Гетеродимерные связывающие белки и их применение

ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к полипептидным гетеродимерам, образованным из двух различных одноцепочечных полипептидов слияния в результате естественной гетеродимеризации участка СН 1 иммуноглобулина и константного участка легкой цепи иммуноглобулина (CL). Полипептидный гетеродимер включает два или более доменов связывания, которые специфически связывают одну или более мишеней (например, рецептор). Кроме того, обе цепи гетеродимера дополнительно включают фрагмент участка Fc. Данное изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам и способам получения полипептидных гетеродимеров, а также способам применения таких полипептидных гетеродимеров, например, для обеспечения направленной активации Т-клеток, ингибирования роста солидной злокачественной опухоли и лечения аутоиммунных или воспалительных состояний.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭМЕРДЖЕНТ ПРОДАКТ ДИВЕЛОПМЕНТ СИЭТЛ, ЛЛС (US) Перекрестная ссылка(-и) на родственную заявку(-и) Данная заявка испрашивает приоритет согласно статье 35 Кодекса США 119(е) временной заявки на патент США No. 61/290840 от 29 декабря 2009 г. и временной заявки на патент США No. 61/365266 от 16 июля 2010, каждая из которых включена в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки. Заявление о перечне последовательностей Перечень последовательностей, связанный с данной заявкой, представлен в текстовом формате в виде бумажной копии и включен в текст данной заявки в виде ссылки. Название текстового файла, содержащего перечень последовательностей, следующее: 910180422PCSEQUENCELISTING.txt. Текстовый файл имеет размер 839 кБ, был создан 29 декабря 2010 г. и предоставлен в электронном виде посредством EFS-Web, соответствуя тексту данной заявки. Уровень техники Область техники. Данное изобретение описывает полипептидные гетеродимеры, содержащие их композиции и способы получения и использования таких полипептидных гетеродимеров. Более конкретно, описанные здесь полипептидные гетеродимеры образованы, частично, путем естественной гетеродимеризации между участком иммуноглобулина СН 1 и константным участком легкой цепи иммуноглобулина (CL). Кроме того, описанные здесь полипептидные гетеродимеры включают два или более связывающих домена, которые связываются специфическим образом с одним или несколькими мишенями. Более того, одноцепочечные полипептиды полипептидных гетеродимеров, описанных в тексте данной заявки, включают часть участка Fc (например, домены СН 2 и СН 3 иммуноглобулина). Описание аналогов. Процесс передачи сигнала часто включает белки-рецепторы, которые имеют внеклеточные домены,трансмембранные домены и внутриклеточные домены. Во время связывания лиганда молекулы рецептора клеточной поверхности часто олигомеризуются или мультимеризуются (также указывается как образование "перекрестной связи") для эффективной передачи сигнала внутриклеточному компартменту клетки. Стимуляция или блокада такого взаимодействия между рецептором и лигандом или последующая олигомеризация или мультимеризация рецептора имеет важное терапевтические влияние на целый ряд заболеваний. Типичные молекулы, используемые в модуляции взаимодействия рецептора и лиганда, включают антитела или молекулы, полученные из антител. Например, антитело или его производное может функционировать в качестве антагониста рецептора, который связывается с рецептором клеточной поверхности и инактивирует его путем блокирования сайта связывания активирующего лиганда или предотвращения димеризации или мультимеризации рецептора, необходимых для активации. В других определенных случаях антитело или его производное может функционировать в качестве агониста путем связывания и образования перекрестных связей с множеством мембранных рецепторов, имитируя функцию естественного лиганда. Другой пример представлен производным биспецифического антитела, которое может использоваться для направления цитотоксических агентов или иммунных эффекторных клеток к сайтам мишеней, таких как опухоли. Биспецифические антитела представлены молекулами на основе антитела, которые могут одновременно связываться с двумя отдельными и различными антигенами (или разными антигенными детерминантами одного и того же антигена). Один из способов применения биспецифических антител состоял в перенаправлении цитотоксических иммунных эффекторных клеток для повышения гибели опухолевых клеток путем антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). В этом контексте одна часть биспецифического антитела связывается с антигеном на опухолевой клетке, и другая часть связывается с детерминантой, экспрессируемой на эффекторных клетках. Путем образования перекрестной связи с опухолевыми и эффекторными связями биспецифическое антитело не только образовывает непосредственную близость между эффекторными клетками и опухолевыми клетками, но также одновременно запускает их активацию, приводя к эффективной гибели опухолевых клеток. Биспецифические антитела также использовали для обогащения химио- или радиотерапевтических агентов в опухолевых тканях для сведения к минимуму губительных эффектов в здоровой ткани. В данном случае один участок биспецифического антитела связывается с антигеном, экспрессируемым на клетке-мишени, намеченной для разрушения, и другая часть несет химиотерапевтический препарат, радиоизотоп или токсин. Основное препятствие в общей разработке биспецифических антител состояло в трудности получения материалов достаточного качества и количества для доклинических и клинических исследований. Изначально основной путь получения биспецифических антител состоял в коэкспрессии обеих легких цепей и обеих тяжелых цепей двух исходных антител с различной специфичностью в одной клетке. Однако требуемые биспецифические антитела с необходимой специфичностью связывания получают в небольшом количестве, и очистка от других продуктов очень затруднена. Другой традиционный способ получения биспецифического антитела представлен химической конъюгацией двух антител или их фрагментов, имеющих различную специфичность. Однако этот способ также осложнен, и процесс химической модификации может инактивировать антитело или способствовать агрегации. Принимая во внимание, что очистка от нежелательных продуктов остается затруднительной, получаемый низкий выход и плохое качество биспецифического антитела делают данный процесс неподходящим для широкомасштабного производства, необходимого для клинической разработки. До недавнего времени для улучшения производства биспецифических антител использовали различные способы гетеродимеризации. Однако слияние простых доменов гетеродимеризации, таких как биспиральных Jun/Fos с доменами scFv, приводит к образованию смеси гомо- и гетеродимеров и требует раскручивания (de Kruif and Logtenberg, J. Biol. Chem. 271: 7630-4, 1996). Слияние фрагментов scFv с целыми антителами также использовали в качестве способа димеризации (Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). Однако такое слияние приводило к образованию большой молекулы с плохими способностями проникновения в солидную ткань. Слияние двух фрагментов scFv использовали для получения биспецифических белков (например, антитела BITE, полученные Micromet Inc., Bethesda, MD,патент США No. 7635472). Однако такие белки не содержат участки Fc, и, следовательно, невозможно манипулировать их активностью посредством участков Fc. Кроме того, такие белки небольшие (55 кДа) и имеют относительно короткое время полужизни в сыворотке. На сегодняшний день способ слияния иммуноглобулинов не предоставил коммерчески подходящих гетеродимерных белков или способов для их получения. Таким образом, в науке сохраняется потребность в альтернативных мультиспецифических гетеродимерных белках, а также эффективных способах их получения. Сущность изобретения Данное изобретение описывает полипептидные гетеродимеры, образованные между двумя различными одноцепочечными полипептидами посредством естественной гетеродимеризации участка СН 1 иммуноглобулина и константного участка легкой цепи иммуноглобулина (CL). Данное изобретение также описывает нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения полипептидных гетеродимеров, а также способы использования таких полипептидных гетеродимеров, таких как направленная активация Т-клеток, ингибирование роста солидной злокачественной опухоли, лечение аутоиммунных или воспалительных состояний или лечение нарушений или заболеваний, ассоциированных с Вклетками. Один из аспектов настоящего изобретения относится к полипептидному гетеродимеру, включающему (а) первый одноцепочечный полипептид (SCP-I), включающий от одного до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от одной до четырех мишеней, шарнирный участок (H-I),домен гетеродимеризации иммуноглобулина (HD-I) и фрагмент участка Fc (FRP-I); и (б) первый одноцепочечный полипептид (SCP-II), включающий от нуля до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от нуля до четырех мишеней, шарнирный участок (Н-II), домен гетеродимеризации иммуноглобулина (HD-II) и фрагмент участка Fc (FRP-II); при этом (i) иммуноглобулин HD-I и иммуноглобулин HD-II преимущественно связываются друг с другом для образования полипептидного гетеродимера, включающего SCP-I и SCP-II, и (1) домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок иммуноглобулина СН 1, и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HD-II) включает первый участокCL иммуноглобулина, или (2) домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок CL иммуноглобулина, и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HD-II) включает первый участок иммуноглобулина СН 1; и (ii) фрагмент участка Fc SCP-I и фрагмент участка Fc SCP-II включают домены СН 2 и СН 3 иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, или любую их комбинацию; один или два домена СНЗ иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM или любую их комбинацию; или домены СН 3 и СН 4 иммуноглобулинов IgE, IgM, или любую их комбинацию, при условии, что полипептидный гетеродимер включает по меньшей мере два связывающих домена, которые специфически связываются с мишенью, например по меньшей мере двумя различными мишенями. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие домены полипептидных гетеродимеров представлены одноцепочечными полипептидами Fv (scFv). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает два связывающих домена (BD1 и BD2). В одном варианте осуществления изобретения два связывающих домена(BD1 и BD2) находятся на первом одноцепочечном полипептиде (SCP-I), при этом HD-I и FRP-I расположены между BD1 и BD2. В другом варианте осуществления изобретения первый связывающий домен(BD1) расположен на первом одноцепочечном полипептиде (SCP-I), и второй связывающий домен (BD2) представлен на втором одноцепочечном полипептиде (SCP-II). Например, первый связывающий домен(BD1) может быть расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I), и второй связывающий домен (BD2) может быть расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II). В альтернативном варианте первый связывающий домен (BD1) может быть расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I), и второй связывающий домен (BD2) может быть расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II). Еще с другой стороны, первый связывающий домен(BD1) может быть расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc первого од-2 023674 ноцепочечного полипептида (FRP-I), и второй связывающий домен (BD2) может быть расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает три связывающих домена (BD1, BD2 и BD3). В одном варианте осуществления изобретения HD-I и FRP-I расположены между BD1 и BD2, и третий связывающий домен (BD3) расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II). В альтернативном варианте осуществления изобретения HD-I и FRP-I расположены между BD1 и BD2, и третий связывающий домен (BD3) расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает четыре связывающих домена (BD1, BD2, BD3 и BD4). Например, HD-I и FRP-I могут быть расположены междуBD1 и BD2, и HD-II и FRP-II могут быть расположены между BD3 и BD4. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает от пяти до восьми связывающих доменов (например, 5, 6, 7 или 8 связывающих доменов). В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один связывающий домен полипептидных гетеродимеров, описанных в тексте данной заявки, специфически связывает или является антагонистом TCR, TCR, CD3, CD3, CD3, CD28, CD79b, гиперИЛ-6, моноИЛ-10, CD86, CD20,PSMA, CD19, HLA-DR, Ron, c-Met, CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR,EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, ангиопоэтина 2, CD64,CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22,CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, ФНО, ИЛ-6, гиперИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-1, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-17 А/С, IP-10,ИФН, ИФН, RANKL, FASL, ТФр, ИЛ-10, ИЛ-17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, ГЦФР, MSP,ЭФР (включая эпирегулин, херрегулин, -регулин, нейрегулин), HIF-1, VEGFA, VEGFB, VEGFC,VEGFD, ФНО, Wnt, sHH, ТФр, PDGF, TWEAK, ЕрСАМ, СЕА, РСТА-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM(CD166), EphA2, CD151, СА-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2,MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, ХГч, Lewis-Y, ганглиозид GD3, 9-O-Acetyl-GD3, GM2, Globo Н, фукозил GM1, поли SA, GD2, карбоангидразы IX (MN/CAIX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1,плазмоклеточного антигена, (связанный с мембраной) IgE, протеогликана хондроитинсульфата меланомы (MCSP), CCR8, предшественника ФНО-альфа, STEAP, мезотелина, антигена А 33, антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA), Ly-6; десмоглеина 4, неоэпитопа Е-кадхерина, рецептора ацетилхолина плода, CD25, маркера СА 19-9, маркера СА-125 и рецептора мюллерова ингибирующего вещества (MIS) тип II, sTn (сиалированный антиген Tn; TAG-72), FAP (антиген активации фибробластов), эндосиалина, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, IGF1R, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, ИЛ-6R, gp130,TNFR2, OSMR, Patched-1, Frizzled, Robo1, CD80, CD81, CD86, OX40, CD40, CD137, LIFRP, TLR7 илиTLR9. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один связывающий домен полипептидных гетеродимеров представлен агонистом ИЛ-10, HLA-G, ГЦФР, ИЛ-35, PD-1, BTLA,TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR или FAS. В некоторых описанных здесь полипептидных гетеродимерах по меньшей мере один связывающий домен специфически связывается с комплексом TCR или его компонентом, и по меньшей мере другой связывающий домен специфически связывается с PSMA, CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, RON, c-Met или СЕАСАМ-6. В других некоторых описанных здесь полипептидных гетеродимерах по меньшей мере один связывающий домен специфически связывается с CD28, и по меньшей мере другой связывающий домен специфически связывается с или является антагонистом CD79b, гиперИЛ-6, PDL2, моноИЛ-10, CD86,LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, HVEM или LTBR. В других некоторых описанных здесь полипептидных гетеродимерах по меньшей мере один связывающий домен специфически связывается с CD28, и по меньшей мере другой связывающий домен является агонистом ИЛ-10, HLA-G, ГЦФР, ИЛ-35, PD-1 или BTLA. