Способ изменения гуморального иммунного ответа с помощью агентов, блокирующих рецепторы бета-лимфотоксина

1 Данное изобретение относится к способам изменения гуморального иммунного ответа на основе композиций, включающих в себя "агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина",которые блокируют сигнал рецепторов лимфотоксина. Агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина, могут быть использованы для лечения иммунологических заболеваний,более конкретно для ингибирования опосредованных антителами иммунных ответов, регулирующих экспрессию адрессинов и направленную миграцию клеток, а также для воздействия на дифференцировку фолликулярных дендритных клеток. Данное изобретение относится к растворимым формам внеклеточного домена рецептора -лимфотоксина и к антителам против рецептора -лимфотоксина или его лиганда и поверхностного лимфотоксина, действующим как агенты, блокирующие рецептор лимфотоксина. Предпосылки изобретения Существует два вида приобретенного иммунитета, которые, обеспечивая достижение совместной цели по устранению антигена, опосредованы различными частями иммунной системы, оказывающими различное действие. Один вид приобретенного иммунного ответа, гуморальный иммунитет, опосредован, главным образом, В-клетками и циркулирующими антителами. Другой вид, называемый клеточным или клеточно-опосредованным иммунитетом, опосредован Т-клетками, синтезирующими и вырабатывающими цитокины, действующие на другие клетки. Активация и дифференцировка В-клеток в ответ на большую часть антигенов требует, чтобы (1) В-клетки получали сигнал антигена через свой антиген-специфичный рецептор, мембранный Ig, и (2) чтобы В-клетки получали контактно-зависимые и независимые сигналы от активированных Т-клеток. Контактно-зависимый совместимый стимулирующий сигнал возникает в результате лигирования рецептора CD40 на Вклетках с лигандом CD40, экспрессируемым на активированных Т-клетках-хелперах. (Laman etVan Kooten and Banchereau, Adv. Immunol., 61,pp. 1-77 (1969. Контактная независимая передача сигналов опосредована цитокинами, синтезируемыми и вырабатываемыми активированными Т-клетками. Эти контактно-зависимые и независимые сигналы совместно направляют Вклетки по пути дифференцировки в (1) В-клетки памяти, готовые обеспечить более быстрый ответ после вторичного воздействия антигена, или(2) в плазматические клетки, секретирующие антитела. Плазматические клетки, которые представляют собой конечную стадию дифференцировки В-клеток, синтезируют и секретируют антитела. 2 Т-клетки-хелперы ("Th") играют несколько важных ролей в иммунной системе. Было установлено, что цитокины, вырабатываемые Тклетками-хелперами при получении иммунного стимула, обеспечивают последующую активацию иммунных реакций по тому или иному эффекторному пути. Т-клетки-хелперы активируются в результате взаимодействия их антигенспецифического рецептора с антиген представляющими клетками (АРС), несущими на своей поверхности пептидные фрагменты обработанного чужеродного антигена, связанного с молекулами МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса II. Активированные Т-клеткихелперы в свою очередь секретируют цитокины(лимфокины), активирующие соответствующие иммунные эффекторные механизмы. В соответствии с типом секретируемых цитокинов Т-клетки-хелперы могут быть разделены на три подгруппы: Th0, Th1 и Th2. (Fritchet al., Ann. Rev. Immunol., 11, pp. 29-48 (1993). У мышей нестимулированные "наивные" Тклетки-хелперы продуцируют IL-2. Краткое стимулирование Т-клеток-хелперов приводит к образованию клеток-предшественников Th0,вырабатывающих широкий круг цитокинов,включая IFN-, IL-2, IL-4, IL-5 и IL-10. Постоянно стимулируемые клетки Th0 разделяют на два типа клеток: либо Th1-клетки, либо Тh2 клетки, при этом меняется экспрессия цитокинов. Определенные цитокины, например IL-3,GM-CSF и TNF, выделяются как клетками Th1 так и Th2. Другие цитокины вырабатываются исключительно одной из подгрупп Т-клетокхелперов. (Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol.,12, pp. 227-257 (1994) . Клетки Тh1 вырабатывают LT IL-2 и IFN-, активирующие макрофаги и воспалительные реакции, связанные с клеточным иммунитетом и сопротивляемостью внутриклеточным инфекциям. Клетки Th2 вырабатывают цитокины IL-4,IL-5, IL-6 и IL-10, увеличивающие образование эозинофильных и тучных клеток и способствующие размножению и созреванию В-клеток.receptors", Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, New York (1993. Клетки Th2 также принимают участие в выработке В-клеток памяти, соматической мутации и, таким образом, в"аффинном созревании", а также в регуляции переключения изотипа иммуноглобулина deIgG1, при этом подавляя другие изотипы. IL-4 также стимулирует перепроизводство IgE в реакциях гиперчувствительности I типа. ЦитокинIL-5 клеток Th2 индуцирует изотип IgA, важный для иммунитета слизистой. Вторичные лимфоидные ткани, такие как лимфатические узлы (LN), лимфоидные ткани селезенки и слизистой, накапливают и концен 3 трируют посторонние вещества с высокой эффективностью и являются основными сайтами активации и дифференцировки Т- и Влимфоцитов, вызванными антигенами. Эти процессы зависят от разнообразия и организации клеток в этих тканях, обеспечивая конструкцию для многих аспектов гуморальных иммунных ответов, таких как взаимодействие Т/В-клеток,образование зародышевых центров, "аффинное созревание", переключение класса иммуноглобулина и направление миграции клеток. (Klein,J., Immunology, John Wiley and Sons (1982. Молекулярные механизмы, ответственные за развитие, структуру и функции периферических лимфоидных тканей, полностью не выявлены. Несмотря на то, что общая структура вторичных лимфоидных тканей существенно отличается и имеет разновидности среди видов млекопитающих, тонкая структура этих вторичных лимфоидных тканей имеет определенные особенности, такие, например, как (1) доступность антигена, (2) структурные особенности, обеспечивающие непрерывный контакт антигена с лимфоцитами, (3) зоны, богатые Т-клетками, (4) фолликулы, богатые В-клетками, (5) сайты типа маргинальных зон, (6) специализированные эндотелиальные клетки, и (7) сайты по выработке антител, как подробно описано ниже. Система вторичных лимфоидных тканей доступна антигену. Например, антиген достигает селезенки через синусоидальный ток крови,лимфатических узлов - через афферентные лимфатические сосуды, и транспортируется через специализированный эпителий в слизистую лимфоидную ткань. Вторичные лимфоидные ткани у разных видов также обладают определенными структурными особенностями, например, фолликулярные дендритные клетки и интердигитальные клетки, обеспечивающие непрерывное присутствие антигена на участках тканей, богатых лимфоцитами. Другой общей чертой является наличие областей, богатых Т-клетками, окруженных Вклетками. Области, богатые Т-клетками, включают, например, периартериолярные лимфоидные оболочки в белой пульпе селезенки, а также паракорковый участок лимфатических узлов,содержащий большое количество рециркулирующих Т-клеток и интердигитальных клеток,которые, в свою очередь, являются вспомогательными клетками для Т- и В-клеток. Кроме того, лимфоидные ткани обычно имеют первичные и вторичные фолликулы, богатые В-клетками, в белой пульпе селезенки и в коре лимфатических узлов. Вторичные фолликулы в таких лимфоидных тканях, обычно называемые "зародышевыми центрами", имеют плотную сеть фолликулярных дендритных клеток для захвата и представления антигенов. Области типа маргинальных зон также отмечаются как определенные гистологические 4 области в селезенке мышей и более диффузные сайты во вторичных лимфоидных органах человека. Эти области, в основном, состоят из макрофагов маргинальных зон, металлофильных макрофагов, В-клеток маргинальных зон и ретикулярных клеток, но также могут включать Тклетки и дендритные клетки (Kraal, Int. Rev.Cytol., 132, pp. 31-74 (1992). Выход тока артериальной крови в области маргинальных зон дает антигенам прямой доступ к этим клеткам и обеспечивает клеточные реакции с антигенами в этом сайте. (Kraal et al., Int. Rev. Cytol., 132, pp. 31-74 (1992. Присутствие макрофагов маргинальных зон также необходимо для оптимальной направленной миграции В-клеток в белой пульпе селезенки. (Kraal, 1992; Kraal et al., Immunology, 68, pp. 227-232 (1989. Обычно лимфоциты крови попадают во вторичные лимфоидные ткани, пересекая специализированный эндотелий, например эндотелиальную выстилку венул лимфатических узлов(высокие эндотелиальные венулы) и эндотелиальную выстилку синусоидов крови селезенки в структурах, подобных маргинальной зоне. Этот эндотелий экспрессирует адгезивные молекулы и адрессины, участвующие в направленной миграции клеток к вторичным лимфоидным тканям. Например, периферические адрессины лимфатических узлов (PNAd) отличаются от адрессина лимфатических узлов слизистой(MAdCAM-1), принимающего участие в направленной миграции лимфоцитов к слизистым лимфоидным тканям, включая такие ткани, как мезентериальные лимфатические узлы, пейеровы бляшки и lamina propria. Не все адрессины определены четко, например адрессин для хоминга лимфоцитов в селезенке остается невыясненным. Физиологическая роль этих адрессинов включает в себя усиление рекруитмента соответствующих наборов антиген-специфических лимфоцитов в иммунном ответе и последующее распространение иммунного ответа по всему организму. Наконец, плазматические клетки, вырабатывающие антитела, обнаруживаются в различных местах, откуда В-клетки-предшественники активируются антигеном. Например, антитело,выработанное плазматическими клетками в красной пульпе селезенки, получается, главным образом, в результате активации В-клеток в Тклеточных зонах, а плазматические клетки в мозговом веществе лимфатических узлов получаются из В-клеток, активируемых в Тклеточных зонах этого же узла. Подобным образом, антитела, вырабатываемые плазматическими клетками в костном мозгу, производятся Вклетками, активированными в селезенке и лимфатическом узле, а плазматические клетки вlamina propria кишечника главным образом получаются из В-клеток, активированных в лимфоидной ткани мезентериальных лимфатических узлов или кишечника.Rosen, M.J. Walport, Blackwell Scientific Publications, pp. 13-30 (1993). В целом, клеточные/гистологические явления, лежащие в основе гуморальной иммунной реакции на Т-зависимые антигены, являются следующими (Toellner et al., J. Exp. Med., 183,pp. 2303-2312 (1996. В индуктивной фазе "наивные" В- и Тклетки активируются и начинают принимать участие в иммунном ответе непосредственно после попадания антигена в организм. Например, в селезенке в течение 12 ч после иммунизации для выработки вторичного ответа Вклетки памяти встречают выработанный кровью антиген в маргинальной зоне и покидают маргинальную зону, поступая в Т-клеточные зоны. В-клетки могут быть обнаружены в Тклеточных зонах в течение 24 ч. Транскрипты переключения иммуноглобулина могут быть обнаружены в течение 12 ч после вторичного появления антигена, указывая, таким образом,на то, что взаимодействие Т-В клетки уже состоялось. Затем В-клетки мигрируют к зоне выхода и красной пульпе, где они пролиферируют,образуя очаги В-лимфобластов и дифференцируют в клетки плазмы. В-клетки также продолжают пролиферировать в Т-клеточной зоне, богатой интердигитальными клетками. В течение 4 дней после иммунизации и после пролиферации в зародышевых центрах начинается выработка В-клеток памяти. При первичном ответе хорошо развитые зародышевые центры проявляются на 10-й день и достигают максимального размера на 14-й день после иммунизации. Пролиферация Т-клеток в Т-клеточных зонах становится очевидной через 48-72 ч, достигая своего пика на 7-й день после иммунизации. Такая пролиферация Т-клеток приводит к зависимой от Т-клеток активации В-клеток. Уровень пролиферации в Т-клеточной зоне снижается по мере образования зародышевых центров. Пролиферация Т-клеток также происходит в зародышевых центрах, где центроциты (В-клетки) в темной зоне забирают антиген у интердигитальных клеток и представляют его Т-клеткам в светлой зоне. Антиген, зависимый от Т-клеток, может активировать В-клетки маргинальной зоны,вновь образованные "наивные" В-клетки и рециркулирующие лимфоциты, привлеченные и удерживаемые во вторичных лимфоидных органах адрессинами и молекулами адгезии. "Наивные" В-клетки проявляют такую же кинетику продвижения к Т-клеточной зоне и т.д., как и активированные В-клетки. 6 Фаза становления ответов, зависимых от Т-клеток Фаза становления зависимых от Т-клеток ответов поддерживается непрерывной активацией В-клеток памяти в фолликулах вторичных лимфоидных органов. На этой стадии происходит очень небольшой рекруитмент "наивных" Вклеток, а ответ, в основном, обусловлен антигеном, удерживаемым на фолликулярной дендритной клетке. Для оптимальной генерации памяти, переключения изотипов, соматической мутации и, таким образом, "аффинного созревания" иммуноглобулина необходимы зародышевые центры. Сумма таких ответов лимфоцитов приводит к образованию антител, способных циркулировать в организме по различным путям, например антитела покидают селезенку через кровь, а поступают в лимфатические узлы через эфферентные лимфатические протоки. Таким образом, антитела контактируют и непосредственно связываются с инвазивным патогеном. Такое явление распознавания включает каскад иммунных эффекторных механизмов, включая активацию комплементного каскада и клеточные реакции для обеспечения защиты хозяина от патогена. Антитела также играют роль в некоторых патологических реакциях, таких как реакции гиперчувствительности - несвойственные или непропорциональные иммунные реакции, возникающие при контакте с ранее встречаемым антигеном. Различают 4 типа гиперчувствительности. Тип I гиперчувствительности "немедленного типа" включает в себя активацию аллерген-индуцированных клеток Th2 и высвобождение цитокинов Th2. Цитокин IL-4 Тh2-клеток стимулирует В-клетки к переключению изотипа для продукции IgE, который, в свою очередь,активирует тучные клетки, в результате чего происходят острые воспалительные реакции,ведущие к экземе, астме и риниту. Типы II и III гиперчувствительности вызываются антителами IgG и IgM против антигенов клеточной поверхности или специфичных тканевых антигенов (тип II), либо растворимых сывороточных антигенов с образованием циркулирующих иммунных комплексов (тип III). Тип IV, гиперчувствительность "замедленного типа", представляет собой ответ, опосредованный Th1-клетками, и может передаваться от одной мыши другой путем переноса клеток Тh1,причем переноса сыворотки недостаточно. Эта особенность отличает IV тип гиперчувствительности замедленного типа от остальных трех типов гиперчувствительности, требующих гуморальных иммунных ответов, вызываемых первично антителами, которые могут быть перенесены в состав сыворотки, свободной от клеток. (Roitt et al., Immunology, pp. 19.1-22.12 7 Патологические гуморальные иммунные реакции связаны с некоторыми органоспецифическими и системными аутоиммунными состояниями, такими как системная красная волчанка,гранулематоз Вегенера, нодозный полиартрит(PAN), быстро прогрессирующий серповидный гломерулонефрит и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, а также хронические воспалительные заболевания, такие как болезньGraves' и Chagas'. Гуморальные иммунные ответы также могут возникнуть при пересадке ткани и отторжении трансплантированных органов. В настоящее время лечение таких иммунологических состояний, в целом, включает иммуномодулирующие и иммунодепрессивные средства. В настоящее время используются три основных иммунодепрессивных средства: стероиды, циклофосфамид и азатиоприн. Стероиды представляют собой плейотропные противовоспалительные средства, подавляющие активированные макрофаги и ингибирующие активность антиген-представляющих клеток, снимая многие виды патологического действия Т-клеток. Циклофосфамид, алкилирующий агент, вызывает гибель клеток, ингибируя репликацию и репарацию ДНК. Азатиоприн является антипролиферативным агентом, ингибирующим синтез ДНК. Применение этих неспецифичных иммунодепрессивных средств требует больших доз, увеличивающих их токсичность (например, нефро- и гепатотоксичность) и вызывающих побочные действия. Таким образом, они не подходят для длительного лечения. Таким образом, существует насущная потребность в дополнительных агентах и видах лечения, разрешающих проблемы, вызываемые современной терапией. