Остеопротегеринсвязующие белки и рецепторы

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые вовлечены в дифференцировку остеокластов. Более точно, изобретение относится к остеопротегерин-связывающим белкам, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие белки, векторам экспрессии и клеткамхозяевам для получения белков, а также к методам исследования связывающей способности белков. В объм изобретения также включены композиции и способы лечения заболеваний костей, таких как остеопороз, утрата костной ткани при артритах, болезнь Педжета и гиперкальциемия. Изобретение также относится к рецепторам остеопротегерин-связывающих белков и способам и композициям для лечения заболеваний костей при использовании рецепторов. Предпосылки создания изобретения В жизнеспособных костных тканях существует динамическое равновесие между их образованием и резорбцией. Указанные процессы,в первую очередь, опосредованы двумя типами клеток: остеобластами, которые секретируют молекулы, формирующие органический матрикс кости, и остеокластами, которые обеспечивают рассасывание костного матрикса и растворение солей, входящих в состав кости. У молодых индивидуумов с растущей костной тканью скорость образования костей превышает скорость их резорбции, в то время как у более взрослых индивидуумов скорость резорбции костей превышает скорость их образования. В последнем случае увеличенная частота разрушения костной ткани приводит к уменьшению костной массы и прочности костей, повышенному риску повреждений костей и более медленному и неполному восстановлению переломов костей. Остеокласты представляют собой большие фагоцитарные многоядерные клетки, которые образуются из гематопоэтических клетокпредшественников в костном мозге. Несмотря на то, что процессы развития и формирования зрелых функционально активных остеокластов изучены недостаточно, считается, что остеокласты созревают в пределах моноцитарно/макрофагальной клеточной линии в ответ на воздействие различных факторов, усиливающих рост. Раннее развитие клеток-предшественников костного мозга с образованием преостеокластов,по-видимому, опосредовано растворимыми факторами, такими, например, как фактор некроза опухолей(TNF-), фактор некроза опухолей(TNF-), интерлейкин 1 (ИЛ-1), интерлейкин 4(ИЛ-4), интерлейкин 6 (ИЛ-6) и фактор ингибирования лейкоза (ФИЛ). В культуре преостеокласты формируются при добавлении макрофагального колониестимулирующего фактора (MCSF). Указанные факторы воздействуют в первую очередь на ранние этапы развития остеокластов. Практически отсутствуют публикации, 003636 2 посвященные вовлечению полипептидных факторов в конечные стадии образования остеокластов. Однако сообщалось о том, что паратиреоидный гормон стимулирует образование и активность остеокластов, а кальцитонин оказывает противоположный эффект, хотя и менее выраженный. Недавно был описан новый полипептидный фактор, названный остеопротегерином(OPG), который отрицательным образом регулирует образование остеокластов in vitro и invivo (см. заявки тех же авторов, одновременно рассматриваемые в Патентном ведомстве США,поданные под номерами 08/577,788 22.12.95. и 08/706,945 03.09.96., включенные в настоящее описание в качестве ссылок, а также заявку РСТ, опубликованную под номером WO 96/26271). OPG существенно увеличивает плотность костей, у трансгенных мышей и уменьшает потерю костной ткани при введении овариэктомированным крысам. Анализ эффективности воздействия OPG на образование остеокластовin vitro выявил, что OPG не задействован в процессах роста и дифференцировки предшественников моноцитов/макрофагов, но, скорее всего,блокируют дифференцировку остеокластов из предшественников моноцитов/макрофагов. Таким образом, OPG, по-видимому, специфичен в регулировании интенсивности процессов формирования остеокластов.OPG содержит два полипептидных домена,имеющих различные структурные и функциональные особенности. Аминоконцевой домен содержит остатки 22-194 полноразмерного полипептида (N-концевой метионин обозначается,как остаток 1), обнаруживая гомологию с другими членами семейства рецептора фактора некроза опухолей (TNFR), в особенности,TNFR-2, для которых характерна консервативность обогащнных цистеином доменов. Карбокси-концевой домен содержит остатки 194401, не обнаруживая существенной гомологии с какими-либо известными последовательностями. В отличие от других многочисленных членов семейства TNFR, OPG, по-видимому, является исключительно секретируемым белком и,скорее всего, не синтезируется в мембраноассоциированной форме. На основании отрицательного регуляторного воздействия OPG на формирование остеокластов постулировано, что OPG может связывать полипептидный фактор, вовлеченный в дифференцировку остеокластов и, таким образом, блокировать одну или более конечный стадий образования зрелых остеокластов. Соответственно, предмет изобретения заключается в том, чтобы идентифицировать полипептиды, взаимодействующие с OPG. Указанные полипептиды могут играть определенную роль в созревании остеокластов и быть полезными для терапии заболеваний костей. Краткое описание изобретения 3 Новый член семейства фактора некроза опухолей был идентифицирован при использовании библиотеки кДНК мыши, экспрессированной в COS-клетках, и скринингом образовавшихся продуктов с помощью белка слиянияOPG-Fc в качестве аффинной пробы. Новый полипептид представляет собой трансмембранный OPG-связывающий белок предсказанной длины в 316 аминокислот, содержащий аминоконцевой цитоплазматический домен, трансмембранный домен и карбокси-концевой внеклеточный домен. Заявленные OPG-связывающие белки могут находиться в мембраносвязанной или растворимой форме. Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим OPG-связывающий белок,векторам и клеткам-хозяевам, экспрессирующим полипептид, а также к способу получения рекомбинантного OPG-связывающего белка.OPG-связывающие белки могут быть использованы для определения количества OPG в биологических образцах, идентификации клеток и тканей, экспрессирующих OPG-связывающий белок, и идентификации новых членов семейства OPG и OPG-связывающего белка. Способы идентификации соединений, которые взаимодействуют с OPG-связывающим белком, также включены в объем настоящего изобретения. К таким соединениям относятся нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, углеводы, липиды или органические молекулы небольшой мол. массы. Они способны действовать как агонисты или антагонисты OPG-связывающего белка.OPG-связывающие белки вовлечены в дифференцировку остеокластов, а уровень активности остеокластов, в свою очередь, модулирует резорбцию костей. Агонисты и антагонисты OPG-связывающего белка модулируют формирование остеокластов и резорбцию кости и могут быть использованы для лечения заболевания костей, характеризующихся изменениями в процессах резорбции костей, таких как остеопороз, гиперкальциемия, утрата костной ткани в результате метастазного артрита, иммобилизация или заболевания периодонта, болезнь Педжета, остеопетроз, расшатывание протезов и т.д. В объем изобретения также включены фармацевтические композиции, содержащие OPGсвязывающие белки и агонисты и антагонистыOPG-связывающих белков. При использовании библиотеки кДНК мыши, полученной из клеток костного мозга,были идентифицированы рецепторы OPGсвязывающих белков, которые связывают флуоресцентно-меченный OPG-связывающий белок. Рецепторы могут быть использованы для идентификации агонистов и антагонистов, взаимодействующих с OPG-связывающим белком, что может оказаться полезным для лечения заболеваний костей. Описание чертежей 4 Фиг. 1. Приведена структура и последовательность вставки 32D-F3, кодирующей OPGсвязывающий белок. Подчеркнуты трансмембранный домен и сайты аспарагин-связанного гликозилирования. Фиг. 2. Экспрессия OPG-связывающего белкав клетках COS-7, трансфицированных рсДНК/32D-F3. Клетки были липофектированны ДНК рсДНК/32D-F3 и исследованы на связывание с конъюгатом алкалинфосфазы и антител козы к IgGl человека (только вторые антитела), с белком слияния OPG человека [22-201]-Fc и вторыми антителами или химерным белком слияния внеклеточного домена ATAR с Fc (sATAR-Fc). ATAR представляет собой новый белок суперсемейства TNFR и sATAR-Fc белок слияния служит контролем для связывания Fcдомена IgGl человека и обычного белка, родственного TNFR, взаимодействующего с маркером 32D на поверхности клеток. Фиг. 3. Показана экспрессия OPGсвязывающего белка в тканях человека. Приведены результаты Нозерн-блоттинга мРНК из тканей человека (Clontech) при использовании радиоактивно меченной гибридизационной пробы на основе 32D-F3. Относительная мол. масса указана слева и выражена в kb. Клинообразные стрелки справа отмечают миграцию транскрипта мРНК с приблизительной мол. массой 2.5 kb в лимфатических узлах. Очень слабая полоса с той же самой мол. массой также выявляется в печени плода. Фиг.4. Приведена структура и последовательность вставки рсДНК/hu OPG bp 1.1, кодирующей OPG-связывающий белок человека. Подчеркнуты предсказанный трансмембранный домен и сайт аспарагин-связанного гликозилирования. Рис. 5. Стимуляция развития остеокластовin vitro из совместно культивируемых макрофагов костного мозга и SТ 2-клеток, обработанных рекомбинантным OPG-связывающим белком мыши [158-316]. В культуры вносили различные концентрации OPG-связывающего белка мыши,составляющие от 1,6 до 500 нг/мг. Через 8-10 дней культуры лизировали и определяли TRAPактивность. Кроме того, некоторые культуры одновременно обрабатывали рекомбинантным белком OPG [22-401]-Fc мыши в концентрациях 1, 10, 100, 500 и 1000 нг/мл. OPG-связывающий белок мыши индуцирует дозо-зависимую стимуляцию образования остеокластов, в то время как OPG [22-401]-Fc ингибирует образование остеокластов. Фиг. 6. Стимуляция развития остеокластов из предшественников костного мозга in vitro в присутствии M-CSF и OPG-связывающего белка мыши [158-316]. Костный мозг мыши собирают и культивируют в присутствии 250, 500, 1000 и 2000 Ед/мл M-CSF. К указанным культурам добавляют различные концентрации OPGсвязывающего белка [158-316], варьирующие от 5 1,6 до 500 нг/мл. Развитие остеокластов определят методом TRAP-анализа в растворе. Фиг. 7. Остеокласты, развившиеся из костного мозга в присутствии как M-CSF, так иOPG-связывающего белка [158-316], обеспечивают резорбцию кости in vitro. Клетки костного мозга,обработанныеM-CSF,OPGсвязывающим белком или обоими факторами вместе, помещали на срезы кости в лунки культуральных планшетов и оставляли для развития в зрелые остеокласты. Полученные культуры окрашивали толуидиновым голубым (левая колонка) или выявляли активность ферментаTRAP гистологическим путем (правая колонка). В культурах, обработанных обоими факторами,формировались остеокласты, способные вызвать эрозию кости, что подтверждалось обнаружением голубых пятен на поверхность кости. Указанное коррелировало с наличием многочисленных крупных многоядерных TRAPпозитивных клеток. Фиг. 8. Приведены графики общих уровней ионизированного кальция (iCa) в крови мышей, инъецированных OPG-связывающим белком, через 51 ч после первой инъекции и мышей, получавших конкурентный OPG. OPGсвязывающий белок в значительной степени и дозо-зависимым образом увеличивает уровеньiCa. OPG (1 мг/кг/день) полностью блокирует увеличение уровня iCa при введении OPGсвязывающего белка в дозе 5 мкг/день и частично предотвращает увеличение уровня iCa при введении OPG-связывающего белка в дозе 25 мкг/день. , различия с контрольной обработкой животных (р 0,05). , уровень iCa у мышей, получавших OPG, существенно отличается от уровня OPG у животных, получавших соответствующую дозу только OPG-связывающего белка (Р 0,05). Фиг. 9. Приведены данные радиографических исследований левых бедренной и большеберцовой костей мышей, которым вводилиOPG-связывающий белок в дозах 0,5, 25 или 100 мкг/день в течение 3,5 дней. Обнаруживается дозо-зависимое увеличение плотности кости,наиболее явным образом выявляемое в проксимальном метафизе большеберцовой кости. Эффект особенно заметен при дозе OPGсвязывающего белка 100 мкг/день. Фиг. 10. Приведена последовательность кДНК ODAR и соответствующего белка мыши. Нуклеотидная последовательность имеет размер 2,1 kb, выше не отмечена транслируемая последовательность из 625 аминокислотных остатков длинной открытой рамки считывания. Подчеркнут гидрофобный сигнальный пептид,жирным шрифтом выделена гидрофобная последовательность (остатки 214-234). Жирным шрифтом также выделены цистеиновые остатки,формулирующие обогащенные цистеином повторяющиеся участки внеклеточного домена. 6 Фиг. 11. Иммунофлуоресцентное окрашивание связывания ODAR-Fc с клетками, трансфицированными OPG-связывающим белком. Клетки COS-7 трансфицировали плазмидой,экспрессирующей OPG-связывающий белок, а затем инкубировали их с FcIgG человека (верхняя панель), ODAR-Fc (средняя панель) и OPGFc (нижняя панель). В качестве вторых антител использовали меченные ФИТЦ антитела козы кFcIgG человека. Положительно окрашенные клетки выявляли с помощью конфокальной микроскопии. Фиг. 12. Эффекты ODAR-Fc на развитие остеокластов из костного мозга мыши in vitro. Культуры костного мозга мыши получали, как описано в примере 8, и обрабатывали OPGсвязывающим белком (5 нг/мл) и CSF-1 (30 нг/мл). Добавляли ODAR-Fc в различных концентрациях, варьирующих от 65 до 1500 нг/мл. Образование остеокластов исследовали, определяя в культуре TRAP гистохимическим методом и анализом в растворе через 5 дней. Фиг. 13. Приведены результаты исследования минеральной плотности костей мыши после введения в течение 4 дней ODAR-Fc в различных дозах. Мышам вводили ODAR-Fc путем ежедневных подкожных инъекций в забуференном фосфатами физиологическом растворе. Минеральную плотность большеберцовой кости определяли при фиксации в 70%-ном этиловом спирте в области проксимального метафиза путем периферической количественной компьютерной томографии (PQCT) (XCT-960M,Norland Medical System, Ft Atkinson, WI). Анализировали два перекрестных среза толщиной 0,5 мм, сделанных на расстоянии 1,5 мм и 2,0 от проксимального конца большеберцовой кости(XMICE 5.2, Stratec, Germany) с целью определения общей минеральной плотности в метафизе. Для определения границы метафиза кости использовали порог отделения мягких тканей 1500. ODAR-Fc вызывает значительное увеличение минеральной плотности в проксимальном метафизе большеберцовой кости дозозависимым образом. Число животных в группе равно четырем. Подробное описание изобретения Изобретение относится к полипептиду,обозначаемому как OPG-связывающий белок,который специфическим образом связываетOPG и вовлечен в дифференцировку остеокластов. Клон кДНК, кодирующий указанный полипептид мышиного происхождения, был выделен из библиотеки, полученной из линии 32-D миеломоноцитов мыши и введенной в клеткиCOS. Затем трансфектанты скринировали на способность связываться с полипептидом слияния OPG [22-201]-Fc (пример 1). Анализ последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей OPG-связывающий белок, показал, что данный белок является новым членом семействаTNF и наиболее тесно связан с AGP-1, полипеп 7 тидом, предварительно описанным в заявке тех же авторов, одновременно рассматриваемой в Патентном ведомстве США под номером 08/660, 562, которая была подана в указанное ведомство 7 июня 1996 г. (Полипептид, идентифицированный как AGP-1 и обозначаемыйTRA, описан Wiley et аl., см. Immunity, 3,673682 (1995. Предполагается, что OPGсвязывающий белок представляет собой трансмембранный белок типа II, имеющий цитоплазматический домен на амино-концевом участке,трансмембранный домен и карбокси-концевой внеклеточный домен (фиг. 1). Аминоконцевой цитоплазматический домен содержит примерно 1-48 аминокислотные остатки, трансмембранный домен включает примерно 49-69 остатки и внеклеточный домен содержит примерно 70-316 остатки, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 2). Мембрано-связанный белок специфическим образом связывает OPG (фиг. 2). Таким образом, OPG-связывающий белок и OPG обладают многими свойствами пары лиганд-рецептор,несмотря на то, что, возможно, существуют другие природные рецепторы OPG-связывающего белка. Клон ДНК,кодирующийOPGсвязывающий белок, был изолирован из кДНКовой библиотеки лимфатических узлов. Последовательность человеческого происхождения (фиг. 4) гомологична последовательности мыши. Очищенный растворимыйOPGсвязывающий белок мыши стимулирует образование остеокластов in vitro и индуцирует гиперкальциемию и резорбцию костей in vivo.OPG-связывающий белок в контексте данного изобретения относится к полипептиду,имеющему аминокислотную последовательность OPG-связывающего белка млекопитающих, или его фрагменту, аналогу или производному, обладающему, по крайней мере, активностью в отношении связывания OPG. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения OPG-связывающий белок имеет мышиное происхождение. В другом случае, OPGсвязывающий белок представляет собой растворимый белок, имеющий изолированный внеклеточный домен, отдельный от цитоплазматического и трансмембранного доменов. OPGсвязывающий белок вовлечен в дифференцировку остеокластов и влияет на скорость и интенсивность резорбции костей. Обнаружено, что он стимулирует образование остеокластов и резорбцию костей. Нуклеиновые кислоты Изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим OPGсвязывающие белки. В контексте данного описания понятие "нуклеиновая кислота" включает кДНК, геномную ДНК, частично или полностью синтетическую ДНК и РНК. Заявленные нуклеиновые кислоты выбраны из группы, включающей: 8 а) нуклеиновые кислоты, структура которых приведена на фиг. 1 (SEQ ID NO:1) и фиг. 4(SEQ ID NO:3); б) нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с участками, кодирующими полипептид, нуклеиновых кислот, структура которых приведена на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1) и фиг. 4(SEQ ID NO:3), и остаются гибридизованными в условиях высокой жесткости; в) нуклеиновые кислоты, которые являются вырожденными по отношению к нуклеиновым кислотам, охарактеризованным в (а) или(б). Гибридизация нуклеиновых кислот обычно представляет собой многоступенчатый процесс,который включает первую стадию гибридизации с образованием дуплексов из отдельных цепей, за которой следует вторая стадия, осуществляемая при более жестких условиях, с избирательным получением дуплексов нуклеиновых кислот, имеющих нужную гомологию. Условия проведения первой стадии гибридизации обычно не являются критическими и не такие жесткие, как условия осуществления второй стадии. В целом, вторая стадия гибридизации осуществляется в условиях высокой жесткости, причем указанные условия относятся к такой концентрации солей и температуре, которая примерно на 12-20 С ниже температуры плавления (Тпл) совершенного гибрида, образованного частью или целыми комплементарными цепями последовательностей, приведенных на фиг. 1 (SEQ IDNO:2) и Фиг. 4 (SEQ ID NO:4). Например, условия высокой жесткости могут составлять около 65 С и не более чем 1 М Na+. Понятно, что концентрация солей, температура и/или продолжительность инкубирования могут варьировать на первой и второй стадиях гибридизации, так что возможно получение гибридизующихся молекул нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с изобретением. Условия гибридизации нуклеиновых кислот и расчеты Тпл для гибридов нуклеиновых кислот описаны в книге Сэмбрука и др. "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство", издательство "Cold SpringHarbor Laboratory Press", New York (1989). Заявленные в соответствии с изобретением нуклеиновые кислоты могут гибридизоваться с частью или целыми участками, кодирующимиOPG-связывающий белок, нуклеиновых кислот,структура которых приведена на фиг. 1 (SEQ IDNO:2) и фиг. 4 (SEQ ID NO :4), а также представлять собой усеченные или удлиненные аминокислотные последовательности по сравнению с приведенными на указанных рисунках. В объем изобретения включены усеченные или удлиненные аминокислоты, кодирующие белок, который, по крайней мере, обладает способностью связывать OPG. В одном случае нуклеиновая кислота может кодировать полипептид, содержащий, по крайней мере, около 10 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения 9 нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий, по крайней мере, около 20 аминокислот. Согласно ещ одному варианту осуществления изобретения, нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий, по крайней мере, 50 аминокислот. Гибридизующиеся нуклеиновые кислоты могут также содержать некодирующие последовательности, локализованные на 5'- и/или 3'-концевых участках кодирующих областей OPG-связывающего белка. К некодирующим последовательностям относятся регуляторные участки, ответственные за экспрессиюOPG-связывающего белка, например, промоторы, энхансеры, сайты инициации трансляции,сайты терминациии транскрипции и т. д. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения заявленные нуклеиновые кислоты кодируют OPG-связывающий белок мыши. Нуклеиновые кислоты кодируют мембрано-связанную форму OPG-связывающего белка или растворимую форму, которая утратила функциональный трансмембранный домен. Трансмембранный домен OPG-связывающего белка мыши предположительно содержит аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1). Трансмембранный доменOPG-связывающего белка человека предположительно содержит аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:3). Замены гидрофобных аминокислотных остатков в указанном домене на нейтральные или гидрофильные аминокислотные остатки,повидимому, нарушит связь белка с мембраной и переведет его в растворимую форму. Кроме того, делеции части или всего трансмембранного домена, как ожидается, также приведут к образованию растворимой формыOPGсвязывающего белка. Нуклеиновые кислоты,кодирующие аминокислотные остатки 70-316,как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1), или их фрагменты и аналоги соответствуют растворимым формам OPG-связывающих белков. В объем изобретения также включены нуклеиновые кислоты, кодирующие усеченные формы растворимых OPG-связывающих белков. Растворимые формы содержат остатки 69-317,как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:3), и соответствующим образом могут быть получены усеченные белки. В одном варианте осуществления изобретения усечения по N-концевому участку приводят к получению полипептидов 70-317,71-317,72-317 и т. д. В другом варианте осуществления изобретения усечения нуклеиновых кислот, кодирующих растворимый OPGсвязывающий белок, OPGbp содержащий остатки 69-317, по N-концевому участку приводят к получению OPGbp [158-317] или, альтернативно, OPGbp [ 166-317]. Плазмида phuOPGbp 1.1 в клетках Е. coli штамма DH10, определяющая синтез OPG-связывающего белка человека, депонирована в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэриленд, 13 июня 1997 г. 10 Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть использованы для выявления в биологических образцах последовательностей, кодирующих OPG-связывающий белок. В частности,последовательности могут быть использованы для скрининга кДНКовых и геномных библиотек с целью выявления последовательностей,кодирующих полипептиды, родственные OPGсвязывающему белку, особенно других биологических видов. Нуклеиновые кислоты также могут использоваться для модулирования уровней OPG-связывающего белка с применением технологии на основе антисмысловых последовательностей или при экспрессии in vivo. Получение трансгенных животных, экспрессирующих OPG-связывающий белок, может оказаться полезным для получения полипептида и тестирования in vivo его биологической активности. Векторы и клетки-хозяева Заявленные в соответствии с изобретением нуклеиновые кислоты могут быть связаны с последовательностями ДНК таким образом, чтобы обеспечить экспрессию биологически активногоOPG-связывающего белка. Последовательности,необходимые для экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области исследований, и включают промоторные и энхансерные последовательности для инициации синтеза РНК,сайты терминации транскрипции, сайты связывания рибосом для инициации синтеза белка и лидерные последовательности, обеспечивающие секрецию. Последовательности, направляющие экспрессию и секрецию OPG-связывающего белка, могут быть гомологичными, т.е. представлять собой последовательности, идентичные или сходные с геномными последовательностями, обеспечивающими экспрессию и секрецию OPG-связывающего белка, или быть гетерологичными. Для экспрессииOPGсвязывающего белка в клетках-хозяевах могут быть использованы различные плазмиды (см.,например, Методы в энзимологии, v. 185, Goeddel, D. V. ed., Academic Press (1990. Для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих предпочтительно использование плазмидыpDSR, описанной в заявке WO 90/14363. Для экспрессии в бактериальных клетках-хозяевах предпочтительно использование плазмид, содержащих lux-промотор (см. заявку тех же авторов, рассматриваемую одновременно в Патентном ведомстве США, поданную 22 декабря 1995 г.). Кроме того, известны векторы для тканеспецифической экспрессии OPG-связывающего белка в организме трансгенных животных. Для экспрессии OPG-связывающего белка в клетках человека в целях терапии in vivo могут быть использованы векторы на основе ретровирусов и аденовирусов (см. заявку WO 86/00922). В объем изобретения также включены эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие OPG-связывающий белок. Клетки-хозяева включают клетки бактерий, дрожжей, растений, 11 насекомых или млекопитающих.OPGсвязывающий белок может быть получен с помощью трансгенных животных, например, мышей и коз. Плазмиды и векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, заявленные в соответствии с изобретением, встраивают в подходящие клетки-хозяева при использовании методик трансфекции или трансформации, известных специалисту в данной области исследований. Клетки-хозяева могут содержать ДНК-последовательности, кодирующие OPG-связывающий белок, приведенные на фиг. 1, или их участки,например, кодирующие внеклеточный домен или цитоплазматический домен. Нуклеиновые кислоты, кодирующие OPG-связывающие белки, могут быть модифицированы путем замещений кодонов, чтобы обеспечить оптимальную экспрессию в определенных клетках-хозяевах. По крайней мере, некоторые кодоны могут представлять собой так называемые предпочтительные кодоны, которые не изменяют аминокислотной последовательности и часто обнаруживаются в высоко экспрессируемых генах. Однако, понятно, что замены кодонов, оптимизируют экспрессию, и ограничиваются введением предпочтительных кодонов. Примеры предпочтительных клеток-хозяев млекопитающих для экспрессии OPG-связывающего белка включают, но не ограничиваются указанными,COS, CHOd-, 293 и 3 Т 3. Предпочтительными клетками-хозяевами бактерий являются клеткиEscherichia coli. Полипептиды Изобретение также относится к OPGсвязывающему белку, как продукту экспрессии экзогенной ДНК-последовательности в прокариотических или эукариотических клетках, т. е.OPG-связывающий белок может рассматриваться как рекомбинантный OPG-связывающий белок. К экзогенной ДНК-последовательности относятся кДНК, геномная ДНК и синтетическая ДНК-последовательность.OPGсвязывающий белок может быть продуктом экспрессии в клетках бактерий, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих или в бесклеточной системе трансляции.OPGсвязывающий белок, получаемый в бактериальных клетках, имеет N-концевой метионин. Изобретение также относится к способу полученияOPG-связывающего белка, включающему выращивание прокариотических или эукариотических клеток, трансформированных или трансфицированных нуклеиновыми клетками, кодирующими OPG-связывающий белок, и выделение полипептидных продуктов экспрессии указанных нуклеиновых кислот. Изобретение также относится к полипептидам, представляющим собой OPG-связывающие белки млекопитающих, а также их фрагментам, аналогам или производным. В предпочтительном варианте осуществления изобретения 12 связывающим белком человека. Фрагмент OPGсвязывающего белка относится к полипептиду,имеющему делению одной или более аминокислот, сохраняющему способность к связываниюOPG. Указанные фрагменты могут иметь делеции, затрагивающие аминоконцевой, карбоксиконцевой или внутренние участки полипептида. Фрагменты OPG-связывающего имеют, по меньшей мере, около 10 аминокислот, около 20 аминокислот или, по меньшей мере, около 50 аминокислот. В предпочтительных случаяхOPG-связывающий белок имеет делению одной или более аминокислот в трансмембранном домене (аминокислотные остатки 49-69, как показано на фиг. 1) или, альтернативно, одной или более аминокислот на амино-концевом участке и/или трансмембранном домене (аминокислотные остатки 1-49, как показано на фиг. 1). В другом случае OPG-связывающий белок представляет собой растворимый белок, содержащий, например, аминокислотные остатки 69-316 или 70-316, или N-концевые, или С-концевые усеченные формы данного белка, сохраняющиеOPG-связывающую активность. OPG-связывающий белок может быть растворимым белком человека, как показано на фиг. 4, содержащим аминокислотные остатки 69-317, приведенные на фиг. 4, а также его усеченными формами,например, 70-517, 71-517, 71-317, 72-317 и т.