Модулятор иммунного ответа alpha2- макроглобулиновый комплекс

1 Исследования, легшие в основу настоящего изобретения, были частично оплачены грантами Национального Института ЗдоровьяHL-24066 и СА-29589 и грантом Датского Исследовательского Совета 11-0529-1. Правительство может иметь определенные права на настоящее изобретение. Область применения Настоящее изобретение в целом относится к иммунологии, а именно к антиген-2-макроглобулиновым комплексам, к простому и воспроизводимому получению антиген-2-макроглобулиновых комплексов, к последующему их применению, включая повышение иммунокомпетентности хозяина, и к получению и назначению вакцин для предотвращения и лечения болезненных состояний. Уровень техники Представление антигена и иммуногенность Обычно антигены представляются иммунной системе с помощью антиген-представляющих клеток (АПК), к которым относятся,например, макрофаги, дендритные клетки и Вклетки, совокупно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые экспонируются на поверхности АПК. Считается,что обычно природные антигены и молекулы,если они иммуногенны, захватываются и частично перевариваются АПК, таким образом, что небольшие фрагменты первоначального антигена экспрессируются на клеточной поверхности в окружении молекул главного комплекса гистосовместимости. Также в настоящее время считают, что Тлимфоциты, в противоположность В-лимфоцитам, в значительной мере менее способны взаимодействовать с растворимыми антигенами. Обычно Т-лимфоциты нуждаются в том, чтобы антиген был соответствующим образом обработан и экспрессирован на поверхности АПК в окружении молекул ГКГ, как это отмечалось выше. Таким образом, Т-клетки, а именно, так называемые, Т-клеточные рецепторы, способны узнавать антиген в форме бимолекулярного лиганда, включающего обработанный антиген и одну или более молекул ГКГ. Помимо представления антигенов на молекулах ГКГ, АПК должны быть активированы для экспрессии костимуляторных молекул, таких как В 7/В 1, прежде чем сможет проявиться эффективная стимуляция Т-клеток. Многие белковые эпитопы, включая эпитопы многих экзогенных и эндогенных белков,обычно не распознаются или слабо распознаются иммунной системой. Эти эпитопы вызывают слабый синтез антител или не вызывают его вовсе, то же относится и к другим типам иммунного ответа. Поэтому часто бывает сложным, а в некоторых случаях невозможным получить антитела к таким эпитопам. Напротив,некоторые эпитопы вызывают необычно силь 004228 2 ный иммунный ответ, в некоторых случаях исключая (или частично исключая) другие эпитопы в пределах той же молекулы антигена. Такие эпитопы называют иммунодоминантными. Отдельной проблемой является изготовление и способ назначения вакцин, в особенности вакцин, представленных пептидными антигенами. Традиционные способы изготовления таких вакцин, где антигены представлены на макромолекуле, путем конъюгации с белкомносителем или полимеризации, часто не дают результатов, так как такие антигены не всегда способны индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vivo. В таких случаях обычно добавляют адъювант. Использование адъюванта при иммунизации усиливает гуморальный ответ, но дает смешанные результаты в отношении стимуляции специфического ответа ЦТЛ. К сожалению, популярные адъюванты,используемые на лабораторных животных, такие как полный адьювант Фрейнда, слишком токсичны и неприменимы на людях. В идеале,защита от вирусной инфекции наилучшим образом обеспечивается как гуморальным, так и клеточным иммунитетами, включая долговременную память и цитотоксичные Т-клетки. Например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), этиологический агент, наиболее тесно связанный с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), стал одной из наиболее приоритетных целей при разработке вакцин. Преобладающая стратегия получения вакцины базируется на использовании оболочечных белковых анигенов gp120 и gp160 ВИЧ-1, полученных рекомбинантным путем. Однако обещания по их применению в вакцинах до сих пор не реализованы, хотя их и назначали вместе с эффективным адъювантами. Усиленное представление антигена Экспонирование антигена (сокращенно Аг) на АПК изучено подробно как in vitro, так и invivo [см. (1,2)]. Используемая методика включает инкапсуляцию Аг в липосоме (3,4), сшивку Аг с антителами к поверхностным белкам (5-9) и формирование иммунных комплексов для распознавания их FcR (10). Еще один подход,заключающийся в обработке поверхности Вклеток моноклональными антителами (MAT),узнающими конкретный Аг, также увеличивает возможности в представлении этого антигена(11). Емкость различных АПК по Аг явно кореллирует с эффективностью представления(12), хотя концентрирование Аг или внутриклеточная сигнализация также могут давать вклад в этот процесс. В общем, размещение Аг на поверхности АПК явно усиливает иммунный ответ. Тогда как В-клетки обладают специфическими рецепторами, поверхностными иммуноглобулинами (ИГ), для захвата Аг, которые они эффективно представляют, макрофаги и другие 3 не В-клеточные АПК вынуждены использовать другие механизмы. Таковые могут включать фагоцитоз частиц или клеток с Аг и усиленный эндоцитоз опсонизированных Аг или иммунных комплексов. До сих пор механизмы эффективного поглощения и представления растворимых Аг такими не В-клеточными АПК у животных не вполне понятны. Возможно, процесс опосредован какими-либо рецепторами. Среди АПК макрофаги вызывают особый интерес в силу той центральной роли, которую они играют в регуляции активности других клеток иммунной системы. Макрофаги действуют как эффекторные клетки при уничтожении микробных, а также и опухолевых клеток, и выделяют множество цитокинов, которые участвуют во многих аспектах иммунного ответа. Способность макрофагов регулировать широкий диапазон иммунологических событий в какой-то мере является функцией экспрессии ими поверхностных Iа антигенов. Экспрессия мембранных Iа антигенов является важным условием для индукции специфического Т-клеточного ответа на антиген (15). Эффективное усвоение и процессинг различных белков является главным вопросом в представлении антигенов макрофагами. Иммунная система вынуждена балансировать между способностью к взаимодействию с огромным количеством непохожих молекул с одной стороны и необходимостью эффективного ответа на очень малое количество антигена. Хотя макрофаги способны опробовать свое окружение через пиноцитоз, предполагается наличие более эффективного средства усвоения, такого как система, опосредованная рецептором(16). Размещение Аг на поверхностных рецепторах макрофагов или В-клеток либо путем искусственной сшивки, либо используя мембранные ИГ, усиливает эффективность представления (1, 16, 17); однако, природные системы представления антигена в макрофагах пока не идентифицированы. Семейство -макроглобулиновых белков-Макроглобулины и компоненты комплемента С 3, С 4 и С 5 составляют суперсемейство структурно родственных белков. Семейство -макроглобулинов включает протеиназасвязывающие глобулины как с 1, так и с 2 подвижностью. Наиболее интенсивно изучали 2-макроглобулин (2M) человека - крупный тетрамерный белок, способный ковалентно связывать другие белки (19-27) и таким образом размещать их на клеточной поверхности, одетой 2 М рецепторами (27-30). Хотя размер и заряд могут влиять на связывание, 2 М способен включать белки с нуклеофильными боковыми цепями аминокислот, относительно неселективным образом. Такая быстрая реакция ковалентного связывания ограничена, однако, отрезком времени, в ходе которого происходят конформационные изменения, в результате ко 004228 4 торых внутренний тиоэфир становится восприимчивым к нуклеофильной замене (20, 21, 31). Так, 2M, С 3 и С 4 являются эволюционнородственными тиоэфир-содержащими белками,которые подвергаются конформационным и функциональным изменениям в условиях ограниченного протеолиза (32, 33), приводя к возможности образования тиоэфир-опосредованных ковалентных связей с такими целевыми веществами как протеиназы, углеводы клеточной поверхности или иммунные комплексы,соответственно. 2-Макроглобулин человека (2 М) является достаточно распространенным белком в плазме (2-5 мг/мл). Он состоит из четырех идентичных субъединиц, расположенных так, что они образуют двустороннюю молекулярную"ловушку" (34). Эта ловушка срабатывает, когда протеолитическое расщепление внутри высокочувствительного участка последовательности аминокислот - "участка-наживки" - инициирует электрофоретически детектируемое конформационное изменение, которое и приводит к захвату протеиназы (35). Получающийся при этом узнаваемый рецептором 2 М эффективно усваивается макрофагами, дендритными клетками и другими клетками, которые экспрессируют 2 М рецепторы [обзор в (36), см. также (37)],один из которых недавно клонировали, и последовательность его была установлена (38, 39). Реакция 2 М с метиламином приводит, в сопровождении подобного конформационного изменения, к узнаваемой рецептором форме 2 М. Обработанные метиламином или протеиназой 2 М эквивалентны в отношении связывания,усвоения и сигнализации. Обработанные амином или обработанные протеиназой 2-макроглобулины обозначают как 2-макроглобулин или сокращенно 2 М. Узнаваемые рецептором -макроглобулины из животных различных видов перекрестно-реагируют с примерно одинаковым сродством к 2 М-рецептору независимо от используемой протеиназы [см. (36, 40, 41) для обзора]. Дополнительное связывание непротеолитических белков не влияет на скорость усвоения,даже если применяли искусственную поперечную сшивку (28, 29, 42). Поэтому, независимо от механизма связывания, белки, комплексующиеся с 2 М, могут быть эффективно усвоены. Возможная роль 2-макроглобулина как средства доставки антигенов, гормонов или ферментов обсуждали ранее (43-47). Существует множество других исследований, подтверждающих роль 2 М в иммуномодуляции [обзор в (48)]. Образование комплекса антиген-2 макроглобулин Как описывалось выше, а также в цитированной литературе, антигены, которые сами не являются протеиназами, неспособны ковалентно 5 связываться с 2-макроглобулинами путем совместной инкубации антигена с 2-макроглобулином. Ковалентное включение потенциального антигена в молекулу 2-макроглобулина требует участия протеолитического фермента для расщепления молекулы 2-макроглобулина, как необходимого предварительного этапа, который позволяет затем ее тиоловому эфиру реагировать с антигеном и таким образом связывать его. Хотя использование протеолитического фермента позволяет получать желаемые антиген-2-макроглобулиновые комплексы invitro, необходимость его применения существенно вредит структурной и эпитопной целостности антигена, который планируется связать с 2-макроглобулином, поскольку он может быть подвергнут протеолизу с образованием мелких фрагментов в процессе получения комплекса или после связывания с 2-макроглобулином. Более того, протеолитический фермент сам всегда включен в состав комплекса, представляя собой серьезную стерическую помеху, и тем самым, ограничивая размер антигена, включаемого в комплекс, до примерно 40 кДа. Таким образом, легкое и воспроизводимое получение комплекса 2-макроглобулина с антигеном любого размера, например, для использования комплекса в качестве вакцины, не такое простое дело. Структура антигена может быть существенно изменена протеолитическим расщеплением, к тому же протяженность и чистота антигена и других компонентов, внедряющихся в 2 макроглобулин, могут качественно и количественно влиять на образующийся комплекс. Другие средства получения антиген-2 макроглобулиновых комплексов, также не являются простыми. Обработка 2-макроглобулина низкомолекулярным амином (нуклеофилом) чтобы расщепить тиоловый эфир, дает превращение в желаемую рецептор-узнаваемую форму 2-макроглобулина, однако, модифицированный амином тиоловый эфир не способен связывать антиген по глутамильному остатку тиоэфира. Некоторые исследователи оценивали способность обработанного амином (например,метиламином) 2-макроглобулина к связыванию антигена, включая протеазы. Когда 2 М, обработанный метиламином, инкубировали с трипсином или эластазой в течение нескольких часов при 23 С (49, 50), образование ковалентной связи не наблюдалось. Таким образом, получение ковалентного антиген-2 М комплекса в отсутствии протеиназы до сих пор не осуществлено. Поэтому существует насущная необходимость в разработке простого и воспроизводимого способа получения ковалентного комплекса между 2-макроглобулином и требуемым антигеном без ограничения размера, избегая применения протеолитических ферментов, и при этом дающего вакцинный или другой материал, в 6 котором антиген стабилен и структурно определен для использования в модуляции иммунного ответа. Именно эту задачу решает настоящее изобретение. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится в общем к модуляции иммунного ответа структурно определенным и стабильным антигеном, ковалентно связанным с рецептор-узнаваемой формой 2-макроглобулина (2 М). Антиген-2 макроглобулиновый комплекс настоящего изобретения состоит из ковалентно связанных антигена и 2-макроглобулина с интактным "участком-наживкой", антиген включается в активированную амином форму 2-макроглобулина нуклеофильной заменой в отсутствие протеолитического фермента. Антиген может быть ковалентно связан с глутамильным или цистеинильным остатком расщепленного тиолового эфира 2-макроглобулиновой молекулы, или с обоими. С комплексом могут быть связаны один или более антигенов. В частности, настоящее изобретение направлено на разработку простых и воспроизводимых способов получения ковалентного комплекса между антигеном и рецептор-узнаваемой формой 2-макроглобулина, в которых условия получения комплекса не угрожают целостности антигена. Комплекс, полученный описанным здесь способом, обеспечивает стабильный и определенный материал для использования его в качестве вакцины или другого реагента для регуляции иммунокомпетентности у животных или в системе in vitro. Размер связываемого антигена не ограничивается. Более того, описываемый здесь комплекс может быть использован для повышения иммунного ответа других антигенов, обладающих низкой иммуногенностью, и в определенных условиях,для подавления иммунного ответа на конкретный антиген. В противоположность предыдущему опыту по антиген-2-макроглобулиновым комплексам и методикам получения таких комплексов, где связывание достигается сопутствующим применением протеолитического фермента для расщепления 2-макроглобулина и приведения тиолового эфира в состояние, годное для реакции с антигеном, в практике настоящего изобретения антиген связывается с предварительно нуклеофил-активированнным 2-макроглобулином в отсутствие протеолитического фермента при повышенной температуре и соответствующей продолжительности инкубации для достижения желаемого связывания. Таким образом, 2-макроглобулин в комплексе настоящего изобретения имеет интактный "участок-наживку". 