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок иммуноглобулина СН 1, и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HD-II) включает первый участок CL иммуноглобулина. В одном варианте осуществления изобретения первый участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый участок CL расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида. В другом варианте осуществления изобретения первый участок СН 1 расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый участок CL расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участкаFc второго одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок иммуноглобулина СН 1, и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HD-II) включает первый участок CL иммуноглобулина, первый одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок СН 1, и второй одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок CL, и второй участок СН 1 первого одноцепочечного полипептида и второй участок CL второго одноцепочечного полипептида в полипептидном гетеродимере связываются между собой. Например,фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида может быть расположен между первым и вторым участками СН 1, и второй фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида может быть расположен между первым и вторым участками CL. В альтернативном варианте и первый, и второй участки СН 1 могут быть расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и как первый, так и второй участки CL могут быть расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида. Еще с другой стороны, оба первый и второй участки СН 1 могут быть расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый и второй участки CL могут быть расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида. В некоторых других вариантах осуществления изобретения, в которых домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок иммуноглобулина СН 1, и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HDII) включает первый участок CL иммуноглобулина, первый одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок CL, и второй одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок СН 1, и второй участок CL первого одноцепочечного полипептида и второй участок СН 1 второго одноцепочечного полипептида в полипептидном гетеродимере связываются между собой. Например, в одном варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc и второй участок CL расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc и второй участок СН 1 расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc. В другом варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc и второй участок CL расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc и второй участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc. В еще одном варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 и второй участок CL расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc, и первый участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно второго участка CL; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL и второй участок СН 1 расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc, и первый участок CL расположен ближе к амино-концу относительно второго участка СН 1. В еще одном варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 и второй участок CL расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc, и второй участок CL расположен ближе к амино-концу относительно первого участка СН 1; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL и второй участок СН 1 расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc, и второй участок СН 1 расположен ближе к аминоконцу относительно первого участка CL. В дополнительном варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 и второй участок CL расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc, и первый участок СН 1 расположен ближе к аминоконцу относительно второго участка CL; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL и второй участок СН 1 расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc, и первый участок CL расположен ближе к амино-концу относительно второго участка СН 1. В другом варианте осуществления изобретения в первом одноцепочечном полипептиде первый участок СН 1 и второй участок CL расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc, и второй участокCL расположен ближе к амино-концу относительно первого участка СН 1; и во втором одноцепочечном полипептиде первый участок CL и второй участок СН 1 расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc, и второй участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно первого участка CL. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина первого одноцепочечного полипептида (HD-I) включает первый участок CL иммуноглобулина и домен гетеродимеризации иммуноглобулина второго одноцепочечного полипептида (HD-II) включает первый участок иммуноглобулина СН 1. В одном варианте осуществления изобретения первый участок CL расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый участок СН 1 расположен ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида В другом варианте осуществления изобретения первый участок CL расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного по-4 023674 липептида, и первый участок СН 1 расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участкаFc второго одноцепочечного полипептида В еще одном варианте осуществления изобретения первый одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок CL и второй одноцепочечный полипептид дополнительно включает второй участок СН 1, и второй участок CL первого одноцепочечного полипептида и второй участок СН 1 второго одноцепочечного полипептида связаны друг с другом в полипептидном гетеродимере. Например, фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида может быть расположен между первым и вторым участками CL, и второй фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида может быть расположен между первым и вторым участками СН 1. В альтернативном варианте оба, первый и второй участки CL, могут быть расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый и второй участки СН 1 могут быть расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида. Еще с другой стороны, оба, первый и второй участки CL, могут быть расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc первого одноцепочечного полипептида, и первый и второй участки СН 1 могут быть расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc второго одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый участок CL представлен участком С. В других вариантах осуществления изобретения первый участок CL представлен участком С. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй участок CL представлен участком С. В других вариантах осуществления изобретения второй участок CL представлен участком С. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Ск представлен участком С иммуноглобулина человека дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С представлен измененным участком С иммуноглобулина человека с одной или более заменами аминокислот в участке С человека дикого типа в положениях N29, N30, Q52, V55, Т 56, Т 56, S68 или Т 70. Например,замена одной или более аминокислот моут быть выбраны из Ала (A), Арг (R), Трп (W), Тир (Y), Глу (Е),Глн (Q), Лиз (K), Асп (D), Мет (М), Сер (S) и Фен (F). В некоторых вариантах осуществления изобретения участок СН 1 представлен измененным участком СН 1 иммуноглобулина человека, включающим замену аминокислот, в результате которой Вал (V) в положении 68 заменен на Лиз (K), Арг (R) или Гис (Н), и при этом участок С представлен измененным участком С иммуноглобулина человека, включающим аминокислотную замену, в результате которой Лей (L) в положении 27 заменен Асп (D) или Глу (Е). В других некоторых вариантах осуществления изобретения участок СН 1 представлен измененным участком СН 1 иммуноглобулина человека, включающего аминокислотную замену, в результате которой Вал (V) в положении 68 заменен на Асп (D) или Глу(Е), и при этом участок С представлен измененным участком С иммуноглобулина человека, включающим аминокислотную замену, в результате которой Лей (L) в положении 27 заменен Лиз (K), Арг (R) или Гис (Н). В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С представлен участком С иммуноглобулина человека дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый участок СН 1 или второй участок СН 1,если присутствует, представлен участком СН 1 иммуноглобулина человека дикого типа, таким как участок CH1 IgG1 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый участок СН 1 или второй участок СН 1,если присутствует, такой как измененный участок CH1 IgG1 человека, в котором цистеин участка СН 1 иммуноглобулина человека дикого типа, который участвует в образовании дисульфидной связи с участком CL иммуноглобулина дикого типа удален или заменен. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С представлен измененным участком С иммуноглобулина человека, таким как участок С иммуноглобулина человека дикого типа, в котором остаток цистеина, который участвует в образовании дисульфидной связи участком СН 1 иммуноглобулина человека дикого типа, удален или заменен. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С представлен измененным участком С иммуноглобулина человека, таким как участок С иммуноглобулина человека дикого типа, в котором остаток цистеина, который участвует в образовании дисульфидной связи с участком СН 1 иммуноглобулина человека дикого типа, удален или заменен. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый участок СН 1 и второй участок СН 1, если присутствует, представлен полипептидом, включающим SEQ ID NO:114, 844 или 845. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С, если присутствует, выбран из любого из полипептидов, включающих SEQ ID NO:141-178, 202 и 838-843. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок С, если присутствует, представляет собой полипептид, включающий SEQ ID NO: 140. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I) и фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II) каждый включает домен СН 2 иммуноглобулина, такой как домен СН 2 IgG1, или домен СН 2 IgG2, IgG3, IgG4,IgA1, IgA2 или IgD. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I) и фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II) каждый включает домен СН 3 иммуноглобулина, такой как домен СН 3 IgG1, или домен СН 2 IgG2, IgG3, IgG4,IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I) и фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II) каждый включает домен СН 2 иммуноглобулина и домен СН 3 иммуноглобулина, такие как домены СН 2 и СН 3IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc включает домен СН 3 иммуноглобулина, который расположен в направлении амино-конца непосредственно за доменом гетеродимеризации иммуноглобулина (например, доменом СН 1 или доменом С), домен СН 3 иммуноглобулина связан с доменом СН 1, непосредственно в направлении карбокси-конца относительно СН 3 иммуноглобулина в один одноцепочечный полипептид посредством пептида, включающего SEQ ID NO:846, 847,848 или 849; и домен СН 3 иммуноглобулина связан с доменом С непосредственно в направлении карбокси-конца относительно домена СН 3 иммуноглобулина в другом одноцепочечном полипептиде посредством пептида, включающего SEQ ID NO:846, 850, 951 или 852. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc первого одноцепочечного полипептида (FRP-I) и фрагмент участка Fc второго одноцепочечного полипептида (FRP-II) включают домены СН 3 и СН 4 IgM или IgE. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых фрагмент участка Fc включает домен иммуноглобулина СН 2, домен СН 2 может быть представлен измененным доменом СН 2 IgG1, IgG2,IgG3 или IgG4 человека. Типичный измененный домен СН 2 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека включает домены, которые включают (а) замену аминокислоты в положении 297 и по меньшей мере одну дополнительную замену или делецию в положениях 234-238; (б) мутации одной или более аминокислот в положениях 234-238 и по меньшей мере одну замену в положении 253, 310, 318, 320, 322 или 331; или (в) замену аминокислоты аспарагин в положении 297, одну или более замен или делеций в положениях 234238, и по меньшей мере одну или несколько замен в положениях 253, 310, 318, 320, 322 или 331. Другой типичный домен СН 2 представлен измененным доменом СН 2 IgG1 человека, который включает замены аминокислот в положениях L234, L235, G237, Е 318, K320 и K322. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СНЗ первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включаетT366W, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену Y407A. В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366Y, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену Y407T. В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2,IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366W, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366S, L368A и Y407V. В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 илиIgG4 человека, который включает замену Y407A, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает заменуT366W. В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену Y407T, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366Y. В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 первого одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366S,L368A и Y407W, и домен СН 3 второго одноцепочечного полипептида представлен измененным доменом СН 3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, который включает замену T366W. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирные участки и первого, и второго одноцепочечных полипептидов представлены шарнирным участком иммуноглобулина, таким как шарнирный участок IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD или IgE. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок иммуноглобулина представлен шарнирным участком иммуноглобулина дикого типа В других некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок иммуноглобулина представлен измененным шарнирным участком иммуноглобулина, выбранным из SEQ ID NO:232,234, 240, 664-673, 675 и 676. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок (а) находится ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc, (б) располагается между связывающим доменом и доменом гетеродимеризации иммуноглобулина, (в) расположен между доменом гетеродимеризации иммуноглобулина и фрагментом участка Fc, (г) располагается на амино-конце первого или второго одноцепочечного полипептида, (д) располагается между фрагментом участка Fc и связывающим доменом, или (е) располагается на карбоксильном конце первого или второго одноцепочечного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один шарнирный участок первого и второго одноцепочечного полипептида представлен шарнирным участком лектина С-типа,таким как пептид NKg2A или NKg2D, или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирные участки первого и второго одноцепочечных полипептидов идентичны. В других некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирные участки первого и второго одноцепочечных полипептидов различаются. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который специфически связывает комплекс TCR или его компонент, и второй одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который специфически связывается с CD19,CD79b, HLA-DR или CD20. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который специфически связывает CD28, и второй одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который (а) специфически связывается с CD79b, гиперИЛ-6 или CD86,или (б) включает эктодомен PDL или моноИЛ-10. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который специфически связывает c-Met, и второй одноцепочечный полипептид включает связывающий домен, который специфически связывается с RON. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй одноцепочечный полипептиды включают SEQ ID NO: SEQ ID NO:2 и 4, SEQ ID NO:6 и 8, SEQ ID NO:10 и 12, SEQ ID NO:14 и 16,SEQ ID NO:18 и 20, SEQ ID NO:20 и 22, SEQ ID NO:20 и 24, SEQ ID NO:30 и 32, SEQ ID NO:29 и 31,SEQ ID NO:29 и 32, SEQ ID NO:30 и 72, SEQ ID NO:53 и 72, SEQ ID NO:54 и 72, SEQ ID NO:55 и 72,SEQ ID NO:70 и 72, SEQ ID NO:71 и 72, SEQ ID NO:63 и 56, SEQ ID NO:64 и 57, SEQ ID NO:65 и 60,SEQ ID NO:66 и 58, SEQ ID NO:67 и 59, SEQ ID NO:68 и 61, SEQ ID NO:69 и 62, SEQ ID NO:54 и 811,SEQ ID NO:54 и 812, SEQ ID NO:54 и 813, SEQ ID NO:814 и 818, SEQ ID NO:815 и 818, SEQ ID NO:816 и 818, SEQ ID NO:817 и 818, SEQ ID NO:814 и 820, SEQ ID NO:814 и 821, SEQ ID NO:54 и 819, SEQ IDNO:876 и 880, SEQ ID NO:877 и 881 или SEQ ID NO:878 и 882. В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающую описанный здесь полипептидный гетеродимер и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В другом аспекте данное изобретение относится к вектору экспрессии, способному экспрессировать описанный здесь полипептидный гетеродимер, включающий первый полинуклеотид, кодирующий первый одноцепочечный полипептид, и второй полинуклеотид, кодирующий второй одноцепочечный полипептид. В другом аспекте данное изобретение относится к клетке-хозяину, включающую указанный выше вектор экспрессии. В другом аспекте данное изобретение описывает клетку-хозяина, включающую первый и второй векторы экспрессии, способные экспрессировать первый и торой одноцепочечные полипептиды, соответственно, описанного здесь полипептидного гетеродимера. В другом аспекте данное изобретение описывает способ получения полипептидного гетеродимера,включающий (а) культивирование описанной здесь клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии первого и второго одноцепочечных полипептидов, и (б) в некоторых случаях, выделение или очистку гетеродимеров, образованных из первого и второго одноцепочечного полипептида из культуры. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу направленной активации Т-клеток,включающему введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полипептидного гетеродимера, который включает связывающий домен, который специфически связывает TCR, TCR,CD3, CD3, CD3 или их комбинацию, и второй связывающий домен, который специфически связывает другие мишени, например опухолеспецифический антиген или другой выбранный антиген, указанном сайте или клетке, в которых необходимо произвести активацию Т-клеток. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста, метастазов или метастатического роста злокачественной опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полипептидного гетеродимера, который включает связывающий домен, который специфически связывает TCR, TCR, CD3, CD3, CD3, c-Met, RON или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение нуждающемуся пациенту химиотерапевтического агента или ионизирующего облучения. В другом аспекте данное изобретение описывает способ лечения аутоиммунного или воспалительного состояния, включающий введение нуждающемуся пациенту эффективного количества полипептидного гетеродимера, который включает связывающий домен, который специфически связывает TCR,TCR, CD3, CD3, CD3 или CD28. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения ассоциированного с Вклетками нарушения или заболевания, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полипептидного гетеродимера, который включает связывающий домен, который специфически связывает TCR, TCR, CD3, CD3 или CD3, и второй связывающий домен, который специфически связывает CD19, CD20, CD79b или HLA-DR. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные здесь способы применения полипептидных гетеродимеров могут дополнительно включать введение нуждающемуся в этом пациенту второго активного агента, такого как второй полипептидный гетеродимер, моноклональное антитело или белок слияния, полученный из иммуноглобулина. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлена схема двухвалентного анти-CD28 полипептидного гетеродимера Х 0172(слева) и анализа SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) Х 0172 (справа); "NR" обозначает "невосстановленный", и "Red" обозначает "восстановленный"; на фиг. 2 показано, что одновалентное (Х 0124) и двухвалентное (Х 0172) анти-CD28 полипептиды действуют синергитически с субоптимальной концентрацией РМА в стимуляции очищенных Т-клеток человека при сравнении с scFv антителом к CD28 (2 Е 12 scFv), но в меньшей степени, чем двухвалентный анти-CD28 белок SMIP (2 Е 12 SMIP); на фиг. 3 показано, что двухвалентный полипептидный гетеродимер Х 0172 связывается с CD4+ T клетками лучше, чем 2 Е 12 scFv и одновалентный полипептидный гетеродимер Х 0124; на фиг. 4 представлена катионобменная хроматография полипептидных гетеродимеров Х 0251,Х 0252 и Х 0253 (слева) и анализ SDS-PAGE этих же полипептидных гетеродимеров в невосстанавливающих (NR) и восстанавливающих (Red) условиях (справа); на фиг. 5 представлены масс-спектры полипептидного гетеродимера Х 0252, который указывает на доминирование гетеродимера; на фиг. 6 представлен электрофоретический анализ SDS-PAGE полипептидных гетеродимеров Х 0283 и Х 0284 в невосстанавливающих (NR) и восстанавливающих (Red) условиях (слева) и катионобменный хроматографический анализ полипептидного гетеродимера Х 0283; на фиг. 7 представлено прямое связывание с CD86 полипептидного гетеродимера Х 0283, как это определено путем анализа BIACORE, с единицами ответа (Ru), нанесенными относительно времени(слева), и схематическое представление Х 0283; на фиг. 8 А и 8 В представлено связывание биспецифических конструкций к RON и CD3 (полипептидный гетеродимер S0268 и белок скорпиона S0266) к клеткам MDA-MB-453 (А) и изолированным Тклеткам (В); на фиг. 9 А и 9 В представлена специфичность связывания с (А) клетками Rec1 (CD19+, CD20+) или(В) клетками Jurkat (CD3+) для биспецифических гетеродимеров, включающих домены связывания сCD19 и CD3 (TSC020) или домены связывания с CD20 и CD3 (TSC021); на фиг. 10A-10D показана пролиферация CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на биспецифические полипептидные гетеродимеры TSC054, TSC078, TSC079, и bsc193 (TSC036) с (А и В) клетки Дауди (CD19+) или (С и D) клетки MDA-MB-453 (CD19); на фиг. 11 А и 11 В представлена направленная цитотоксичность Т-клеток, индуцируемая биспецифическими полипептидными гетеродимерами TSC054, TSC078, TSC079 и S0268 в ходе анализа высвобождения хрома (51Cr) с использованием (А) клеток Дауди (RON-, CD19+) или (В) клеток BxPC-3 (RON+,CD19-); на фиг. 12 представлена мишень-зависимая пролиферация Т-клеток, индуцируемая СО 19+линией клеток (Дауди) с использованием биспецифических полипептидных гетеродимеров TSC165, TSC166,TSC167, TSC168 и TSC100 в концентрациях от 0,1 до 10000 пМ; на фиг. 13 представлена мишень-зависимая пролиферация Т-клеток, индуцируемая CD19+линией клеток (Дауди) с использованием биспецифических полипептидных гетеродимеров TSC127 и TS165bsc19 3 BiTE в качестве контроля в концентрациях от 0,001 до 1000 пМ; на фиг. 14 представлена мишень-зависимая перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность на линию клеток CD19+ (Дауди) с использованием биспецифических полипептидных гетеродимеров TSC100,TSC165, ТС 166, TSC167 и TSC168. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к полипептидным гетеродимерам, образованным из двух различных одноцепочечных полипептидов в результате естественной гетеродимеризации участка СН 1 иммуноглобулина и константного участка легкой цепи иммуноглобулина (CL). Полипептидный гетеродимер имеет два или более доменов связывания, которые специфически связывают одну или более мишеней (например, ан-8 023674 тиген, рецептор или лиганд). Кроме того, обе цепи гетеродимера дополнительно включают фрагмент участка Fc (например, домены СН 2 и/или СН 3 иммуноглобулина). Данное изобретение описывает также нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения полипептидных гетеродимеров. Описанный здесь способ гетеродимеризации имеет одно или более из следующих преимуществ: (1) возможность минимальной иммуногенности полипептидных гетеродимеров по причине того, что димеры образуются посредством природной гетеродимеризации участка СН 1 иммуноглобулина и участка CL иммуноглобулина; (2) эффективная выработка и очистка полипептидных гетеродимеров по данному изобретению возможна путем ко-экспрессии двух различных одноцепочечных полипептидов, как это представлено в примерах; (3) способность опосредовать эффекторные функции Fc (например, КЗЦ, АЗКЦ,АЗКФ), которые могут быть модулированы в обе стороны мутагенезом, и более долгий период полужизни в сыворотке по причине того, что каждая цепь полипептидного гетеродимера по данному изобретению имеет фрагмент участка Fc (например, домены СН 2 и СН 3 иммуноглобулина); и (4) полипептидные гетеродимеры по данному изобретению имеют размер, который, как правило, меньше, чем молекула антитела, что обеспечивает лучшее проникновение в ткани, такие как ткани злокачественной опухоли. Описанные здесь полипептидные гетеродимеры используют для направления терапевтических агентов или иммунных эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидные гетеродимеры могут включать связывающий домен, который специфически связывается с комплексом TCR или его компонентом (например, TCR, TCR, CD3,CD3 и CD3), и второй связывающий домен, который специфически связывается со второй мишенью,такой как онкологическая мишень (например, c-Met, RON, CEACAM-6 и PSMA) или мишень В-клетки(например, CD19, CD79b, HLA-DR и CD20). Связывающий домен, специфичный для второй мишени,может иметь большую аффинность относительно своей мишени, чем аффинность связывающего домена для комплекса TCR или его компонента, такого как CD3. Такие полипептидные гетеродимеры будут преимущественно связываться вначале с онкологической мишенью или мишенью В-клеткой, и впоследствии привлекать Т-клетки к опухоли или раковым клеткам, экспрессирующим онкологическую мишень или мишень В-клетку, и используют при ингибировании роста, метастазов или метастатического роста злокачественного новообразования (включая В-клеточные виды рака). Дополнительное применение описанных здесь полипептидных гетеродимеров включает направленную активацию Т-клеток и лечение аутоиммунных или воспалительных состояний. Названия глав в тексте данной заявки представлены только в организационных целях и не должны рассматриваться в качестве ограничивающих объект изобретения. Все документы или части документов,процитированные в тексте данной заявки, включая, но не ограничиваясь, патенты, патентные заявки,статьи, книги и научные труды, включены в данный документ во всей своей полноте для любых целей посредством ссылки. В случае, если один или более включенных документов или частей документов определяют термин, который идет вразрез с определением термином, указанным в тексте данной заявки,правильным считается определение, данное в тексте данной заявки. В тексте данной заявки считается, что любой диапазон концентраций, диапазон процентов, соотношение диапазонов или диапазон целых чисел включает значение любого целого числа в указанном диапазоне и, в случае необходимости, их доли (такие как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. В контексте данного изобретения термин "примерно" обозначает 20% указанного диапазона, значения, последовательности или структуры, если не указано иное. Следует понимать, что в контексте данного изобретения термины единственного числа обозначают "один или несколько" перечисленных компонентов, если не указано иное или не понятно из контекста. Применение альтернативных указателей (например, "или") следует понимать как обозначение одного, обоих альтернативных значений, или любой их комбинации. В контексте данного изобретения термины "включают" и "содержат" используют синонимичным образом. Кроме того, следует понимать, что отдельные одноцепочечные полипептиды или гетеродимеры, полученные из различных комбинаций структур и заместителей (например, доменов, участков, шарнирных участков и линкеров), описанных в тексте данной заявки, представлены в данном изобретении в той же самой степени, что и каждый одноцепочечный полипептид или гетеродимер, который рассматривается отдельным образом. Таким образом, выбор отдельных компонентов для образования отдельных одноцепочечных полипептидов или гетеродимеров входит в объем данного изобретения. В контексте данного изобретения белок "по существу, состоит из" нескольких доменов (например,связывающего домена, который специфически связывает мишень, каркасного участка, домена гетеродимеризации иммуноглобулина и фрагмента участка Fc), если другие участки белка (например, аминокислоты на амино- или карбокси-конце или между двумя доменами), в комбинации, составляют, по большей мере, 20% (например, по большей мере, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%) от длины белка, и не влияют, по существу (т.е. не снижают активность более чем на 50%, т.е. более чем на 40, 30, 25, 20, 15, 10 или 5%),на активность различных доменов (например, аффинность связывания с мишенью связывающего домена,активность фрагмента участка Fc и способность домена гетеродимеризации иммуноглобулина облегчать гетеродимеризацию). В некоторых вариантах осуществления изобретения белок (например, одноцепо-9 023674 чечный полипептид) состоит, по существу, из связывающего домена, который специфически связывает мишень, домен гетеродимеризации иммуноглобулина, шарнирный участок, и фрагмент участка Fc может включать соединяющие аминокислоты на амино- и/или карбоксильном конце белка и/или между двумя различнымидоменами (например, между связывающим доменом и доменом гетеродимеризации иммуноглобулина, между доменом гетеродимеризации иммуноглобулина и шарнирным участком и/или между шарнирным участком и фрагментом участка Fc). В контексте данного изобретения термин "полипептидный гетеродимер" или "гетеродимер" обозначает димер, образованный двумя различными одноцепочечными полипептидами. Этот термин не включает антитело, образованное четырьмя одноцепочечными полипептидами (т.е. двумя легкими цепями и двумя тяжелыми цепями). Термин "димер" относится к биологическому веществу, которое состоит из двух субъединиц, объединенных одна с другой посредством одной или нескольких видов межмолекулярных связей (например, дисульфидных связей) и других взаимодействий (например, электростатических взаимодействий, солевых мостиков, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), и является устойчивым при соответствующих условиях (например, при физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессии, очистки и/или хранения рекомбинантных белков, или при условиях для неденатурирующего и/или невосстанавливающего электрофореза). Термин "одноцепочечный полипептид" обозначает одинарное, линейное и непрерывное присоединение аминокислот ковалентным образом. Он не включает две полипептидные цепи, которые связаны вместе нелинейным образом, таким как посредством дисульфидного мостика между цепями (например,половина молекулы иммуноглобулина, в который легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидной связью). В некоторых вариантах осуществления изобретения одноцепочечный полипептид может иметь или образовывать одну или несколько дисульфидных связей внутри цепи. В контексте данного изобретения термин "домен гетеродимеризации иммуноглобулина" обозначает домен иммуноглобулина одноцепочечного полипептида, который преимущественно взаимодействует или связывается с различными доменами иммуноглобулина другого одноцепочечного полипептида, при этом взаимодействие различных доменов гетеродимеризации по существу способствует или эффективно обеспечивает гетеродимеризацию первого и второго одноцепочечного полипептидов (т.