д. В предпочтительном случае растворимый OPGсвязывающий белок человека включает остатки 69-317, а также представляет собой N-концевые усеченные формы OPGbp [158-317] и OPG [166317]. Аналог OPG-связывающего белка относится к полипептиду, имеющему замещения или добавления одной или более аминокислот, причем такой полипептид сохраняет OPGсвязывающую активность. Такие аналоги могут иметь замещения или добавления аминокислот в любом участке полипептида. Предпочтительные аналоги относятся к аналогам растворимой формы OPG-связывающих белков. Фрагменты или аналоги могут иметь природное происхождение, например, как продукты аллельных вариантов соответствующих генов или сплайсированных вариантов мРНК, или же быть сконструированными с помощью технологий манипулирования нуклеиновыми кислотами и синтезом нуклеиновых кислот, известных специалистам в данной области исследований. Полипептиды могут иметь аминоконцевой метиониновый остаток или не иметь такого остатка. В обьем настоящего изобретения также включены производные OPG-связывающего белка, которые представляют собой полипептиды, подвергшиеся посттрансляционным модификациям (например, добавлениям N-связанных или О-связанных углеводных цепей, процессингу N-концевых или С-концевых участков), прикреплению химических соединений к остову аминокислот, химическим изменениям N 13 связанных или О-связанных углеводных цепей и добавлению N-концевого остатка метионина в результате экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах. В частности, химически модифицированные производные OPG-связывающего белка, обладающие дополнительными преимуществами, например, повышенной стабильностью, большим временем циркуляции или повышенной иммуногенностью, также включены в объем изобретения. В частности,белки могут быть модифицированы с помощью водорастворимых полимеров, например, полиэтиленгликоля и его производных (см., например, патент US 4 179 337). Химические соединения, используемые для модификации белков и получения их производных, могут быть выбраны из водорастворимых полимеров, например,полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы,декстрана, поливинилового спирта и т. д. Полипептиды могут быть модифицированы случайным образом или по определенным позициям в пределах молекулы и к ним могут быть присоединены одна, две, три или более химических групп. Полипептиды могут быть также модифицированы по определенным участкам, например, амино-концевым участкам, например, выбранному лизиновому или аргининовому остаткам. Другие модификации могут включать присоединение выявляемой метки, скажем, флуоресцентной, ферментной, изотопной или аффинной для обеспечения детекции или выделения белка. К химерам OPG-связывающего белка относятся полипептиды, включающие полную аминокислотную последовательность OPGсвязывающего белка или е часть, слитую с гетерологичной аминокислотной последовательностью. Такие химеры также включены в объем изобретения. Гетерологичная последовательность может включать любую последовательность, которая обеспечивает способность белка слияния связывать OPG. В предпочтительном случае карбокси-концевой внеклеточный доменOPG-связывающего белка сливают с гетерологичной последовательностью. К таким последовательностям относятся гетерологичные цитоплазматические домены, генерирующие альтернативные внутриклеточные сигналы, последовательности, усиливающие олигомеризацию, например, Fc-участок IgG, последовательности ферментов, представляющих собой полипептидные метки, последовательности аффинных зондов, например, обеспечивающие распознавание комплекса антиген-антитело. Полипептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, выделяют и очищают из тканей и клеточных линий, экспрессирующих OPG-связывающий белок, экстрагируют из лизатов или кондиционированной ростовой среды, или трансформированных клетокхозяев, экспрессирующих OPG-связывающий 14 белок. OPG-связывающий белок может быть получен из миеломоноцитарной клеточной линии 32-D мыши (АТСС CR-11346). OPGсвязывающий белок человека или кодирующие его нуклеиновые кислоты могут быть выделены из лимфатического узла человека или ткани печени плода. Выделенный OPG-связывающий белок свободен от сопутствующих белков человека или других компонентов клеток. Изобретение также относится к способу очистки OPG-связывающего белка из природных источников (например, тканей и клеточных линий, которые в норме экспрессируют OPGсвязывающий белок), а также из трансфицированных клеток-хозяев. Способы очистки могут включать одну или более стандартных стадий,подходящих для получения белка определенной чистоты. Хроматографическая стадия может включать ионообменную хроматографию, гельфильтрацию, гидрофобные взаимодействия,обратнофазовую хроматографию, хроматофокусирование, аффинную хроматографию, хроматографию, основанную на антителах к OPGсвязывающему белку или аффинном комплексе биотин-стрептавидин. Антитела В объем изобретения также включены антитела, специфически связывающиеся с заявленными полипептидами. Антитела могут быть получены иммунизацией животных полноразмерным OPG-связывающим белком, растворимыми формами OPG-связывающего белка или их фрагментами. Заявленные антитела могут быть моноклональными или поликлональными,рекомбинантными, например, химерными антителами, в которых константные участки легких и тяжелых цепей антител мыши замещены последовательностями антител человека, илиCRD-привитыми антителами, в которых только области, определяющие комплементарность,имеют мышиное происхождение. Заявленные антитела могут быть антителами человека, полученными, например, иммунизацией трансгенных животных, способных продуцировать антитела человека (см., например, WO 93/12227). Антитела могут оказаться полезными для выявления OPG-связывающего белка в биологических образцах, обеспечивая идентификацию клеток или тканей, продуцирующих белок. Кроме того, антитела, взаимодействующие сOPG-связывающим белком и блокирующие его соединение с другими веществами, могут иметь терапевтическое значение для модулирования дифференцировки остеокластов и резорбции кости. Антитела к OPG-связывающему белку могут быть полезны для лечения заболеваний костей, например, остеопороза и болезни Педжета. Антитела могут быть тестированы на взаимодействие с OPG-связывающим белком в присутствии или в отсутствие OPG и исследованы на их способность ингибировать лиганд (OPG 15 связывающий белок), опосредующий остеокластогенез и/или резорбцию кости. Показано, что пептиды сами по себе способны действовать как антагонисты взаимодействия "лиганд-рецептор" и ингибировать опосредованный лигандом остеокластогенез. Пептиды OPG-связывающего белка, полученные в соответствии с изобретением, могут быть использованы в указанных целях. Композиции Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количествоOPGсвязывающего белка, заявленного в соответствии с изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество агониста или антагониста OPG-связывающего белка. Понятие "терапевтически эффективное количество" означает такое количество, которое обеспечивает терапевтический эффект в отношении определенного заболевания при данном способе применения препарата. Композиции могут быть в жидкой или лиофилизированной форме и включать разбавитель (Трис-буфер, ацетатный или фосфатный буфер), имеющий различные значения рН и ионной силы, растворитель, например, Твин или полисорбат, носители, например, сывороточный альбумин человека или желатин, консерванты, например, тимерозал или бензольный спирт, и антиоксиданты, например,аскорбиновую кислоту или метабисульфит натрия. Выбор определенной композиции будет зависеть от множества факторов, в том числе природы заболевания, пути введения препарата и необходимых фармакокинетических параметров. Более подробно компоненты, которые могут быть использованы для приготовления фармацевтических композиций, описаны в книгеR. Gennaro, ed. Mark, Easton, PA (1980). Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения заявлены композиции, включающие растворимые OPG-связывающие белки. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим растворимые OPGсвязывающие белки, модифицированные с помощью водорастворимых полимеров для увеличения растворимости, стабильности, периода полужизни в плазме крови и биодоступности. Композиции могут также представлять собой липосомы, содержащие OPG-связывающий белок, микроэмульсии, мицеллы или везикулы,обеспечивающие контролируемую доставку действующего начала в течение определенного периода времени. Растворимый OPG-связывающий белок может быть включен в микрочастицы, подходящие для способа введения через легкие. 16 Заявленные композиции могут быть введены путем инъекции, как подкожной, внутривенной или внутримышечной, а также оральным,назальным, легочным или ректальным путем. Выбор способа введения зависит от множества факторов и может быть легко осуществлен специалистом в данной области исследований. Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество заявленных нуклеиновых кислот вместе с фармацевтически приемлемым адъювантом. Композиции на основе нуклеиновых кислот могут быть пригодны для доставки части или всего кодирующегоOPG-связывающий белок участка и/или фланкирующих участков в клетки и ткани при осуществлении терапевтических подходов при использовании антисмысловых нуклеиновых кислот. Способы примененияOPG-связывающие белки могут быть использованы в различных способах, предназначенных для выявления OPG и описания взаимодействий с OPG. В целом, исследования включают инкубирование OPG-связывающего белка с биологическим образцом, содержащим OPG, в условиях, обеспечивающих связывание OPG сOPG-связывающим белком, и измерение степени связывания. OPG может быть в очищенной форме или входить в состав композиций, таких,так жидкости тела или культуральная среда. Исследования могут носить как качественный,так и количественный характер, в последнем случае определяются параметры связыванияOPG-связывающего белка, а также уровни биологически активного OPG в композициях. Исследования могут быть полезны для оценки степени связывания OPG с фрагментами, аналогами или производными OPG-связывающего белка и для идентификации новых OPG и OPGсвязывающих белков, принадлежащих соответствующим семействам. Взаимодействие OPG с OPG-связывающим белком может быть осуществлено различным образом, например при использовании клеток,клеточных мембран, методов исследования в растворе и методов иммуносвязывания. В целом, следовые количества меченного OPG инкубируют с образцами OPG-связывающего белка в течение определенного периода времени,затем измеряют количество связавшегося OPG фильтрованием, электрохемилюминесценцией(ЕС, система ORIGE фирмы IGEN), методами,основанными на использовании клеток, или методами иммунологического связывания. Могут быть использованы технологии на основе гомогенных методов исследования, например, радиоактивных (SPA, Amersham) и зависимой от времени флуоресценции (HTRF, Packard). Связывание определяется мечением OPG или антитела к OPG радиоактивными изотопами (125J, 17 35S, 3 Н), флуоресцентными красителями (флуоресцеин), а также комплексами лантанида (Еu3+) с хелатами или криптатами или рутения (Ru2+) с орбипиридилом. Понятно, что выбор метки зависит от используемой системы определения. Альтернативно, OPG может быть модифицирован с помощью невыявляемой эпитопной метки(например, биотина, пептидов, His6, туc) и связан с белками, такими как стептавидин, антитело к пептиду или антитело к белку, которые соединены с детектируемой меткой, как описано выше. В альтернативном способе OPG-связывающий белок может быть определен непосредственным образом с помощью поликлональных или моноклональных антител к OPGсвязывающему белку при осуществлении методов иммунологического связывания. Дополнительные формы OPG-связывающих белков, содержащих эпитопные метки, описанные выше,могут быть использованы при осуществлении жидкофазных методов и методов иммунологического связывания. В объем изобретения также включены способы идентификации соединений, взаимодействующих с OPG-связывающим белком. Способы включают инкубирование OPG-связывающего белка с тестируемым соединением в условиях,обеспечивающих их связывание, и измерение интенсивности связывания. Соединение может быть, по существу, очищенным или присутствовать в исходной смеси. Соединения, взаимодействующие с OPG-связывающим белком, могут представлять собой нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, углеводы, липиды или органические соединения небольшой мол. массы. Они могут быть дополнительно охарактеризованы по своей способности увеличивать или уменьшать активность OPG-связывающего белка, что позволяет отнести их к агонистам или антагонистам указанного вещества.OPG-Связывающие белки также могут быть использованы для идентификации внутриклеточных белков, взаимодействующих с цитоплазматическим доменом при использовании способа скрининга на основе двойных дрожжевых гибридов. Гибридные конструкты, содержащие ДНК, кодирующую N-концевые 50 аминокислот OPG-связывающего белка, сливают с ДНК GА 4 связывающего домена дрожжей с получением двугибридной плазмиды. Положительные клоны, отобранные при скрининге, могут быть далее охарактеризованы для идентификации взаимодействующих белков. Полученная информация может оказаться полезной для оценки передающего сигналы внутриклеточного механизма, ассоциированного с OPG-связывающим белком, и определения внутриклеточных мишеней для новых лекарственных препаратов,модулирующих резорбцию кости.OPG-связывающий белок может быть использован для лечения состояний, характери 003636 18 зующихся избыточной плотностью кости. Наиболее распространенным заболеванием такого рода является остеопетроз, при котором генетический дефект обуславливает увеличение костной массы и обычно приводит к смерти на первых нескольких месяцах жизни. Остеопетроз предпочтительно лечится путем введения растворимого OPG-связывающего белка. Изобретение также относится к модуляторам (агонистам и антагонистам) OPGсвязывающего белка и способу их получения. Модулятор OPG-связывающего белка способен увеличивать или уменьшать по крайней мере один вид активности, ассоциированной с OPGсвязывающим белком, например, способность связывать OPG или некоторые другие взаимодействующие молекулы, или же регулировать созревание остеокластов. Обычно, агонист или антагонист может быть кофактором, например,белком, пептидом, углеводом, липидом или веществом небольшой мол. массы, который взаимодействует с OPG-связывающим белком и регулирует его активность. Возможные полипептидные антагонисты включают антитела, которые реагируют с растворимой или мембраносвязанной формами OPG-связывающего белка, а также с растворимыми формами OPGсвязывающего белка, которые содержат весь внеклеточный домен OPG-связывающего белка или часть такого домена. К молекулам, которые регулируют экспрессию OPG-связывающего белка, обычно относятся нуклеиновые кислоты,комплементарные нуклеиновым кислотам, кодирующим OPG-связывающий белок, которые действуют как антисмысловые регуляторы экспрессии.OPG-связывающий белок вовлечен в контролирование формирования зрелых остеокластов, клеток, которые в первую очередь задействованы в резорбции кости. Увеличение скорости резорбции кости (превышающей