Иммуногенные химерные частицы нвс, обладающие повышенной стабильностью

006207 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области пересечения иммунологии и инженерии белков, а в частности к химерному нуклеокапсидному белку вируса гепатита В (HBV), который был сконструирован как для повышения стабильности самособирающихся частиц, так и для представления иммуногенного эпитопа. Предпосылки создания изобретения Семейство гепаднавирусов представляет собой оболочечные ДНК-солержащие вирусы животных,которые могут вызывать гепатит B у человека (HBV). Семейство гепаднавирусов включает вирусы гепатита В других млекопитающих, например лесного сурка (WHV) и земляной белки (GSHV), и птичьи вирусы, обнаруженные у уток (DHV) и цапель (HeHV). Используемый здесь термин "вирус гепатита В(HBV)" относится к члену семейства гепаднавирусов, если это не оговорено особо в конкретно обсуждаемом примере. Нуклеокапсид или сердцевина (кор) вируса гепатита В млекопитающего (HBV или гепаднавирус) содержит последовательность из 183 или 185 аминокислотных остатков, в зависимости от подтипа вируса, а капсид вируса утки содержит 262 аминокислотных остатка. Мономеры корового белка нескольких вирусов гепатита В, принадлежащих к гепаднавирусам, подвергаются самосборке в инфицированных клетках и образуют стабильные агрегаты, известные как частицы корового белка вируса гепатита В (частицы НВс). Сообщалось, что частицы НВс имеют две трехмерные структуры. Первая структура представляет небольшую популяцию, содержащую 90 копий субъединицы белка НВс в виде димеров или 180 отдельных мономеров белка, а вторая представляет главную популяцию, содержащую 120 копий субъединицы белка НВс в виде димеров или 240 отдельных мономеров белка. Эти частицы обозначаются как частицы Т=4 или Т=3 соответственно, где Т представляет триангуляционное число. Эти частицы НВс вируса, инфицирующего человека (человеческого вируса), имеют диаметр приблизительно 30 или 34 нм соответственно. Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74; и Metzger et al., (1998) J.Gen.Viol. 79:587590. В работе Conway et al., (1997) Nature, 386:91-94, описана структура частиц НВс человека при разрешении в 9 , которая была определена по криоэлектронным микрофотографиям. В работе Bottcher etal., (1997) Nature, 386:88-91, описана полипептидная укладка для мономеров человеческого НВс и представлена приблизительная схема нумерации аминокислотных остатков в альфа-спиральных областях и в областях связанной с ними петли. В работе Zheng et al., (1992), J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429, сообщалось, что образование коровой частицы не зависит от богатого аргинином С-концевого домена, от связывания с нуклеиновыми кислотами или от образования дисульфидных связей, как было подтверждено на основании исследований мутантных белков, не содержащих одного или нескольких цистеинов, и на основании других экспериментов с усеченными по С-концу белками (Birnbaum et al., (1990) J. Virol. 64,3319-3330). Нуклеокапсид или коровый белок вируса гепатита В (НВс) был описан как иммуногенная молекула-носитель, которая стимулирует Т-клеточный ответ у иммунизованного животного-хозяина. См., например, патенты США 4818527, 4882145 и 5143726. Особенно ценным свойством этого носителя является его способность представлять чужеродные или гетерологичные В-клеточные эпитопы в сайте иммунодоминантной петли, которая присутствует в положениях остатков примерно 70-90, а обычно, в положениях примерно 75-85 от аминоконца (N-конца) данного белка. Clarke et al. (1991) F. Brown et al.,eds. Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318. В процессе репликации вируса, нуклеокапсиды HBV ассоциируются с пре-геномом вирусной РНК,с вирусной обратной транскриптазой (Pol) и с концевым белком (происходящим от Pol), в результате чего образуются компетентные по репликации коровые частицы. Ассоциация между этим нуклеокапсидом и пре-геномом вирусной РНК опосредуется аргинин-богатым доменом у карбоксильного конца (Сконца). При экспрессии в гетерологичных экспрессионных системах, таких как E.coli, где пре-геном вирусной РНК отсутствует, протамин-подобный С-конец, т.е. остатки в положениях 150-183, может связываться с РНК E.coli. Zhang et al., (1992) JBC, 267(13), 9422-29. При применении в качестве молекулы-носителя предпочтительно, чтобы эти нуклеокапсиды HBV не связывались с нуклеиновой кислотой данного хозяина. Birnbaum et al., (1990) J.Virol., 64:3319-3330 обнаружили, что протамин-подобный С-концевой домен нуклеокапсидов HBV может быть делетирован,и это не влияет на способность данного белка к сборке вирусоподобных частиц. Так, например, сообщалось, что белки, усеченные примерно до положения 144, т.е. содержащие последовательность НВс в положении примерно 1-144, способны подвергаться самосборке, тогда как делеции, находящиеся за остатком 139, препятствуют сборке капсида [F. BirnbaumМ. Nassal (1990) J. Virl. 64, 3319-30].Zlotnick et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561, изучали сборку полноразмерных и усеченных белков НВс в частицы. Помимо обсуждения полноразмерных молекул, этими авторами было описано получение усеченного белка, который содержит последовательность НВс от положения 1 до положения 149, где цистеины в положениях 48, 61 и 107 были заменены аланинами и где у С-конца был добавлен цистеиновый остаток (положение 150). Для мечения в целях проведения электронной микроскопии был использован С-концевой меркаптан для связывания с кластером, содержащим атом золота.-1 006207 Совсем недавно Metzger et al., (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590, сообщали, что пролин в положении 138 (Pro-138 или Р 138) последовательности человеческого вируса необходим для образования частицы. Эти авторы также сообщали, что способность к сборке частиц, усеченных у карбоксиконца до длины 142 и 140 остатков, была нарушена, а при усечениях до длины 139 и 137 остатков, способность к сборке была полностью утрачена. Несколько групп показали, что усеченные частицы обладали пониженной стабильностью по сравнению со стандартными коровыми частицами вируса гепатита В [Galena et al., (1989) J. Virol., 63:46454652; Inada et al., (1989) Virus. Res., 14:27-48], на что указывала вариабельность размеров частиц и присутствие фрагментов частиц в очищенных препаратах [Maasen et al., (1994) Arch. Virol., 135:131-142]. Таким образом, еще до сообщения Metzger et al. (см.выше), Pumpens et al., (1995), Intervirology, 38:63-74,представили краткий обзор сообщений, где указывалось, что карбоксиконцевая граница для последовательностей НВс, необходимая для их самосборки, локализована между аминокислотными остатками 139 и 144, и что первые два или три аминокислотных остатка могут быть заменены другими последовательностями, однако удаление четырех или одиннадцати аминоконцевых остатков приводит к полному исчезновению химерного белка в трансформированных клетках E.coli. Neirynck et al., (October 1999) NatureMed., 5(10):1157-1163, сообщали, что образование частицы происходит в результате экспрессии в E.coli НВс-химеры, содержащей N-концевую часть из 24 остатков белка М 2 вируса гриппа, присоединенную к НВс у остатка 5. Рекомбинантно продуцируемые гибридные частицы НВс, несущие внутренние вставки (называемые в литературе химерными НВс-частицами или НВс-химерами), содержащие различные встроенные полипептидные последовательности, были получены путем гетерологичной экспрессии в организмах широкого ряда, включая E.coli, B.subtilis, Vaccinia, Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae. См. например работу Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74 и указанные в ней ссылки, относящиеся к работам, проведенным несколькими группами исследователей. Как описано выше, Pumpens и др. представили список химер, образующих частицы, в которых встроенная полипептидная последовательность расположена у N-конца, у С-конца и между этими концами. В этой статье сообщалось, что длины вставок составляют 24-50 остатков у N-конца, 7-43 внутренних остатков и 11-741 остатков у С-конца.Kratz et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920, недавно описали экспрессию в E.coli химерных частиц НВс, состоящих из усеченной последовательности НВс, внутренне слитой с белком,состоящим из 238 остатков и флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра (GFP). Эта химера содержала встроенную последовательность GFP, фланкированную парой богатых глицином гибких линкерных"плечей", заменяющих аминокислотные остатки 79 и 80 в НВс. Указывается, что эти частицы эффективно индуцируют выработку антител против нативного GFP у кроликов, используемых в качестве животных-хозяев. В патенте США 5990085 описаны два гибридных белка, образованных из антигенного бычьего пептида ингибина, слитого (i) с иммуногенной петлей между остатками 78 и 79 и (ii) с карбоксиконцевой усеченной НВс после остатка 144. Указывается, что экспрессированные гибридные белки, при их введении животному-хозяину, индуцируют выработку антител против ингибина. Сообщалось, что через тридцать дней после иммунизации титры у пациентов являются относительно низкими, например 1:3000-15000 для гибридного белка со вставкой в петлю и 1:100-125 для вставки после остатка 144. Очевидно, что химерные коровые частицы гепатита В, несущие внутренние вставки, часто имеют менее упорядоченную структуру по сравнению с частицами, у которых отсутствуют гетерологичные эпитопы, на что указывал анализ, проведенный с помощью электронной микроскопии [Schodel et al.,(1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. В некоторых случаях, инсерция гетерологичных эпитопов в усеченные по С-концу частицы НВс оказывает такое сильное дестабилизирующее действие, что гибридные частицы не могут быть выделены после гетерологичной экспрессии. [Schodel et al., (1994) Infect. Immunol.,62:1669-1676]. Таким образом, многие химерные частицы НВс являются настолько нестабильными, что в процессе очистки они разлагаются до такой степени, что становятся невыделяемыми, либо отличаются очень плохой стабильностью, что делает проблематичным их использование для разработки вакцин. Сохранение структурной особенности, а значит и стабильности полноразмерных частиц НВс, при утрате способности к связыванию этих полноразмерных частиц НВс с нуклеиновой кислотой могло бы быть в высокой степени благоприятным фактором при разработке вакцины, где в качестве системы доставки используется гепаднавирусный нуклеокапсид. Действительно, Urlich и др. в своем недавно опубликованном обзоре по использованию НВс-химер в качестве носителей для чужеродных эпитопов [Adv.Virus Res., vol. 50 (1998) Academic Press pages 141-182] указывают на три потенциальных проблемы, которые должны быть решены при использовании этих химер в человеческих вакцинах. Первая потенциальная проблема связана с неумышленным переносом нуклеиновых кислот, присутствующих в химерной вакцине, иммунизованному хозяину. Вторая потенциальная проблема связана с определенными препятствиями, возникающими из-за уже присутствующего иммунитета к НВс. Третья потенциальная проблема связана с требованиями воспроизводимости в получении интактных химерных частиц, которые можно было бы также хранить в течение длительного периода времени.-2 006207 Как будет описано ниже, настоящее изобретение дает одно решение этих проблем, обеспечивая стабильность НВс-химеры, а также, в основном, отсутствие способности полученной конструкции связываться с нуклеиновой кислотой, при этом данная конструкция представляет собой в высокой степени иммуногенный материал. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку нуклеокапсида гепаднавируса, то есть к химерному белку кора вируса гепатита В (НВс) [или к молекуле корового белка вируса гепатита В или к химерной молекуле НВс или просто химере], который, после его экспрессии в клетке-хозяине, подвергается самосборке с образованием частицы. Этот химерный белок (i) представляет один или несколько иммуногенных эпитопов на N-конце, в иммунногенной петле НВс или на С-конце, либо (ii) он имеет гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа в иммуногенной петле и содержит цистеиновый остаток в С-конце или вблизи С-конца, который сообщает повышенную стабильность этим частицам. Указанный химерный белок имеет достаточно мало аргининовых остатков, так что эти самособирающиеся частицы не связываются с нуклеиновой кислотой. Настоящее изобретение также относится к иммуногенной частице, состоящей из молекул рекомбинантного химерного белка кора вируса гепатита В (НВс). Этот химерный белок (i) представляет один или несколько иммуногенных эпитопов на N-конце, в иммунногенной петле НВс или на С-конце, либо (ii) он имеет гетерологический линкерный остаток для конъюгированного эпитопа в иммуногенной петле. Этот рекомбинантный белок содержит цистеиновый остаток в С-конце или вблизи С-конца. Указанные частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и обладают повышенной стабильностью по сравнению с частицами, состоящими из каких-либо других идентичных белков, не содержащих цистеиновый остаток. В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к молекуле рекомбинантного корового белка вируса гепатита В (НВс), имеющей длину примерно вплоть до 515 аминокислотных остатков, где указанная молекула(a) содержит (i) последовательность из, по крайней мере, примерно 130 остатков N-концевых 150 аминокислотных остатков молекулы НВс, включая гетерологичный эпитоп, ковалентно связанный пептидной связью, или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа, присутствующий в иммунодоминантной петле НВс, или (ii) последовательность, по крайней мере, примерно из 135 остатков N-концевых 150 аминокислотных остатков НВс;(b) содержит от одного до десяти, а более предпочтительно от одного до трех цистеиновых остатков, расположенных в направлении к С-концу данной молекулы от С-концевого остатка присутствующей последовательности НВс и в пределах примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы [Сконцевой(ые) цистеиновый(ые) остаток(ки)], и(c) содержит последовательность по крайней мере из пяти аминокислотных остатков от положения 135 последовательности НВс до С-конца НВс. Рассматриваемые химерные молекулы (i) содержат не более чем 20 % замененных аминокислотных остатков в последовательности НВс и (ii) подвергаются самосборке после экспрессии в клетке-хозяине с образованием частиц, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами. Эти частицы, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, которая не содержит вышеуказанного Сконцевого цистеинового остатка(ов), или в которой С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен в этой молекуле другим остатком, таким как аланиновый остаток. В одном из аспектов настоящего изобретения, рассматриваемая НВс-химера имеет последовательность из примерно от 135 до 515 аминокислотных остатков и содержит четыре последовательно расположенных и связанных пептидной связью доменов, которые обозначены доменами I, II, III и IV. Начиная с N-конца, домен I содержит примерно от 71 до 100 аминокислотных остатков, последовательность которого включает, по крайней мере, последовательность остатков примерно от положения 5 до положения 75 НВс, и необязательно включает гетерологичный эпитоп, содержащий примерно до 30 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с одним из остатков 1-4 НВс. Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с остатком 75 НВс домена I, в котором (i) от нуля до всех остатков, а предпочтительно по крайней мере 4 остатка в положениях 76-85 последовательности НВс связаны пептидной связью примерно с 1-245 аминокислотными остатками, которые являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс и составляют гетерологичный эпитоп, такой как В-клеточный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как Вклеточный эпитоп, или (ii) последовательность НВс в положениях 76-85 не имеет гетерологичных остатков. Домен III представляет собой последовательность НВс от положения 86 до положения 135, связанную пептидной связью с остатком 85 домена II. Домен IV содержит (i) от нуля до четырнадцати остатков аминокислотной последовательности НВс от положения 136 до положения 149, связанных пептидной связью с остатком в положении 135 домена III, (ii) от одного до десяти, а более предпочтительно, от одного до трех цистеиновых остатков, связанных пептидной связью у С-конца с последовательностью НВс[С-концевой(ые) цистеиновый(ые) остаток(ки)], и (iii) от нуля до примерно 100, более предпочтительно-3 006207 от нуля до примерно 50, а наиболее предпочтительно примерно 25 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, от положения 150 до С-конца, при условии, что указанный домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, включая вышеуказанные от одного до десяти цистеиновых остатков (ii). Рассматриваемый рекомбинантный химерный белок образует частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем частицы, образованные из НВс-химеры, содержащей те же самые связанные пептидной связью последовательности доменов I, II иIII и последовательность домена IV, которая по существу, является той же самой, но в которых отсутствуют какие-либо цистеиновые остатки, или в которой цистеиновый остаток заменен другим остатком,таким как аланиновый остаток. При сборке химерных молекул в частицы, эти частицы имеют отношение оптической плотности при 280-260 нм (отношение оптической плотности 280/260), равное примерно 1,21,7. Образованные частицы, вероятно, имеют структуру Т=4, содержащую 240 мономерных НВс-химер или 120 димерных НВс-химер. В более широком смысле, рассматриваемая химерная частица содержит С-концевой усеченный белок НВс (по крайней мере, до остатка 149), который содержит гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа в иммунодоминантной петле, или непрерываемую иммунодоминантную петлю, и независимо от последовательности аминокислотных остатков иммунодоминантной петли, от одного до трех С-концевых цистеиновых остатков, гетерологичных по отношению к последовательности НВс. Такая частица имеет отношение оптической плотности при 280/260, равное примерно 1,2-1,7 и является более стабильной, чем частица, образованная из какой-либо другой идентичной НВсхимеры, в которой отсутствует вышеуказанный С-концевой цистеиновый остаток (остатки), или в которой единственный С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен другим остатком. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к инокуляту или вакцине, которые содержат вышеуказанную химерную НВс-частицу или конъюгат гаптена с вышеуказанной НВс-химерной частицей, растворенные или диспергируемые в фармацевтически приемлемом составе разбавителей, который обычно также содержит воду. При введении иммуногенно эффективного количества инокулята животному, такому как млекопитающее или птица, этот инокулят (i) индуцирует образование антител,которые вступают в специфическую иммунную реакцию с химерной частицей или с конъюгированным с ней гаптеном (связанным через боковую группу) или (ii) активирует Т-клетки, или (iii) и то и другое. Эти индуцированные таким образом антитела также предпочтительно вступают в специфическую иммунную реакцию (связываются) с антигеном, содержащим гаптен, таким как белок, где указанный гаптен является пептидом, или сахарид, где гаптен является олигосахаридом. Настоящее изобретение имеет несколько благоприятных эффектов и преимуществ. Один из таких благоприятных эффектов настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные частицы НВс являются более стабильными при хранении в водных композициях, чем частицы с похожей последовательностью, в которой отсутствуют какие-либо С-концевые цистеиновые остатки. Преимуществом настоящего изобретения является то, что полученные химерные молекулы обладают такой же способностью к самосборке, как и нативные частицы НВс, но при этом они не связываются с нуклеиновой кислотой как нативные частицы. Другой благоприятный эффект настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные молекулы обладают превосходной В-клеточной и Т-клеточной иммуногенностью. Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что химерные частицы настоящего изобретения обычно получают с более высоким выходом, чем аналогичные частицы, не содержащие Сконцевого цистеинового остатка. Другой благоприятный эффект настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные частицы в большинстве случаев являются значительно более иммуногенными, чем аналогичные конъюгаты, не содержащие С-концевого цистеинового остатка. Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что иммуногенности частиц, собранных из химерных молекул, содержащих по крайней мере один С-концевой цистеиновый остаток, являются более высокими, чем иммуногенность аналогичных частиц, собранных из химерных молекул, не содержащих по крайней мере одного С-концевого цистеинового остатка. Другие благоприятные эффекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны каждому специалисту из нижеследующего описания изобретения. Краткое описание графического материала Графический материал составляет часть описания настоящего изобретения. На фиг. 1 показаны модификации, внесенные в коммерчески доступный плазмидный вектор рКК 223-3 при получении плазмидного вектора pKK223-3N, используемого в настоящем изобретении для получения некоторых рекомбинантных НВс-химер. Модифицированная последовательность (SEQ IDNO:285) показана ниже последовательности коммерчески доступного вектора (SEQ ID NO:286). Основания добавленного NcoI-сайта показаны строчными буквами, где все добавленные основания подчеркну-4 006207 ты двойными линиями, а делегированные основания показаны пунктиром. Показаны два рестрикционных сайта, присутствующие в этом сегменте последовательности (NcoI и HindIII). На фиг. 2 на трех панелях фиг. 2 А, 2 В и 2 С схематически проиллюстрирована предпочтительная стратегия клонирования, в которой В-клеточный эпитоп вируса малярии, такой как (NANP)4 (SEQ IDN0:l), клонируют в EcoRI- и SасI-сайты сконструированного гена НВс (фиг. 2 А) между положениями остатков 78 и 79, что приводит к разрушению EcoRl-сайта, но к сохранению Sad-сайта. На фиг. 2 В показана ДНК, которая кодирует Т-клеточный эпитоп, такой как эпитоп, обозначенный Pf/CS-UTC, и стопкодон (SEQ ID NO:120), клонированный в EcoRI- и HindIII-сайты у С-конца сконструированного усеченного гена НВс, содержащего первые 149 остатков НВс (НВс 149). ПЦР-амплификация конструкции фиг. 2 В с использованием праймера, имеющего 5'-концевой рестрикционный Sacl-сайт, смежный с НВскодирующей последовательностью, начинающейся в положении остатка 79; расщепление амплифицированной последовательности и конструкции фиг. 2 А ферментом SacI; и последующее лигирование соответствующих частей, как показано на фиг. 2 С, приводят к образованию единственной генной конструкции, называемой далее V12, которая кодирует В-клеточные и Т-клеточные эпитопы иммуногена, используемого для вакцины против Р. falciparum. На фиг. 3 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа в восстанавливающих условиях для иллюстрации стабилизирующего действия на экспрессированные частицы кодона для единственного цистеинового остатка, встроенного с сохранением рамки считывания между С-концевым кодоном (V149) и стоп-кодоном НВс в химере, которая также содержит (NANP)4, встроенный между аминокислотами в положениях 78 и 79 (V2.Pf1+C), и по сравнению с аналогичной конструкцией, С-конец которой представляет остаток V149 (V2.Pf1) на день 0 и через 15 дней при 37 С. [дорожка 1, V2.Pf1 - день 0; дорожка 2, V2.Pf1 - день 15 при 37 С; дорожка 3, V2.Pf1+C, день 0; дорожка 4, V2.Pf1+C - день 15 при 37 С]. На фиг. 4 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа в восстанавливающих условиях для иллюстрации стабилизирующих действий на химерные частицы НВс 149, содержащие (NANP)4, встроенный между аминокислотами положений 78 и 79 и цистеин-содержащим Т-клеточным эпитопом, слитым с Сконцом (V2.Pf1+Pf/CS-UTC, обозначаемым также V12.Pf1), по сравнению со схожей частицей, в которой С-концевой Сys заменен остатком А 1 а [V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A), обозначаемый также V12.Pf1(C17A) на день 0 и через 28 дней при 37 С. [дорожка 1, V2.Pf1+Pf/CS-UTC -день 0; дорожка 2, V2.Pf1+Pf/CSUTC - день 28 при 37 С; дорожка 3, V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)] - день 0; дорожка 4, V2.Pf1+Pf/CSUTC(C17A) - день 28 при 37 С]. На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий результаты непрямого иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), осуществляемого с использованием фиксированных глутаральдегидом спорозоитов Р. falciparum и ФИТЦ-меченных антимышиных IgG (специфичных к гамма-цепи) для детекции титров связанного антитела (log 1/разведение; ордината) в зависимости от времени (недели) (абцисса) для трех химерных иммуногенов после иммунизации мышей. Данные для известного химерного иммуногена, CS2, показаны квадратами; данные для рекомбинантной НВс-химеры V12.Pf1 показаны ромбами, а данные для рекомбинантной НВс-химеры V12.Pf3.1 показаны треугольниками. На фиг. 6 проиллюстрирована реакционная схема (схема 1), на которой показаны две последовательности реакций: (I) реакцию образования активированного носителя для связывания гаптена через боковую цепь с частицей вируса гепатита В, содержащей химерный коровый белок (sm-HBc), где эту реакцию проводят с использованием 1-карбоксилата сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексана (сульфо-SMCC), а затем (II) реакцию связывания сульфгидрил-терминированного (цистеинтерминированного) гаптена с активированным носителем с образованием частицы конъюгата. Частицаsm-HBc обозначена рамкой, имеющей единственную боковую аминогруппу (для более ясной иллюстрации этой схемы), а сульфгидрил-терминированный гаптен обозначен линией, оканчивающейся группойSH. На фиг. 7 на двух панелях фиг. 7 А и 7 В проиллюстрировано сопоставление шести опубликованных последовательностей аминокислотных остатков для белков НВс от шести вирусов млекопитающих. Первая последовательность (SEQ ID NO: 247) представляет собой последовательность человеческого вируса,подтипа ayw, и опубликована в работе Galibert et al. (1983) Nature, 281:646-650; вторая последовательность (SEQ ID NO:248) представляет собой последовательность человеческого вируса подтипа adw и опубликована в работе Оnо et al., (1983) Nucleic Acids Res., 11(6):1747-1757; третья последовательность(SEQ ID NO:249) представляет собой последовательность человеческого вируса подтипа adw2 и опубликована в работе Valenzuela et al., Animal Virus Genetics, Field et al., eds., Academic Press, New York (1980)pages 57-70; четвертая последовательность (SEQ ID NO:250) представляет собой последовательность человеческого вируса, подтипа adyw и опубликована в работе Pasek et al., (1979) Nature, 282:575-579; пятая последовательность (SEQ ID NO:251) представляет собой последовательность вируса лесного сурка и опубликована в работе Galibert et al. (1982) J.Virol. 41:51-65; а шестая последовательность млекопитающего (SEQ ID NO:246) и представляет собой последовательность вируса суслика и опубликована в работе Seeger et al. (1984) J.Virol., 51:367-375. На фиг. 8 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа, проведенного в восстанавливающих условиях после инкубирования при 37 С в дни 0, 1 и 2, где проиллюстрировано стабилизирующее действие-5 006207 на (1) на химерные частицы НВс 149, содержащие иммуногенную последовательность (NANP)4 P. falciparum, встроенную между аминокислотными остатками 78 и 79 НВс, которая также содержит карбоксиконцевой универсальный Т-клеточный эпитоп Р. falciparum, связанный пептидной связью с положением 149 НВс [UTC; V12.Pf1=V2.Pf1 + Pf/CS-UTC], и (2) на сходные частицы, в которых цистеин в положении 17 UTC был заменен аланиновым остатком, и был добавлен цистеиновый остаток в положении 150 между остатком НВс в положении 149 и началом UTC [V12.Pf1(C17A)+C150]. На фиг. 9 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа, который был проведен в восстанавливающих условиях после получения частицы, и который показал, что мономерная конструкция ICC-1438 является нестабильной (дорожка 2) по сравнению с конструкцией ICC-1492 (дорожка 3), при этом, НВс 149 (дорожка 1), ICC-1475 (дорожка 4) и ICC-1473 (дорожка 5) служат в качестве дополнительного контроля молекулярной массы. Определения Цифры, используемые вместе с НВс-химерами, указывают на положения в последовательности аминокислотных остатков ayw НВс SEQ ID NO: 247, где к этой последовательности добавлены один или несколько остатков, независимо от того, имеются ли в этой последовательности аминокислотных остатков добавления или делеции. Таким образом, НВс 149 означает, что химера заканчивается в положении 149, а НВс 149+С 150 означает, что та же самая химера содержит цистеиновый остаток в положении 150 НВс. С другой стороны, универсальный Т-клеточный эпитоп малярийного белка CS (UTC) имеет длину в 20 остатков, а эпитоп, где цистеин в положении 17 этой последовательности был заменен аланином, обозначен CS-UTC(C17A). Термин "антитело" означает молекулу, которая является членом семейства гликозилированных белков, называемых иммуноглобулинами, и которая может специфически связываться с антигеном. Термин "антиген" исторически используется для обозначения молекулы, которая связывается с антителом или рецептором, а также для обозначения молекулы, индуцирующей продуцирование антитела. В последнее время, термин "антиген" имеет ограниченный смысл и относится к молекуле, связывающейся с антителом или рецептором, тогда как термин "иммуноген" означает молекулу, которая индуцирует продуцирование антитела или связывается с рецептором. Если обсуждаемая здесь молекула является как иммуногенной, так и антигенной, то она называется либо иммуногеном, либо антигеном в зависимости от целей ее использования."Антигенная детерминанта" означает фактическую структурную часть антигена, которая иммунологически связывается со связывающим сайтом антитела или Т-клеточным рецептором. Этот термин имеет то же значение, что и "эпитоп". Термины "антигенная детерминанта" и "эпитоп", используемые здесь в несколько более широком смысле, включают дополнительные остатки, которые являются гетерологичными по отношению к последовательности НВс, но которые, фактически, не могут связываться с антителом. Так, например, предполагается, что каждая из повторяющихся последовательностей малярийного белка CS (NANP)4 и NANPNVDP(NANP)3NVDP SEQ ID NO:1 и 21 содержит более чем один истинный эпитоп, но в соответствии с настоящим изобретением считается, что они содержат лишь один эпитоп. При этом использование обеих указанных последовательностей в одной химерной молекуле НВс рассматривают как использование множества эпитопов. Используемый здесь термин "конъюгат" означает гаптен, функционально присоединенный к белкуносителю через боковую цепь аминокислотных остатков белка-носителя, таких как лизин, аспарагиновая или глутаминовая кислота, тирозин или цистеин. Используемый здесь термин "консервативная замена" означает, что один аминокислотный остаток заменен другим биологически сходным остатком. Примерами консервативных замен является замена одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим остатком, или замена одного полярного остатка другим остатком, например замена аргинина лизином и наоборот, замена глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой и наоборот или глутамина аспарагином и наоборот,и т.п. Термин "соответствует" в его различных грамматических формах используется по отношению к пептидным последовательностям и относится к описанной пептидной последовательности, у которой делетированы или к которой добавлены 1-3 аминокислотных остатка либо у одного, либо у обоих аминои карбоксиконцов, и которая содержит лишь консервативные замены в конкретных аминокислотных остатках на протяжении всей полипептидной последовательности. Используемый здесь термин "домен" означает часть рекомбинантной химерной молекулы НВс, которая идентифицирована (i) по положению остатка, имеющего номер, соответствующий номерам положений НВсАg подтипа ayw, как описано Galibert et al. (1979) Nature, 281:646-650 (SEQ ID NO:246). Полипептидные части, по крайней мере, химерных доменов I, II и III, очевидно, существуют в третичной форме, сходной с соответствующими последовательностями природного НВсАg. Используемый здесь термин "гибридный белок" означает полипептид, содержащий по крайней мере две последовательности аминокислотных остатков, которые обычно не связаны друг с другом в природном окружении и которые своими концами ("голова к хвосту") функционально соединены друг с другом пептидными связями между их соответствующими карбокси- и аминоконцевыми аминокислотными-6 006207 остатками. Гибридные белки настоящего изобретения представляют собой НВс-химеры, которые индуцируют продуцирование антител, вступающих в иммунную реакцию с полипептидом или ассоциированным с патогеном иммуногеном, и аминокислотная последовательность которых соответствует последовательности полипептида или ассоциированной с патогеном части гибридного белка. Термин "вирус гепатита В", используемый здесь в его наиболее широком смысле, относится к любому члену семейства гепаднавирусов, обсуждаемых выше. Термин "остаток" используется здесь как синоним термина "аминокислотный остаток" и означает реакционноспособную аминокислоту, присутствующую в пептиде или в белке. Используемый здесь термин "экспрессирующий вектор" означает ДНК-последовательность, имеющую регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию структурного кодирующего белок гена так, чтобы в результате этой экспрессии образовывался белок. Используемый здесь термин "функционально присоединенный", относящийся к нуклеиновой кислоте, означает, что данный ген ковалентно присоединен в "правильной" рамке считывания к другому ДНК-сегменту (или РНК-сегменту, если это необходимо), такому как экспрессирующий вектор, так, чтобы этот структурный ген находился под контролем указанного экспрессирующего вектора. Термин"функционально присоединенный", относящийся к белку, полипептиду или к химере, означает, что указанные элементы ковалентно связаны друг с другом. Используемый здесь термин "промотор" означает сайт распознавания на ДНК-последовательности или на группе ДНК-последовательностей, который представляет собой элемент, регулирующий экспрессию гена и с которым специфически связывается РНК-полимераза, инициирующая синтез РНК (транскрипцию) этого гена. Используемый здесь термин "рекомбинантная молекула ДНК" означает гибридную ДНКпоследовательность, содержащую по крайней мере две нуклеотидных последовательности, которые в природных условиях вместе не встречаются. Используемый здесь термин "вектор" означает молекулу ДНК, которая способна реплицироваться в клетке и/или к которой может быть функционально присоединен другой ДНК-сегмент, что приводит к репликации этого присоединенного сегмента. Примером такого вектора является плазмида. Все идентифицированные здесь аминокислотные остатки имеют природную L-конфигурацию. Для сохранения стандартной номенклатуры полипептида, J.Biol.Chem., 243:3557-59 (1969), для аминокислотных остатков были использованы общепринятые аббревиатуры, которые представлены в нижеследующей таблице соответствий. Таблица соответствий-7 006207 Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к химерному нуклеокапсидному белку гепаднавируса; т.