2-Макроглобулин сначала может быть активирован низкомолекулярным амином, таким как аммиак, метиламин, этиламин, пропиламин и им подобные. Аммиак и метиламин являются предпочтительными. Анти 7 ген может быть инкубирован с аминактивированным 2-макроглобулином при температуре от примерно 35 до 55 С и при соответствующей продолжительности реакции для достижения желаемого связывания. Выбор соответствующей температуры может быть сделан в зависимости от стабильности конкретного антигена. Например, при 50 С связывание может быть достигнуто за 1-5 ч, при 37 С связывание может быть достигнуто за 24 ч. Предпочтительные условия для антигена, стабильного при 50 С - 1-5 ч. Предпочтительные условия для антигена, стабильного при 37 С - 24 ч. 2-Макроглобулин, используемый в настоящем изобретении, является нативным белком или полученным рекомбинантной техникой,с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии. Подходящие антигены для связывания с 2-макроглобулином для получения комплекса настоящего изобретения включают нуклеофилы, включая пептиды, белки, углеводы, цитокины, факторы роста, гормоны, ферменты, токсины, нуклеиновые кислоты,такие как антисмысловые РНК, а также другие препараты или олигонуклеотиды. С другой стороны, антиген может быть мягко окислен, например, N-хлорбензолсульфонамидом для увеличения количества антигена, связывающегося с 2-макроглобулином способом настоящего изобретения. Комплекс, сформированный способом настоящего изобретения, может быть введен в культуру клеток или в животного-хозяина, или в целевую ткань или орган, где известно, что 2 М увеличивает представительность желаемого антигена и где будет формироваться соответствующий иммунный ответ. Одно из преимуществ настоящего изобретения и его отличительная характеристика состоит в том, что комплекс, полученный путем ковалентного связывания 2 М с данным антигеном способом, описанным здесь, может быть назначен в качестве вакцины без необходимости применения адъюванта. Принимая во внимание трудности, возникающие при включении адъюванта в состав вакцины, получение вакцин в соответствии с настоящим изобретением дает значительные преимущества и обещает быть гораздо более эффективным средством представления антигена, позволяющим избежать множества недостатков, таких как токсичность и тому подобное, которые проявляются в современных адъювантсодержащих рецептурах. Кроме того, комплексы настоящего изобретения особенно практичны в силу их сродства к макрофагам и другим клеткам, которые связывают или усваивают 2 М. Разнообразие антигенов, иммуногенных или иммуномодулирующих молекул, которые могут быть ассоциированы в комплекс настоящего изобретения,весьма велико и простирается от олигонуклео 004228 8 тидов, белков, пептидов, цитокинов, токсинов,ферментов, факторов роста, антисмысловой РНК и лекарственных препаратов, до других углеводов, которые могут проявлять некоторые желательные модулирующие эффекты на целевых клетках. Необходимо только иметь в составе нуклеофильную группу, такую как амин,сульфгидрил или гидроксил для замены амина 2-макроглобулина. Поэтому, настоящее изобретение задумывалось как охватывающее эти вариации в пределах их принятого смыслового значения. Еще одно преимущество настоящего изобретения состоит в том, что оно предусматривает независимое ориентирование рецепторсвязывающих 2 М, а также комплексов настоящего изобретения, включающих эти компоненты, на эндоцитоз или клетки сигнализации и активации. Правильная активация АПК необходима для эффективного представления антигена и эффективной стимуляции общего иммунного ответа. Предполагается, что может быть достигнута как положительная, так и отрицательная регуляция антигенности эпитопов. Например, если эпитоп более узнаваемый, антитела более эффективны в узнавании и связывании антигена. Усиление антигенности и способности к увеличению эффективности слабых антител у слабых или неэффективных эпитопов предполагает широкий диапазон применения не только, например, для получения вакцин для животных и людей, но также при получении антител, которые могут быть использованы в качестве реагентов для, помимо прочего, связывания, идентификации, характеризации и преципитации эпитопов и антигенов в исследовательских целях. Предпочтительно, способ настоящего изобретения усиливает иммуногенность данного антигена. Однако настоящее изобретение предполагает и понижающую регуляцию, или суппрессию, иммунного ответа на иммунодоминантные эпитопы, путем предпочтительной стимуляции иммунного ответа на "обычные" эпитопы или путем введения агентов или факторов, избирательно подавляющих иммуногенность целевого эпитопа. Эта дополнительная возможность модуляции иммунного ответа может быть полезной, например, при иммунизации животных,включая людей, и также при получении антител,активных в отношении "молчащих" или слабых антигенных эпитопов. Такие антитела полезны также, помимо прочего, для связывания, идентификации, характеризации и преципитации эпитопов и антигенов in vivo и in vitro. Настоящее изобретение, описываемое здесь, предпочтительно также включает антитела, получаемые описанным здесь способом или в ответ на иммуногены, полученные как описано здесь, причем упомянутые антитела включают моноклональные, поликлональные и химер 9 ные антитела, а также бессмертные линии клеток, которые продуцируют такие антитела, например, гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, которые узнают молекулы и другие интересующие антигены. Такие антитела могут быть получены преимущественно против эпитопов на антигенах, которые обычно суппрессированы или являются вторичными. Настоящее изобретение охватывает также компоненты клеточной иммунной системы, например Т-лимфоциты с улучшенным ответом на такие антигены или иммуногены, фармацевтические композиции, содержащие антигены, антитела или компоненты клеточной иммунной системы, а также способы их применения. Настоящее изобретение предполагает повышение эффективности иммунизации. Это может быть полезным не только при потенциальных терапевтических вмешательствах, например при вакцинации, но также для получения антител или праймированных лимфоцитов(Т или В) к слабым антигенам в исследовательских целях. В соответствии с этим, основным объектом настоящего изобретения является структурно определенный и стабильный комплекс антигена с 2-макроглобулином для описанных здесь целей. Другим объектом настоящего изобретения является стабильный комплекс, включающий одну или более интактных биомолекул и активированный 2-макроглобулин, в котором каждая из биомолекул ковалентно связана с аминокислотным остатком расщепленного тиолового эфира 2-макроглобулина. Биомолекула может быть связана с глутамильным остатком или цистеинильным остатком или с обоими. Биомолекула может быть пептидом, белком, углеводом,цитокином, фактором роста, гормоном, ферментом, токсином, анти-смысловой РНК, терапевтическим лекарственным средством, олигонуклеотидом, жиром, ДНК, антигеном, иммуногеном или аллергеном. Биомолекула может иметь молекулярный вес от примерно 0.5 до примерно 100 кДа. Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуноген, который включает антигенную молекулу, имеющую как минимум один эпитоп, в комплексе с 2-макроглобулином. Иммуноген представляет собой комплекс, полученный путем последовательных операций активирования 2-макроглобулина инкубацией с нуклеофильным веществом для образования нуклеофил-активированного 2 макроглобулина, удаления избытка нуклеофильного вещества и инкубации нуклеофилактивированного 2-макроглобулина с биомолекулой. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения ковалентного комплекса между одной или более интактными 10 биомолекулами и 2-макроглобулином путем проведения следующих операций: 1) активация упомянутого 2-макроглобулина путем инкубации с нуклеофильным веществом для образования нуклеофил-активированного 2-макроглобулина; 2) удаление избытка нуклеофильного вещества и 3) инкубация нуклеофилактивированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой. Еще одним объектом настоящего изобретения является иммуноген, который включает антигенную молекулу в комплексе с 2-макроглобулином, где антигенная молекула имеет как минимум один эпитоп, и где 2-макроглобулин способен связываться с 2-макроглобулиновым рецептором. В другом случае применения, способ представления слабо иммуногенного эпитопа на антигене, узнаваемом иммунной системой,путем получения комплекса с помощью реакции между молекулой упомянутого антигена и 2 макроглобулином, экспонирования антигенпредставляющей клетки, несущей главный комплекс гистосовместимости, с комплексом и приведение в контакт упомянутой аннтигенпредставляющей клетки с лимфоцитами. Еще одним объектом настоящего изобретения является вакцина, которая включает антиген-2-макроглобулиновый комплекс, полученный способом настоящего изобретения. В еще одном случае применения, описан способ получения Т-лимфоцитов, узнающих антиген, включающий введение млекопитающему Т-лимфоцитов, праймированных эффективным количеством комплекса, включающего антиген и 2 макроглобулин, и полученного в соответствии с настоящим изобретением, который способен связывать 2-макроглобулиновый рецептор, и сбор упомянутых Т-лимфоцитов из млекопитающего. В еще одном случае применения описан способ лечения или предотвращения инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания или рака у млекопитающих пациентов,нуждающихся в таком лечении или предотвращении, включающий назначение пациенту эффективного количества иммуногена, включающего комплекс, состоящий из антигена и 2 макроглобулина в соответствии с настоящим изобретением, где 2-макроглобулин способен связывать 2-макроглобулиновый рецептор, в количестве, эффективном для модификации иммунного ответа на упомянутый антиген. Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения структурно определенного и стабильного комплекса конкретного антигена с 2-макроглобулином, который может быть проведен легко и воспроизводимо для различных целей, упомянутых здесь. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения соответствующих комплексов, упомянутых выше, кото 11 рый способствует улучшению иммунного узнавания и активации. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ и соответствующие комплексы, упомянутые выше, которые могут быть использованы для избирательной активации эпитопов в отличие от других, иммунодоминантных, эпитопов. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ простого получения клинически значительного количества антител к слабым антигенам. Другие объекты и преимущества станут очевидны специалистам после ознакомления со следующим ниже подробным описанием, дополненным ссылками на соответствующие фигуры чертежей. Краткое описание фигур чертежей Фиг. 1 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса между меченным по Болтону-Хантеру 125I-лизоцимом куриного яйца и 2 М, сформированным при 50 С. Комплекс получали при 50 С, инкубируя лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру с NН 3 обработанным 2 М, как описано в примере 1. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГPHOSPHORIMAGER (В). Через 5 ч инкубации аликвоту подвергали гель-фильтрации и фракции, содержащие 2M (дорожки 9 и 10), объединяли. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 50 С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, "быстро" мигрирующий 2 М; 2, "медленно" мигрирующий 2M; 3-5, 2 М, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру 125I-лизоцимом при 50 С 0,5 и 24 ч, соответственно; 6-8, 2 М сам по себе,инкубированный при 50 С 0,5 и 24 ч, соответственно; 9, выделенный комплекс 2 М-лизоцим; 10, выделенный комплекс 2 Млизоцим, обработанный панкреатической эластазой свиньи. Фиг. 2 демонстрирует результат электрофоретического анализа комплекса, полученного при 50 С, путем инкубации меченного по Болтону-Хантеру лизоцима и NН 3-обработанного 2 М. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в 4-20% SDS ПААГ (денатурирующем полиакриламидном геле) (А) и отсканировать PHOSPHORIMAGER (В). Через 5 ч инкубации аликвоту подвергали гель-фильтрации и фракции, содержащие 2 М, объединяли. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 50 С. Дорожки обозначаются сле 004228 12 дующим образом: 1, меченный по БолтонуХантеру лизоцим; 2, восстановленный выделенный комплекс 2 М-лизоцим; 3, невосстановленный выделенный комплекс 2 М-лизоцим; 4-6, 2 М, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру лизоцимом при 50 С 0, 5 и 24 ч,соответственно; 7-9, а 2 М, инкубированные при 50 С 0, 5 и 24 ч, соответственно. Фиг. 3 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса. Полученного при 37 С путем инкубации меченного по Болтону-Хантеру лизоцима иNН 3-обработанного 2 М. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГ (полиакриламидном геле) (А) и отсканировать PHOSPHORIMAGER (В). Дорожки обозначаются следующим образом: 1-3. 2 М, инкубированный с меченным по Болтону-Хантеру 125I-лизоцимом при 37 С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 4-6. 2 М сам по себе, инкубированный при 37 С 0, 5 и 24 ч, соответственно. Фиг. 4 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса, полученного при 37 С путем инкубации меченного по Болтон-Хантеру лизоцима и NH3-обработанного 2 М. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы затем проанализировать их на электрофоретическую подвижность в 4-20% SDS ПААГ (денатурирующем полиакриламидном геле) (А) и отсканировать PHOSPHORIMAGER (В). Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжительной экспозиции при 37 С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, маркер молекулярного веса; 2, нативный 2M; 3-5, восстановленный 2 М, инкубированный с меченным по Болтон-Хантеру лизоцимом 0, 5 и 24 ч, соответственно; 6-8, невосстановленный 2 М, инкубированный с меченным по Болтон-Хантеру лизоцимом 0, 5 и 24 ч, соответственно; 9, восстановленный немеченный лизоцим, 16 мкг; 10, восстановленный лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру, 4 мкг; 11, восстановленный лизоцим, меченный по БолтонуХантеру, 0.8 мкг; 12, невосстановленный лизоцим, меченный по Болтону-Хантеру, 0.8 мкг. Фиг. 5 демонстрирует результаты электрофоретического анализа меченного радиоактивным иодом 125I-лизоцима куриного яйца в комплексе с 2M в неденатурирующем ПААГ. 2 М получали как описано в примере 1 и инкубировали с буфером (дорожки 3-5), меченным радиоактивным иодом лизоцимом (дорожки 6-8) при 50 С. В указанные моменты времени отбирали и замораживали аликвоты с тем, чтобы потом подвергнуть их анализу на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 415% ПААГ. Концентрации образца были недостаточными для осаждения после продолжитель 13 ной экспозиции при 50 С. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, "быстро" мигрирующий 2 М; 2, "медленно" мигрирующий 2 М; 3-5, 2 М; инкубированный при 50 С 0, 5 и 24 ч, соответственно; 6-8, 2 М, инкубированный с меченным радиоактивным иодом лизоцимом при 50 С 0, 5 и 24 ч, соответственно. Фиг. 6 демонстрирует результаты электрофоретического анализа комплекса меченного радиоактивным иодом 125I-лизоцима и 2 М,образованного при 50 С, в неденатурирующем ПААГ. 2 М инкубировали с буфером (дорожки 2-3) или 40-кратным молярным избытком меченного радиоактивным иодом инсулина (дорожки 4-5) при 50 С. Через 5 ч аликвоту инсулинсодержащей смеси подвергали гель-фильтрации, и фракции, содержащие 2 М, объединяли (дорожка 6). В указанные моменты времени отбирали и помещали на лед аликвоты с тем,чтобы потом подвергнуть их анализу на электрофоретическую подвижность в неденатурирующем 4-15% ПААГ. Дорожки обозначаются следующим образом: 1, "медленно" мигрирующий 2 М; 2-3, 2 М, инкубированный при 50 С 0 и 5 ч, соответственно, с буфером; 4 и 5, с радиоактивно-меченным инсулином при 50 С 0 и 5 ч, соответственно; 6, выделенный 2 Минсулиновый комплекс. Фиг. 7 демонстрирует результаты электрофоретического анализа в денатурирующем геле меченного радиоактивным иодом 125I-инсулина в комплексе с 2 М. 2 М инкубировали с 40 кратным молярным избытком радиоактивномеченного инсулина при 50 С. Через 5 ч отбирали аликвоту, подвергали ее гель-фильтрации и охарактеризовывали в SDS-ПААГ (А), затем сканировали PHOSPHORIMAGER (В). Дорожки обозначали следующим образом: 1, маркеры молекулярного веса; 2-3, восстановленный 2 макроглобулин-инсулиновый комплекс; 4-6,невосстановленный 2-макроглобулин-инсулиновый комплекс; 7-9, невосстановленный меченный радиоактивным иодом инсулин; 10, восстановленный меченный радиоактивным иодом инсулин. Фиг. 8 демонстрирует включение 3 Нтимидина в периферические мононуклеарные клетки крови из индивидуальных SW через пять дней после экспонирования клеток с различными дозами комплекса стрептокиназы и 2 макроглобулина (белые квадраты), полученного в соответствии со способом настоящего изобретения, в сравнении с одной только стрептокиназой (черные ромбы). Фиг. 9 демонстрирует тот же эксперимент,что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных HG. Фиг. 10 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных KW. 14 Фиг. 11 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных SW, спустя шесть дней после экспозиции. Фиг. 12 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных HG, спустя шесть дней после экспозиции. Фиг. 13 демонстрирует тот же эксперимент, что и фиг. 8, с клетками из индивидуальных KW, спустя шесть дней после экспозиции. Подробное описание изобретения Следующие термины и сокращения, используемые в настоящем тексте, имеют следующие значения, если это не оговорено особо. Термин "биомолекула" относится к любой молекуле биологического происхождения или использования, такой как пептиды, белки, углеводы, цитокины, факторы роста, гормоны, ферменты, токсины, антисмысловые РНК, лекарственные препараты, олигонуклеотиды жиры,ДНК, антигены, иммуногены и аллергены. Термин "иммуноген" относится к любой субстанции, такой как молекула, клетка, вирус или фрагмент такой молекулы, клетки или вируса, который может быть введен в организм с целью вызвать иммунный ответ. Термин "иммуноген", таким образом, просто относится к таким субстанциям, которые вводят или могут ввести или используют иначе для того, чтобы повысить содержание антител или компонентов клеточной иммунной системы, как при "праймировании". При использовании вместе с термином "иммуноген", термин "молекула" относится к молекуле или фрагменту молекулы антигена, если это не оговорено особо. Подобным образом, когда термин используется применительно к клетке, вирусу или их фрагментам, иммуногеном может быть клетка,вирус или их компоненты, которые могут быть размещены в составе комплекса в соответствии с настоящим изобретением для усиления иммунного ответа к ним. Термин "иммуноген" поэтому включает антигенные вещества, такие как чужеродные белки, а также вещества, которые не несут существенной антигенности, если не обработаны так, как описано здесь, клетки, вирусы, и клеточные и вирусные компоненты. Термин "антиген", который может быть сокращен до "Аг", относится к веществам, то есть молекулам, которые индуцируют иммунный ответ. Он, таким образом, относится к любой молекуле, контактирующей с иммунной системой, и может включать без ограничений белки, нуклеиновые кислоты и подобные вещества, и может даже распространяться на углеводы, способные быть представленными в соответствии с настоящим описанием. Обычно каждый типичный антиген включает один или более эпитопов. Термины антиген и иммуноген иногда используют как взаимозаменяемые. Определенные антигены, описанные здесь,или эпитопы, расположенные на них, в некоторых случаях могут рассматриваться как слабые 15 антигены и могут не вызывать существенного иммунного ответа или другой иммунологической реакции при инъекции или другом способе экспонирования у нормального, вполне иммунокомпетентного хозяина. Они могут также включать слабые антигены, которые трудно получить или очистить, или антигены, которые требуют адъювантов или назначения в больших количествах для получения эффективного иммунного ответа. В соответствии с вышесказанным, "антигенность" и "иммуногенность" используют как взаимозаменяемые термины. Термин "белок" относится к синтетическим и природным полипептидам, фрагментам полипептидов и их производным, которые могут провоцировать иммунный ответ либо invitro, либо in vivo. Для удобства, но не в качестве ограничения, в последующем описании используется термин "белок" как применимый также к веществам, которые либо содержат белковые остатки, либо структурно им подобны. Олигонуклеотиды, углеводы, аминсодержащие жиры, а также другие реактивные биомолекулы могут быть упомянуты в качестве неограничивающих примеров. Настоящее толкование термина, таким образом, не ограничивается белками или их фрагментами. Термины "иммунокомпетентный", "нормальная иммунная система" и подобные термины относятся к иммунному ответу, который может быть получен у нормальных млекопитающих хозяев к интересующему антигену, когда испытуемый антиген вводится без модификаций и подготовки, описанной здесь. Иммуноген просто может быть введен хозяину в немодифицированной форме с целью оценки нормального иммунного ответа. Таким образом,используя известные способы, такой контроль легко организовать, без обращения к уникальному экспериментированию. Термин "антитело" относится к иммуноглобулинам, включая целые антитела, а также их фрагменты, такие как Fab-, F(ab')2- или dAbфрагменты, которые узнают или связывают специфические эпитопы. Термин, таким образом,включает, помимо прочего, поликлональные,моноклональные и химерные антитела, причем последние подробно описаны в Патентах США 4816397 и 4816567, включенных в настоящее описание в виде ссылок. "Препарат" антител,таким образом, содержит такие антитела или их фрагменты, которые реактивны по отношению к антигену, когда по крайней мере часть индивидуальных молекул иммуноглобулина в препарате узнает (то есть, связывает) антиген. Препарат антител поэтому называют "нереактивным" к антигену, если связывание индивидуальных молекул иммуноглобулина с антигеном не детектируется с помощью обычно используемых способов. Упомянутые антитела "узнают" эпитоп,если они связываются с этим эпитопом. Следо 004228 16 вательно, "узнавание" включает реакцию связывания антитела с эпитопом, которая включает обычные механизмы и способы связывания."Связывание" используется в традиционном смысле и не требует образования химических связей. Термин "эпитоп" используется для идентификации одной или более частей антигена или иммуногена, который узнается или является узнаваемым антителами или другими компонентами иммунной системы. "Эпитопная область", как это понимается здесь, относится к эпитопу и окружающей его области, имея в виду трехмерное пространство. Следовательно,принимается во внимание третичная и четвертичная структура антигена."Процессинг" и "представление" относятся к механизмам, с помощью которых антиген принимается, изменяется и становится доступным для иммунной системы. Представление также включает, в соответствующих случаях,образование комплексов или связывание с ГКГ(см. ниже) и другие молекулярные события, связанные с генерацией эффективного Тклеточного ответа. В определенных случаях процессинг влечет за собой поглощение и частичную протеолитическую деградацию антигена Антиген Чувствительными Клетками (АПК),а также его экспонирование на поверхности АПК в окружении ГКГ. Термины "реакция" и "комплекс", а также их производные, когда используются в своем общем значении, не следует истолковывать как требующие конкретного механизма реакции или последовательности. Сокращение ГКГ относится к главному комплексу гистосовместимости, группе веществ, которые в норме присутствуют в большей или меньшей степени на поверхности, помимо прочих, антигенпредставляющих клеток. Функция ГКГ состоит в том, чтобы сигнализировать компонентам клеточной иммунной системы, то есть Т-лимфоцитам, о том, что следует распознать антигенпредставляющую клетку и реагировать с ней и/или антигеном, связанным с упомянутой клеткой и/или с их ГКГ. Термин"сигнал" используется в общем значении и относится к инициации реакции между Тклетками и АПК, несущими процессированный антиген в окружении ГКГ. По существу, такой сигнал может включать любую реакцию между этими компонентами, что приводит к тому, что антиген начинает узнаваться антителами, препаратом антител или компонентами клеточной иммунной системы. В рамках настоящего изобретения термин"2-макроглобулин" и его сокращение 2 М используются как взаимозаменяемые. Более того,использование 2-макроглобулина в соответствии с настоящим изобретением очевидно в более широком смысле применимо к 17 макроглобулинам и к семейству макроглобулинов, и в рамках настоящего изобретения допустимо такое широкое толкование. Предпочтительно термин 2 М относится к 2 М человека. Однако этот термин также включает, но не ограничивается ими: 2 М мыши (гомотетрамер), 1-ингибитор-3 мыши (мономер),2 М крысы (гомотетрамер), 1M крысы (гомотетрамер), 1-ингибитор-3 крысы (мономер),1M кролика (гомотетрамер), белок зоны беременности человека (гомодимер), 2 М коровы(гомотетрамер), 2 М собаки (гомотетрамер),овостатин или овомакроглобулин утки (гомотетрамер), овостатин или овомакроглобулин курицы (гомотетрамер), 2 М лягушки (гомотетрамер), а также их рецептор-связывающие фрагменты. Термин "рецептор-связывающий" относится к способности связываться со специфическим рецептором или АПК. Рецептор может опосредовать эндоцитоз, сигнализацию и активацию клеток или и то и другое. В настоящее время известно два рецептора для 2M. Один рецептор опосредует сигнализацию, и, тем самым, активацию клеток и рост. Другой рецептор опосредует эндоцитоз. С-концевой фрагмент 2 М индуцирует активацию макрофагов. Когда этот фрагмент лишают реакционного участка, чувствительного к окислению цис-дихлордиаминплатиной (цис-ДДП), он очевидно связывается с сигнальным рецептором, но не с эндоцитозным рецептором. Когда С-концевой фрагмент включает реакционный участок, чувствительный к окислению цис-ДДП, он очевидно связывается с обоими рецепторами. В соответствии с настоящим изобретением описан структурно-определенный и стабильный комплекс, включающий антиген и 2-макроглобулин, который может быть использован в модуляции иммунного ответа. Настоящее изобретение предлагает простой и воспроизводимый способ получения комплекса между структурно-определенным антигеном и 2-макроглобулином, без ограничения размера антигена. Как было описано в разделе "Уровень техники", выше, предыдущие исследования образования комплекса между антигеном, таким как белок, и 2-макроглобулином, продемонстрировали необходимость протеолитической обработки молекулы нативного 2-макроглобулина для получения как рецептор-узнаваемой формы молекулы, так и для открытия доступа антигену к тиоловому эфиру 2-макроглобулина, включающему глутамильный остаток в позиции 952(Cys949). Расщепление тиолового эфира, сформированного аминогруппой и сульфгидрильной группой соответствующих аминокислотных остатков, дает потенциальный участок для ковалентного присоединения антигена. Когда нуклеофильные аминокислотные остатки в составе 18 антигена, такие как лизин, получают доступ к тиоловому эфиру в результате протеолитического расщепления, они открывают тиоловый эфир и связываются с -глутамильным остатком. Тот же или другой антиген может также связаться с цистеиновьм остатком посредством дисульфидной связи. Затем антиген-2-макроглобулиновый комплекс, через процессинг,осуществляемый иммунной системой, описанный в разделе "Уровень техники" выше, дает возрастание иммунного ответа на антиген. Предыдущие исследования на тиоловом эфире и антигене, связанном с 2-макроглобулином, привели исследователей к мысли использовать малые нуклеофильные соединения(чаще всего метиламин) для изучения активации 2-макроглобулина. В отсутствие протеиназ эти нуклеофилы расщепляли тиоловый эфир и активировали 2-макроглобулин, который имел интактный участок-наживку, в рецептор-узнаваемую форму. Однако после добавления нуклеофила к тиоловому эфиру, дальнейшее добавление или замена на другой нуклеофил, такой как лизильный остаток антигена, не рассматривалось. Авторы настоящего изобретения при изучении тиолового эфира и реактивности 2 макроглобулина по отношению к антигену, сделали неожиданное и важное открытие, что нуклеофил-активированнный 2-макроглобулин может в действительности вступать в реакцию нуклеофильной замены с белком или другим антигеном в определенных условиях. Условия,позволяющие реакцию нуклеофильной замены,как выяснилось, представляют собой инкубацию при повышенной температуре в течение соответствующего периода времени. Например,белковый антиген, который стабилен при повышенной температуре, подвергался замене в ходе инкубации при примерно 50 С в течение 15 ч с нуклеофил-активированным 2-макроглобулином, что привело к значительному включению белкового антигена в 2-макроглобулин. При более низких температурах, как, например,37 С, нуклеофильная замена может быть достигнута за более продолжительный период времени, примерно 24 ч. Способность к ковалентному присоединению антигена к 2-макроглобулину в отсутствие протеиназы позволяет значительно улучшить, по сравнению с предыдущим опытом, в отношении простоты и воспроизводимости, процесс получения структурноопределенных антиген-2-макроглобулиновых конъюгатов для модуляции иммунного ответа. Одно из основных преимуществ этого открытия состоит в том, что антиген, который не являлся подходящим для связывания с 2-макроглобулином по причине своего размера и/или чувствительности к протеолитической деградации,теперь может быть связан с нуклеофилактивированным 2-макроглобулином в отсут 19 ствие протеиназы способом настоящего изобретения. Поскольку условия, в которых происходит конъюгация антигена и 2-макроглобулина определены, может быть достигнуто высокое отношение антигена к 2-макроглобулину. Более того, когда используют протеиназу, происходит включение протеиназы в 2-макроглобулин, что уменьшает емкость 2-макроглобулина в отношении антигена и формирует комплекс с более чем одним антигеном: желаемый антиген и нежелаемая протеиназа. Более того, при использовании протеиназы, могут формироваться антитела к самой протеиназе. Эти нежелательные дополнения устраняются настоящим изобретением. Имея в виду склонность 2-макроглобулина к участию в процессинге антигенов для усиления или подавления иммунного ответа, способность получать структурно-определенные комплексы дает значительное облегчение при получении вакцин. 