скорость образования костной ткани) может привести к различным заболеваниям костей под общим названием остеопенические, к которым относятся остеопороз, остеомиелит, гиперкальциемия,остеопения, вызванная хирургическим вмешательством или введением стероидов, болезнь Педжета, остеонекроз, потеря костной массы,обусловленная ревматоидным артритом, периодонтоз, иммобилизация, расшатывание протезов или остеолитический метастаз. Наоборот,уменьшение скорости резорбции кости приводит к остеопетрозу, заболеванию, для которого характерно увеличение плотности кости. Агонисты и антагонисты OPG-связывающего белка,используемые для лечения остеопений, могут вводиться по отдельности или в комбинации с терапевтически эффективным количеством агентов, усиливающего рост кости, например,морфогенетических факторов кости, обозначенных ВМР-1 - BMP-12, трансформирующих ростовых факторови членов семейства транс 19 формирующих ростовых факторов, факторов роста фибробластов FGF-1 - FGF-10, ингибиторов интерлейкина-1, ингибиторов TNF, паратиреоидного гормона, простагландинов серии Е,бифосфонатов и минеральных соединений, увеличивающих плотность костей, скажем, фтора и кальция. Антагонисты OPG-связывающих белков могут быть особенно полезны для лечения остеопений. Рецепторы остеопротегерин-связывающих белков Изобретение также относится к рецепторам, которые взаимодействуют с OPGсвязывающими белками. Более точно, изобретение относится к рецепторам дифференцировки и активации остеокластов (ODAR, от англ, osteoclast differentiation and activation receptor). ODAR представляет собой трансмембранный полипептид, обнаруживающий наиболее высокую степень гомологии с CD40, членом семейства рецепторов TNF. Последовательность нуклеотидов, кодирующая ODAR мыши, и соответствующий полипептид, приведены на фиг. 10. Человеческий гомолог ODAR мыши может быть легко получен путем гибридизационного скрининга кДНК человека или геномной библиотеки с помощью последовательности нуклеотидов,приведенной на фиг. 10. Процедуры клонирования ODAR человека сходны с таковыми, описанными в примере 5 в отношении клонирования OPG-связывающих белков. Человеческий гомолог полипептида, приведенного на фиг. 1,описан Anderson et al. (Nature 390, 175-179(1997 и обозначен здесь как RANK. RANK охарактеризован как трансмембранный белок типа I, гомологичный членам семейства TNFрецептора и вовлеченный в функционирование дендритных клеток. Доказательства взаимодействия ODAR иODAR-Fc) предотвращает созревание остеокластов in vitro (фиг. 12) и увеличивает плотность костей у нормальных мышей после подкожной инъекции препарата. Полученные результаты согласуются с обнаруженным взаимодействиемOPG-связывающего белка с ODAR и его активацией для обеспечения созревания остеокластов. Развитие остеокластов, а также скорость и интенсивность резорбции кости регулируются взаимодействием OPG-связывающего белка иODAR. Соединения, которые уменьшают или блокируют взаимодействие OPG-связывающего белка и ODAR, являются потенциальными антагонистами активности OPG-связывающего белка и могут прерывать развитие остеокластов,что приводит к уменьшению резорбции кости. Альтернативно, соединения,усиливающие взаимодействие OPG-связывающего белка и 20 которые обеспечивают развитие остеокластов и усиливают резорбцию кости. Различные способы могут быть использованы для измерения степени взаимодействияOPG-связывающего белка и ODAR in vitro при использовании очищенных белков. Указанные способы могут применяться для скрининга соединений, способных увеличивать или уменьшать скорость или интенсивность связыванияODAR OPG-связывающим белком. В одном типе исследований белок ODAR может быть иммобилизован путем прикрепления ко дну лунок планшеты для микротитрования. Радиоактивно меченный OPG-связывающий белок (например, иодированный OPG-связывающий белок) и тестируемое(ые) соединение(я) затем могут быть добавлены в лунки в определенном порядке или одновременно. После инкубирования лунки отмывают и обсчитывают с помощью сцинтилляционного счетчика радиоактивности для определения интенсивности связыванияODAR OPG-связывающим белком в присутствии тестируемого вещества. Обычно, вещество тестируется в различном диапазоне концентраций, и для адекватной оценки результатов тестирования используется набор контрольных лунок, не содержащих одного или более соединений, входящих в набор для тестирования. Альтернативный указанному способ подразумевает "обратное" расположение белков, т.е. иммобилизацию OPG-связывающего белка в лунках планшета для микротитрования, инкубирование его с тестируемым соединением и радиоактивно меченным ODAR и определение интенсивности связывания с ODAR (см., например,Главу 18 Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al., eds., John WileySons, New York,NY [1995]). Как альтернатива радиоактивному мечению, OPG-связывающий белок или ODAR могут быть конъюгированы с биотином и наличие биотинилированного белка затем может быть определено при использовании стрептавидина,связанного с ферментом, например, пероксидазой хрена [HRP] или щелочной фосфатазой [АР] колорометрическим путем или флуоресцентным мечением стрептавидина. Антитела, направленные к OPG-связывающему белку или ODAR,конъюгированные с биотином, также могут быть использованы и затем выявлены после инкубирования с фермент-связанным стрептавидином, соединенным с АР или НRP.OPG-связывающий белок и ODAR могут также быть иммобилизованы связыванием с агарозными или акриловыми шариками или другими типами такого рода инертных носителей. Комплекс субстрат-белок может быть помещен в раствор, содержащий комплементарный белок и тестируемое соединение, после инкубирования шарики могут быть преципитированы путем центрифугирования, и степень связывания между OPG-связывающим белком иODAR может быть определена с помощью методов, описанных выше. Альтернативно, комплекс субстрат-белок может быть иммобилизован на колонке, а тестируемое вещество и комплементарный белок затем пропущены через колонку. Образование комплекса между OPGсвязывающим белком и ODAR затем может быть определено с помощью описанных выше методов, например, радиоактивным мечением,связыванием с антителами и т. д. Другой тип исследования in vitro, полезного для идентификации соединения, усиливающего или ослабляющего образование комплекса"ODAR/OPG-связывающий белок", использует детекторную систему на основе поверхностного плазмонового резонанса, например, системыBiacore может быть использована в соответствии с рекомендациями производителя. Указанный метод подразумевает обязательное ковалентное связывание OPG-связывающего белка или ODAR с покрытым декстраном сенсорным чипом, который локализован в детекторе. Тестируемое соединение и другой комплементарный белок могут быть затем инъецированы в камеру, содержащую сенсорный чип, как одновременно так и последовательно, а количество связывающегося комплементарного белка может быть определено на основе изменения в мол. массе, которое физическим образом ассоциировано с покрытой декстраном стороной чипа; измерение мол. массы определяется с помощью детекторной системы. В некоторых случаях необходима одновременная оценка двух или более тестируемых соединений на возможность использования для усиления или ослабления образования комплекса "ODAR/OPG-связывающий белок". В таких ситуациях исследования, описанные выше, могут быть легко модифицированы добавлением указанного(ых) тестируемого(ых) соединения(ий) как одновременно, так и последовательно, к первому тестируемому веществу. Остальные этапы исследований осуществляют, как описано выше. Исследования in vitro, такие как описано выше, могут быть успешно использованы для быстрого скрининга большого числа соединений, воздействующих на образование комплекса между ODAR и OPG-связывающим белком. Исследования могут быть автоматизированы с целью выявления соединений, экспрессируемых в бактериофагах, синтетических пептидов и химическим путем синтезированных библиотек. Соединения, которые усиливают или ослабляют образование комплекса "ODAR/OPGсвязывающий белок", могут также быть скринированы в культуре клеток с помощью клеток и клеточных линий, экспрессирующих ODAR. Клетки и клеточные линии могут быть получены из организма любого млекопитающего, но,предпочтительно, их получают из организма 22 человека или других приматов, собак или грызунов. Клетки, экспрессирующие ODAR, например остеокласты, могут быть выделены обогащением из клеточных популяций других типов путем аффинной хроматографии при использовании известных методик. Присоединение OPG-связывающего белка к клеткам, экспрессирующим ODAR, оценивают в отсутствие тестируемых соединений, а интенсивность связывания определяют, например, путем проточной цитометрии при использовании биотинилированных антител к OPG-связывающему белку. Альтернативно, культура остеокластов человека или мыши может быть получена, как описано в примере 8, а тестируемые соединения могут быть оценены на их способность блокировать созревание остеокластов, стимулируемое CFS-1 и OPG-связывающим белком. Исследования,проводимые в клеточной культуре, могут быть преимущественным образом использованы для дальнейшей оценки соединений, которые обнаружили положительный результат в описанных выше экспериментах по связыванию белка. Соединения, которые усиливают или уменьшают взаимодействие между OPGсвязывающим белком и ODAR, также могут быть оценены на активность in vivo путем их введения мышам с последующим измерением плотности костей при использовании сканирующей денситометрии или радиографии. Методики измерения плотности костей описаны в опубликованной заявке WO 97/23614 и примере 13. Изобретение также относится к соединениям, которые уменьшают или блокируют взаимодействие между OPG-связывающим белком и ODAR, и относятся к антагонистам образования остеокластов. Такие соединения обычно подразделяются на две группы. В одну группу входят соединения, которые происходят изOPG-связывающего белка или взаимодействуют с OPG-связывающим белком. Такие соединения описаны выше. Во вторую группу включены соединения, которые происходят из ODAR или взаимодействуют с ODAR. Примерами соединений, которые служат антагонистами ODAR,могут служить нуклеиновые кислоты, белки,пептиды, углеводы, липиды или органические вещества небольшой мол. массы. Антагонистами ODAR могут быть вещества, которые соединяются с одним или более сайтами связывания OPG-связывающего белка во внеклеточном домене ODAR и уменьшают или полностью блокируют образование комплекса. Те участки ODAR, которые могут быть вовлечены в образование комплекса с OPGсвязывающим белком, могут быть идентифицированы по аналогии со структурой гомологичного комплекса TNF/TNF-R55, описанного 23 быть использована для идентификации участковOPG-связывающего белка и ODAR, которые вовлечены в образование комплекса. Затем могут быть сконструированы соединения, которые преимущественным образом связываться с участками, вовлеченными в образование комплекса, и действуют как антагонисты. В одном случае, описанном далее в примере 11, конструируются пептидные антигены, которые используются для получения антител к OPGсвязывающему белку, которые действуют как антагонисты. Ожидается, что указанные антитела будут связываться с OPG-связывающим белком и блокировать образование комплекса сODAR. В аналогичном случае пептидные антигены, полученные на основе структуры ODAR,могут быть использованы для генерации антител ODAR, действующих как антагонисты. Антагонисты ODAR могут также связываться с ODAR в участках, отстоящих на некотором расстоянии от сайта(ов) связывания OPGсвязывающего белка, и вызывать конформационные изменения в ODAR-полипептиде, что приводит к ослаблению образования комплекса с OPG-связывающими белками или формированию непродуктивного комплекса. Согласно одному варианту осуществления изобретения, антагонист представляет собой растворимую форму ODAR, утратившую функционально активный трансмембранный домен. Растворимые формы ODAR могут иметь делецию одной или более аминокислот в трансмембранном домене (аминокислоты 214-234, показанные на фиг. 10). Растворимые полипептидыODAR могут содержать часть внеклеточного домена или весь домен и обладать способностью к связыванию OPG-связывающего белка. Необязательно, растворимая форма ODAR может быть частью химерного белка, когда часть внеклеточного домена ODAR или весь домен сливают с гетерологичной аминокислотной последовательностью. В одном случае гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой Fc-участок IgG человека. Модуляторы (агонисты и антагонисты)ODAR могут быть использованы для предотвращения или лечения остеопений, в том числе остеопороза, остеомиелита, гиперкальциемии при злокачественных опухолях, остеопений,вызванной хирургическим вмешательством или введением стероидов, болезни Педжета, остеонекроза, потери костной ткани, обусловленной ревматоидным артритом, парадонтоза, иммобилизации, расшатывания протезов и остеолитического метастаза. Агонисты и антагонистыODAR, используемые для лечения остеопений,могут вводиться как сами по себе, так и в сочетании с терапевтически эффективным количеством агента, усиливающего рост кости, в том числе, морфогенетических факторов кости, обозначенных BMP-1-BMP-12, трансформирующего ростового фактора (TGF-) и членов семей 003636FGF-1-FGF-10, ингибиторов интерлейкина-1,ингибиторов TNF-, паратиреоидного гормона,простагландинов серии Е, бифосфорнатов, эстрогенов, SERMs и минеральных веществ, увеличивающих плотность кости, например, фтора и кальция. Антагонисты ODAR особенно полезны для лечения остеопений. Приведенные ниже примеры предназначены для более полной иллюстрации изобретения и не ограничивают его объема. Пример 1. Идентификация клеточной линии, которая является источником полученияOPG-связывающего белка. Остеопротегерин (OPG) отрицательным образом регулирует остеокластогенез in vitro иTNFR-родственный белок, скорее всего, он будет взаимодействовать с членом семейства TNFродственных белков, опосредуя его эффекты. За одним исключением, все известные члены суперсемейства TNF представляют собой трансмембранные белки типа II, экспрессируемые на клеточной поверхности. Для идентификации источника OPG-связывающего белка используют рекомбинантные белки слияния OPG-Fc в качестве иммунопроб для скрининга OPGсвязывающих белков, локализованных на поверхности клеток различных линий и, в первую очередь, гематопоэтических клеток. Клеточные линии, которые были выращены как адгезивные культуры in vitro, обрабатывали следующим образом. Клетки помещали в 24-луночные планшеты для культивирования тканей (Falcon) и затем выращивали до состояния монослоя, которое оценивалось как 80%-ная величина. Затем ростовую среду удаляли и прикрепившиеся культуры отмывали фосфатным буферным раствором (PBS) (Gibco), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки(FCS). Рекомбинантные