е. к рекомбинантному коровому белку вируса гепатита В (НВс), который сконструирован так, что (а) он представляет иммуногенный эпитоп В-клеток или Т-клеток, линкер для связывания с иммуногенным эпитопом В-клеток или Т-клеток или усеченный белок НВс, (b) обладает повышенной стабильностью, если он присутствует в самособранной частице, а также (с) в основном, не обладает способностью связываться с нуклеиновой кислотой как самособирающаяся частица. Рассматриваемая НВс-химера является усеченной по С-концу молекулой по сравнению с нативной молекулой НВс. Таким образом, указанный химерный белок представляет один или несколько иммуногенных эпитопов в N-конце в иммуногенной петле или в С-конце НВс, или линкер для такого эпитопа в иммуногенной петле. Указанный химерный белок содержит цистеиновый остаток у С-конца или вблизи С-конца,который сообщает повышенную стабильность самособирающимся частицам. Этот химерный белок, в основном, не содержит аргининовых остатков "правее" (по направлению к карбокси-концу) остатка НВс в положении 149, а поэтому эти самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой. Для простоты обсуждения, рассматриваемые химерные последовательности и номера положений в этих последовательностях основаны на последовательности и нумерации положений корового человеческого белка вируса гепатита В подтипа ayw [Galibert et al. (1979) Nature, 281:646-650]. Однако если принять во внимание большое сходство между последовательностями капсидных белков гепаднавирусов млекопитающих и образование этими белками аналогичных частиц, как это хорошо известно специалистам, то обсуждение, относящееся к подтипу ayw НВс человека, также применимо к подтипу adw, а также к белкам лесного сурка и земляной белки. Принимая во внимание близкое сходство последовательностей НВс, то в настоящем описании они обычно обозначаются последовательностями "НВс", если это не оговорено особо. В одном из вариантов своего осуществления, рассматриваемая НВс-химера длиной примерно до 515 аминокислотных остатков(a) содержит (i) последовательность, имеющую, по крайней мере, примерно 130 из 150 N-концевых аминокислотных остатков молекулы НВс, включая ковалентно связанный гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа, присутствующий в связанной пептидной связью иммунодоминантной петле НВс или (ii) последовательность, имеющую, по крайней мере,примерно 135 остатков из 150 N-концевых НВс аминокислотных остатков,(b) содержит от одного до десяти, а более предпочтительно от одного до трех цистеиновых остатков, расположенных в направлении к С-концу данной молекулы от С-концевого остатка присутствующей последовательности НВс и в пределах примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы [Сконцевого цистеинового остатка(ков)], и(c) содержит последовательность по крайней мере из пяти аминокислотных остатков от положения 135 последовательности НВС до С-конца НВс. Предпочтительно пять из этих шести остатков из положений 136-140 последовательности НВс, а шестым остатком является требуемый цистеин. При экспрессии химерных молекул белка в клетке-хозяине рассматриваемая химера способна к самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем (1) частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, которая не содержит вышеуказанных 1-10 цистеиновых остатков [С-концевого цистеинового остатка(ов], или (2) частицы, в которых С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен в этой молекуле другим остатком, таким как аланиновый остаток. В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительная НВс-химера имеет последовательность из примерно от 135 до 515 Lаминокислотных остатков и содержит четыре последовательно расположенных связанных пептидной связью доменов, которые обозначены доменами I, II, III и IV. Эти четыре домена связаны вместе так же, как и нативные белки, в отличие от полипептидов, которые содержат остатки, не являющиеся остатками -аминокислот, а поэтому они не могут образовывать пептидные связи тех полипептидов, которые содержат D-аминокислотные остатки, или олигопептидных конъюгатов, в которых два или несколько полипептидов функционально связаны через боковую цепь аминокислотных остатков. Следовательно, рассматриваемый химерный белок НВс может быть получен путем экспрессии с использованием стандартной рекомбинантной технологии. Начиная с аминоконца, домен I содержит примерно от 71 до 100 аминокислотных остатков, последовательность которых включает, по крайней мере, последовательность остатков примерно от положения 5 до положения 75 НВс. Предпочтительно, чтобы последовательность остатков 1-75 последовательности НВс присутствовала как часть домена I. Наиболее предпочтительно, чтобы домен I состоял только из последовательности НВс в положениях 1-75. Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с остатком 75 НВс домена I, в котором (i) от нуля до всех остатков, а предпочтительно по крайней мере 4 остатка, а более предпочтительно по крайней мере 8 остатков в положениях 76-85 последовательности-8 006207 НВс связаны пептидной связью примерно с 1-245 аминокислотными остатками, которые являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс и составляют гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как В-клеточный эпитоп, или гетерологичный эпитоп, такой как сам В-клеточный эпитоп, или (ii) последовательность НВс в положениях 76-85 не имеет гетерологичных остатков. Особенно предпочтительно, чтобы присутствовала последовательность из 10 остатков в положениях 76-85 (последовательность 76-85), но чтобы она прерывалась примерно 1-245 остатками гетерологичного линкера или гетерологичного эпитопа. В других случаях особенно предпочтительно, чтобы присутствовала только последовательность из 10 остатков и чтобы она не прерывалась каким-либо гетерологичным остатком. Химера, содержащая только остатки НВс в этом домене, вместе с обсуждаемыми ниже признаками,может быть использована для индуцирования В- и/или Т-клеточного ответа на сам НВс. Предпочтительная НВс-химерная молекула с непрерываемой последовательностью 76-85 содержит непрерываемую аминокислотную последовательность НВс от положения 1 до положения по крайней мере 140, а более предпочтительно непрерываемую аминокислотную последовательность НВс от положения 1 до положения 149, плюс один цистеиновый остаток у карбоксиконца, как обсуждается ниже. Домен III представляет собой последовательность НВс от положения 86 до положения 135, связанную пептидной связью с остатком 85. Домен IV содержит (i) от нуля до четырнадцати остатков аминокислотной последовательности НВс от положения 136 до положения 149, связанной пептидной связью с остатком в положении 135 доменаIII, (ii) от одного до десяти цистеиновых остатков [С-концевого цистеинового остатка(ов)] и (iii) от нуля до примерно 100 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс,от положения 150 до С-конца, которая обычно состоит из одного Т-клеточного эпитопа или множества Т-клеточных эпитопов, при условии, что указанный домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, от остатка в положении 135 до С-конца указанной химеры, включая вышеуказанные 1-10 цистеиновых остатков (ii). Предпочтительно, чтобы домен IV содержал последовательность от 0 до примерно 50 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, а более предпочтительно, чтобы эта последовательность содержала от нуля до примерно 25 остатков. Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула может не содержать эпитопов или остатков, гетерологичных по отношению к НВс, за исключением Сконцевого цистеина. В другом аспекте настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп у N-конца, связанный пептидной связью с одним из остатков 1-5 НВс. В другом аспекте настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, присоединенный пептидной связью почти в середине молекулы, локализованной между остатками НВс 76 и 85 в иммунодоминантной петле. В еще одном аспекте изобретения, гетерологичный эпитоп локализован в С-концевой части химерной молекулы, связанной пептидной связью с одним из остатков 136-149 НВс. В других аспектах изобретения, два или три гетерологичных эпитопа присутствуют в вышеуказанной локализации либо один или два гетерологичных эпитопа присутствуют вместе с гетерологичным линкерным остатком для эпитопа. Каждая из этих химерных молекул также содержит С-концевой цистеиновый остаток(и), как обсуждается ниже. Конкретные примеры нескольких таких химерных молекул и их самособирающихся частиц обсуждаются ниже. Как уже было отмечено, рассматриваемая химерная молекула НВс может содержать примерно от 135 до 515 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, остатки 1-5 НВс расположены так, что домен I начинается у остатка 1 НВс и простирается до остатка 75 включительно, т.е. этот остаток НВс находится в положении 75. Гетерологичный эпитоп, присутствующий в домене II в иммунодоминантной петле, предпочтительно содержит примерно от 15 до 50 остатков,хотя короткий эпитоп из примерно 6 аминокислотных остатков может индуцировать антитела и Тклеточные рецепторы и распознаваться ими. Домен III содержит остатки 86-135 НВс, связанные пептидной связью с остатком 85. Домен IV содержит последовательность по крайней мере из шести остатков,которые включают (i) ноль, один или последовательность остатков НВс от положения 136 до 149 НВс,связанную пептидной связью с остатком 135 (ii) по крайней мере один цистеиновый остаток и (iii) может, но необязательно, содержать гетерологичную последовательность эпитопа примерно до 100 остатков, особенно в том случае, когда последовательность НВс заканчивается у остатка 135, хотя более предпочтительной является более короткая последовательность примерно до 25 остатков. В одном из вариантов осуществления изобретения, наиболее предпочтительной является химера,содержащая два гетерологичных эпитопа. Эти два гетерологичных эпитопа присутствуют в доменах I иII, или II и IV, или I и IV. В некоторых вариантах осуществления изобретения одним из двух гетерологичных эпитопов предпочтительно является В-клеточный эпитоп. В других вариантах осуществления изобретения, одним из двух гетерологичных эпитопов является Т-клеточный эпитоп. Более предпочтительно одним из двух гетерологичных эпитопов является В-клеточный эпитоп, а другим является Тклеточный эпитоп. Кроме того, в месте локализации В-клеточного эпитопа может присутствовать мно-9 006207 жество В-клеточных эпитопов, а в месте локализации Т-клеточного эпитопа может присутствовать множество Т-клеточных эпитопов. В тех вариантах осуществления изобретения, в которых химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп в домене II, предпочтительно, чтобы этот эпитоп представлял собой один или несколько Вклеточных эпитопов, а также, чтобы между аминокислотными остатками 76 и 85 присутствовала последовательность НВс, но, чтобы она прерывалась указанным гетерологичным эпитопом(ами) и чтобы данная химера, кроме того, включала один или несколько Т-клеточных эпитопов в домене IV, связанном пептидной связью с одним из остатков 140-149 НВс. Те же самые предпочтительные особенности относятся к тем химерным молекулам, в которых гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа присутствует в домене II, обеспечивая тем самым, присутствие одного или нескольких гетерологичных эпитопов в домене II, в остатках 76 и 85,но при этом прерываемых этим гетерологичным линкерным остатком, причем Т-клеточный эпитоп связан пептидной связью с одним из остатков 140-149 НВс. Частицы, образованные из таких химерных молекул, обычно содержат "конъюгированный эпитоп - С-концевой пептид, связанный пептидной связью с Т-клеточным эпитопом" в отношении примерно 1:4 - 1:1, а обычно это отношение составляет 1:2. В проиллюстрированной структуре вышеописанной химерной молекулы, гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа присутствует в домене II, а Т-клеточный эпитоп присутствует в домене IV, при этом в домене II отсутствует какой-либо дополнительный В-клеточный эпитоп. Такая химера обладает иммуногенностью Т-клеточного эпитопа и обладает минимальной, если вообще обладает, НВс-антигенностью, как было измерено путем связывания с моноклональными антителами против петли в анализе ELISA, обсуждаемом ниже. Предпочтительная рассматриваемая химерная молекула НВс содержит последовательность примерно от 140 до 515 остатков. Предпочтительная химерная молекула НВс, содержащая два гетерологичных эпитопа, каждый из которых имеет длину, предпочтительно от примерно 15 до примерно 50 остатков, и предпочтительную НВс-часть, имеющую длину примерно от 140 до 149 остатков, имеет последовательность длиной примерно от 175 до 240 аминокислотных остатков. Особенно предпочтительные химерные молекулы, содержащие два гетерологичных эпитопа, имеют длину примерно от 190 до 210 остатков. Следует отметить, что рассматриваемый широкий диапазон длин химерных молекул обусловлен различными длинами N- и С-концевых НВс-частей и различными длинами нескольких рассматриваемых эпитопов, которые могут быть встроены в иммуногенную петлю. Рассматриваемый рекомбинантный белок после его экспрессии в клетке-хозяине, способен к самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами. Эти рассматриваемые НВс-химерные частицы обычно имеют сферическую форму и обычно являются гомогенными по размеру для данного препарата. Таким образом, эти химерные частицы сходны с нативными частицами НВс, которые имеют аналогичную форму и размер, и могут быть выделены у инфицированных индивидуумов. Рассматриваемая химерная частица включает обсуждаемые ранее химерные молекулы. В более широком смысле такая химерная частица включает усеченный по С-концу химерный белок НВс, который имеет последовательность, содержащую по крайней мере примерно 130 из 150 N-концевых остатков, и содержит (i) гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа в иммунодоминантной петле или по крайней мере примерно 130 из 150 N-концевых остатков и непрерываемую иммунодоминантную петлю, и (ii) от одного до трех С-концевых цистеиновых остатков, описанных ранее,и, по крайней мере, последовательность НВс из 5 остатков, начиная с положения 135. Такая частица, в основном, не содержит аргининовых остатков, благодаря чему указанные самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и имеют отношение оптической плотности при 280/260, составляющее примерно от 1,2 до 1,7, как обсуждается ниже. Таким образом, рассматриваемый химерный белок может не содержать последовательность НВс в положениях от 150 до 183. Рассматриваемая частица является более стабильной, чем частица, образованная из другого идентичного химерного белка НВс, в котором отсутствует вышеуказанный С-концевой цистеиновый остаток(ки). Аналогичным образом, частица, химерная молекула которой содержит единственный С-концевой цистеиновый остаток, является более стабильной, чем частица, в которой цистеин заменен другим остатком, таким как аланиновый остаток. В некоторых случаях частицы не образуются, если не присутствует С-концевой цистеин. Примеры последовательностей обоих типов с повышенной стабильностью проиллюстрированы в представленных ниже примерах, а более конкретно в примерах, относящихся к фиг. 3, 4 и 8. В основном, отсутствие связывания с нуклеиновой кислотой может быть легко определено путем сравнения оптической плотности частиц в водном растворе, измеренной при 280 и 260 нм, т.