е. образование димера между двумя разными одноцепочечными полипептидами, который также называют "гетеродимером"). Взаимодействие (я) между доменами гетеродимеризации "по существу, способствует или эффективно влияет" на гетеродимеризацию первого и второго одноцепочечного полипептидов, если существует статистически значимое снижение димеризации между первым и вторым одноцепочечным полипептидами в отсутствие домена гетеродимеризации первого одноцепочечного полипептида (HD-I) и/или домена гетеродимеризации второго одноцепочечного полипептида (HD-II). В некоторых вариантах осуществления изобретения, когда коэкспрессируются первый и второй одноцепочечные полипептиды по меньшей мере 60%, по меньшей мере от примерно 60 до примерно 70%, по меньшей мере от примерно 70% до примерно 80%, по меньшей мере от примерно 80 до примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% и по меньшей мере от примерно 90 до примерно 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% первого и второго одноцепочечного полипептидов образуют друг с другом гетеродимер. Репрезентативные домены гетеродимеризации иммуноглобулина по данному изобретению включают участок СН 1 иммуноглобулина, участок CL иммуноглобулина (например, изотипы С или С) или их производные, включая участки СН 1 и CL иммуноглобулина дикого типа и измененные (или мутированные) участки СН 1 и CL иммуноглобулина, как это описано в тексте данной заявки. В контексте данного изобретения термин "связывающий домен" или "связывающий участок" обозначает белок, полипептид, олигопептид или пептид, обладающий способностью специфически распознавать и связывать мишень (например, CD3, TCR, CD28, c-Met, RON). Связывающий домен включает любой встречающийся в природе, синтетический, полусинтетический или полученный рекомбинантным способом связывающий партнер для биологической молекулы или другой интересующей мишени. Типичные связывающие домены включают вариабельные участки одноцепочечного антитела (например,домены антител, sFv, scFv, Fab), эктодомены рецептора (например, с-Met, RON) или лиганды (например,цитокины, хемокины). Известен целый ряд анализов для идентификации связывающих доменов по данному изобретению, которые специфически связывают отдельную мишень, включая вестерн-блоттинг,ИФА и анализ Biacore. Связывающий домен и белок слияния "специфически связывают" мишень, если он связывает мишень с аффинностью или Ka (т.е. равновесной константой ассоциации отдельного связывающего взаимодействия с единицами 1/М), равной или превышающей 105 М-1, в то же самое время не связываясь по существу с другими компонентами, присутствующими в исследуемом образце. Связывающие домены (или их белки слияния) могут быть классифицированы как связывающие домены с "высокой аффинностью" (или их белки слияния) и связывающие домены с "низкой аффинностью" (или их белки слияния). Связывающие домены с "высокой аффинностью" относятся к связывающим доменам со значением Ka по меньшей мере 107 М-1 по меньшей мере 108 М-1 по меньшей мере 109 М-1 по меньшей мере 1010 М-1 по меньшей мере 1011 М-1 по меньшей мере 1012 М-1, или по меньшей мере, 1013 М-1. Связывающие домены с "низкой аффинностью" относятся к связывающим доменам со значением Ка, доходящим до 107 М-1, до 106 М-1, до 105 М-1. В альтер- 10023674 нативном варианте аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (Kd) отдельного взаимодействия связывания с единицами М (например, от 10-5 М до 10-13 М). Аффинность связывающих доменов полипептидов и одноцепочечных полипептидов по данному изобретению может быть легко определена с использованием обычных способов (см., например, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y."Т-клеточный рецептор" (TCR) представляет собой молекулу, находящуюся на поверхности Тклеток, которая, вместе с CD3, обычно ответственна за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Он состоит из дисульфидно-присоединенного гетеродимера с высоковариабельными цепямиив большинстве Т-клеток. В других Т-клетках альтернативный рецептор состоит из вариабельнойиэкспрессируемых цепей. Каждая цепь TCR является членом суперсемейства иммуноглобулинов и несет один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранный участок и короткий цитоплазматический хвост на С-конце (см. Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5th Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th Ed.,Current Biology Publications, pl48, 149, and 172, 1999). TCR, используемый в данном изобретении, может быть получен из разных видов животных, включая человека, мышь, крысу или других млекопитающих."CD3" известен в науке как мультипротеиновый комплекс из шести цепей (см. Abbas and Lichtman,2003; Janeway et al., p. 172 and 178, 1999). У млекопитающих комплекс включает цепь CD3, цепь CD3,две цепи CD3 и гомодимер цепей CD3. Цепи CD3, CD3 и CD3 представлены белками с высоким сродством к клеточной поверхности из суперсемейства иммуноглобулинов, содержащими один домен иммуноглобулина. Трансмембранные участки цепей CD3, CD3 и CD3 имеют отрицательный заряд,который является характерным для таких цепей, обеспечивая взаимосвязь с положительно заряженными цепями рецептора Т-клеток. Внутриклеточные хвосты цепей CD3, CD3 и CD3 содержат один сохраненный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM, в то время как каждая цепь CD3 имеет три мотива. Считается, что ITAM играют важную роль в передаче сигнала комплексом TCR. CD3, используемый в данном изобретении, может быть получен из разных видов животных, включая человека, мышь, крысу или других млекопитающих. В контексте данного изобретения термин "комплекс TCR" обозначает комплекс, образованный взаимосвязью CD3 с TCR. Например, комплекс TCR может состоять из цепи CD3, цепи CD3, двух цепейCD3, гомодимера из цепей CD3, цепи TCR и цепи TCR. В альтернативном варианте комплекс TCR может состоять из цепи CD3, цепи CD3, двух цепей CD3, гомодимера из цепей CD3, цепи TCR и цепи TCR . В контексте данного изобретения термин "компонент комплекса TCR" обозначает цепь TCR (т.е.TCR, TCR, TCR или TCR ), цепь CD3 (т.е. CD3, CD3, CD3 или CD3), или комплекс, образованный двумя или более цепями TCR или цепями CD3 (например, комплекс TCR и TCR, комплекс TCR и TCR, комплекс CD3 и CD3, комплекс CD3 и CD3, или комплекс суб-TCR TCR, TCR, CD3,CD3 и двух цепей CD3). Термины, понимаемые специалистом в области технологии антител, обозначают принятые в науке термины, если здесь четко не указано иное. Как известно, антитела имеют вариабельные участки, шарнирный участок и константные домены. Структура и функция иммуноглобулина описаны, например, вHarbor, 1988). Например, термины "VL" и "VH" обозначают вариабельный связывающий участок легкой и тяжелой цепи антитела соответственно. Вариабельные связывающие участки состоят из дискретных, хорошо определенных субучастков, известных как "гипервариабельные участки" (CDR) и "каркасные участки"(КУ). Термин "CL" обозначает "константный участок легкой цепи иммуноглобулина" или "константный участок легкой цепи", т.е. константный участок легкой цепи антитела. Термин "СН" обозначает "константный участок тяжелой цепи иммуноглобулина" или "константный участок тяжелой цепи", который дополнительно может быть разделен, в зависимости от изотипа антитела на домены CH1, CH2 и СН 3(IgA, IgD, IgG) или домены CH1, CH2, СН 3 и СН 4 (IgE, IgM). "Fab" (антигенсвязывающий фрагмент) является частью антитела, которая связывает антигены и включает вариабельный участок и СН 1 тяжелой цепи, связанный с легкой цепью посредством дисульфидной связи между цепями. В контексте данного изобретения "участок константного домена фрагмента Fc" или "фрагмент участка Fc" обозначает сегмент константного участка тяжелой цепи фрагмента Fc ("кристаллизируемый участок фрагмента" или участок Fc) антитела, который может включать один или более константных доменов, таких как СН 2, СН 3, СН 4 или любую их комбинацию. В качестве пояснения, участок Fc ответственен за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как АЗКЦ (антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность), АЗКФ (антителозависимый клеточный фагоцитоз), КЗЦ (комплементзависимая цитотоксичность) или фиксация комплемента, связывание с рецепторами Fc (например, CD16,CD32, FcRn), больший период полужизни in vivo относительно полипептида без участка Fc, связывание белка А и, возможно, даже трансфер через плаценту (см. Capon et al., Nature, 337:525 (1989. Кроме того, антитела имеют шарнирную последовательность, которая обычно располагается междуFab и Fc фрагментами (но расположенный ниже шарнирный участок может включать амино-концевой участок фрагмента Fc). В качестве пояснения, шарнирный участок иммуноглобулина действует в качестве гибкого спейсера для обеспечения свободного перемещения фрагмента Fab в пространстве. В отличие от константных участков, шарнирные участки структурно отличаются, варьируя в последовательности и длине между классами иммуноглобулинов и даже среди подклассов. Например, шарнирный участокIgG1 человека без ограничения гибкий, что позволяет фрагментам Fab вращаться вокруг своей оси симметрии и двигаться по сфере с центром в первом из двух дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями. В отличие от этого, шарнирный участок IgG2 человека относительно короткий и содержит жесткую полипролиновую двойную спираль, стабилизированную четырьмя дисульфидными мостками между тяжелыми цепями, что ограничивает гибкость. Шарнирный участок IgG3 человека отличается от других подклассов своим уникальным удлиненным шарнирным фрагментом (примерно в четыре раза длиннее,чем шарнирный участок IgG1), включая 62 аминокислоты (включая 21 пролинов и 11 цистеинов), образуя негибкую полипролиновую двойную спираль и обеспечивая большую гибкость по причине того, что фрагменты Fab расположены относительно далеко от фрагмента Fc. Шарнирный участок IgG4 человека более короткий, чем IgG1, но имеет такую же длину, что и IgG2, и его гибкость является промежуточной между IgG1 и IgG2. В соответствии с кристаллографическими исследованиями, домен шарнирного участка IgG может функционально и структурно подразделен на три участка: верхние, основные или средние и нижние шарнирные участки (Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992. Типичные верхние шарнирные участки включают EPKSCDKTHT (SEQ ID NO:227), как установлено для IgG1, ERKCCVE (SEQ IDNO:211), как установлено для IgG2, ELKTPLGDTT НТ (SEQ ID NO:245) или EPKSCDTPPP (SEQ IDNO:246), как установлено для IgG3, и ESKYGPP (SEQ ID NO:247), как установлено для IgG4. Типичные средние или основные шарнирные участки включают СРРСР (SEQ ID NO:228), как установлено для IgG1 и IgG2, CPRCP (SEQ ID NO:248), как установлено для IgG3, и CPSCP (SEQ ID NO:249), как установлено для IgG4. В то время как антитела IgG1, IgG2 и IgG4 имеют один верхний и средний шарнирные участки,IgG3 имеет четыре в тандеме - один ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:250) и три EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:251). Как оказалось, антитела IgA и IgD не имеют IgG-подобного основного участка, и IgD имеет два верхних шарнирных участка в тандеме (см. SEQ ID NO:222 и 252). Типичные верхние шарнирные участки дикого типа, находящиеся в антителах IgA1 и IgA2, имеют последовательности SEQ ID NO:215 и 216. В отличие от этого, антитела IgE и IgM не имеют типичного шарнирного участка, и вместо него имеют домен СН 2 с похожими на шарнирный участок свойствами. Типичные последовательности верхних шарнирноподобных участков СН 2 дикого типа IgE и IgM представлены SEQ ID NO:253 (VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDG QVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFE(VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLIC QATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTI KESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP) соответственно. В контексте данного изобретения термин "шарнирный участок" или "шарнир" обозначает (а) шарнирный участок иммуноглобулина (состоящий, например, из верхних и основных участков) или его функционального варианта, включая шарнирные участки дикого типа и измененные шарнирные участки иммуноглобулина, (б) междоменный участок лектина или его функциональный вариант, (в) выступающий участок молекулы кластера дифференциации (CD) или ее функциональный вариант, или (г) участок поверхностного клеточного рецептора (междоменный участок), который соединяет V-образные или Собразные домены иммуноглобулина. В контексте данного изобретения термин "шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа" обозначает встречающиеся в природе аминокислотные последовательности верхних и средних шарнирных участков, расположенных между и соединяющих домены СН 1 и СН 2 (для IgG, IgA и IgD) или расположенных между и соединяющих домены СН 1 и СН 3 (для IgE и IgM), находящиеся в тяжелой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа представлена последовательностью человека и может включать шарнирный участок IgG человека. Типичные шарнирные участки иммуноглобулина человека дикого типа имеют последовательности SEQ ID NO:215 (шарнирный участок IgA1), 216 (шарнирный участок IgA2), 217 (шарнирный участок IgD), 667 (шарнирный участок IgG1), 219 (шарнирный участок IgG2), 220 (шарнирный участок IgG3) и 221 (шарнирный участок IgG4). Термин "измененный шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа" или "шарнирный участок измененного иммуноглобулина" обозначает (а) шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа с изменениями аминокислот до 30% (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% замен или делеций аминокислот),или (б) фрагмент шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа, который имеет в длину примерно от 5 аминокислот (например, примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот) до примерно 120 аминокислот (например, имеет длину от примерно 10 до примерно 40 аминокислот или от примерно 15 до примерно 30 аминокислот или от примерно 15 до примерно 20 аминокислот или от примерно 20 до примерно 25 аминокислот), имеет примерно до 30% изменений аминокислот (например, примерно до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% замен или делеций аминокислот или их комбинации), и имеет основной шарнирный участок IgG с последовательностями SEQ ID NO:228, 248 или 249. Термин "пептидный линкер" обозначает последовательность аминокислот, которая соединяет вариабельный участок тяжелой цепи с вариабельным участком легкой цепи и обеспечивает спейсерную функцию, совместимую со взаимодействием двух субсвязывающих доменов таким образом, что получаемый полипептид сохраняет специфическую аффинность связывания с той же самой молекулоймишенью, что и антитело, которое включает такие же самые вариабельные участки легкой и тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер состоит из пяти до примерно 35 аминокислот, например от примерно 15 до примерно 25 аминокислот. Термин "соединительные аминокислоты" или "соединительные аминокислотные остатки" обозначает один или более (например, примерно 2-10) аминокислотных остатков между двумя прилегающими участками или доменами одноцепочечного полипептида, таких как между шарнирным участком и прилегающим фрагментом участка Fc или между шарнирным участком и прилегающим доменом связывания,или между пептидным линкером, которые связывают два вариабельных домена иммуноглобулина и прилегающий вариабельный домен иммуноглобулина. Соединительные аминокислоты могут получать при построении структуры одноцепочечного полипептида (например, аминокислотные остатки, полученные в результате использования сайта рестриктазы во время построения молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующей одноцепочечный полипептид). Термин "линкер между СН 3 и СН 1 или CL" обозначает один или несколько (например, примерно 212) аминокислотных остатков между С-концом домена СН 3 (например, СН 3 дикого типа или мутированного СН 3) и N-концом домена СН 1 или домена CL (например, С). Термин "участок иммуноглобулина дикого типа" или "домен иммуноглобулина дикого типа" обозначает встречающийся в природе участок или домен иммуноглобулина (например, встречающиеся в природе VL, VH, шарнирный участок, CL, CH1, CH2, СН 3 или СН 4) из различных классов или подклассов иммуноглобулинов (включая, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM) и различных видов (включая, например, человека, овцу, мышь, крысу и других млекопитающих). Типичные участки СН 1 человека дикого типа имеют последовательность SEQ ID NO:114, 186-192 и 194, участки С человека дикого типа имеют последовательность SEQ ID NO:112, участки С человека дикого типа имеют последовательность SEQ ID NO:113 и 224-226, домены СН 2 человека дикого типа имеют последовательность SEQ ID NO:115, 195-201 и 203, домены СН 3 человека дикого типа имеют последовательность SEQ ID NO:116, 204-210 и 212, и домены СН 4 человека дикого типа имеют последовательностьSEQ ID NO:213 и 214. Термин "измененный участок иммуноглобулина", "измененный домен иммуноглобулина", "мутированный домен иммуноглобулина" или т.