белки слияния OPG [22194]-Fc мыши и OPG [22-201]-Fc человека (см. заявку US 08/706, 945, поданную 3 сентября 1996 г) по отдельности разбавляли до концентрации 5 мкг/мл в PBS, содержащем 1% FCS,добавляли к культурам и инкубировали в течение 45 мин при 0 С. Затем раствор белка слияния OPG-Fc удаляли и клетки отмывали PBSFCS, как описано выше. Затем культуры обрабатывали конъюгированными с фикоэритриномF(аb')-фрагментами антител козы к IgG человека в качестве вторых антител (Southern Biotechnology Associates Cat.2043-09), разведенными вPBS-FCS. Через 30-45 мин инкубирования при 0 С раствор удаляли и культуры отмывали, как указано выше. Затем клетки исследовали с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа для выявления клеточных линий, экспрессирующих на своей поверхности 25 Суспензионные клеточные культуры анализировали сходным образом со следующими модификациями: разбавитель и отмывающий буфер представляли собой не содержащий кальция и магния фосфатный буферный раствор с добавлением 1% FCS. Клетки собирали на стадии экспоненциально реплицирующихся культур в ростовой среде, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в концентрации 1 х 107 кл/мл в 96-луночном микротитровальном планшете для культуры тканей (Falcon). Клетки последовательно инкубировали с рекомбинантными белками слияния OPG-Fc и вторыми антителами, как описано выше, и затем клетки отмывали, центрифугируя их в промежутках между каждой стадией отмывания. Клетки исследовали с помощью флуоресцентно активированного клеточного сортера (FACS) при использовании системы Becton Dickinson FACscan. Указанный подход позволил выявить миеломоноцитарную клеточную линию 32D мыши(АТСС CR 11346), экспрессирующую поверхностные молекулы, которые детектируются с помощью белков слияния OPG [22-194]-Fc мыши и OPG [22-201]-Fc человека. Вторые антитела сами по себе не связываются с поверхностью клеток 32D так же, как и очищенные фрагментыOPG-Fc белков слияния обусловлено OPG, причем рекомбинантный белок OPG [22-401 ] мыши или человека дозо-зависимым образом конкурирует с OPG за связывание OPG-Fc белков. Таким образом, участок OPG, необходимый для проявления его биологической активности, способен специфическим образом связываться с поверхностными молекулами клеток 32D. Пример 2. Экспрессия клонированногоOPG-связывающего белка мыши. Библиотеку кДНК получают из мРНК клеток 32D и лигируют в вектор экспрессии для клеток млекопитающих pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). Клетки 32D, поддерживаемые на экспоненциальной фазе роста в присутствии рекомбинантного интерлейкина-3, собирали и выделяли общую фракцию РНК экстрагированием кислым раствором, содержащим гуанидин, тиоцианат, фенол и хлороформ(Chomczynsky and Sacchi. Anal. Biochem. 162,156-159, (1987. Фракцию поли (А+) мРНК получали из общей фракции РНК путем адсорбции на бусах Dynabeads Oligo dT25 (Dynal Corp) и последующего элюирования с бус, как это рекомендовано производителем. Библиотеку кДНК, праймированную oligo dT, получали при использовании Superscript Plasmid System (GibloBR, Gaithersburg, Md) согласно рекомендациям производителя. Полученную кДНК полностью переваривали рестрикционными эндонуклеазами Sal I и Not I и затем фракционировали гельхроматографией с исключением по размеру. Отбирали фракцию с наибольшей мол. массой и 26 лигировали в полилинкерный участок плазмидного вектора pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, СА). Указанный вектор содержит промоторCMV "выше" сайта множественного клонирования и обеспечивает высокий уровень экспрессии продуктов в эукариотических клетках. Затем библиотеку вводили путем электропорации в компетентные клетки Е. Coli (ElectroMAXDH10B, Giblo, NY) и титровали на агаре В,содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Затем библиотеку разделяли на отдельные пулы, примерно 1000 клонов на пул, и 1,0 мл культуры каждого пула выращивали в течение 16-10 ч при 37 С. Плазмидную ДНК из каждой культуры выделяли с помощью набора Qiagen Qiawell 96Ultra Plasmid Kit (каталожный номер 16191)в соответствии с рекомендациями изготовителя. Упорядоченные пулы экспрессионной библиотеки кДНК 32D были по отдельности с помощью липофекции введены в клетки COS-7 и затем исследовали способность клеток захватывать OPG-связывающий белок на своей поверхности. Для этого клетки помещали с плотностью 1 х 106 кл/мл в щестилуночные планшеты для культуры тканей (Costar) и культивировали в течение ночи в среде DMEM (Gibco) содержащей 10% FCS. Примерно 2 мкг плазмидной ДНК из каждого пула разбавляли в 0,5 мл свободной от сыворотки среды DMEM и стерилизовали центрифугированием на 0,2-мкг колонкеSpin-X (Costar). Одновременно 10 мкл липофектамина (Lipofectamine, Life Technologies, каталожный номер 18324-012) добавляли в отдельную пробирку, содержащую 0,5 мл свободной от сыворотки среды DMEM. Смешивали растворы ДНК и липофектамина и проводили инкубирование при комнатной температуре в течение 30 мин. Культуры клеток COS-7 затем отмывали в свободной от сыворотки средеDMEM, добавляли к культурам комплексы ДНК-липофектин и осуществляли инкубирование в течение 2-5 ч при 37 С. После указанного периода среду удаляли и замещали средойDMEM, содержащей 10% FCS. Затем клетки инкубировали в течение 48 ч при 37 С. Чтобы выявить культуры, экспрессирующие OPG-связывающий белок, ростовую среду удаляли и клетки отмывали раствором PBS-FCS. В каждую лунку добавляли 1,0 мл PBS-FCS,содержащего 5 мкг/мл белка слияния OPG [22201]-Fc человека и осуществляли инкубирование при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем клетки трижды отмывали раствором PBSFCS и затем фиксировали PBS, содержащем 2% параформальдегида и 0,2% глутаральдегида в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем культуры один раз отмывали PBS-FCS и затем инкубировали при 65 С в течение 1 ч погруженными в раствор PBS-FCS. Далее культуры охлаждали и отсасывали раствор PBS-FCS. Затем культуры инкубировали с антителами козы к IgG человека (Fc-участкам), конъюгиро 27 ванными с щелочной фосфатазой (SIGMA, каталожный номерА-9544), при комнатной температуре в течение 3 мин и затем отмывали трижды 20 мМ Трис-Сl (рН 7,6) и 137 мМ NaCl. Иммунные комплексы, которые формируются во время указанных стадий, выявляли путем исследования активности щелочной фосфатазы при использовании субстратного набора FastRed TR/AS-MX (Pierce, каталожный номер 34034), как это рекомендовано производителем. С помощью данного подхода скринировали в целом около 300, 000 независимых клонов кДНК 32D, соответствующих 300 трансфицированным пулам по 1000 клонов в каждом. Одну лунку идентифицировали как содержащую клетки, обладающие способностью специфически взаимодействовать с белком слияния OPGFc. Этот пул подвергали двум последовательным этапам повторной селекции и выделяли определенный плазмидный клон 32D-F3 (фиг. 1). Плазмидную ДНК 32D-A3 затем вводили путем трансфекции в клетки COS-7, которые окрашивали конъюгированными с ФИТЦ антителами козы к IgG человека (только вторые антитела), белком слияния OPG [22-201]-Fc человека и вторыми антителами или белком слиянияATAR-Fc (ATAR также известен как HVEM;Montgomery et al., Cell 87,427-436 (1996 (Рис. 2). Только вторые антитела не связываются с клетками COS-7/32D-F3, так же, как и белок слияния ATAR-Fc. Только белок слияния OPGFc связывается с клетками COS-7/32D-F3, свидетельствуя о том, что 32D-F3 кодирует OPGсвязывающий белок, экспрессируемый на поверхности соответствующих клеток. Пример 3. Последовательность OPGсвязывающего белка. Клон 32D-F3, выделенный, как описано выше, содержит кДНК-вставку около 2,3 kb,которую подвергали секвенированию в обоих направлениях с помощью автоматического секвенатора ДНК-последовательностей AppliedBiosystems 373 A (primer-driven Taq dye terminator reactions, Applied Biosystems) согласно рекомендациям производителя. Расшифрованную аминокислотную последовательность сравнивали с последовательностями ДНК базы данных с помощью программы FASTA (GCG,Висконсинский Университет) и анализировали на присутствие длинных открытых рамок считывания (LORF's) с помощью системы "Six-way(ак), начинающаяся с метионина, в подходящей ориентации,которой предшествует 5'нетранслируемый участок размером около 150 п.о. 5'-нетранслируемый участок содержит в пределах рамки стоп-кодон, расположенный"выше" предсказанного стартового кодона. Это свидетельствует о том, что структура плазмиды 32D-F3 соответствует е способности использо 003636 28 вать промоторный участок CMV для того, чтобы направлять экспрессию продукта, состоящего из 316 ак, в клетках млекопитающих. Предсказанную последовательность OPGсвязанного белка затем сравнивали с известными последовательностями существующей базы данных при использовании модифицированной версии программы FASTA (Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63-98 (1990. Затем аминокислотную последовательность анализировали на присутствие специфических структур, свойственных всем известным членам суперсемейства фактора некроза опухолей (TNF) при использовании метода сравнивая "профилей" последовательностей Gribskov et al. (Proc. Natl. Acad Sci.Luethy et al. (Protein Sci. 3,139-146 (1994. Повидимому, существует значительная гомология между OPG-связывающим белком и определенными членами суперсемейства TNF. OPGсвязывающий белок мыши, по-видимому, наиболее тесно связан с гомологичными лигандамиTRAIL и CD40 мыши и человека. Дальнейший анализ последовательности OPG-связывающего белка выявил значительную степень соответствия суперсемейству TNF с высоким Z-счетом 19.46. Аминокислотная последовательностьOPG-связывающего белка содержит возможный гидрофобный трансмембранный домен, который начинается с М 49 и простирается до L69. На основе такой конфигурации в отношении метионинового стартового кодона предсказано,что OPG-связывающий белок является трансмембранным белком типа II с коротким Nконцевым внутриклеточным доменом и более длинным С-концевым внеклеточным доменом(фиг. 4). Это характерно для всех известных членов суперсемейства TNF, за исключением лимфотоксина альфа (Nagata and Golstein, Science 267,1449-1456 (1995. Пример 4. Экспрессия мРНК OPG-связывающего белка. Многочисленные Нозерн-блоты тканей человека (Clontech, Palo Alto, CA) обрабатывали пробой, представляющей собой 32D-F3 рестрикционный фрагмент, меченный 32P-dCTP, для определения размеров транскрипта в тканях человека и выявления характера экспрессии. Нозерн-блоты предгибридизовали в растворе,содержащем 5 Х SSPE, 50% формамида, 5 Х раствор Денхардта, 0,5%-ный SDS и денатурированную ДНК спермы лосося в концентрации 100 мкг/мл, в течение 2-4 ч при 42 С. Затем блоты гибридизовали в растворе, содержащем 5 ХSSPE, 50% формамида, 2 Х раствор Денхардта,0,1%-ный SDS, денатурированную ДНК спермы лосося в концентрации 100 мкг/мл и меченую пробу в концентрации 5 нг/мл, в течение 18-24 ч при 42 С. Затем блоты отмывали в 2 Х SC в течение 10 мин при комнатной температуре, вIX SSC в течение 10 мин при 50 С и далее в 0,5 Х SSC в течение 10-15 мин. Используя пробу, полученную на основе кДНК мыши, в результате гибридизации в жестких условиях в лимфатических узлах была обнаружена преобладающая фракция мРНК с относительной мол. массой около 2,5 kb (фиг. 3). Слабый сигнал, соответствующий МРНК с той же самой мол. массой, был обнаружен и в печени плода. В других исследованных тканях не было обнаружено транскриптовOPGсвязывающего белка. Полученные данные подтверждают, что экспрессия мРНК OPGсвязывающего белка строго ограничена тканями человека. Они также подтверждают, что выделенный клон кДНК по размеру очень близок к природному транскрипту и свидетельствуют о том, что клон 32D-F3 является полноразмерным. Пример 5. Молекулярное клонированиеOPG-связывающего белка человека. Человеческий гомолог OPG-связывающего белка экспрессируется в виде мРНК приблизительной мол. массы 2,5 kb в периферических лимфатических узлах человека и выявляется путем гибридизации с кДНКовой пробой мыши в строгих условиях. ДНК, кодирующую OPGсвязывающий белок человека, получают скринингом библиотеки кДНК лимфатических узлов человека как в рекомбинантных бактериофаговых бляшках, так и в трансформированных бактериальных колониях с помощью гибридизационных методов (Sambrook et al., MolecularPress, New York (1989. В указанных целях фаговую или плазмидную библиотеку кДНК скринировали с помощью радиоактивно меченных проб, полученных из клона 32D-F3 OPGсвязывающего белка мыши. Пробы использовали для скрининга нитроцеллюлозных фильтров,отпечатанных с рассеянных на чашки библиотечных клонов. Указанные фильтры предгибридизовали и затем гибридизовали в условиях,описанных в примере 4, и очищали кДНК OPGсвязывающего белка человека. Вставки, полученные из клонов OPG-связывающего белка человека, секвенировали и анализировали, как описано в примере 3. Поли А+ РНК из лимфатических узлов человека (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) анализировали на присутствии OPG-bp транскриптов, как ранее описано в заявке США 08/577, 788, поданной 22 декабря 1995 г. Нозерн-блоты указанного образца РНК, обработанные пробой в жестких условиях гибридизации, в качестве которой служил меченный 32 Р OPG-bp мыши, выявляли наличие транскриптов OPG-bp человека. Затем на основе мРНК лимфатических узлов при использовании набора Superscript (GIBCOLife Technologies, Gaithersberg, MD) синтезировали праймированную олиго-dT библиотеку кДНК, как описано в примере 2. Полученную кДНК отбирали по размеру и фракцию с высо 003636 30 кой мол. массой лигировали в плазмидный вектор рсДНК 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). Электрокомпетентные клетки Е. coli DH 10(GIBCO Life Technologies, Gaithersberg, MD) трансформировали и 1 x 106 устойчивых к ампициллину трансформантов скринировали гибридизацией колоний, используя в качестве пробы OPG-связывающий белок мыши. Был выделен плазмидный клон phuOPGbp1.1 кДНК возможного OPG-связывающего белка человека, содержащий вставку размером 2,3 kb. Полученная последовательность нуклеотидов вставки phuOPGbp-1.1 обнаружила около 8085% гомологии с последовательностью кДНКOPG-связывающего белка мыши. Трансляция последовательности кДНК-вставки выявила наличие длинной открытой рамки считывания,которая предположительно кодирует полипептид размером 317 ак (фиг. 4). Сравнение полипептидов OPG-bp человека и мыши показывает,что они примерно на 87% идентичны. Это свидетельствует о высокой консервативности указанного белка в процессе эволюции. ДНК OPGсвязывающего белка человека и аминокислотная последовательность OPG-bp не обнаружены в банке генов, и не выявлено гомологии с ESTпоследовательностями. Как последовательность мышиного гомолога, последовательность OPGсвязывающего белка человека обнаруживает высокое сходство со всеми членами суперсемейства цитокинов TNF. Пример 6. Клонирование и бактериальная экспрессия OPG-связывающего белка. Для получения различных форм OPGсвязывающих белков мыши была использованаPCR-амплификация с парами праймеров и матрицами, описанными ниже. Один из праймеров каждой пары вводит ТАА стоп-кодон и уникальный Xho I - или Sac II - сайт за карбоксиконцевым участком гена. Другой праймер каждой пары вводит уникальный Nde I - сайт, Nконцевой метионин и оптимизированные кодоны для амино-концевого участка гена. PCR и термосайклинг проводят с помощью стандартной технологии рекомбинантных ДНК. PCRпродукты очищают, расщепляют ферментами и встраивают в уникальные сайты Nde I и Xho I или Sac II вектора pAMG21 (ATCC98113),которым трансформируют фототрофные клетки Е. coli 393 или 2596. Другие обычно используемые векторы экспрессии для Е. coli и клеткихозяева также подходят для осуществления экспрессии. После трансформации клоны отбирают, выделяют плазмидную ДНК и определяют последовательность вставки OPG-связывающего белка. Указанный конструкт содержит 242 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met (75)-Asp-Pro-AsnArgGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32 В-А 3, и в качестве пары праймеров для проведения PCR и клонирования указанного генного конструктора служат олигонуклеотиды 1581-72 и 1581-76. Указанный белок мыши содержит 190 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Lys (128)-Glu-LeuGln-HisGln-Asp-Ile-Asp (316)-СООН. Матрицей для осуществления PRC служит рсДНК/23D-F3, и в качестве пары праймеров для проведения PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1591-91 и 1591-95.