Слитые белки glp-1
Номер патента: 5584
Опубликовано: 28.04.2005
Авторы: Глеснер Вольфганг, Миканович Радмилла, Щанг Шенг-Ханг Рэйнбоу
Формула / Реферат
1. Гетерологичный слитый белок, содержащий первый полипептид, имеющий N-конец и C-конец, слитый со вторым полипептидом, имеющим N-конец и C-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей из
a) альбумина человека;
b) аналогов альбумина человека и
c) фрагментов альбумина человека,
и где C-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида.
2. Гетерологичный слитый белок, содержащий первый полипептид, имеющий N-конец и C-конец, слитый со вторым полипептидом, имеющим N-конец и C-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей из
a) альбумина человека;
b) аналогов альбумина человека и
c) фрагментов альбумина человека,
и где C-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида посредством пептидного линкера.
3. Гетерологичный слитый белок по п.2, где пептидный линкер выбран из группы, состоящей из
a) богатого глицином пептида;
b) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и
c) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
4. Гетерологичный слитый белок по п.1, 2 или 3, где GLP-1-соединение содержит последовательность формулы 1 [SEQ ID NO:2]
где Xaa в положении 8 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 9 означает Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 11 означает Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 14 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 16 означает Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp или Lys;
Xaa в положении 17 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 18 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr или Lys;
Xaa в положении 19 означает Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln или Lys;
Xaa в положении 20 означает Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr или Lys;
Xaa в положении 21 означает Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 22 означает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 23 означает Gln, Asn, Arg, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 24 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 25 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 26 означает Lys, Arg, Gln, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 27 означает Leu, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 30 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 31 означает Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 32 означает Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 33 означает Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 34 означает Asn, Lys, Arg, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 35 означает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 36 означает Gly, Arg, Lys, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 37 означает Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 38 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована;
Xaa в положении 39 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована;
Xaa в положении 40 означает Gly, Asp, Glu или Lys или делетирована;
Xaa в положении 41 означает Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 42 означает Ser, Pro, Lys, Glu или Asp или делетирована;
Xaa в положении 43 означает Ser, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 44 означает Gly, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована и
Xaa в положении 45 означает Ala, Ser, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована;
при условии, что в том случае, когда аминокислота в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 делетирована, то каждая аминокислота, расположенная ниже данной аминокислоты, также делетирована.
5. Гетерологичный слитый белок по п.4, где GLP-1-соединение содержит не более 6 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
6. Гетерологичный слитый белок по п.5, где GLP-1-соединение содержит не более 5 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
7. Гетерологичный слитый белок по п.6, где GLP-1-соединение содержит не более 4 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
8. Гетерологичный слитый белок по п.7, где GLP-1-соединение содержит не более 3 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
9. Гетерологичный слитый белок по п.8, где GLP-1-соединение содержит не более 2 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
10. Гетерологичный слитый белок, содержащий первый полипептид, имеющий N-конец и C-конец, слитый со вторым полипептидом, имеющим N-конец и C-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей из
a) Fc-фрагмента иммуноглобулина;
b) аналога Fc-фрагмента иммуноглобулина и
c) фрагментов Fc-фрагмента иммуноглобулина,
и где C-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида.
11. Гетерологичный слитый белок по п.10, где C-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида посредством пептидного линкера.
12. Гетерологичный слитый белок по п.11, где пептидный линкер выбран из группы, состоящей из
a) богатого глицином пептида;
b) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и
c) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
13. Гетерологичный слитый белок по п.10, 11 или 12, где GLP-1-соединение содержит последовательность формулы 1 [SEQ ID NO: 2]
где Xaa в положении 8 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 9 означает Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 11 означает Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 14 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 16 означает Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp или Lys;
Xaa в положении 17 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 18 означает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr или Lys;
Xaa в положении 19 означает Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln или Lys;
Xaa в положении 20 означает Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr или Lys;
Xaa в положении 21 означает Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 22 означает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 23 означает Gln, Asn, Arg, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 24 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 25 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 26 означает Lys, Arg, Gln, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 27 означает Leu, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 30 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 31 означает Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 32 означает Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 33 означает Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 34 означрхт Asn, Lys, Arg, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 35 означает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;
Xaa в положении 36 означает Gly, Arg, Lys, Glu, Asp или His;
Xaa в положении 37 означает Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 38 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована;
Xaa в положении 39 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована;
Xaa в положении 40 означает Gly, Asp, Glu или Lys или делетирована;
Xaa в положении 41 означает Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 42 означает Ser, Pro, Lys, Glu или Asp или делетирована;
Xaa в положении 43 означает Ser, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована;
Xaa в положении 44 означает Gly, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована и
Xaa в положении 45 означает Ala, Ser, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована;
при условии, что в том случае, когда аминокислота в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 делетирована, то каждая аминокислота, расположенная ниже данной аминокислоты, также делетирована.
14. Гегерологичный слитый белок по п.13, где GLP-1-соединение содержит не более 6 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
15. Гетерологичный слитый белок по п.14, где GLP-1-соединение содержит не более 5 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
16. Гетерологичный слитый белок по п.15, где GLP-1-соединение содержит не более 4 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
17. Гетерологичный слитый белок по п.16, где GLP-1-соединение содержит не более 3 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
18. Гетерологичный слитый белок по п.17, где GLP-1-соединение содержит не более 2 аминокислот, отличающихся от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH или эксендине-4.
19. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-18 для производства лекарственного средства для лечения больных с инсулиннезависимым сахарным диабетом.
20. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-18 для производства лекарственного средства для лечения больных ожирением.
Текст
005584 Данное изобретение относится к глюкагонподобным пептидам, включая их аналоги и производные,слитым с белками, обладающими эффектом увеличения периода полужизни пептидов in vivo. Указанные слитые белки можно использовать для лечения инсулинзависимого сахарного диабета, а также ряда других состояний. Глюкагонподобный пептид 1 (GLP-1) представляет собой пептид из 37 аминокислот, который секретируется L-клетками кишечника в ответ на прием пищи. Обнаружено, что он стимулирует секрецию инсулина (инсулинотропное действие), тем самым вызывая поглощение глюкозы клетками и пониженное содержание глюкозы в сыворотке [см., например, Mojsov, S., (1992) Int. Peptide Protein Research, 40: 333-343]. Однако GLP-1 обладает слабой активностью. Последующее эндогенное расщепление между 6 и 7 положениями дает более эффективный биологически активный пептид GLP-1(7-37)ОН. Известны многочисленные аналоги и производные GLP-1, которые в данном описании названы GLP-1 соединениями. Указанные аналоги GLP-1 включают эксендины, которые представляют собой пептиды,обнаруженные в яде ящерицы-ядозуба. Эксендины обладают гомологией последовательностей с нативным GLP-1 и могут связывать рецептор GLP-1 и инициировать каскад сигнальной трансдукции, отвечающий за многочисленные активности, которые считают характерными для GLP-1(7-37)ОН.GLP-1-соединения обладают рядом физиологически важных активностей. Например, показано, чтоGLP-1 стимулирует высвобождение инсулина, понижает секрецию глюкагона, ингибирует опорожнение желудка и усиливает утилизацию глюкозы. [Nauck, M., et аl. (1993) Diabetologia 36: 741-744; Gutniak, M.GLP-1 является самым многообещающим средством для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета (ИНСД). На рынке имеется множество пероральных лекарственных средств для лечения резистентности к инсулину, связанной с ИНСД. Однако по мере того, как заболевание прогрессирует, пациенты должны переходить к лечению, которое стимулирует высвобождение инсулина, и в конечном итоге к лечению, которое заключается в инъекциях инсулина. Однако современные лекарственные средства,которые стимулируют высвобождение инсулина, могут также вызывать гипогликемию, так же, как фактическое введение инсулина. Однако активность GLP-1 контролируется уровнями глюкозы в крови. В том случае, когда уровни падают до определенного порогового уровня, GLP-1 не активен. Таким образом, не существует риска гипогликемии, связанного с лечением с привлечением GLP-1. Однако полезность терапии с привлечением пептидов GLP-1 ограничена их быстрым клиренсом и короткими периодами полужизни. Например, GLP-1(7-37) имеет период полужизни в сыворотке, составляющий только от 3 до 5 мин. Амид GLP-1(7-36) при подкожном введении обладает временем действия около 50 мин. Даже аналоги и производные, которые устойчивы к расщеплению эндогенными протеазами, не имеют периода полужизни достаточно продолжительного для того, чтобы избежать повторных введений на протяжении 24-часового периода. Быстрый клиренс терапевтического средства неудобен в тех случаях, когда требуется поддержать высокий уровень средства в крови на протяжении длительного периода времени, так как будут необходимы многократные введения. Кроме того, длительно действующее соединение особенно важно в случае пациентов с диабетом, схема лечения которых в прошлом заключалась только в пероральном приеме лекарственных средств. Для таких пациентов часто очень тяжелым является время перехода к схеме лечения, которая заключается в многократных инъекциях лекарственного средства. Данное изобретение преодолевает проблемы, связанные с доставкой соединения, которое имеет короткий период полужизни в плазме. Соединения согласно данному изобретению охватывают GLP-1 соединения, слитые с другим белком, с длительным периодом полужизни в циркуляторном русле, таким как Fc-фрагмент иммуноглобулина или альбумин. Как правило, трудно манипулировать небольшими терапевтическими пептидами, так как даже небольшие изменения их структуры могут влиять на стабильность и/или биологическую активность. Это особенно справедливо в случае GLP-1-соединений, разрабатываемых в настоящее время. Например,GLP-1(7-37)ОН имеет тенденцию подвергаться конформационному изменению от структуры, в основном представленной -спиралью, к структуре, представленной в основном -складками. Следствием указанной формы в виде -складок является агрегированный материал, который предположительно является неактивным. Таким образом, не ожидалось, что можно разработать биологически активные GLP-1 слитые белки с увеличенными периодами полужизни. Особенно неожиданным это было с точки зрения трудности работы отдельно с GLP-1(7-37)ОН и большого размера партнера при слиянии по сравнению с небольшим связанным пептидом GLP-1. Соединения согласно данному изобретению включают гетерологичные слитые белки, содержащие первый полипептид, имеющий N-конец и С-конец, слитый со вторым полипептидом, имеющим N-конец и С-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей изb) аналогов альбумина человека иc) фрагментов альбумина человека,-1 005584 и где С-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида. Соединения согласно данному изобретению также включают гетерологичный слитый белок, содержащий первый полипептид, имеющий N-конец и С-конец, слитый со вторым полипептидом, имеющим N-конец и С-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей изb) аналогов альбумина человека иc) фрагментов альбумина человека,и где С-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида посредством пептидного линкера. Предпочтительно пептидный линкер выбран из группы, состоящей изc) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3. Дополнительные соединения согласно данному изобретению включают гетерологичный слитый белок, содержащий первый полипептид, имеющий N-конец и С-конец, слитый со вторым полипептидом,имеющим N-конец и С-конец, где первым полипептидом является GLP-1-соединение, а второй полипептид выбран из группы, состоящей изc) фрагментов Fc-фрагмента иммуноглобулина,и где С-конец первого полипептида слит с N-концом второго полипептида. GLP-1-соединение может быть слито со вторым полипептидом посредством пептидного линкера. Предпочтительно пептидный линкер выбран из группы, состоящей изc) пептида, имеющего последовательность [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3. Как правило, предпочтительно, чтобы GLP-1-соединение, которое является частью гетерологичного слитого белка, не имело более 6 аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты вGLP-1(7-37)ОН, GLP-1(7-36)ОН или эксендине-4. Еще более предпочтительно, чтобы GLP-1-соединение не имело более 5 аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(737)ОН, GLP-1(7-36)ОН или эксендине-4. Наиболее предпочтительно, чтобы GLP-1-соединение не имело более 4, 3 или 2 аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН,GLP-1(7-36)ОН или эксендине-4. Предпочтительно GLP-1-соединение, которое является частью гетерологичного слитого белка, имеет глицин или валин в положении 8. Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим описанный в данной заявке гетерологичный слитый белок, векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, и клеткам-хозяевам,трансфицированным или трансформированным описанными в данной заявке векторами. Также раскрыт способ получения гетерологичного слитого белка, включающий в себя стадии транскрипции и трансляции описанного в данной заявке полинуклеотида в условиях, при которых гетерологичный слитый белок экспрессируется в регистрируемых количествах. Данное изобретение также относится к способу нормализации уровней глюкозы в крови у млекопитающего, которое в этом нуждается, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества описанного в данной заявке гетерологичного слитого белка. Далее изобретение проиллюстрировано со ссылками на следующие чертежи. Фиг. 1 - аминокислотная последовательность Fc IgG1, охватывающая шарнирную область, домены СН 2 и СН 3; фиг. 2 - аминокислотная последовательность сывороточного альбумина человека; фиг. 3 - А. SDS-ПААГ-гель и иммуноблот того же самого геля, показывающие молекулярную массуIgG1-Fc и GLP-1-Fc-слитых белков (дорожка 1, стандарты М.м.; дорожка 2, очищенный Fc; дорожка 3,среды при имитационной трансфекции; дорожка 4, Val8-GLP-1-Fc; дорожка 5, эксендин-4-Fc) В. SDSПААГ-гель и иммуноблот того же самого геля, показывающие молекулярную массу HSA человека и слитых белков GLP-1-HSA (дорожка 1, стандарты М.м.; дорожка 2, очищенный HSA; дорожка 3, среды при имитационной трансфекции; дорожка 4, Val8-GLP-1-HSA; дорожка 5, Val8-GLP-1-[Gly-Gly-Gly-GlySer]3-HSA; дорожка 6, эксендин-4-HSA; дорожка 7, эксендин-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA); фиг. 4 - SDS-ПААГ-гель очищенного Fc, альбумина и GLP-1-слитых белков (дорожка 1, стандарты М.м.; дорожка 2, очищенный Fc; дорожка 3, Val8-GLP-1-Fc; дорожка 4, эксендин-4-Fc; дорожка 5, стандарты М.м.; дорожка 6, Val8-GLP-1-HSA; дорожка 7, эксендин-4-HSA; дорожка 8, эксендин-4-[Gly-GlyGly-Gly-Ser]3-HSA); фиг. 5 - экспрессирующий клонирующий вектор, содержащий области Fc, показанные на фиг. 1; фиг. 6 - экспрессирующий клонирующий вектор, содержащий последовательность альбумина, показанную на фиг. 2;-2 005584 фиг. 7 - экспрессирующий клонирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую 15-аминокислотный линкер, слитый в рамке и на 5'-конце последовательности альбумина, показанной на фиг. 2; фиг. 8 - кривые доза-ответ активности GLP-1-слитых белков in vitro; фиг. 9 - фармакокинетика слитых с Fc и HSA белков GLP-1; фиг. 10 - глюкодинамический ответ на эксендин-Fc у двух нормальных собак при голодании; фиг. 11 - инсулинотропный ответ на эксендин-Fc у двух нормальных собак при голодании; фиг. 12 - последовательность ДНК, кодирующая Fc-область IgG1 человека; фиг. 13 - последовательность ДНК, кодирующая белок альбумина человека. Гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению содержат GLP-1-соединение, слитое с альбумином человека, аналогом альбумина человека, фрагментом альбумина человека, Fc-фрагментом иммуноглобулина, аналогом Fc-фрагмента иммуноглобулина или фрагментом Fc-фрагмента иммуноглобулина. С-конец GLP-1-соединения может быть слит непосредственно или слит через пептидный линкер с N-концом альбумина или белка Fc. Указанные гетерологичные слитые белки биологически активны и имеют увеличенный период полужизни по сравнению с нативным GLP-1. Предпочтительно GLP-1-соединения, которые составляют часть гетерологичного слитого белка, охватывают полипептиды, имеющие примерно от двадцати пяти до тридцати девяти аминокислот природного происхождения или неприродного происхождения, которые обладают достаточной гомологией с нативным GLP-1(7-37)ОН, так что они проявляют инсулинотропную активность посредством связывания с рецептором GLP-1 на -клетках поджелудочной железы. GLP-1-соединение обычно содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность GLP-1(7-37)ОН, аналога GLP-1(7-37)ОН, фрагментаGLP-1(7-37)ОН или фрагмента аналога GLP-1(7-37)ОН. GLP-1(7-37)ОН имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1: В соответствии с обычными в данной области правилами аминоконцу GLP-1(7-37)ОН присвоен номер остатка 1, а карбоксильному концу - номер 37. Другие аминокислоты в полипептиде пронумерованы последовательно, как показано в SEQ ID NO: 1. Например, положение 12 представлено фенилаланином, а положение 22 - глицином.GLP-1-соединения также охватывают GLP-1-фрагменты. GLP-1-фрагменом является полипептид,полученный после укорочения на одну или несколько аминокислот N-конца и/или С-конца GLP-1(737)ОН, или его аналога, или производного. Номенклатура, используемая для описания GLP-1(7-37)ОН также применима для фрагментов GLP-1. Например, GLP-1(9-36)ОН обозначен фрагмент GLP-1, полученный укорочением на две аминокислоты N-конца и на одну аминокислоту С-конца. Аминокислоты во фрагменте обозначены таким же номером, как и соответствующая аминокислота в GLP-1(7-37)ОН. Например, N-концевая глутаминовая кислота в GLP-1(9-36)ОН находится в положении 9; положение 12 занято фенилаланином и положение 22 занято глицином, также как в GLP-1(7-37)ОН. В случае GLP-1(736)ОН глицин в положении 37 GLP-1(7-37)ОН делетирован.GLP-1-соединения также включают полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот добавлены к N-концу и/или С-концу GLP-1(7-37)ОН или его фрагменту или аналогу. ПредпочтительноGLP-1-соединения данного типа имеют примерно до тридцати девяти аминокислот. Аминокислоты в удлиненном GLP-1-соединении обозначены таким же номером, как и соответствующая аминокислота в GLP-1(7-37)ОН. Например, N-концевая аминокислота GLP-1-соединения, полученного добавлением двух аминокислот к N-концу GLP-1(7-37)ОН, имеет положение 5; и С-концевая аминокислота GLP-1 соединения, полученного добавлением одной аминокислоты к С-концу GLP-1(7-37)ОН, имеет положение 38. Таким образом, положение 12 занято фенилаланином, а положение 22 занято глицином в обоих из указанных удлиненных GLP-1-соединениях, также как в GLP-1(7-37)ОН. Аминокислоты 1-6 удлиненного GLP-1-соединения предпочтительно являются такими же или представляют собой консервативную замену аминокислоты в соответствующем положении GLP-1(1-37)ОН. Аминокислоты 38-45 удлиненного GLP-1-соединения предпочтительно являются такими же или представляют собой консервативную замену аминокислоты в соответствующем положении глюкагона или эксендина-4.GLP-1-соединения согласно данному изобретению охватывают аналоги GLP-1. Аналог GLP-1 обладает достаточной гомологией с GLP-1(7-37)ОН или фрагментом GLP-1(7-37)ОН, так что аналог обладает инсулинотропной активностью. Предпочтительно аналог GLP-1 имеет аминокислотную последовательность GLP-1(7-37)ОН или его фрагмента, модифицированную так, что одна, две, три, четыре или пять аминокислот отличаются от аминокислот в соответствующих положениях GLP-1(7-37)ОН или-3 005584 фрагмента GLP-1(7-37)ОН. В номенклатуре, используемой в данном описании для обозначения GLP-1 соединений, замещающую аминокислоту и ее положение указывают перед исходной структурой. Например, Glu22-GLP-1(7-37)ОН означает GLP-1-соединение, в котором глицин, обычно находящийся в положении 22 GLP-1(7-37)ОН, был заменен глутаминовой кислотой; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)ОН означаетGLP-1-соединение, в котором аланин, обычно находящийся в положении 8, и глицин, обычно находящийся в положении 22 GLP-1(7-37)OH, были соответственно заменены валином и глутаминовой кислотой.GLP-1-соединения согласно данному изобретению также включают производные GLP-1. Определение производное GLP-1 получила молекула, имеющая аминокислотную последовательность GLP-1 или аналога GLP-1, но дополнительно претерпевшая химическую модификацию одной или нескольких боковых групп аминокислот молекулы, -углеродных атомов, концевой аминогруппы или концевой группы карбоновой кислоты. Химическая модификация включает без ограничения добавление химических фрагментов, создание новых связей и удаление химических фрагментов. Модификации боковых групп аминокислот включают без ограничения ацилирование -аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование групп карбоновой кислоты глутаминовой или аспарагиновой кислоты и дезаминирование глутамина или аспарагина. Модификации концевой аминогруппы включают без ограничения модификации: дезаминоформу, низший N-алкил, низший N-диалкил и Nацил. Модификации концевой карбоксильной группы включают без ограничения модификации с образованием амида, низшего алкиламида, диалкиламида и сложного низшего алкилэфира. Низший алкил представляет собой С 1-С 4 алкил. Кроме того, одна или несколько боковых групп или концевых групп может быть защищена защитными группами, известными специалисту в области химии белка. -Углерод аминокислоты может быть моно- или диметилирован. Любое GLP-1-соединение может быть частью гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению, при условии, что само GLP-1-соединение способно связываться и индуцировать передачу сигнала посредством GLP-1-рецептора. Связывание GLP-1-рецептора и передачу сигнала можно оценить с использованием анализов in vitro, таких как анализы, описанные в европейском патенте ЕР 619322 и патенте США 5120712 соответственно. В данной области известны многочисленные активные фрагмента, аналоги и производные GLP-1, и любой из этих аналогов и производных также может являться частью гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению. Некоторые примеры новых аналогов GLP-1, а также аналогов и производных GLP-1, известных в данной области, представлены в данном описании. Некоторые аналоги GLP-1 и фрагменты GLP-1, известные в данной области, включают, например,GLP-1(7-34) и GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37) и Lys18-GLP-1(7-37). Аналоги GLP-1, такие как GLP-1(7-34) и GLP-1(7-35), описаны в патенте США 5118666. Также известны биологически процессированные формы GLP-1, которые обладают инсулинотропными свойствами, такие как GLP-1(7-36). Другие известные биологически активные GLP-1 соединения описаны в патенте США 5977071 Hoffmann, et al., патенте США 5545618 Buckley, et al. и Adelhorst, et al., J. Biol. Chem. 269: 6275 (1994). Предпочтительная группа аналогов GLP-1 состоит из аналогов GLP-1 формулы I (SEQ ID NO: 2):-4 005584 Хаа в положении 24 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 25 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 26 означает Lys, Arg, Gln, Glu, Asp или His; Хаа в положении 27 означает Leu, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 30 означает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 31 означает Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 32 означает Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 33 означает Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 34 означает Asn, Lys, Arg, Glu, Asp или His; Хаа в положении 35 означает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys; Хаа в положении 36 означает Gly, Arg, Lys, Glu, Asp или His; Хаа в положении 37 означает Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована; Хаа в положении 38 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована; Хаа в положении 39 означает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирована; Хаа в положении 40 означает Gly, Asp, Glu или Lys или делетирована; Хаа в положении 41 означает Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp или Lys или делетирована; Хаа в положении 42 означает Ser, Pro, Lys, Glu или Asp или делетирована; Хаа в положении 43 означает Ser, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована; Хаа в положении 44 означает Gly, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирована; и Хаа в положении 45 означает Ala, Ser, Val, Glu, Asp или Lys или делетирована; при условии, что в том случае, когда аминокислота в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 делетирована, то каждая аминокислота, расположенная ниже данной аминокислоты, также делетирована. Предпочтительно GLP-1-соединение формулы I содержит меньше шести аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или эксендине-4. Более предпочтительно меньше пяти аминокислот отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или эксендине-4. Еще более предпочтительно меньше четырех аминокислот отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или эксендине-4.GLP-1-соединения согласно данному изобретению включают производные формулы I, такие как его С-1-6-сложный эфир, или амид, или С-1-6-алкиламид, или С-1-6-диалкиламид. В заявке на выдачу патента WO 99/43706 описаны производные GLP-1-соединений формулы I, и заявка включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Соединения формулы I, дериватизированные, как описано вWО 99/43706, и недериватизированные охвачены данным изобретением. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений состоит из аналогов GLP-1 формулы II (SEQR в положении 37 означает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирована. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений состоит из аналогов GLP-1 формулы III (SEQR в положении 37 означает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, или делетирована. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений состоит из аналогов GLP-1 формулы IV (SEQR в положении 37 означает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирована. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений состоит из аналогов GLP-1 формулы V (SEQR в положении 37 означает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирована. Предпочтительные GLP-1-соединения формул I, II, III, IV и V включают аналоги GLP-1 или фрагменты аналогов GLP-1, причем аналоги или фрагменты содержат аминокислоту, отличную от аланина, в положении 8 (аналоги по положению 8). Предпочтительно указанные аналоги по положению 8 содержат одно или несколько дополнительных изменений в положениях 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31,33, 34, 35, 36 и 37 по сравнению с соответствующими аминокислотами нативного GLP-1(7-37)ОН. Также предпочтительно указанные аналоги имеют 6 или меньше изменений по сравнению с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)ОН или GLP-1(7-36)ОН. Более предпочтительные аналоги имеют 5 или меньше изменений по сравнению с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(737)ОН или GLP-1(7-36)ОН или имеют 4 или меньше изменений по сравнению с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)ОН или GLP-1(7-36)ОН. Еще более предпочтительно указанные аналоги имеют 3 или меньше изменений по сравнению с соответствующими аминокислотами в нативномGLP-1(7-37)ОН или GLP-1(7-36)ОН. Наиболее предпочтительно указанные аналоги имеют 2 или меньше изменений по сравнению с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)ОН. Обнаружено, что соединения формул II, III, IV и V обладают пониженной склонностью к агрегации и образованию нерастворимых форм. Это также важно в контексте слитого белка, в котором относительно небольшой пептид GLP-1 может сохранять активную конформацию несмотря на то, что он слит с гораздо более крупным белком. Предпочтительные GLP-1-соединения формул II, III, IV и V, охватываемые слитыми белками согласно данному изобретению, включают аналоги GLP-1 или фрагменты аналоговGLP-1, в которых глицин в положении 22 и предпочтительно аланин в положении 8 были заменены другой аминокислотой. В том случае, когда положение 22 занято аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, аргинином или лизином, положение 8 предпочтительно представлено глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. В том случае, когда положение 22 занято сульфоновой кислотой, такой как цистеиновая кислота, положение 8 предпочтительно представлено глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5),при этом аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН за исключением того, что аминокислота в положении 8 предпочтительно представляет собой глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, а положение 30 занято глутаминовой кислотой,аспарагиновой кислотой, серином или гистидином и более предпочтительно глутаминовой кислотой. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5), причем аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН, за исключением того, что аминокислота в положении 8 предпочтительно представляет собой глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, а положение 37 занято гистидином, лизином,аргинином, треонином, серином, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, триптофаном, тирозином, фенилаланином и более предпочтительно гистидином. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5), причем аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН за исключением того, что аминокислота в положении 8 предпочтительно представляет собой глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, и положение 22 представлено глутаминовой кислотой, лизином, аспарагиновой кислотой или аргинином и более предпочтительно глутаминовой кислотой или лизином, и положение 23 представлено лизином, аргинином, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой и гистидином и более предпочтительно лизином или глутаминовой кислотой. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1 формулы V (SEQ ID NO: 6),причем аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН за исключением того, что аминокислота в положении 8 предпочтительно представляет собой глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, и положение 22 представлено глутаминовой кислотой, лизином, аспарагиновой кислотой или аргинином и более предпочтительно глутаминовой кислотой или лизином, и положение 27 представлено аланином, лизином, аргинином, триптофаном, тирозином, фенилаланином или гистидином и более предпочтительно аланином. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1 формулы II, причем аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН, за исключением того, что аминокислота в положении 8 и одна, две или три аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из положения 9, положения 11, положения 12, положения 16, положения 18, положения 22, положения 23, положения 24, положения 26,-7 005584 положения 27, положения 30, положения 31, положения 33, положения 34, положения 35, положения 36 и положения 37, отличаются от аминокислот в соответствующих положениях нативного GLP-1(7-37)ОН. Другие предпочтительные GLP-1-соединения формулы II включают-8 005584 Другая предпочтительная группа аналогов и производных GLP-1 для применения в данном изобретении состоит из молекул формулы VI (SEQ ID NO: 7)R2 означает Gly-OH. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений для применения в данном изобретении заявлена в WO 91/11457 и, по существу, состоит из GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) или GLP-1(7-37) или их амидной формы и их фармацевтически приемлемых солей, имеющих по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, состоящей из(а) замены лизина в положении 26 и/или положении 34 глицином, серином, цистеином, треонином,аспарагином, глутамином, тирозином, аланином, валином, изолейцином, лейцином, метионином, фенилаланином, аргинином или D-лизином; или замены аргинина в положении 36 глицином, серином, цистеином, треонином, аспарагином, глутамином, тирозином, аланином, валином, изолейцином, лейцином,метионином, фенилаланином, лизином или D-аргинином;(c) по меньшей мере одной из замен: валина в положении 16 на тирозин; серина в положении 18 на лизин; глутаминовой кислоты в положении 21 на аспарагиновую кислоту; глицина в положении 22 на серин; глутамина в положении 23 на аргинин; аланина в положении 24 на аргинин и лизина в положении 26 на глутамин; и(d) по меньшей мере одной из замен: аланина в положении 8 глицином, серином или цистеином; глутаминовой кислоты в положении 9 аспарагиновой кислотой, глицином, серином, цистеином, треонином, аспарагином, глутамином, тирозином, аланином, валином, изолейцином, лейцином, метионином или фенилаланином; глицина в положении 10 серином, цистеином, треонином, аспарагином, глутамином, тирозином, аланином, валином, изолейцином, лейцином, метионином или фенилаланином; и аспарагиновой кислоты в положении 15 глутаминовой кислотой; и(e) замены гистидина в положении 7 глицином, серином, цистеином, треонином, аспарагином, глутамином, тирозином, аланином, валином, изолейцином, лейцином, метионином или фенилаланином илиD- или N-ацилированной или алкилированной формой гистидина; при этом в случае замен (а), (b), (d) и (е) замененные аминокислоты необязательно могут быть в Dформе и аминокислоты, замененные в положении 7, необязательно могут быть в N-ацилированной илиN-алкилированной форме. Так как фермент дипептидилпептидаза IV (DPP IV) может быть ответственен за наблюдаемую быструю инактивацию in vivo введенного GLP-1 [см., например, Mentlein, R., et al., Eur. J. Biochem., 214: 829-835 (1993)], то предпочтительны аналоги и производные GLP-1, которые защищены от активностиDPP IV в контексте слитого белка, и более предпочтительны слитые белки, в которых GLP-1-соединение представляет собой Gly8-GLP-1(7-37)ОН, Val8-GLP-1(7-37)ОН, -метил-Аla8-GLР-1(7-37)ОН или Gly8Gln21-GLP-1(7-37)ОН. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений для применения в данном изобретении состоит из соединений формулы VII (SEQ ID NO: 8), заявленных в патенте США 5512549, который специально включен в данное описание в виде ссылки.R2 выбрана из группы, состоящей из неразветвленного С 6-С 10 ацила или отсутствует;-9 005584 Более предпочтительными соединениями формулы IV для применения в данном изобретении являются соединения, в которых Хаа является Аrg, а R2 является неразветвленным С 6-С 10 ацилом. Еще более предпочтительными соединениями формулы IV для применения в данном изобретении являются соединения, в которых Хаа является Аrg, R2 является неразветвленным С 6-С 10 ацилом и R3 является Gly-OH. Другими высоко предпочтительными соединениями формулы IV для применения в данном изобретении являются соединения, в которых Хаа является Аrg, R2 является неразветвленным С 6-С 10 ацилом, R3 является Gly-OH и R1 означает 4-имидазопропионил. Особенно предпочтительным соединением формулы IV для применения в данном изобретении является соединение, в котором Хаа является Аrg, R2 является неразветвленным С 8-ацилом, R3 является Gly-OH и R1 является 4-имидазопропионилом. Предпочтительно GLP-1-соединения включают аналоги GLP-1, в которых основная цепь таких аналогов или фрагментов содержит в положении 8 аминокислоту, отличную от аланина (аналоги по положению 8). Основная цепь также может содержать в положении 7 L-гистидин, D-гистидин или модифицированные формы гистидина, такие как дезаминогистидин, 2-аминогистидин, -гидроксигистидин, гомогистидин, -фторметилгистидин или -метилгистидин. Предпочтительно указанные аналоги по положению 8 содержат одно или несколько дополнительных изменений в положениях 12, 16, 18, 19, 20, 22,25, 27, 30, 33 и 37 по сравнению с соответствующей аминокислотой в нативном GLP-1(7-37)ОН. Более предпочтительно указанные аналоги по положению 8 содержат одно или несколько дополнительных изменений в положениях 16, 18, 22, 25 и 33 по сравнению с соответствующей аминокислотой в нативномGLP-1(7-37)ОН. В предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 12 выбрана из группы, состоящей из триптофана или тирозина. Более предпочтительно кроме замены в положении 12 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 12 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 16 выбрана из группы, состоящей из триптофана, изолейцина, лейцина, фенилаланина или тирозина. Более предпочтительно кроме замены в положении 16 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 16 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 16 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 16 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 18 выбрана из группы, состоящей из триптофана, тирозина, фенилаланина, лизина,лейцина или изолейцина, предпочтительно триптофана, тирозина и изолейцина. Более предпочтительно кроме замены в положении 18 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином,изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 18 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 18 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 18 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 19 выбрана из группы, состоящей из триптофана или фенилаланина, предпочтительно триптофана. Более предпочтительно кроме замены в положении 19 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 19 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 19 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 19 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 20 является фенилаланином, тирозином или триптофаном. Более предпочтительно кроме замены в положении 20 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином,изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 20 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 20 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 20 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 25 выбрана из группы, состоящей из валина, изолейцина и лейцина, предпочтительно валина. Более предпочтительно кроме замен в положении 25 аминокислота в положении 8 заме-10 005584 нена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 25 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 25 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 25 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислота в положении 27 выбрана из группы, состоящей из изолейцина или аланина. Более предпочтительно кроме замены в положении 27 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 27 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 27 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 27 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином. В другом предпочтительном варианте аналогом GLP-1 является GLP-1(7-37)ОН, в котором аминокислотой в положении 33 является изолейцин. Более предпочтительно кроме замен в положении 33 аминокислота в положении 8 заменена глицином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином или метионином и более предпочтительно валином или глицином. Еще более предпочтительно кроме замен в положениях 33 и 8 аминокислота в положении 22 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 33 и 8 аминокислота в положении 30 заменена глутаминовой кислотой. Также предпочтительно кроме замен в положениях 33 и 8 аминокислота в положении 37 заменена гистидином.GLP-1-соединения имеют модификации в одном или нескольких из следующих положений: 8, 12,16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 и 37. Указанные GLP-1-соединения проявляют повышенную эффективность по сравнению с GLP-1(7-37)ОН и включают в себя аминокислотную последовательность формулы Некоторые предпочтительные GLP-1-соединения формулы IX, имеющие множественные замены,включают GLP-1(7-37)ОН, в котором положение 8 представлено валином или глицином, положение 22 представлено глутаминовой кислотой, положение 16 представлено тирозином, лейцином или триптофаном, положение 18 представлено тирозином, триптофаном или изолейцином, положение 25 представлено валином и положение 33 представлено изолейцином. Другие предпочтительные GLP-1-соединения включают следующие соединенияGLP-1-соединения согласно данному изобретению также охватывают соединения эксендина. Эксендин-3 и эксендин-4 являются биологически активными пептидами, впервые выделенными из яда ящериц Helodermatidae, и показано, что данные пептиды связываются с рецептором GLP-1 и стимулируют цАМФ-зависимую выработку Н+ в париетальных клетках млекопитающих. И эксендин-3, и эксендин 4 являются пептидами из 39 аминокислот, которые примерно на 53% гомологичны GLP-1. Они действуют как эффективные агонисты активности GLP-1. А именно, укороченное на N-конце производное эксендина, известное как эксендин (аминокислоты 9-39) является ингибитором эксендина-3, эксендина-4 иGLP-1. Соединения эксендина обычно включает в себя полипептид, имеющий аминокислотную последовательность эксендина-3, эксендина-4 или их аналога или фрагмента. Эксендин-3 и эксендин-4 описаны в патенте США 5424286. Эксендин-3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9(SEQ ID NO: 9) Эксендин-4 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10GLP-1-соединения также включают фрагменты эксендина, которые представляют собой полипептиды, полученные после укорочения N-конца и/или С-конца эксендина или аналога эксендина на одну или несколько аминокислот. Кроме того, GLP-1-соединения включают полипептиды эксендина, в которых к N-концу и/или С-концу эксендина или его фрагментов были добавлены одна или несколько аминокислот. Соединения эксендина указанного типа имеют примерно до сорока пяти аминокислот.GLP-1-соединения также включают аналоги эксендина. Аналог эксендина имеет достаточную гомологию с эксендином-4, эксендином-3 или их фрагментом, так что аналог обладает инсулинотропной активностью. Активность фрагментов и/или аналогов эксендина можно оценить с использованием анализов in vitro, таких как анализы, описанные в ЕР 619322 и патенте США 5120712. Предпочтительно аналог эксендина имеет аминокислотную последовательность эксендина-4 или его фрагмента, модифицированную так, что одна, две, три, четыре или пять аминокислот отличаются от аминокислоты в соответствующем положении эксендина-4 или фрагмента эксендина-4. В используемой в данном описании номенклатуре для обозначения соединений эксендина замещающая аминокислота и ее положение указаны перед исходной структурой. Например, Val8-эксендин-4 обозначает соединение эксендина, в котором глицин обычно, находящийся в положении 8 эксендина-4, был заменен валином. Другая предпочтительная группа GLP-1-соединений состоит из аналогов GLР-1/эксендина-4 формулы VIII (SEQ ID NO: 11)R в положении 37 означает Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser или отсутствует. Активность 18 различных видов, которые относятся к данному роду, представлена в табл. 6. Следующие аналоги эксендина, которые применимы в данном изобретении, описаны в заявках на выдачу патента РСТ WO 99/25728 (Beeley et al.), WO 99/25727 (Beeley et al.), WO 98/05351 (Young et al.),WO 99/40788 (Young et al.), WO 99/07404 (Beeley et al.) и WO 99/43708 (Knudsen et al.). Слитые белки GLP-1 согласно данному изобретению могут содержать сайты гликозилирования. Гликозилирование является химической модификацией, при которой с белком в специфичных сайтах связываются углеводные группы. Гликозилирование белков играет роль в обеспечении правильного заряда, конформации и стабильности созревающего белка и может направлять белок к поверхности клетки и обеспечивать возможную секрецию белка. Наибольшее значение имеет то, что гликозилирование влияет на скорость клиренса многих белков. Сахара могут быть O-связанными или N-связанными. В большинстве случаев, O-связанные сахара присоединяются к кислороду гидроксильной группы серина и треонина, тогда как N-связанные сахара присоединяются к азоту амида аспарагина. Консенсусным сайтомGLP-1-соединения, как правило, не гликозилированы in vivo; однако, интересно, что GLP-1-слитые белки согласно данному изобретению, которые включают в себя GLP-1-соединение с С-концевым удлинением, слитое с Fc-последовательностью, гликозилированы по последнему серину С-концевого удлинения (SSGAPPPS) и треонину в положении 11 в N-концевой области Fc (AEPKSCDKTHTCPPC). Слитые с Fc гетерологичные белки Описанные выше GLP-1-соединения можно сливать непосредственно или через пептидный линкер с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Иммуноглобулины представляют собой молекулы, содержащие полипептидные цепи, удерживаемые вместе посредством дисульфидных связей, обычно имеющие две легких цепи и две тяжелых цепи. В каждой цепи один домен (V) имеет вариабельную аминокислотную последовательность, зависимую от специфичности молекулы антитела. Другие домены (С) имеют довольно константную последовательность, общую среди молекул одного и того же класса. В используемом в данном описании смысле Fc-фрагмент иммуноглобулина имеет значение обычно придаваемое термину в области иммунологии. В частности указанный термин относится к фрагменту антитела, который получают удалением из антитела двух антигенсвязывающих областей (Fabфрагментов). Один из путей удаления Fab-фрагментов состоит в расщеплении иммуноглобулина протеазой папаином. Таким образом, Fc-фрагмент образована примерно равными по величине фрагментами константной области из обеих тяжелых цепей, которые связаны посредством нековалентного взаимодействия и дисульфидных связей. Fc-фрагмент может включать в себя шарнирные области и простираться через домены СН 2 и СН 3 до С-конца антитела. Типичные шарнирные области иммуноглобулинов человека и мыши описаны в Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, С.