п. обозначает участок иммуноглобулина с последовательностью, идентичной участку или домену иммуноглобулина дикого типа (например, VL, VH, шарнирного участка, CL, CH1, CH2, СН 3 или СН 4 дикого типа) по меньшей мере на 75 (например, 80, 82, 84, 86, 88,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%). Например, "измененный участок СН 1 иммуноглобулина" или "измененный участок СН 1" обозначает участок СН 1 с последовательностью, идентичной участку СН 1 иммуноглобулина дикого типа (например, СН 1 человека) по меньшей мере на 75% (например, 80,82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%). Подобным образом, "измененный домен СН 2 иммуноглобулина" или "измененный домен СН 2" обозначает домен СН 2 с последовательностью,идентичной участку СН 2 иммуноглобулина дикого типа (например, СН 2 человека) по меньшей мере на 75% (например, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5%). В контексте данного изобретения термин "идентичность последовательности" обозначает процентный показатель остатков аминокислот в одной последовательности, который идентичен аминокислотным остаткам в другой эталонной полипептидной последовательности после сопоставления последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, не принимая во внимание любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Процентный показатель значений идентичности последовательности получен с помощью программного обеспечения NCBI BLAST2.0, как это определено Altschul et al. (1997) "GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:33893402, с параметрами, установленными на значения по умолчанию. В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен иммуноглобулина содержит только замены консервативных аминокислот домена иммуноглобулина дикого типа. В других некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен иммуноглобулина содержит только замены неконсервативных аминокислот домена иммуноглобулина дикого типа. В еще других вариантах осуществления изобретения измененный домен иммуноглобулина содержит замены консервативных и неконсервативных аминокислот. Термин "замена консервативной аминокислоты" обозначает в науке замену одной аминокислоты другой аминокислотой с подобными свойствами. Типичные замены консервативных аминокислот широ- 13023674Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8). В некоторых вариантах осуществления изобретения замена консервативной аминокислоты включает замену лейцина на серин. В контексте данного изобретения термин "производное" обозначает модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков пептида химическими или биологическими способами с/без использования фермента, например путем гликозилирования, алкилирования, ацилирования, образования эфира или образования амида Как правило, "производное" отличается от "аналога" тем, что исходный полипептид может служить исходным материалом для получения "производного", в то время как исходный полипептид необязательно может использоваться в качестве исходного материала для получения "аналога". Производное может иметь различные химические, биологические или физические свойства исходного полипептида. Например, производное может быть более гидрофильным или может иметь измененную реакционную способность (например, CDR имеет измененные аминокислоты, которые изменяют его аффинность относительно мишени) в сравнении с исходным полипептидом. В контексте данного изобретения, если иное не указано, положение остатка аминокислоты в вариабельном участке молекулы иммуноглобулина пронумеровано в соответствии с системой нумерации поKabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service,National Institutes of Health (1991, и положение остатка аминокислоты в константном участке молекулы иммуноглобулина пронумеровано в соответствии с номенклатурой ЕС (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)."Рецептор" представляет собой молекулу белка, присутствующую в цитоплазматической мембране или в цитоплазме клетки, к которой может присоединяться сигнальная молекула (т.е. лиганд, такой как гормон, нейропередатчик, токсин, цитокин). Связывание сигнальной молекулы с рецептором приводит к конформационному изменению рецептора, что обычно инициирует клеточный ответ. Однако некоторые лиганды всего лишь блокируют рецепторы без индуцирования какого-либо ответа (например, антагонисты). Некоторые белки-рецепторы являются периферическими мембранными белками. Много гормонов и рецепторов-нейропередатчиков являются трансмембранными белками, которые погружены в фосфолипидный бислой клеточных мембран, и другой большой класс рецепторов представлен внутриклеточными белками, такими как белки для рецепторов стероидов и интракринов."В-клеточное ассоциированное заболевание или нарушение" или "заболевание или нарушение, связанное с аберрантной активностью В-клеток" обозначает заболевание или нарушение, ассоциированное(например, вызванное или возникшее в результате) аберрантной активности В-клеток или активности,которая отклоняется от нормального, правильного или ожидаемого курса. Например, В-клеточное ассоциированное нарушение или заболевание может включать несоответствующую пролиферацию В-клеток,которые имеют поврежденную или дефективную ДНК или другие клеточные компоненты. Аберрантная активность В-клеток может включать пролиферацию клеток, характеризующуюся несоответствующими высокими уровнями деления В-клеток, несоответствующими низкими уровнями апоптоза В-клеток, или обоими явлениями. Такие заболевания могут характеризоваться, например, однократной или множественной локальными аномальными пролиферациями В-клеток, групп В-клеток или ткани (-ей), раковых или нераковых, злокачественных или доброкачественных. В-клеточное ассоциированное нарушение или заболевание также может включать аберрантную выработку антител, такую как выработку аутоантител,или избыточную выработку антител, которые наиболее желательны при их выработке в нормальных количествах. Также предусматривается, что аберрантная активность В-клеток может возникнуть в определенных субпопуляциях В-клеток, а не в других популяциях, или может включать несоответствующую стимуляцию Т-клеток, такую как несоответствующее представление антигена относительно Т-клеток или другие пути В-клеток. Примеры В-клеточных ассоциированных нарушений или заболеваний включают В-клеточное злокачественное образование или В-клеточный рак (например, В-клеточная лимфома, Вклеточный лейкоз или В-клеточная миелома), заболевание, характеризующееся выработкой аутоантитела(например, аутоиммунные заболевания) или воспаление, или заболевание, характеризующееся несоответствующей стимуляцией Т-клеток, вызванной представлением антигена В-клетками относительно Тклеток или вызванной другими путями, задействующими В-клетки. Термины "лечение", "лечить" или "снижение симптомов" обозначают терапевтическое лечение или профилактическое/превентивное лечение. Лечение является терапевтическим, если по меньшей мере один симптом заболевания у индивидуума, принимающего лечение, улучшается, или лечение может замедлять ухудшение прогрессирующего заболевания у индивидуума, или предотвратить возникновение дополнительных связанных заболеваний."Терапевтически эффективное количество (или доза)" или "эффективное количество (или доза)" специфической связывающейся молекулы или соединения обозначает количество соединения, достаточное для снижения одного или нескольких симптомов заболевания, подвергнутого лечению, статистически значимым образом. При использовании отдельного активного действующего вещества, которое вводится в виде монотерапии, терапевтически эффективная доза обозначает только данное вещество. При использовании относительно комбинации терапевтически эффективная доза относится к комбинирован- 14023674 ным количествам активных действующих веществ, что приводит к терапевтическому эффекту при их последовательном или одновременном введении (в одном и том же препарате или сопутственно в разных препаратах). Термин "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным единицам и композициям, которые не приводят к аллергии или другим серьезным нежелательным реакциям при введении с использованием хорошо известных в науке путей введения. Термин "нуждающийся пациент" обозначает пациента, имеющего риск или страдающего от заболевания, нарушения или состояния, которое поддается лечению или улучшению с использованием описанных здесь полипептидного гетеродимера или их композиций. В контексте данного изобретения термин "белок слияния, полученный из иммуноглобулина" обозначает белок слияния, который включает по меньшей мере один участок иммуноглобулина, такой как домен VL, VH, CL, CH1, CH2, СН 3 и СН 4. Участок иммуноглобулина может быть представлен участком иммуноглобулина дикого типа или измененным участком иммуноглобулина. Типичные белки слияния,полученные из иммуноглобулина, включают одноцепочечные вариабельные фрагменты антитела (scFv)(см., например, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83, 1988), SMIP белки (см. публикацию патента США No. 2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049), белки PIMS (см. публикацию заявки РСТNo. WO 2009/023386), и многофункциональные связывающие белки (такие как белки SCORPION иXceptor) (см. публикацию заявки РСТ No. WO 2007/146968, публикацию заявки на патент США No. 2006/0051844, и патент США No. 7166707). Дополнительные определения представлены в тексте данной заявки. Полипептидные гетеродимеры. В одном аспекте данное изобретение описывает полипептидный гетеродимер, образованный объединением двух разных одноцепочечных полипептидов. Первый одноцепочечный полипептид (SCP-I) включает, состоит, по существу, из или состоит из от одного до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от одной до четырех мишеней, шарнирный участок (H-I), домен гетеродимеризации иммуноглобулина (HD-I) и фрагмент участка Fc (FRP-I), в то время как второй одноцепочечный полипептид включает, состоит, по существу, из или состоит из от нуля до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от нуля до четырех мишеней, шарнирный участок (Н-II), домен гетеродимеризации иммуноглобулина (HD-II) и фрагмент участка Fc (FRP-II), при условии, что полипептидный гетеродимер включает по меньшей мере два связывающих домена, которые специфически связывают одну или более мишеней, например по меньшей мере две различные мишени. H-I и Н-II могут иметь одинаковую последовательность, но могут и отличаться. HD-I может включать участок иммуноглобулина СН 1, и HD-II может включать участок CL иммуноглобулина. В альтернативном варианте HD-I может включать участок CL иммуноглобулина, и HD-II может включать участок иммуноглобулина CH1.FRP-I и FRP-II могут иметь одинаковую последовательность, но могут и отличаться. Отдельные компоненты полипептидных гетеродимеров по данному изобретению описаны подробно ниже. Связывающие домены. Как это указано выше, полипептидный гетеродимер по данному изобретению включает два одноцепочечных полипептида: один одноцепочечный полипептид включает от одного до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от одной до четырех мишеней, и другой одноцепочечный полипептид полипептидного гетеродимера включает от нуля до четырех связывающих доменов, которые специфически связывают от нуля до четырех мишеней. Общее число связывающих доменов полипептидного гетеродимера варьирует от примерно двух до восьми, и общее количество различных мишеней,с которыми связываются связывающие домены, варьирует от примерно одного до восьми, например от двух до восьми, двух до четырех, двух до трех или двух мишеней. Если одноцепочечный полипептид полипептидного гетеродимера включает один связывающий домен, связывающий домен может быть расположен на амино- или карбоксильном конце фрагмента участка Fc одноцепочечного полипептида. Например, одноцепочечный полипептид, включающий два связывающих домена, расположенных на аминоконце и карбоксильном конце фрагмента участка Fc одноцепочечного полипептида, или оба связывающих домена могут быть расположены в направлении N-конца или С-конца относительно фрагмента участка Fc. В другом примере одноцепочечный полипептид может включать три связывающих домена, при этом (а) два связывающих домена являются аминоконцевыми на разных одноцепочечных белках и третий связывающий домен расположен ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc на SCP-I или SCP-II, (б) два связывающих домена являются карбоксиконцевыми на разных одноцепочечных белках и третий связывающий домен расположен ближе к аминоконцу относительно фрагмента участка Fc на SCP-I или SCP-II. В еще одном примере полипептидный гетеродимер может включать четыре связывающих домена, при этом два связывающих домена расположены ближе к амино-концу относительно фрагмента участка Fc на разных цепях и другие два связывающих домена расположены ближе к карбокси-концу относительно фрагмента участка Fc на разных цепях. В альтернативном варианте в любом из таких вариантов воплощения изобретения два связывающих домена могут быть присоединены друг к другу в тандеме и располагаться на SCP-I или SCP-II или обоих доменах, в зависимости от количества присутствующих связывающих доменов - укладка доменов используется в случае присутствия от пяти до восьми связывающих доменов в SCP-I и SCP-II. Связывание мишени связывающим доменом опосредует взаимодействие между мишенью (например, рецептором или лигандом) и другой молекулой. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание мишени (например, рецептора) связывающим доменом стимулирует определенные функции мишени (например, передачу сигнала) или сближает мишени для биологического эффекта (например,направляет Т-клетки к опухоли, что, в свою очередь, активирует Т-клетки). В других некоторых вариантах осуществления изобретения связывание мишени связывающими доменами блокирует взаимодействие между мишенью и другой молекулой, и это изменяет, снижает или элиминирует определенные функции мишени. Молекула-мишень, которая специфически связана связывающим доменом, содержащимся в полипептидном гетеродимере по данному изобретению, может находиться на или во взаимосвязи с интересующей клеткой ("клеткой-мишенью"). Типичные клетки-мишени включают раковые клетки, клетки,ассоциированные с аутоиммунным заболеванием или нарушением или с воспалительным заболеванием или нарушением, В-клетки и Т-клетки. Молекула-мишень также может быть и не ассоциирована с клеткой. Типичные молекулы-мишени, не ассоциированные с клеткой, включают растворимые белки, секретируемые белки, депонированные белки и внеклеточные структурные (матрикс) белки. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающие домены полипептидных гетеродимеров по данному изобретению специфически связывают мишень, выбираемую из мишеней Т-клеток,опухолевых антигенов, мишеней В-клеток, провоспалительных цитокинов или хемокинов, проонкогенных цитокинов или факторов роста, ангиогенных агентов, рецепторов Fc, рецептора трансферрина, тирозинкиназных рецепторов (RTK), TNFSFR или любой их комбинации. Например, полипептидные гетеродимеры по данному изобретению специфически связывают мишень Т-клеток и опухолевую мишень. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает Т-клеточную мишень, такую как комплексTCR или его компонент (например, TCR, TCR, CD3, CD3 и CD3), CD28, PD-1, HVEM, BTLA,CD80, CD86, GITR и TGFBR1. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает комплекс TCR или его компонент. Например,в некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен специфически связывает отдельную цепь CD3 человека (например, цепь CD3 человека, цепь CD3 человека, и цепь CD3 человека) или комбинацию двух или более отдельных цепей CD3 человека (например, комплекс CD3 человека иCD3 человека или комплекс CD3 человека и CD3 человека). В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен специфически связывает цепь CD3 человека. В других некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен специфически связывает один или более TCR человека, TCR человека или гетеродимер, образованный из TCR человека и TCRP человека. В других некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен по данному изобретению связывает комплекс, образованный из одной или более цепей CD3 человека с одной или более цепей TCR человека, такой как комплекс, образованный из цепи CD3 человека, цепи CD3 человека, или цепи CD3 человека с цепью TCR человека или цепью TCR человека. В любом из таких вариантов воплощения изобретения полипептидный гетеродимер по данному изобретению также может связывать опухолевую мишень. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает опухолевую мишень,включая следующие: RON, c-Met, СЕАСАМ-6, PSMA, ЕрСАМ, СЕА, РСТА-1, STEAP-1, PSCA, ALCAMIX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, плазмоклеточный антиген, (связанный с мембраной) IgE, меланома хондроитин сульфат протеогликан (MCSP), CCR8, предшественник ФНО-альфа, STEAP-2, мезотелин, А 33 антиген, антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), Ly-6; десмоглеин 4, неоэпитоп Е-кадхерина, ацетилхолиновый рецептор плода, CD25, СА 19-9 маркер, СА-125 маркер и мюллерово ингибирующее вещество (MIS) рецептор II типа, sTn (сиалированный антиген Tn; TAG-72), FAP(антиген активации фибробластов), эндосиалин, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, В 7-Н 3 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает В-клеточную мишень,такую как CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, CD79b, HLA-DR или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает провоспалительный цитокин или хемокин, такой как ФНО-, ИЛ-6, гиперИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-1, ИЛ-8, IP-10, ИФН-, ИФН-,RANKL, FASL, ТФр, ИЛ-7, ИЛ-10, ИЛ-17 А/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 или BLyS/APRIL или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает проонкогенный цитокин или фактор роста, такой как ГЦФР, MSP, ЭФР (включая эпирегулин, херрегулин, -регулин, нейрегулин), HIF-1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, ФНО-, ИЛ-6, гиперИЛ-6, ИЛ-8, Wnt, sHH, ТФр,PDGF или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает ангиогенный агент, такой как PDGFR, VEGFR1-4, NRP1, ангиопоэтин 2, c-Met или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает рецептор Fc, такой какCD64, CD32A, CD32B, CD16, FcRn или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает рецептор трансферрина, такой как CD71. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает рецептор тирозинкиназы,такой как EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, c-Met, RON или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает TNFSFR, такой какTNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, ВСМА, FAS, OX40, GITR, 4-1-BB, LTbetaR, HVEM, RANK или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению специфически связывает гиперИЛ-6, ИЛ-10,LIGHT, CD40, PDL1, PDL2 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько связывающих доменов полипептидного гетеродимера по данному изобретению являются агонистом одной из следующих молекул: ИЛ-10, HLA-G, ГЦФР, ИЛ-35, PD-1, BTLA, TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR, FAS или любой их комбинации. Связывающий домен также может быть любым пептидом, который специфически связывает интересующую мишень. Источники связывающих доменов включают вариабельные участки антитела из различных видов (которые могут быть представлены в виде антител, sFv, scFv, Fab, или растворимого домена VH или доменных антител), включая человека, грызунов, птиц и овец. Дополнительные источники связывающих доменов включают вариабельные участки антител из других видов, таких как верблюжьиand Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol, 275:413), акул-нянек (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804), американского гидролага (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39) или миноги (Herrin et al.,(2008) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040-2045 и Alder et al. (2008) Nature Immunology 9:319-327). Такие антитела могут образовывать антигенсвязывающие участки с использованием только вариабельного домена тяжелой цепи, т.е. такие функциональные антитела являются гомодимерами только тяжелых цепей (обозначается как "антитела с тяжелой цепью") (Jespers et al. (2004) Nature Biotechnology 22:11611165; Cortez-Retamozo et al. (2004) Cancer Research 64:2853-2857; Baral et al. (2006) Nature Medicine 12:580-584, and Barthelemy et al. (2008) Journal of Biological Chemistry 283:3639-3654). Типичные антитела к CD3, из которых может быть получен связывающий домен по данному изобретению, включают моноклональное антитело Cris-7 (Reinherz E.L. et al. (eds.), Leukocyte typing II.,Springer Verlag, New York, (1986, моноклональное антитело BC3 (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med 172:1691), OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) и их производные, такие как ОКТЗ ала-ала (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409), визилизумаб (Carpenter et al.(2002) Blood 99:2712), и моноклональное антитело 145-2 С 11 (Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766). Типичное антитело к TCR представлено моноклональным антителом Н 57 (Lavasani et al. (2007) Scandinavian Journal of Immunology 65:39-47). Альтернативный источник связывающих доменов по данному изобретению включает последовательности, которые кодируют обычные пептидные библиотеки, или последовательности, которые кодируют рекомбинантное разнообразие аминокислот в петлевых участках альтернативных структур, не являющихся антителом, таких как домены фибриногена (см., например, Weisel et al. (1985) Science 230:1388), домены Кунитца (см., например, патент США No. 6423498), повторяющиеся белки анкирина(2005) Structure 13:755-768), повторяющиеся домены тетратрикопептида (Main et al. (2003) Structure 11:497-508 and Cortajarena et al. (2008) ACS Chemical Biology 3:161-166), лейцин-обогащенные повторяющиеся домены (Stumpp et al. (2003) Journal of Molecular Biology 332:471-487), домены липокалина(см., например, WO 2006/095164, Beste et al. (1999) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898-1903 and Schnfeld et al. (2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198-8203), V-образные домены (см., например, публикацию заявки на патент США No. 2007/0065431), домены лектина С-типа (Zelensky and Gready (2005)Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779-7784), mAb2 или FCAB (см., например, публикации заявок на патент США No. WO 2007/098934; WO 2006/072620), или подобные (Nord et al. (1995) Protein Engineering 8(6):601-608; Nord et al. (1997) Nature Biotechnology 15:772-777; Nord et al (2001) European Journal of Biochemistry 268(15):4269-4277 и Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268). Связывающие домены по изобретению могут быть получены, как это описано в тексте данной заявки, или с использованием целого ряда известных в науке способов (см., например, патенты США No. 6291161 и 6291158). Например, связывающие домены по данному изобретению могут быть идентифицированы способом скрининга фаговой библиотеки Fab на предмет Fab фрагментов, которые специфически связываются с интересующей мишенью (см. Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344). Кроме того, традиционные стратегии разработки гибридомы с использованием интересующей мишени в виде иммуногена в стандартных системах (например, мышах, HUMAB MOUSE, ТС MOUSE, KM-MOUSE, ламах, цыплятах, крысах, хомяках, кроликах и т.д.) могут использоваться для разработки связывающих доменов по изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает связывающий домен CD86, такой как эктодомен CTLA4, эктодомен CD28 или связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулина (такой как scFv), специфичный относительно CD86 (например, из моноклональных антител 3D1 или FUN1). В некоторых вариантах осуществления изобретения используют не весь эктодомен. Например, могут использоваться домены в пределах эктодомена CTLA4, которые связывают CD86 и предотвращают связывание CD86 с CD28. Связывающий домен CD86 может блокировать связывание CD86 с CD28 и, таким способом, снижать активацию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонист ИЛ-10, такой как ИЛ-10, моноИЛ-10, или его функциональный участок. Термин "моноИЛ-10" обозначает молекулу ИЛ-10, имеющую короткий линкер (GGGSGG, SEQ ID NO:760), который разделяет два субдомена молекулы (домены амино- и карбоксильного конца), таким образом, что такие субдомены могут образовывать внутримолекулярный димер. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонистHLA-G, такой как HLA-G5, HLA-G1, мутеин HLA-G или его функциональный участок; эктодомен HLAG5, HLA-G1 или мутеина HLA-G; или связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулина(такой как scFv), специфичный относительно ILT2, ILT4 или KIR2DL4. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонист ГЦФР, такой как ГЦФР или его субдомен. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонист ИЛ-35, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулина (такой как scFv), специфичный относительно ИЛ-35R или ИЛ-35, или его функциональный участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает антагонист LIGHT, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулина (такой как scFv),специфичный относительно LIGHT, или эктодомен HVEM, или его функциональный участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонистPD-1, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулина (такой как scFv), специфичный относительно PD-1, или лиганд PD-1 (например, PD-L1 или PD-L2), или его функциональный участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает агонистBTLA, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулинового происхождения (такой как scFv), специфичный относительно BTLA, или эктодомен HVEM, или его функциональный участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает антагонист GITRL, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулинового происхождения (такой как scFv), специфичный относительно GITRL, или эктодомен GITR, растворимый GITR, или его функциональный участок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает антагонист CD40, такой как связывающий домен вариабельного участка иммуноглобулинового происхождения В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен представлен одноцепочечным фрагментом Fv (scFv), который включает участки VH и VL, специфичные относительно интересующей мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения домены VH и VL имеют человеческое происхождение. Типичные участки VH включают участок VH 2 Е 12 (антитело к CD28) scFv с последовательностью SEQ ID NO:106, участок VH P2C2 (антитело к CD79b) scFv с последовательностью SEQ(антитело к CD86) scFv, представлены SEQ ID NO:83 и 95 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен представлен одноцепочечным фрагментом Fv (scFv), который включает домены VH и VL, специфичные относительно комплекса TCR или его компонента В некоторых вариантах осуществления изобретения домены VH и VL представлены доменами человека или гуманизированными доменами VH и VL. Типичные домены VH включают домен ВС 3 (антитело к CD3) VH, домен ОКТ 3 (антитело к CD3) VH, домен Н 57 (антитело kTCR) VH и домен 2 С 11 (антитело к CD3) VH с последовательностями SEQ ID NO:301, 303, 313 и 317 соответственно. Дополнительные типичные домены VH включают домены Cris-7 (антитело к CD3) VH с последовательностями SEQ ID NO:327 и 331-333. Типичные домены VL включают домен ВС 3 (антитело к CD3)VL, домен ОКТ 3 (антитело к CD3) VL, домен Н 57 (антитело kTCR) VL и домен 2 С 11 (антитело к CD3) VL с последовательностями SEQ ID NO:302, 304, 315 и 318 соответственно. Дополнительные типичные домены VL включают домены Cris-7 (антитело к CD3) VL с последовательностями SEQ ID NO:328, 329 и 330. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен включает или представлен последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или 100% аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи (VL) или вариабельного участка тяжелой цепи (VH), или обоих участков, при этом каждый CDR включает нулевые изменения или по меньшей мере одно, два или три изменения в моноклональном антителе или фрагменте, или его производном, которые специфически связываются с интересующей мишенью (например, c-Met, RON, CD28, CD79b, CD3, TCR, TCR, гиперИЛ-6, CD86, CD19 и HLA-DR),и такой мутант или производное все еще связывается со своей мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен участка VH или VL по данному изобретению может быть получен или основан на VH или VL известного моноклонального антитела и содержит одну или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) вставок, одну или несколько(например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) делеций, одну или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) замен аминокислот (например, замен консервативных аминокислот или замен неконсервативных аминокислот),или комбинацию указанных выше изменений при сравнении с VH или VL известного моноклонального антитела. Вставка(-и), делеция(-и) или замена(-ы) могут быть в любом месте участка VH, включая амино- или карбокси-конец, или оба конца данного участка, при условии, что каждый CDR включает нулевые изменения или, по большей мере, одно, два или три изменения, и при условии, что связывающий домен, включающий модифицированный участок VH или VL, все еще может специфически связываться со своей мишенью с примерно такой же аффинностью, что и связывающий домен дикого типа. Домены VH и VL могут быть расположены в любой ориентации (т.