[95-316] Указанный конструкт содержит 223 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-His (95)-Glu-AsnAla-GlyGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществленияPCR служит рсДНК/32D-F3, и в качестве пары праймеров для PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1591-90 и 1591-95.[137-316] Указанный конструкт содержит 181 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Gln (137)-Arg-PheSer-GluGlu-Asp-Ile-Asp (316)-СООН. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32D-F3, и в качестве пары праймеров для проведения PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1591-92 и 1591-95.[107-316] Указанный конструкт содержит 211 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Ser (107)-Glu-AspThr-LeuGln-Asp-Ile-Asp (316)-СООН. Матрицей для осуществления PRC служитpcДHK/32D-Fc, и в качестве пары праймеров для проведения PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1591-93 и 1591-95.[146-316] Указанный конструкт содержит 171 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met (146)-Glu-Gly-SerTrpGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PCR служит OPGсвязывающий белок мыши pAMG 21 [75-316],описанный выше, и для проведения PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1600-98 и 1581-76.[118-316] Указанный конструкт содержит 199 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met (118)-Lys-Gln-AlaPhe-GlnGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32D-F3, и в качестве пары праймеров для проведения PCR и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1591-94 и 1591-95.[156-316] Указанный конструкт содержит 162 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Arg (156)-Gly-LysProGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PRC служитOPG-связывающий белок мыши pAMG 21 [ 158316], описанный ниже, и для проведения PRC и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1619-86 и 1581-76. 33 Указанный конструкт содержит 160 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Lys (158)-Pro-GluAlaGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32D-F3,и для проведения PRC и клонирования указанного генного конструкта служат олигонуклеотиды 1581-73 и 1581-76. 1581-73: 5'-GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTT[166-316] Указанный конструкт содержит 52 в длину и имеет следующие N-концевые и С-концевые остатки: NH2-Met-His (166)-Lеu-Тhr-IlеGlnAsp-Ile-Asp (316)-СООН. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32D-F3, и для проведения PCR и клонирования указанного конструкта служат олигонуклеотиды 1581-75 и 1581-76. 1581-75: 5'-GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCAT[168-316] Указанный конструкт содержит 150 ак в длину и имеет следующие N-концевые и Сконцевые остатки: NH2-Met-Thr (168)-Ile-AsnAlaGln-Asp-Ile-Asp (316)-COOH. Матрицей для осуществления PCR служит рсДНК/32D-F3, и для проведения PCR и клонирования указанного конструкта олигонуклеотиды 1581-74 и 1581-76. 1581-74: 5'-GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCC Понятно, что охарактеризованные выше конструкты приведены здесь в качестве примеров, и специалист в данной области исследований может легко получить другие формы OPGсвязывающего белка с помощью раскрытых в описании методологических подходов. Рекомбинантные бактериальные конструкты OPG-связывающего белка мыши pAMG 21[75-316], [95-316], [107-316], [118-316], [128316], [137-316], [158-316] были клонированы,определены их ДНК-последовательности и после индукции были выявлены уровни экспрессии рекомбинантных генных продуктов. Все конструкты продуцировали такие уровни рекомбинантных генных продуктов, которые визуально определялись в результате электрофореза в полиакриламидном геле в присутствииSDS (SDS-PAGE) и последующего окрашивания с помощью Кумасси грубых клеточных лизатов. Выращивание трансформированных клеток Е.coli 393 или 2596, индукцию экспрессии OPGсвязывающего белка и выделение телец включения осуществляли, как описано в заявке WO 97/23614. Очистка OPG-связывающих белков из телец включения требует их солюбилизации и ренатурации, которые могут быть осуществлены специалистом в данной области исследований с помощью известных методик. Обнаружено, что рекомбинантный OPG-связывающий белок мыши [158-316] главным образом продуцируется в нерастворимой форме, однако, 40% выявляется в растворимой фракции. Рекомбинантный белок очищают из растворимой фракции, как описано ниже, и определяют его биологическую активность. Пример 7. Очистка рекомбинантного OPGсвязывающего белка мыши [158-316]. Замороженные бактериальные культуры,экспрессирующие OPG-связывающий белок мыши [158-316] оттаивали и ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,0, 10 мМ ЭДТА. Затем клеточные суспензии (20% вес/объем) гомогенизировали путем трехкратного пропускания через микрогомогенизатор. Суспензию лизированных клеток центрифугировали в роторе JA14 при 10,000 об/мин в течение 45 мин. SDS-PAGE выявил полосу с примерной мол. массой около 18 кДа в тельцах включения и супернатанте. Затем растворимую фракцию наносили на колонку Pharmacia 4FF с SP Сефарозой, уравновешенную 10 мМ MES, рН 6,0. OPGсвязывающий белок элюировали в градиенте 00,4 М NaCl в MES, рН 6,0, в 20 объемах колонки. Затем фракции, содержащие OPGсвязывающий белок, наносили на колонку АВХBakerbond, уравновешенную 20 мМ MES, рН 6,0. OPG-связывающий белок элюировали в градиенте 15 CV 0-0,5 М NaCl в MES, рН 6,0. Конечный продукт имел степень гомогенности более 95%, как было определено SDS-PAGE. Nконцевое секвенирование выявило следующую последовательность: Met-Lys-Pro-Glu-Ala-GlnPro-Phe-Ala-His, которая соответствовала предсказанной последовательности полипептида,начинающегося с остатка 158 (инициаторный метиониновый остаток). Относительная мол. масса белка, определенная SDS-PAGE, не изменялась в результате восстановления. Пример 8. Биоактивность in vitro рекомбинантного растворимого OPG-связывающего белка. Предварительно было показано, что рекомбинантный OPG-белок блокирует зависимое от витамина D3 образование остеокластов из предшественников костного мозга и селезенки в исследовании формирования остеокластов, описанном в заявке США 08/577, 788. ПосколькуOPG-связывающий белок связывает OPG и является новым членом TNF-семейства лигандов,он может служить потенциальной мишенью тестирования биоактивности OPG. Рекомби 35 нантный растворимый OPG-связывающий белок[158-316], соответствующий минимальному коровому TNF-подобному домену, был исследован на способность модулировать дифференцировку остеокластов из предшественников остеокластов. Клетки костного мозга были выделены из бедренной кости взрослой мыши и обработаны M-CSF. Неприкрепившуюся фракцию совместно культивировали с клетками ST2 в присутствии и в отсутствие витамина D3 и дексаметазона. Как предварительно показано, остеокласты развиваются только из совместных культур,содержащих стромальные клетки (ST2), витамин D3 и дексаметазон. Рекомбинантный растворимый OPG-связывающий белок добавляли в различных концентрациях, варьирующих от 0,16 до 500 нг/мл, и созревание остеокластов выявляли исследованием TRAP в растворе и путем визуального наблюдения.OPGсвязывающий белок эффективно стимулировал дифференцировку и созревание остеокластов дозо-зависимым образом с половинным максимальным эффектом при концентрации 1-2 нг/мл. Указанное позволяет предположить, что данный белок действует как потенциальный индуктор остеокластогенеза in vitro (фиг. 5). ДействиеOPG-связывающего белка блокируется рекомбинантным OPG (фиг. 6). Для выяснения того факта, способен лиOPG-связывающий белок замещать строму и добавленные стероиды, культуры устанавливали при использовании M-CSF в различных концентрациях для усиления роста предшественников остеокластов, и к культурам добавляли различные количества OPG-связывающего белка. Как показано на фиг. 6, OPG-связывающий белок дозо-зависимым образом стимулируетTRAP-активность и интенсивность стимуляции зависит от уровня добавленного M-CSF, позволяя предположить, что оба указанных фактора совместно необходимы для развития остеокластов. Для подтверждения последнего наблюдения с точки зрения биологической активности культуры помещали на срезы коры кости быка и тестировали действие M-CSF и OPGсвязывающего белка как вместе, так и по отдельности. Как показано на фиг. 7, OPGсвязывающий белок в присутствии M-CSF стимулирует образование крупных, положительных по TRAP остеокластов, которые вызывают эрозию поверхности кости, приводя к появлению ямок. Таким образом, OPG-связывающий белок действует как фактор стимуляции (дифференциации) остеокластогенеза. Это позволяет предположить, что OPG блокирует развитие остеокластов, подавляя OPG-связывающий белок. Пример 9. Активность in vivo рекомбинантного растворимого OPG-связывающего белка. На основе исследований in vitro был сделан вывод о том, что рекомбинантный OPGсвязывающий белок мыши [158-316], продуци 003636 36 руемый в клетках Е. coli является эффективным индуктором развития остеокластов из миелоидных предшественников. Для подтверждения действия данного белка in vivo самцов мышейOPGсвязывающим белком [158-316] дважды в день в течение 3 дней и утром четвертого дня (дни 0, 1,2 и 3). Пять групп животных (n=4) получали один носитель или 1, 5, 25 или 100 мкг OPGсвязывающего белка в день. Дополнительные 5 групп мышей (n=4) получали указанные выше дозы носителя или OPG-связывающего белка[158-316] и, кроме того, Fc-OPG-[22-194] человека в дозе 1 мг/кг/день (примерно 20 мкг/день) путем однократной ежедневной подкожной инъекции. Общее содержание в крови ионизированного кальция определяли до начала эксперимента в день 0 через 3-4 ч после первой ежедневной инъекции OPG-связывающего белка[158-316] в дни 1, 2 и 3. Через 4 ч после последней инъекции в день 3 мышей умерщвляли и проводили радиографию. Рекомбинантный OPG-связывающий белок[158-316] вызывает существенное увеличение в крови ионизированного кальция через 2 дня после его введения в дозах 5 мкг/день и выше(фиг. 8). Тяжесть гиперкальциемии свидетельствует об эффективной индукции активности остеокластов, приводящей к усиленной резорбции кости. Конкурентное введение OPG ограничивает гиперкальциемию при дозах OPGсвязывающего белка [158-316] 5 и 25 мкг/день,но не 100 мкг/день. Животных также исследовали радиографией для того, чтобы определить влияние OPG-связывающего белка на минеральную плотность костей, что видно в рентгеновских лучах (фиг. 9). Рекомбинантный OPG-связывающий белок[158-316], вводимый в течение 3 дней, уменьшал плотность в проксимальном участке большеберцовой кости мыши дозо-зависимым образом. Редукция плотности костей особенно явно выявлялась у мышей, получавших OPGсвязывающий белок в дозе 100 мкг/день, подтверждая, что тяжелая гиперкальциемия у данных животных вызвана усиленной резорбцией костей, что приводит к высвобождению кальция из скелета. Приведенные данные четко показывают, что OPG-связывающий белок [158-316] действует in vivo как индуктор резорбции костей, вызывая системную гиперкальциемию, а рекомбинантный OPG корригирует указанные эффекты. Пример 10. Клонирование и экспрессия растворимого OPG-связывающего белка в клетках млекопитающих. Полноразмерный клон OPG-связывающего белка мыши и человека может быть экспрессирован в клетках млекопитающих, как ранее описано в примере 2. Альтернативно, клоны кДНК могут быть модифицированы так, чтобы коди 37 ровать секретируемые формы белка при экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого природный 5'-концевой участок кДНК, кодирующей кодон инициации и примерно первые 69 аминокислот белка, в том числе трансмембранный участок, замещают лидерной последовательностью сигнального пептида. Например,последовательности ДНК, кодирующие кодон инициации и сигнальный пептид известного гена, могут быть сплайсированы с последовательностью кДНК OPG-связывающего белка в каком-либо участке после области, кодирующей аминокислоту в положении 68. Предсказывается, что полученные рекомбинантные клоны продуцируют секретируемые формы OPGсвязывающего белка в клетках млекопитающих и будут подвергаться посттрансляционным модификациям, которые обычно происходят в пределах С-концевого внеклеточного доменаOPGсвязывающего белка, которая имеет на своем 5'конце сигнальный пептид OPG-мыши, а на своем 3'-конце Fc-домен IgGl человека. Плазмидный вектор pCEP4/mu OPG [22-401]-Fc, описанный в заявке США 08/577, 788, поданной 22 декабря 1995 г., расщепляют Not I в участке между 3'-концом OPG и Fc-геном. Затем линеаризованную ДНК частично расщепляют Xmn I только между остатками 23 и 24 OPG с образованием тупого конца. Рестриктированные перевары затем дефосфорилируют с помощью CIP и соответствующие участки вектора (включая остатки 1-23OPG и Fc) очищают в геле. Участок кДНК OPG-связывающего белка мыши, кодирующий аминокислотные остатки 69-316, амплифицируют с помощью Pfuполимеразы (Stratagene, San Diego, СА) на основе плазмидной матрицы при использовании следующих олигонуклеотидов: 1602-61: ССТ СТА GGC СТG ТАС TTТ CGA GCG CAG Олигонуклеотид 1602-61 амплифицирует 5'-концевой участок гена и содержит искусственный Stu I - сайт. Праймер 