2-Макроглобулин, используемый в настоящем изобретении. Может быть нативным или полученным рекомбинантным путем, используя хорошо известные методики молекулярной биологии. Рекомбинантная форма целого белка может экспрессироваться в гликозилированной форме, например, путем экспрессии в дрожжевых, бакуловирусных экспрессионных системах, или в системах клеток млекопитающих, либо в негликозилированной форме, например, путем экспрессии в бактериальных экспрессионных системах. Альтернативно, 2 макроглобулин может быть получен трансгенным путем, например, путем экспрессии в молоко трансгенных животных, таких как корова,коза или овца. В предпочтительном случае экспрессию проводят в бакуловирусной экспрессионной системе, которая обеспечивает высокий выход, при этом избегая проблем загрязнения эндотоксинами, которые сопровождают экспрессию в бактериальных системах, таких как Е.coli. Трансгенная экспрессия в молоко, описанная выше, также не страдает этими проблемами. Активация 2 М до формы 2 М может быть достигнута с помощью соответствующего амина, такого как описываемый формулойRNH2, где R означает линейную или разветвленную низшую алкильную группу, содержащую от 1 до 6 углеродных атомов, такую как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил и им подобные. Аммиак и метиламин являются предпочтительными. Как описывалось выше, значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что размер антигена для связывания с 2-макроглобулином не ограничен. Прежние способы, которые использовали протеиназы для активации 2-макроглобулина, ограничивали размер связываемого антигена величиной примерно 40 килодальтон, соответствующей разме 004228 20 ру связывающего кармана 5 нм, образующегося в 2-макроглобулине после протеолитического расщепления. Способы настоящего изобретения устраняют необходимость активации 2-макроглобулина протеиназой, и поэтому размер антигена, предназначенного для связывания, не ограничен, и может колебаться в пределах от примерно 0.5 до примерно 100 кДа. Включение антигена или биомолекулы через тиоловый эфир (один или более) молекулы 2-макроглобулина может осуществляться по глутамильному, цистеинильному остатку или по обоим остаткам, формирующимся после расщепления тиолового эфира. Теоретически максимальное количество антигенов, способных связаться с тетрамерным 2-макроглобулином, составляет восемь молекул. Также было обнаружено, что степень включения антигена в 2-макроглобулин способом настоящего изобретения может быть увеличена. В прежних способах, использующих протеиназную активацию, определенное количество протеиназы могло включаться в 2-макроглобулин, ограничивая количество антигена, который мог бы стать связанным. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для дальнейшего увеличения количества антигена, который может быть включен в 2 макроглобулин, может быть использовано мягкое окисление антигена. Оно может быть достигнуто путем инкубации антигена с окислителем, таким как N-хлорбензолсульфонамид или другие реактивы, которые не влияют на структурные или иммуногенные свойства антигена. В конкретном, но не ограничивающем примере практического применения настоящего изобретения, 2-макроглобулин активируют до его рецептор-узнаваемой формы путем инкубации с 200 мм бикарбоната аммония, рН 8.5, в течение 1 ч. Эта обработка приводит к расщеплению тиолового эфира 2-макроглобулина. Затем, после удаления избытка бикарбоната аммония, 2-макроглобулин с расщепленным тиоловым эфиром инкубировали в 40-кратном молярном избытке антигена, такого как лизоцим, стрептокиназа или инсулин. Инкубация при 37 С обеспечивает оптимальное включение антигена через 24 ч, при 50 С реакция идет быстрее и оптимальное включение наблюдается через 5 ч. Комбинация температуры и времени может быть выбрана, основываясь на температурной чувствительности и стабильности белка и желаемой степени связывания антигена с 2 макроглобулином; опытный специалист определит на основе характеристик конкретного антигена оптимальные условия получения желаемого продукта. Примеры, приведенные ниже, демонстрируют конкретные, но не ограничивающие условия. Предполагалось множество применений антиген-2-макроглобулиновых комплексов 21 настоящего изобретения. Как будет показано в следующих ниже примерах, полезными преимуществами являются простота и воспроизводимость получения, отсутствие протеолитического расщепления и структурная определенность и стабильность комплекса, полученного способом настоящего изобретения. Эти примеры являются всего лишь иллюстрациями многочисленных применений комплекса настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие. Другие примеры применения антиген-2-макроглобулиновых комплексов настоящего изобретения можно найти в CT7US 93/12479 Университета Дюка, включенной здесь в виде ссылки. Как было показано ранее, полезность антиген-2-макроглобулиновых комплексов настоящего изобретения основывалась на улучшенном представлении антигена in vitro и, что более важно, на значительном усилении иммунной активности, оцениваемой по производству антител в ответ на антигенный стимул in vivo, когда антиген связан с 2-макроглобулином. Такое значительное усиление активности является одной из целей настоящего изобретения, другой целью является способность комплекса настоящего изобретения быть полученным без использования и включения протеиназы. Способность к работе без адъюванта рецептуры, полученной в соответствии с настоящим изобретением, делает систему более эффективной, а также устраняет возможность вредных реакций и задержек в поглощении, которые наблюдаются с адъювантсодержащими рецептурами. Настоящее изобретение далее охватывает получение антител к антигенам, включая, при необходимости, моноклональные и химерные антитела на основе тех, что были получены к комплексам настоящего изобретения, а также"праймированные" лимфоциты, специфичные по отношению к конкретным антигенам. Подобным образом, настоящее изобретение может быть использовано как средство стимуляции антигенности и иммунокомпетентности в случаях, когда конкретный антиген ранее не добился иммунологически или терапевтически значимого возбуждения и активности в хозяине. Применение комплексов настоящего изобретения в первую очередь ориентируется на назначение антигенов, узнаваемых макрофагами, принимая во внимание наличие на макрофагах рецепторов 2-макроглобулина. Однако другие АПК могут также иметь рецепторы 2 М и настоящее изобретение вместе с тем предназначено распространить представление антигена на эти другие АПК. Путем связывания антигена с 2-макроглобулином в соответствии с настоящим изобретением с образованием комплекса настоящего изобретения, и использования этого комплекса в качестве иммуногена, может быть получен"модифицированный иммунный ответ". Это означает, что, например, иммуноген может быть использован для генерации антител, которые специфичны либо к слабоузнаваемым, либо к вообще неузнаваемым эпитопам. Кроме того,модифицированный иммунный ответ может включать неантительные компоненты иммунной системы, то есть Т-лимфоциты, которые могут узнавать эпитоп, бывший ранее непредставляемым или неузнаваемым. Таким образом, "модифицированный иммунный ответ" в значительной степени направлен на ранее плохо или совсем неузнаваемые эпитопы на обработанном антигене или на эпитопы, требующие адъюванта, или требующие использования больших количеств антигена, как и было ранее описано. Еще один предпочтительный случай применения настоящего изобретения использует комплекс как иммуноген, и подразумевает генерирование антител и реагирование комплекса с антителами, которые узнают тот же или другой эпитоп, находящийся на той же молекуле. В этом случае так называемый модифицированный иммунный ответ включает генерирование антител, которые в ином случае не могут быть эффективно получены или обнаружены in vitro и in vivo. Это может также включать генерирование антител или стимуляцию лимфоцитов,которые бы в противном случае не проявились бы без применения вредных адъювантов, которые не рекомендуется применять на людях. Предпочтительно и преимущественно, такие антитела могут быть получены для иммунизации в отсутствии адъюванта. Например, иммуноген может быть использован для инокуляции млекопитающего для генерирования антител к новоузнаваемому эпитопу. И для получения антисыворотки или вакцинных препаратов и т.п. Подобным образом, молекулы антител могут быть расщеплены с образованием фрагментов антител, которые могут быть рекомбинированы in vitro с образованием химерных антител,которые узнают или связывают новоузнаваемые эпитопы на антигене. Таким образом, "модифицированный иммунный ответ" не ограничен традиционным иммунным ответом или просто увеличением или уменьшением его специфичности и силы. Как отмечалось выше, может быть достигнута и позитивная и негативная регуляция антигенности эпитопов. Например, как только эпитоп становится узнанным или узнаваемым, сразу могут быть произведены антитела для узнавания и связывания антигена. Повышенная антигенность и способность вызывать синтез антител к слабым, скудным или неэффективным эпитопамам, обнаруживает практический смысл не только с точки зрения получения вакцин для животных, включая людей, но также при получении антител, которые могут быть использованы в качестве реагентов для, помимо прочего,связывания, идентификации, характеризации и 23 преципитации эпитопов и антигенов, для получения антител к бедным, слабым антигенам для исследовательских целей. Иммунодоминантность конкретных эпитопов на молекуле может быть модифицирована. Некоторые антигены, содержащие более чем один эпитоп, имеют характерный иммунный ответ, основанный на доминировании одного эпитопа над другим (другими). Настоящее изобретение позволяет улучшить узнавание подчиненных (недоминантных) эпитопов (эпитопа) либо путем получения и введения комплекса настоящего изобретения для усиления и активации подчиненного эпитопа (эпитопов), либо путем получения и введения комплекса, несущего на себе агент, который будет узнаваться доминантным эпитопом, который, в свою очередь тем самым будет подавлять собственную антигенность. В еще одном случае применения настоящего изобретения можно, например, использовать возможности рецепторных белков АПК,которые узнают и связывают полипептидные молекулы в составе антигена или комплекса настоящего изобретения. Поглощение антигена антиген-представляющими клетками может осуществляться через неспецифические механизмы, и может привести к экспозиции антигена вместе с ГКГ на клеточной поверхности. Как только антиген поглощен АПК, осуществляется его частичная протеолитическая деградация в прелизосомальной эндосоме, после чего процессированные пептидные фрагменты антигена ассоциируют с молекулами ГКГ. Однако, хотя частичная протеолитическая деградация антигена может быть весьма глубокой с целью образования соответствующих связей ГКГ и Т-клеток с его пептидными фрагментами,избыточная деградация антигена, как выяснилось, является пагубной для окончательного иммунного ответа. Было показано, что ингибирование не очень глубокого протеолиза в процессинге некоторых специфических антигенов,усиливает процессинг и представление антигенов, что означает, что вмешательство неуместного протеолиза в действительности усиливает представление антигенов. Настоящее изобретение подразумевает способ получения антиген 2-макроглобулиновых комплексов, включающих структурно-определенный антиген для доставки его к АПК и дальнейшего процессинга. Протеолитическая деградация антигена в ходе получения комплекса не является желательной для получения ожидаемого иммунного ответа. Антитела, описанные здесь, обычно являются антителами, которые узнают эпитопы антигенов, которые сделаны узнаваемыми, усиленными или суппрессированными как описано выше. Путем инъецирования таких антигенов в млекопитающего, например, в соответствии с методикой гипериммунизации, может быть по 004228 24 лучен модулированный иммунный антительный или Т-лимфоцитарный клеточный ответ. Описанные здесь антитела могут быть поликлональными, моноклональными или химерными антителами, и могут быть получены для распознавания желаемого эпитопа и использованы в различных диагностических, терапевтических и исследовательских целях. Например,антитела могут быть использованы для скрининга экспрессионных библиотек для однозначной идентификации гена, который кодирует белки, несущие интересующий эпитоп. Кроме того, антитела, которые узнают представляемый антиген, могут быть использованы или измерены в интактных животных для выяснения биологической роли, которую играет какой-либо белок, для более эффективной