками в течение 48 ч, при концентрации 0,25 мкг/мл, были значи- 28007232 тельно слабее, чем ODN 2006 или родственный олигонуклеотид 2397. Как отмечалось авторами ранее,при более высоких концентрациях ODN, таких как 1 мкг/мл, различные ODN имели менее явные отличия(фиг. 5 В). В том же самом эксперименте авторами была также измерена активация В-клеток в анализе на пролиферацию (включение 3 Н-тимидина; фиг. 6). И в этом случае ODN 2006 и ODN 2397 (SEQ IDNO:44) при концентрациях 0,25 мкг/мл были гораздо более эффективными (фиг. 6 А). Однако при более высоких концентрациях олигонуклеотид, родственный ODN 2395, имел аналогичную эффективность(фиг. 6 В). Пример 4. ODN 2395 и родственный ODN являются слабыми индукторами IL-10. Проведенные заявителями предварительные исследования дают основание предположить, что наибольший уровень продуцирования IL-10, который был индуцирован CpG, был получен с использованием В-клеток. Как показано на фиг. 7, экспрессия IL-10 хорошо коррелирует с пролиферацией В-клеток. И снова, ODN 2006 и родственный ему ODN 2397 были самыми эффективными при концентрациях 0,25 мкг/мл. ODN 2395 и родственный ему олигонуклеотид индуцировали меньший уровень продуцированияIL-10 при этих концентрациях. Пример 5. Зависимость иммуностимулирующего эффекта от концентрации. Дополнительные исследования олигонуклеотидов этого класса и их производных проводили с использованием ODN2427-2433 (SEQ ID NO:2-8). Данные для этих ODN представлены на фиг. 8. Эти данные еще раз продемонстрировали, что ODN 2006 обладал очень слабой активностью в качестве индуктора продуцирования IFN- как при концентрации 1, так и при концентрации 6 мкг/мл. Однако ODN 2395 индуцировал значительные количества IFN-, особенно при более низкой концентрации 1 мкг/мл. При этом авторами отмечалось, что в некоторых случаях стимулирующая активность ODN была ниже при более высокой концентрации, такой как 6 мкг/мл, по сравнению с активностью при более низкой концентрации, такой как 1 мкг/мл. В экспериментах, проиллюстрированных на фиг. 8, ODN 2395 был более эффективным при более низкой концентрации, чем при более высокой концентрации, а ODN 2429 был более эффективным при более высокой концентрации. В противоположность общеизвестной кривой обратной зависимости от дозы для фосфортиоатного ODN, в этом эксперименте химерный ODN, такой как 2336, обычно обнаруживал повышенное иммуностимулирующее действие при более высоких концентрациях. Стимулирующий эффект ODN 2432 в данном эксперименте, проиллюстрированный на фиг. 8, особенно интересен тем, что этотODN не имел "хорошего" палиндрома. Эта система с относительно слабой активностью в отношении стимуляции В-клеток показана на фиг. 5 и 6. Пример 6. Обратная зависимость между стимуляцией В-клеток и стимуляций NK-клеток и секрецией IFN-. На фиг. 9 проиллюстрирован другой эксперимент, где ODN 2395 при низкой концентрации, 0,4 мкг/мл, был значительно менее эффективным в отношении индуцирования В-клеточной экспрессииCD86, чем ODN 2006. Другие олигонуклеотиды, родственные 2395, обнаруживали менее заметное снижение уровня стимуляции В-клеток. Интересно отметить, что потеря способности к стимуляции Вклеток предположительно имеет тот же самый ранговый порядок, наблюдаемый ранее для усиления стимуляции NK-клеток: на первом месте стоит ODN 2429, а за ним следует ODN 24 30, и эти олигонуклеотиды являются наиболее слабыми стимуляторами В-клеток среди олигонуклеотидов, родственных 2395. Это объясняется, очевидно, тем, что потеря способности 2395-подобным ODN стимулировать В-клетки тесно связана с его способностью стимулировать NK-клетки и секрецию IFN-. На фиг. 10 и 11 проиллюстрирована индукция IFN- олигонуклеотидами ODN 2395 и ODN 2429, а затем ODN 2430. В табл. 4 и на фиг. 12 в отдельном эксперименте также проиллюстрирована высокая способность ODN 2395 иODN 2429 индуцировать секрецию IFN- у двух различных человеческих доноров (D141 и D142). Таблица 4. Секреция IFN- вариантами ODN 23951 Пример 7. Характеристики GC-богатого домена Неожиданно было обнаружено, что ни один из ODN 5293-5297 не давал сильного иммуностимулирующего ответа. ODN 5293 содержит палиндром из 10 оснований, но этот палиндром отличается от