1602-59 амплифицирует 3'-концевой участок гена и содержит искусственный Not I - сайт. Полученный в результате PCR продукт расщепляют Not I и Stu I и затем очищают в геле. Очищенный PCRпродукт лигируют в вектор и затем используют для трансформации электрокомпетентных клеток Е. coli DH10 В. Полученный клон секвенируют для подтверждения интеграции амплифицированной последовательности и соединений рестрикционных сайтов. Эту плазмиду затем используют для трансфекции фибробластов 293 человека и белок слияния "OPG-связывающий 38 белок-Fc" собирают из культурной среды, как ранее описано в заявке США 08/577, 788,поданной в декабре 1995 г. При использовании сходной стратегии конструируют вектор экспрессии, который способен экспрессировать N-концевую усеченную форму, слитую с доменом Fc IgGl человека. Указанный конструкт содержит сигнальный пептид OPG мыши (ак 1 -21), слитый в пределах рамки считывания с остатками 158-316 OPGсвязывающего белка мыши, за которым следует домен Fc IgGl человека, также слитый в пределах рамки считывания. Для этого плазмидный вектор рСЕР 4/ОРG мыши [22-401] (Заявка США 08/577, 788, поданная 22 декабря 1995 г.) расщепляют Hind III и Not I для удаления полной рамки считывания OPG. Остатки 158-316OPG-связывающего белка мыши амплифицируют с помощью PCR при использовании в качестве матрицы плазмиды рсДНК/32-F3 и следующих праймеров: 1661-44: ССТ СТС TCG AGT GGA CAA CCC AGA AGC СТG AGG CCC AGC CAT TTG С (SEQ ID NO:29) 1602-59: ССТ СТG CGG CCG СGТ СТА ТGТ ССТ GAA СТТ TG (SEQ ID NO:30)PCR-продукт расщепляют Not I и Xho I и затем очищают в геле. Следующие комплементарные праймеры отжигают друг с другом с образованием адаптера, кодирующего сигнальный пептид OPG мыши и последовательность Козака, окружающую сайт инициации трансляции: 1616-41: AGC ТТС СAC CAT GAA САА GTG GCT GTG Указанные праймеры отжигают с образованием 5-липких концов, совместимых с HindPCR-фрагмент лигируют вместе и вводят электропорацией в клетки DH10B. Полученный клон секвенируют для подтверждения аутентичной реконструкции соединения между сигнальным пептидом,фрагментомOPGсвязывающего белка, кодирующим остатки 158316, и доменом Fc IgGl. Рекомбинантную плазмиду очищают, трансфицируют в фибробласты человека 293 и экспрессируют как продукт кондиционированной среды, как описано выше. 39 Полноразмерную кДНК человека и мыши клонируют в векторе экспрессии рСЕР 4 (Invitrogen, San Diego, CA) и затем трансфицируют в культуры клеток фибробластов человека 293,как описано в примере 1. Клеточные культуры отбирают на срезе с гигромицином, как описано выше, и получают свободную от сыворотки кондиционированную среду. Кондиционированную среду наносят на колонку с иммобилизованным рекомбинантным OPG и с помощью аффинной хроматографии очищают слущивающиеся формы рекомбинантного OPG bp человека и мыши. N-концевое секвенирование очищенных растворимых OPG-связывающих белков показывает, что белок мыши предпочтительным образом расщепляется перед фенилаланином в положении 139, а белок человека предпочтительным образом расщепляется перед гомологичным остатком, а именно изолейцином 140. Кроме того, белок человека также преимущественно расщепляется перед остатком глицина 145. Указанное позволяет предположить, что природные растворимые формыOPGсвязывающего белка человека имеют аминоконцевые остатки, представленные изолейцином в положении 140 или глицином в положении 145. Пример 11. Пептиды OPG-связывающего белка и получение поликлональных и моноклональных антител к белку. Антитела к специфическим участкам OPGсвязывающего белка могут быть получены иммунизацией пептидами OPG-связывающего белка. Такие пептиды могут использоваться для иммунизации по отдельности или же в конъюгированной форме. Кристаллическая структура зрелого TNF описана ранее I. E. Y. Jones, D. I. Stuart, and N. Р. С. Walker (1990) J. Cell Sci. Suppl. 13, [11-18] и мономер образует "сэндвич" из антипараллельных -складчатых листов, имеющих топологию рулета с вареньем. В указанной кристаллической структуре обнаруживаются 10 антипараллельных -цепей, которые формируют сэндвич с одним -листом, состоящим из цепейB'BIDG, и другим, состоящим из цепей. С'СНЕF [E.Y. Jones et al., см. там же]. В результате исследований по мутагенезу обнаружено, что две петли зрелого TNF формируют контакты с рецептором, одна петля образуется между -цепями ВВ', другая - между -цепямиBroger, H. Loetscher, and W. Lesslauer (1993) Cell 73,431 -445]. Обнаружено, что в соответствии с данными исследования по мутагенезу, приве 003636 40 денными выше [С. R. Goh et al., см. выше], определенные петли ВВ' и EF лиганда TNF образуют большую часть контактов с рецептором в расшифрованной кристаллической структуре комплекса "TNFb: TNF-R55". Аминокислотную последовательность OPG-связывающего белка мыши сравнили с аминокислотной последовательностью TNF и TNF. Участки OPGсвязывающего белка мыши, соответствующие ВВ' и EF петлям, были предсказаны на основе результатов указанного сравнения и были сконструированы пептиды, которые описаны ниже. А. Антиген(ы): рекомбинантный OPGсвязывающий белок мыши [158-316] использовали в качестве антигена (аг) для иммунизации животных, как описано ниже, и сыворотку животных исследовали с помощью методов, охарактеризованных далее. Пептиды, соответствующие возможным ВВ' и EF петлям OPGсвязывающего белка мыши, были синтезированы и использованы для иммунизации. Этими пептидами являются следующие: пептид ВВ' петли: NH2-NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGW Пептиды с карбосиконцевым цистеиновым остатком использовались для конъюгации с помощью методов, описанных в разделе В ниже, и далее для иммунизации.B. Конъюгация с гемоцианином моллюска фиссуреллы или бычьим сывороточным альбумином. Выбранные пептиды или фрагменты белка могут быть конъюгированы с гемоцианином моллюска фиссурелы (KLH) для увеличения их иммуногенности в организме животных. Кроме того, для осуществления методики EIA могут применяться пептиды, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (BSА) или фрагментами белка. Активированный KLH илиdH2O до конечной концентрации 10 мг/мл. Пептидные или белковые фрагменты растворяют в фосфатном буфере и затем смешивают с эквивалентным количеством (г/г) KLH или BSA. Осуществляют реакцию конъюгирования в течение 2 ч при комнатной температуре (RT) с легким перемешиванием. Затем раствор пропускают через обессоливающую колонку или диализуют против PBS в течение ночи. Пептидный конъюгат хранят при 20 С до иммунизации или проведения EIAs.Rivers Laboratories, Wilmington, MA), крыс Lou или новозеландских белых кроликов подкожно 41 го инъецируют антигеном (50 мкг, 150 мкг и 100 мкг соответственно), эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ, 50% об/об;Difco Laboratories, Detroit, MI). Затем кроликам вводят бустерные дозы антигена два или три раза с 2-недельными интервалами, причем антиген был приготовлен, как описано выше, но в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ, DifcoLaboratories, Detroit, MI). Мышей и крыс бустируют примерно каждые 4 недели. Через 7 дней после второго бустирования отбирают образцы крови и определяют титры антител в сыворотке. Когда в крови кроликов удавалось определить наличие антител, в течение 6 последующих недель каждую неделю отбирали образцы крови объемом 50 мл. Мышей и крыс отбирали для получения гибридом на основе титров антител в сыворотке; использовали животных, в крови которых половинные значения максимальных титров превышали 5000. Модификации указанной методики могут быть осуществлены специалистом в данной области исследований; например, в настоящее время доступны различные типы иммуномодуляторов, которые могут быть использованы.D. Иммуносорбентный анализ со связанным ферментом (EIA).EIA осуществляли для выявления титров сывороточных антител (ат) у индивидуальных животных, а позднее -для скрининга потенциальных гибридом. 96-луночные платы для микротитрования с плоским дном с высокой эффективностью связывания для EIA/RIA (Costar Corporation, Cambridge, MA) покрывали очищенным рекомбинантным белком или фрагментом белка (антиген, аг) в концентрации 5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,2 (0,015 М Na2CO3, 0,035 М NaHCO3). Фрагменты белка могут быть конъюгированы с бычьим сывороточным альбумином (BSA), если это необходимо. 50 мкл аг добавляют в каждую лунку. Затем платы закрывают ацетатной пленкой (INC Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) и инкубируют при комнатной температуре на вращающейся платформе в течение 2 ч или в течение ночи при 4 С. Затем осуществляют блокирование в течение 30 мин при комнатной температуре добавлением в каждую лунку 250 мкл 5%-ного раствора BSA, приготовленного смешиванием 1 части концентрата блокирующего раствора/разбавителя BSA и части деионизированной воды (dH2O). Блокирующий раствор удаляют и в каждую лунку вносят 50 мкл 2-кратных разведений сыворотки (от 1:100 до 1:12 800) или супернатантов гибридомных клеточных культур. Разбавлением сыворотки является 1%-ный BSA(10% концентрат блокирующего раствора/разбавитель BSA разводят в соотношении 1:10 в фосфатном буферном растворе Дульбекко, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY), в то время как супернатанты гибридом тестируются неразбавленными. При скрининге гибридом 42 одну лунку используют как контроль конъюгата, а вторую лунку - в качестве положительного контроля ат. Платы снова инкубируют при комнатной температуре, вращают в течение 1 ч и затем 4 раза отмывают 1 х раствором для отмывания, приготовленным из 20 х концентрата(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.,Gaithersburg, MD) в dH2O. Вторые антитела,конъюгированные с пероксидазой хрена (Boeringer Mannheim Biochemicals, Indianopolis, IN) разводят в 1%-ном BSA и затем инкубируют в каждой лунке 30 мин. Платы отмывают, как описано ранее, высушивают и добавляют однокомпонентный субстрат ABTS для пероксидазы(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.,Gaithersburg, MD). В каждой лунке определяют величину поглощения при 405 нм с помощью ридера микроплат EL310 (Biotek Instruments,Inc., Winooski, VT). Величины, соответствующие половинным максимальным титрам антител в сыворотке, определяют, строя график зависимости log10 разведения сыворотки от оптической плотности при 405 нм и затем экстраполируя величину 50%-ной максимальной оптической плотности, полученной для данной сыворотки. Гибридомы отбирают как положительные, если величины оптической плотности более чем в 5 раз превышают фоновые значения. Могут быть использованы модификации указанной методики, например, могут быть выбраны конъюгированные вторые антитела определенной специфичности или перекрестно не реагирующие. Е. Слияние клеток. Животному, отобранному для получения гибридом, внутривенно вводят 50-100 мкг аг вPBS. Через 4 дня животное умерщвляют с помощью СO2 и в стерильных условиях забирают селезенку в 35 мл модифицированной Дульбекко среды Игла, содержащей 200 Ед/мл пенициллина G, 200 мкг/мл стрептомицинсульфата и 4 мМ глутамина (2xP/S/G DMEM). Селезенку очищают от избытка жировой ткани и отмывают в чашках чистой средой 2xP/S/G DMEM. Затем селезенку переносят в стерильный мешочек(Stomacher) (Tekmar, Cincinnati, ОН), содержащий 100 мл 2xP/S/G DMEM и гомогенизируют до одноклеточной суспензии в блендере Stomacher Lab 80 (Seward Laboratory UAC House;London, England). По мере того, как клетки высвобождаются из селезеночной капсулы в среду,их удаляют из мешочка и переносят в стерильную 50-мл коническую пробирку для центрифугирования (Becton Dickinson and Company, Lincoln Park, NJ). Далее свежую среду добавляют в мешочек и процедуру повторяют до тех пор,пока из селезенки не высвободятся все клетки. Полученные спленоциты трижды отмывают центрифугированием при 225 g в течение 10 мин. Одновременно культуры миеломных клеток Sp2/0-Ag14 мыши или Y3-Ag 1.2.3 крысы на логарифмической стадии роста, предназначены 43 для слияния со спленоцитами (American TypeCulture Collection; Rockville, MD), выращенные в полной среде (DMEM, 10% инактивированной сыворотки плода коровы, 2 мМ глутамина, 0,1 мМ необходимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 10 мМ Hepes-буфера; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) отмывают сходным образом. Спленоциты объединяют с клетками миеломы и осаждают. Среду над клеточным осадком отсасывают и к клеткам при осторожном перемешивании добавляют 2 мл полиэтиленгликоля 1500 (PEG 1500; Boehringer MannheimBiochemicals, Indianapolis, IN) в течение 1 мин. Затем медленно добавляют эквивалентный объем 2xP/S/G DMEM. Клетки оставляют для слияния при 37 С в течение 2 мин и затем вносят дополнительное количество (6 мл) 2xP/S/GDMEM. Затем клетки выдерживают при 37 С в течение 3 мин. И, наконец, 35 мл 2xP/S/GDMEM добавляют к клеточной суспензии и клетки осаждают центрифугированием. Среду над осадком клеток отсасывают и клетки осторожно ресуспендируют в полной среде. Клетки распределяют в 96-луночные плоскодонные платы для культуры тканей (Becton DickinsonLabware; Lincoln Park, NJ) одиночными каплями из 5-мл пипетки. Платы ингибируют в течение ночи в условиях влажности при 37 С в атмосфере 5%-ного СО 2. На следующий день в каждую лунку добавляют эквивалентный объем среды для селекции. Указанная среда содержит 0,1 мМ гипоксантина, 4 х 10-4 мМ аминоптерна и 1,6 х 10-2 мМ тимидина в полной среде. Платы со слившимися клетками инкубируют в течение 7 дней и далее в течение 3 дней дважды меняют среду. Среду же для селекции HAT используют после каждой смены жидкости. Супернатанты тканевых культур отбирают через 3-4 дня после последней смены жидкости из каждой лунки,содержащей клеточные гибриды, и тестируют с помощью EIA для выявления специфических антител. Указанная методика может быть модифицирована; см., например, Hudson and Hay,"Практическая иммунология, второе издание",Blackwell Scientific Publications. Пример 12. Клонирование рецептора OPGсвязывающего белка, который экспрессируется на гематопоэтических клетках-предшественниках. Биологически активный рекомбинантный(FITC) с получением флуоресцентной пробы. Флуоресцентное мечение осуществляют инкубированием рекомбинантного OPG-связывающего белка мыши [158-316] с 6-флуоресцеин 5- (и 6) сукцинимидиловым эфиром гексановой кислоты (Molecular Probes, Eugene, OR) при молярном соотношении 1:6 в течение 12 ч при 4 С. Меченный FITC OPG-связывающий белок [158316] затем очищают путем гель-фильтрационной хроматографией. Клетки костного мозга[158-316], как описано в примере 10. Клетки костного мозга мыши культивируют в течение ночи при добавлении в CSF-1 (30 нг/мл) и OPGсвязывающего белка [158-316] (20 нг/мл). Неприкрепившиеся клетки удаляют и хранят на льду, а оставшиеся прикрепившиеся клетки удаляют путем инкубирования в буфере для диссоциации клеток (Sigma