оценки состояния иммунного ответа или иммунной памяти. Поликлональные, моноклональные и химерные антитела к антигенам могут быть получены с помощью хорошо известных способов после иммунизации комплексом в соответствии с настоящим изобретением, таких как методика гипериммунизации или гибридомная технология, используя, например, лимфоциты селезенки мыши, слитые с клетками миеломы. Бессмертные клеточные линии, продуцирующие антитела, могут быть также получены иными способами, нежели слияние, такими как прямая трансформация лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейн-Барр. Подобным образом, химерные молекулы антител могут быть получены с использованием соответствующей трансфекции и гибридомной технологии. Аналогично могут быть получены бессмертные эпитопно-специфичные линии Тлимфоцитов. Настоящее изобретение также включает иммуногены, которые получают и используют как здесь описано. Так, предпочтительный иммуноген представляет собой антиген, полученный в составе комплекса настоящего изобретения, который имеет по крайней мере один эпитоп, такой иммуноген имеет модифицированную антигенность в виду присутствия, реакции с или связи с 2-макроглобулиновой молекулой. Такой иммуноген индуцирует образование или пролиферацию Т-клеток или антител, которые узнают белок в его модифицированной форме или в его немодифицированной форме. В предпочтительном случае применения,антиген, используемый в иммуногенном комплексе настоящего изобретения, является синтетическим пептидом ВИЧ, например, как описано в (52). Такие синтетические пептиды объединяют нейтрализующие В-клетки участки из третьего вариабельного региона (V3) оболочечного пептида ВИЧ gp120, и Т-хелперный эпитоп Т-1 gp120. Некоторые из этих синтетических пептидов, обозначаемые T1-SP10, вызывали образование высокого титра нейтрализующих антител и Т-клеточный ответ у мышей, коз и 25 макак-резусов, если их вводили в неполном адъюванте Фрейнда (см. Harrt et al., supra). Например, пептид T1-SP10MN(A) (MW 4771), который имеет следующую аминокислотную последовательность:(SEQ ID NO:1), может быть скомплексован с 2 М путем инкубации пептида с нуклеофил-активированным 2-макроглобулином в соответствии со способом настоящего изобретения. Другие неограничивающие примеры антигенов, которые могут быть использованы в иммуногенных комплексах настоящего изобретения, включают другой ВИЧ-кодируемый гибридный пептид [Tl-SPlOIIIB(A): последовательность: KQIINMWQEVGKAMYACTRPNNNTRKSHBsAg, белок, представляющий один из основных поверхностных антигенов вируса гепатита В человека; пептид OS (аминокислоты 124-147SLDSCTKPTDGNC) (81), представляющий Тклеточный эпитоп (аминокислоты 23-24)HBsAg. Эти примеры только иллюстрируют типы и разнообразие антигенов, которые могут быть использованы для получения полезных иммуногенов настоящего изобретения и в любом случае не должны рассматриваться как ограничивающие в отношении выбора антигена. В другом случае применения, иммунный ответ к конкретному антигену может быть индуцирован у животных путем экспонирования invitro антиген-представляющих клеток, выделенных у животного, с комплексом антигена и 2 М,описываемом здесь. После экспозиции, антиген-представляющие клетки могут быть реинтродуцированы обратно в животное и праймированные таким образом антиген-представляющие клетки будут индуцировать иммунный ответ к этому антигену. Например, чтобы индуцировать иммунный ответ к растущей у пациента опухоли, может быть приготовлен комплекс между выделенными антигенами раковых клеток и 2 М. Дендритные клетки могут быть выделены из образца цельной крови пациента и экспонированы с комплексом опухолевый антиген-2 М in vitro. Затем дендритные клетки реинтродуцируют обратно пациенту. Получаемый иммунный ответ, направленный против опухолевого антигена, таким образом, осуществляет атаку на опухоль. Используя любые из, или все разнообразные компоненты и способы, описанные здесь,можно представить различные способы тера 004228 26 певтического лечения и диагностики. Например,для диагностики или лечения рака или инфекционного заболевания из опухоли, анормальных клеток или инфекционных организмов может быть получен очищенный белок, который может быть использован в качестве антигена и включен в комплекс с 2-макроглобулином, следуя способу настоящего изобретения. Антитела к этому белку могут быть получены, используя способы усиления представления антигенов,описанные здесь, и используемые для идентификации, характеризации, связывания, ингибирования или инактивации, по мере необходимости, ранее неизвестных или неэффективных эпитопов опухолей, анормальных клеток, бактериальных или вирусных белков. Эта информация, в свою очередь, полезна для разработки лекарственных препаратов против таких недугов, таких как агонисты, антагонисты и им подобные. Подобным образом, антитела, описанные выше, могут быть получены с целью прямой диагностики или непосредственного терапевтического использования, особенно при лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Предпочтительной формой использования антиген-2-макроглобулинового комплекса,описанного здесь, является форма вакцины, которая может быть использована для иммунизации млекопитающих пациентов, нуждающихся в таком лечении. Назначением таким пациентам эффективного количества иммуногена могут быть получены антитела к конкретному антигену, а иммуноген-специфические лимфоциты могут быть праймированы и активированы, становясь эффективными для лечения заболеваний или их предотвращения или распространения. В специфическом случае применения, настоящее изобретение подразумевает вакцину против ВИЧ. Предпочитаемые неклеточные компоненты, которые узнают антиген и которые используют для характеризации представляемых эпитопов в соответствии с настоящим изобретением, включают антитела к антигену, которые трудно или невозможно генерировать, не применяя способы, описанные здесь. Также, как отмечалось выше, наиболее предпочтительные антитела получают к антигену в комплексе, но при этом узнают немодифицированную молекулу. Общие методики и протоколы, упомянутые выше, иллюстрируются следующими неограничивающими примерами. Материалы и методы Буферы,5,5'-дитиобис(2-нитробензоат)(ДТНБ), порошковая лазурь, NH4HCO3, -аминопропионитрил, иодацетамид, панкреатическая эластаза свиньи, и бычий инсулин получены отSigma (Сент-Луис, Миссури). 2,4-динитрофе 27 ниловый эфир тиоциановой кислоты (DNPSCN) получены от TCI America (Портленд, Орегон). Бычий сывороточный альбумин, среда RPMI,сбалансированный солевой раствор Earle получены от Gibco BRL (Грэнд Айленд, Нью-Йорк). Лизоцим куриных яиц получен от BoehringerMannheim. Пептид T1-SP10MN(A) был любезно предоставлен доктором Бартоном Ф. Хайнесом из Университета Дюка. IODO-BEADS получены от Pierce (Рокфорд, Иллинойс). New EnglandNuclear (Бостон, Массачусеттс) поставил реактив 125I-Болтон-Хантера и Na125I. Реактивы для электрофореза получены от Bio-Rad Laboratories(Ричмонд, Калифорния), а замороженную, обедненную по тромбоцитам просроченную человеческую плазму получали от Американского Красного Креста (Шарлотт, Северная Каролина). Мыши C57BL/6 были получены от CharlesRiver Laboratories (Роли, Северная Каролина). Используемые спектрофотометры были либоBeckman DU 640 (Арлингтон Хайтс, Иллинойс). Меченные белки считали в счетчикеLKB-Wallac 1272 CLINIGAMMA (Пискатавей,Нью-Джерси), а гели с меченными белками анализировали в PHOSPHORIMAGER 410A отMolecular Dynamics (Саннивэйл, Калифорния). 2M человека очищали как ранее описано(53). Концентрацию интактного тиолового эфира определяли титрованием ДНТБ (53, 54), Концентрация белка основывалась на А 280 нм(55). Титрование ДТНБ подтвердило, что более чем 95% тиоловых эфиров в препарате 2 М были интактны. Если не оговорено особо, тиолэфир-расщепленное производное, обозначенное как 2 М, получали инкубацией 2 М (2-6 мг/мл) с 0.2 М NН 4 НСО 3 (рН доводили до 8.5 с помощьюNH4OH) в течение 60 мин при комнатной температуре. В результате такой обработки более 95% тиоловых эфиров были расщеплены, что определялось титрованием ДНТБ (53, 54), электрофоретической подвижностью и в тестировании с порошковой лазурью (53, 56, 57). Избыток модифицирующего реагента удаляли гельфильтрацией на колонке PD-10 SEPHADEX G25 (Pharmacia, Пискатавей, Нью-Джерси). Состав буфера, если не оговорено особо: 50 мМ Трис, 50 мМ NaCl, pH 7.5. Лизоцим растворяли в воде и разбавляли соответствующим буфером. Инсулин растворяли при кислом рН и разбавляли соответствующим буфером. Чистоту инсулина и лизоцима определяли электрофорезом в восстанавливающем и невосстанавливающем SDS-ПААГ. Концентрацию инсулина определяли по формуле:E280 нм=5220 М-1 см-1 (58), а лизоцима по формуле: А 280 нм(1%/1 см)=26.5 (59). Инсулин или лизоцим включали в 2 М путем инкубации обессоленного 2 М с избытком лиганда при 37 С или 28 при 50 С в течение 5-24 ч. В некоторых случаях комплексы отделяли от свободного лиганда гель-фильтрацией на колонке SEPHACRYL S300-HR (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Коэффициент экстинкции, используемый для комплексов, был тем же, что и для свободного 2 М, что позволяло получать оценки в пределах экспериментальной ошибки. Белки концентрировали,используя ячейку AMICON или концентраторCENTRICON от Amicon (Денверс, Массачусеттс). Лизоцим и инсулин метили реактивом 125IБолтона-Хантера, в основном, как описано Болтоном и Хантером в (60). В некоторых случаях лизоцим или инсулин метили радиоактивным иодом, используя IODO-BEADS, в соответствии со спецификацией производителя. Радиоактивность измеряли, используя LKB 1272 счетчик. Электрофорез в SDS-ПААГ проводили в градиентном 4-20% геле (10 см х 10 см х 1.5 мм),используя систему глицин/2-амино-2-метил-1,3 пропандиол/НСl, описанную Бьюри (61). Электрофорез в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ проводили для разделения белков в соответствии с их радиусом, как описано ранее (53). Когда 2 М обрабатывалиNH3, тиоловый эфир расщеплялся и связанные с этим конформационные изменения можно было наблюдать с помощью электрофореза в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ(61-63). Электрофоретическая подвижность нативного 2 М традиционно рассматривается как(2 М как "быстрая". Во всех представленных здесь исследованиях электрофоретическая подвижность 2 М и его производных рассматривалась относительно этих двух стандартов. Пороограничивающие гели, описанные здесь, являлись градиентными 4-15% гелями (10 см х 10 см х 1.5 мм). В некоторых случаях гель сушили и сканировали по радиоизотопным маркерам вPHOSPHORIMAGER. Исследования по связыванию проводили в основном как описано Имбером и Пиццо в (64). Перитонеальные макрофаги получали из мышейC57BL/6, стимулированных тиогликолатом, как описано ранее (65); их размещали в микропланшетах на 24 лунки (2 х 105 клеток/лунка) и инкубировали при 37 С в увлажняющем СO2 инкубаторе. После уравновешивания при 4 С,монослои клеток промывали ледяным сбалансированным солевым раствором Earle с 0.2% бычьего сывороточного альбумина. В каждую лунку добавляли увеличивающиеся концентрации (0.23 нМ-60 нМ) 125I-меченного 2 М или 2 М с белковыми лигандом, включенным посредством инкубации в течение 5 ч при 50 С,после чего оставляли на инкубацию при осторожном перемешивании при 4 С на 16 ч. Неспецифическое связывание определяли в парал 29 лельных экспериментах, в которых связывание радиоактивно-меченного лиганда имело место в присутствии 10-100-кратного молярного избытка немеченного лиганда. Раствор радиоактивномеченного лиганда удаляли из лунки, которую затем промывали сбалансированным солевым раствором Earle с 0.2% бычьего сывороточного альбумина. Клетки солюбилизировали 1.0 МNaOH, 0.1% SDS и считали на -счетчике. Специфическое связывание оценивали путем вычитания неспецифического связывания из величины общего связывания, а Кd определяли для каждого лиганда решением уравнения связывания для одного участка, используя программу нелинейных данных SIGMAPLOT (Jandel Scientific,Сан Рафаэль, Калифорния). Пример 1. 2-Макроглобулин получали как описано выше и инкубировали с сорокакратным молярным избытком лизоцима из куриных яиц, меченного реактивом 125I-БолтонаХантера при 50 С. Образцы анализировали неденатурирующим пороограничивающим электрофорезом в ПААГ (фиг. 1 А). Контрольные образцы, в отсутствии лизоцима, вели себя как ожидалось (18), принимая характеристики "медленно" мигрирующей конформации нативного 2M (фиг. 1 А, дорожки 6-8). Однако в присутствии лизоцима наблюдали как "медленно", так и"быстро" мигрирующие формы даже после 24 ч при 50 С (фиг. 1 А, дорожка 5). Гели высушивали и сканировали на радиоактивность на PHOSPHORIMAGER (фиг. 1 Б). Радиоактивность определяли только в образцах, инкубированных с 125I-лизоцимом, и радиоактивный материал мигрировал со скоростью, соответствующей "быстрой", рецептор-узнаваемой форме 2 М (фиг. 1 Б, дорожки 3-5). Для дальнейшего подтверждения положения радиоактивной полосы, аликвоту комплекса, выделенного через 5 ч инкубации (см. ниже), инкубировали с избытком панкреатической эластазы свиньи. Окрашивание Кумасси голубым подтвердило, что весь белок мигрирует с той же скоростью, что и радиоактивная полоса, то есть "быстрый" 2 М (фиг. 1,дорожки 9 и 10). Была предпринята попытка исследования, используя увеличивающиеся концентрации лизоцима, с целью предотвращения принятия 2M "медленно" мигрирующей конформации. Однако, из-за плохой растворимости оказалось невозможным довести реакцию до завершения, и во всех экспериментах некоторое количество 2 М принимало "медленно" мигрирующую нативную конформацию, без ассоциирования с лизоцимом. Электрофорез вSDS-ПААГ подтвердил, что не весь лизоцим,ассоциированный с 2M, был включен ковалентно (фиг. 2). В образцах, которые хранили на льду или при комнатной температуре, большая часть радиоактивности высвобождалась из 2 М при нагревании образца до 100 С в присутствии 1% SDS (фиг. 2 Б, дорожка 4). Кова 004228 30 лентное включение 125I-лизоцима в 2 М наблюдали только после продолжительной инкубации при 50 С (фиг. 2 Б, дорожки 5 и 6, радиоактивная полоса в положении субъединицы 2 М 180 кДа). Кинетическое исследование определило оптимальные условия для ковалентного включения лиганда как 5 ч при 50 С. Пример 2. Для дальнейшей характеризации комплекса, 2M инкубировали с сорокакратным избытком меченного по 125I-БолтонХантеру лизоцима при 50 С (5 ч) как описано выше. Образовавшийся комплекс отделяли от свободного лиганда гель-фильтрацией на колонке S-300-HR. Как и ожидалось, при электрофоретическом анализе