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение решает вышеуказанные проблемы, предусматривая фармацевтические композиции и способы лечения иммунологических заболеваний путем ингибирования передачи сигналов рецептора -лимфотоксина(LTR) с применением блокирующих рецептор -лимфотоксина агентов. Более конкретно,композиции и способы, включающие в себя агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина, могут быть использованы для ингибирования опосредованных антителом иммунных ответов, для регуляции уровня экспрессии адрессина и направленной миграции клеток, для воздействия на дифференцировку фолликулярных дендритных клеток и для изменения структурной организации вторичных лимфоидных тканей и подобных лимфоидных структур при патологических состояниях, таких, например,как системная красная волчанка и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура. Кроме того, в некоторых вариантах заявленное изобретение может быть использовано для изменения 8 связи между иммунными комплексами и Вклетками. Более конкретно, способы согласно изобретению могут предотвращать презентацию или отложение антигенов на клетках, либо, наоборот, по существу, растворять или устранять антигены, уже присутствующие на клетках. В альтернативных вариантах осуществления данного изобретения агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, выбирают из группы,включающей в себя растворимый рецептор лимфотоксина, антитело против рецептора лимфотоксина и антитело против поверхностного лиганда лимфотоксина. Один из вариантов осуществления данного изобретения предусматривает растворимые формы внеклеточного домена рецептора лимфотоксина, действующие как агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина. Предпочтительные композиции и способы в соответствии с этим вариантом включают в себя рекомбинантный белок слияния рецептора лимфотоксина, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен рецептора -лимфотоксина, слитого с доменом константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Более предпочтительно связующий домен лиганда рецептора -лимфотоксина слит с Fc-доменом IgG человека. В другом варианте осуществления данного изобретения предусмотрены антитела, действующие как агенты, блокирующие рецепторы лимфотоксина. Предпочтительные композиции и способы в данном варианте включают в себя одно или несколько антител против рецептора-лимфотоксина. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело. Другие предпочтительные композиции и способы данного варианта включают в себя одно или несколько антител против поверхностного лимфотоксина. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело против -лимфотоксина. Предпочтительные антитела включают в себя mAb BDA8 против LTR человека и mAb B9 против LTR человека. В соответствии с очередным вариантом осуществления данного изобретения, заявленное изобретение относится к способам изменения гуморального иммунного ответа у животных путем введения фармацевтической композиции, имеющей терапевтически активное количество агента, блокирующего рецепторы лимфотоксина. В соответствии с некоторыми другими вариантами, фармацевтическую композицию вводят в количестве, достаточном для покрытия LTR-позитивных клеток на период приблизительно от 1 до 14 дней. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель или адъювант. 9 В других вариантах осуществления данного изобретения заявленные способы ингибируют сигнал рецептора -лимфотоксина, не ингибируя TNF-R (рецептор фактора некроза опухоли), с использованием вышеописанных агентов,блокирующих рецепторы -лимфотоксина. Заявленное изобретение также предусматривает способы лечения, профилактики или элиминации вируса иммунодефицита человека у млекопитающих, включающие в себя введение агентов, блокирующих рецепторы -лимфотоксина,либо отдельно, либо в сочетании с фармацевтическими носителями, адъювантами или другими лекарственными средствами, которые, как известно специалистам в данной области, используются для лечения или уменьшения интенсивности симптомов ВИЧ или СПИД. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения в области трансплантологии, т.е. отторжения трансплантата. Конкретно, некоторые варианты осуществления данного изобретения относятся к совместному введению агента, блокирующего путь CD40, и агента, блокирующего путь лимфотоксина. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - последовательность внеклеточного участка рецептора LT человека, кодирующего лиганд-связывающий домен; фиг. 2 - иммуногистохимический анализ селезенки мышей, получавших многократные инъекции слитых белков LT-R-Ig или LFA-3-Ig и ангигена; фиг. 3 - иммуногистохимический анализ,показывающий отсутствие зародышевых центров в селезенках мышей, получавших LT-R-Ig и MR-1 (антитело лиганда анти-СD40), а также присутствие фолликулярных дендритных клеток в селезенках мышей, получавших MR-1, но неLT-R-Ig. Слитые белки и антиген эритроцитов барана вводят, как указано в описании к фиг. 2; фиг. 4 - иммуногистохимический анализ,показывающий изменение экспрессии адрессина в лимфатических узлах мышей, получавшихLT-R-Ig внутриутробно и непрерывно после рождения; фиг. 5 - иммуногистохимический анализ расположения лимфоцитов и экспрессии маркеров макрофагов в мезентериальных лимфатических узлах мышей, получавших (как и в случае,показанном на фиг. 4) LT-R-Ig внутриутробно и непрерывно после рождения; фиг. 6 - иммуногистохимический анализ,показывающий, что введение LT-R-Ig мышам ингибирует реакцию антителообразования наSRBC (эритроциты барана); фиг. 7 - изображение накопления иммунных комплексов на фолликулярных дендритных клетках. 10 Подробное описание изобретения Следующее подробное описание приводится с целью обеспечения более полного понимания настоящего изобретения. Термины "иммуноглобулиновый ответ",или "гуморальный ответ", в данном описании означают иммунологический ответ животного на посторонний антиген, при котором животное вырабатывает антитела на посторонний антиген. Класс Th2-T-клеток-хелперов является важным для эффективной выработки антител с высокой аффинностью. Термин "зародышевый центр" в данном описании означает вторичный В-клеточный фолликул, образующийся после иммунизации антигеном. Возникновение этого гистологического сайта коррелирует с оптимальной выработкой памяти, переключением изотипа, соматической гипермутацией и, таким образом, "аффинным созреванием" антительного ответа. Термины "маргинальная зона" или "область типа маргинальной зоны" означают гистологически описанные компартменты вторичных лимфоидных тканей, включающие в себя, главным образом, " макрофаги маргинальной зоны,металлофильные макрофаги, В-клетки и ретикулярные клетки маргинальной зоны, а также Тклетки и дендритные клетки. Артериальный ток крови открывается в маргинальные синусы,обеспечивая таким образом антигенам прямой доступ к этим клеткам и способствуя клеточным реакциям на антигены в этом сайте. Термин "адрессин" в данном описании означает молекулу, принимающую участие в хоминге лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Такие молекулы экспрессируются на эндотелиальных клетках, а конкретно, на высоких эндотелиальных венулах в лимфатических узлах. Селезеночный адрессин не определен.NAdCAM-1 представляет собой адрессин слизистой, a PNAd представляет собой периферический адрессин. Термин "Т-клетки-хелперы (Th)" в данном описании означает функциональный подкласс Т-клеток, помогающих вырабатывать цитотоксичные Т-клетки, которые сотрудничают с Вклетками, стимулируя выработку антител. Тклетки-хелперы распознают антиген в сочетании с молекулами главного комплекса гистосовместимости, класса II и обеспечивают контактно-зависимые и контактно-независимые(цитокиновые) сигналы эффекторным клеткам. Термин "цитокин" в данном описании означает молекулу, передающую сигналы между клетками. "Лимфокин" - это цитокин, высвобождаемый лимфоцитами. Термин "Th2" означает подкласс Т-клетокхелперов, вырабатывающих LT, интерферони IL-2 (и другие цитокины) и вызывающих воспалительные реакции, связанные с клеточным,т.е. неиммуноглобулиновым, ответом на иммунный стимул. 11 Термин "Fc-домен" антитела означает часть молекулы, включая петлю, домены СН 2 и СН 3, но не включая антиген-связывающие сайты. Этот термин также означает эквивалентные области изотипа IgM или другого антитела. Термин "антитело против рецептора LT" означает любое антитело, специфически связывающееся, по меньшей мере, с одним эпитопом рецептора LT. Термин "антитело против LT" означает антитело, специфически связывающееся, по меньшей мере, с одним эпитопом комплекса-лимфотоксина" означает агент, способный уменьшать связывание лиганда с рецептором лимфотоксина, образование кластеров рецепторов -лимфотоксина на поверхности клеток или сигналирование рецепторов -лимфотоксина,или такой, который способен воздействовать на интерпретацию сигнала рецептора -лимфотоксина внутри клетки. Агент, блокирующий рецепторы лимфотоксина, действующий на стадии связывания лиганд-рецептор, способен ингибировать лиганд лимфотоксина, связывающийся с рецептором -лимфотоксина, по меньшей мере, на 20%. Примеры агентов, блокирующих рецепторы -лимфотоксина, включают в себя растворимые молекулы LT-R-Fc, анти-LT, анти-LT,анти-LT/ и анти-LT-R Abs. Предпочтительно антитела не вступают в перекрестную реакцию с секретируемой формой LT. Термин "биологическая активность рецептора -лимфотоксина" означает 1) способность молекулы рецептора -лимфотоксина или ее производного конкурировать за растворимый или поверхностный лиганд лимфотоксина, связывающийся с растворимыми или поверхностными молекулами рецепторов -лимфотоксина; 2) нативную активность -лимфотоксина, например способность стимулировать иммунный регуляторный ответ или цитотоксическую активность. Термин "лиганд лимфотоксина" означает гетеромерный комплекс /-лимфотоксина или его производного, способный специфически связываться с рецептором -лимфотоксина. Термин "лиганд-связывающий домен рецептора -лимфотоксина" означает часть или части рецептора -лимфотоксина, принимающие участие в специфическом распознавании и взаимодействии с лигандом лимфотоксина. Термины "поверхностный лимфотоксин" и 12 чают комплекс, включающий в себя лимфотоксин и мембранно-связанные субъединицы -лимфотоксина, включая мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц, распределенные на поверхности клетки. "Поверхностный лиганд лимфотоксина" означает поверхностный комплекс лимфотоксина или его производного, способный специфически связываться с рецептором -лимфотоксина. Термин "объект" относится к животному,либо к одной или нескольким клеткам, полученным у животного. Предпочтительно, чтобы животное являлось млекопитающим. Клетки могут иметь любую форму, включая, но не ограничиваясь ими, клетки, задержанные в ткани,клеточные кластеры,иммортализованные,трансфецированные или трансформированные клетки, а также клетки, полученные у животного, измененного физически или фенотипически. Лимфотоксин : член семейства факторов некроза опухоли Цитокины, связанные с фактором некроза опухоли, возникли как большое семейство плейотропных медиаторов защиты и иммунной регуляции хозяина. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанных формах, оказывающих местное действие через контакт клетки с клеткой, или в виде секретированных белков,способных воздействовать на отдаленные мишени. Параллельное семейство рецепторов, связанных с фактором некроза опухоли, вступает в реакцию с этими цитокинами и включает различные механизмы, в том числе гибель клеток,пролиферацию клеток, дифференциацию тканей и провоспалительные реакции. Фактор некроза опухоли (TNF), лимфотоксин(LT, также называемый TNF) и лимфотоксин(LT) являются членами TNFсемейства лигандов, также включающем лиганды к рецепторам Fas, CD27, CD30, CD40, ОХ-40 и 4-1 ВВ. (Smith et al., Cell, 76, pp. 959-962(1994. Передача сигнала несколькими членами семейства факторов некроза опухоли, включаяTNF, LT, LT и Fas, может индуцировать гибель опухолевых клеток путем некроза или апоптоза (запрограммированная гибель клеток). В неопухолевых клетках фактор некроза опухоли и многие виды взаимодействия лиганда из семейства фактора некроза опухоли с рецептором влияют на развитие и ответ иммунной системы на различные иммунные стимулы. Большая часть комплексов LT/, связанных с мембраной ("поверхностный лимфотоксин"), имеет стехометрию LT1/2. (Browning etImmunol., 154, pp. 33-46 (1995. Поверхностные лиганды лимфотоксина не связывают рецептор фактора некроза опухоли с высокой аффинностью и не активируют передачу сигналов рецептора фактора некроза опухоли. Однако рецептор-лимфотоксина связывает эти поверхностные комплексы лимфотоксина с высокой аффинностью (Crowe et al., Science, 264, pp. 707-710(1994. Передача сигнала рецептора -лимфотоксина, подобно передаче сигнала рецептора фактора некроза опухоли, оказывает антипролиферативное действие и может быть цитотоксичным для опухолевых клеток. В одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный 08/378968, США, описаны композиции и способы для селективного стимулирования рецептора -лимфотоксина с применением агентов, активирующих рецепторы -лимфотоксина. Агенты, активирующие рецепторы -лимфотоксина, могут быть использованы для ингибирования роста клеток опухоли, не активируя при этом индуцированные рецептором фактора некроза опухоли провоспалительные или иммунорегулирующие пути. Недавние исследования по таргетированию гена дают основание предполагать, что /лимфотоксин играет роль в развитии вторичных лимфоидных органов. (Banks et al., J. Immunol.,155, pp. 1685-1693 (1995); De Togni et al., Science, 264, pp. 703-706 (1994. Действительно,мыши с дефицитом лимфотоксинане имеют лимфатических узлов и пейеровых бляшек. Более того, их селезенки имеют нарушенное строение, а экспрессия функциональных маркеров на клетках маргинальной зоны селезенки изменена. (Banks et al., 1995; De Togni et al., Science, 264, pp. 703-706 (1994); Matsumoto et al.,Science, 271, pp. 1289-1291 (1996. Ни одна из этих характеристик не была описана относительно рецепторов фактора некроза опухоли мышей. (Erickson et al., Nature, 372, pp. 560-563Rothe et al., Nature, 364, pp. 798-802 (1993. Заявители недавно определили роль мембранных комплексов /-лимфотоксинов в развитии вторичных лимфоидных органов, показав, что потомство мышей, которым во время беременности инъецировалась растворимая форма мышиного рецептора -лимфотоксина, слитого с порцией человеческого IgG1 Fc (LT-R-Ig), не имело большей части лимфатических узлов и обладало нарушенным строением селезенки. (Rennert et al., 1996, "Surface Lymphotoxin alpha/betacomplex is required for the development of peripheral lymphoid organs", J. Exp. Med., 184: 19992006). В результате другого исследования было установлено, что мыши, трансгенные по подобной конструкции LT-R-Ig, которая начинает экспрессироваться через 3 дня после рождения,имеют лимфатические узлы. Однако строение их печени было нарушено и несколько маркеров клеток маргинальной зоны селезенки не было экспрессировано (Ettinger et al., "Disrupted splenic architecture, but normal lymph node development in mice expressing a soluble LT-R/IgGl fu 002983sion protein", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 13102-13107). В сумме эти данные показывают,что существуют временные условия функционирования лимфотоксинов мембраны для опосредованного воздействия на развитие вторичных лимфоидных органов, но не на строение селезенки. Система факторов некроза опухоли может оказывать влияние также и на развитие селезенки. Клетки маргинальной зоны селезенки мышей с дефицитом фактора некроза опухоли не экспрессируют маркеры макрофагов или MAdCAM-1 (Alexopoulou et al., 60th Int.TNF Congress, Eur. Cytokine Network, pp. 228 (1996); Pasparakis et al., 60th Int.TNF Congress, Eur. Cytokine Network, pp. 239 (1996. Мыши с дефицитом TNF-R55 также не имеют окрашиванияMAdCAM-1 (но не МОМА-1) в маргинальной зоне селезенки. (Neumann et al., J. Exp. Med.,184, pp. 259-264 (1996); Matsumoto et al., Science,271, pp. 1289-1291 (1996. Как видно на селезенке мышей с дефицитом TNF-R75, экспрессия этих маркеров оказывается нормальной. (Matsumoto et al., Science, 271, pp. 1289-1291 (1996. Лимфоидоподобные ткани не только выступают как часть процессов развития, но и появляются при некоторых патологических состояниях, таких как хроническое воспаление, процесс, недавно получивший название "неолимфоорганогенез" (Picker and Butcher, Annu.al., J. Exp. Med., 1183, pp. 1461-1471 (1996. На такие процессы очевидно воздействуют члены семейства факторов некроза опухоли. У мышей,трансгенных по гену -лимфотоксина, находящегося под контролем инсулинового промотора крыс (RIP-LT), развиваются хронические воспалительные поражения, индуцированные лимфотоксином, с характеристиками организованных лимфоидных тканей (Kratz et al., J. Exp. Med.,1183, pp. 1461-1471 (1996); Picarelles et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 89, pp. 10036-10040 (1992. Оценка функции лимфотоксина во время иммунного ответа, зависимого от Т-клеток у мышей с дефицитом -лимфотоксинов, указывает на необходимость присутствия лимфотоксинов для образования зародышевых центров,возможно для поддержания организованной структуры фолликулярных дендритных клетокMatsumoto et al., Nature, 382, pp. 462-466 (1996. У мышей с дефицитом TNF-R55 также отсутствуют фолликулярные дендритные клетки, у них не развиваются зародышевые центры, а также оптимальный ответ антитела на эритроциты барана. Это предполагает, что для большей части таких ответов TNF-R55 может быть стимулирован растворимым лимфотоксином или сигналами фактора некроза опухоли (Le Hir et al., J.