А.К., ed., W.H. Freeman andCo., 1992, инструкции которой включены в данное описание в виде ссылки. Fc-фрагмент, кроме того,может содержать один или несколько сайтов гликозилирования. Аминокислотная последовательность типичного Fc-белка, содержащего шарнирную область, домены СН 2 и СН 3 и один сайт Nгликозилирования в положении 82, показана на фиг. 1. Существует пять типов Fc-областей иммуноглобулинов человека разного действия или с разными фармакокинетическими свойствами: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. IgG является иммуноглобулином, наиболее широко распространенным в сыворотке. IgG также имеет наиболее длительный период полужизни в сыворотке из всех иммуноглобулинов (23 дня). В отличие от других иммуноглобулинов IgG эффективно рециркулирует после связывания с Fc-рецептором. Существует четыре подкласса IgG - G1, G2, G3 и G4,каждый из которых обладает разным действием или функциями. G1, G2 и G3 могут связывать C1q и фиксировать комплемент, тогда как G4 не способен к такому действию. Хотя G3 способен более эффективно связываться с C1q, чем G1, G1 более эффективен в опосредовании управляемого комплементом лизиса клеток. G2 фиксирует комплемент очень неэффективно. Сайт связывания C1q в IgG локализован в области карбоксильного конца домена СН 2. Все подклассы IgG способны связываться с рецепторами Fc (CD16, CD32, CD64), при этом G1 и G3 являются более эффективными, чем G2 и G4. Область IgG, связывающая Fc-рецептор, образована остатками, локализованными как в шарнирной области, так и в области карбоксильного конца домена СН 2.IgA может существовать как в мономерной, так и в димерной форме, удерживаемой вместе Jцепью. IgA является вторым наиболее широко распространенным в сыворотке Ig, но время его полужизни составляет только 6 дней. IgA имеет три действия или функции. Он связывается со специфичным дляIgA рецептором на макрофагах и эозинофилах, которые осуществляют, соответственно, фагоцитоз и дегрануляцию. Он также может фиксировать комплемент посредством неизвестного альтернативного пути.IgM экспрессируется либо в виде пентамера, либо гексамера, которые оба удерживаются вместе Jцепью. IgM имеет период полужизни в сыворотке, равный 5 дням. Он слабо связывается с C1q посредством сайта связывания, локализованного в его СН 3-домене. IgD имеет период полужизни в сыворотке,равный 3 дням. Неясно, какое действие или функции можно отнести к данному Ig. IgE является моно-14 005584 мерным Ig и имеет период полужизни в сыворотке, равный 2,5 дням. IgE связывается с двумя Fcрецепторами, которые управляют дегрануляцией, и приводит к высвобождению провоспалительных агентов. В зависимости от требуемого действия in vivo гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению могут содержать любой из описанных выше изотипов или могут содержать мутантные Fcобласти, в которых были изменены функции связывания комплемента и/или Fc-рецептора. Таким образом, гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению могут содержать полную Fc-фрагмент иммуноглобулина, фрагменты Fc-фрагмента иммуноглобулина или их аналоги, слитые с GLP-1 соединением. Слитые белки согласно данному изобретению могут состоять из одноцепочечных белков или многоцепочечных полипептидов. Можно получить два или большее количество Fc-слитых белков, так чтобы они взаимодействовали посредством дисульфидных связей, которые естественным образом образуются между областями Fc. Указанные мультимеры могут быть гомогенными по отношению к GLP-1 соединению или могут содержать различные GLP-1-соединения, слитые с N-концом Fc-фрагмента слитого белка. Независимо от конечной структуры слитого белка Fc- или Fc-подобная область должна служить для того, чтобы продлить период полужизни в плазме in vivo GLP-1-соединения, слитого с N-концом. Кроме того, слитое GLP-1-соединение должно сохранять определенную биологическую активность. Увеличение периода полужизни можно показать с использованием способа, описанного в примере 7, при котором период полужизни слитого белка сравнивают с периодом полужизни отдельного GLP-1-соединения. Биологическую активность можно определять известными в данной области способами in vitro и in vivo. Типичные биологические анализы описаны в примерах 6, 8 и 9. Так как Fc-область IgG, образуемая в результате протеолиза, имеет такой же период полужизни invivo, как и интактная молекула IgG, a Fab-фрагменты быстро деградируются, предполагается, что важная для пролонгирования периода полужизни последовательность находится в доменах СН 2 и/или СН 3. Кроме того, в литературе показано, что скорости катаболизма вариантов IgG, которые не связываются с высоко аффинным Fc-рецептором или C1q, не отличаются от скорости клиренса исходного антитела дикого типа, что свидетельствует о том, что сайт катаболизма отличен от сайтов, вовлеченных в связываниеFc-рецептора или C1q. [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29: 221]. Исследования на основе сайт-специфичного мутагенеза с использованием Fc-области IgG1 мыши свидетельствовали о том, что сайт Fc-области IgG1, который контролирует скорость катаболизма, локализован на границе доменов СН 2-СН 3. На основании приведенных исследований Fc-области можно модифицировать в сайте катаболизма для того, чтобы оптимизировать время полужизни слитых белков. Предпочтительно Fc-область, используемая для гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению, получают из Fc-области IgG1 или IgG4. Еще более предпочтительно Fc-область представлена IgG4 или получена из IgG4. Предпочтительно Fc-область IgG содержит как СН 2, так и СН 3-области, включая область шарнира. Гетерологичные слитые с альбумином белки Описанные выше GLP-1-соединения могут быть слиты непосредственно или через пептидный линкер с альбумином или его аналогом, фрагментом или производным. Как правило, белки альбумина, составляющие часть слитых белков согласно данному изобретению,можно получить из альбумина, клонированного из любого вида. Однако предпочтительным является альбумин человека и его фрагменты и аналоги, чтобы снизить риск иммуногенности слитого белка у людей. Сывороточный альбумин человека (HSA) состоит из одной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с формульной молекулярной массой 66500. Аминокислотная последовательность HSA человека показана на фиг. 2. [См. Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58: 136; Behrens, et al.Biol. Chem. 261: 6747]. Описан ряд полиморфных вариантов, а также аналогов и фрагментов альбумина[см. Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37: 219]. Например, в ЕР 322094 авторы изобретения описали различные более короткие формы HSA. Некоторые из указанных фрагментов включают HSA (1373), HSA (1-388), HSA (1-389), HSA (1-369) и HSA (1- 419) и фрагменты от 1-369 до 1-419. В ЕР 399666 описаны фрагменты альбумина, которые включают HSA (1-177) и HSA (1-200) и фрагменты от HSA (1177) до HSA (1-200). Имеется в виду, что гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению включают GLP1-соединения, которые связаны с любым белком альбумина, включая фрагменты, аналоги и производные, причем такой слитый белок является биологически активным и имеет более продолжительный период полужизни в плазме, чем отдельное GLP-1-соединение. Таким образом, альбуминовая часть слитого белка не обязательно должна иметь период полужизни в плазме, равный периоду полужизни нативного альбумина человека. Известны или могут быть созданы фрагменты, аналоги и производные, которые имеют более продолжительные периоды полужизни или имеют периоды полужизни средние между периодом полужизни нативного альбумина человека и представляющего интерес GLP-1-соединения.-15 005584 Гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению охватывают белки, имеющие консервативные аминокислотные замены в GLP-1-соединении и/или Fc- или альбуминовой части слитого белка. Консервативная замена представляет собой замену аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет такой же общий заряд электронов и примерно такой же размер и форму. Аминокислоты с алифатическими или замещенными алифатическими аминокислотными боковыми цепями имеют примерно один и тот же размер в том случае, когда общее число атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем примерно на четыре. Они имеют приблизительно одну и ту же форму в том случае, когда количество ответвлений в их боковых цепях отличается не более чем на единицу. Считается, что аминокислоты с фенильными или замещенными фенильными группами в их боковых цепях имеют приблизительно один и тот же размер и форму. За исключением случаев, которые в данном описании оговорены особо, консервативные замены предпочтительно осуществляют аминокислотами природного происхождения. Однако термин аминокислота используют в данном описании в его самом широком смысле, и термин включает в себя аминокислоты природного происхождения, а также аминокислоты неприродного происхождения, включая аналоги и производные аминокислот. Последние включают молекулы, содержащие аминокислотный компонент. Принимая во внимание данное широкое определение, специалист в данной области поймет, что упоминание в данном описании аминокислоты включает в себя, например,протеогенные L-аминокислоты природного происхождения; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как аналоги и производные аминокислот; непротеогенные аминокислоты природного происхождения, такие как норлейцин, -аланин, орнитин, GABA, и т.д.; и химически синтезированные соединения, имеющие свойства, известные в данной области как свойства, характерные для аминокислот. В используемом в данном описании смысле термин протеогенный свидетельствует о том, что аминокислота может быть включена в состав пептида, полипептида или белка в клетке посредством пути метаболизма. Включение в гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению неприродных аминокислот, в том числе синтетических неприродных аминокислот, замещенных аминокислот или одной или нескольких D-аминокислот может иметь преимущества по ряду различных направлений. Пептиды, содержащие D-аминокислоты и т.д., проявляют повышенную стабильность in vitro или in vivo no сравнению с аналогами, содержащими L-аминокислоты. Таким образом, конструирование пептидов и т.д., содержащих D-аминокислоты, может быть особенно полезным в том случае, когда желательна или необходима более высокая внутриклеточная стабильность. Более конкретно, D-пептиды и т.д., устойчивы к эндогенным пептидазам и протеазам, тем самым, обеспечивая повышенную биодоступность молекулы и увеличенные периоды полужизни in vivo в том случае, когда такие свойства желательны. Кроме того, Dпептиды и т.д., не могут эффективно процессироваться для презентации Т-хелперным клеткам, ограниченной классом II главного комплекса гистосовместимости, и поэтому менее вероятно, что они индуцируют гуморальные иммунные ответы в целом организме. В дополнение к анализам структуры/функции различных полипептидов, охватываемых данным изобретением, существуют многочисленные факторы, которые могут быть приняты во внимание при отборе аминокислоты для замены. Одним из факторов, который может учитываться при осуществлении таких изменений, является гидропатический индекс аминокислот. Значение гидропатического индекса аминокислот в придании белку биологической функции, связанной с взаимодействием, обсуждалосьKyte и Doolittle (1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Считается, что относительный гидропатический характер аминокислот вносит вклад во вторичную структуру полученного в результате белка. Это в свою очередь влияет на взаимодействие белка с такими молекулами, как ферменты, субстраты, рецепторы, лиганды, ДНК, антитела, антигены и т.д. На основе параметров гидрофобности и заряда для каждой аминокислоты определен гидропатический индекс следующим образом: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин(-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат/глутамин/аспартат/аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5). Как известно в данной области некоторые аминокислоты в пептиде, полипептиде или белке можно заменить другими аминокислотами, имеющими сходный гидропатический индекс или оценку и в результате получить пептид и т.д., обладающий сходной или даже повышенной биологической активностью. При осуществлении таких изменений предпочтительно, чтобы друг друга заменяли аминокислоты,имеющие гидропатические индексы в пределах 2. Более предпочтительными заменами являются замены, при которых аминокислоты имеют гидропатические индексы в пределах 1. Наиболее предпочтительными заменами являются замены, при которых аминокислоты имеют гидропатические индексы в пределах 0,5. Подобным образом аминокислоты также можно заменять на основе гидрофильности. В патенте США 4554101 сообщается, что самая высокая средняя локальная гидрофильность белка, на которую влияет гидрофильность близлежащих аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка. Аминокислотам были приписаны следующие значения гидрофильности: аргинин/лизин (+3,0); аспартат/глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагин/глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5-16 005584 1); аланин/гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин/изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). Таким образом, одну аминокислота в пептиде, полипептиде или белке можно заменить другой аминокислотой, имеющей сходную оценку гидрофильности, и еще получить в результате пептид и т.д., обладающий сходной биологической активностью, т.е. все еще сохраняющий правильную биологическую функцию. При осуществлении таких изменений предпочтительно, чтобы друг друга заменяли аминокислоты, имеющие гидропатические индексы в пределах 2,более предпочтительны замены в пределах 1 и наиболее предпочтительны замены в пределах 0,5. Как указано выше, замены аминокислот в слитых белках согласно данному изобретению могут быть основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.д. Кроме того, замены можно осуществлять на основе склонности к образованию вторичной структуры. Например, аминокислоту, участвующую в образовании спирали, можно заменять аминокислотой, которая будет сохранять спиральную структуру. Примерные замены, при которых учитываются различные указанные выше характеристики для того, чтобы получить консервативные изменения аминокислот, результатом которых являются молчащие изменения в пределах данных пептидов и т.