в неденатурирующем,пороограничивающем ПААГ, в образце обнаруживались как "быстрая", так и "медленная" формы 2 М (фиг. 1 А, дорожка 9). Поскольку разделить две формы макроглобулина с помощью гель-фильтрации было невозможно, представленная стехиометрия основана на смеси этих двух форм. Количество включенного лизоцима определяли из общей концентрации белка(А 280 нм), включенной радиоактивности и удельной радиоактивности меченного по 125I-БолтонХантеру лизоцима (3000-5000 имп./мин/пМоль). Комплекс содержал примерно 2.3 Моль связанного лизоцима на каждый Моль 2M (см. табл. 1 ниже). Более чем 94% радиоактивности комплекса осаждалось 25% трихлоруксусной кислотой, показывая, что вся она ассоциирована с белком. Для определения стабильности комплекса, аликвоту кипятили 30 мин, затем подвергали центрифужной микрофильтрации в микроконцентраторе CENTRICON 100 (с порогом 100 кДа) для выделения свободного лизоцима или свободной метки. Фильтрат анализировали на радиоактивность и определили, что высвобождалось менее 15% радиоактивности комплекса. Уровень нековалентного связывания количественно определяли денатурацией комплекса в 1% SDS, 30 мин при 100 С, с последующей центрифужной микрофильтрацией. Примерно 60% радиоактивности, остающейся в 2 М -комплексе, означает, что 1.4 Моль лизоцима ковалентно связывается с 1 Моль 2 М при 50 С (5 ч). Анализ комплекса в SDS-ПААГ подтвердил такую стехиометрию (фиг. 2, дорожки 2 и 3). Перед электрофорезом образцы кипятили десять минут в присутствии 1% SDS,и, в некоторых случаях 50 мМ ДТТ. После высушивания гели сканировали на PHOSPHORIMAGER. Радиоактивные полосы оценивали количественно либо с помощью программного обеспечения к PHOSPHORIMAGER, либо вырезая полосы из геля и промеряя их в гаммасчетчике; оба способа дали сходные результаты. В невосстанавливающих, денатурирующих условиях, примерно 1.6 Моль 125I-лизоцима оставалось связанным с 1 Моль комплекса (фиг. 2 Б,дорожка 3). В присутствии 50 мМ ДТТ приSDS-обработке, примерно 0.6 Моль 125Iлизоцима оставалось связанным с 2M на 1 Моль комплекса (фиг. 2 Б, дорожка 2). Вся радиоактивность мигрировала в позициях, соответствующих либо электрофоретической подвижности свободного лизоцима, либо субъединице 180 кДа 2 М. Таблица 1 Число Моль меченного лиганда на 1 Моль 2 М Взаимодействие Лиганд и условия Лизоцим 37 С (24 ч) Лизоцим 50 С (5 ч) Ковалентное и 6.6 2.3 нековалентное 949 952 Пример 3. Исследовали эффективность реакции при пониженной температуре. 2 М инкубировали с сорокакратным избытком 125Iлизоцима при 23 С и 37 С с различной продолжительностью. Даже через 24 ч инкубации при 23 С, ковалентного включения лизоцима в 2 М не наблюдалось, как было показано электрофорезом в SDS-ПААГ с последующей центрифужной микрофильтрацией выделенного комплекса, обработанного SDS. Как наблюдалось при 50 С, при 37 С, зависимость электрофоретической подвижности 2M от времени инкубации изменялась в присутствии лизоцима и меньшая часть макроглобулина превращалась в "медленно" мигрирующую конформационную форму нативного 2 М (фиг. 3 А, дорожки 3 и 6). Оптимальное время для ковалентного включения, как было определено с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, составляло 24 ч. Комплекс, который выделяли через 24 ч при 37 С,содержал примерно 6.6 Моль связанного лизоцима на каждый Моль 2 М (см. табл. 1 выше). Уровень нековалентного связывания количественно определяли денатурацией комплекса в 1%SDS, 30 мин при 100 С, с последующей центрифужной микрофильтрацией. Примерно 1.3 Моль лизоцима оставалось ковалентно связанным на Моль 2 М -комплекса (см. табл. 1 выше). Анализ комплекса электрофорезом в SDSПААГ подтверждает эту стехиометрию (фиг. 4 А и 4 Б). В невосстанавливающих условиях примерно 1.3 Моль лизоцима оставалось связанным с каждым Моль 2 М. Когда в ходе обработкиSDS применяли 50 мМ ДТТ, на каждый Моль 2M оставалось связанным 1.0 Моль 125Iлизоцима. Очевидно, что при 37 С большая часть ковалентного связывания устойчива к восстановлению, чем при 50 С. Пример 4. Непротеолитическое ковалентное включение белка в 2-макроглобулин не ограничивается лизоцимом. Небольшой белок инсулин ведет себя очень похоже. 2-Макроглобулин инкубировали с сорокакратным из 004228 32 бытком меченным по 125I-Болтон-Хантеру инсулином при 37 С или 50 С 5 или 24 ч. При каждом наборе условий образовавшийся комплекс анализировали электрофорезом в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ, и обе,"быстрая" и "медленная", миграционные формы 2-макроглобулина были обнаружены, как описано выше. Количество ковалентно включаемого инсулина определяли электрофорезом в SDSПААГ в кинетических исследованиях. Оптимальные условия для включения составляли(как и для лизоцима) 5 ч при 50 С и 24 ч при 37 С. Комплекс, образованный в 5-часовой инкубации при 50 С содержал 3 Моль инсулина,ковалентно связанного с каждым Моль 2 макроглобулина. В восстанавливающих условиях только 0.3 Моль инсулина оставалось связанным на 1 Моль 2-макроглобулина. Так же как и с лизоцимом, комплекс был более устойчив к восстановлению, когда был образован при 37 С, чем при 50 С. В отсутствие восстанавливающего агента, 2.5 Моль инсулина ковалентно связывались с 1 Моль комплекса, образованного при 37 С (24 ч). В восстанавливающих условиях примерно 1.6 Моль 125I-инсулина оставалось связанным с каждым Моль 2-макроглобулина. Эти данные суммированы ниже: Таблица 2 Число молей меченного лиганда,связавшегося с 1 Моль 2M. Лиганды и условия Инсулин 37 С Инсулин 50 С Пример 5. Дальнейшая характеризация ковалентной связи между лизоцимом и "быстро" мигрирующим 2 М в комплексе. Нативный,"медленно" мигрирующий 2 М инкубировали с 125I-лизоцимом при 37 С (24 ч) или 50 С (5 ч). Образцы анализировали электрофорезом в SDSПААГ, как описано выше (гели не показаны). При 37 С ковалентное включение в нативный 2 М было менее чем 7% от включения в расщепленный по тиоловому эфиру, "быстро" мигрирующий 2 М. При 50 С ковалентное включение в нативный 2 М составляло примерно 10% от включения в 2 М. Единственное химическое различие между нативным 2 М и расщепленным по тиоловому эфиру 2M состоит в свободном Cys949 и модифицированном -NH2Gln952 в 2 М. Ограниченное включение лиганда в нативный 2 М говорит о том, что большая часть ковалентного включения лизоцима в 2M опосредована компонентами тиолового эфира,либо через нуклеофильную замену по Gln952,либо через тиол-дисульфидную замену поCys949. Глубже это было изучено путем оценки включения белкового лиганда в присутствии конкурентного нуклеофила или тиолспецифических реагентов. В некоторых экспериментах инкубацию 2 М и 125I-лизоцима проводили в присутствии 150 мМ -аминопропионитрила, реагента, который конкурирует за включение по глутамильному остатку тиолового эфира (20). Некоторые инкубации проводили в присутствии 0.65 мМ DNPSCN или 0.1 мМ иодацетамида, реагентов, которые модифицируют Cys949 в 2 М (66-71) (при более высоких концентрациях реагентов белок выпадает в осадок в ходе инкубации при высокой температуре). В параллельных экспериментах 2 М инкубировали либо с 125I-лизоцимом, либо только с модифицирующими реагентами. Образцы анализировали на включение радиоактивного белка в 2M с помощью электрофореза в SDSПААГ. Аминокислотные остатки, специфичные для конкурентного реагента После 5 ч при 50 С образцы с -аминопропионитрилом включили примерно 40% лизоцима, включенного в отсутствии -аминопропионитрила. В присутствии DNPSCN или иодацеетамида, включение приближалось 30%. После 24 ч при 37 С образцы с -аминопропионитрилом включили примерно 40% лизоцима, включенного в отсутствии -аминопропионитрила. В присутствии DNPSCN или иодацетамида включение составляло 50-60%. Таким образом, модификация либо Gln952, либоCys949 в 2 М значительно уменьшает включение белкового лиганда. Пример 6. 2 М и а 2 М-лизоцимовый комплекс, образуемый в ходе инкубации при 50 С (5 ч), метили радиоактивным иодом с помощью Na125I и исследовали связывание с макрофагами. Два образца связывали макрофаги со сходным сродством: Кd(2 М)=5+/-2 нМ и Кd(комплекс)=8+/-2 нМ. В образце комплекса присутствовали и "медленно" мигрирующая и рецептор-узнаваемая формы 2M. Мы не разделяли эти две формы макроглобулина, поэтому стехиометрия базируется на смеси этих двух форм, без учета того факта, что только рецептор-узнаваемая форма связывается с макрофагами. Это может объяснить почему Kd комплекса немного выше, чем для самого 2 М. Однако наблюдаемые величины лежат в пределах экспериментальной ошибки для такого рода исследований, и согласуются с нашей величиной Кd для связывания 2M с LRP-рецептором (72). 34 Пример 7. В одной серии экспериментов лизоцим куриных яиц был мечен радиоактивным иодом с помощью Na125I способом химического окисления N-хлорбензолсульфонамидом,иммобилизованном на полистирольных гранулах (IODOBEADS). Реакция между меченным радиоактивным иодом лизоцимом (125I-лизоцим) и 2 М представляется более эффективной, чем с лизоцимом куриного яйца, меченным по 125IБолтон-Хантеру. 2 М инкубировали с сорокакратным избытком 125I-лизоцима при 50 С. В параллельных экспериментах 2 М инкубировали при 50 С в отсутствие лизоцима, пробы отбирали через 0, 5 и 24 ч и анализировали электрофорезом в неденатурирующем, пороограничивающем ПААГ. Как описано выше,контрольные образцы, без лизоцима, почти полностью принимали "медленно" мигрирующую конформацию нативного 2 М (фиг. 5, дорожки 3-5). Однако в присутствии 125I-лизоцима весь белок и вся радиоактивность мигрировали как(через 5 ч при 50 С) гель-фильтрацией на колонке S-300-HR. Количество лизоцима, связавшегося с 2 М в комплекс 2 М-125I-лизоцим определяли по включенной радиоактивности и удельной радиоактивности лизоцима, участвующего в образовании комплекса (18500 имп/мин/пМоль). Примерно 2.7 Моль 125Iлизоцима связываются с одним Моль 2M. Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации 2 Мсодержащих фракций в 1% SDS, 30 мин при 100 С с последующей центрифужной микрофильтрацией на микроконцентраторе CENTRICON 100, для выделения всего свободного лизоцима. примерно 75% радиоактивности оставалось в составе комплекса 2 М-125I-лизоцим,демонстрируя тем самым, что 2 Моль лизоцима куриного яйца ковалентно связывает один Моль 2 М. При электрофоретическом анализе в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ,комплекс 2 М-125I-лизоцим мигрирует исключительно как "быстрый" рецептор-узнаваемый 2M, означая, тем самым, что равновесие сдвинуто в сторону образования комплекса. Комплекс был затем охарактеризован электрофорезом в SDS-ПААГ (гели не показаны). Перед электрофорезом образцы кипятили десять минут в присутствии 1% SDS и, в некоторых случаях, 50 мМ ДТТ, после чего гели сканировали на PHOSPHORIMAGER. В невосстанавливающих условиях SDS высвобождает примерно 0.3 Моль свободного 125I-лизоцима на один Моль комплекса 2 М-125I-лизоцим,тогда как 1.6 Моль 125I-лизоцима остаются связанными с одним Моль комплекса. В присутствии и 50 мМ ДТТ, и 1% SDS, 0.8 Моль свободного 125I-лизоцима высвобождается на 1 Моль 35 комплекса 2 М-125I-лизоцим, тогда как 1.2 Моль 125I-лизоцима на 1 Моль 2 М остаются в комплексе. Видно, что степень ковалентного взаимодействия, полученная с меченным радиоактивным иодом лизоцимом выше, чем с лизоцимом, меченным по 125I-Болтон-Хантеру, и более высокая фракция ковалентного связывания устойчива к восстановлению. Поскольку реагент Болтон-Хантера реагирует с лизильными остатками, то возможно, что более низкая степень ковалентного включения, наблюдаемая с лизоцимом куриного яйца, меченным по Болтон-Хантеру, объясняется наличием нескольких групп, доступных для нуклеофильной замены, в районе тиолового эфира. Однако 2 М, инкубированный с необработанным лизоцимом при 50 С, имел профиль миграции в пороограничивающем ПААГ, идентичный профилю 2 М,инкубированного с лизоцимом, меченным по 125I-Болтон-Хантеру (гели не показаны), и распределение между "медленной" и "быстрой" миграцией 2 М-комплексов было таким же. Когда эксперименты были повторены с лизоцимом, который был экспонировал для окисления на IODOBEADS, в отсутствии Na125I, нативный электрофорез в ПААГ подтвердил, что реакция с 2 М была полной, и что все 2 М-комплексы сохранили "быстро" мигрирующую конформацию даже после 24 ч при 50 С. Поэтому мы считаем, что мягкое окисление "праймирует" аминокислотные остатки лиганда, что ведет к более охотному реагированию с 2 М и к замене на -NH2 по Gln952 тиололового эфира 2 М. Этот механизм не был описан ранее и мы допускаем, что усиленная реактивность также может быть обусловлена окислением боковых цепей аминокислот у лизоцима. Пример 8. Упомянутые выше эксперименты были повторены с инсулином. Интересно,что меньший по размерам инсулин вел себя также как лизоцим куриного яйца. Когда инсулин метили радиоактивным иодом с помощьюNa125I способом химического окисления, используя IODOBEADS, лиганд был полностью включен в 2 М после инкубации 5 ч при 50 С. Электрофорез в неденатурирующем пороограничивающем ПААГ показал, что весь белок и вся радиоактивность мигрировали одной полосой в позиции, соответствующей "быстро",рецептор-узнаваемому 2 М (фиг. 6, дорожки 46). После выделения комплекса 2 М-инсулин,7.5 Моль 125I-инсулина обнаружили в связанном состоянии на один Моль 2 М. Ковалентное связывание составляло примерно 57% инсулина в комплексе 2 М-125I-инсулин (4.3 Моль инсулина на Моль 2 М), как было определено центрифужной микрофильтрацией. Комплекс анализировали электрофорезом в SDS-ПААГ фиг. 7 А и 6 Б, дорожки 2-6). В не-восстанавливающих условиях SDS высвобождает 2.8 Моль свободного 125I-инсулина на Моль комплекса 2 М 004228I-инсулин, тогда как 3.3 Моль 125I-инсулина остается в комплексе на каждый Моль 2 М(Фиг. 7 Б, дорожки 4-6). Когда в ходе SDSобработки добавляли 50 мМ ДТТ, высвобождалось 7 Моль 125I-инсулина на Моль 2 М и очень мало радиоактивности оставалось ассоциированной с макроглобулином (фиг. 6 Б, дорожки 2 и 3). В параллельных экспериментах 2M инкубировали при 50 С в присутствии необработанного нативного инсулина и образцы, взятые в 0, 5 и 24 ч, анализировали электрофорезом в неденатурирующем поро-ограничивающем ПААГ. Как было описано для лизоцима, некоторые 2 М обратились в "медленно" мигрирующую конформацию без включенного инсулина и реакция не была настолько полной, как в тех случаях, когда инсулин праймировали окислением, используя IODOBEADS. Данные, представленные в приведенных выше примерах, показывают, что лизоцим и инсулин могут ковалентно включаться в нуклеофил-обработанный 2M, когда они инкубируются совместно при 37 С (24 