Chemical, St. Louis, МО),объединяют с популяцией неприкрепившихся клеток и окрашивают FITC-OPG-связывающим белком, как описано выше. После отмывания и ресуспендирования в PBS с 0,5% BSA клетки обрабатывают FITC-OPG-связывающим белком,отмывают и сортируют при использованииFACS. Популяцию клеток, которые положительны на окрашиваниеFITC-OPGсвязывающим белком, собирают и выделяют из них мРНК, как описано в примере 2. Полученный препарат мРНК использует для конструирования кДНКовой библиотеки, как описано в примере 2. Библиотеку кДНК, полученную из указанного источника, используют для выборочногоEST-секвенирования, как предварительно описано в опубликованной заявке WO 97/23614 и в работе Simonet et al. (Cell-89, 309-319 (1997. Используя указанный подход, выявляют кДНК размером около 2,1 kb, которая кодирует новыйTNFR-родственный белок. Длинная открытая рамка считывания кДНК ODAR мыши кодирует белок размером в 625 ак и содержит структурные элементы, характерные для TNFRродственных белков: на N-концевом участке гидрофобную последовательность сигнального пептида, четыре тандемные обогащенные цистеином повторяющиеся последовательности,гидрофобный трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен. Гомология указанного белка с другими членами семействаFITC-OPGсвязывающий белок, позволяет предположить,что он является возможным рецепторам для родственного TNF OPG-связывающего белка. Этот белок обозначают ODAR или "рецептор дифференцировки и активации остеокластов". Последовательность нуклеотидов и предсказанная аминокислотная последовательность ODAR мыши приведена на фиг. 10. Сравнение последовательностей с доступными базами данных свидетельствует о том, что полученный белок является мышиным гомологомODAR-белка в клетках млекопитающих. Растворимый внеклеточный домен ODAR,слитый с Fc-участком IgGl человека, получают с помощью методик для конструирования и экс 45 прессии Fc-слитых белков, как предварительно описано в заявке WO 97/23614 и в работе Simonet et al., см. выше. Для получения растворимого ODAR-белка в клетках млекопитающих кДНК, кодирующую внеклеточный доменODAR мыши (ак 27-211), амплифицируют с помощью PCR при использовании следующего набора олигонуклеотидных праймеров: 5' ТСТ CCA AGC TTG TGA СТС ТСС AGG ТСА СТС С -3'PCR-реакции осуществляют в объеме 50 мкл с добавлением 1 Ед коммерческой ДНКполимеразы (New England Biolabs) в растворе,содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 10 мМ КСl, 10 мМ (NH4)2SO4,0,1%-ный Тритон-Х 100,10 мкМ каждого из dNTP, 1 мкМ каждого праймера и 10 нг кДНК-матрицы ODAR. Реакции проводят при 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с и 72 С в течение 1 мин, в общей сложности 16 циклов. PCR-фрагмент выделяют путем электрофореза. В PCR-фрагменте создаетсяI - рестрикционный сайт на 3'-конце. Расщепленный Hind III - Not I PCR-фрагмент затем субклонируют в пределах рамки считывания в модифицированный вектор pCEP4-Fc впереди последовательности тяжелой цепи IgG-l человека, как ранее описано в заявке WO 97/23614 и в работе Simonet et al., см. выше. В вектор также встраивают линкер, который кодирует две иррелевантные аминокислоты, перекрывающие соединение между внеклеточном доменом ODAR и участком Fc IgG. Конструкт затем расщепляют Nhe I и HindIII и встраивают в пределах рамки следующую отожженную пару олигонуклеотидов, кодирующую сигнальный пептид OPG (ак 1-21): 5' СТА GCA CCA TGA АСА AGT GGC TGT GCT GCG САС ТСС TGG TGC ТСС ТGG АСА ТСА TTG ААТ GGA САА ССС AGA - 3' (SEQ ID NO:39) 5' AGC ТТС TGG GTT GTC САТТСА ATG ATG ТСС AGG Линкер, кодирующий две иррелевантные аминокислоты, встраивают между последовательностями сигнального пептида OPG иIgG человека. Конструкт затем трансформируют в клетки 293-EBNA-1 кальций-фосфатным методом, как описано в работе Ausubel et al., Curr. Prot. Mol.Biol. 1, 9.1.1-9.1.3, (1994). Затем трансфицированные клетки отбирают в присутствии 200 46 мкг/мл гигромицина (GibcoBRL) и полученные масс-культуры, устойчивые к гигромицину,объединяют и выращивают до состояния монослоя. Клетки отмывают один раз в PBS и культивируют в свободной от сыворотки среде в течение 72 ч. Кондиционированную среду собирают. Белок слияния ODAR-Fc в среде выявляют Вестерн-блоттингом с антителами к Fc IgG человека. Белок слияния Fc был очищают путем хроматографии на колонке с протеином А(Pierce), согласно рекомендациям производителя. Затем 50 пкМ очищенного белка подвергаютN-концевому секвенированию путем автоматической деградации по Эдману, как описано Matsudaira et al., (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987. После 10 циклов устанавливают следующую аминокислотную последовательность:OPG-связывающим белком исследуют путем иммунофлуоресцентного окрашивания трансфицированных клеточных культур COS-7, как описано в примере 2. Клетки COS-7 липофектируют 1 мкг вектора экспрессии, содержащего ДНК, кодирующую OPG-связывающий белок мыши. Через 48 ч инкубирования клетки вновь инкубируют в PBS-FBS-растворе, содержащем 10 мг/мкл Fc IgG человека, ODAR-Fc или OPGFc-белок, при 4 С в течение 1 ч. Затем клетки дважды отмывают PBS и инкубируют в растворе PBS-FBS, содержащем 20 мкг/мл меченныхBiotech Associates) еще в течение часа. После отмывания PBS клетки исследуют под конфокальным микроскопом (ACAS, Ultima, InsightODAR-Fc, так и OPG-Fc связываются с трансфицированными OPGL COS-7 клетками (фиг. 11). Пример 14. Биологическая активность рекомбинантного растворимого ODAR in vitro. Способность ODAR ингибировать стимуляцию образования остеокластов под действиемOPG-связывающего белка определяют в культуре клеток костного мозга мыши в присутствииCSF-1 (30 нг/мл) и OPG-связывающего белка (5 нг/мл). Методики использования культур костного мозга мыши для изучения созревания остеокластов описаны в заявке WO 97/23614 и примере 8. Белок слияния ODAR-Fc, как описано в примере 12, добавляют в культуры в концентрациях 65-1500 нг/мл. Образование остеокластов исследуют цитохимическим анализом устойчивой к тартрату алкалинфосфатазы(TRAP) и анализом TRAP в растворе через 5 дней после добавления в культуры белка. Дозозависимое ингибирование образования остеокластов под действием белка слиянияODAR-Fc наблюдают как при цитохимическом исследовании TRAP, так и при исследовании в растворе (фиг. 12). Белок слияния ODAR-Fc 47 ингибирует образование остеокластов, когда ЕД 50 составляет около 10-50 нг/мл. Пример 15. Биологическая активность рекомбинантного растворимого ODAR in vivo. Молодых, быстро растущих самцов мышейBDF1 в возрасте 3-4 недель подкожно инъецируют различными дозами белка слияния ODARFc один раз в день в течение 4 дней (в качестве носителя использовали PBS/0,1% BSА). Мышей исследовали рентгенографией на 5-ый день. Используемые дозы белка слияния ODAR-Fc составляли 0,5, 1,5 и 5 мг/кг/день. В каждом случае всех мышей в данной группе и контрольной группе, получавшей PBS/0,1% BSА, исследовали рентгенографией при использовании одной и той же пленки. Проксимальный метафизный участок большеберцовой кости сравнивали попарно у контрольных и "обработанных" животных и оценивали как "+", если большеберцовая кость опытного животного при визуальной оценке была более плотной по сравнению с костью контрольного животного, дающей счет 8,как указано ниже. Счет 5/8 был необходим для оценки результата как "положительный". (Дозу выражали в мк/кг/день). (n=4). После умерщвления животных правую большеберцовую кость у каждого животного удаляли и определяли плотность кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости путем периферической количественной компьютерной томографии (pQCT) (Stratec, Germany). Два 0,5-мм перекрестных среза кости, сделанных на расстоянии 1,5 мм и 2,0 мм от проксимального конца большеберцовой кости исследовали (XMICE 5.2, Stratec, Germany) для определения общей минеральной плотности костей в метафизах. Для определения границы метафизной кости используют порог отделения мягких тканей 1500. Введение ODAR-Fc молодым растущим мышам ингибирует резорбцию кости в проксимальной ростовой пластинке большеберцовой кости с образованием участка повышенной костной плотности, который явным образом виден на радиографических снимках. Радиографические изменения проявляются при дозе 1,5 мг/кг/день и выше (табл. 1). Измерение плотности кости путем pQCT в образцах, исследованных во втором эксперименте в сходном участке большеберцовой кости, подтверждает дозозависимое увеличение плотности кости у данных животных (фиг. 13). Таблица 1. Ингибирование резорбции кости белком слияния Несмотря на то, что в настоящем описании приведены предпочтительные варианты осуществления изобретения, специалисту в данной области исследований понятно, что могут быть сделаны его различные модификации. Таким образом, приведенная ниже формула охватывает все эквивалентные варианты изобретения в пределах его объема. 57 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая остеопротегеринсвязывающий белок,выбранная из группы, включающей: а) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную на фиг. 1 (SEQ ID NO:1) и фиг. 4 (SEQ ID NO:3); б) нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с участками последовательности, приведенной в а),причем последовательность, приведенная в а),кодирует остеопротегеринсвязывающий белок,показанный на фиг. 1 (SEQ ID NO:2) и фиг. 4(SEQ ID NO:4); в) нуклеиновые кислоты, которые являются вырожденными по отношению к нуклеиновым кислотам (а) или (б). 2. Нуклеиновая кислота по п.1, представляющая собой кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК или РНК. 3. Нуклеиновая кислота по п.1, включающая один или более кодонов, предпочтительных для экспрессии в Escherichia coli. 4. Нуклеиновая кислота по п.1, имеющая прикрепленную к ней детектируемую метку. 5. Нуклеиновая кислота по п.1, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 1-316, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO:1). 6. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 70-316, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO:1). 7. Нуклеиновая кислота по п.1, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 1-317, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:3). 8. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 69-317, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:3). 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая растворимый остеопротегеринсвязывающий белок,содержащий остатки 69-317, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:3), и его усеченные на N и С концах формы, которые стимулируют образование остеокластов или резорбцию костей. 10. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-9. 11. Вектор экспрессии по п.10, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота содержит участок, кодирующий полипептид, как показано на фиг.1 (SEQ ID NO:2) и фиг. 4 (SEQ ID NO:4). 12. Штамм культуры прокариотической и эукариотической клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии по п.10. 13. Штамм по п.12, представляющий собой штамм культуры клеток Escherichia Coli. 14. Способ получения остеопротегеринсвязывающего белка, включающий культивирова 003636 58 ние штамма клеток-хозяев по п.12 в условиях,обеспечивающих экспрессию белка, и выделение полипептидного продукта экспрессии. 15. Полипептид, полученный способом по п.14. 16. Выделенный остеопротегеринсвязывающий белок, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, или его фрагмент, аналог или производное, которые стимулируют образование остеокластов или резорбцию костей. 17. Белок по п.16, который ковалентно модифицирован с помощью водорастворимого полимера. 18. Белок по п.17, отличающийся тем, что полимер представляет собой полиэтиленгликоль. 19. Белок по п.16, представляющий собой растворимый остеопротегеринсвязывающий белок. 20. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 70-316,как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO:2), или его фрагмент, аналог или производное. 21. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 69-317,как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:4), и его усеченные формы. 22. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 140316, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:4), или фрагмент, аналог или производное данного белка. 23. Белок по п.19, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 145316, как показано на фиг. 4 (SEQ ID NO:4), или его фрагмент, аналог или производное. 24. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с остеопротегеринсвязывающим белком по п.16. 25. Способ выявления наличия остеопротегеринсвязывающего белка в биологическом образце, включающий инкубирование образца с антителом по п.24 в условиях, обеспечивающих связывание антитела с остеопротегеринсвязывающим белком, и выявление связанного антитела. 26. Способ выявления наличия остеопротегерина в биологическом образце, включающий инкубирование образца с остеопротегеринсвязывающим белком по п.16 в условиях, обеспечивающих связывание белка с остеопротегерином, и определение связанного остеопротегеринсвязывающего белка. 27. Способ определения способности тестируемого соединения связываться с остеопротегеринсвязывающим белком, включающий инкубирование остеопротегеринсвязывающего белка по п.16 с тестируемым соединением в условиях, обеспечивающих связывание, и выявление связанного соединения. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что соединение представляет собой агонист или 59 антагонист остеопротегеринсвязывающего белка. 29. Способ регулирования экспрессии остеопротегеринсвязывающего белка в организме животного, включающий введение животному эффективного количества нуклеиновой кислоты по п.1 б). 30. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество остеопротегеринсвязывающего белка по п.16 в фармацевтически приемлемом носителе, адъюванте, солюбилизаторе, стабилизаторе и/или антиоксиданте. 31. Композиция по п.30, отличающаяся тем, что остеопротегеринсвязывающий белок представляет собой остеопротегеринсвязывающий белок человека. 32. Способ предотвращения или лечения заболеваний костей у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора остеопротегеринсвязывающего белка, причем указанный модулятор является антителом по п.24, которое ингибирует образование остеокластов или резорбцию костей. 33. Способ оценки способности тестируемого соединения усиливать или ослаблять связывание остеопротегеринсвязывающего белка с рецептором дифференцировки и активации остеокластов, включающий инкубирование остеопротегеринсвязывающего белка, указанного рецептора и, необязательно, тестируемого соединения в условиях, обеспечивающих связывание остеопротегеринсвязывающего белка и указанного фактора, и выявление связывания остеопротегеринсвязывающего белка с указанным рецептором в отсутствие или в присутствии тестируемого соединения.