д., можно выбрать из других представителей класса, к которому относится аминокислота природного происхождения. Аминокислоты можно разделить на четыре следующие группы:(1) кислые аминокислоты; (2) основные аминокислоты; (3) нейтральные полярные аминокислоты и (4) нейтральные неполярные аминокислоты. Общие способы получения гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению Хотя гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению можно получить множеством различных способов, предпочтительны рекомбинантные способы. В целях данного изобретения, которые раскрыты и заявлены в данном описании, ниже дано определение следующих общих терминов молекулярной биологии и сокращений. Используемые в данном документе термины и сокращения имеют свое обычное значение, если не оговорено особо. Например, С относится градусам Цельсия; ммоль относится к миллимолю или миллимолям; мг относится к миллиграммам; мкг относится к микрограммам; мл относится к миллилитрам и мкл относится к микролитрам. Сокращенные названия аминокислот указаны в 37 C.F.R.1.822 (b) (2) (1994). Пара оснований или п.о. в используемом в данном описании смысле относится к ДНК или РНК. Сокращения А, С, G и Т соответствуют 5'-монофосфатным формам дезоксирибонуклеозидов (дезокси)аденозину, (дезокси)цитидину, (дезокси)гуанозину и тимидину, соответственно, в том случае, когда они находятся в молекулах ДНК. Сокращения U, С, G и А соответствуют 5'-монофосфатным формам рибонуклеозидов уридина, цитидина, гуанозина и аденозина, соответственно, в том случае, когда они находятся в молекулах РНК. В двунитевой ДНК пара оснований может относиться к образованию пар А с Т или С с G. В гетеродуплексах ДНК/РНК пара оснований может относиться к образованию пар А с U или С с G. (смотри определение комплементарный ниже). Расщепление или рестрикция ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции, который действует только в определенных последовательностях ДНК (специфичные для последовательностей эндонуклеазы). Различные используемые в данном изобретении ферменты рестрикции являются коммерчески доступными и для них использовали условия реакции, кофакторы и другие требования, которые должны быть известны специалисту в данной области. Подходящие буферы и количества субстратов для конкретных ферментов рестрикции конкретно указываются производителем или могут быть легко найдены в литературе. Лигирование относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя двунитевыми фрагментами нуклеиновой кислоты. Если не оговорено особо, лигирование можно осуществлять с использованием известных буферов и условий такой ДНК-лигазой, как ДНК-лигаза Т 4. Плазмида относится к внехромосомному (обычно) самореплицирующемуся генетическому элементу. Плазмиды, как правило, обозначают строчной буквой р, после которой следуют буквы и/или числа. Исходные плазмиды в данном изобретении либо коммерчески доступны, находятся в открытом доступе на неограниченной основе, либо могут быть сконструированы из доступных плазмид согласно опубликованным способам. Кроме того, в данной области известны и будут очевидны для специалиста в данной области плазмиды, эквивалентные описанным плазмидам. Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК в используемом в данном описании смысле относится к любому автономно реплицирующемуся агенту, включая без ограничения плазмиды и фаги, содержащему молекулу ДНК, к которой может быть или уже был присоединен один или несколько дополнительных участков ДНК. Экспрессирующий вектор рекомбинантной ДНК в используемом в данном описании смысле относится к любому клонирующему вектору рекомбинантной ДНК, в который был введен промотор для контроля транскрипции встроенной ДНК. Транскрипция относится к процессу, при котором информация, содержащая в нуклеотидной последовательности ДНК, переносится на комплементарную последовательность РНК. Трансфекция относится к захвату экспрессирующего вектора клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются ли в действительности какие-либо кодирующие последовательности, или не экс-17 005584 прессируются. Специалисту в данной области известны многочисленные способы трансфекции, например, копреципитация фосфатом кальция, трансфекция липосомами и электропорация. Обычно трансфекцию признают успешной в том случае, когда в клетке-хозяине имеется любой признак работы данного вектора. Трансформация относится к введению ДНК в организм, так что ДНК способна к репликации либо в виде внехромосомного элемента, либо при интеграции в хромосому. Способы трансформирования бактериальных и эукариотических хозяев хорошо известны в данной области, и многие из этих способов,такие какинъекция в ядро, слияние протопластов или обработка кальцием с использованием хлорида кальция, суммированы в J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989). В большинстве случаев при введении ДНК в дрожжи термин трансформация используют как противоположный термину трансфекция. Трансляция в используемом в данном описании смысле относится к процессу, при котором генетическая информация матричной РНК (мРНК) используется для того, чтобы точно определить и направить синтез полипептидной цепи. Вектор относится к соединению нуклеиновой кислоты, используемому для трансфекции и/или трансформации клеток при генетическом манипулировании, несущему полинуклеотидные последовательности, соответствующие подходящим белковым молекулам, которое при комбинировании с подходящими регуляторными последовательностями придает специфичные свойства клетке-хозяину, подвергаемой трансфекции и/или трансформации. Подходящими векторами являются плазмиды, вирусы и бактериофаги. Искусственные векторы конструируют разрезанием и связыванием молекул ДНК из различных источников с использованием ферментов рестрикции и лигаз. Термин вектор в используемом в данном описании смысле включает в себя клонирующие векторы рекомбинантной ДНК и экспрессирующие векторы рекомбинантной ДНК. Комплементарный или комплементарность в используемом в данном описании смысле относится к парам оснований (пуринам и пиримидинам), которые связаны посредством водородных связей в двунитевую нуклеиновую кислоту. Комплементарными являются следующие пары оснований: гуанин и цитозин; аденин и тимин; и аденин и урацил. Гибридизация в используемом в данном описании смысле относится к процессу, при котором нить нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной нитью посредством образования пар оснований. Условия, используемые при гибридизации двух неидентичных, но очень сходных комплементарных нуклеиновых кислот варьируют в зависимости от степени комплементарности двух нитей и длины нитей. Такие способы и условия хорошо известны специалистам в данной области. Изолированная аминокислотная последовательность относится к любой аминокислотной последовательности, как бы она ни была сконструирована или синтезирована, которая расположена отдельно от последовательности природного происхождения. Изолированное соединение ДНК относится к любой последовательности ДНК, как бы она ни была сконструирована или синтезирована, которая расположена отдельно от своего природного положения в геномной ДНК. Изолированное соединение нуклеиновой кислоты относится к любой последовательности РНК или ДНК, как бы она ни была сконструирована или синтезирована, которая находится отдельно от ее природного положения. Праймер относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует в качестве инициирующего субстрата для ферментативной или синтетической элонгации. Промотор относится к последовательности ДНК, которая управляет транскрипцией ДНК в РНК. Зонд относится к соединению нуклеиновой кислоты или его фрагменту, который гибридизуется с другим соединением нуклеиновой кислоты. Жесткость реакции гибридизации легко определяется специалистом в данной области и обычно является результатом эмпирического расчета, зависящего от длины зонда, температуры промывки и концентрации соли. В общем, для правильного отжига более длинные зонды требуют более высоких температур, тогда как для коротких зондов требуются более низкие температуры. Гибридизация, как правило,зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу в том случае, когда присутствуют комплементарные нити, в условиях окружающей среды ниже температуры их плавления. Чем выше степень требуемой гомологии между зондом и способной к гибридизации последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. В результате следует, что более высокие относительные температуры должны иметь тенденцию делать реакции более жесткими, тогда как более низкие температуры - менее жесткими. Для знакомства с дополнительными подробностями и объяснением жесткости реакций гибридизации смотрите Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, WileyInterscience Publishers, 1995. Жесткие условия или условия высокой жесткости, которые определены в данном описании,можно охарактеризовать как условия, при которых (1) для промывки используют низкую ионную силу и высокую температуру, например, 15 мМ хлорид натрия/1,5 мМ цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50 С; (2) во время гибридизации используют денатурирующий агент, такой как формамид, на-18 005584 пример, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фикол/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натрий-фосфатный буфер при рН 6,5 в присутствии 750 мМ хлорида натрия/75 мМ цитрата натрия при 42 С; или (3) используют 50% формамид, 5 Х SSC (750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 Х раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42 С с промывками при 42 С в 0,2 Х SSC (30 мМ хлорид натрия/3 мМ цитрат натрия) и 50% формамиде при 55 С, после чего следует промывка в условиях высокой жесткости, которая заключается в промывке 0,1XSSC, содержащим EDTA, при 55 С. Условия умеренной жесткости можно охарактеризовать, как описано Sambrook et al. [MolecularCloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], и они включают в себя применение раствора для промывки и условий гибридизации (например, температура, ионная сила и %SDS) менее жестких, чем описанные выше. Примером условий умеренной жесткости является инкубация в течение ночи при 37 С в растворе, содержащем: 20% формамид, 5 Х SSC (750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия при рН 7,6, 5 Х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной нарезанной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в IX SSC примерно при 37-50 С. Специалисту в данной области будет понятно, как довести температуру, ионную силу и т.д., которые необходимы для того, чтобы привести их в соответствие с такими факторами, как длина зонда и тому подобное. ПЦР относится к широко известной полимеразной цепной реакции с применением термостабильной ДНК-полимеразы. Лидерная последовательность относится к последовательности аминокислот, которая может быть удалена ферментативным или химическим путем, чтобы получить требуемый представляющий интерес полипептид. Последовательность сигнала секреции относится к последовательности аминокислот, обычно присутствующей в N-концевой области большего по размеру полипептида, функционирующей в качестве инициатора связывания такого полипептида с отделами клеточной мембраны, подобными эндоплазматическому ретикулуму, и секреции данного полипептида через плазматическую мембрану. Конструирование ДНК, кодирующей гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению Белки альбумина и иммуноглобулина дикого типа можно получить из ряда источников. Например,указанные белки можно получить из библиотеки кДНК, приготовленной из ткани или клеток, которые экспрессируют представляющую интерес мРНК на регистрируемом уровне. Можно провести скрининг библиотек с помощью зондов, сконструированных с использованием опубликованной последовательности ДНК или белка в отношении конкретного представляющего интерес белка. Например, константные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов описаны в Adams, et al. (1980) Biochemistry 19: 27112719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19: 2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298: 286288; и Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256. Некоторые источники информации, в которых описаны последовательности белка и ДНК альбумина, включают Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58: 136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34: 591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114; иMinghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747. Скрининг библиотеки кДНК или геномной библиотеки с помощью выбранного зонда можно проводить, используя стандартные способы, такие как способы, описанные в Sambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Альтернативным способом выделения гена, кодирующего белок альбумина или иммуноглобулина, является использование методики ПЦРPress, NY (1995)]. ПЦР-праймеры можно сконструировать на основе опубликованных последовательностей. Вообще полноразмерные последовательности дикого типа, клонированные из конкретного вида,могут служить в качестве матрицы для создания аналогов, фрагментов и производных, которые сохраняют способность обеспечивать более длительные периоды полужизни GLP-1-соединению, которое является частью слитого белка. Предпочтительно, чтобы Fc- и альбуминовые части гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению были получены из нативной последовательности человека, чтобы снизить риск возможной иммуногенности слитого белка у человека. В частности, предпочтительно, чтобы иммуноглобулиновая часть слитого белка, который входит в объем данного изобретения, содержала только Fc-фрагмент иммуноглобулина. В зависимости от того,требуется ли конкретное действие или функции и структурных характеристик слитого белка Fc-фрагмент может содержать шарнирную область наряду с доменами СН 2 и СН 3 или какую-либо другую их комбинацию. Указанные Fc-фрагменты можно создать с использованием методики ПЦР с праймерами, сконструированными так, чтобы они гибридизовались с последовательностями, соответствующими требуемым концам фрагмента. Подобным образом, если требуются фрагменты альбумина, можно сконструировать ПЦР-праймеры, которые комплементарны внутренним последовательностям альбумина. Также можно-19 005584 сконструировать ПЦР-праймеры, чтобы создать сайты ферментов рестрикции для обеспечения клонирования в экспрессирующих векторах. ДНК, кодирующую GLP-1-соединения согласно данному изобретению, можно получить множеством различных способов, включая способы клонирования, подобные способам, описанным выше, а также ДНК, синтезированную химическим способом. Химический синтез может быть привлекательным,при условии короткой длины кодируемого пептида. Аминокислотная последовательность GLP-1 опубликована, также как последовательность гена препроглюкагона [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 80: 5485-5489; Bell, et al. (1983) Nature, 302: 716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115: 21762181; Ghiglione, M., et al. (1984) Diabetologia 27: 599-600]. Таким образом, можно сконструировать праймеры, чтобы осуществлять ПЦР нативных GLP-соединений и их фрагментов. Затем можно сконструировать ген, кодирующий слитый белок, путем лигирования ДНК, кодирующей GLP-1-соединение, в рамке с ДНК, кодирующей альбумин или белок Fc. Ген, кодирующий GLP-1 соединение, и ген, кодирующий альбумин или белок Fc, также можно соединить в рамке посредством ДНК, кодирующей линкерный пептид. Функционирование и стабильность in vivo гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению можно оптимизировать путем добавления небольших пептидных линкеров, чтобы предотвратить нежелательные потенциальные взаимодействия доменов. Хотя указанные линкеры потенциально могут быть любой длины и состоять из любой комбинации аминокислот, предпочтительно, чтобы длина не была больше, чем необходимо для предотвращения нежелательных взаимодействий доменов и/или оптимизации биологической активности и/или стабильности. Как правило, линкеры не должны содержать аминокислоты с экстремально большими боковыми цепями, или аминокислоты, которые вероятно вводят существенную вторичную структуру. Предпочтительно, чтобы линкер был богат сериномглицином и его длина была меньше 30 