е. отношения оптической плотности 280/260. Рассматриваемые частицы, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами, которые представляют собой олигомерные и/или полимерные ДНК- и РНК-молекулы,присутствующие в природных клетках организма, используемого для экспрессии белка. Такие нуклеиновые кислоты имеют определенную оптическую плотность при 260 нм и относительно меньшую оптическую плотность при 280 нм, тогда как белок, такой как рассматриваемая химера, имеет относительно низкую оптическую плотность при 260 нм и более высокую оптическую плотность при 280 нм.- 10006207 Таким образом, рекомбинантно экспрессируемые частицы НВс или химерные частицы НВс, которые содержат богатую аргинином последовательность в положениях остатков 150-183 (или 150-185),иногда называемую в литературе протаминовой областью, имеют отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 260 нм (отношение оптических плотностей 280/260), составляющее примерно 0,8, тогда как частицы, в основном, не содержащие аргининовых остатков, благодаря чему эти самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой, например, частицы,которые не содержат богатой аргинином области связывания природной НВс с нуклеиновой кислотой,такие как частицы, которые содержат менее чем три смежных аргининовых или лизиновых остатков или их смесей, или частицы, содержащие нативную или химерную последовательность, которая заканчивается примерно в положениях 140-149 остатков НВс, имеют отношение оптических плотностей при 280/260,составляющее примерно от 1,2 до 1,6. Химерные частицы НВс настоящего изобретения, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и имеют отношение оптических плотностей при 280/260, составляющее примерно от 1,2 до 1,6 а обычно, примерно от 1,4 до 1,6. Этот диапазон в значительной степени обусловлен числом ароматических аминокислотных остатков, присутствующих в доменах II и IV данной химерной частицы НВс. Этот диапазон также, частично, обусловлен присутствием Суs в домене IV рассматриваемой химеры, что может снижать наблюдаемое отношение примерно на 0,1 по пока не выясненным причинам. Рассматриваемые химерные частицы НВс являются более стабильными в водным буфере при 37 С в течение периода времени примерно от двух недель до одного месяца, чем частицы, образованные из НВс-химеры, содержащей те же самые связанные пептидной связью последовательности доменов I, II иIII и другую аналогичную последовательность домена IV, в которой отсутствует от одного до десяти цистеиновых остатков [С-концевых цистеиновых остатков], либо присутствующий единственный Сконцевой остаток заменен другим остатком, таким как аланиновый остаток. Стабильность различных химерных частиц определяют, как обсуждается ниже. Так, например, частицы, содержащие гетерологичный малярийный эпитоп в домене II [например,(NANP)4] и один цистеиновый остаток, расположенный со стороны С-конца по отношению к валиновому остатку 149, являются более стабильными, чем какие-либо другие идентичные частицы, собранные из химерных молекул, у которых С-концевым остатком является валин в положении 149. Аналогичным образом, частицы, содержащие вышеуказанный малярийный В-клеточный эпитоп в домене II и универсальный малярийный Т-клеточный эпитоп, который содержит один цистеин возле С-конца, являются более стабильными, чем какие-либо другие идентичные частицы, в которых цистеин заменен аланиновым остатком. См. фиг. 3, 4 и 8 и обсуждение, приведенное выше. Рассматриваемую частицу, содержащую С-концевой цистеиновый остаток, также получают, в основном, с более высоким выходом, чем частицу, собранную из химерной молекулы, в которой отсутствует С-концевой цистеин. Такое увеличение выхода можно видеть, исходя из массы полученных частиц или исходя из анализа, осуществляемого методом гель-фильтрации с использованием Superose 6 HR,как обсуждается ниже и в табл. 17. Домен I рассматриваемого химерного НВс-белка состоит из последовательности аминокислотных остатков НВс, начинающихся с аминокислотного остатка, по крайней мере, в положении 5, и заканчивающихся в положении 75, а домен III состоит из последовательности НВс, простирающейся от положения 86 до положения 137. Для любого из доменов I и III могут быть использованы последовательности любого гепаднавируса млекопитающего, и в одной химере могут быть использованы последовательности двух или более вирусов. Предпочтительно и для облегчения конструкции, во всех химерах используется человеческая последовательность ayw. Сообщалось, что при экспрессии в клетках E.coli НВс химер, имеющих домен I, который содержит большую делецию, чем делеция первых трех амино-концевых (N-концевых) остатков, наблюдается полное исчезновение химерного белка НВс, Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74. С другой стороны,в недавних исследованиях, в которых иммуногенный 23-мерный полипептид белка вируса гриппа М 2 был слит с N-концевой последовательностью НВс, сообщалось, что полученный гибридный белок образовывал частицы в случае замены остатков 1-4 нативной последовательности НВс, Neirynck et al. (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163. Таким образом, из вышесказанного следует, что частицы могут образовываться в том случае, когда добавленная аминокислотная последовательность связана пептидной связью с одним из остатков 1-4 НВс, но эти частицы не образуются, когда отсутствует дополнительная последовательность и более чем 1-3 остатка делетированы у N-конца НВс.N-концевая последовательность, связанная пептидной связью с одним из первых пяти N-концевых остатков НВс, может содержать последовательность примерно до 25 остатков, которые являются гетерологичными по отношению к НВс. Примерами таких последовательностей являются В-клеточный или Тклеточный эпитопы, которые обсуждаются ниже, 23-мерный полипептид белка вируса гриппа М 2Neirynck et al., см. выше, последовательность другого (гетерологичного) белка, такого как галактозидаза, которые могут присутствовать в гибридных белках в результате использования соответствующей экспрессионной системы, или другая последовательность, родственная последовательности ви- 11006207 руса гепатита В, такая как последовательность, происходящая от областей Pre-S1 или Рre-S2, или главная иммуногенная последовательность HBsAg. Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков. Из этих остатков ноль остатков(отсутствие остатков), предпочтительно по крайней мере 4 остатка, более предпочтительно по крайней мере 8 остатков, составляют части последовательности НВс в положениях 76-85, а последовательность от 1 до примерно 245 остатков, а предпочтительно от 1 до примерно 50 остатков являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс. Эти гетерологичные остатки составляют (i) гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как В-клеточный или Т-клеточный эпитоп, или (ii) гетерологичный В- или Т-клеточный эпитопы, которые, предпочтительно, содержат от 6 до примерно 50, более предпочтительно примерно от 15 до 50, а наиболее предпочтительно примерно от 20 до 30 аминокислотных остатков, и которые расположены так, что они связаны пептидной связью между 0, или более предпочтительно по крайней мере 4 остатка или примерно со всеми остатками от положения 76 до положения 85 последовательности НВс. Гетерологичные В-клеточные эпитопы предпочтительно связаны в этом положении линкерным остатком или связаны пептидной связью с последовательностью НВс, и пример такого использования В-клеточного эпитопа обсуждается ниже. Все эти предпочтительные, по крайней мере, 4 остатка НВс могут находиться в одной последовательности, в положениях остатков 82-85, либо они могут разделены и находиться на обеих сторонах(фланкировать) гетерологичного(ый) остатка(ок), например, как остатки, присутствующие в положениях 76-77 и 84-85, или остатки, присутствующие в положениях 76 и 83-85. Более предпочтительно, если домен II содержит по крайней мере 8 остатков последовательности НВс от остатка 76 до остатка 85. Более предпочтительно, чтобы в данной химере присутствовала последовательность из всех 10 остатков в положениях 76-85. Последовательность от одного до примерно 245 остатков, добавленных к последовательности петли НВс, является гетерологичной по отношению к последовательности НВс. Одним из таких добавленных гетерологичных остатков является гетерологичный линкерный остаток для В-клеточного эпитопа, обсуждаемый выше. Более длинные последовательности, обычно по крайней мере от 6 аминокислотных остатков и примерно до 50 аминокислотных остатков, а более предпочтительно, примерно от 15 и примерно до 50 остатков, как указывалось выше, находятся в последовательности, которая включает гетерологичный иммуноген, такой как В-клеточный эпитоп, за исключением гетерологичных остатков, кодируемых рестрикционными сайтами. Примеры пептидных иммуногенов, используемых как для связывания с линкерным остатком после экспрессии рассматриваемой химеры, так и для экспрессии внутри НВс-химеры, представлены ниже в таблице А, при этом рядом с общепризнанным названием гена приводится последовательность, которая получена из этого гена, в этой таблице также приводится ссылка на литературу или патенты, где указаны известные эпитопы и SEQ ID NO. Таблица А В-клеточные эпитопы Остальные остатки домена II, которые присутствуют с любой стороны от гетерологичного остатка или последовательности, представляют собой остатки НВс в положении 76-85. Таким образом, в типичном примере, когда остатки 78-82 были заменены, то химерная последовательность в домене II представляет собой последовательность остатков 76-77, за которым следуют остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, гетерологичная иммуногенная последовательность (эпитопа), затем остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, а затем последовательность НВс 84-85. Типичным примером последовательности химеры, полученной с помощью стратегии инсерции между остатками 78 и 79, является последовательность НВс остатков 1-78, за которой следуют остатки,кодируемые рестрикционным сайтом, гетерологичная иммуногенная последовательность, затем остатки,кодируемые рестрикционным сайтом, а затем последовательность НВс 79-85. Последовательности других рассматриваемых химер в доменах I и II должны быть очевидными из этих приведенных примеров, и из примеров, представленных ниже, и не нуждаются в перечислении. Как уже указывалось выше, гетерологичный линкер для конъюгированного эпитопа связан пептидной связью в положении последовательности НВс между аминокислотными остатками 76 и 85. Как и в случае гетерологичного эпитопа предпочтительно присутствует последовательность НВс из остатков 7685, но эта последовательность прерывается гетерологичным линкером для конъюгированного эпитопа. Эта химера предпочтительно включает последовательность НВс, начиная с положения 1 и, по крайней мере, до положения 140, плюс цистеиновый остаток у С-конца химерного белка. Более предпочтительно,если последовательность НВс простирается от положения 1 до положения 149, но в остатках 76-85 прерывается гетерологичным линкером для конъюгированного эпитопа, и химерная молекула содержит Сконцевой цистеин. Наиболее предпочтительно, если гетерологичный линкер для конъюгированного эпитопа представляет собой лизиновый (К) остаток. В качестве линкерных остатков могут быть также использованы остатки глутаминовой или аспарагиновой кислоты, тирозина и цистеина, а также могут быть использованы тирозиновый и цистеиновый остатки. При этом, следует отметить, что может присутство- 15006207 вать более чем один линкер, такой как последовательность из трех лизинов, но этот вариант не является предпочтительным, поскольку в результате такого использования могут образовываться гетерогенные конъюгаты, в которых конъюгированный гаптен связан с одним линкером в первой химерной молекуле,и с другим линкером во второй химерной молекуле. В опубликованной заявке РСТ/US 99/03055 описаны химерные молекулы НВс, которые содержат один или несколько линкерных остатков, но в которых отсутствует стабилизирующий С-концевой цистеиновый остаток. Также следует отметить, что гетерологичная последовательность эпитопа, присутствующая в рассматриваемой НВс-химере, может быть также отделена от остатков последовательности НВс "гибким линкерным плечом" на одной или обеих сторонах (фланкирующих) гетерологичной иммуногенной последовательности (эпитопа). Это, в частности, происходит в случае, когда указанная гетерологичная иммуногенная последовательность имеет длину более чем 30 аминокислотных остатков. Характерные последовательности гибкого линкерного плеча обычно содержат примерно от 4 до 10 глициновых остатков,которые, как считается, позволяют этой встроенной последовательности значительно "выступать" за пределы другой выступающей последовательности петли и наделять эту конструкцию дополнительной стабильностью. Характерные последовательности гибкого линкерного плеча описаны в работе Kratz etal., (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 96:1915-1920 и представлены последовательностями аминокислотных остатков:GGGGSGGGGT SEQ ID NO:256 GGGGSGGGG SEQ ID NO:257. Как уже отмечалось ранее, домен III состоит из последовательности НВс, простирающейся от положения 86 до положения 135. Следовательно, последовательность типичных химер, обсуждаемых выше для доменов I и II, можно удлинить так, чтобы первая обсуждаемая химера имела последовательность НВс от положения 84 до положения 135, а вторая обсуждаемая химера имела последовательность НВс от положения 79 до положения 135. Домен IV представляет собой последовательность, которая (i) необязательно включает последовательность НВс от положения 135 до положения 149, (ii) содержит по крайней мере от одного до трех цистеиновых остатков и (iii) содержит примерно до 100 аминокислотных остатков в последовательности,гетерологичной по отношению к НВс, начиная от положения 150 и до С-конца, при условии, что доменIV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, включая вышеуказанные 1-10 цистеиновых остатков (ii). Более предпочтительно, чтобы последовательность домена IV, гетерологичная по отношению к НВс, содержала последовательность примерно до 50 аминокислотных остатков, а наиболее предпочтительно, примерно до 25 остатков. Таким образом, последовательность домена IV может представлять собой, по существу, любую цистеинсодержащую последовательность, за исключением С-концевой последовательности НВс, простирающейся от положения 150 до С-конца. Длина последовательности домена IV может составлять шесть остатков, то есть цистеин плюс любые пять остатков, содержащих, в целом, до трех цистеинов, и примерно до 100 аминокислотных остатков, то есть эта длина должна быть достаточной для того, чтобы рассматриваемый химерный белок имел,в целом, длину примерно от 135 до 515 остатков, более предпочтительно примерно до 460 остатков, а наиболее предпочтительно примерно до 435 аминокислотных остатков. В случае если эпитоп, связанный пептидной связью с доменами I или II, содержит примерно до 30 или примерно до 50 остатков соответственно, что является предпочтительным для этих эпитопов, то более предпочтительная длина химерной молекулы, включая эпитоп домена IV, составляют примерно от 175 до 240 остатков. Особенно предпочтительные химерные молекулы, содержащие два гетерологичных эпитопа, имеют длину примерно от 190 до 210 остатков. Отсутствие связывания полученной частицы с нуклеиновой кислотой определяют путем измерения отношения оптических плотностей при 280/260, как обсуждалось ранее. Последовательность домена IV включает по крайней мере один цистеиновый (Cys) остаток и может содержать вплоть до трех остатков Cys. Предпочтительно, чтобы один или несколько остатков Cys находились возле или в пределах примерно пяти аминокислотных остатков у С-конца химерной молекулы белка. Кроме того, если в последовательности домена IV присутствует более чем один остаток Cys, то предпочтительно, чтобы эти остатки Cys были смежными друг с другом. Также предпочтительно, чтобы последовательность домена IV состояла из Т-клеточного эпитопа,множества Т-клеточных эпитопов, которые могут быть одинаковыми или различными, или дополнительного В-клеточного эпитопа для организма, против которого предлагается использовать рассматриваемую химеру в качестве иммуногена. Примеры последовательностей Т-клеточного эпитопа домена IV представлены ниже в таблице В, а также в таблице А.- 17006207 17. Saron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7:3314. 18. Corthesy et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 52:33670. 19. Bastien et al. (1997) Virol., 234, 1:118. 20. Yang et al. (1997) Vaccine. 15, 4:377. 21. Lotter et al. (1997) J. Exp. Med., 185, 10:1793. 22. Nara et al. (1997) Vaccine 15, 1:79. 23. U.S. No. 4886782. 24. Zavala et al. (1985) Science, 228:1436. 25. Schodel et al. (1994) J. Exper. Med., 180:1037. 26. Calvo-Calleet al. (1997) J. Immunol. 