ч) или при 50 С(5 ч). Приблизительно 6.6 (37 С) или 2.3 (50 С) Моль лизоцима связываются с 1 Моль 2 М. Кипячение комплекса 2 М-лизоцим высвобождает 15-25% включенной радиоактивности. Кипячение в присутствии 1% SDS высвобождает значительно больше, показывая тем самым,что при 50 С (5 ч) или 37 С (24 ч) примерно 1.4 Моль лизоцима на 1 Моль 2 М включается ковалентно. Это превышает величины, полученные протеолитическим включением, когда всего 1 моль лизоцима ковалентно связывался с 1 Моль 2 М (27). В ходе протеолитической реакции протеиназа захватывается совместно с лигандом во внутреннюю полость 2 М и размер лиганда и протеиназы ограничивает число молекул, которые могут быть включены. Более того, активированная протеиназа конкурирует с лизоцимом за реакцию с тиоловым эфиром. Интересно, что когда включение осуществлялось через протеолитического посредника, связь между лизоцимом и 2 М была устойчивой к восстановлению (27), тогда как мы обнаружили,что часть лизоцима, включенного путем нуклеофильной активации, освобождается из комплекса 2 М-лизоцим восстановлением. В ходе протеолитической активации, нуклеофилы на поверхности белка могут реагировать с глутамиловой группой тиолового эфира (Gln952),но в 2 М эта группа модифицирована -NH2. Тиоловая группа тиолового эфира (Cys949), однако, доступна для тиол-дисульфидной замены(73). Показано, что температура влияет на распределение между включениями по Gln952 иCys949. Комплексы, образованные при 37 С, были более устойчивы к восстановлению, чем комплексы, образованные при 50 С, показывающие большее предпочтение к реакции сCys949 в противоположность к замене нуклеофи 37 лов на участке Gln952 при повышенной температуре. Мягкое окисление лизоцима и инсулина приводит к увеличению включения в 2M. Улучшенное включение, индуцируемое мягким окислением, не было ранее описано, и мы полагаем, что оно обусловлено окислением аминокислотных остатков в белковом лиганде до более реакционно-способного нуклеофильного состояния. Инсулин является небольшой, подобной фактору роста, молекулой, имеющей такой размер (6 кДа), который позволяет ей диффундировать в ловушку 2 М и из нее, тогда как лизоцим (14 кДа) слишком велик для такой диффузии (35). Инкубация при 50 С позволяет ковалентно включить 3 Моль инсулина на 1 Моль 2 М, что сравнимо с протеолитическим включением 3-4 Моль инсулина на Моль 2 М(21). С точки зрения структуры, способность нуклеофил-инактивированого 2 М захватывать различные непротеолитические белки и образовывать с ними SDS-стабильные комплексы,расширяет ранее известные знания о механизме связывания 2 М и 2 М (обзор в (74) и (75. Пример 9. В этом примере оценивали способность комплексов, сформированных из стрептокиназы и амин-активированного 2 макроглобулина индуцировать иммунный ответ в иммунных клетках человека. Стрептокиназу очищали из препарата KABIKINASE (PharmaciaAdria), поставленного аптекой Медицинского Центра Университета Дюка, в соответствии со способами Castellino et al. (Methods in Enzimology XLV:244-257). Исходный материал следовало переочистить с целью освободить стрептокиназу от сывороточного альбумина человека,который используют в препарате KABIKINASE в качестве носителя. 2-Макроглобулин получали очисткой из просроченной плазмы человека(Американский Красный Крест, Дурхэм, Северная Каролина) по процедуре, описанной в (64). Набор для тестирования эндотоксинов LAL, был получен от Associates of Cape Cod, а колонка для удаления эндотоксинов - от Pierce ChemicalCompany (Рокфорд, Иллинойс). Мононуклеарные клетки нормальной периферической крови (МКПК) были получены в стерильных условиях из венозной крови с добавлением 10% цитрата (кислый цитрат декстрозы, Sigma, Сент-Луис, Миссури), полученной от здоровых информированных добровольцев по их согласию. Кровь разбавляли 1:1 в 50 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке стерильным солевым раствором с фосфатным буфером (PBS, GIBCO BRL, Гайтерсбург, Мерилэнд), на подслойке из равного объема среды для разделения лимфоцитов(LSM, Organon Teknika Corp., Дурхэм, Северная Каролина), после чего пробирки центрифугировали 40 мин при 400g, 20C. Полосу мононукле 004228 38 арных клеток отбирали в другую пробирку,клетки дважды промывали PBS и ресуспендировали в концентрации 2x106/мл в полной средеMEM не-необходимых аминокислот, 2 мМ Lглутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия. 2-Макроглобулин (2.5 мл, 9.6 мкМ) добавляли к 408 мкл 1% М NН 4 НСО 3 рН 8.0 и инкубировали 60 мин при комнатной температуре. Затем 2-макроглобулин пропускали через колонку PD-10 (Pierce, Рокфорд, Иллинойс), уравновешенную PBS (10 мМ Na2HPO4, 50 мМ NaCl,pH 7.4), для замены буфера. Такой 2-макроглобулин в так называемой "быстрой" форме обозначается здесь как 2-макроглобулин и имеет А 280=2.227 в кювете 1 см. Стрептокиназа(СК), ранее очищенная из KABIKINASE, имела А 280=2.088, что соответствует концентрации 46.4 мкМ. Для получения 2-макроглобулин / СК-комплексов, 6.0 мл СК (280 нМоль) смешивали с 2.0 мл 2M (7 нМ), стерилизовали фильтрацией через 0.45 мкм фильтр с низким уровнем сорбции белка, и инкубировали 24 ч при 37 С. Затем смесь наносили на колонкуSEPHACRYL S-300-HR (1.5 х 96 см, с объемом слоя 170 мл, Pharmacia), уравновешенную PBS,для отделения комплексов от свободной СК. Колонку элюировали на скорости потока 40 мл/ч по 6 мин на фракцию. Фракции анализировали электрофорезом в SDS-ПААГ, используя 5-15% градиентные гели в восстанавливающих условиях. Фракции (21-23), представляющие апекс пика (определено по значению A280 каждой фракции), соответствующие 2 М/СКкомплексам, объединяли с конечным выходом 12 мл материала с А 280=0.219. Этот объединенный препарат 2 М/СК комплексов затем тестировали на эндотоксины и обнаружили их содержание на уровне 0.1 нг/мл при концентрации СК 1.0 мкг/мл. Стимуляцию МКПК in vitro проводили следующим образом: клетки от трех здоровых доноров (обозначенных как SW, HG и KW) получали как описано выше. Сто мкл клеток(2x106/мл в полном RPMI) вносили в каждую лунку 96-луночного полистирольного планшета для тканевых культур (Costar). На каждом планшете верхний и нижний ряды не использовали, но заполняли 200 мкл стерильного PBS. К каждой четверке лунок добавляли 100 мкл СК(0.02-20 мкг/мл среды, четырехкратные разведения) или 2 М/СК (0.002-2.0 мкг/мл среды,четырехкратные разведения). Дополнительные контроли включали 2 М сам по себе (0.075-75 мкг/мл среды, четырехкратные разведения) илиPBS (0.04-31% в среде, четырехкратные разведения). Сдублированные планшеты инкубиро 39 вали 5 и 6 дней, соответственно, при 37 С в увлажненной атмосфере с 5% СO2. Когда до окончания инкубации оставалось 6 ч, в каждую лунку добавляли по 50 мкл среды, содержащей 0.5 мк Ки 3H-тимидина (6.7 Ки/мМоль в стерильной Н 2O, New England Nuclear). Содержимое каждой лунки собирали на стекло-волоконные фильтры и промывали, используя автоматический собиратель клеток Skatron, фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы, содержащие 3 мл сцинтиллятора, и определяли включенную радиоактивность (выраженную в импульсах в минуту, имп./мин) жидкостно-сцинтилляционной спектрофотометрией. Определяли среднее от четырех повторов и строили график против концентрации СК или 2-макроглобулин/СК. Значительного включения 3H-тимидина клетками, экспонированными только с 2 М или с PBS не было, в сравнении с литературными данными о клетках, экспонированных только со средой (данные не показаны). Сходные результаты были получены в других экспериментах, использующих тех же трех доноров. Как показано на фиг. 8-10, пик пролиферативного ответа на 5-й день после введения только СК, с клетками, полученными от SW, HG и KW, наблюдался при концентрации вводимой СК 10 мкг/мл, хотя ответ клеток KW был очень низкий и пик был довольно плоским, из чего можно заключить, что данный донор является относительным анергиком по отношению к СК. Однако, для каждого из трех доноров клеток, максимальный пролиферативный ответ на 5-6-й день был в 2-3 раза выше, чем ответ, полученный на введение только СК (фиг. 8-10). Кроме того, для каждого из трех доноров максимальный ответ, наблюдаемый в варианте"только СК", мог быть получен с концентрацией 2-макроглобулин/СК комплекса, содержащем в 300 раз меньшее количество СК. Результаты шестого дня близки к результатам пятого дня(фиг. 11-13); хотя пиковое значение ответа, полученного для комплекса, все еще значительно выше наблюдаемого для только СК, это превышение не настолько выражено, как на 5-й день. Однако концентрации, требуемые для достижения пикового пролиферативного ответа, были настолько значительно низки (в 35 раз для SW,200 раз для HG) с комплексом 2-макроглобулин/СК, что даже клетки довольно анергичного донора (KW) показали ответ с отчетливой дозовой зависимостью на комплексы, хотя на "только СК" такого ответа не было. Таким образом,включение СК в 2-макроглобулин вызывает очень значительное усиление иммунного ответа у уже сенсибилизированных клеток и усиление ответов у клеток либо плохо сенсибилизированных, либо анергичных. Пример 10. Непротеолитическое ковалентное включение белка в 2-макроглобулин(2 М) никак не ограничено для полноразмер 004228 40 ного интактного белка. Гибридный синтетический пептид [T1-SP10MN(A); аминокислотная последовательность = KQIINMWQEVGKAMY(76), от N-концевого до гидрофильного Вклеточные эпитопы gp120 из района петли V3(последовательность SP10) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (77-79), был синтезирован твердо-фазным методом и очищен обратнофазовой ВЭЖХ. Этот синтетический пептид метили реактивом 125I-Болтона-Хантера (NewEngland Nuclear) в соответствии с рекомендациями производителя с получением удельной радиоактивности примерно 132000 имп./мин/мг пептида. 2 М человека получали как описано выше. К 470 мкл 2 М (1072 пМоль) добавляли 1000 мкл меченый реактивом 125I-БолтонХантера пептид Tl-SP10MN(A) (43130 пМоль; 26 х 106 имп./мин). Сто пятьдесят мкл смеси отбирали для параллельного эксперимента с целью получения образцов для анализа. Основную часть смеси инкубировали 5 ч при 50 С. В параллельном эксперименте 150 мкл смеси, отобранные ранее, а также 150 мкл 2 М в отсутствие Tl-SP10MN(A), инкубировали при 50 С,отбирая образцы для анализа через 0, 5 ч и 24 ч. После инкубации в течение 5 ч при 50 С свободный пептид отделяли от пептида, связанного с 2 М пропусканием смеси через колонку(Sigma, Сент-Луис, Миссури), уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, pH7.5. Поток элюента в колонке составлял 5.4 мл/ч, размер собираемых фракций 1.8 мл. В каждой фракции определяли поглощение при 280 нм и радиоактивность. Количество 125I-T1-SP10MN(A), связавшегося с 2M в комплекс 2M-125I-T1SP10MN(A) определяли исходя из включенной радиоактивности и удельной радиоактивности 125I-T1-SP10MN(A), используемого для образования комплекса. Фракции с колонки анализировали электрофорезом в 4-15% пороограничивающем геле и в 4-20% SDS-ПААГ в присутствии или отсутствии восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ). Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации 2 М-содержащих фракций в буфере образца для электрофореза в SDS-ПААГ в течение 5 мин при 100 С перед электрофорезом. Примерно 6.4 Моль 125I-T1-SP10MN(A) на 1 Моль 2 М связывалось в отсутствие ДТТ, тогда как в присутствии ДТТ с одним Моль 2 М связывалось примерно 1.4 Моль 125I-T1SP10MN(A). Таким образом, комплекс содержит 5 Моль пептида, связанного ковалентно с 1 Моль 2 М. В восстановительных условиях примерно 1 моль пептида остается связанным с 1 Моль 2 М. Стехиометрия включения пептида слегка выше, чем для белков, упомянутых выше - ли 41 зоцима и инсулина, возможно в силу димерной структуры пептида. Пептид имеет только один цистеинильный остаток и анализ электрофорезом в невосстанавливающем SDS-ПААГ подтверждает, что существует фракция пептида, в форме димера, связанного через дисульфидный мостик. Пример 11. Непротеолитическое ковалентное включение синтетического пептида в 2 макроглобулин (2 М) подтверждалось с помощью другого ВИЧ-кодируемого пептида. Гибридный синтетический пептид(76), от N-концевого до гидрофильного Вклеточные эпитопы gp120 из района петли V3(последовательность SP10) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (77-79), был синтезирован твердо-фазным методом и очищен обратнофазовой ВЭЖХ. Этот синтетический пептид метили реактивом 125I-Болтона-Хантера (NewEngland Nuclear) в соответствии с рекомендациями производителя с получением удельной радиоактивности примерно 2 х 107 имп./мин/мг пептида и разбавляли немеченньм пептидом перед включением в 2 М. 2 М человека получали как описано выше. К 470 мкл 2 М (69 пМоль) добавляли 1000 мкл меченый реактивом 125(2778 пМоль; примерно 3.4 х 106 имп./мин). Сто пятьдесят мкл смеси отбирали для параллельного эксперимента с целью получения образцов для анализа. Основную часть смеси инкубировали 5 ч при 50 С. После инкубации в течение 5 ч при 50 С свободный пептид отделяли от пептида, связанного с 2 М пропусканием смеси через колонку (объем слоя 22,5 мл) SEPHACRYL S300 HR (Sigma, Сент-Луис, Миссури),уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl,pH7.5. Поток элюента в колонке составлял 5.4 мл/ч, размер собираемых фракций 1.8 мл. В каждой фракции определяли поглощение при 280 нм и радиоактивность. Количество 125I-T1SP10IIIB(A), связавшегося с 2 М в комплекс 2M-125I-T1-SP10IIIB(A) определяли исходя из включенной радиоактивности и удельной радиоактивности 125I-T1-SP10IIIB(A), используемого для образования комплекса. Фракции с колонки анализировали электрофорезом в 415% пороограничивающем геле и в 4-20% SDSПААГ в присутствии или отсутствии восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ). Уровень ковалентного связывания количественно определяли путем денатурации 2Mсодержащих фракций в буфере образца для электрофореза в SDS-ПААГ в течение 5 мин при 100 С перед электрофорезом. Примерно 6.5 Моль 125I-T1-SP10IIIB(A) на 1 Моль 2 М связывалось в отсутствие ДТТ, тогда как в присут 004228 42 ствии ДТТ с одним Моль 2 М связывалось примерно 1.1 Моль 125I-T1-SP10IIIB(A). Пример 12. В дополнение к приведенным выше примерам, другие белки или синтетические пептиды, которые непротеолитически и ковалентно включаются в -макроглобулин с образованием иммуногена настоящего изобретения, следуя процедурам, подобным описанным выше, включают HBsAg, белок, представляющий один из главных поверхностных антигенов гепатита В человека, пептид OS (аминокислоты 124-147 HBsAg; последовательность =NO:4) (81), представляющий