(1996. До настоящего времени функциональная роль пути поверхностного LT/LT-R в гуморальных иммунных ответах не была определена. Рецептор -лимфотоксина, член семейства рецепторов фактора некроза опухоли, специфически связывается с поверхностными лигандами лимфотоксинов. Рецептор -лимфотоксина связывает гетеромерные комплексы лимфотоксина(преимущественно LT1/2 и LT2/1), но не связывает фактор некроза опухоли или лимфотоксин (Crowe et al., Science, 264, pp. 707710 (1994. мРНК рецепторов -лимфотоксина обнаруживаются в селезенке, тимусе и в других органах человека, связанных с иммунной системой. Несмотря на то, что исследования экспрессии рецепторов -лимфотоксинов находятся на ранней стадии, типы экспрессии рецептора лимфотоксина, по всей видимости, подобны типам, описанным для TNF-R55, за исключением того, что рецептор -лимфотоксина отсутствует на периферических Т- и В-клетках крови, а также Т- и В-клеточных линиях. Комплексы лимфотоксинов поверхности клеток были охарактеризованы в CD4+-Тклетках гибридомы (II-23.D7), экспрессирующих высокий уровень лимфотоксина (Browning(1992), приводимые в данном описании в качестве ссылок). Экспрессия и биологическая роль рецептора -лимфотоксина, субъединиц лимфотоксина и поверхностных комплексов лимфотоксина описаны С.F. Ware et al., "The ligandsImmunol., Springer-Verlag, pp. 175-218 (1995), в частности, приводимом в данном описании в качестве ссылки. Индукция экспрессии -лимфотоксинов и секреция -лимфотоксинов, в основном, наблюдается в активированных Т- и В-лимфоцитах и естественных клетках-киллерах. По всей видимости, в Т-клетках-хелперах -лимфотоксин продуцируется клетками Th1, а не Th2. Лимфотоксин также обнаруживается в меланоцитах. Клетки микроглии и Т-клетки в очагах поражения у пациентов с множественным склерозом также могут быть окрашены с помощью антисыворотки против -лимфотоксина (Selmajet al., J. Clin. Invest., 87, pp. 949-954 (1991. Лимфотоксин(также называемый "р 33") экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов людей и мышей. Т-клеточных линий, Вклеточных линий и лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK). -Лимфотоксин является предметом рассмотрения параллельных зая 002983 16 вок заявителя PCT/US 91/04588, опубликована 9 января 1992 г. как WO 92/00329; и PCT/US 93/11669, опубликована 23 июня 1994 г. как WO 94/13808, приводимых в данном описании в качестве ссылок. Поверхностные комплексы лимфотоксина вначале экспрессируются активированными Т(хелперы, Th1 и клетки-киллеры) и Влимфоцитами, а также естественными клетками-киллерами, как показано с помощью анализа клеточного сортера с возбуждением флуоресценции или иммуногистологически с применением антител против -лимфотоксина или растворимых слитых белков LT-R-Ig. В одновременно рассматриваемой заявке США заявителя,серийный 08/505606, поданной 21 июля 1995 г., описаны композиции и способы применения растворимых рецепторов -лимфотоксина, а также антитела против рецептора лимфотоксина и лиганд-специфические антитела как терапевтические средства для лечения иммунологических заболеваний, опосредованных клетками Тh1. Поверхностные лимфотоксины описаны также на клонах цитотоксичных Т-лимфоцитов человека (CTL), активированных периферических мононуклеарных лимфоцитах(PML), активированных IL-2 периферических лимфоцитах крови (лимфокин-активированные клетки-киллеры), активированных митогеном лаконоса или анти-СD40-активированных периферических В-лимфоцитах (PBL) и различных лимфоидных опухолях Т- и В-ряда. Вовлечение аллоантиген-несущих клеток-мишеней специфически индуцирует экспрессию поверхностных лимфотоксинов клонами цитотоксичных Т-лимфоцитов CD8+ и CD4+. В данной заявке заявители описывают несколько иммунологических функций поверхностного лимфотоксина и показывают действие реагентов, связывающих /-лимфотоксины, на возникновение и характер иммунологических ответов, поддержание клеточной организации вторичных лимфоидных тканей, включая действие на состояние дифференцировки фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, а также уровень экспрессии адрессинов, влияющих на направленную миграцию клеток. Таким образом, заявители определяют терапевтическое применение поверхностных агентов, связывающих рецепторы LT/ иLT. До настоящего изобретения влияние сигнала рецепторов -лимфотоксина на гуморальный или иммуногенный ответы не было выяснено полностью. Авторы впервые обнаружили,что блокирование пути лимфотоксина (лимфотоксина или рецептора -лимфотоксина) может изменить гуморальный иммунный ответ животного. Таким образом, заявленное изобретение в широком смысле относится к способам изменения гуморального иммунного ответа жи 17 вотных, включая стадии введения фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество блокирующего агента пути лимфотоксина, в частности, предпочтительными являются блокаторы рецептора-лимфотоксина. В соответствии с данным изобретением могут быть использованы любые блокирующие агенты, и специалист в данной области может легко определить агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина. Например, такие блокирующие агенты могут включать в себя ингибиторы небольших молекул рецептора, растворимый рецептор -лимфотоксина, антитела против рецепторов -лимфотоксина и антитела против поверхностного лиганда лимфотоксина. В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения блокирующие агенты включают в себя растворимые рецепторы -лимфотоксина,имеющие лиганд-связывающий домен, способный селективно связываться с поверхностным лигандом лимфотоксина, и более предпочтительно, когда растворимый рецептор лимфотоксина включает в себя Fc-домен иммуноглобулина человека. В других вариантах осуществления данного изобретения предпочтительные блокирующие агенты включают в себя моноклональные антитела против рецептора -лимфотоксина,предпочтительно включая mАb BDA8 против рецептора -лимфотоксина человека и mAb B9 против -лимфотоксина человека. Более предпочтительные антитела включают в себяA1.D5.18, A0.D12.10 и BB-F6. В некоторых случаях желательно применение моноклонального антитела против мышиного лиганда поверхностного лимфотоксина. Длительное представление антигена фолликулярными дендритными клетками, по всей вероятности, является существенным при аутоиммунных заболеваниях, когда непрерывная активация иммунной системы эндогенными аутоантигенами поддерживает болезнь. Захват иммунного комплекса на фолликулярных дендритных клетках показан на фиг. 7. Возможность удалять эти иммунные комплексы с фолликулярных дендритных клеток будет способствовать уменьшению иммунной активации и уменьшать заболевание или даже прекращать его развитие. Аутоиммунные заболевания, вызывающие аберрантные ответы антител, являются очевидными мишенями для ингибиторов путей лимфотоксина, хотя другие, более "классически" вызванные Т-клетками аутоиммунные заболевания, могут содержать нераспознанные гуморальные компоненты и поэтому также могут быть подвергнуты положительному воздействию. Подобным образом, в области трансплантологии отторжение трансплантата, т.е. "хозяин против трансплантата" и болезнь "трансплантат 18 против хозяина", требует постоянной презентации антигена. Описываемые здесь механизмы манипулирования фолликулярными дендритными клетками также применимы к задачам,связанным с распознаванием "не своего", т.е. трансплантата. Кроме того, непрерывное представление антигена или поддержание антигенной памяти может играть роль в аутоиммунных заболеваниях, вызванных молекулярной мимикрией. Например, иммунный ответ на инфекционный агент болезни Лайма Borrelia burgdorferi приводит к возникновению артритоподобного заболевания предположительно из-за того, что какойто антигенный эпитоп этой бактерии напоминает нормальный компонент сустава. Удаление удерживаемого фолликулярными дендритными клетками антигена бактерий Лайма может вызвать улучшение при артрите, индуцированном болезнью Лайма. Такая терапия также подходит и для других случаев мимикрии, связанных с инфекционными агентами. Заявители неожиданно обнаружили, что введение блокирующих агентов рецепторов лимфотоксина способно мешать представлению и/или депонированию антигенов на фолликулярных дендритных клетках. Обычно В-клетки распознают антиген в виде иммунных комплексов, связанных с поверхностью фолликулярных дендритных клеток. Эти клетки могут удерживать антигены неопределенно долго. Периодический контакт с антигеном, удерживаемым на фолликулярных дендритных клетках, может быть, таким образом, связан с удержанием памяти на В-клетках. Таким образом, заявляемые способы включают в себя многочисленные болезненные состояния, зависящие от представления антигена на дендритных клетках. Введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением может быть осуществлено перед введением животному антигена. В этом случае блокирующие агенты полностью или частично предотвращают депонирование антигена на фолликулярных дендритных клетках, предотвращая или уменьшая таким образом ожидаемый иммуногенный ответ. Альтернативно, блокирующие агенты в соответствии с данным изобретением могут быть введены животному после того, как фолликулярные дендритные клетки связались с ними посредством антигена. Заявляемые способы могут обеспечить разрушение этой связи таким образом, что ожидаемый иммуногенный ответ будет затем снижен или устранен. Таким образом, терапевтические способы в соответствии с данным изобретением могут включать в себя полное или частичное устранение иммунных комплексов, уже захваченных в фолликулы В-клеток, либо полное или частичное предотвращение захвата иммунных комплексов В-клеточными фолликулами. Способность разрушать связь между этими антиген представляющими фолликулярными 19 дендритными клетками и иммунными комплексами является уникальной для обмена лимфотоксина. Например, анти-СD40L (MR-1) является другим членом семейства факторов некроза опухоли и также экспрессируется на фолликулярных дендритных клетках. Было установлено, что подобно LTR/Ig, MR-1 предотвращает образование зародышевых клеток,однако, он не влияет на экспрессию маркеров фолликулярных дендритных клеток. В отличие от рецептора -лимфотоксина, анти-СD40-L не предотвращает захват иммунного комплекса на фолликулярных дендритных клетках, он также не способен устранять иммунные комплексы,захваченные ранее на фолликулярных дендритных клетках. Кроме того, заявители установили,что анти-СD40-L не влияет на выживание/поддержание ранее генерированных Вклеток памяти. Несмотря на то, что точное основание для различий между воздействием блокирующих агентов анти-СD40-L и рецептора -лимфотоксина неизвестно, высказывается предположение, что CD40 может обеспечивать сохранение сигналов к В-клеткам. Однако система лимфотоксина важна для поддержания фолликулярных дендритных клеток в полностью дифференцированном и функциональном состоянии, что является необходимым условием для реакции зародышевого центра, а также для генерации и поддержания В-клеток памяти. Таким образом, блокирование пути CD40/CD40L может предотвратить генерацию В-клеток памяти,но не повлияет на уже образовавшийся пул Вклеток памяти. С другой стороны, блокирование обмена лимфотоксина предотвращает не только генерацию и поддержание В-клеток памяти, но также влияет на поддержание ранее генерированных В-клеток памяти. Дальнейшее применение ингибирования пути обмена лимфотоксина заключается в воздействии на вирусы, образующие резервуары в компартменте фолликулярных дендритных клеток. Хорошим примером такого случая является вирус ВИЧ. После вирусного заражения большое количество инфекционных вирусов размещается на фолликулярных дендритных клетках в В-клеточных фолликулах вторичных лимфоидных органов (Heathe et al., 1995, "Follicularinfectivity", Nature, 377: 740-4). Предполагается,что вирус образует комплексы с комплементом или иммуноглобулином и связывается с Fcрецепторами или рецепторами комплемента либо с теми и другими. Таким образом, вирус использует нормальный механизм иммунной системы для сохранения антигенной памяти на долгое время. В процессе заболевания активное инфицирование лимфоцитов возникает, прежде всего, на этих сайтах. Было подсчитано, что во время асимптоматической фазы инфекции пул 20 вируса в этом компартменте более чем в 10 раз превышает пул, содержащийся в Т-клетках и моноцитах (Cavert et al., 1997, "Kinetics of response in lymphoid tissues to antiretroviral therapyof HIV-1 infection", Science, 276: 960-964). В современных способах воздействия на ВИЧ многочисленные антивирусные агенты соединяют для снижения вирусной нагрузки и избежания потери резистентных вариантов. Вероятное ограничение такого лечения заключается в несоответствии с терапией - во время таких интервалов остаточный вирус имеет возможность мутировать, обеспечивая развитие резистентных вариантов и, таким образом, обходя процесс лечения. В то время как вирусная нагрузка в компартменте фолликулярных дендритных клеток подвергается сильному воздействию во время множественной лекарственной терапии, сами лекарственные средства, в основном, направлены на вирусный репликативный комплекс, а не на нерепликативный вирус на поверхности фолликулярных дендритных клеток. Поэтому резервуар вирусов на фолликулярных дендритных клетках может служить для реинокуляции после прекращения лекарственной терапии. Более того, фолликулярные дендритные клетки способны превращать нейтрализованный вирус в инфекционную форму, подчеркивая важность этих клеток в патогенезе ВИЧ. Поскольку ингибирование пути обмена лимфотоксина может заставить фолликулярные дендритные клетки высвободить иммунные комплексы с поверхности клеток, ВИЧ также может быть высвобожден в виде иммунного комплекса. Желательно снять всю нагрузку ВИЧ в этом компартменте непосредственно перед началом режимов множественной терапии,поскольку высвобожденный вирус должен быть либо подвергнут воздействию и удален из организма, либо после заражения он станет чувствительным к лекарственной терапии. Такое сочетание может снизить остаточную вирусную нагрузку до очень низкого уровня, возможно, оказывая влияние на лечение. В этом случае полезными оказываются LTR/Ig или антитела,блокирующие лиганд или рецептор. Потенциальный протокол лечения включает в себя инициирующую лекарственную терапию, а затем в течение нескольких дней высвобождение всех связанных вирусов путем однократного или многократного воздействия ингибиторами пути лимфотоксина. После снижения вирусной нагрузки дальнейшее воздействие агентами, направленными на лимфотоксин, не требуется. Тогда как ВИЧ является особенно хорошо изученным примером, по всей вероятности другие вирусы размещаются или прячутся на фолликулярных дендритных клетках в спокойном состоянии, ожидая каких-либо событий, таких как иммунологическое возмущение, ведущее к большой дополнительной антигенной нагрузке,и, вследствие этого, к высвобождению связан 21 ного вируса из фолликулярных дендритных клеток и его возрождению. Поэтому данное изобретение относится к любым способам ингибирования пути лимфотоксина во избежание осложнений, обусловленных вирусом, связанным с фолликулярной дендритной клеткой. Это открытие имеет важное значение для многих заболеваний, основой которых является представление антигена на дендритных клетках и ответ, генерируемый В-клетками памяти.LT1/2 эффективно передает сигналы и служит примером терапевтически полезного антиLТb-блокирующего моноклонального антитела. Кроме того, моноклональное антитело против человека,называемое"AOD12", способно блокировать передачу сигналов LT1/2 и все же, в отличие от большей части моноклональных антител против лимфотоксина человека, оно малоэффективно против одного -лимфотоксина. Эти моноклональные антитела были получены после иммунизации мышей растворимым лигандомLT1/2, приведя к открытию моноклональных антител с уникальной специфичностью. Более того, мы настаиваем, что антилимфотоксиновые моноклональные антитела со специфичностью предпочтительно против комплексаLT1/2 будут обнаружены только при такой иммунизации, а не при иммунизации только лимфотоксином, и поэтому включают уникальный класс антител против -лимфотоксинов. Примеры Материалы и методы Мыши. Беременных мышей Ваlb/с с одинаковым сроком приобретали в Jackson Laboratory (BarHarbor, ME), помещали в обычные клетки и содержали в соответствии с рекомендациями. В хвостовую вену беременных мышей внутривенно вводили белки рецептора-Ig. Потомству мышей и 5-недельным самкам Balb/c (приобретенным в Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) внутрибрюшинно вводили слитые белки. Слитые белки и антитела. Слитые белки, включающие в себя внеклеточный домен мышиного рецептора -лимфотоксина, TNF-R55 или LFA-3 человека (не связывающегося с мышиным CD2), слитые в петлю, Сн 2- и Сн 3-домены IgG1 человека готовили,как описано Force et al., J. Immunol., 155, pp. 5280-5288 (1995); Miller et al, J. Exp. Med., 178,pp. 211-222 (1993). Очищенный IgGl человека,используемый в качестве контроля, приобретали в Protos Immunoresearch (San Francisco, CA).MR1, антитело против мышиного лигандаCD40, приобретали в Pharmingen (San Diego,CA). Антитела (MOMA-1, ED3), специфичные в отношении маркеров, экспрессируемых мышиными металлофильными макрофагами (MM) 22 ные в отношении ретикулярных фибробластов мыши (ER-TR-7) приобретали в Serotec (Oxon,UR). Антитела, специфичные для мышей В 220,CD4 и MadCAM-1 (МЕСА 367) приобретали вPharmingen (San Diego, CA). Антитело (ER-TR9), специфичное к маркеру, экспрессируемому макрофагами маргинальной зоны мышей, поставляет Dr. Reina Mebius (Vrije Universiteit,Amsterdam). Антитела (FDC-M1 и FDC-M2),специфичные к мышиной фолликулярной дендритной клетке, были описаны ранее (Maeda etal., J. Immunol., 148, pp. 2340-2347 (1992. Антитело против CR1 мыши (которое также окрашивает фолликулярные дендритные клетки) было любезно предоставлено Dr. Randolph J.Noelle (Dartmouth Medical School). Для выявления адрессина периферических лимфатических узлов (PNAd) применяли антитело МЕСА 79(супернатант клеточной культуры, полученной из клеток, приобретенных в АТСС, Rockville,MD). Антигены и иммунизация. Мышей подвергали внутрибрюшинной иммунизации 100 мкл 10% суспензии (приобретаемой в Colorado Serum Company), что эквивалентно 1-5108 SRBC на иммунизацию. Иммуногистохимия. Селезенку и лимфатические узлы замораживали в заливочной среде ОСТ (Miles, Elkhart,IN) и подготавливали для получения срезов в криостате. Срезы толщиной 7-10 мм высушивали и фиксировали ацетоном. Срезы инкубировали с конъюгированными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненной камере после разбавления в Tris-забуференном солевом буфере A (TBS-A, 0,05 М Tris, 0,15 М(0,05 М Tris, 0,15 NaCl, 0,05% Tween-20) и фиксировали в течение 1 мин в этаноле, перед тем как инициировать энзиматическую реакцию. Активность пероксидазы (HRP) хрена и щелочной фосфатазы (АР) выявляли с помощью набора DAB таблеток с субстратом (Sigma, St. Louis,МО) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат нитроголубой тетразолий (BCIP/NBT, Sigma) соответственно. Срезы ткани фиксировали в течение 5 мин в метаноле и окрашивали для подсчета,применяя Giemsa (Fluka, Buchs, Switzerland). Анализ флюоресцентного изображения. Для иммунофлюоресцентного окрашивания замороженные срезы фиксировали в ацетоне, высушивали на воздухе и предварительно блокировали 5 мкг/мл анти-СD16/СD32-Fсблокатором (Pharmingen, San Diego, CA) в забуференном Tris солевом растворе, содержащем 0,25% бычьего сывороточного альбумина,0,05% Tween-20 и 10% термоагрегированной сыворотки кролика. Срезы окрашивали в этом же буфере, используя следующие mSbs и выявляющие реагенты: 10 мкг/мл биотинилированного анти-B220 mAb (Pharmingen), затем 20(Southern Biotechnology Associates); супернатанта культуры МЕСА 79, затем 20 мкг/мл FIТСмышиного антикрысиного IgM (Pharmingen); 20 мкг/мл антисиалоадгезинового mAb, затем 10 мкг/мл РЕ-козьего F(ab')2 против крысиного IgGBiotechnology Associates); разбавленное 1:5 mAb из супернатанта клеточной структуры МОМА-1,затем 20 мкг/мл мышиного FITC-антикрысиногоIgM (Pharmingen). Некоторые срезы окрашивали одновременно многими mAbs для получения анализа наложенного образа. Все срезы рассматривали при 50 х увеличении и фотографировали, используя Ektachrome P1600 (Kodak,Rochester, NY), или запечатлевали в виде красных и зеленых файлов изображения, как описано Rennert et al., J. Exp. Med. (ноябрь 1996 г., в печати). Анализы на гемагглютинацию. Серийные разбавления сывороток осуществляют в 96-луночном титрационном микропланшете (Costar, Cambridge, MA) в забуференном фосфатом физиологическом растворе/1% глюкозе. Титр IgM, специфичный к эритроцитам барана, определяют путем добавления 25 мкл 10% суспензии эритроцитов барана в каждую лунку и инкубирования планшета в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе при 37 С. При использовании IgG, специфичного к эритроцитам барана, сыворотку инкубируют в течение 30 мин при 37 С с применением 20 мкл/лунку 1% 2-меркаптоэтанола (об./об.) (Bio-Rad, Richmond,CA) для устранения пентамеров IgM. Затем добавляют 25 мкл/лунку 10% суспензии эритроцитов барана, а потом 25 мкл/лунку 10 мг/мл раствора (в забуференном фосфатом физиологическом растворе/1% глюкозе) козьего антимышиного IgG (Southern Biotechnology, Birmingham,AL) в качестве поперечносшивающего агента для гемагглютинации. Титр определяют как обратную величину последнего разбавления сыворотки, при котором гемагглютинация явно очевидна. Твердофазные иммуноферментные анализы (ELISAs). В анализах Ig-рецепторов в плазме используют mAbs, специфичные к мышиному рецептору -лимфотоксина (Browning et аl., манускрипт находится в стадии подготовки), LFA-3(1993 или домен СН 3 IgG1 человека (CDG5,выпускаемый в Biogen), непосредственно иммобилизованные (10 мкг/мл) в 96-луночных титрационных микропланшетах для получения изображений, а также ослиные антитела противIgG1 человека против пероксидазы хрена для регистрации (Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA, разбавление 1:4000). Получение растворимых молекул рецептора -лимфотоксина. В одном из вариантов осуществления данного изобретения агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина включают растворимые молекулы рецепторов -лимфотоксина. Фиг. 1 показывает последовательность внеклеточной части рецептора -лимфотоксина человека, кодирующую лиганд-связывающий домен. Используя информацию о последовательности,приведенную на фиг. 1, и метод рекомбинантной ДНК, хорошо известный в данной области,функциональные фрагменты, кодирующие лиганд-связывающий домен рецептора лимфотоксина, могут быть клонированы в вектор и экспрессированы в соответствующем хозяине для получения растворимой молекулы рецептора -лимфотоксина. В качестве агентов,блокирующих рецепторы -лимфотоксина, выбирают растворимые молекулы рецепторов лимфотоксина, которые могут конкурировать с нативными рецепторами -лимфотоксина для связывания лиганда лимфотоксина в соответствии с анализами, описанными в одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный 08/505606, поданной 21 июля 1995 г., США. Растворимый рецептор -лимфотоксина,включающий в себя аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, приведенных на фиг. 1, может быть прикреплен к одному или нескольким гетерологичным белковым доменам ("домен слияния") для улучшения стабильности белка слияния рецептора in vivo, либо для модулирования его биологической активности или локализации. Устойчивые белки плазмы, обычно имеющие период полураспада, превышающий 20 ч в циркуляции, предпочтительно используют для конструирования белков слияния рецепторов. Такие белки плазмы включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, сывороточный альбумин, липопротеины, аполипопротеины и трансферрин. Последовательности, способные нацеливать растворимую молекулу рецептора лимфотоксина на конкретную клетку или тип ткани, также могут быть прикреплены к лигандсвязывающему домену рецептора лимфотоксина для получения специфически локализованного растворимого белка слияния рецептора -лимфотоксина. Весь внеклеточный участок рецептора лимфотоксина или его функциональная часть(фиг. 1), включающие лиганд-связывающий домен рецептора -лимфотоксина, могут быть слиты с постоянным участком иммуноглобулина, подобно Fc-домену IgG1 человека с тяжелой цепью (Browning et al., J. Immunol., 154, pp. 3346 (1995. Растворимые белки слияния IgG ре 25 цепторов являются предпочтительными и обычными иммунологическими реагентами; способы их конструирования известны в данной области(см., например, патент США 5225538, приводимый в настоящем описании в качестве ссылки). Функциональный лиганд-связывающий домен рецептора -лимфотоксина может быть слит с Fc-доменом иммуноглобулина (Ig), полученного из класса или подкласса иммуноглобулинов, отличных от IgG1. Fc-Домены антител,принадлежащих к различным классам или подклассам Ig, могут активировать различные вторичные эффекторные функции. Активация происходит тогда, когда Fc-домен связан родственным Fc-рецептором. Вторичные эффекторные функции включают способность активировать систему комплемента, проникать через плаценту и связывать различные микробные белки. Свойства различных классов и подклассов иммуноглобулинов описаны Roitt et al., Immunology, p. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3d ed.,1993). Активация системы комплемента инициирует каскад ферментативных реакций, вызывающих воспаление. Продукты системы комплемента имеют различные функции, включая связывание бактерий, эндоцитоз, фагоцитоз,цитотоксичность, выработку свободных радикалов и солюбилизацию иммунных комплексов. Каскад ферментов комплемента может быть активирован Fc-доменами антигенсвязанных антител IgG1, IgG3 и IgM. Fc-ДоменIgG2 оказывается менее эффективным, а домены Fc IgG4, IgA, IgD и IgE - неэффективными для активации комплемента. Таким образом, Fcдомен может быть выбран на основании его ассоциированных вторичных эффекторных функций, желательных для конкретного иммунного ответа, или заболевания, лечимого белком слияния иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина. Если предпочтительно повредить или убить несущую лиганд клетку-мишень лимфотоксина, можно выбрать особо активный Fcдомен (IgG1) для получения слитого белка иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина. Альтернативно, если желательно нацелить слияние Fc-рецептора -лимфотоксина на клетку без запуска системы комплемента, можно выбрать неактивный Fc-домен IgG4. Мутации в Fc-доменах, снижающие или устраняющие связывание с Fc-рецепторами и активацию комплемента, описаны S. Morrison,Annu. Rev. Immunol., 10, pp. 239-265 (1992). Эти или иные мутации могут быть использованы по отдельности или в сочетании для оптимизации активности Fc-домена, используемого для конструирования слитого белка иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина. 26 Получение растворимого слитого белка рецептора -лимфотоксина человека, включающего в себя лиганд-связывающие последовательности, слитые с Fc-доменом иммуноглобулина человека (hLT-R-Ig), описано в примере 1. Одну линию СНО, полученную в соответствии с примером 1, секретирующую hLT-R-Fc,называют "hLT-R, hG1 СНО 14". Образец этой линии был депонирован 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС)(Rockville, MD) в соответствии с условиями Будапештского договора и ему был присвоен номер АТСС CRL11965. Получение растворимой мышиной слитой молекулы рецептора -лимфотоксина (LT-RIg) описано в примере 2. Линию СНО, полученную в соответствии с примером 2, секретирующую иммуноглобулин рецептора -лимфотоксина, называют "mLT, R-hG1 CHO1,3.BB". Образец этой линии был депонирован 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (Rockville, MD) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ему был присвоен номер АТСС CRL11964. Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно устранены после выдачи патента по данной заявке. Различные аминокислотные остатки, образующие точку слияния рецептора с иммуноглобулином в слитом белке, могут изменять структуру, стабильность и окончательную биологическую активность растворимого слитого белка рецептора -лимфотоксина. К С-концу выбранного фрагмента рецептора -лимфотоксина могут быть добавлены одна или несколько аминокислот для модификации точки слияния выбранным доменом слияния.N-конец слитого белка рецептора лимфотоксина также может варьироваться путем изменения позиции, в которой выбранный фрагмент ДНК рецептора -лимфотоксина расщепляют на 5'-конце для инсерции в рекомбинантный вектор экспрессии. Стабильность и активность каждого слитого белка рецептора лимфотоксина может быть проверена и оптимизирована с помощью рутинных экспериментов и анализов по выбору описанных выше агентов,блокирующих рецепторы -лимфотоксина. С помощью последовательностей лигандсвязывающего домена рецептора -лимфотоксина в составе внеклеточного домена, приведенного на фиг. 1, можно также сконструировать варианты аминокислотных последовательностей для модификации аффинности растворимого рецептора -лимфотоксина или слитого белка к лиганду лимфотоксина. Растворимые молекулы рецептора -лимфотоксина согласно изобретению могут конкурировать за поверхностное связывание лиганда с эндогенными рецепторами -лимфотоксина на поверхности кле 27 ток. Предусматривается, что любая растворимая молекула, содержащая лиганд-связывающий домен рецептора -лимфотоксина, способный конкурировать с рецепторами -лимфотоксина на поверхности клеток за связывание лиганда лимфотоксина, представляет собой агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина согласно изобретению. Источник антител против рецептора лимфотоксина. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения антитела против рецептора -лимфотоксина человека функционируют как агенты, блокирующие рецептор-лимфотоксина. Антитела против рецептора -лимфотоксина (анти-LT-R Abs) согласно изобретению могут быть поликлональными или моноклональными (mAbs) и могут быть модифицированы для оптимизации их способности блокировать передачу сигналов рецептора лимфотоксина, их биодоступности in vivo, стабильности или других желательных свойств. Поликлональные антисыворотки против рецептора -лимфотоксина человека получают с применением известных способов путем подкожного введения животным, таким как коза,кролик, крыса, хомяк или мышь, слитого белка иммуноглобулина с рецептором -лимфотоксина (пример 1) в полном адъюванте Фрейнда с повторной внутрибрюшинной или подкожной бустер-инъекцией в неполном адъюванте Фрейнда. Поликлональные антисыворотки, содержащие требуемые антитела против рецептора -лимфотоксина, подвегают скринингу путем обычных иммунологических процедур. Моноклональные антитела мышей против слитого белка LT-R-Ig человека получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителей, серийный 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Клеточная линия гибридомы (BD.A8.AB9), вырабатывающая мышиные моноклональные антитела BDA8 против рецептора -лимфотоксина человека, была депонирована 12 января 1995 г. в Американской коллекции типовых культур(АТСС) (Rockville, MD), в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АТСС НВ 11798. Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно сняты после выдачи патента по данной заявке. С применением стандартных методов рекомбинантной ДНК могут быть получены различные формы антител против рецептора лимфотоксина (Winter and Milstein, Nature, 349,pp. 293-299 (1991. Например, могут быть сконструированы "химерные" антитела, в которых антиген-связывающий домен из антитела человека связан с константным доменом человека(1984. Химерные антитела уменьшают наблюдаемые иммунные ответы, вызываемые антителами животных, будучи использованными для клинического лечения людей. Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные "очеловеченные антитела", распознающие рецептор -лимфотоксина. "Очеловеченные" антитела представляют собой химеры, в основном включающие последовательности IgG человека, в которые вставляют участки,ответственные за специфическое связывание антигенов (например, WO 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют и часть последовательностей с вариабельными участками, ответственными за специфическое связывание антигенов, удаляют. Полученные от животных антигенсвязывающие участки затем клонируют в соответствующую позицию генов антител человека с удаленными антигенсвязывающими участками. "Очеловеченные" антитела сводят к минимуму применение гетерологичных (межвидовых) последовательностей в антителах человека, что снижает вероятность нежелательных иммунных реакций в процессе лечения. Конструирование различных классов рекомбинантных антител против рецепторов лимфотоксина может быть также осуществлено путем получения химерных или "очеловеченных" антител, включающих в себя антитела против вариабельных доменов рецепторов лимфотоксина и константные домены человека(СН 1, СН 2, СН 3), выделенные из иммуноглобулинов различных классов. Например, IgMантитела против рецепторов -лимфотоксина с повышенной валентностью антигенсвязывающих сайтов могут быть получены рекомбинантным способом путем клонирования антигенсвязывающего сайта в векторы, несущие константные участки с -цепью иммунглобулина человека (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177,pp. 1439-1450 (1993); Lane et al., Eur. J.al., Nature, 339, pp. 68-70 (1989. Кроме того, стандартные методы рекомбинантной ДНК могут быть использованы для изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами путем изменения аминокислотных остатков вблизи от антигенсвязывающих сайтов. Антиген-связывающая аффинность "очеловеченного" антитела может быть усилена с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании (Queen et(1989); WO 94/04679). Может возникнуть необходимость увеличить или уменьшить аффинность антител против рецепторов -лимфотоксина к рецепторам-лимфотоксина в зависимости от типа тканимишени или конкретной схемы лечения. На 29 пример, может возникнуть необходимость лечения пациента, поддерживая постоянный уровень антител против рецепторов -лимфотоксина с пониженной способностью передавать сигналы по пути -лимфотоксина с целью полупрофилактического лечения. Подобным образом, ингибиторные антитела против рецепторов лимфотоксина с повышенной аффинностью по отношению к рецепторам -лимфотоксина могут оказаться предпочтительными для краткосрочного лечения. Источник антител против поверхностных лигандов лимфотоксина. Другой предпочтительный вариант осуществления данного изобретения предусматривает композиции и способы, включающие антитела против лиганда лимфотоксина, действующего как агенты, блокирующие рецепторы лимфотоксина. Как описано выше для антител против рецепторов -лимфотоксина, антитела против лигандов лимфотоксина, функционирующие в качестве агентов, блокирующих рецепторы -лимфотоксина, могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть модифицированы в соответствии с рутинными процедурами для модулирования их антиген-связывающих свойств и их иммуногенности. Антилимфотоксиновые антитела согласно изобретению могут быть получены конкретно против одной или двух субъединиц, включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы субъединицы лимфотоксина. Если субъединицы лимфотоксина используют в качестве антигена, предпочтительно, чтобы это были субъединицы -лимфотоксина. При использовании субъединиц -лимфотоксина предпочтительно, чтобы полученные антитела против лимфотоксина связывались с поверхностным лигандом лимфотоксина и не вступали в перекрестную реакцию с секретируемым -лимфотоксином или модулировали активность рецептора TNF (в соответствии с анализами, описываемыми в параллельной заявке заявителей 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г.). Альтернативно, антитела против гомомерных (LT) или гетеромерных комплексов(LT/), содержащих одну или несколько субъединиц лимфотоксина, могут быть получены и подвергнуты скринингу на активность как агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина. Комплексы LT1/2 предпочтительно используют в качестве антигена. Как указывалось выше, предпочтительно, чтобы полученные антитела против LT1/2 связывались с поверхностным лигандом лимфотоксина, не связываясь с секретируемым -лимфотоксином и не воздействуя на активность рецептора TNF. Получение поликлональных антител против -лимфотоксина человека описано в одновременно рассматриваемой заявке заявителя(WO 94/13808). Моноклональные антитела против -лимфотоксина и -лимфотоксина также описаны (Browning et аl., J. Immunol., 154, pp. 33-46 (1995. Мышиные моноклональные антитела против -лимфотоксина человека получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителя, серийный 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Клеточная линия гибридомы (В 9.С 9.1), вырабатывающая мышиные моноклональные антитела В 9 против рецептора -лимфотоксина человека,была депонирована 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС)(Rockville, MD) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АТСС НВ 11962. Моноклональные антитела хомяка против мышиного /-лимфотоксина получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителя, серийный 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Линия клеток гибридомы (BB.F6.1), вырабатывающая моноклональные антитела хомяка против мышиного /-лимфотоксина, BB.F6 mAb,была депонирована 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС)(Rockville, MD) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АТСС НВ 11963. Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно сняты после выдачи патента по данной заявке. Применение растворимого LT-R-Ig для ингибирования иммунологических функций поверхностного комплекса лимфотоксина. Далее следует описание действия реагента,связывающего поверхностный лимфотоксин,слитого белка, содержащего внеклеточный домен мышиного рецептора -лимфотоксина и петлю, СН 2- и СН 3-домены IgG1 человека(LT-R-Ig), на выработку и характер ответов иммуноглобулина, на поддержание клеточной организации вторичных лимфоидных тканей,включая действие на состояние дифференцировки фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, а также на уровень экспрессии адрессина, влияющего на направленную миграцию клеток. Многократные инъекции мышам LT-R-Ig изменяют организацию лимфоцитов селезенки и экспрессию функциональных маркеров клетками маргинальной зоны селезенки. Действие блокады поверхностного лимфотоксина на структуру селезенки изучают, впрыскивая мышам 6 недель подряд (1 раз в неделю)LT-R-Ig. Затем мышей подвергают иммунизации эритроцитами барана и через 4 дня еще раз впрыскивают LT-R-Ig. На 10-й день после введения эритроцитов барана мышей умерщвляют. Иммуногистохимическое окрашивание заморо 31 женных срезов селезенки обнаруживает несколько гистологических изменений. После введения LT-R-Ig фолликулы, включающие компартмент В-клеток селезенки у нормальных мышей, более не являются дискретными. Вместо этого В-клетки теперь организованы в виде диффузной полосы, окружающей участки с Тклетками (фиг. 2 В), а граница между зонами Ти В-клеток нарушена (фиг. 2 В). В противоположность этому, у контрольных мышей, получавших LFA-3-Ig, фолликулы В-клеток селезенки являются дискретными и имеется четкая граница между областями Т- и В-клеток (фиг. 2 А). Экспрессия поверхностных маркеров клеток, распознаваемых моноклональными антителами ER-TR-9 и МОМА-1, отсутствует у двух различных популяций макрофагов, размещающихся в маргинальной зоне селезенки мышей,получавших LT-R-Ig. Известно, что ER-TR-9 окрашивает маркер на макрофагах маргинальных зон (Dijkstra et al., Immunol., 55, 23-30(1985, а МОМА-1 окрашивает маркер на металлофильных макрофагах (Kraal and Janse, Immunol., 58, 665-669 (1986 (фиг. 2D, F соответственно). Эти маркеры экспрессированы на клетках контрольных мышей, получавших LFA3-I (фиг. 2 С, Е). Экспрессия сиалоадгезина, другого маркера МОМА-1 + микрофаги в маргинальной зоне селезенки мышей, у мышей, получавших LT-R-Ig, также отсутствует (не показанo). Антитело МЕСА-367 связывает адгезивную молекулу и адрессин слизистой MadCAM1, первоначально описанный на эндотелиальных клетках в пейеровых бляшках, мезентериальных лимфатических узлах, интестинальной слизистой оболочке и lamina propria (Briskin et al.,Nature, 363, pp. 461-464 (1993); Nakache et al.,Nature, 337, pp. 179-181 (1989. Также описана экспрессия MAdCAM-1 в маргинальной зоне селезенки (предположительно экспрессируемой на эндотелиальных клетках небольших терминальных артериол, выходящих на маргинальный синус) и на ретикулярной сетчатой структуре в зародышевых центрах (Kraal et al., Am. J.MAdCAM-1 в селезенке была погашена (фиг. 2 Н). Подобным образом, окрашивание антителом ER-TR-7 (Van Vliet et al., Cytochem., 34, pp. 883-890 (1986, отличающее популяцию ретикулярных фибробластов в маргинальной зоне(фиг. 2I), распределяется аномально и сильнее в белой пульпе животных, получавших LT-R-Ig,чем LFA-3-Ig (фиг. 2J). Изменения, наблюдаемые у мышей, получавших LT-R-Ig, не зависели от воздействия антигена, поскольку рисунок окрашивания у иммунизированных мышей, по 002983 лучавших LT-R-Ig, был идентичным (не показано). Образование зародышевых центров прекращается и фолликулярные дендритные клетки не обнаруживаются в селезенке мышей, получавших LT-R-Ig. Для определения на гистологическом уровне, влияют ли многократные инъекции мышам LT-R-Ig на иммунный ответ на эритроциты барана, проводят исследование образования зародышевых центров и распределения фолликулярных дендритных клеток (FDC) в ответ на праймирование антигена. Замороженные срезы селезенки мышей, предварительно многократно получавших LT-R-Ig или LFA-3Ig, как указано в описании к фиг. 2, окрашивали арахисовым агглютинином, чтобы выявить зародышевые центры, а также антителом M1 для выявления фолликулярных дендритных клеток,клеточного компонента, необходимого для образования зародышевых центров (Schriever and(1990). Взаимодействие лигандов CD40-CD40 также оказалось важным для образования зародышевых центров (Foy et al., J. Exp. Med., 180,pp. 157-163 (1994. Таким образом, для сравнения группа мышей получает MR1, антитело против мышиного лиганда CD40, после системы инъекций, которые, как показали ранее, ингибировали образование зародышевых центров (Hanet al., J. Immunol., 155, pp. 556-567 (1995. Через 10 дней после стимулирования эритроцитами барана у мышей, получавших контрольный белок иммуноглобулина LFA-3, развиваются многочисленные ярко окрашенные зародышевые центры PNA в селезенке (фиг. 3 А). Зародышевые центры не обнаруживаются в селезенке мышей, получавших LT-R-Ig или MR1 (фиг. 3 В, С соответственно). Однако действие MR1 иLT-R-Ig может быть обнаружено с помощью двух других наблюдений. Окрашивание фолликулярных дендритных клеток (FDC-M1) в зародышевых центрах (фиг. 3D) отсутствует в селезенке мышей, получавших LT-R-Ig (фиг. 3 Е),но все еще присутствует в селезенке мышей,получавших MR1 (фиг. 3F). Подобные наблюдения были проведены с применением антителаFDC-M2 для окрашивания фолликулярных дендритных клеток (не показано). Таким образом,введение LT-R-Ig приводит к изменениям фенотипа фолликулярных дендритных клеток в селезенке и к отсутствию образования зародышевых центров. Помимо окрашивания зародышевых центров, PNA также окрашивает маргинальную зону в селезенке нормальных мышей. Такое окрашивание также было отмечено у мышей, получавших LFA-3-Ig (фиг. 3 А) и MR1 (фиг. 3 С),но отсутствовало в селезенке мышей, получавших LT-R-Ig (фиг. 3 В). 34 макрофагов, макрофагов маргинальной зоны,MAdCAM-1, зародышевых центров и фолликулярных дендритных клеток оказалась различной. Одной инъекции LT-R-Ig достаточно для устранения окрашивания MAdCAM-1 неделю спустя. После трех еженедельных инъекцийLT-R-Ig окрашивание зародышевых центров и фолликулярных дендритных клеток не обнаруживалось, а компартменты лимфоцитов Т/В оказались прерванными. Требуется, как минимум, 4 инъекции LT-R-Ig для устранения окрашивания металлофильных макрофагов. Шесть инъекций LT-R-Ig не устраняли полностью окрашивания макрофагов маргинальной зоны антителом ER-TR-9 (также показано на фиг. 2D). Более точный анализ быстрого ингибирования окрашивания МОМА-1, MAdCAM-1,FDC-M1, FDC-M2 и CR-1 после одной инъекции LT-R-Ig проводили в отсутствие антигена Экспрессия сиалоадгезина, МОМА-1, ERTR-9, ER-TR-7 и MadCAM-1 в селезенке мышей, получавших MR1, также оказалась нормальной (не показано), еще более подчеркивая молекулярные эффекты действия сигналирования CD40 и рецептора -лимфотоксина. Кинетика изменений, индуцированныхLT-R-Ig, в организации лимфоцитов селезенки и экспрессии маркеров клеток маргинальной зоны. Изучали количество инъекций LT-R-Ig,необходимых для воздействия на организацию лимфоцитов и экспрессию маркеров клеток маргинальной зоны в селезенке. LT-R-Ig вводили мышам внутрибрюшинно один или несколько раз, как показано в табл. 1. Некоторые мыши были затем также иммунизированы эритроцитами барана в день последней инъекции(для MAdCAM-1), МОМА-1, ER-TR-9 и FDCM1 оценивали на замороженных срезах селезенки подвергнутых обработке мышей. Кинетика исчезновения окрашивания металлофильных Таблица 1 Действие LT-R-Ig на организацию селезенки и образование зародышевых центров в ответ на введение эритроцитов барана взрослым мышам Количество инъекций нормальная нормальная слегка аномальная прерванная прерванная прерванная прерванная Мышам вводили внутрибрюшинно по 100 мкг LT-R-Ig еженедельно в течение 1-5 недель,а затем умерщвляли. Если не указано иначе,LT-R-Ig вводили перед введением внутрибрюшинно эритроцитов барана (100 мкл 10% суспензии), причем последнюю инъекцию LT-RIg делали в тот же день, что и инъекцию антигена. Животных умерщвляли через 10 дней после инъекции эритроцитов барана. Замороженные срезы селезенки дважды окрашивали биотинилированным крысиным антителом против мышиного В 220 и крысиным антителом против мышиного CD4, а затем стрептавидинщелочной фосфатазой и мышиной противокрысиной иммуноглобулин-пероксидазой соответственно. Срезы селезенки также окрашивали следующими мышиными антителами против крысиных макрофагов маргинальной зоны (ERTR-9), крысиных металлофильных макрофагов(МОМА-1), крысиных MAdCAM-1 (МЕСА 367) и крысиных фолликулярных дендритных клеток(FDC-М 1), а затем мышиной антикрысиной им муноглобулин-пероксидазой. Дополнительный набор замороженных срезов окрашивали биотинилированным арахисовым агглютинином(PNA-биотин), а затем стрептавидин-пероксидазой для выявления зародышевых центров. Проводили наблюдения срезов, по меньшей мере, от 3 животных на группу.