159, 3:1362. 27. Qari et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol., 55(1-2):105. 28. Qari et al. (1993) Lancet, 341 (8848):780. 29. Neirynck et al. (Oct 1999) Nature Med., 5 (10):1157-1163. 30. Thompson et al. (1994) Eur.J. Biochem., 226(3):751-764. 31. Wilson et al. (2000) Science, 287:1664-1666. 32. Brown et al. (1993) J. Virol., 67 (5):2887-2893. 33. U.S. No. 4886663. 34. Schenk et al. (Jul 8, 1999) Nature, 400(6740):116-117. 35. Slepushkin et al. (1995) Vaccine, 13(15) :1399-1402. Помимо по крайней мере одного цистеинового остатка, присутствующего в домене IV, в рассматриваемой химерной молекуле и частице предпочтительно присутствует аминокислотная последовательность НВс от положения 1, по крайней мере, до положения 140. Более предпочтительно, если присутствует последовательность, простирающаяся от положения 1 до положения 149. В-клеточный эпитоп,предпочтительно присутствует между остатками 76 и 85, а по крайней мере один цистеиновый остаток или Т-клеточный эпитоп, содержащий цистеиновый остаток, присутствует в виде С-концевого добавления к последовательности НВс. Рассматриваемая рекомбинантная НВс-химера, в основном, не связывается с нуклеиновой кислотой. Рассматриваемая химерная частица, которая содержит добавленный остаток Cys у С-конца или возле С-конца этой молекулы, является также более стабильной при 37 С, чем аналогичная частица, не содержащая такого добавленного Cys. Такая повышенная стабильность проиллюстрирована на фиг. 3, 4 и 8, и обсуждается ниже. Рассматриваемая рекомбинантная химерная молекула НВс обычно присутствует и используется как самособирающаяся частица. Эти частицы состоят из 180-240 химерных молекул (90 или 120 димерных пар), а обычно из 240 химерных молекул, которые разделяются на белковые молекулы в присутствии дисульфидных восстановителей, таких как 2-меркаптоэтанол, а поэтому очевидно, что отдельные молекулы связываются друг с другом и образуют частицу, главным образом, посредством дисульфидных связей. Не претендуя на какую-либо теорию, очевидно, что наблюдаемая повышенная стабильность, а в некоторых случаях усиленная экспрессия рассматриваемой НВс-химеры, обусловлена образованием дополнительной дисульфидной связи между цистеинами белков химерных молекул. Независимо от того,присутствует ли цистеин или цистин, этот С-концевой цистеиновый остаток называется цистеином, поскольку этот остаток кодируется кодоном, присутствующим в нуклеиновой кислоте, из которой экспрессируется белок и собранная частица. Эти частицы аналогичны частицам, наблюдаемым у пациентов, инфицированных HBV, но эти частицы не являются инфекционными. После экспрессии в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, отдельные рекомбинантные химерные молекулы НВс собираются в данном хозяине и образуют частицы, которые могут быть легко выделены из клеток-хозяев и очищены, если это необходимо. Как указывалось выше, иммунодоминантная петля НВс обычно, как известно, локализована в области примерно от положения 75 до положения 85, от аминоконца (N-конца) интактного белка. Гетерологичная последовательность домена II, содержащая В-клеточный эпитоп, находится в этой иммунодоминантной последовательности петли. Такая локализация приводит, в основном, к элиминации иммуногенности последовательности петли НВс, хотя присутствующая гетерологичная последовательность или линкерный остаток находится в крайнем иммуногенном положении в собранных химерных частицах. Помимо обсуждаемых выше N- и С-усечений, инсерций различных эпитопов и спейсеров, рассматриваемая химерная молекула может также содержать консервативные замены в аминокислотных остатках, которые составляют домены I, II, III и IV НВс. Консервативные замены являются такими, как они определены выше. В более редких случаях может быть осуществлена "неконсервативная" замена, например замена глицина триптофаном. Аналогичные небольшие модификации могут также включать делеции или инсерции аминокислот либо и то и другое. Для того чтобы определить, какой именно аминокислотный остаток может быть заменен, инсертирован или делегирован без воздействия на биологическую активность или образование частицы, можно использовать компьютерные программы, хорошо известные специалистам, например программы LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.).- 18006207 НВс-часть химерной молекулы настоящего изобретения, то есть часть, имеющая последовательность НВс, которая содержит последовательность, не являющуюся последовательностью или остатком добавленного эпитопа, линкера, гибкого линкерного "плеча" или гетерологичного(ых) остатка(ов), представляющих собой артефакт рестриктирующего фермента, наиболее предпочтительно имеет последовательность аминокислотных остатков в положениях 1-149 подтипа ayw, показанную на фиг. 7 (SEQ IDNO:247), менее предпочтительно какую-либо часть или части последовательности подтипа ayw, отсутствующих из-за усечения в любом одном или в обоих концах. Несколько менее предпочтительными являются соответствующие последовательности аминокислотных остатков подтипов adw, adw2 и adyw, которые также показаны на фиг. 7 (SEQ ID NO:248, 249 и 250). Еще менее предпочтительными являются последовательности лесного сурка и земляной белки в выровненных положениях 1-149, которые представляют собой последние две последовательности на фиг. 7 (SEQ ID NO:251 и 246). Как уже указывалось,части различных последовательностей других белков НВс млекопитающего могут быть использованы вместе в одной химере. Если НВс-часть химерной молекулы настоящего изобретения, описанная выше, имеет последовательность, не являющуюся последовательностью молекулы НВс млекопитающего, соответствующей положениям 1-149, то в ней, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:247, простирающейся от положения 1 до положения 149, должно быть заменено не более чем примерно 20% аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы было заменено не более чем примерно 10%, более предпочтительно не более чем примерно 5% в, а наиболее предпочтительно не более чем примерно 3% аминокислотных остатков по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:247, простирающейся от положения 1 до положения 149. Таким образом, рассматриваемая химера, состоящая из 149 остатков НВс, может содержать примерно до 30 остатков, а предпочтительно, примерно 15 остатков, которые отличаются от остатков последовательности SEQ ID NO:247, простирающейся от положения 1 до положения 149. Более предпочтительно, примерно 7 или 8 остатков, а наиболее предпочтительно примерно 4 или 5 остатков отличаются от остатков в последовательности ayw (SEQ ID NO:247) в положениях остатков 1-149. Предпочтительно,чтобы замены, сделанные не в иммунодоминантной петле или в концах домена II, находились в неспиральных частях химерной молекулы, и обычно между остатками примерно 1-15 и остатками примерно 24-50, что гарантирует образование частицы. См., Koschel et al., J.Virol., 73(3):2153-2160 (Mar.1999). Если последовательность НВс усечена у С-конца за положением 149 или у N-конца, либо содержит одну или несколько делеций в иммуногенной петле, то число замененных остатков пропорционально изменяется, поскольку общая длина последовательности составляет менее, чем 149 остатков. Для удобства подсчета, какие-либо другие делеции в данной молекуле рассматриваются как консервативные замены. Получение химеры Рассматриваемый химерный иммуноген НВс обычно получают с использованием хорошо известной техники рекомбинантных ДНК. Так, добавляют последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют конкретные полипептидные последовательности, и делетируют из последовательности предшественника, которая кодирует НВс, для получения нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемую химеру. Любая из двух стратегий является предпочтительной для введения гетерологичной последовательности эпитопа в последовательность петли. Первой стратегией является замена, где ДНК, которая кодирует часть иммунодоминантной петли, вырезают и заменяют ДНК, кодирующей гетерологичный эпитоп,такой как В-клеточная последовательность. Вторая стратегия называется инсерционной стратегией, в которой гетерологичный эпитоп встраивают между смежными остатками данной петли. В одном из примеров стратегии замены используется сайт-направленный мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения химерной ДНК-последовательности НВс, которая кодирует пару различных рестрикционных сайтов, например EcoRI и SacI, по одному вблизи каждого конца ДНК, кодирующей иммунодоминантную петлю. Примерами замененных остатков являются остатки в положениях 76-81. Фрагмент, кодирующий петлю, вырезают, нужную последовательность, кодирующую гетерологичный В-клеточный эпитоп, лигируют в рестрикционные сайты, и полученную ДНК используют для экспрессии НВс-химеры. См., например, табл. 2 в работе Pumpens et al., (1995) Intervirology,38:63-74, где описаны примеры использования такой техники. Альтернативно, один рестрикционный сайт может быть введен в кодирующую область с помощью сайт-направленного мутагенеза; ДНК расщепляют рестриктазой с получением "липких" концов, после чего эти липкие концы затупляют эндонуклеазой и затупленный по концам сегмент гетерологичной ДНК лигируют в вырезанную область. Примеры замены последовательности такого типа в НВс можно найти в работах Schodel et al., (1991) F.Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringMed., (1994) 180(3): р.1037-4, где в последних двух работах обсуждается получение вакцин против- 19006207 Было обнаружено, что положение инсерции в иммуногенной петле НВс и присутствие остатков петли может иметь важное значение для активности иммуногена. Таким образом, как проиллюстрировано ниже, введение малярийного В-клеточного эпитопа между остатками НВс в положениях 78 и 79,обеспечивает присутствие специфического иммуногена, что дает в 10-1000 раз большую иммуногенность, чем присутствие того же самого иммуногена в вырезанной и замененной области между остатками 76 и 81. Кроме того, введение того же самого малярийного иммуногена между остатками 78 и 79, по сравнению с иммуногеном, расположенным между остатками 77 и 78, дает неожиданное усиление иммуногенности, примерно в 15 раз. Поэтому такая инсерция является, в основном, предпочтительной. В иллюстративном примере инсерционной стратегии сайт-направленный мутагенез используют для создания двух рестрикционных сайтов, которые являются смежными по отношению друг к другу и которые расположены между кодонами, кодирующими смежные аминокислотные остатки, такие как остатки в положениях 78 и 79. Эта стратегия позволяет добавлять двенадцать пар оснований, которые кодируют четыре аминокислотных остатка (два для каждого рестрикционного сайта), между указанными ранее смежными остатками в петле НВс. Очевидно, что после расщепления рестриктазами, лигирования ДНК, кодирующей последовательность гетерологичного В-клеточного эпитопа, и экспрессии ДНК с образованием НВс-химер, аминокислотная последовательность петли НВс прерывается на ее N-концевой стороне двумя остатками, кодируемыми 5' рестрикционным сайтом, а далее по направлению к С-концу, последовательностью гетерологичного В-клеточного эпитопа, а затем еще двумя гетерологичными непетлевыми остатками, кодируемыми 3'-рестрикционным сайтом, за которым следует остальная последовательность петли. Та же самая стратегия может быть использована для инсерции в домен I N-концевой последовательности, как описано Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163, или для инсерции в домен IV Тклеточного эпитопа, или одного или нескольких цистеиновых остатков, которые не являются частью Тклеточного эпитопа. Аналогичная стратегия, предусматривающая инсерцию между остатками 82 и 83,описана в работе Schodel et al., (1990) F. Brown et al., eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New York, pp.193-198. Более конкретно, эта стратегия клонирования схематично проиллюстрирована на фиг. 2 А, 2 В и 2 С. На фиг. 2 А ДНК-последовательность, кодирующую усеченную у С-конца последовательность НВс(НВс 149), конструируют так, чтобы она содержала смежные EcoRI и SacI-сайты между остатками 78 и 79. Расщепление этой ДНК обоими ферментами дает один фрагмент, который кодирует область НВс в положениях 1-78, имеющую липкий EcoRI-3'-конец, и другой фрагмент, который имеет липкий SacI-5'конец и кодирует остатки в положениях 79-149. Лигирование синтетической нуклеиновой кислоты,имеющей 5'-выступающий ААТТ, за которым следует последовательность, кодирующая нужный малярийный В-клеточный эпитоп и 3'-выступающий AGCT, приводит к получению химерной последовательности НВс, которая кодирует В-клеточный эпитоп, фланкированный на каждой стороне двумя гетерологичными остатками [GlyIle (GI) и GluLeu (EL), соответственно], между остатками 78 и 79, при этом обычно EcoRI-сайт разрушается, а SacI-сайт сохраняется. Аналогичная стратегия проиллюстрирована на фиг. 2 В для инсерции цистеинсодержащей последовательности в домен IV и такой особенно предпочтительной последовательностью является малярийный Т-клеточный эпитоп, который содержит последовательность белка CS P. falciparum, простирающуюся от положения 326 до положения 345 и обозначенную здесь PF/CS326-345 (Pf-UTC). В данном случае рестрикционные EcoRI- и HindIJI-сайты были сконструированы так, чтобы они находились в ДНКпоследовательности НВс после аминокислотного остатка в положении 149. После расщепления ферментами EcoRI и HindIII, синтетическую ДНК, имеющую вышеуказанный 5'-выступающий ААТТ, за которым следуют последовательность, кодирующая Т-клеточный эпитоп, один или несколько стоп-кодонов и 3'-выступающий AGCT, лигируют в расщепленную последовательность, в результате чего получают последовательность, кодирующую остатки 1-149 НВс, за которой следуют два гетерологичных остатка(GI), стоп-кодон и HindIII-сайт. После ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера, имеющего рестрикционный SacIсайт, за которым следует последовательность, кодирующая НВс и начинающаяся с остатка в положении 79, и после расщепления ферментами SacI и HindIII получают последовательность, кодирующую НВс в положениях 79-149 плюс два дополнительных остатка и Т-клеточный эпитоп у С-конца. После расщепления конструкции, представленной на фиг. 2 В, ферментом SacI и после лигирования получают полноразмерный ген, кодирующий нужный рекомбинантный химерный иммуноген НВс, который содержит последовательность от N-конца в положениях 1-78 НВс, два добавленных остатка, малярийный Вклеточный эпитоп, два добавленных остатка, остатки НВс в положениях 79-149, два добавленных остатка и Т-клеточный эпитоп, как показано на фиг. 2 С. Аналогичная техника может быть использована для введения гетерологичного линкерного остатка для конъюгирования В-клеточного эпитопа в область последовательности петли. Рассматриваемые линкерные остатки включают лизин (Lys), который является особенно предпочтительным, аспарагиновую кислоту (Asp), глутаминовую кислоту (Glu), цистеин (Cys) и тирозин (Тyr).