палиндрома 2395 тем, что в нем центральный CG заменен на GC. Однако очевидно, что такая замена сама по себе не объясняет потерю активности, поскольку ODN 2429 также имеет такую инверсию. Точнее,более высокие уровни активности могут наблюдаться с палиндромом из 12 оснований, если в этом палиндроме присутствует центральный CG. Однако ODN 2430 имеет палиндром, также состоящий только из 10 оснований с центральным динуклеотидом GC. Повышенная иммуностимулирующая активностьODN 2430 может быть обусловлена тем фактом, что этот олигонуклеотид содержит пять динуклеотидовCpG у 3'-конца, тогда как ODN 5293 содержит только три таких динуклеотида.ODN 5294 содержит палиндром, состоящий только из 6 оснований, что, вероятно, может объяснять его низкую активность. ODN 5295 также не имеет "хорошего" палиндрома. Низкая активность ODN 5296, вероятно, обусловлена тем, что простых повторов CCG не достаточно, чтобы сообщать иммуностимулирующее действие, подобное действию ODN 23 95. ODN 2397 имеет полный палиндром из 12 оснований у 3'-конца, но он не содержит мотива CpG на своем 5'-конце. Поскольку палиндром из 12 оснований в ODN 5297 является таким же, как и в ODN 2429, то можно сделать вывод, что мотив 5'TCGTCG, содержащийся в ODN 2429, имеет важное значение для его иммуностимулирующей активности. Таким образом, очевидно, что присутствие нейтрализующего палиндрома в ODN 2429 на одном конце олигонуклеотида при отсутствии по меньшей мере одного стимулирующего мотива на другом конце этого олигонуклеотида, является недостаточным для сообщения иммуностимулирующей активности. Пример 8. Влияние на продуцирование IFNДля лучшего понимания диапазона иммуностимулирующего действия иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты этого нового класса было проведено несколько дополнительных анализов различных типов. На фиг. 13 проиллюстрированы некоторые эффекты этих ODN, влияющие на продуцирование IFN- из супернатантов человеческих МКПК. Эти клетки были теми же самыми клетками, которые использовались в экспериментах, проиллюстрированных в табл. 3, но супернатанты от этих культур анализировали на их уровни IFN-. На панели С фиг. 13 показано, что CpG-ODN SOS, такой как ODN 1585,стимулировал продуцирование определенного уровня IFN-, тогда как ODN без мотива CpG (например,контрольный ODN 2118) не обнаруживал такой способности. На панелях А и В фиг. 13 показано, чтоODN 2006 относительно слабо стимулировал продуцирование IFN-, тогда как ODN 2395 и родственные олигонуклеотиды обнаруживали несколько более сильную активность. Для оценки воздействия указанных различных ODN на дендритные клетки была проведена другая серия исследований. Источником IFN-, который продуцировался в ответ на действие ODN 2395 и родственных ему олигонуклеотидов, служили плазмацитоидные DC (pDC). Влияния различных ODN на миелоидные DC (mDC) были относительно одинаковыми в том смысле, что все эти ODN индуцировали способность частично очищенных mDC активировать СD4+-Т-клетки с продуцированием IFN- (фиг. 14 и 15). Миелоидные DC выделяли из лейкоцитарной пленки и инкубировали с GM-CSF (4,4 нг/мл) и с различными ODN в течение 2 дней. Затем CD4+-"необученные" Т-клетки выделяли от другого донора и смешивали с DC при выбранном отношении эффектор:мишень (Е:Т) и инкубировали в течение еще 6 дней. Затем клетки окрашивали и анализировали путем сортировки активированных клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Результаты выражали в процентах CD3+-клеток, которые были окрашены по IFN-. На фиг. 14 показан процент Т-клеток, которые имели IFNположительную окраску, а на фиг. 15 показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) IFNокрашивания в этих Т-клетках. Пример 9. Не все GC-богатые палиндромы являются эффективными. В целях лучшего понимания структурных требований для ODN нового класса было синтезировано несколько дополнительных ODN. Поскольку, как уже отмечалось авторами, сильные иммуностимулирующие ODN содержали GC-богатые палиндромы, то были синтезированы ODN 2449NO:10), содержащие GC-богатые палиндромы, которые имели просто несколько следующих друг за другом G, за которыми следовало несколько С, либо несколько следующих друг за другом С, за которыми