Интенсивность окрашивания оценивали на глаз: нормальное окрашивание - , пониженное окрашивание - , слабое окрашивание + и отсутствие окрашивания - "-". Интенсивность окрашивания на срезах от неподвергавшихся инъецированию животных и от животных, получавших LFA-3-Ig, оценивали относительно нормального окрашивания. Количество зародышевых центров на срезе селезенки определяли следующим образом: 10 - , 5-10 - , 1-5 - +, отсутствие - "-". х Животные из этих групп не получали эритроцитов барана. Таблица 2 Точное время влияния LT-R-Ig на окрашивание МОМА-1, MAdCAM-1, CR1, FDC-M1 и FDC-M2 МОМА-1+/+/ Дни после разовой инъекции LТ-R-Ig 3 5 7 5-6-недельные мыши Balb/с получали по одной внутрибрюшинной инъекции (100 мкг)LT-R-Ig или иммуноглобулина человека. Мышей из каждой группы умерщвляли на 0-й, 1-й,3-й, 5-й, 7-й, 10-й и 14-й день. Замороженные срезы селезенки окрашивали следующими антителами: крысиными, против мышиных металлофильных макрофагов (МОМА-1), крысиными,против мышиных MAdCAM-1 (MECA 367),крысиными, против мышиных фолликулярных дендритных клеток (FDC-M1), крысиными, против мышиных фолликулярных дендритных клеток (FDC-M2) и мечеными биотином крысиными, против мышиных CR1, а затем мышиной антикрысиной иммуноглобулин-пероксидазой(МОМА-1, MAdCAM-1, FDC-M1, FDC-M2) или меченым пероксидазой стрептавидином (CR1).Интенсивность окрашивания оценивали на глаз: нормальное окрашивание - , пониженное окрашивание - , слабое окрашивание + и отсутствие окрашивания - "-". Интенсивность окрашивания на срезах от неподвергавшихся инъецированию животных и от животных, получавших иммуноглобулин человека,принимали в качестве стандарта нормального окрашивания. Анализу подвергали срезы, по меньшей мере, от двух животных на группу. Мышей Balb/c, получивших по одной внутрибрюшинной инъекции LT-R-Ig, умерщвляли каждый день в течение 14 дней после инъекции, а их селезенки удаляли и замораживали. Замороженные срезы селезенки окрашивали МОМА-1, анти-MAdCAM-1 (MECA-367) иFDC-M1, FDC-M2 и анти-CR1. Через день после инъекции LT-R-Ig окрашивание реагентами анти-MAdCAM-l, FDC-M1 и FDC-M2 существенно снижалось (табл. 2). Более быстрое ингибирование окрашивания FDC-M1 в этом эксперименте по сравнению с результатами, представленными в табл. 1, возможно происходило благодаря интенсивности окрашивания FDCM1, более сильной у иммунизированных животных. Окрашивание CR1 все еще обнаруживалось на 14-й день, показывая тем самым, что фолликулярные дендритные клетки все еще присутствуют на 3-й день после введения LTR-Ig, но что экспрессия маркеров, обнаруживаемых с помощью FDC-M1 и FDC-M2, снижается. Таким образом, введение LT-R-Ig изменяло фенотип фолликулярных дендритных кле 10 ток. Наконец, окрашивание МОМА-1 снижалось, но все еще обнаруживалось на 14-й день. Многократное введение LT-R-Ig ингибирует экспрессию адрессина в лимфатических узлах. Мы исследовали экспрессию адрессина в лимфатических узлах потомства беременных мышей Balb/c с одинаковым сроком, которым на 14-й и 17-й день беременности вводили внутривенно по 200 мкг белков иммуноглобулинрецептор. После рождения потомству либо ничего не вводили, либо один раз в неделю вводили внутрибрюшинно по 100 мкг LT-R-Ig, TNFR55-Ig или LFA-3-Ig. Как показали методомELISA, уровень слитых белков остается на уровне или выше 10 мкг/мл на протяжении всей жизни (не показано). Иммуногистохимическое окрашивание МЕСА 367 и МЕСА 79 показывает,что MAdCAM-1 и периферические адрессины лимфатических узлов полностью отсутствуют в мезентериальных лимфатических узлах мышей,получавших на протяжении всей жизни LT-RIg (фиг. 4 А, В). Сакральные лимфатические узлы этих мышей также не экспрессировали никаких адрессинов, а цервикальные и подвздошные лимфатические узлы не обнаруживали периферического окрашивания (не показано). Регуляция экспрессии адрессина по типу обратной связи является обратимой, поскольку экспрессия достигает нормального уровня у животных,получавших инъекции только внутриутробно(фиг. 4G, Н). У мышей, получавших на протяжении всей жизни по 100 мкг в неделю TNFR55-Ig или LFA-3-Ig, экспрессия адрессина в лимфатических узлах остается не сравнимой с экспрессией у мышей, не получавших инъекций(фиг. 4 С, D, Е, F). Расположение -лимфоцитов и экспрессия маркеров макрофагов в лимфатических узлах мышей, получавших LT-R-Ig, меняются. Антитела, связывающие маркеры популяций макрофагов в субкапсулярном синусе лимфатических узлов (аналогично маргинальной зоне селезенки), использовали для проведения иммуногистохимического анализа лимфатических узлов, взятых у мышей, получавших во время беременности и непрерывно после рождения LT-R-Ig, TNF-R55-Ig или LFA-3-Ig, как указано в вышеприведенном описании к фиг. 4. Флуоресцентные изображения анализировали с применением математического обеспечения для 37 анализа изображений. Было установлено, что экспрессия сиалоадгезина в лимфатических узлах мышей, получавших растворимый LT-R-Ig(фиг. 5 В), снижается, в отличие от лимфатических узлов мышей, получавших TNF-R55-Ig илиLFA-3-Ig (фиг. 5 Е, Н). Экспрессия МОМА-1 на макрофагах субкапсулярного синуса все еще обнаруживалась в лимфатических узлах мышей,получавших LT-R-Ig (фиг. 5 С). Оценивали также эффект непрерывного действия LT-R-Ig на организацию лимфоцитов в лимфатических узлах. Срезы лимфатических узлов окрашивали mAbs, специфичными по отношению к маркеру В-клеток В 220 и маркеру Тклеток CD4. Для идентификации областей наложения зон Т- и В-клеток применяли анализ изображения. Введение LT-R-Ig вызывает растворение фолликул В-клеток таким образом, что В-клетки присутствуют в диффузной полосе на внешней границе области Т-клеток (фиг. 5 А). Несмотря на растворение фолликулярной структуры В-клеток, эти клетки не присутствуют в областях Т-клеток, вместо этого они появляются в областях, аномально занятых лимфоцитами. Очень похожий рисунок окрашивания Т- и Вклеток наблюдался у мышей, всю жизнь получавших по 100 мкг в неделю TNF-R55-Ig, но неLFA-3-Ig (фиг. 5D). Фолликулы В-клеток вновь прерываются и В-клетки присутствуют в областях лимфатических узлов, в которых лимфоциты обычно не обнаруживаются. Наложения Вклеток на Т-клетки не наблюдается. Введение LT-R-Ig мышам ингибирует ответ антител IgM и IgG. Неспособность зародышевых центров селезенки образовывать последующее праймирование эритроцитов барана у мышей, многократно получавших LT-R-Ig (как на фиг. 3), предполагает изменения гуморального иммунного ответа этих мышей. С целью непосредственного исследования этого взрослым мышам делали по 6 инъекций (один раз в неделю) LT-R-Ig илиLFA-3-Ig, а затем их праймировали эритроцитами барана. У мышей брали кровь на 7-й и 14-й день после иммунизации и анализировали ее на присутствие в сыворотке IgM и IgG, специфичных к эритроцитам барана, с применением анализа на гемагглютинацию. Через 7 дней после иммунизации эритроцитами барана титр IgM оказывался нормальным, но ответ IgG существенно снижался у мышей, получавших LT-RIg, по сравнению с мышами, получавшими иммуноглобулин человека или забуференный фосфатом физиологический раствор (фиг. 6 А). На 14-й день после иммунизации IgG, специфичный к эритроцитам барана, все еще не обнаруживался в сыворотке мышей, получавшихLT-R-Ig, а титр IgM, специфичного к эритроцитам барана, у этих мышей также снижался более чем наполовину, по сравнению с мышами,получавшими иммуноглобулин человека или 38 забуференный фосфатом физиологический раствор (фиг. 6 А). Через 10 дней после праймирования эритроцитами барана зародышевые центры обнаруживаются в селезенках мышей, один или два раза получавших иммуноглобулин рецептора лимфотоксина, однако, количество зародышевых центров существенно снижается по сравнению с контролем (табл. 1). Если мыши получают по две инъекции иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина, первую инъекцию за неделю до праймирования эритроцитами барана, а вторую инъекцию - в день инъекции эритроцитов барана, то ингибирование ответов IgM и IgG на эритроциты барана на 7-й и 14-й день (фиг. 6 В) подобно ингибированию, обнаруживаемому в тех случаях, когда мыши получают многократные инъекции LT-R-Ig (фиг. 6 А). На 30-й день после иммунизации IgG, специфичный к эритроцитам барана, не обнаруживается, а уровень IgM снижается более чем на 80% по сравнению с контролем (фиг. 6 В). Таким образом,такие протоколы введения LT-R-Ig приводят к полному ингибированию ответов IgG, а также к сокращенному/сниженному ответу IgM относительно контроля. Если мыши получали разовую инъекцию иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина в тот же день, что и праймирование эритроцитами барана, уровень ответа IgG и IgM на эритроциты барана на 7-й день был сравним с уровнем в контрольных группах (фиг. 6 С). Однако на 24-й день после иммунизации титры IgM и IgG снижались на 30%. На 34-й день после праймирования эритроцитами барана титр IgM, специфичного к ним, снижался на 50% по сравнению с контрольными группами, а IgG, специфичного к эритроцитами барана, не обнаруживали (фиг. 6 С). Эти данные показывают, что такой протокол введения LT-R-Ig приводит к заметному сокращению/снижению уровня непрерывного ответа IgM и IgG, т.е. введение LT-R-Ig способно ингибировать уже инициированный гуморальный ответ. Заболевания, вызванные антителами Многие органоспецифичные и мультисистемные аутоиммунные состояния включают в себя ответы патологических антител. Такие состояния включают в себя миастению Gravis,аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Чагаса, болезнь Грейвса, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), системную красную волчанку, гранулематоз Вегенера,нодозный полиартрит и быстро прогрессирующий серповидный гломерулонефрит (из Benjamini et al., Immunology, A Short Course (WileyLiss, New-York, 3d ed. (1996. Несмотря на то, что этиология системной красной волчанки неизвестна, имеется достаточно сведений об иммунологическом механизме, отвечающем на наблюдаемую патологию. 39 По неизвестным причинам пациенты с системной красной волчанкой вырабатывают антитела против ядерных компонентов организма (антинуклеарные антитела явно направлены против нативной двухцепочечной ДНК). Клинически присутствие этих антител лучше всего коррелирует с почечной патологией в системной красной волчанке. Эти антитела образуют комплексы с ДНК, по всей очевидности, образующиеся в результате нарушения нормальной ткани, и,как и при любом заболевании, при котором происходит образование иммунных комплексов,такие комплексы образуют отложения, накапливаемые на базальной мембране гломерул, в стенках артериол и в синовиальном пространстве суставов. Эти комплексы активируют каскад комплементов и привлекают гранулоциты. Последующая воспалительная реакция характеризуется как гломерулонефрит, приводящий к повреждению почек и вызывающий протеинурию и гематурию. Люпус-нефрит исследовался на моделях мышей в течение нескольких десятилетий. Недавно на такой модели оценивалась терапевтическая эффективность реагента, специфичного к мышиному лиганду CD40 (Mohan et al., J. Immunol., 154, pp. 1470-1480 (1995. Было установлено, что ускорение волчаночного процесса переносом клеток, индуцирующих выработку патогенных антител in vivo, ингибируется введением моноклонального антитела, блокирующего взаимодействие лигандов CD40/CD40. Более того, краткий период лечения мышей с волчанкой антителом против лиганда CD40 оказывает продолжительное благоприятное действе на их спонтанное заболевание еще в течение долгого времени после того, как антитело выведено из системы их организма. Эксперименты показали, что патогенные В-клетки не способны вырабатывать антитело даже через 9 месяцев после терапии, что дает возможность предположить, что существует задержка экспансии аутоиммунных В-клеток памяти, приводящая к длительным положительным терапевтическим результатам. Поскольку мы показали, что реагенты,блокирующиевзаимодействиеLT//LT-R in vivo, ингибируют генерацию ответов антитела, изменяют фенотип фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, принимающих участие в оптимальной выработке В-клеток памяти, блокирующие реагенты LT//LT-R согласно изобретению могут быть использованы для лечения или профилактики системной красной волчанки. Ноpмальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также вызывает ответы антитела, которые могут стать чрезмерными и превратиться в медицинскую проблему. Одним из примеров является болезнь Чагаса, воспалительная кардиомиопатия, развивающаяся у людей и экспериментальных жи 002983cruzi. Среди возможных механизмов, участвующих в патогенезе кардиомиопатии Чагаса у людей, в последнее время существенную экспериментальную поддержку получило индуцирование сердечно-специфичных аутоиммунных ответов. Недавние исследования (Tibbetts et al.,J. Immunol., 152, pp.1493-1499 (1994 показали,что сердечные антиген-специфичные антитела вырабатываются у мышей С 57 В 1/6 с сердечным заболеванием, инфицированных T.Cruzi. После заражения бразильским штаммом T.Cruzi мыши С 57 В 1/6 развивают кардиомиопатию, гистологически похожую на кардиомиопатию, наблюдаемую в хронически инфицируемых людях. Антисыворотки этих мышей реагируют с тремя сердечными антигенами, в то время как мыши С 57 В 1/6, инфицированные штаммом GuayasT.Cruzi, не вызывающим кардиомиопатию, не вырабатывают таких антител. Эти данные показывают, что такие антитела являются специфическими маркерами кардиомиопатии. Таким образом, подобная модель грызунов может служить для оценки способности агентов, блокирующих рецептор -лимфотоксина, ингибировать нарушения, вызываемые аутоантителами. Другим примером клеточной деструкции антителами, вырабатываемыми в результате определенных инфекционных заболеваний или по неизвестным причинам, является идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP). При таком состоянии антитела против тромбоцитов приводят к их деструкции (комплементарными или фагоцитарными клетками с рецептором Fc или С 3b), что может вызвать кровотечение. Терапии, ингибирующие такие аутоиммунные реакции, вызванные антителами in vivo,такие как агенты, блокирующие рецептор лимфотоксина согласно изобретению, могут быть также использованы для лечения или профилактики этих аутоиммунных заболеваний. Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также вызывает реакции гиперчувствительности, которые могут приобрести чрезмерный характер и превратиться в медицинскую проблему. Наиболее распространенным примером гиперчувствительности I типа является аллергическая реакция. Она вызывается антителами IgE, которые связываются через свой Fc-участок с рецепторами на тучных клетках и базофилах для запуска выделения фармакологически активных агентов, вызывающих анафилаксию. Иногда считают, что идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и синдром Гудпасчера принадлежит к реакциям II типа, происходящим тогда, когда антитела IgM или IgG связываются с антигеном на поверхности клеток и активируют каскад комплемента. Тогда гранулоциты привлекаются в сайт активации, а нарушение, возникающее в результате выделения литических ферментов из 41 их гранул, приводит к разрушению клеток. Считается, что ревматоидный артрит является результатом реакции гиперчувствительности II типа, вызываемой иммунными комплексами антигена (в этом случае ревматоидным фактором является аутоантитело IgM), связывающегося с Fc-участком нормального IgG. Эти иммунные комплексы участвуют в воспалении суставов и повреждениях, характерных для этого заболевания. Поскольку эти патологии частично вызываются антителами, терапевтические агенты, ингибирующие выработку антител, такие как агенты, блокирующие рецептор лимфотоксина согласно изобретению, могут быть также использованы для лечения или профилактики этих заболеваний. Лечение с применением агентов,блокирующих рецептор -лимфотоксина Композиции согласно изобретению вводят в эффективной дозе для лечения конкретного клинического состояния. Определение предпочтительного фармацевтического состава и режима терапевтически эффективной дозы для конкретного применения зависит от квалификации специалиста, принимающего во внимание, например, состояние и массу тела пациента, степень желаемого лечения и его переносимость пациентом. Дозы, составляющие приблизительно 1 мг/кг растворимого рецептора -лимфотоксина,считаются подходящими исходными точками для оптимизации доз лечения. Терапевтически эффективная доза также может быть определена путем проведения экспериментов in vitro, устанавливающих концентрацию агента, блокирующего рецептор лимфотоксина, необходимую для покрытия клеток-мишени (рецептор -лимфотоксина или лиганд-положительные клетки лимфотоксина в зависимости от блокирующего агента) в течение 1-14 дней. Анализы по связыванию рецептора и лиганда, описанные ранее в одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г.,могут быть использованы для мониторинга реакции покрытия клеток. Рецептор -лимфотоксина или лиганд-положительные клетки лимфотоксина могут быть отделены от активированных популяций лимфоцитов с применением клеточного сортера с возбуждением флуоресценции. На основании результатов таких анализов по связыванию in vitro может быть подобран интервал подходящих концентраций агента,блокирующего рецептор -лимфотоксина, для ипытания на животных. Введение растворимых молекул рецептора-лимфотоксина, лиганда антилимфотоксина и анти-LT-R-Abs согласно изобретению, по отдельности или в сочетании, включая выделенные и очищенные формы антител или комплексов, их солей или их фармацевтически прием 002983 42 лемых производных, может быть осуществлено с применением любых общепринятых способов введения агентов, обладающих иммуносупрессивной активностью. Фармацевтические композиции, применяемые в такой терапии, также могут иметь различные формы, включающие, например, твердые, полутвердые и жидкие лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки,жидкие растворы или суспензии, суппозитории,а также растворы для инъекций и вливаний. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Способы введения могут включать пероральное, парентеральное, подкожное, внутривенное, местное введение или введение в очаг поражения. Растворимые молекулы рецептора лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и LT-R согласно изобретению, например, могут быть добавлены к стерильным изотоническим составам с кофакторами или без них, стимулирующим поглощение или стабильность. Состав предпочтительно является жидким или может представлять собой лиофилизированный порошок. Например, растворимые молекулы рецептора -лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и LT-R согласно изобретению, могут быть разбавлены буферным составом, включающим 5,0 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 2,7 мг/мл тринатрий цитрата, 41 мг/мл маннита, 1 мг/мл глицина и 1 мг/мл полисорбата 20. Этот раствор может быть лиофилизирован, сохранен в холодильнике и восстановлен перед введением водой для инъекций(USP). Композиции также предпочтительно включают известные фармацевтически приемлемые носители, широко применяемые в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Mac PublishingCompany). Такие фармацевтически приемлемые носители могут включать в себя другие лекарственные средства, носители, генетические носители, адъюванты, наполнители и т.д., такие как сывороточный альбумин человека или препараты плазмы. Композиции имеют вид разовой дозы, обычно вводимой один или несколько раз в сутки. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть также введены с использованием макрофагов, липосом, других систем доставки микрочастиц или составов пролонгированного действия, приводимых в контакт с пораженными тканями или током крови. Подходящие примеры носителей пролонгированного действия включают в себя полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, такие как суппозитории или микрокапсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы пролонгированного действия 43 включают в себя полилактиды (патент США 3773319, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата (Sidman et al.,Biopolymers, 22, pp. 547-556 (1985, поли(2:гидроксиэтилметакрилат) или этиленвинилацетат (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, pp. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, pp. 98105 (1982. Липосомы, содержащие растворимые молекулы рецептора -лимфотоксина, антитела против лиганд лимфотоксина и против LT-R согласно изобретению, отдельно или в сочетании, могут быть получены хорошо известными способами (см., например, DE 3218121; EpsteinUSA, 77, pp. 4030-4034 (1980); патенты США 4485045 и 4544545). Обычно это небольшие (около 200-800 А) однослойные липосомы,в которых содержание липидов составляет примерно более 30 мол.% холестерина. Пропорцию холестерина выбирают таким образом, чтобы контролировать оптимальный уровень выделения растворимых молекул рецептора лимфотоксина, антител против лиганда лимфотоксина и против LT-R. Растворимые молекулы рецептора лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и против LT-R Abs согласно изобретению, могут быть также прикреплены к липосомам, содержащим другие агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина, иммуносупрессивные агенты или цитокины для модулирования активности, блокирующей рецепторы лимфотоксина. Прикрепление молекул рецепторов -лимфотоксина, антител против лиганда лимфотоксина и против LT-R Abs, к липосомам может осуществляться при помощи любого известного поперечно-сшивающего агента, такого как гетеробифункциональные поперечносшивающие агенты, широко используемые для связывания токсинов или химиотерапевтических агентов с антителами для направленной доставки. Конъюгирование с липосомами может быть также осуществлено с применением карбогидрат-направленного поперечно-сшивающего реагента 4-(4-малеимидофенил)гидразида масляной кислоты (МРВН) (Duzgunes et al., J. Cell.Biochem. Abst. Suppl., 16E 77 (1992. Преимущества терапевтических композиций,включающих агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина Агенты, блокирующие рецепторы лимфотоксина согласно изобретению, способны селективно ингибировать иммуноэффекторные механизмы. Ингибирование иммунитета, вызванного антителами, осуществляется многими механизмами, включая регуляцию образования зародышевых центров путем воздействия на функцию фолликулярных дендритных клеток. Иммунитет, опосредованный как антителами, 002983 44 так и клетками, частично ингибируется путем регуляции экспрессии адрессинов, воздействующих таким образом на миграцию лимфоцитов. Таким образом, агенты, блокирующие рецепторы -лимфотоксина, могут быть использованы для лечения состояний, обостряемых действием антител или аберрантной экспрессией адрессинов. Способность селективно ингибировать такие иммуноопосредованные ответы подходит для лечения аномальных состояний,включая различные аутоиммунные и хронические воспалительные состояния. Как указано выше, лечение таких патологических иммуноопосредованных состояний обычно включает в себя применение иммуномодуляторных и иммуносупрессивных агентов,оказывающих плейотропное действие на широкий спектр типов клеток и иммунологические ответы. Обычно требуются высокие и зачастую цитотоксические дозы этих неспецифических иммуносупрессивных агентов, вызывающих побочное действие. Способность реагента, ингибирующего ответы антител, улучшать патологический иммунологический ответ подтверждается последними исследованиями люпус-нефрита у мышей. Последнее исследование показывает, что введение антитела, блокирующего путь CD40/CD40,ингибирует акселерацию люпус-нефрита, возникающего после переноса клеток, индуцирующих выработку патогенных антител in vivo,и оказывает положительное пролонгированное действие на спонтанное заболевание в течение длительного периода времени после выведения антитела из системы. Эти данные показывают,что агенты, блокирующие рецепторы лимфотоксина согласно изобретению, могут быть использованы для подавления клеточного трансплантата и трансплантата органов, ингибируя процессы, ведущие к возникновению ответов антител. Агенты, блокирующие рецепторы лимфотоксина, композиций и способов согласно изобретению могут быть модифицированы для получения желаемого уровня передачи сигналов рецепторов -лимфотоксина, в зависимости от состояния, расстройства или подвергаемого лечению заболевания. Предусматривается, что абсолютный уровень передачи сигналов рецепторов -лимфотоксина может контролироваться с помощью концентрации и аффинностей агентов, блокирующих рецепторы -лимфотоксина,по отношению к соответствующим молекулярным мишеням. Например, в одном из вариантов осуществления данного изобретения вводят композиции, включающие растворимые молекулы рецепторов -лимфотоксина. Растворимый рецептор -лимфотоксина способен эффективно конкурировать с клеточными поверхностными рецепторами -лимфотоксина за связывание по 45 верхностных лигандов лимфотоксина. Способность конкурировать с поверхностными лигандами лимфотоксина зависит от относительной концентрации растворимых и связанных с клеточной поверхностью молекул рецепторов лимфотоксина, а также от их сравнительной аффинности связывания лигандов. Растворимые молекулы рецепторов лимфотоксина, несущие мутации, повышающие или снижающие связывающую аффинность такого растворимого мутантного рецептора лимфотоксина с поверхностным лигандом лимфотоксина, могут быть построены с применением стандартных методов рекомбинантной ДНК,хорошо известных специалистам в данной области. Большое количество молекул с сайтнаправленными или случайными мутациями могут быть исследованы на активность действия в качестве агентов, блокирующих рецепторы лимфотоксина, с применением рутинных экспериментов и описываемых в данной заявке методов. Подобным образом в другом варианте осуществления данного изобретения антитела против рецептора -лимфотоксина либо одного,либо нескольких субъединиц лиганда лимфотоксина функционируют в качестве агентов,блокирующих рецепторы -лимфотоксина. Способность этих антител блокировать передачу сигналов рецепторов -лимфотоксина может быть модифицирована путем мутации, химической модификации или другими способами,способными изменить эффективную концентрацию или активность антитела, доставляемого объекту. Способность уменьшить передачу сигналов рецепторов -лимфотоксина, не ингибируя ее полностью, может оказаться важной для установления или поддержания пониженного уровня передачи сигналов рецепторов лимфотоксина, поддерживающих нормальную иммунную функцию при ингибировании слишком сильных или аномальных ответов антител или клеточно-опосредованных ответов. Разрушение гена -лимфотоксина у мышей ведет к развитию аберрантного периферического лимфоидного органа (De Togni et al.,Science, 264, pp. 703-707 (1994. У таких мышей отсутствуют лимфатические узлы, а в их селезенках отсутствует обычно четкая граница между зонами, обогащенными Т- и В-клетками, в фолликулах. Мы полагаем, что этот фенотип связан с потерей поверхностной, индуцированной лимфотоксином, передачи сигналов рецепторов -лимфотоксина, поскольку подобные фенотипы не наблюдались при модулировании активности рецепторов TNF. Таким образом,способность селективно или частично блокировать пути рецептора -лимфотоксина может быть использована при лечении аномального развития лимфоидоподобных структур, возни 002983 46 кающих в результате хронического воспаления,связанного с неправильной или избыточной экспрессией сигналов по пути рецептора лимфотоксина. Антитела являются решающими медиаторами иммунных ответов на патологические агенты. Таким образом, абсолютное ингибирование ответов антител в определенных обстоятельствах может оказаться нежелательным. Например, антитела требуются для сообщения резистентности против инфекций внеклеточными бактериями, такими как пневмококковые и гемофильные бактерии. Способность влиять на уровень антител,вырабатываемых путем блокирования передачи сигналов рецепторов -лимфотоксина, может оказаться существенной при максимизации положительных результатов, которые могут быть достигнуты при лечении агентами, блокирующими рецептор -лимфотоксина, в соответствии с данным изобретением. Терапевтические способы согласно изобретению включают в себя селективное ингибирование ответов, частично или полностью зависящих от пути -лимфотоксина. Как очевидно специалистам в данной области, конкретные случаи терапевтического применения заявленного изобретения зависят от соответствующего этиологического механизма ингибируемого процесса или от поддерживаемого желательного медицинского процесса. Таким образом, способы различных вариантов осуществления данного изобретения включают в себя введение терапевтически эффективного количества агента,блокирующего рецептор -лимфотоксина или лимфотоксин. Белки, используемые в этих способах, могут представлять собой либо полноразмерные белки, либо фрагменты белка, либо фрагменты слияния. В других вариантах осуществления данного изобретения способы включают в себя введение растворимого фрагмента,такого как растворимый рецептор лимфотоксина. В других предпочтительных вариантах осуществления данное изобретение относится к введению антител против рецептора-лимфотоксина или против -лимфотоксина. Блокирующие агенты в соответствии с данным изобретением могут вводиться вместе с терапевтически эффективным количеством второго соединения, оказывающего положительное медицинское действие. Например, в соответствии с некоторыми способами лечения СПИД и/или ВИЧ-инфекции может оказаться желательным совместное введение дополнительных известных антивирусных агентов, например AЗT или ингибиторов протеазы. Особенно предпочтительным может оказаться введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением, более предпочтительно белка слияния LT-R/IgG в сочетании с "коктейльной" терапией СПИД. Такие 47 лекарственные "коктейли" включают в себя введение пациенту нескольких лекарственных препаратов для снижения количества вирусов в системе организма пациента. Композиции согласно изобретению могут быть составлены в соответствии со стандартной практикой, например, с применением носителя. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько органических или неорганических ингредиентов, натуральных или синтетических, которые могут облегчить введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением пациенту. Подходящие носители известны специалистам в данной области. Любая из композиций в соответствии с данным изобретением может быть введена любым медицински приемлемым способом. Такие способы включают в себя парентеральные инъекции, такие как внутривенные, внутрисосудистые, внутриартериальные, подкожные, внутримышечные, внутриопухолевые, внутрибрюшинные, интраэнтрикулярные, интраэпидуральные и прочие инъекции, а также пероральные, назальные, глазные, ректальные или местные инъекции. Введение препаратов с пролонгированным действием также входит в состав данного изобретения, например b-средства, такие как вещества замедленного всасывания или имплантаты. Также может возникнуть необходимость в локализованной доставке. Способы введения легко определяются специалистами в данной области. Агенты, блокирующие путь лимфотоксина,используемые в заявляемом изобретении, включают в себя функциональные производные растворимого рецептора -лимфотоксина, а также антитела, заявленные в данном описании. Функциональные производные включают в себя фрагменты, варианты, аналоги или химические производные молекулы. Подразумевается, что фрагмент молекулы, такой как любой из антигенов согласно изобретению, вырастает в любой полипептидной субпопуляции молекулы. Подразумевается, что вариант такой молекулы относится к естественной молекуле, по существу,подобной либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Аналог молекулы означает искусственную молекулу, существенно подобную либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Варианты блокирующих агентов согласно изобретению отличаются от естественных агентов аминокислотной последовательностью или другими особенностями, либо тем и другим. Варианты аминокислотной последовательности образуются тогда, когда одна или несколько аминокислот в естественных молекулах замещена другой естественной аминокислотой, ее производным или ненативной аминокислотой. Особенно предпочтительные варианты включают в себя естественные белки или биологически активные фрагменты естественных белков, по 002983 48 следовательности которых отличаются от последовательности дикого типа одним или несколькими консервативными заместителями аминокислоты. Такие замены хорошо известны специалистам в данной области и обычно оказывают минимальное влияние на вторичную структуру и гидрофобную природу блокирующего агента. В соответствии с другими вариантами воплощения данного изобретения варианты с менее консервативными заменами аминокислот могут также привести к желаемым производным, например путем осуществления решающих изменений, конформации и других биологических свойств. Такие замены включают в себя, например, замену гидрофильных остатков на гидрофобные остатки, замену цистеина или линии prot (protline) на другой остаток, замену остатка с небольшой боковой цепью на остаток с большой боковой цепью, или замену остатка,имеющего чистый положительный заряд, на остаток, имеющий отрицательный заряд. Если результат какой-либо замены не может быть предсказан с достаточной определенностью,производные могут быть легко проанализированы в соответствии с описываемыми в данной спецификации способами определения отсутствия или наличия желаемых свойств. Варианты, входящие в состав данного изобретения, включают в себя белки и пептиды с аминокислотными последовательностями,имеющими, по меньшей мере, 80% гомологию с блокирующими агентами согласно изобретению. Более предпочтительно гомология последовательностей составляет, по меньшей мере,90% или, по меньшей мере, 95%. С целью определения гомологии следует указать, что длина сравниваемых последовательностей в целом составляет, по меньшей мере, 8 аминокислотных остатков, обычно, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков. Варианты, входящие в состав данного изобретения, также включают в себя любой блокирующий агент, который 1) имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 40% гомологичную последовательности блокирующего агента, а также который 2) после оптимального выравнивания с последовательностью блокирующего агента согласно изобретению имеет, по меньшей мере,80% своих цистеиновых остатков, выравненных с цистеинами блокирующего агента согласно изобретению. В объем данного изобретения также входят агенты, специфически связывающиеся с блокирующими агентами в соответствии с настоящим изобретением, включая лиганды и антитела. Нижеследующие примеры иллюстрируют растворимые рецепторы -лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и антитела против рецептора -лимфотоксина согласно изобретению, а также способы, используемые 49 для их характеристики. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие: они приводятся с целью иллюстрации, а настоящее изобретение ограничивается только формулой изобретения. Пример 1. Получение растворимых рецепторов -лимфотоксина человека в виде белков слияния Fc-иммуноглобулина. Последовательность клона кДНК человека,выделенная из библиотеки транскрибированных последовательностей 12 р человека, полученных из соматического клеточного гибрида (Baens etal., Genomics, 16, pp. 214-218 (1993, была помещена в банк данных GenBank и позднее идентифицирована как последовательность, кодирующая рецептор -лимфотоксина человека. Последовательность этого клона кДНК рецептора -лимфотоксина человека полной длины может быть получена, начиная с 1992 г., в банке данных GenBank как позиция L04270. Внеклеточный домен рецептора лимфотоксина вплоть до трансмембранного участка (фиг. 1) амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции из клона кДНК,используя праймеры, помещающие сайты фермента рестрикции NotI и SalI на концы 5'-и 3'-,соответственно (Browning et al., J. Immunol.,154, pp.33-46 (1995. Амплифицированный продукт разрезают с помощью NotI и SalI, очищают и лигируют в вектор pMDR901, линеаризованный NotI вместе с фрагментом SalI-NotI,кодирующим участок Fc-IgG1 человека. Полученный вектор содержит ген дигидрофолатредуктазы и белок слияния иммуноглобулина рецептора -лимфотоксина, направляемые отдельными промоторами. Вектор электропорировали в клетки dhfrCHO (яичников китайского хомячка), а клоны,резистентные к метотрексату, выделяли с использованием стандартных процедур. LT-R-Ig секретировался в среду и для отбора клеточных линий, вырабатывающих самый высокий уровень белка слияния рецептора, применяли методELISA. Высокопроизводительную клеточную линию выращивали до больших объемов, а культуральную среду собирали. Чистый белок слияния рецептора -лимфотоксина выделяли с помощью высокоскоростной аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Pharmacia). Пример 2. Получение растворимых рецепторов -лимфотоксина мышей в виде слитых белков иммуноглобулина. Полный клон кДНК рецептора -лимфотоксина мышей получают путем лигирования фрагментов 5'-NotI/ApaLI и 3-ApaLI/NotI из двух частичных изолятов кДНК в сайт NotIpCDNK3 (InVitrogen, San Diego, CA). Последовательность этого клона кДНК доступна в банке данных под кодом U29173. При сравнении с другой последовательностью рецептора лимфотоксина мышей в банке данных под ко 002983 50 дом L38423 не было обнаружено никаких различий между кодирующими последовательностями. Растворимый рецептор -лимфотоксина мышей и слитой белок IgG1 человека получали путем амплификации полимеразной цепной реакции клона кДНК рецептора mLT-R полной длины в виде матрицы и праймеров 5' AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC 3' и 5' Амплифицированный продукт очищали и разрезали с помощью NotI и SalI, а также лигировали с помощью фрагмента Fc-IgG1 человекаSalI/NotI в линеаризованный NotI и обработанный фосфатазой SAB132 для получения JLB 122. Для устойчивой экспрессии кассету NotI,содержащую фрагмент мышиного LT-R-Ig переносили в сайт NotI pMDR901, получая(1995). Клоны клеток, секретирующие мышиный LT-R-Ig идентифицировали с помощью метода ELISA. Очищенный слитой белок рецептора выделяли из супернатантов клеток СНО(яичников китайского хомячка) с применением высокоскоростной аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Pharmacia) и использовали в следующих примерах. Пример 3. Иммуногистохимический анализ селезенки после многократного инъецирования мышей LT-R-Ig. Мыши в возрасте 4-5 недель получали по 6 инъекций (по одной в неделю) LT-R-Ig или иммуноглобулина 3-LFA (100 мкг внутрибрюшинно) и иммунизацию эритроцитами барана на шестой инъекции слитого белка. Затем мыши пролучали дополнительную инъекцию LT-R-Ig или иммуноглобулина 3-LFA на 4-й день после стимулирования эритроцитами барана. Животных умерщвляли на 10-й день после стимулирования эритроцитами барана, а органы забирали для анализа структуры. Левая колонка фиг. 2 показывает срезы селезенки от животных, получавших иммуноглобулин 3-LFA (А, С, Е, G, I), а правая колонка - от животных, получавшихLT-R-Ig (В, D, F, H, J). Зафиксированные в ацетоне замороженные срезы селезенки дважды окрашивали биотинилированными антителами против мышиных меченых В 220 и мышиныхCD4 (А и В), а затем подвергали соответствующему второму окрашиванию щелочным, меченым фосфатазой, стрептавидином (темная фиолетово-синяя окраска) и меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином (светло-коричневая окраска) соответственно. Другой набор замороженных срезов окрашивали ЕR-ТR-9 (для выявления макрофагов маргинальных зон, С и D), МОМА-1 (для выявления металлофильных макрофагов Е и F),МЕСА-367 (специфичного к MAdCAM-1, G и 51 Н), а также антителами ER-TR-7 (для окрашивания ретикулярных фибробластов, I и J), а затем проводили второе окрашивание меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином (коричневая окраска). Эти снимки показывают характерное окрашивание срезов, как минимум, от 6 животных при 10 х увеличении. Пример 4. Действие LT-R-Ig и лиганда анти-СD40 на образование зародышевых центров и окрашивание фолликулярных дендритных клеток. Животным вводили LT-R-Ig или иммуноглобулин 3-LFA. Другой группе животных вводили MR1 (антимышиный лиганд CD40, 250 мкг/инъекцию, внутрибрюшинно в -1-й, на 1-й и 3-й день, эритроциты барана на 0-й день и умерщвляли на 10-й день. Фиксированные в ацетоне срезы селезенки животных, получавшихIg-3-LFA (фиг. 3, левая колонка, А и D), LT-RIg (средняя колонка, В и Е), MR1 (правая колонка, С и F) окрашивали меченым биотином арахисовым агглютинином (верхний ряд, А, В и С) или FDC-M1 (нижний ряд, D, Е и F), а затем второй раз окрашивали меченым пероксидазой хрена стрептавидином и меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином, соответственно (коричневая окраска). Окрашивание арахисовым агглютинином маргинальной зоны указано стрелками в А и С. Образование зародышевых центров показано белой звездочкой в А. Окрашивание фолликулярных дендритных клеток показано черными стрелками в D и F. Эти снимки показывают характерное окрашивание срезов, как минимум, от 4 животных при 10 х увеличении. Пример 5. Экспрессия адрессина в лимфатических узлах мышей, получавших LT-R-Ig внутриутробно и непрерывно после рождения. В этих экспериментах использовали потомство мышей Balb/c с одинаковым сроком беременности, которым внутривенно вводили на 14-й и 17-й день беременности по 200 мкг белков рецептор-иммуноглобулин. После рождения потомству один раз в неделю интраперитонеально вводили по 100 мкг LT-R-Ig, TNFR55-Ig или LFA-3-Ig. Как показали методомELISA (данные не приведены), содержание слитого белка оставалось на уровне или выше 10 мкг/мл на протяжении всей жизни. Фиг. 4: панели А, В, G и Н: окрашивание лимфатических узлов мышей, получавших LT-R-Ig; панели С иD: окрашивание лимфатических узлов мышей,получавших LFA-3-Ig; панели Е и F: окрашивание лимфатических узлов мышей, получавшихTNF-R55-Ig. Панели А, С, Е и G представляют собой мезентериальные лимфатические узлы,окрашенные антителом МЕСА 367 для выявления адрессина слизистой, MAdCAM-1. Панели В, D, F и Н представляют собой периферические 52 антителом МЕСА 79, специфичным к периферическим адрессинам лимфатических узлов(PNAds). Панели G и Н представляют собой лимфатические узлы мышей в возрасте 6 недель, получавших LT-R-Ig только внутриутробно. Все изображения имеют 50 х увеличение. Пример 6. Расположение лимфоцитов и экспрессия маркеров макрофагов в лимфатических узлах мышей, получавших LT-R-Ig внутриутробно и непрерывно после рождения. Мыши получали LT-R-Ig, TNF-R55-Ig или LFA-3-Ig внутриутробно и непрерывно после рождения, как описано в примере 5. Затем участки лимфатических узлов окрашивали антителами, специфичными к маркерам, экспрессируемым макрофагами, или mAbs, специфичными к маркеру В 220 В-клеток и к маркеру CD4 Т-клеток. Для идентификации областей наложения зон Т- и В-клеток проводили анализ изображений. Фиг. 5: панели A, D и G представляют собой окрашивание B220/CD4 лимфатических узлов мышей, получавших LT-R-Ig, иммуноглобулин LFA-3 и иммуноглобулин TNFR55 соответственно. Флуоресцентные изображения анализировали с применением математического анализа изображений. Панели В, Е и Н показывают окрашивание сиалоадгезина, а панели С, F и I показывают окрашивание МОМА 1. Пример 7. Действие инъекций LT-R-Ig на ответ антител на эритроциты барана. Мышей Balb/c инъецировали LT-R-Ig,иммуноглобулином человека или забуференным фосфатом физиологическим раствором следующим образом. Фиг. 6 А: мыши получали по 6 инъекций, как указано в описании к фиг. 2,пример 3. Животным пускали кровь на 7-й день(черные столбики) и на 14-й день (полосатые столбики) после иммунизации эритроцитами барана. 6 В: животные получали слитые белки на-7-й день и 0-й день. Эритроциты барана вводили на 0-й день и животным делали кровопускание на 7-й день (черные столбики), 14-й день(полосатые столбики) и на 30-й день (белые столбики). 6 С: животные получали белки слияния один раз в 0-й день, одновременно с иммунизацией эритроцитами барана. Кровь собирали на 7-й день (черные столбики), 14-й день (полосатые столбики) и 34-й день (серые столбики). Титры IgM и IgG, специфичных к эритроцитам барана, определяли путем анализа сыворотки в исследованиях на гемагглютинацию. Титр определяли как величину, обратную последнему разбавлению сыворотки, в котором определяли гемагглютинацию и представляли в виде логарифма по основанию 2 (1 = разбавлению сыворотки 1/15). Результаты представлены в виде средней величины, полученной от четырех различных животных на группу со стандартным отклонением. 53 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ изменения гуморального иммунного ответа у животного, включающий в себя стадию введения фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, блокирующего рецептор-лимфотоксина. 2. Способ по п.1, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, выбран из группы,состоящей из растворимого рецептора лимфотоксина, антитела против рецептора лимфотоксина, антитела против поверхностного лиганда лимфотоксина и антитела против лимфотоксина. 3. Способ по п.1, где животное является млекопитающим. 4. Способ по п.3, где млекопитающее является человеком. 5. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, содержит растворимый рецептор -лимфотоксина, имеющий лиганд-связывающий домен, способный селективно связываться с поверхностным лигандом лимфотоксина. 6. Способ по п.5, где растворимый рецептор -лимфотоксина содержит Fc-домен иммуноглобулина человека. 7. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, содержит моноклональное антитело против рецептора лимфотоксина. 8. Способ по п.7, где композицию вводят на период приблизительно от 1 до 14 дней. 54 9. Способ по п.7, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, содержит mAb BDA8 против рецептора -лимфотоксина человека. 10. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, содержит моноклональное антитело против поверхностного лиганда -лимфотоксина. 11. Способ по п.10, где композицию вводят на период приблизительно от 1 до 14 дней. 12. Способ по п.10, где антитело направлено против субъединицы лиганда лимфотоксина. 13. Способ по п.10, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, представляет собой mAb B9 против -лимфотоксина человека. 14. Способ по п.10, где агент, блокирующий рецептор -лимфотоксина, представляет собой моноклональное антитело против мышиного поверхностного лиганда лимфотоксина. 15. Способ по п.1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или адъювант. 16. Способ по п.1, согласно которому гуморальный иммунный ответ ингибируется. 17. Способ по п.1, согласно которому указанное животное инфицировано вирусом иммунодефицита человека. 18. Способ по п.17, дополнительно включающий введение противовирусного агента.