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы длина линкера не превышала 20 аминокислот. Еще более предпочтительно, чтобы длина линкера не превышала 15 аминокислот. Предпочтительный линкер содержит повторы последовательности Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Предпочтительно, чтобы было от 2 до 6 повторов указанной последовательности. Еще более предпочтительно, чтобы имелось от 3 до 4 повторов указанной последовательности. ДНК, кодирующую полипептиды GLP-1, альбумина и Fc дикого типа и их фрагменты, можно подвергнуть мутациям либо перед лигированием, либо в контексте ДНК, кодирующей полный слитый белок. В данной области известно множество способов мутагенеза. Например, в способе мутагенной ПЦР используют удлинение перекрывающихся нитей, чтобы создать специфичные мутации оснований в целях изменения конкретной аминокислотной последовательности в соответствующем белке. Для указанного ПЦР-мутагенеза необходимо использовать четыре праймера, два в прямой ориентации (праймеры А и С) и два в обратной ориентации (праймеры В и D). Мутантный ген амплифицируют с матрицы дикого типа в две различные стадии. В первой реакции амплифицируют половины гены, выполняя реакцию от А к В и отдельную реакцию от С к D, где праймеры В и С отмечают в качестве мишени область гена, которая должна быть мутирована. При выравнивании указанных праймеров с областью мишени они содержат ошибочно спариваемые основания с теми основаниями, которые выбраны в качестве мишени для изменения. После завершения реакций от А к В и от С к D продукты реакции выделяют и смешивают для использования в качестве матрицы для реакции от А к D. Данная реакция дает затем полный мутантный продукт. После получения гена, кодирующего полный слитый белок, его можно клонировать в соответствующем экспрессирующем векторе. Конкретные методики, которые можно использовать для получения слитых GLP-1-белков согласно данному изобретению, описаны в примере 1. Общие способы рекомбинантной экспрессии гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют экспрессирующими или клонирующими векторами, описанными в данной заявке для получения гетерологичных слитых белков, и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных так, чтобы они подходили для индукции промоторов,отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих требуемые последовательности. Специалист в данной области может выбрать условия культивирования, такие как среды, температура, рН и тому подобное, без ненужного экспериментирования. В общем, принципы, протоколы и практические способы максимизации продуктивности клеточных культур можно найти в Mammalian Cell Biotechnology: APractical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) и Sambrook, et al., выше. Способы трансфекции известны специалисту в данной области, например, СаРО 4 и электропорация. Общие аспекты систем трансформации клеток-хозяев млекопитающих описаны в патенте США 4399216. Трансформации дрожжей обычно осуществляют согласно способу van Solingen et al., J. Bact. 130 (2): 946-7 (1977) и Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (8): 3829-33 (1979). Однако также можно использовать другие способы введения ДНК в клетки, такие как микроинъекция в ядро, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками или использование поликатионов, например полибрена или полиомитина. Для ознакомления с различными способами трансформации клеток млекопитающих см. Keown, et al.,Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) и Mansour, et al., Nature 336 (6197): 348-52 (1988).-20 005584 Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии нуклеиновой кислоты (например,ДНК) в векторах, указанных в данном описании, включают клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Подходящие прокариоты включают, но не ограничены указанным, эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriacea, такие как Е. coli. Широко доступны различные штаммы Е. coli, такие как штамм Е. coli K12 ММ 294 (АТСС 3 1.446); Е. coli X1 776 (АТСС 3 1.537); штамм Е. coli W3 110 (АТСС 27.325) и К 5 772 (АТСС 53.635). Другие подходящие прокариотические клетки-хозяева включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например Е. coli,Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, напримерSerratia marcescans, и Shigeila, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, В. licheniformis 4 1 Р, описанная в DD266,7 10, опубликованной 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как Р. aeruginosa, и Streptomyces. Указанные примеры являются иллюстративными, но не ограничивающими. ШтаммW3 110 является одним из особенно предпочтительных хозяев или исходных хозяев, поскольку он является общепринятым штаммом-хозяином для ферментации продуктов рекомбинантной ДНК. Предпочтительно клетка-хозяин секретирует минимальные количества протеолитических ферментов. Например,штамм W3 110 можно модифицировать, чтобы получить генетическую мутацию в генах, кодирующих белки, эндогенные по отношению к хозяину, при этом примеры таких хозяев включают Е. coli W3 110 штамм 1 А 2, который имеет полный генотип ronА; Е. coli W3 110 штамм 9 Е 4, который имеет полный генотип ton4 ptr3; Е. coli W3 110 штамм 27 С 7 (АТСС 55244), который имеет полный генотип tonA, ptr3phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT/can'; E. coli W3 110 штамм 40 В 4, который представляет собой штамм 37D6 с делеционной мутацией degP, неустойчивой к канамицину; и штамм Е. coli, имеющий мутантную периплазматическую протеазу, описанный в патенте США 4946783, выданном 7 августа 1990. Альтернативно подходящими являются способы клонирования in vivo, например, ПЦР или другие полимеразные реакции нуклеиновых кислот. Кроме прокариот подходящими для клонирования или экспрессии хозяевами для векторов слитых белков являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Saccharomyces cerevisiae является широко используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином. Другие хозяева включают Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); патент ЕР 139383, опубликованный 2 мая 1995]; хозяева Muyveromyces [патент США 4943529; Fleer, et al.,Bio/Technology 9 (10): 968-75 (1991)], такие как, например, К. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [deUSA 81 (5): 1470-4 (1984)] и A. niger [Kelly and Hynes, EMBO J. 4 (2): 475-9 (1985)]. Метилотрофные дрожжи выбраны из родов, включающих Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Rhodotoruia. Список конкретных видов, которые являются примерами данного класса дрожжей, можно найти в С. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982). Подходящие клетки-хозяева для экспрессии слитых белков согласно данному изобретению получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых,такие как Drosophila S2 и Spodoptera Sp, Spodoptera high5, а также растительные клетки. Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки COS. Более конкретные примеры включают линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линию клеток эмбриональной почки человека [клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham, et al., J. Gen Virol., 36 (1): 59-74(1977)]; клетки яичника китайского хомячка/-DНFR [СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 (7): 4216-20 (1980)]; клетки Сертоли мышей [ТМ 4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1): 243-52 (1980)]; клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Нер G2, НВ 8065); и опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51). Предполагается, что выбор подходящей клетки-хозяина находится в пределах развития данной области. Слитые белки согласно данному изобретению можно непосредственно получать рекомбинантным способом или получать в виде белка, имеющего сигнальную последовательность или другие дополнительные последовательности, которые создают специфичный сайт расщепления на N-конце зрелого слитого белка. В общем, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или может быть частью ДНК, кодирующей слитый белок, которая встроена в вектор. Сигнальной последовательностью может быть прокариотическая сигнальная последовательность, выбранная, например, из группы, состоящей из лидеров щелочной фосфатазы, пенициллазы, lрр или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции у дрожжей сигнальной последовательностью может, например, являться лидер инвертазы-21 005584 дрожжей, лидер -фактора (включая лидеры сс-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces, последний описан в патенте США 5010182) или лидер кислой фосфатазы, лидер глюкоамилазы С. albicans (EP 362179) или сигнал, описанный в WO 90/13646. При экспрессии в клетках млекопитающих для того, чтобы направлять секрецию белка, можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих,такие как сигнальные последовательности секретируемых полипептидов того же самого или родственного вида, а также вирусные лидеры секреции. Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая дает возможность вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клеткаххозяевах. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, начало репликации 2 мк-плазмиды подходит для дрожжей, и различные вирусные начала репликации (SV40, вирус полиомы, аденовирус, VSV или BPV) подходят для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно будут содержать ген для селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены для селекции кодируют белки, которые (а) придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) комплементируют дефициты автотрофности или (с) обеспечивают поступление необходимых питательных веществ, недоступных из комплексных сред, например, ген, кодирующий Dаланинрацемазу Bacilli. Примером подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры,которые обеспечивают идентификацию клеток, компетентных в отношении захвата нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, такие как DHFR или тимидинкиназа. Подходящей клеткой-хозяином при использовании DHFR дикого типа является линия клеток СНО, дефицитных по активности DHFR, полученная и размноженная, как описано [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (7) : 4216-20(1980)]. Подходящим селектируемым геном для применения у дрожжей является ген trpl, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282 (5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al.,Gene 7 (2): 141-52 (1979); Tschumper, et al., Gene 10 (2): 157-66 (1980)]. Ген trpl обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, у которых отсутствует способность расти на триптофане,например, АТСС 44076 или РЕРС 1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)]. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, оперативно связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, чтобы направлять синтез мРНК. Промоторы, распознаваемые множеством возможных клеток-хозяев, хорошо известны. Промоторы, подходящие для применения в случае прокариотических хозяев, включают промоторные системы лактамазы и лактозы [Chang, et al., Nature 275 (5681): 617-24 (1978); Goeddel, et al., Nature 281 (5732): 5448 (1979)], промоторную систему щелочной фосфатазы, триптофана (up) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8(18): 4057-74 (1980); ЕР 36776, опубликованный 30 сентября 1981] и гибридные промоторы, такие как промотор tat [deBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1): 21-5 (1983)]. Промоторы для применения в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайна-Далгарно (S.D.), оперативно связанную с ДНК, кодирующей слитый белок. Примеры подходящих промоторных последовательностей для применения в случае дрожжевых хозяев включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-80(1980)] или других гликолитических ферментов [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland,Biochemistry 17 (23): 49007 (1978)], таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза,пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Другими дрожжевыми промоторами, которые представляют собой индуцируемые промоторы, обладающие дополнительным преимуществом, заключающемся в контролировании транскрипции условиями роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деградирующих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для применения в случае экспрессии у дрожжей, кроме того, описаны в ЕР 73657. Транскрипцию мРНК, кодирующей слитый белок, с векторов в клетках-хозяевах млекопитающих можно,например, контролировать с помощью промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, поксвирус птиц, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы быка, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например промотора актина или промотора иммуноглобулина, и из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев. Транскрипцию полинуклеотида, кодирующего слитый белок, высшими эукариотами можно увеличить встраиванием в вектор последовательности энхансера. Энхансерами являются цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной примерно от 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, усиливая его транскрипцию. В настоящее время известны многие последовательности энхансеров из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, -кетопротеина и инсулина). Однако, как правило, будет ис-22 005584 пользован энхансер вируса эукариотических клеток. Примеры включают энхансер SV40 на конце начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на конце начала репликации и энхансеры аденовирусов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в 5'- или 3'положении по отношению к последовательности, кодирующей слитый белок, но предпочтительно локализован с 5'-стороны от промотора. Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетках дрожжей,грибов, насекомых, растений, животных, человека или нуклеированных клетках из других многоклеточных организмов), также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности широко доступны из 5'- и иногда 3'нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Указанные области содержат участки нуклеотидов, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей слитый белок. Различные формы слитого белка можно извлечь из культуральной среды или из лизатов клетокхозяев. В том случае, если белок связан с мембраной, его можно высвободить из мембраны с использованием раствора подходящего детергента (например, тритона-Х-100) или путем ферментативного расщепления. Клетки, используемые для экспрессии слитого белка, можно разрушить различными физическими или химическими способами, такими как выполнение циклов замораживания-оттаивания, обработка ультразвуком, механическое разрушение или с помощью агентов, лизирующих клетки. Очистка гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению После того, как гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению экспрессированы в подходящей клетке-хозяине, аналоги можно выделить и очистить. Примерами подходящих способов очистки являются следующие способы: фракционирование на карбоксиметилцеллюлозе; гельфильтрация, такая как на сефадексе G-75; использование анионообменной смолы, такой как DEAE илиMono-Q; катионного обмена, такого как на СМ или Mono-S; использование белок А-сефарозы, чтобы удалить такие загрязнения, как IgG; металл-хелатирующие колонки, чтобы связать формы полипептиды,содержащие эпитопы-мишени; обращенно-фазовая ВЭЖХ; хроматофокусирование; применение силикагеля; осаждение этанолом; и осаждение сульфатом аммония. Можно использовать различные способы очистки белка, и такие способы известны в данной области и описаны, например, в Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) и Scopes, ProteinPurification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Выбранная стадия(ии) очистки будет зависеть от природы используемого способа получения и конкретного полученного слитого белка. Например,слитые белки, содержащие Fc-фрагмент, можно эффективно очистить с использованием аффинного матрикса на основе белка А или белка G. Буферы с низким или высоким значением рН можно использовать для того, чтобы элюировать слитый белок с аффинного матрикса. Умеренные условия элюирования помогут предотвратить необратимую денатурацию слитого белка. Также можно использовать буферы, содержащие имидазол. В примере 3 описаны некоторые успешные протоколы очистки слитых белков согласно данному изобретению. Характеристика гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению Существуют многочисленные способы для характеристики слитых белков согласно данному изобретению. Некоторые из указанных способов включают SDS-ПААГ вместе со способами окраски белков или иммуноблоттинга с использованием антител против IgG или против HSA. Другие способы включают масс-спектрометрию с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-MC), жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, изоэлектрическое фокусирование, аналитический анионный обмен, хроматофокусирование и круговой дихроизм, приведенные, чтобы указать некоторые из них. Ряд типичных гетерологичных слитых белков охарактеризовали с использованием SDS-ПААГ вместе с иммуноблоттингом, а также масс-спектрометрии (см. примеры 4 и 5 и фиг. 3 и 4). Например, в табл. 3 (см. пример 5) показана рассчитанная молекулярная масса ряда типичных слитых белков, а также масса, которая определена с помощью масс-спектрометрии. Кроме того, на фиг. 3 и 4 показаны молекулярные массы ряда типичных слитых белков, которые определены с помощью SDSПААГ. Все тестированные гетерологичные слитые белки экспрессировались и секретировались временно. Кроме того, сигнальная последовательность Igk отщеплялась, давая белки с правильным N-концом. Далее в табл. 3 показано, что в некоторых случаях масса, определенная с помощью массспектрометрии, выше ожидаемой. Это является результатом гликозилирования Fc-фрагмента и Сконцевого удлинения. Посредством ферментативного расщепления слитых белков с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрией можно идентифицировать пептидные фракции, которые содержат компоненты cахаров. Затем можно провести секвенирование N-концевых аминокислот в указанных фракциях, чтобы идентифицировать возможный сайт гликозилирования. Например, характеристика эксендина-4-Fc (SEQ ID NO: 29) показывает, что серин в положении 39 и треонин в положении 50 гликозилированы O-связанными сахарами, а аспарагин в положении 122 гликозилирован N-связанными сахарами. Репрезентативный ряд GLP-1-слитый белков также тестировали в отношении их активности. Существуют многочисленные способы выявления активности GLP-1 in vitro и in vivo (см. примеры 6, 7, 8 и 9).-23 005584 В табл. 4 (пример 6) показана активность рецептора GLP-1, связанная с несколькими GLP-1-слитыми белками. Значения указаны относительно активности, связанной с Val8-GLP-1(7-37)ОН. Все тестированные слитые белки обладали активностью по отношению к рецептору GLP-1. Низкий уровень активностиin vitro не обязательно свидетельствует о слабом действии in vivo. Вследствие значительного увеличения периода полужизни указанных слитых белков слабая активность in vitro не всегда является параметром,прогнозирующим слабую активность in vivo. На фиг. 7 и в примере 7 показан увеличенный период полужизни, соответствующий слитым белкам согласно данному изобретению. Например, Val8-GLP-1-Fc имел период полужизни, составляющий примерно 45 ч у обезьян, Val8-GLP-1-HSA имел период полужизни около 87 ч у обезьян, Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-линкep-IgG1 имел период полужизни у собак после в/в-введения примерно 55 ч и Gly8-Glu22-GLP-1-CEx-линкep-IgG1 имел период полужизни у собак после п/к-введения примерно 38 ч. Композиции согласно изобретению Физическая стабильность также является существенным свойством терапевтических белковых композиций. GLP-1-соединения было особенно трудно производить и готовить их композиции вследствие структурных изменений, которые происходят во время обработки. Например, некоторые GLP-1 соединения имеют общую тенденцию к агрегации. Кроме того, было показано, что некоторые GLP-1 соединения превращаются из растворимой и активной -спиральной формы в нерастворимую и потенциально неактивную форму в виде -слоев. Слияние GLP-1-соединений с крупными белками, такими какFc-область IgG или альбумин, не только действует, увеличивая период полужизни GLP-1-соединения, но также вносит вклад в физическую и конформационную стабильность GLP-1-соединения. Например, Val8GLP-1-линкep-HSA в PBS стабилен при 37 С примерно более 30 дней. Гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению можно готовить в составе композиции с одним или несколькими эксципиентами. Активные слитые белки согласно данному изобретению можно комбинировать с фармацевтически приемлемым буфером с рН доведенным для того, чтобы обеспечить приемлемую стабильность, и с рН, приемлемым для введения, такого как парентеральное введение. Необязательно можно добавлять один или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми противомикробными средствами являются метакрезол и фенол. Чтобы отрегулировать ионную силу или тоничность, можно добавить одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Для того чтобы далее установить изотоничность композиции можно добавить один или несколько эксципиентов. Примером эксципиента для доведения изотоничности является глицерин. Фармацевтически приемлемый означает подходящий для введения человеку или другому животному и, следовательно, не содержит токсичных элементов или нежелательных загрязнений и не мешает активности активных соединений в композиции. В данном изобретении можно использовать фармацевтически приемлемую форму соли гетерологичных слитых белков согласно данному изобретению. Кислотами, обычно используемыми для образования кислотно-аддитивных солей, являются неорганические кислоты, такие как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и тому подобные, и органические кислоты, такие как паратолуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, парабромфенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота,лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и тому подобные. Предпочтительными кислотно-аддитивными солями являются соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота и бромисто-водородная кислота. Аддитивные соли основания включают соли, полученные из неорганических оснований, таких как гидроксиды аммония или щелочного или щелочно-земельного металла, карбонаты, бикарбонаты и тому подобное. Таким образом, такие основания, пригодные для получения солей согласно данному изобретению, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и тому подобное. Введение композиций Введение можно осуществлять любым способом, известным специалисту в данной области, как эффективный путь введения. Одним из таких способов является периферическое парентеральное введение. В медицинской литературе под парентеральным введением обычно понимают инъекцию дозированной формы в организм стерильным шприцем или каким-либо другим механическим устройством, таким как насос для инфузии. Периферические парентеральные пути могут включать внутривенный, внутримышечный, подкожный и внутрибрюшинный пути введения. Гетерологичные слитые белки согласно данному изобретению также можно вводить пероральным,ректальным, назальным путями или через нижние дыхательные пути, которые являются непарентеральными путями. Из указанных непарентеральных путей предпочтительными являются путь через нижние дыхательные пути и пероральный путь. Слитые белки согласно данному изобретению можно использовать для лечения широкого круга заболеваний и состояний. Слитые белки согласно данному изобретению главным образом проявляют свое биологическое влияние, действуя на рецептор, называемый GLP-1-рецептором. Поэтому GLP-1-24 005584 слитыми белками согласно данному изобретению можно лечить субъектов с заболеваниями и/или состояниями, которые положительно отвечают на стимуляцию GLP-1-рецептора или на введение GLP-1 соединений. Говорят, что указанные субъекты нуждаются в лечении GLP-1-соединениями или нуждаются в стимуляции GLP-1-рецептора. К указанным субъектам относятся субъекты с инсулиннезависимым диабетом, инсулинзависимым диабетом, инсультом (см. WO 00/16797), инфарктом миокарда (см.WO 98/08531), ожирением (см. WO 98/19698), изменениями катаболизма после хирургической операции(см. патент США 6006753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженного кишечника (см.WO 99/64060). Также указанные субъекты включают субъектов, которым требуется профилактическое лечение GLP-1-соединением, например, субъектов с риском развития инсулиннезависимого диабета (см.WO 00/07617). Риск развития инсулиннезависимого диабета имеется для субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным содержанием глюкозы натощак, субъектов, масса тела у которых примерно на 25% выше нормальной массы тела для роста и телосложения субъекта, субъектов с частичной пакреатэктомией, субъектов, имеющих одного или нескольких предков с инсулиннезависимым диабетом, субъектов, имевших гестационный диабет, и субъектов, имевших острый или хронический панкреатит. Эффективное количество GLP-1-соединения представляет собой количество, которое в результате оказывает требуемое терапевтическое и/или профилактическое действие, не вызывая неприемлемых побочных эффектов при введении субъекту, нуждающемуся в стимуляции GLP-1-рецептора. Требуемое терапевтическое действие включает один или несколько из следующих показателей: 1) улучшение симптома(ов), связанного с заболеванием или состоянием; 2) задержка появления симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; 3) увеличение продолжительности жизни по сравнению со случаями в отсутствии лечения; и 4) улучшенное качество жизни по сравнению со случаями в отсутствии лечения. Например, эффективным количеством GLP-1-соединения для лечения диабета является количество,которое привело бы к лучшей регуляции концентрации глюкозы в крови, чем в отсутствии лечения, тем самым, препятствуя появлению диабетических осложнений, таких как ретинопатия, нейропатия или заболевание почек. Эффективным количеством GLP-1-соединения для профилактики диабета является количество, которое по сравнению со случаями в отсутствии лечения, препятствует появлению повышенных уровней глюкозы в крови, которые требуют лечения антигипогликемическими лекарственными средствами, такими как сульфонилмочевины, триазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины. Доза слитого белка, эффективная для того, чтобы нормализовать уровень глюкозы в крови пациента, будет зависеть от ряда факторов, которые включают, но не ограничены указанным, пол, массу и возраст субъекта, тяжесть неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль слитого белка, эффективность и композицию. Данное изобретение включает в себя GLP-1-соединения, которые обладают улучшенными биохимическими и биофизическими свойствами в силу слияния с белком альбумина, фрагментом альбумина,аналогом альбумина, белком Fc, фрагментом Fc или аналогом Fc. Указанные гетерологичные белки могут быть успешно экспрессированы в клетках-хозяевах, они сохраняют активность в передаче сигнала,связанную с активацией рецептора GLP-1, и имеют удлиненные периоды полужизни. Следующие примеры приведены для дальнейшего описания данного изобретения. Объем данного изобретения не следует считать состоящим только из следующих примеров. Специалисты в данной области поймут, что описанные конкретные реагенты, оборудование и способы являются только иллюстративными и никоим образом не предназначены для ограничения данного изобретения. Пример 1. Конструирование ДНК, кодирующей гетерологичные слитые белки. Пример 1 а. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-GLP-1(7-37)-Fc.Fc-фрагмент IgG1 человека выделяли из библиотеки кДНК, и она содержит полную шарнирную область и домены СН 2 и СН 3. Фрагмент указанной Fc-фрагмента IgG1 человека, содержащий 696 пар оснований, субклонировали в сайтах NheI и Есо 47III экспрессирующего вектора млекопитающих pJB02,чтобы создать pJB02/Fc (см. фиг. 5). ДНК, кодирующую сигнальную последовательность для секрецииIgk, слитую с Val8-GLP-1(7-37), получали посредством гибридизации in vitro четырех перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов Реакцию гибридизации выполняли с использованием эквивалентных количеств каждого из олигонуклеотидов (конечная концентрация каждого олигонуклеотида 1 пмоль/мкл). Смесь олигонуклеотидов нагревали в течение 5 мин при 100 С в буфере для лигирования (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2,10 мМ ДДТ, 1 мМ АТР, 25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина) и затем охлаждали, по меньшей мере, в течение 2 ч до 30 С. Полученный в результате гибридизации продукт лигировали в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 16 С с остовом вектора pJB02/Fc, который был расщеплен Nhel и Eco47III. Продукты лигирования использовали для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene). Проводили скрининг рекомбинантных плазмид в отношении наличия вставок, кодирующих пептид, путем расщепления клонов NcoI (кодирующая последовательность Козака и первый Met сигнального пептида) и секвенировали. Полученную в результате экспрессирующую плазмиду, используемую для анализа трансфекции, обозначили pJB02-V8-GLP-1-Fc (фиг. 5). Пример 1b. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-GLP-1(7-37)-HSA. Плазмиду HSA/pcDNA3.1GS приобретали из Invitrogen (катал.H-M12523M-pcDNA3.1/GS) и использовали в качестве матрицы, чтобы выделить кДНК, кодирующую сывороточный альбумин человека(HSA). кДНК HSA получали, используя ПЦР, при этом на 5'-конце удаляли ДНК, кодирующую лидерную последовательность, а также шесть аминокислот пропептида. Кроме того, непосредственно к 3'концу последовательности, кодирующей HSA, добавляли стоп-кодоны. Наконец конструировали сайты ферментов рестрикции на 5'- и 3'-конце, чтобы обеспечить клонирование. Последовательность ДНК HSA,присутствующая в исходном векторе, приобретенном из Invitrogen, содержала изменение одного основания в 3'-области гена (положение 667), по сравнению с нативной последовательностью человека. Указанное изменение дает кодон для Asn вместо Asp. Таким образом, используя способ мутагенеза на основе ПЦР перекрывающихся нитей, обсуждавшийся выше, кодон в указанном положении заменяли на кодон для Asp. Полученную в результате ДНК, кодирующую HSA, клонировали в NheI- и HindIII-сайтах pJB02,чтобы создать pJB02-HSA (фиг. 6). Лидерную последовательность Igk, слитую с последовательностью Val8-GLP-1(7-37) получали, как обсуждалось выше в примере 1 а. Полученную ДНК лигировали в NheI- и FspI-сайты pJB02-HSA, чтобы создать pJB02-Val8-GLP-1-HSA. Пример 1 с. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-GLP-1(7-37)-линкер-HSA. Вектор pJB02-HSA получали, как обсуждалось в примере 1b. ДНК, кодирующую линкерную последовательность [GGGGS]3, лигировали в рамке с 5'-концом ДНК, кодирующей HSA, чтобы создать pJB02 линкер-HSA (фиг. 7). ДНК, кодирующую лидерную последовательность Igk и слитую с последовательностью Val8-GLP-1(7-37) и 5'-частью линкерной последовательности, создавали, как обсуждалось в примере 1 а. Полученную ДНК лигировали в NheI- и BspEI-сайты pJB02, чтобы создать pJB02-Val8-GLP-1 линкep-HSA. Пример 1d. Конструирование ДНК, кодирующей эксендин-4-Fc. Плазмиду pJB02/Fc получали, как описано в примере 1 а. ДНК, кодирующую сигнальную последовательность Igk, слитую с эксендином-4, создавали путем гибридизации in vitro следующих перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов: Реакцию гибридизации проводили, как описано в примере 1 а. Гибридизованный продукт лигировали с вектором pJB02, который был расщеплен NheI и Eco47III, как описано в примере 1 а, чтобы создатьpJB02-экceндин-4-Fc. Пример 1 е. Конструирование ДНК, кодирующей эксендин-4-HSA. Плазмиду pJB02-HSA получали, как описано в примере 1b. ДНК. Кодирующую сигнальную последовательность Igk, слитую с эксендином-4, создавали посредством гибридизации in vitro таких же перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов, которые описаны в примере 1d. Реакции гибридизации также проводили, как описано выше. ДНК клонировали в уникальных NheI- и FspI-сайтах в pJB02HSA, чтобы создать pJB02-экceндин-4-HSA. Пример 1f. Конструирование ДНК, кодирующей эксендин-4-линкер-НSА. Плазмиду pJB02-линкep-HSA конструировали, как описано в примере 1 с. DNA, кодирующую сигнальную последовательность Igk, слитую с эксендином-4 и 5'-частью линкерной последовательности,создавали как в примере 1d. Полученную ДНК клонировали в уникальных NheI- и BspEI-сайтах в pJB02 линкep-HSA, чтобы создать pJB02-экceндин-4-линкep-HSA. Пример 1g. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-GLP-1/C-Ex-Fc. Плазмиду pJB02-экceндин-4-Fc получали, как описано в примере 1d. ДНК, кодирующую эксендин 4, вырезали из вектора с помощью AgeI и Eco47III. ДНК, кодирующую Val8-GLP-1/C-Ex, создавали путем гибридизации in vitro следующих перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов: Реакцию гибридизации проводили, как описано в примере 1 а. Гибридизованный продукт лигировали вместо эксендина-4 в экспрессирующий вектор pJB02-экceндин-4-Fc, чтобы создать pJB02-Val8-GLP1/C-Ex-Fc. Пример 1h. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-Glu22-GLP-1-Fc. Плазмиду pJB02-экceндин-4-Fc получали, как описано в примере 1d. ДНК, кодирующую эксендин 4, вырезали из вектора с помощью AgeI и Eco47III. ДНК, кодирующую Val8-Glu22-GLP-1, создавали посредством гибридизации in vitro следующих перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов: Реакцию гибридизации проводили, как описано в примере 1 а. Гибридизованный продукт лигировали вместо эксендина-4 в экспрессирующий вектор pJB02-экceндин-4-Fc, чтобы создать pJB02-Val8-Glu22GLP-1-Fc. Пример 1i. Конструирование ДНК, кодирующей Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex-Fc. Плазмиду pJB02-экceндин-4-Fc получали, как описано в примере 1d. ДНК, кодирующую эксендин 4, вырезали из вектора с помощью AgeI и Eco47III. ДНК, кодирующую Val8-Glu22-GLP-1/C-Ex, создавали посредством гибридизации in vitro следующих перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов: Реакцию гибридизации проводили, как описано в примере 1 а. Гибридизованный продукт лигировали вместо эксендина-4 в экспрессирующий вектор pJB02-экceндин-4-Fc, чтобы создать pJB02-Val8-Glu22GLP-1/C-Ex-Fc. Пример 1j. Конструирование ДНК, кодирующей Gly8-GLP-1-Fc. Плазмиду pJB02-экceндин-4-Fc получали, как описано в примере 1d. ДНК, кодирующую эксендин 4, вырезали из вектора с помощью AgeI и Eco47III. ДНК, кодирующую Gly8-GLP-1, создавали посредством гибридизации in vitro следующих перекрывающихся и комплементарных олигонуклеотидов: Реакцию гибридизации проводили, как описано в примере 1 а. Гибридизованный продукт лигировали вместо эксендина-4 в экспрессирующий вектор pJB02-экceндин-4-Fc, чтобы создать pJB02-Gly8-GLP1-Fc. Пример 2. Экспрессия гетерологичных слитых белков. Экспрессию слитых белков, кодируемых конструкциями ДНК из примера 1, осуществляли посредством временной трансфекции клеток НЕК 293EBNA cells (как прикрепленных, так и в суспензии). Клетки подсчитывали и высевали за 24 ч до трансфекции. Смесь для трансфекции готовили смешиванием реагента для трансфекции FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, катал.1814443) с OptiMEM(Gibco/BRL) и инкубированием при комнатной температуре в течение 5 мин, в этот момент добавляли ДНК и смесь инкубировали еще в течение 15 мин. Непосредственно перед трансфекцией в планшет добавляли свежую среду роста. В табл. 1 и 2 приведены дополнительные подробности трансфекции.-28 005584 Таблица 1 Реагенты, используемые для временной трансфекции клеток 293EBNA Для трансфекции в небольшом масштабе (сосуды 35 мм - 10 мм) клетки промывали PBS и переносили в среды для сбора через 24 ч после трансфекции и среды собирали и заменяли каждые 24 ч в течение нескольких дней. В случае крупномасштабных трансфекции (роллерные флаконы объемом 700 см 2) роллерные флаконы промывали PBS через 48 ч после трансфекции и заменяли средой для сбора. Среды собирали и заменяли каждые 24 ч, по меньшей мере, в течение 10 последующих дней. Для последующей очистки белков обычно использовали только 10 сборов. Пример 3. Oчистка гетерологичных слитых белков. Пример 3 а. Очистки Val8-GLP-1-Fc. Примерно 4,5 л кондиционированной среды (уровень экспрессии слитого белка примерно 20 мкг/мл) в случае крупномасштабной трансфекции фильтровали с использованием фильтровальной системы CUNO и концентрировали до 250 мл, используя систему тангенциального проточного фильтрования ProFlux с мембранным фильтром 10 К. Val8-GLP-1-Fc улавливали с помощью колонки HiTrap с белком А объемом 5 мл в 1xPBS, pH 7,4 при скорости потока 2 мл/мин и элюировали 50 мМ лимонной кислотой, pH 3,3. Фракции (1 мл) собирали в пробирки, содержащие 4 мл 1xPBS и 100 мкл 1 М триса, pH 8. Фракции, содержащие слитый белок, который определяли посредством SDS-ПААГ и обращеннофазовой ВЭЖХ на Zorbax C8, объединяли и наносили на колонку Superdex 75 60/60 в 1xPBS, pH 7,4 при скорости потока 10 мл/мин. Позитивные фракции (20 мл/пробирку) собирали и объединяли. Затем объединенные фракции подвергали обращенно-фазовой хроматографии С 4 в 0,1% ТФУ в воде при скорости потока 3 мл/мин. Val8-GLP-1-Fc элюировали, используя градиент от 5% В (0,1% ТФУ в ацетонитриле) до 100% В за 70 мин. Элюированные фракции (3 мл/пробирку) собирали. Ацетонитрил удаляли сушкой в вакууме и добавляли 1 мл Н 2 О. Очищенный образец (примерно 32 мл) дважды диализовали против 4 л 1xPBS, pH 7,4. Затем диализованный образец фильтровали, используя фильтровальную установку MILLEX-GV 0,22 мк, и концентрацию определяли, используя поглощение при 280 нм. Пример 3b. Oчистка Val8-GLP-1-HSA или Val8-GLP-1-линкep-HSA. Примерно 6,5 л кондиционированной среды (уровень экспрессии слитого белка примерно 10 мкг/мл) фильтровали с использованием фильтровальной системы CUNO и концентрировали до 380 мл,используя систему тангенциального проточного фильтрования ProFlux с мембранным фильтром 10 К. Слитый белок улавливали с помощью колонки Fast Flow Q объемом 50 мл (Pharmacia) в 20 мМ трис, pH 7,4 при скорости потока 5 мл/мин. Белок элюировали, используя градиент: от 0 до 50% 20 мМ трис, pH 7,4, 1 М NaСl 10 объемами колонки затем до 100% В 2 объемами колонки.-29 005584 Фракции, содержащие слитый белок, объединяли и повергали обращенно-фазовой хроматографии С 4 в 0,1% ТФУ в воде при скорости потока 5 мл/мин. Слитый белок элюировали, используя градиент от 20% В (0,1% ТФУ в ацетонитриле) до 90% В за 120 мин. Фракции (3,5 мл/пробирку) собирали. Ацетонитрил удаляли сушкой в вакууме. Примерно 9 мл объединенного образца разбавляли 1x PBS, рН 7,4, до 40 мл и диализовали против 4 л 1xPBS, рН 7,4, в течение ночи. Образец фильтровали, и концентрацию определяли по поглощению при 280 нм. Пример 3 с. Очистка эксендина-4-Fc. Примерно 4 л кондиционированной среды (уровень экспрессии слитого белка примерно 8 мкг/мл) фильтровали с использованием фильтровальной системы CUNO и концентрировали до 250 мл, используя систему тангенциального проточного фильтрования ProFlux с мембранным фильтром 30 К. Эксендин-4-Fc улавливали с помощью колонки HiTrap с белком А объемом 5 мл в 1xPBS, рН 7,4 при скорости потока 2 мл/мин и элюировали 50 мМ лимонной кислотой, рН 3,3. Фракции, содержащие слитый белок, объединяли, фильтровали и диализовали против 4 л 1xPBS в течение ночи. Затем диализованный образец наносили на колонку Superdex 75 60/60 в 1xPBS, рН 7,4, 0,5 М NaCl при скорости потока 10 мл/мин. Фракции (20 мл/пробирку), содержащие слитый белок, собирали, объединяли и концентрировали примерно до 1 мг/мл. Затем концентрированные образцы фильтровали, используя фильтровальную установку MILLEX-GV 0,22 мк. Пример 3d. Очистка эксендин-4-HSA и экceндин-4-линкep-HSA. Примерно 1,1 л кондиционированной среды (уровень экспрессии слитого белка примерно 6 мкг/мл) фильтровали с использованием фильтровальной системы CUNO и концентрировали до 175 мл, используя систему тангенциального проточного фильтрования ProFlux с мембранным фильтром 30 К. Слитый белок улавливали с помощью колонки HiTrap Q-сефароза объемом 5 мл (Pharmacia) в 20 мМ трис, рН 7,4 при скорости потока 2 мл/мин. Белок элюировали, используя градиент от 0 до 50% 20 мМ трис, рН 7,4, 1 М NaCl 12 объемами колонки затем до 100% В 4 объемами колонки. Фракции, содержащие слитый белок, объединяли и повергали обращенно-фазовой хроматографии С 4 в 0,1% ТФУ в воде при скорости потока 5 мл/мин. Слитый белок элюировали, используя градиент от 10% В (0,1% ТФУ в ацетонитриле) до 100% В за 70 мин. Фракции (10 мл/пробирку), содержащие слитый белок, собирали. Ацетонитрил удаляли, используя вакуумную сушку. Примерно 8 мл объединенного образца диализовали против 4 л 1xPBS, рН 7,4, в течение ночи. Образец фильтровали, и концентрацию определяли по поглощению при 280 нм. Затем диализованный образец наносили на колонку Superdex 200 26/60 в 1xPBS, pH 7,4, 0,5 M NaCl при скорости потока 2 мл/мин. Фракции (3 мл/пробирку), содержащие слитый белок, собирали, объединяли, концентрировали и фильтровали. Пример 4. Характеристика слитых белков посредством SDS-ПААГ.SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом использовали для анализа как очищенного слитого белка, так и кондиционированной среды от клеток, трансфицированных различными векторами, экспрессирующими слитые белки. SDS-ПААГ выполняли на системе Novex Powerease 500, используя готовые гели Novex 16% трис-глицин (ЕС 6498), рабочий буфер (10 х, LC2675) и буфер для образцов (L2676). Образцы восстанавливали 50 мМ ДТТ и перед нанесением нагревали 3-5 мин при 95 С. После разгонки в SDS-ПААГ-геле использовали воду и буфер для переноса (1X трис-глицин Seprabuff (Owl Scientific катал. No. ER26-S) с 20% метанола), чтобы отмыть гели от SDS. Использовали устройство для переноса Novex с PVDF (BioRad, катал. No. 162-0174) и нитроцеллюлозные мембраны(BioRad, катал. No. 1703965 или 1703932). Перенос осуществляли при комнатной температуре в течение 90 мин при 30-35 В. Мембраны блокировали в 1X PBS с 0,1% твина-20 (Sigma, катал. No. P7949) и 5% молока (BioRad, катал. No. 170-6404) в течение 1-12 ч при 4 С. Антитела разводили в 1X PBS + 5% молока и блоты инкубировали в указанных растворах в течение 1-2 ч при 4 С. Между инкубациями блоты промывали 4 раза в течение 5 мин каждый 1X PBS и 0,2% твином-20 при комнатной температуре. PBS готовили либо из 10 Х PBS GIBCO (катал. No. 70011), чтобы получить конечный состав 1 мМ дигидрофосфат калия, 3 мМ гидрофосфат натрия, 153 мМ хлорид натрия, рН 7,4, или из PBS, приобретенного изSigma (катал.10003), чтобы получить 120 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl и 10 мМ фосфат, рН 7,4 при 25 С. Первым антителом было либо поликлональное антитело козы против IgG1, либо антитело кролика против HSA. Вторым антителом было либо антитело против IgG козы, конъюгированное с HRP, либо антитело против IgG кролика, конъюгированное с HRP. Второе антитело разводили 1:5000. Для проявления блотов использовали систему ECL (Amersham Pharmacia Biotech, катал.RN2108 и катал.RPN1674H). На фиг. 3 А приведено сравнение очищенного белка Fc с кондиционированными средами от клеток,трансфицированных pJB02-Val8-GLP-1-Fc и pJB02-экceндин-4-Fc. Снижение подвижности соответствует увеличенному размеру вследствие наличия в слитом белке GLP-1-части. Подобным образом на фиг. 3 В сравнивается очищенный HSA с кондиционированными средами от клеток, трансфицированных pJB02Val8-GLP-2-HSA, pJB02-Val8-GLP-1-линкep-HSA, pJB02-экceндин-4-HSA или pJB02-экceндин-4-линкepHSA. На фиг. 4 идентифицированы препараты очищенных слитых белков.
МПК / Метки
МПК: A61K 38/38, A61P 3/10, C12N 15/62, C07K 14/605
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-5584-slitye-belki-glp-1.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Слитые белки glp-1</a>
Остеопротегеринсвязующие белки и рецепторы
Номер патента: 3636
Опубликовано: 28.08.2003
Автор: Бойл Уильям Дж.
МПК: A61K 31/7115, A61P 19/08, C07K 14/705...
Метки: белки, остеопротегеринсвязующие, рецепторы
Формула / Реферат:
1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая остеопротегеринсвязывающий белок, выбранная из группы, включающей: а) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную на фиг. 1 (SEQ ID NO:1) и фиг. 4 (SEQ ID NO:3); б) нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с участками последовательности, приведенной в а), причем последовательность, приведенная в а), кодирует остеопротегеринсвязывающий белок, показанный на фиг....
Гены и белки и их применение
Номер патента: 4444
Опубликовано: 29.04.2004
Авторы: Уилсон Ребекка Керри, Фелдман Роберт, Сантанджело Джозеф Дэвид, Лэйн Джонатан Дуглас, Эверест Пол, Хьюз Мартин Джон Глентон, Мур Джоанн Кристин, Дауган Гордон, Добсон Ричард Джеймс
МПК: C12N 15/31, A61K 39/09, C07K 16/12...
Метки: применение, белки, гены
Формула / Реферат:
1. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho 1-13, полученный из микроорганизмов Streptococcus группы B, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или его гомолог, имеющий сходство последовательности более чем на 60%, или его функциональный фрагмент, используемый для лечения или профилактики состояний, связанных с бактериальной инфекцией, вызванной данными микроорганизмами. 2. Пептид, кодируемый геном, обозначенным как pho...
Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение
Номер патента: 3675
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Динарелло Чарльз, Новик Даниела, Ким Соо Хиун, Рубинштейн Менахем
МПК: C07K 14/54
Метки: применение, получение, интерлейкин-18, белки, связывающие
Формула / Реферат:
1. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 и AA29-AA197 SEQ ID NO: 6, (b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (a), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по...
Гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения и их применение
Номер патента: 3739
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Пепински Р.Блэйк, Бейкер Даррен П., Гэлдес Элфонс, Портер Джеффри, Уилльямс Кевин П., Вен Дингайи, Тэйлор Фредерик Р., Гэрбер Эллен Э.
МПК: A61P 25/00, C07K 14/00, A61K 38/00...
Метки: применение, белки, гидрофобно-модифицированные, способы, получения
Формула / Реферат:
1. Изолированный белок, включающий в себя N-концевую аминокислоту и C-концевую аминокислоту, который выбран из (a) белка с N-концевым цистеином, соединенным, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; (b) белка с N-концевой аминокислотой, отличной от цистеина, соединенного, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; и (c) белка, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей, заменяющей N-концевую...
Пептиды и/или белки ,а также их применение для получения терапевтической и/или профилактической фармацевтической композиции
Номер патента: 5576
Опубликовано: 28.04.2005
Автор: Петцельбауер Петер
МПК: A61K 38/36, C07K 14/75
Метки: профилактической, композиции, получения, также, пептиды, фармацевтической, белки, терапевтической, применение
Формула / Реферат:
1. Применение пептидов или белков общей формулы II (SEQ ID NO:3-10) где R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными и означают водород, насыщенный или ненасыщенный углеводородный остаток, содержащий 1-3, а в частности до 10 атомов углерода, Z5 означает белковый остаток или пептидный остаток, содержащий, в частности, от 2 до 30 аминокислот, или спиртовой остаток, содержащий от 1 до 3, а в частности до 10 атомов углерода, или остаток...
Предыдущий патент: Применение ингибиторов il-18
Следующий патент: 3-аминохиназолин-2,4-дионовые антибактериальные агенты
Случайный патент: Эффективные противоопухолевые лекарственные средства