- 20006207 Следует отметить, что последовательность аминокислотных остатков, показанная в SEQ ID NO:247,содержит остатки Glu и Asp в положениях 77 и 78. Тем не менее, рассматривается также введение дополнительного гетерологичного карбоксилсодержащего остатка. Химическая реакционная способность имеющихся глутаминовой и аспарагиновой кислот может быть снижена под действием других факторов. Так, например, специалистам известно, что находящийся по соседству пролин, такой как пролин в положении 79, может нейтрализовывать и тем самым снижать химическую реакционную способность проксимальной карбоксильной группы. В данном случае, при использовании первой описанной стратегии инсерции, в последовательность петли вводят пять гетерологичных остатков, один из которых является гетерологичным линкерным остатком для конъюгирования В-клеточного эпитопа, а два смежных остатка, с каждой стороны от этого одного остатка, сами также являются смежными с остатками последовательности петли и представляют собой продукт экспрессии встроенных рестрикционных сайтов (артефакты рестриктазы). Следует отметить, что сайт-направленный мутагенез можно также использовать для добавления одного кодона в последовательность петли НВс, который кодирует гетерологичный линкерный остаток для В-клеточного эпитопа. При этом следует отметить, что для удобства предпочтительно использовать два гетерологичных остатка на любой стороне (фланкирующей) В-клеточного или Т-клеточного эпитопа. В результате этого,на любой стороне или на обеих сторонах встроенной последовательности можно также использовать 0-3 или более дополнительных остатков, которые не являются частью последовательности НВс. Один или оба конца этой вставки и нуклеиновой кислоты НВс могут быть "снова гидролизованы" соответствующей нуклеазой (например, нуклеазой S1) с образованием "тупых" концов, которые могут быть затем лигированы вместе. Добавленные гетерологичные остатки, которые не являются ни частью инсертированного В-клеточного или Т-клеточного эпитопа, ни частью последовательности НВс, не включаются в число остатков, присутствующих в описанном домене. При этом следует отметить, что может быть также синтезирована часть или вся нужная рекомбинантная химерная нуклеиновая кислота НВс с использованием хорошо известных методов синтеза, обсуждаемых и проиллюстрированных в патенте США 5656472, для синтеза ДНК из 177 пар оснований,которая кодирует 59 остатков сигнального пептида рибулозо-бис-фосфат-карбоксилазооксигеназыNicotiana tabacum. Так, например, можно синтезировать домены I и II с тупым или "липким" концом, которые могут быть лигированы с доменами III и IV с получением конструкции, экспрессирующей рассматриваемую НВс-химеру, которая не содержит дополнительных остатков со стороны N-конца Вклеточного эпитопа, и содержит от нуля до трех дополнительных остатков со стороны С-конца или на стыке домена II/III, либо в некоторых других нужных положениях. Альтернативная стратегия инсерции описана у Clarke et al. (1991), F. Brown et al., eds., Vaccines 91,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318. В данном случае, учитывая преимущество, которое дает вырожденность генетического кода, эти авторы сконструировали один рестрикционный сайт, соответствующий остаткам 80 и 81, который кодирует исходные остатки, присутствующие в этих положениях. Таким образом, их экспрессированные НВс-химеры не содержали остатки,кодируемые рестрикционным сайтом, и содержали остатки петли НВс, непосредственно смежные со встроенной последовательностью. В настоящем описании также рассматривается последовательность нуклеиновой кислоты (сегмент),которая кодирует описанную ранее химерную молекулу НВс, или комплементарная последовательность этой кодирующей последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, такой сегмент нуклеиновой кислоты присутствует в выделенной и очищенной форме. В живых организмах, последовательность аминокислотных остатков белка или полипептида непосредственно связана посредством генетического кода с последовательностью дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) гена, кодирующего этот белок. Таким образом, благодаря хорошо известной вырожденности генетического кода могут быть получены, если это необходимо, дополнительные ДНК и соответствующие РНК-последовательности (нуклеиновые кислоты), которые кодируют те же самые химерные последовательности аминокислотных остатков, но которые в достаточной степени отличаются от обсуждаемой выше генной последовательности так, что эти две последовательности не гибридизуются в условиях высокой жесткости, но гибридизуются в условиях умеренной жесткости. Условия высокой жесткости могут быть определены как условия гибридизации при температуре примерно 50-55 С в 6 х SSC и с конечной промывкой при температуре 68 С в 1-3 х SSC. Условиями умеренной жесткости являются условия гибридизации при температуре примерно от 50 до 65 С в 0,2-0,3 МNaCl, с последующей промывкой при температуре примерно от 50 до 55 С в 0,2 х SSC, 0,1% ДСН (додецилсульфате натрия). Последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК-последовательность или РНК-последовательность), (1) которая сама, или ее комплементарная последовательность кодирует химерную молекулу,НВс-часть которой от остатка 1 до остатка 136, если они присутствуют, представляет собой последовательность SEQ ID NO:246, 247, 248, 249, 250 или 251; и (2) гибридизуется с ДНК-последовательностьюSEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, по крайней мере, в условиях умеренной жесткости (обсуж- 21006207 даемых выше); и (3) НВс-последовательность которой по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 100% идентична ДНК-последовательности SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, определена как вариант ДНК-последовательности. Как хорошо известно специалистам, последовательность нуклеиновой кислоты, такая как рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессируется при ее функциональном присоединении к соответствующему промотору в соответствующей экспрессионной системе, как обсуждается в настоящем описании. Аналог последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или последовательность, аналогичная этой последовательности, которая кодирует рассматриваемую химерную молекулу, также рассматривается как часть настоящего изобретения. Химерный аналог последовательности нуклеиновой кислоты или комплементарная ей последовательность нуклеиновой кислоты кодирует последовательность аминокислотных остатков НВс, которая по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, наиболее предпочтительно по крайней мере на 95%, идентична части последовательности НВс от остатка в положении 1 до остатка в положении 136, показанных в SEQ ID NO: 246, 247, 248,249, 250 и 251. Эта ДНК или РНК называются здесь "аналогом" или "аналогичными" последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, и гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или с комплементарными им последовательности в условиях гибридизации умеренной жесткости. Нуклеиновая кислота, кодирующая аналогичную последовательность, после соответствующей трансфекции и экспрессии, также продуцирует рассматриваемую химеру. У различных хозяев часто отдается предпочтение конкретному кодону, используемому для кодирования конкретного аминокислотного остатка. Такая предпочтительность кодонов хорошо известна специалистам, и ДНК-последовательность, кодирующая нужную химерную последовательность, может быть модифицирована с использованием, например, in vitro-мутагенеза так, чтобы в данном хозяине, в котором должен экспрессироваться данный фермент, использовались предпочтительные для этого хозяина кодоны. Кроме того, вырожденность генетического кода можно также использовать для кодирования части НВс последовательности SEQ ID NO; 246, 247, 248, 249, 250 и 251, которая не имеет существенной идентичности с ДНК SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или комплементарными им последовательностями. Таким образом, используемая аналогичная ДНК-последовательность необязательно должна гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или их комплементарными последовательностями в условиях умеренной жесткости, но при этом они могут образовывать рассматриваемую химерную молекулу. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула ДНК, включающая вектор,функционально присоединенный к экзогенному сегменту нуклеиновой кислоты (например, сегменту или последовательности ДНК), который определяет ген, кодирующий рассматриваемую химеру, как обсуждалось выше, и промотору, подходящему для регуляции экспрессии этого гена в совместимом организме-хозяине, также входит в объем настоящего изобретения. Более конкретно, рассматривается также рекомбинантная молекула ДНК, включающая вектор, содержащий промотор для регуляции экспрессии химеры в клетках организма-хозяина, функционально присоединенный к сегменту ДНК, определяющему ген для части НВс-химеры или ДНК-варианта, который по крайней мере на 90% идентичен химерному гену SEQ ID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 и гибридизуется с этим геном в условиях умеренной жесткости. Кроме того, рассматривается рекомбинантная молекула ДНК, содержащая вектор, включающий промотор для регуляции экспрессии химеры в клетках организма-хозяина, функционально присоединенный к сегменту ДНК, который является аналогом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность аминокислотных остатков части химерной НВс, которая по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 95%, идентична части НВс последовательности SEQ ID NO: 246, 247, 248, 249, 250 и 251. Эта рекомбинантная ДНК-молекула, после соответствующей трансфекции и экспрессии в клетке-хозяине, также продуцирует рассматриваемую химерную молекулу. Следует отметить, что поскольку N-концевая последовательность из 30 аминокислотных остатков НВс земляной белки не соответствует каким-либо другим последовательностям НВс, то эта последовательность и кодирующие ее последовательности нуклеиновой кислоты и комплементарные им последовательности не имеют идентичность, соответствующую вышеуказанному проценту и не являются частями нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность из 30 остатков или комплементарную ей последовательность, используемую при определении гибридизации. Аналогичным образом, последовательности, которые являются усеченными по любому из N-и С-концов НВс или по обоим концам, не соответствуют оценкам идентичности, и не являются последовательностями, в которых остатки иммунодоминантной петли удалены для инсерции гетерологичного эпитопа. Таким образом, при оценке идентичности со сравниваемой последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков учитываются и сравниваются только те НВс-кодирующие основания или остатки последовательности НВс, которые присутствуют в химерной молекуле.- 22006207 Поскольку кодирующие последовательности для описанного здесь гена проиллюстрированы в SEQID NO: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, то изолированные сегменты нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК-последовательности, их варианты и аналоги, могут быть получены методом in vitroмутагенеза, известным специалистам и обсуждаемым в монографии. Current Protocols in Molecular Biology, N.Y. Ausubel et al. eds., John WileySons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6, где указанные сегменты,их варианты и аналоги начинаются с начального кодона ATG для данного гена и кончаются стопкодоном или простираются "правее" этого стоп-кодона для каждого гена. Таким образом, нужный рестрикционный сайт может быть сконструирован у инициирующего кодона или "левее" от него, и у стопкодона или "правее" от него так, чтобы можно было получить, вырезать и изолировать другие гены. Как хорошо известно специалистам, если присутствует требуемая нуклеиновая кислота, например ДНК-последовательность (включая старт- и стоп-сигналы), то дополнительные пары оснований могут обычно присутствовать у любого конца сегмента, и этот сегмент может быть еще использован для экспрессии белка. При этом, разумеется, предполагается отсутствие в данном сегменте функционально присоединенной ДНК-последовательности, которая подавляет экспрессию, экспрессирует дополнительный продукт, который утилизует нужный экспрессируемый фермент, экспрессирует продукт, который утилизует нужный реакционный продукт, продуцируемый этим нужным ферментом, либо оказывает какоелибо другое влияние на экспрессию гена указанного сегмента ДНК. Таким образом, если ДНК-сегмент не имеет таких интерферирующих ДНК-последовательностей, то ДНК-сегмент настоящего изобретения может иметь длину примерно от 500 до 15000 пар оснований. Максимальный размер рекомбинантной ДНК-молекулы, а в частности экспрессирующего вектора, определяется, главным образом, удобством использования и размером вектора, который может быть подходящим для клетки-хозяина, когда присутствуют все минимальные ДНК-последовательности, требуемые для репликации и экспрессии, если это необходимо. Минимальные размеры вектора хорошо известны. Могут быть также использованы и длинные ДНК-сегменты, но они не являются предпочтительными. ДНК-сегменты, которые кодируют вышеописанные химеры, могут быть синтезированы методами химического синтеза, например фосфотриэфирным методом Matteucci et al. (1981) J.Am.Chem.Soc. 103:3185. Разумеется, при химическом синтезе кодирующей последовательности могут быть введены любые нужные модификации просто путем замены оснований, кодирующих нативную последовательность аминокислотных остатков, соответствующими основаниями. Однако предпочтительными являются ДНК-сегменты, включающие последовательности, описанные выше. Рассматриваемая НВс-химера может быть получена (экспрессирована) в ряде трансформированных систем-хозяев, обычно клеток-хозяев, хотя также рассматривается экспрессия в бесклеточных in vitro системах. Этими клеточными системами-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными экспрессирующими ДНК-векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты; вирусом мозаики табака) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидой Ti); либо соответствующим образом трансформированные клеточные системы животных, такие как клетки СНО, VERO или COS. Настоящее изобретение не ограничивается используемыми клетками-хозяевами. ДНК-сегменты, содержащие ген, кодирующий НВс-химеру, предпочтительно получают из рекомбинантных молекул ДНК (плазмидных векторов), содержащих этот ген. Векторы, способные регулировать экспрессию химерного гена в белок НВс-химеры, называют в настоящем описании "экспрессирующими векторами". Экспрессирующий вектор содержит элементы регуляции экспрессии, включая промотор. Этот кодирующий химеру ген функционально присоединен к экспрессирующему вектору, что позволяет промоторной последовательности регулировать связывание с РНК-полимеразой и экспрессию кодирующего химеру гена. Для экспрессии полипептид-кодирующего гена могут быть использованы индуцибельные,вирусные, синтетические, конститутивные промоторы, описанные Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719 и Odell et al., (1985) Nature, 313:810, а также промоторы с временной, пространственной и пространственно-временной регуляцией, как указано в работе Chua et al. (1989) Science, 244:174-181. Одним из предпочтительных промоторов, используемых в прокариотических клетках, таких какE.coli, является промотор Rec 7, который индуцируется путем экзогенной доставки налидиксовой кислоты. Более предпочтительным промотором является промотор, присутствующий в плазмидном вектореJHEX25 (поставляемом от Promega), который индуцируется путем экзогенной доставки изопропилDтиогалактопиранозида (IPTG). Еще более предпочтительный промотор, промотор tac, присутствует в плазмидном векторе рКК 223-3, и также индуцируется экзогенно поставляемым IPTG. Плазмида рКК 2233 может быть успешно экспрессирована в ряде штаммов E.coli, таких как XL-1, TB1, BL21 и BLR, с использованием примерно от 25 до 100 мкМ IPTG для индуцирования. Неожиданно было обнаружено, что при экспрессии в 2-литровых шейкерных колбах и ферментерах, оптимальные результаты дают концентрации, составляющие примерно от 25 до 50 мкМ IPTG.- 23006207 Несколько штаммов Salmonella, таких как S.typhi и S.typhimurium и гибриды S.typhimurium-E.coli,были использовали для экспрессии иммуногенных трансгенов, включающих ранее полученные химерные частицы НВс, как источники частиц, используемых в качестве иммуногенов и в качестве "живых" аттенюированных вакцин, содержащих целые клетки, и инокулятов, и эти системы экспрессии и вакцинации могут быть использованы в настоящем изобретении. См. патент США 6024961; патент США 5888799; патент США 5387744; патент США 5297441; Ulrich et al., (1998) Adv. Virus Res. 50:141182; Tacket et al., (Aug 1997) Infect. Immun. 65(8):3381-3385, Schodel et al., (Feb 1997) Behring Inst. Mitt.,98:114-119; Nardelli-Haefliger et al., (Dec 1996) Infect. Immun., 64(12):5219-5224; Londono et al. (Apr 1996)Vaccine, 14(6):545-552 и указанные там ссылки. Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, такие как экспрессирующие векторы, совместимые с дрожжевыми клетками или с клетками высших растений или млекопитающих, также рассматриваются в настоящем изобретении. Такие экспрессирующие векторы могут быть также использованы для образования рекомбинантных ДНК-молекул настоящего изобретения. Векторы для использования в дрожжах, таких как S. cerevisiae или Pichia pastoris, могут быть эписомными или интегрирующимися, и хорошо известны специалистам. Эукариотические экспрессирующие векторы клеток хорошо известны специалистам и могут быть получены из нескольких коммерческих источников. Обычно, такие векторы содержат один или несколько подходящих рестрикционных сайтов для инсерции нужного ДНК-сегмента и промоторных последовательностей. Такие векторы содержат, но необязательно, селективные маркеры для использования в эукариотических клетках. Примерами промоторов для использования в S. cerevisiae является промотор киназы фосфоглицериновой кислоты (PGK) S. cerevisiae и дивергентные промоторы GAL 10 и GAL 1, тогда как подходящим промотором для Pichia pastoris является промотор гена алкогольоксидазы (АОХ 1). Так, например, для продуцирования химер в метилотропных дрожжах, Р. pastoris, ген, который кодирует нужную химеру, помещают под контроль регуляторных последовательностей, регулирующих экспрессию структурных генов в Pichia. Полученные компетентные по экспрессии формы этих генов вводят в клетки Pichia. Более конкретно, может быть использована система трансформации и экспрессии, описанная в работе Cregg et al. (1987) Biotechnology, 5:479-485; (1987) Molecular and Cellular Biology, 12:3376-3385. Ген химеры Vl2.Pf3.1 помещают "правее" промотора гена алкогольоксидазы (АОХ 1) и "левее" последовательности терминатора транскрипции того же самого гена АОХ 1. Затем ген и его фланкирующие регуляторные области встраивают в плазмиду, несущую ген HIS4 Р. pastoris и последовательность ARS Р.pastoris (автономно реплицирующуюся последовательность), которая позволяет плазмиде реплицироваться в клетках Р. pastoris [Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12:3376-3385]. Указанный вектор также содержит соответствующие части плазмиды, такой как pBR322, которые обеспечивают репликацию этой плазмиды в клетках E.coli. Полученная плазмида, несущая химерный ген, а также различные дополнительные вышеописанные элементы соответствующим образом трансформируются в мутант his4 P. pastoris, т.