Т-клеточный эпитоп (аминокислоты 23-34) HBsAg, соединенный с NH2-концом В-клеточного эпитопа (аминокислоты 139-147) HBsAg. В примере HBsAg, рекомбинантного белка, продуцируемого в дрожжах (Advanced Biotechnologies Inc., Коламбия, Мерилэнд) анализировали, используя электрофорез в ПААГ (полиакриламидном геле) и в SDS-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Было показано, что белок агрегирует и что эта агрегация зависит от дисульфидных связей. С целью восстановления белка до его мономерного состояния (25 кДа), белок восстанавливали и алкилировали следующим образом. HBsAg сначала обессоливали, используя PD-10 (Pharmacia Biotech) или подобную колонку, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH8. Следующий этап проводили в темноте, заворачивая пробирку в алюминиевую фольгу. Белок восстанавливали добавлением 1 мМ ДТТ на 30 мин при 37 С. Восстановленный белок затем алкилировали добавлением 5 мМ иодацетамида с последующей 30-минутной инкубацией при 37 С. В завершение восстановленный/ алкилированный HBsAg обессоливал, используя PD-10 или подобную колонку, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, рН 7.4. HBsAg включался как в 2 М человека, так и в 2 М мыши,приготовленные как описано выше, в ходе инкубации восстановленного/алкилированногоHBsAg с препаратом 2 М (молярное отношение HBsAg к 2 М 40:1) в течение 5 ч при 50 С. Инкубационную смесь затем разделяли электрофорезом либо в ПААГ, либо в SDS-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и переносили на PVDF-мембраны с помощью Вестерн-блоттинга. Мембраны затем блокировали для подавления неспецифического связывания и инкубировали с поликлональными антителами кролика к HBsAg для определения наличия и размера HBsAg. Этот анализ подтвердил, что часть HBsAg была ассоциирована с 2 М. Настоящее изобретение может быть выполнено в других формах или проведено други 43 ми способами без отступления от его духа или существенных признаков. Настоящее описание,поэтому, следует рассматривать как во всех отношениях иллюстративное и не ограничивающее, пределы настоящего изобретения установлены прилагаемой формулой изобретения, и все изменения, которые происходят в пределах эквивалентных указанным в формуле значений и диапазона следует рассматривать как включенные в настоящее описание. Далее следует перечень публикаций, относящихся к использованным выше ссылкам с номерами, соответствующими указанным в описании. Каждая из следующих ссылок, а также ссылки, цитированные по ходу описания,настоящим включены в данное описание как его неотъемлемая часть. 1. Lanzavecchia, A. 1990. Receptor-mediated ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный 2 49 макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2 макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с -глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина. 2. Стабильный комплекс по п.1, где упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов,токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК,антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 3. Стабильный комплекс по п.2, где упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 4. Стабильный комплекс по п.1, где упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 5. Иммуноген, включающий стабильный комплекс по п.1, причем упомянутая по меньшей мере одна интактная биомолекула с нуклеофильной группой представляет собой антигенную молекулу, несущую как минимум один эпитоп. 6. Стабильный комплекс по п.2, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 7. Стабильный комплекс по п.6, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат gp120, gp160 или их фрагмент. 8. Стабильный комплекс по п.6, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 9. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный 2 макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2 макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с -глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина, причем упо 004228 50 мянутый стабильный комплекс получен последовательностью стадий активации 2-макроглобулина путем инкубации с нуклеофильным веществом до образования нуклеофил-активированного 2-макроглобулина, удаления избытка упомянутого нуклеофильного вещества и инкубации упомянутого нуклеофил-активированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой, вследствие чего образуется упомянутый стабильный комплекс. 10. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы,состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов,токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК,антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 11. Стабильный комплекс по п.10, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 12. Стабильный комплекс по п.11, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат gp120, gp160 или их фрагмент. 13. Стабильный комплекс по п.11, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 14. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы,состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 15. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 16. Иммуноген, включающий стабильный комплекс по п.9, причем упомянутая по меньшей мере одна интактная биомолекула с нуклеофильной группой представляет собой антигенную молекулу, несущую как минимум один эпитоп. 17. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу RNH2, где R выбран из группы, состоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6. 18. Стабильный комплекс по п.17, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы, состоящей из аммиака, метиламина,этиламина и их комбинаций. 19. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклео 51 фил-активированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55 С. 20. Стабильный комплекс по п.9, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно 50 С и в период времени в диапазоне от примерно 1 до примерно 24 ч. 21. Стабильный комплекс по п.20, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37 С для примерно 24 ч и температуры примерно 50 С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч. 22. Способ получения ковалентного комплекса между как минимум одной интактной биомолекулой с нуклеофильной группой и активированным 2-макроглобулином, несущим интактный участок наживки, причем упомянутая интактная биомолекула с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2-макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с -глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина, включающий стадииii) удаления избытка упомянутого нуклеофильного вещества иiii) инкубации упомянутого нуклеофилактивированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой в течение периода времени,достаточного для образования упомянутого комплекса. 23. Способ по п.22, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу RNH2,где R выбран из группы, состоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6. 24. Способ по п.23, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы,состоящей из аммиака, метиламина, этиламина и их комбинаций. 25. Способ по п.22, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклеофил-активированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55 С. 26. Способ по п.22, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно 50 С и в период времени в диапазоне от примерно 1 до примерно 24 ч. 27. Способ по п.26, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37 С для 52 примерно 24 ч и температуры примерно 50 С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч. 28. Способ по п.22, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов,олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 29. Способ по п.28, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧантигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 30. Способ по п.29, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержатgp120, gp160 или их фрагмент. 31. Способ по п.29, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 32. Способ по п.28, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 33. Способ по п.22, причем молекулярный вес упомянутой биомолекулы составляет от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 34. Способ по п.22, причем упомянутый способ осуществляют в отсутствии протеолитического фермента, способного к расщеплению упомянутой биомолекулы и упомянутого участка наживки. 35. Иммуноген, включающий биомолекулу с нуклеофильной группой в комплексе с 2 макроглобулином, имеющим интактный участок наживки, причем упомянутая биомолекула имеет как минимум один эпитоп, причем упомянутый 2-макроглобулин способен связываться с 2-макроглобулиновым рецептором,упомянутый комплекс включает как минимум одну интактную биомолекулу и активированный 2-макроглобулин с интактным участком наживки, где каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2-макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с-глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина. 36. Иммуноген по п.35, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов,факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов,антисмысловой РНК, лекарственных препара 53 тов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов,иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 37. Иммуноген по п.36, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита,их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 38. Иммуноген по п.37, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат gp120, gp160 или их фрагмент. 39. Иммуноген по п.37, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 40. Иммуноген по п.35, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 41. Иммуноген по п.35, причем молекулярный вес упомянутой биомолекулы составляет от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 42. Вакцина, включающая стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный 2-макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2-макроглобулином через связь,состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с -глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина, способного к связыванию рецептора 2-макроглобулина. 43. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов, токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов,олигонуклеотидов, жиров, ДНК, антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 44. Вакцина по п.43, причем упомянутый антиген выбран из группы, состоящей из ВИЧантигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 45. Вакцина по п.44, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержатgp120, gp160 или их фрагмент. 46. Вакцина по п.44, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 54 47. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы, состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 48. Вакцина по п.42, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 49. Способ увеличения степени ковалентного связывания биомолекулы с 2-макроглобулином для образования биомолекула-2 макроглобулинового комплекса, полученного по п.22, причем перед реакцией упомянутой биомолекулы с упомянутым нуклеофилактивированным 2-макроглобулином, упомянутую биомолекулу обрабатывают мягким окислителем. 50. Способ по п.49, причем упомянутым окислителем является N-хлорбензолсульфонамид. 51. Стабильный комплекс, включающий как минимум одну интактную биомолекулу с нуклеофильной группой и активированный 2 макроглобулин, несущий интактный участок наживки, причем каждая из упомянутых интактных биомолекул с нуклеофильной группой связана с упомянутым активированным 2 макроглобулином через связь, состоящую из упомянутой нуклеофильной группы, ковалентно связанной с -глутамиловой группой упомянутого расщепленного сложного тиолового эфира упомянутого 2-макроглобулина, причем упомянутый комплекс получают способом, включающим стадииi) активации упомянутого 2-макроглобулина в форму нуклеофил-активированного 2-макроглобулина путем инкубации упомянутого 2-макроглобулина с нуклеофильным веществом в отсутствие протеиназы, способной расщепить участок наживки;ii) удаления остатка упомянутого нуклеофильного вещества иiii) инкубации упомянутого нуклеофилактивированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой в течение периода времени,достаточного для образования упомянутого комплекса. 52. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы,состоящей из пептидов, белков, углеводов, цитокинов, факторов роста, гормонов, ферментов,токсинов, антисмысловой РНК, лекарственных препаратов, олигонуклеотидов, жиров, ДНК,антигенов, иммуногенов, аллергенов и их комбинаций. 53. Стабильный комплекс по п.52, причем упомянутый антиген выбран из группы, со 55 стоящей из ВИЧ-антигенов, антигенов вирусного гепатита, их пептидов, их фрагментов, их гибридных пептидов, их химерных пептидов и их гибридных синтетически пептидов. 54. Стабильный комплекс по п.53, причем упомянутые антигены или фрагменты вируса ВИЧ содержат gp120, gp160 или их фрагмент. 55. Стабильный комплекс по п.53, причем упомянутые антигены вирусного гепатита или их фрагменты содержат HbsAg или его фрагмент. 56. Стабильный комплекс по п.52, причем упомянутая биомолекула выбрана из группы,состоящей изTRILTIPQSLDSCTKPTDGNC (SEQ ID NO:4). 57. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутая биомолекула имеет молекулярный вес от примерно 0,5 до примерно 100 кДа. 58. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутое нуклеофильное вещество имеет формулу RNH2, где R выбран из группы, со 004228 56 стоящей из водорода и алкильной группы с числом углеродных атомов от 1 до 6. 59. Стабильный комплекс по п.58, причем упомянутое нуклеофильное вещество выбрано из группы, состоящей из аммиака, метиламина,этиламина и их комбинаций. 60. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутую инкубацию упомянутого нуклеофил-активированного 2-макроглобулина с упомянутой биомолекулой проводят в температурном диапазоне от примерно 35 до примерно 55 С. 61. Стабильный комплекс по п.60, причем упомянутую стадию инкубации проводят в температурном диапазоне от примерно 37 до примерно 50 С и в период времени от примерно 1 до примерно 24 ч. 62. Стабильный комплекс по п.61, причем диапазоны температуры и времени упомянутой инкубации выбраны из температуры примерно 37 С для примерно 24 ч и температуры примерно 50 С для диапазона от примерно 1 до примерно 5 ч. 63. Стабильный комплекс по п.51, причем упомянутый стабильный комплекс является иммуногеном, антиген-представляющим комплексом или вакциной.