е. в клетки штамма, у которого отсутствует функциональный ген гистидинолдегидрогеназы. После отбора колоний трансформантов на средах, не содержащих гистидина, клетки культивируют на средах, не содержащих гистидина, но содержащих метанол, как описано Cregg et а 1., (1987) Molecularand Cellular Biology, 12:3376-3385, для индуцирования промоторов АОХ 1. Эти индуцированные промоторы АОХ 1 приводят к экспрессии химерного белка и продуцированию химерных частиц в Р. pastoris. Рассматриваемый химерный ген может быть также введен путем интеграционной трансформации,для которой не требуется использования последовательности ARS, как описано Cregg et а 1., (1987) Molecular and Cellular Biology, 12:3376-3385. Продуцирование химерных частиц с помощью экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках млекопитающих осуществляют, в качестве примера, с использованием рекомбинантного ДНК-вектора, способного экспрессировать химерный ген в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Это продуцирование осуществляют в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам и более подробно описанными у Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring HarborLaboratories. В одном иллюстративном примере, экспрессирующий вектор pKSV-10, полученный на основе обезьяньего вируса SV40 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) подвергают расщеплению рестриктазами NcoI и HindIII. NcoI/HindIII-фрагмент последовательности, который кодирует нужную НВс-химеру,полученную как описано в примере 1, лигируют в экспрессирующую плазмиду, что приводит к образованию кольцевой рекомбинантной экспрессирующей плазмиды, обозначенной pSV-Pf. Эта экспрессирующая плазмида pSV-Pf содержит интактный ген резистентности к ампициллинуE.coli. Таким образом, штамм E.coli RR101 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), при его трансформации плазмидой pSV-Pf, может быть отобран исходя из резистентности к ампициллину тех бактерий, которые содержат эту плазмиду. Затем, содержащие плазмиду бактерии клонируют, и эти клоны скринируют на соответствующую ориентацию кодирующего гена, встроенного в этот экспрессирующий вектор.- 24006207 Вышеуказанную полученную плазмиду, pSV-Pf, содержащую ген, кодирующий нужную НВсхимеру, размножают путем культивирования E.coli, содержащей эту плазмиду. Плазмидную ДНК выделяют из культур E.coli, как описано у Sambrook et al., см выше. Экспрессию химеры осуществляют путем введения pSV-Pf в клеточную линию млекопитающих,например, в клетки СНО, методом трансфекции с использованием фосфата кальция, Graham et al. (1973)Virol., 52:456, или аналогичным методом. Для обеспечения максимальной эффективности введения pSV-Pf в клетки СНО в культуре, трансфекцию осуществляют в присутствии второй плазмиды pSV2NEO (ATCC 37149) и цитотоксического лекарственного средства G418 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.), как описано в работе Southern etal. (1982) J.Mol.Appl. Genet. 1:327. Эти клетки СНО, которые являются резистентными к G418, имеют обе плазмиды pSV2NEO и pSV-Pf, культивируют, и эти клетки обозначают CHO/pSV-Pf. Благодаря генетической архитектуре экспрессирующего вектора pSV-Pf, химера экспрессируется в полученных клеткахCHO/pSV-Pf, может быть детектирована и выделена из цитоплазмы этих клеток. Полученную композицию, содержащую клеточный белок, выделяют на колонке, как обсуждается в настоящем описании. Выбор конкретного экспрессирующего вектора и в конечном счете конкретного промотора, функционально присоединенного к кодирующему химеру гену, непосредственно зависит от нужных функциональных свойств, например от локализации и времени экспрессии белка и от конкретной трансформируемой клетки-хозяина. Эти ограничения хорошо известны специалистам в области конструирования молекул рекомбинантной ДНК. Однако, вектор, используемый для осуществления настоящего изобретения, может регулировать репликацию, а предпочтительно также экспрессию (для экспрессирующего вектора) химерного гена, встроенного в ДНК-сегмент, к которому он функционально присоединен. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, хозяином, экспрессирующим данную химеру, является прокариот, E.coli, а предпочтительным вектором является прокариотический репликон; то есть ДНК-последовательность, способная регулировать автономную репликацию и поддерживать рекомбинантную в не хромосомную ДНК-молекулу в прокариотическом хозяине, трансформированном этой молекулой. Такие репликоны хорошо известны специалистам. Векторы, которые включают прокариотический репликон, могут также содержать область прокариотического промотора, способную регулировать экспрессию рассматриваемого химерного гена НВс в клетке-хозяине, такой как E.coli, трансформированной этим геном. Промоторные последовательности,совместимые с бактериальными хозяевами, обычно находятся в плазмидных векторах, содержащих один или несколько удобных рестрикционных сайтов для встраивания рассматриваемого ДНК-сегмента. Такими типичными векторными плазмидами являются pUC8, pUC9 и pBR329, поставляемые Biorad Laboratories, (Richmond, CA) и pPL и рКК 223-3, поставляемые от Pharmacia, Piscataway, NJ. Типичные векторы, используемые для экспрессии генов в клетках высших растений и млекопитающих, хорошо известны специалистам, и такими векторами являются растительные векторы, происходящие от опухоль-индуцирующей плазмиды (Ti) Agrobacterium tumefaciens и описанные Rogers et al.,(1987) Meth. in Enzymol., 153:253-277; экспрессирующие векторы млекопитающих, вышеупомянутый вектор pKSV-10 и pCI-neo (Promega Corp.,E1841, Madison, WI). Однако известно, что имеется несколько других систем экспрессирующих векторов, которые функционируют в растениях, включая вектор регуляции переноса pCaMVCN, описанный в работе Fromm et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824. Плазмида pCaMVCN (поставляемая от Pharmacia Piscataway, NJ) включает промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S. Вышеуказанные системы экспрессии в растениях обычно обеспечивают системную или конститутивную экспрессию встроенного трансгена. Системная экспрессия может быть осуществлена в том случае, когда большинство или все растения используются как источник для рассматриваемой химерной молекулы или полученных частиц, или в том случае, когда большая часть растения используется для получения пероральной вакцины. Однако более эффективной может оказаться экспрессия химерной молекулы или частицы в запасающем органе растения, таком как корень, семена или плоды, из которых указанные частицы могут быть легко выделены или гидролизованы. Один из способов достижения экспрессии в запасающем органе заключается в использовании промотора, который экспрессирует регулируемый им ген в одном или нескольких предварительно выбранных или предварительно определенных органов растения, в которых не происходит фотосинтеза. Экспрессия в одном или нескольких предварительно выбранных запасающих органах при незначительной экспрессии или при отсутствии экспрессии в других органах, таких как корни, семена или плоды в отличие от листьев или стеблей, рассматривается здесь как повышенная или преимущественная экспрессия. Характерный промотор, который регулирует экспрессию в одном или нескольких предварительно выбранных органах по сравнению с другими органами в отношении по крайней мере 5:1, определяется здесь как промотор, усиливающий экспрессию в данном органе. Экспрессия, происходящая, в основном,только в одном запасающем органе и, в основном, не происходящая в других запасающих органах, называется орган-специфической экспрессией, то есть отношение продуктов экспрессии в данном запасающем органе к продуктам экспрессии в другом запасающем органе, составляющие примерно 100:1 или более, указывает на специфичность экспрессии в данном органе. Таким образом, промоторы, специфиче- 25006207 ские в отношении экспрессии в запасающем органе, являются членами класса промоторов, усиливающих экспрессию в запасающем органе. Примерами запасающих органов растения являются корни моркови, таро или маниоки, клубни картофеля и мякоть фруктов, таких как красная гуава, маракуйя, манго, папайя, томаты, авокадо, вишня,танжерин, мандарин, пальма, дыни, такие как канталупские дыни, и арбузы, а также другие мясистые плоды, такие как американская тыква, огурцы, манго, абрикосы, персики и семена маиса (кукурузы), сои,риса, масличного рапса и т.п. Промотор CaMV 35S обычно считается конститутивным промотором. Однако недавно проведенные исследования показали, что 21 п.н.-область промотора CaMV 35S, при ее функциональном присоединении к другому гетерологичному обычному промотору зеленой ткани, промотору rbcS-3 А, может превращать полученный химерный промотор в промотор, усиливающий экспрессию в корнях. Эта 21 п.н.последовательность описана в патенте США 5023179. Химерный промотор rbcS-3 А, содержащий 21 п.н.-вставку, как описано в патенте США 5023179, используется здесь как промотор, усиливающий экспрессию в корнях. Аналогичным промотором, усиливающим экспрессию в корнях, который включает вышеуказанный 21 п.н.-сегмент, является область от -90 до +8 самого промотора CaMV 35S. В патенте США 5110732 указано, что усеченный промотор CaMV 35S обеспечивает повышенную экспрессию в корнях и прикорневом семени, то есть ткани, превращающейся в корень. Этот промотор также используется в настоящем изобретении. Другим подходящим усиливающим экспрессию в корнях промотором является промоторная область от -1616 до -1 гена семян масличного рапса (Brassica napus L.), описанного в PCT/GB 92/00416 (WO 91/13922, опубликованная 19 сент. 1991). Штамм DH5 E.coli, содержащий плазмиду pRlambd.aS4, и бактериофаг лямбда.бета.1, который содержит этот промотор, были депонированы в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (National Collection of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen, GB) 8 марта 1990 и имеют регистрационные номера NCIMB40265 и NCIMB40266. Используемая часть этого промотора может быть получена как 1,0 т.п.н.-фрагмент путем расщепления этой плазмиды ферментом HaeIII. Предпочтительным промотором, усиливающим экспрессию в корнях, является промотор маннопинсинтазы (mas), присутствующий в плазмиде рКаn2, описанной DiRitaGelvin (1987) Mol. Gen. Genet.,207:233-241. Этот промотор может быть удален из плазмиды рКаn2 в виде ХbаI-Х.baII-фрагмента. Предпочтительный корнеспецифический промотор маннопин-синтазы состоит из сердцевинной области промотора маннопин-синтазы (mas), простирающейся до положения -138, и активатора маннопинсинтазы, простирающегося от положения -318 до положения -213, и называется в целом AmasPmas. Было обнаружено, что этот промотор способствует увеличению экспрессии в корнях табака примерно в 10-100 раз по сравнению с уровнями экспрессии в листьях. Другим корнеспецифическим промотором является 5'-фланкирующая последовательность длиной примерно из 500 п.н., за которой следует ген богатого гидроксипролином гликопротеина, HRGPnt3, экспрессируемый в процессе образования боковых корней и описанный у Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646. Другой предпочтительный корнеспецифический промотор присутствует в 5'-фланкирующей области корнеспецифического гена табака ToRBF, в положении примерно от -636 до -1, как описано Yamamoto et al. (1991) Plant. Cell 3:371-381. Цис-действующие элементы, регулирующие экспрессию, находятся, как более точно определено этими авторами, в области примерно от -636 до -299 со стороны 5'конца от сайта инициации транскрипции. Yamamoto et al. описали стабильное продуцирование мРНК из гена ToRBF в корнях, но не в листьях, не в меристемах побегов и не в стеблях. Еще одним подходящим промотором, специфичным для запасающих органов, являются 5'- и 3'фланкирующие области гена созревания плодов Е 8 томатов, Lycopersicon esculentum. Эти области и их кДНК-последовательности проиллюстрированы и описаны в работе Deikman et al. (1988) EMBO J., 7(11):3315-3320 и (1992) Plant Physiol., 100:2013-2017. Очевидно, что экспрессию гена Е 8 регулируют три области, локализованные в 5'-фланкирующей последовательности этого гена, длиной 2181 п.н., и в 522 п.н.-последовательности со стороны 3'-конца от сайта добавления poly(А). Одна область, простирающаяся от -2181 до -1088, требуется для активации транскрипции гена Е 8 в незрелом плоде в присутствии этилена, а также способствует транскрипции в процессе созревания. Две другие области, от -1088 до -863 и от -409 до -263, неспособны сообщать восприимчивость к этилену в незрелом плоде, но являются достаточными для экспрессии гена Е 8 в процессе созревания. Сообщалось, что промотор сахарозосинтазы 1 (Sh) кукурузы, который экспрессирует высокие уровни контролируемого им фермента в эндосперме, но гораздо более низкие уровни в корнях и не экспрессирует этот фермент в зеленых тканях или в пыльце, специфически экспрессирует химерный ген репортера, бета-глюкуронидазы (GUS), в клетках флоэмы табака, которые находятся в избыточном количестве в стеблях и корнях. Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:4144-4148. Таким образом,этот промотор может быть использован в органах растений, таких как мясистые плоды, например дыни,- 26006207 то есть канталупские дыни, или семян, которые содержат эндосперм, и корни, которые имеют высокие уровни клеток флоэмы. Другим примером тканеспецифического промотора является промотор лектина, который обладает специфичностью к тканям семян. Этот лектиновый белок в семенах сои кодируется одним геном (Le1),который экспрессируется только во время созревания семян и обеспечивает примерно 2-5% от общего уровня мРНК семян. Ген лектина и семяспецифический промотор были полностью охарактеризованы и использованы для прямой семяспецифической экспрессии в трансгенных растениях табака. См. например, Vodkin et al. (1983) Cell, 34:1023 and Lindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160. Особенно предпочтительным клубнеспецифическим экспрессирующим промотором является 5'фланкирующая область гена пататина картофеля. Использование этого промотора описано в работеTwell et al. (1987) Plant. Mol. Biol., 9:365-375. Этот промотор присутствует во фрагменте бактериофагаLPOTI, длиной примерно из 406 п.н. Промотор LPOTI включает области, имеющие более чем 90 процентную гомологию с четырьмя другими промоторами пататина, и примерно 95-процентную гомологию на протяжении всех 400 оснований с промотором пататина PGT5. Каждый из этих промоторов может быть использован в настоящем изобретении. См. также Wenzler et al., (1989) Plant Mol. Biol., 12:4150. Еще один промотор, усиливающий экспрессию в данном органе, и органспецифический промотор описан Benfey et al. (1988) Science, 244:174-181. Ни на одну из используемых промоторных последовательностей, в основном, не влияет количество химерных молекул или частиц в клетке. Используемый здесь термин "в основном, не влияет" означает,что данный промотор не является восприимчивым к прямому торможению по типу обратной связи (ингибированию) химерными молекулами или частицами, аккумулированными в трансформированных клетках или в трансгенных растениях. Трансфекцию растительных клеток с использованием Agrobacterium tumefaciens обычно лучше всего осуществлять на двудольных растениях. Однодольные растения обычно наиболее легко трансформируются путем так называемого прямого переноса гена протопластов. Прямой перенос гена обычно осуществляют путем электропорации, путем опосредуемого полиэтиленгликолем переноса или путем бомбардировки клеток микрочастицами, несущими нужную ДНК. Эти методы трансфекции хорошо известны специалистам и не обсуждаются в настоящем описании. Методы регенерации целых растений из трансфицированных клеток и протопластов также хорошо известны специалистам, как и методы получения нужного белка из ткани растений. См. также патенты США 5618988 и 5679880 и указанные там ссылки. Трансгенное растение, получаемое методами трансформации Agrobacterium, электропорации или другими методами, обычно содержит один ген на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут называться гетерозиготными по добавленному гену. Однако, поскольку использование термина "гетерозиготный" обычно подразумевает присутствие комплементарного гена на том же самом локусе второй хромосомы из данной пары хромосом, то очевидно, что при отсутствии такого гена в растении, содержащем один добавленный ген, как в данном случае, было бы более точным назвать такое растение "независимым сегрегантом", так как добавленный экзогенный ген, кодирующий химерную молекулу, независимо сегрегируется в процессе митоза и мейоза. Предпочтительным трансгенным растением является трансгенное растение, содержащее промотор, усиливающий экспрессию в данном органе и регулирующий один структурный ген, кодирующий рассматриваемую химерную молекулу НВс, то есть независимый сегрегант. Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по добавленному структурному гену, то есть трансгенное растение, которое содержит два дополнительных гена, по одному гену в одном и том же локусе на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем самоопыления трансгенного растения, являющегося независимым сегрегантом и содержащего один добавленный ген, с последующим проращиванием некоторых продуцированных семян и анализом полученных растений на повышенную аккумуляцию химерных частиц по сравнению с контрольным (нативным, нетрансгенным) растением или с трансгенным растением, являющимся независимым сегрегантом. Гомозиготное трансгенное растение, по сравнению с нативным нетрансгенным растением и с трансгенным растением, являющимся независимым сегрегантом, обнаруживает повышенную аккумуляцию химерных частиц. Следует отметить, что можно также скрещивать два различных трансгенных растения с продуцированием потомства, которое содержит два добавленных независимо сегрегирующихся экзогенных (гетерологичных) гена. Самоопыление соответствующего потомства может приводить к продуцированию растений, которые являются гомозиготными по обоим добавленным экзогенным генам, кодирующим химерную молекулу НВс. Могут быть также рассмотрены возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением. Таким образом, трансгенное растение настоящего изобретения имеет гетерологичный структурный ген, кодирующий рассматриваемую химерную молекулу НВс. Предпочтительным трансгенным растением является независимый сегрегант по добавленному гетерологичному химерному структурному гену- 27006207 НВс, который может передавать этот ген потомству. Более предпочтительным трансгенным растением является растение, гомозиготное по гетерологичному гену и способное передавать этот ген всему потомству после полового скрещивания. Поскольку ген, который кодирует химерную молекулу НВс, не встречается в нативных растениях,то рассматриваемое трансгенное растение аккумулирует частицы химерной молекулы НВс в количестве,превышающем количество этих частиц в нетрансформированном растении такого же типа или линии,если оба этих растения были выращены в одних и тех же условиях. Используемые здесь термины "тот же самый тип" или "та же самая линия" означает растение того же самого кросса, что и клон нетрансформированного растения. Если аллельные вариации между сибсами данного кросса являются незначительными, как в случае в высокой степени инбредного растения, то могут быть проведены сравнения между сибсами или выведено среднее, полученное с использованием нескольких сибсов. И в тех, и в других случаях клоны являются предпочтительными для сравнения. Семена от трансгенного растения выращивают в теплицах, на подоконниках или т.п., и полученные зрелые трансгенные растения подвергают самоопылению с продуцированием генетически чистых растений. Потомство от этих растений дает генетически чистые линии, которые оценивают на аккумуляцию химерных молекулярных частиц НВс, предпочтительно, в открытом поле при ряде различных условий окружающей среды. Трансгенное растение, гомозиготное по аккумуляции частиц химерной молекулы НВс, скрещивают с родительским растением, имеющим другие желательные признаки. Потомство, которое является гетерозиготным или независимо сегрегируемым по аккумуляции частиц химерной молекулы НВс, подвергают возвратному скрещиванию с одним или с другим родителем с получением трансгенных растений,которые обнаруживают аккумуляцию частиц химерной молекулы НВс и другие нужные признаки. Возвратное скрещивание потомства с родителем можно повторять более чем один раз с получением трансгенного растения, которое обладает рядом желательных признаков. Для экспрессии НВс-химеры может быть использована клеточная система насекомых. Так, например, в одной такой системе вирус нуклеарного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) или бакуловирус используют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugipedra илиTrichoplusia larvae. Последовательности, кодирующие химеру, могут быть клонированы в неосновную область вируса,такую как ген полиэдрина, и помещены под контроль промотора полиэдрина. Последующее встраивание химерной последовательности делает ген подиэдрина неактивным и приводит к продуцированию рекомбинантного вируса, не содержащего белка оболочки. Затем рекомбинантные вирусы используют для инфицирования, например, клеток S. frugipedra или Trichoplusia larvae, в которых может быть экспрессирована НВс-химера. Е. Engelhard et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91:3224-3227 and V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc. 1996). Гетерологичные гены, помещенные под контроль промотора полиэдрина вируса нуклеарного полиэдроза Autographa californica (AcNPV), часто экспрессируются на высоких уровнях на поздних стадиях инфицирования. Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие указанный химерный ген, конструируют с использованием системы бакуловирусных челночных векторов [Luckow et al., (1993) J. Virol., 67:4556-4579], коммерчески доступных в виде экспрессирующей системы бакуловирусов Вас-То-Вас (Life Technologies). Получают биомассу рекомбинантных вирусов и мониторинг экспрессии рекомбинантного белка проводят в соответствии со стандартными протоколами (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992; and King et al., The Baculovirus ExpressionSystem: A Laboratory Guide, ChapmanHall, London, 1992). Для функционального присоединения ДНК к векторам посредством комплементарных "липких" концов или тупых концов были разработаны различные методы. Так, например, для встраивания в векторную ДНК, к ДНК-сегменту могут быть добавлены комплементарные гомополимерные "хвосты". Затем вектор и ДНК-сегмент соединяют посредством водородной связи между комплементарными гомополимерными хвостами с образованием рекомбинантных молекул ДНК. Альтернативно, синтетические линкеры, содержащие один или несколько рестрикционных эндонуклеазных сайтов, могут быть использованы для присоединения ДНК-сегмента к экспрессирующему вектору, как описано выше. Эти синтетические линкеры присоединяют к затупленным по концам ДНКсегментам путем инкубирования этих затупленных по концам ДНК-сегментов с большим избытком синтетических линкерных молекул в присутствии фермента, способного катализировать лигирование затупленных по концам молекул ДНК, такого как ДНК-лигаза бактериофага Т 4. Таким образом, продуктами указанной реакции являются ДНК-сегменты, несущие у своих концов синтетические линкерные последовательности. Затем, эти ДНК-сегменты расщепляют соответствующей рестриктионной эндонуклеазой и лигируют в экспрессирующий вектор, который расщепляют ферментом, продуцирующим концы, совместимые с концами этого синтетического линкера. Синтетические линкеры, содержащие ряд рестрикционных эндонулеазных сайтов, могут быть закуплены у ряда фирм,включая New England Biolabs, Beverly, MA. Нужный ДНК-сегмент может быть также получен с исполь- 28006207 зованием ПЦР-технологии, где прямой и обратный праймеры содержат нужные рестрикционные сайты,которые после амплификации могут быть разрезаны так, чтобы указанный ген мог быть встроен в данный вектор. Альтернативно, ПЦР-продукты могут быть непосредственно клонированы в векторы, содержащие выступающие Т-участки (Promega Corp., A3600, Madison, WI), как хорошо известно специалистам. Экспрессированный химерный белок подвергается самосборке с образованием частиц в клеткаххозяевах, независимо от того, является ли хозяином одна клетка или многоклеточный организм. Клетки,содержащие эти частицы, собирают в соответствии со стандартными процедурами, и эти клетки подвергают лизису с использованием камеры пресса Френча, лизоцима, ультразвукового аппарата, бисерной дробилки или микрофлюидизатора (Microfluidics International Corp., Newton MA). После осветления лизата, частицы осаждают 45% сульфатом аммония, ресуспендируют в 20 мМ фосфате натрия, рН 6,8, и диализуют против того же самого буфера. Этот диализованный материал осветляют путем быстрого центрифугирования и полученный супернатант подвергают гель-фильтрации на сефарозе CL-4B. Фракции,содержащие частицы, идентифицируют, подвергают хроматографии на гидроксиапатитах и повторно осаждают сульфатом аммония, а затем ресуспендируют, диализуют, подвергают стерильной фильтрации и хранят при -70 С. Конъюгаты НВс-химеры Любой гаптен, против которого желательно продуцировать В-клеточный или Т-клеточный ответ,может быть присоединен к рассматриваемой НВс-химере или к химерной частице, такой как химерная частица, содержащая гетерологичный линкерный остаток, такой как лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота, цистеин или тирозин, в области петли домена II, и добавленный цистеиновый остаток в домене IV, с получением конъюгата НВс-химеры. Представляющим интерес гаптеном обычно является В-клеточный иммуноген. Таким гаптеном может быть полипептид, углевод (сахарид, то есть олиго- или полисахарид), или неполипептид, неуглеводное химическое соединение, такое как 2,4-динитробензол,или лекарственное средство, такое как кокаин или никотин. Полученный таким образом конъюгат НВсхимерной частицы, может быть использован в качестве инокулята или вакцины, как обсуждается ниже. Поскольку указанный химерный белок подвергается самосборке при экспрессии, а конъюгат образуется после экспрессии, то образование конъюгата обычно происходит с использованием собранных частиц, а не свободных молекул белка. Методы функционального присоединения отдельных гаптенов к белку или полипептиду посредством боковой цепи аминокислотных остатков белка или полипептида с образованием связанного через боковые группы иммуногенного конъюгата, например полипептидного полимера с разветвленной цепью,хорошо известны специалистам. Такими методами являются присоединение посредством функциональных групп одного или нескольких типов, присутствующих на различных боковых цепях, и получения, в результате этого, полипептидного остова белка-носителя (в данном случае НВс-химеры) в этой частице,которая присоединена через боковую цепь, то есть ковалентно присоединена (связана), с гаптеном, но отделена по крайней мере одной боковой цепью. Методы присоединения белков-носителей к гаптенам с использованием каждой из вышеуказанных функциональных групп описаны в работе Erlanger (1980) Method of Enzymology, 70:85; Aurameas et al.,(1978) Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7, 7-23 и в патенте США 4493795, Nestor et al. Кроме того, реакция сайт-направленного присоединения, описанная в работе Rodwell et al. (1985) Biotech., 3:889-894,может быть осуществлена так, чтобы не наблюдалось значительного снижения биологической активности указанных полипептидов. Кроме того, как известно специалистам, белок НВс и полипептидный гаптен могут быть использованы в своей нативной форме либо их функциональные группы могут быть модифицированы путем сукцинилирования лизиновых остатков или посредством реакции с цистеином-тиолактоном. Сульфгидрильная группа может быть также включена либо в белок-носитель, либо в конъюгат посредством реакции функциональных аминогрупп с 2-иминотиоланом, N-гидроксисукцинимидоэфиром 3-(3-дитиопиридил) пропионата или с другими реагентами, известными специалистам. Для облегчения присоединения к боковой группе указанные НВс-химера или гаптен могут быть также модифицированы так, чтобы они включали спейсерное "плечо", такое как гексаметилендиамин или другая бифункциональная молекула. Такая процедура обсуждается ниже. Методы ковалентного связывания полипептидного гаптена сильно варьируются и хорошо известны специалистам в области иммунологии. Так, например, в соответствии с патентом США 4818527 метамалеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидоэфир (ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) либо сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) подвергают реакции с соответствующей НВс-химерой, в результате чего образуется активированный носитель. Затем этот активированный носитель подвергают реакции с гаптеном, таким как терминированный сульфгидрилом гаптен или полипептид, который либо содержит концевой цистеин, либо к которому присоединен дополнительный амино- или карбоксиконцевой цистеиновый остаток, в результате чего образуется ковалентно связанный конъюгат НВс-химеры. В качестве альтернативного примера, амино- 29006207 группа полипептидного гаптена может быть сначала подвергнута реакции с N-сукцинимидил-3-(2 пиридилтио)пропионатом (SPDP, Pharmacia, Piscataway, NJ), а затем этот тиолсодержащий полипептид может быть подвергнут реакции с активированным носителем после восстановления. Разумеется, что серусодержащая часть и акцептор Михаэля, содержащий двойную связь, могут быть подвергнуты обратимой реакции. Эти реакции описаны в инструкциях поставщиков, а также у Kitagawa et al. (1976) J. Biochem., 79:233 и у Lachmann et al., 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119),pp.25-40 (Wiley, Chichester: 1986). В патенте США 4767842 описаны несколько методов ковалентного связывания носителя с полипептидом, которые используются в настоящем изобретении. В одном из этих методов, толилендиизоцианат подвергают реакции с носителем в забуференном диоксаном растворителе при температуре 0 С с получением активированного носителя. Затем полипептидный гаптен смешивают и подвергают реакции с активированным носителем с образованием ковалентно связанного конъюгата НВс-химеры. В частности, может быть использовано большое число гетеробифункциональных агентов, которые образуют дисульфидную связь у одного конца функциональной группы и амидную связь у другого ее конца, включая N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), как описано выше, и которые образуют дисульфидную связь с тиолом либо в НВс-химере, либо в гаптене. Примерами реагентов являются цистеиновый остаток в полипептидном гаптене и амин на партнере по связыванию, таком как амин лизина или другая свободная аминогруппа в белке-носителе. Варианты таких дисульфид/амидобразующих агентов известны специалистам. См., например, Immun. Rev. (1982) 62:185. Другие бифункциональные связывающие агенты образуют тиоэфирную, а не дисульфидную связь. Многие из этих тиоэфиробразующих агентов являются коммерчески доступными и представляют собой реакционноспособные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2 иодуксусной кислоты, 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты и т.п. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их объединения с сукцинимидом или натриевой солью 1 гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. Особенно предпочтительным связывающим агентом способа настоящего изобретения является сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат(SMCC), поставляемый от Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Вышеприведенный список не является исчерпывающим, и очевидно, что могут быть использованы модификации указанных соединений. На фиг. 6 схематично проиллюстрированы (схема 1) получение активированного носителя НВс с использованиемSMCC (I) и последующая реакция этого активированного носителя с гаптеном, на конце которого находится сульфгидрил (II). Полипептидный гаптен может быть получен различными путями, хорошо известными специалистам. При этом может быть легко использована обычная техника пептидного синтеза. Так, например, для продуцирования более длинных пептидов может быть использована техника рекомбинантных ДНК и ПЦР-технология. Поскольку нужные последовательности обычно являются относительно короткими, то может быть использован твердофазный химический синтез. Примеры полипептидных гаптенов представлены выше в таблицах А и В. Каждый из этих полипептидов может быть присоединен посредством своей N-концевой аминогруппы или с использованием дополнительного N-концевого цистеина, который не показан в таблице. Аналогичные подходы используют для связывания так называемых "химических соединений" с белками-носителями. Обычно для связывания химического соединения используют его соответствующую функциональную группу. Примером химического гаптена, индуцированные антитела против которого защищают от инфекции Streptococcus рnеumоniae, является гидроксигексаноат 6-O-фосфохолина.Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154:3373-3382. В нижеприведенной таблице представлены другие примеры химических гаптенов. Химические гаптены