е. со стороны амино- или карбоксильного конца, VH-VL или VL-VH) и могут быть соединены аминокислотной последовательностью(например, имеющей длину от примерно пяти до примерно 35 аминокислот), способной обеспечивать спейсерную функцию, таким образом, два субсвязывающих домена могут взаимодействовать с образованием функционального связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность, которая соединяет домены VH и VL (также указана в тексте данной заявки как "линкер"), включает последовательность, принадлежащую семейству (GlynSer), такому как(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n или (Gly4Ser)n, при этом n является целым числом от 1 до 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения ликер представлен GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:183) или GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:108). Дополнительный типичный линкер представлен GGGGSGGGGSGGGGAS (SEQ ID NO:739). В некоторых вариантах осуществления изобретения такие линкеры на основе (GlynSer) используют для соединения доменов VH и VL в связывающем домене, но не используют для соединения связывающего домена с доменом гетеродимеризации иммуноглобулина или фрагментом участка Fc. Типичные связывающие домены, специфичные относительно CD28, включают 2 Е 12 scFv с последовательностью SEQ ID NO:109, связывающие домены, специфичные относительно CD79b включают Р 2 С 2 scFv с последовательностью SEQ ID NO:185; связывающие домены, специфичные относительно cMet включают 5D5 scFv с последовательностью SEQ ID NO:257; связывающие домены, специфичные относительно RON включают 4 С 04 scFv с последовательностью SEQ ID NO:261 и 11 Н 09 scFv с последовательностью SEQ ID NO:265; связывающие домены, специфичные относительно гиперИЛ-6 включают А 2 scFv с последовательностью SEQ ID NO:86; связывающие домены, специфичные относительно CD86 включают 3D1 scFv с последовательностью SEQ ID NO:98; связывающие домены, специфичные относительно HLA-DR включают М 0042 scFv с последовательностью SEQ ID NO:120; связывающие домены,специфичные относительно CD3 включают G19-4 scFv с последовательностью SEQ ID NO: 102, OKT3-МTCR или его компонент, включают ВМА 031 scFv с последовательностью SEQ ID NO:830 и другие scFv с последовательностью SEQ ID NO:310, 311, 312, 319 и 334-340. Дополнительные типичные связывающие домены включают эктодомен PDL2 с последовательностью SEQ ID NO:88 и моноИЛ-10 с последовательностью SEQ ID NO:90. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эктодомен PDL2 и моноИЛ-10 имеют последовательность SEQ ID NO:87 и 89 соответственно. Аминокислотная последовательность легкой цепи 4 С 04 (антитело к RON) scFv имеет последовательность SEQ ID NO:602, и CDR1, CDR2 и CDR3 имеют последовательность SEQ ID NO:604-606 соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 4 С 04 (антитело к RON) scFv имеет последовательность SEQ ID NO:603, и CDR1, CDR2 и CDR3 имеют последовательность SEQ ID NO:607609 соответственно. Аминокислотная последовательность легкой цепи 11 Н 09 (антитело к RON) scFv имеет последовательность SEQ ID NO:610, и CDR1, CDR2 и CDR3 имеют последовательность SEQ ID NO:612-614 соответственно. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 11 Н 09 (антитело к RON) scFv имеет последовательность SEQ ID NO:611, и CDR1, CDR2 и CDR3 имеют последовательность SEQ ID NO:615617 соответственно. Связывающий домен может быть расположен на амино- или карбоксильном конце относительно фрагмента участка Fc одноцепочечного полипептида по данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен расположен на аминоконце одноцепочечного полипептида. В других некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен расположен на карбоксильном конце одноцепочечного полипептида. В других некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий домен расположен на амино- и карбоксильном конце одноцепочечного полипептида. Домены гетеродимеризации. Как это указано выше, полипептидный гетеродимер по данному изобретению включает домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой полипептидной цепи. Домены гетеродимеризации иммуноглобулина в двух одноцепочечных полипептидах полипептидного гетеродимера отличаются друг от друга и, следовательно, могут быть по-разному модифицированы для облегчения гетеродимеризации в обеих цепях и для сведения к минимуму гомодимеризацию любой цепи. Как это показано в примерах, домены гетеродимеризации иммуноглобулина, описанные в тексте данной заявки, обеспечивают эффективную гетеродимеризацию различных полипептидов и облегчают очистку полученных полипептидных гетеродимеров. Как это описано в тексте данной заявки, домены гетеродимеризации иммуноглобулина используют для обеспечения гетеродимеризации двух разных одноцепочечных полипептидов (например, одного короткого и одного длинного) в соответствии с данным изобретением и включают домены СН 1 и CL иммуноглобулинов, например, домены СН 1 и CL человека В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен участком СН 1 дикого типа, таким как участок CH1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен участкомNO:114, 186-192 и 194 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен участком CH1 IgG1 дикого типа с последовательностьюSEQ ID NO: 114. В дополнительных вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен измененным участком СН 1 дикого типа, таким как измененный участок CH1 IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен измененным участком CH1 IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM. В других дополнительных вариантах осуществления изобретения остаток цистеина участка СН 1 дикого типа (например, СН 1 человека), участвующий в образовании дисульфидной связи с доменом CL иммуноглобулина дикого типа (например, CL человека), удален или заменен в измененным участке СН 1 иммуноглобулина, таким образом, в результате чего дисульфидная связь между измененным участком СН 1 и доменом CL дикого типа не образуется. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен доменом CL дикого типа, таким как домен С дикого типа или домен С дикого типа. В отдельных вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен доменом С человека дикого типа или доменом С человека дикого типа с последовательностьюSEQ ID NO:112 и 113 соответственно. В дополнительных вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен измененным доменом CL иммуноглобулина, таким как измененный домен С или С, например, измененный домен С человека или домен С человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения остаток цистеина в домене CL дикого типа (например, CL человека), участвующий в формировании дисульфидной связи с участком СН 1 иммуноглобулина дикого типа (например, СН 1 человека), удален или заменен в измененном домене CL иммуноглобулина. Такие измененные домены CL могут дополнительно включать делецию аминокислот на аминоконце. Типичный домен С имеет последовательность SEQ ID NO:141, в которой первый аргинин и последний цистеин домена С человека дикого типа удалены. В некоторых вариантах осуществления изобретения удален только последний цистеин домена С человека дикого типа в измененном домене C по той причине, что первый аргинин, удаленный из домена С человека дикого типа, может быть обеспечен линкером, который имеет аргинин на карбоксильном конце, и связями аминоконца измененного домена С с другим доменом (например, фрагментом участка Fc). Типичный домен С имеет последовательность SEQ ID NO:140, в которой первый аргинин домена С человека дикого типа удален, и цистеин,участвующий в образовании дисульфидной связи с цистеином участка СН 1, заменен на серин. В дополнительных вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен измененным доменом С, который содержит одну или несколько аминокислотных замен в сравнении с доменом С дикого типа, в положениях, которые могут участвовать в образовании межцепочечной водородной связи при взаимодействии С-С. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимеризации иммуноглобулина представлен измененным доменом С человека, имеющим одну или более аминокислот в положениях N29, N30, Q52, V55, Т 56, S68 или Т 70, которые заменены на другие аминокислоты. Нумерация аминокислот на основе их положений в измененной последовательности С человека указана в последовательности SEQ ID NO:141. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен гетеродимерации иммуноглобулина представлен измененным доменом С человека, имеющим одну, две, три или четыре аминокислотных замены в положениях N29, N30, V55 или Т 70. Аминокислота, используемая в качестве заместителя в указанных выше положениях, может быть аланином, или аминокислотным остатком с молекулой боковой цепи, такой как аргинин, триптофан, тирозин, глутамат, глутамин или лизин. Дополнительные аминокислотные остатки,которые могут использоваться для замены аминокислотных остатков последовательности С человека дикого типа в указанных выше положениях (например, N30), включают аспартат, метионин, серин и фенилаланин. Типичные измененные домены С иммуноглобулина имеют последовательность SEQ IDNO:142-178. Измененные домены С человека представлены доменами, которые облегчают гетеродимеризацию участка СН 1, но сводят к минимуму гомодимеризацию другого домена С . Репрезентативные измененные домены С человека имеют последовательность SEQ ID NO:160 (N29W V55A Т 70 А), 161 840 (N30S V55A Т 70 Е) и 841 (N30F V55A Т 70 Е). В некоторых вариантах осуществления изобретения в дополнение или альтернативно мутациям в описанных здесь доменах С домены гетеродимеризации иммуноглобулина (т.е. домены иммуноглобулина СН 1 и CL) полипептидного гетеродимера имеют мутации, таким образом, полученные домены гетеродимеризации иммуноглобулина образуют солевые мостики (т.е. ионные взаимодействия) между остатками аминокислот в мутированных сайтах. Например, домен гетеродимеризации иммуноглобулина полипептидного гетеродимера может быть представлен мутированным доменом СН 1 в комбинации с мутированным доменом С. В мутированном домене СН 1 валин в положении 68 (V68) домена СН 1 человека дикого типа заменен аминокислотным остатком, имеющим отрицательный заряд (например, аспартатом или глутаматом), в то время как лейцин в положении 27 (L27) мутированного домена С человека, в котором первый аргинин и последний цистеин были удалены, заменен аминокислотным остатком с положительным зарядом (например, лизином, аргинином или гистидином). Взаимодействие зарядов между аминокислотными остатками с отрицательным зарядом полученного мутированного домена СН 1 и аминокислотными остатками с положительным зарядом полученного мутированного домена С образует солевой мостик, который стабилизирует интерфейс гетеродимера между мутированными доменами СН 1 и С. В альтернативном варианте V68 СН 1 дикого типа может быть заменен аминокислотным остатком с положительным зарядом, в то время как L27 мутированного домена С человека, в котором первый аргинин и последний цистеин были удалены, может быть заменен аминокислотным остатком с отрицательным зарядом. Типичные мутированные последовательности СН 1, в которых V68 заменен аминокислотой с отрицательным или положительным зарядом, представлены SEQ ID NO:844 и 845. Типичные мутированные последовательности С, в которых L27 заменен аминокислотой с отрицательным или положительным зарядом, представлены SEQ ID NO:842 и 843. Положения, отличные от V68 СН 1 домена человека и L27 домена С человека, могут быть заменены аминокислотами с противоположными зарядами для выработки ионных взаимодействий между аминокислотами в добавление или как альтернатива мутаций в V68 СН 1 домена и L27 домена С. Такие положения могут быть идентифицированы с использованием любого подходящего способа, включая случайный мутагенез, анализ кристаллической структуры пары СН 1-С для идентификации аминокислотных остатков в СН 1-С и последующая идентификация подходящих положений аминокислотных остатков в СН 1-С с использованием набора критериев (например, склонность к участию в ионных взаимодействиях, близость к потенциальному партнерскому остатку и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидные гетеродимеры по данному изобретению содержат только одну пару доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например, первая цепь полипептидного гетеродимера может включать участок СН 1 в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, в то время как вторая цепь может включать домен CL (например, С или С ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина. В альтернативном варианте первая цепь может включать участок CL (например, С или С ) в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина, в то время как вторая цепь может включать участок СН 1 в качестве домена гетеродимеризации иммуноглобулина Как это указано в тексте данной заявки, домены гетеродимеризации иммуноглобулина первой и второй цепей способны ассоциировать с образованием полипептидного гетеродимера по данному изобретению. В других некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидные гетеродимеры по данному изобретению могут включать две пары доменов гетеродимеризации иммуноглобулина. Например,первая цепь полипептидного гетеродимера может включать два участка СН 1, в то время как вторая цепь может иметь два домена CL, которые ассоциируют с двумя участками СН 1 в первой цепи. В альтернативном варианте первая цепь может включать два домена CL, в то время как вторая цепь может иметь два участка СН 1, которые ассоциируют с двумя доменами CL в первой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая цепь полипептида включает участок СН 1 и домен CL, в то время как вторая цепь полипептидавключает домен CL и участок СН 1, которые ассоциируют с участком СН 1 и доменом CL, соответственно, первой цепи полипептида. В вариантах осуществления изобретения, в которых полипептидный гетеродимер включает только одну пару гетеродимеризации (т.е. один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи),домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может располагаться на амино-конце во фрагменте участка Fc такой цепи. В альтернативном варианте домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может располагаться на карбоксильном конце фрагмента участка Fc данной цепи. В вариантах осуществления изобретения, в которых полипептидный гетеродимер включает две пары гетеродимеризации (т.е. два домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи), оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут располагаться на амино-конце во фрагменте участка Fc такой цепи. В альтернативном варианте оба домена гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи могут располагаться на карбоксильном конце фрагмента участка Fc данной цепи. В дополнительных вариантах осуществления изобретения один домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может располагаться на амино-конце во фрагменте участка Fc данной цепи, в то время как второй домен гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи может располагаться на карбоксильном конце фрагмента участка Fc данной цепи. Другими словами, в таких вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc помещен между двумя доменами гетеродимеризации иммуноглобулина в каждой цепи. Фрагмент участка Fc. Как указано в тексте данной заявки, полипептидные гетеродимеры по данному изобретению включают фрагмент константного домена участка Fc (также обозначаемого здесь как фрагмент участка Fc) в каждой полипептидной цепи. Включение фрагмента участка Fc замедляет клиренс гетеродимеров из кровеносного русла после введения субъекту. Путем мутаций или других изменений, фрагмент участкаFc дополнительно обеспечивает относительно легкую модуляцию эффекторных функций полипептидного гетеродимера (например, АЗКЦ, АЗКФ, КЗЦ, фиксация комплемента и связывание с рецепторами Fc),которая может быть повышена или понижена в зависимости от подвергнутого лечению заболевания, как это известно в науке и описано в тексте данной заявки. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc полипептидных гетеродимеров по данному изобретению будет способен опосредовать одну или более таких эффекторных функций. Фрагмент участка Fc, присутствующий в одноцепочечных полипептидах, которые образуют часть полипептидных гетеродимеров по данному изобретению, может включать домен СН 2, домен СН 3, домен СН 4 или любую их комбинацию. Например, фрагмент участка Fc может включать домен СН 2, домен СН 3, оба домена СН 2 и СН 3, оба домена СН 3 и СН 4, два домена СН 3, домен СН 4 или два домена СН 4. Домен СН 2, который может образовывать фрагмент участка Fc одноцепочечного полипептидного гетеродимера по данному изобретению, может быть представлен доменом СН 2 иммуноглобулина дикого типа или измененным доменом СН 2 иммуноглобулина из определенных классов или подклассов иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD) и из различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 2 представлен доменом СН 2 иммуноглобулина человека дикого типа, таким как домены СН 2 дикого типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1,IgA2 или IgD человека с последовательностями SEQ ID NO:115, 199-201 и 195-197 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 2 представлен участком СН 2 IgG1 человека дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 115. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 2 представлен измененным участком СН 2 иммуноглобулина (например, измененным доменом СН 2 IgG1 человека), который включает аминокислотную замену в положении аспарагина 297 (например, замена аспарагина аланином). Такая замена аминокислоты снижает или элиминирует гликозилирование в данном сайте и упраздняет эффективное связывание Fc с Fc R и C1q. Последовательность измененного домена СН 2 IgG1 человека с заменой Асн на Ала в положении 297 представлена SEQ ID NO:324. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 2 представлен измененным участком СН 2 иммуноглобулина (например, измененным доменом СН 2 IgG1 человека), который включает по меньшей мере одну замену или делецию в положениях от 234 до 238. Например, участок СН 2 иммуноглобулина может включать замену в положении 234, 235, 236, 237 или 238, положениях 234 и 235, положениях 234 и 236, положениях 234 и 237, положениях 234 и 238, положениях 234-236, положениях 234,235 и 237, положениях 234, 236 и 238, положениях 234, 235, 237, и 238, положениях 236-238, или любую другую комбинацию двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238. В дополнение или в качестве альтернативы измененный участок СН 2 может включать одну или более (например, две, три,четыре или пять) делеций аминокислот в положениях 234-238, например, в положении 236 или положении 237, в то время как в других положениях присутствует замена. Указанные выше мутации снижают или элиминируют активность антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или способность связывания рецептора Fc полипептидного гетеродимера, который включает измененный домен СН 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в одном или более положениях 234-238 были заменены одним или более остатками аланина. В дополнительных вариантах осуществления изобретения только один аминокислотный остаток в положении 234-238 удален, в то время как одна или более оставшихся аминокислот в положениях 234-238 могут быть заменены другой аминокислотой (например, аланином или серином). В других некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 2 представлен измененным участком СН 2 иммуноглобулина (например, измененным доменом СН 2 IgG1 человека), который включает одну или более замен аминокислот в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, участок СН 2 иммуноглобулина может включать замену в положении 253, 310, 318, 320, 322 или 331, положениях 318 и 320, положениях 318 и 322, положениях 318, 320 и 322, или любую другую комбинацию двух, трех,четырех, пяти или шести аминокислот в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Указанные выше мутации снижают или элиминируют комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) полипептидного гетеродимера, который включает измененный домен СН 2. В других некоторых вариантах осуществления изобретения в добавление к замене аминокислоты в положении 297, измененный участок СН 2 (например, измененный домен СН 2 IgG1 человека) может до- 23023674 полнительно включать одну или более (например, две, три, четыре или пять) дополнительных замен в положениях 234-238. Например, участок СН 2 иммуноглобулина может включать замену в положениях 234 и 297, положениях 234, 235 и 297, положениях 234, 236 и 297, положениях 234-236 и 297, положениях 234, 235, 237 и 297, положениях 234, 236, 238 и 297, положениях 234, 235, 237, 238 и 297, положениях 236-238 и 297, или любую другую комбинацию двух, трех, четырех или пяти аминокислот в положениях 234-238 в дополнение к положению 297. В дополнение или в качестве альтернативы, измененный участок СН 2 может включать одну или более (например, две, три, четыре или пять) делеций аминокислот в положениях 234-238, например, в положении 236 или положении 237. Дополнительные мутации снижают или элиминируют активность антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности(АЗКЦ) или способность связывания рецептора Fc полипептидного гетеродимера, который включает измененный домен СН 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки в одном или более положениях 234-238 были заменены одним или более остатками аланина В дополнительных вариантах осуществления изобретения только один аминокислотный остаток в положении 234238 удален, в то время как одна или более оставшихся аминокислот в положениях 234-238 могут быть заменены другой аминокислотой (например, аланином или серином). В некоторых вариантах осуществления изобретения в дополнение к одной или более (например, 2,3, 4 или 5) заменам аминокислот в положениях 234-238, мутированный участок СН 2 (например, измененный домен СН 2 IgG1 человека) в белке слияния по данному изобретению может содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или 6) дополнительных замен аминокислот (например, замененных аланином) в одном или более положениях, участвующих в фиксации комплемента (например, в положениях I253,Н 310, Е 318, K320, K322 или Р 331). Примеры мутированных участков СН 2 иммуноглобулина включают участки СН 2 IgG1, IgG2, IgG4 человека и IgG2a мыши с замеными аланином в положениях 234, 235, 237(если присутствует), 318, 320 и 322. Типичный мутированный участок СН 2 иммуноглобулина представлен участком СН 2 IGHG2c мыши с заменами аланином в положениях L234, L235, G237, Е 318, K320 иK322 (SEQ ID NO:314). В других вариантах осуществления изобретения дополнительно к аминокислотной замене в положении 297 и дополнительной делеции(-ям) или замене(-ам) в положениях 234-238, измененный участок СН 2 (например, измененный домен СН 2 IgG1 человека) может дополнительно включать одну или более(например, две, три, четыре, пять или шесть) дополнительных замен в положениях 253, 310, 318, 320, 322 и 331. Например, участок СН 2 иммуноглобулина может включать (1) замену в положении 297, (2) одну или более замен или делеций или их комбинацию в положениях 234-238, и одну или более (например, 2,3, 4, 5 или 6) аминокислотных замен в положениях 1253, Н 310, Е 318, K320, K322 и Р 331, таких как одна,две, три замены в положениях Е 318, K320 и K322. Аминокислоты в указанных выше положениях могут быть заменены аланином или серином. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок СН 2 иммуноглобулина полипептида включает: (i) замену аминокислоты аспарагин в положении 297 и одной аминокислоты в положении 234,235, 236 или 237; (ii) замену аминокислоты аспарагин в положении 297 и двух аминокислот в положениях 234-237; (iii) замену аминокислоты аспарагин в положении 297 и аминокислот в трех положениях 234237; (iv) замену аминокислоты аспарагин в положении 297, аминокислот в положениях 234, 235 и 237, и делецию аминокислоты в положении 236; (v) замену аминокислот в трех положениях 234-237 и аминокислот в положениях 318, 320 и 322; или (vi) замену аминокислот в трех положениях 234-237, делецию аминокислоты в положении 236, и замены аминокислот в положениях 318, 320 и 322. Типичные измененные участки СН 2 иммуноглобулина с заменами аминокислоты аспарагин в положении 297 включают: участок СН 2 IgG1 человека с заменами аланина в положениях L234, L235, G237 и N297 и делецию в положении G236 (SEQ ID NO:325), участок СН 2 IgG2 человека с заменами аланина в положениях V234, G236 и N297 (SEQ ID NO:326), участок СН 2 IgG4 человека с заменами аланина в положениях F234, L235, G237 и N297 и делецию G236 (SEQ ID NO:322), участок СН 2 IgG4 человека с заменами аланина в положениях F234 и N297 (SEQ ID NO:343), участок СН 2 IgG4 человека с заменами аланина в положениях L235 и N297 (SEQ ID NO:344), участок СН 2 IgG4 человека с заменами аланина в положениях G236 и N297 (SEQ ID NO:345), и участок СН 2 IgG4 человека с заменами аланина в положениях G237 и N297 (SEQ ID NO:346). В некоторых вариантах осуществления изобретения в дополнение к описанным выше заменам аминокислот измененный участок СН 2 (например, измененный домен СН 2 IgG1 человека) может содержать одну или более дополнительных замен аминокислот в одном или более положениях, кроме указанных выше положений. Такие замены аминокислот могут быть представлены заменами консервативных или неконсервативных аминокислот. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения Р 233 может быть изменен на Е 233 в измененном участке СН 2 IgG2 (см., например, SEQ ID NO:326). Кроме того или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления изобретения измененный участок СН 2 может содержать одну или более вставок, делеций аминокислот, или оба явления. Вставка(-и),делеция(-и) или замена(-ы) могут быть в любом участке СН 2 иммуноглобулина, таком как N- или Сконец участка СН 2 иммуноглобулина дикого типа, полученный в результате соединения участка СН 2 с другим участком (например, связывающим доменом или доменом гетеродимеризации иммуноглобулина) посредством шарнирного участка. В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный участок СН 2 в полипептидном гетеродимере по данному изобретению включает или представлен последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% участку СН 2 иммуноглобулина дикого типа,такому как участок СН 2 IgG1, IgG2 или IgG4 человека дикого типа или IgG2a мыши дикого типа (например, IGHG2c). Измененный участок СН 2 иммуноглобулина в полипептидном гетеродимере по данному изобретению может быть получен из участка СН 2 различных изотипов иммуноглобулинов, таких как IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 и IgD, из различных видов (включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный участок СН 2 иммуноглобулина в белке слияния по данному изобретению может быть получен из участка СН 2 IgG1, IgG2 или IgG4 человека или IgG2a мыши (например, IGHG2c) с последовательностями SEQ ID NO:115, 199, 201 и 320. В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен СН 2 представлен доменом СН 2 IgG1 человека с заменой на аланин в положениях 235, 318, 320 и 322 (т.е. доменом СН 2 IgG1 человека с заменами L235A, Е 318 А, K320 А и K322 А) (SEQ ID NO:595), и в некоторых случаях с мутациейN297 (например, в аланин). В других некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен СН 2 представлен доменом СН 2 IgG1 человека с заменами на аланин в положениях 234, 235, 237,318, 320 и 322 (т.е. доменом СН 2 IgG1 человека с заменами L234A, L235A, G237A, Е 318 А, K320 А иK322 А) (SEQ ID NO:596), и в некоторых случаях с мутацией N297 (например, в аланин). В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен СН 2 представлен измененным доменом СН 2 IgG1 человека с мутациями, известными в науке, которые повышают иммунологическую активность, такую как АЗКЦ, АЗКФ, КЗЦ, фиксацию комплемента, связывание рецептора Fc или любую их комбинацию. Домен СН 3, который может образовывать фрагмент участка Fc одноцепочечного полипептида гетеродимера по данному изобретению, может быть представлен доменом СН 3 иммуноглобулина дикого типа или измененным доменом СН 3 иммуноглобулина из определенных классов или подклассов иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM) и из различных видов(включая человека, мышь, крысу и других млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 представлен доменом СН 3 иммуноглобулина человека дикого типа, таким как домены СН 3 дикого типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM человека с последовательностями SEQ ID NO:116, 208-210, 204-207 и 212 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 представлен участком СН 3 IgG1 дикого типа с последовательностью SEQ IDNO:116. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 3 представлен измененным доменом СН 3 иммуноглобулина человека, таким как измененный домен СН 3 на основе или полученный из домена СН 3 дикого типа антител к IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM человека. Например, измененный домен СН 3 может быть представлен доменом СН 3 IgG1 человека с одной или двумя мутациями в положениях Н 433 и N434 (положения пронумерованы в соответствии с нумерацией ЕС). Мутации в таких положениях могут участвовать в фиксации комплемента. В других некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен СН 3 может быть представлен доменом СН 3 IgG1 человека, но иметь одну или две замены аминокислот в положении F405 или Y407. Аминокислоты в таких положениях участвуют во взаимодействии с другим доменом СН 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения измененный домен СН 3 может быть представлен доменом СН 3 IgG1 человека с последним удаленным лизином. Последовательность такого измененного домена СН 3 представлена SEQ IDNO:761. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер включает пару СН 3, которая включает так называемые мутации "выступов во впадину" (см. Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966). Более специфически,мутации могут быть введены в каждый из двух доменов СН 3, таким образом, необходима пространственная комплементарность для ассоциации облигатов СН 3/СН 3 двух таких доменов СН 3 для образования пары друг с другом. Например, домен СН 3 в одном одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию T366W (мутацию "выступ", в результате которой небольшую аминокислота заменяется на большую аминокислоту), и домен СН 3 в другом одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера может содержать мутацию Y407A (мутацию "впадина", в результате которой более крупная аминокислота заменяется на меле крупную). Другие типичные мутации выступов во впадину включают (1) мутацию T366Y в одном домене СН 3 и Y407T в другом домене СН 3, и (2) мутацию T366W в одном домене СН 3 и мутации T366S, L368A и Y407V в другом домене СН 3. Домен СН 4, который может образовывать фрагмент участка Fc одноцепочечного полипептида гетеродимера по данному изобретению, может быть представлен доменом СН 4 иммуноглобулина дикого типа или измененным доменом СН 4 иммуноглобулина из молекул IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 4 представлен доменом СН 4 иммуноглобулина человека дикого типа, таким как домены СН 4 дикого типа молекул IgE и IgM человека с SEQ ID NO:213 и 214 соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен СН 4 представлен измененным доменом СН 4 иммуноглобулина человека, таким как измененный домен СН 4 на основе или полученный из домена СН 4 молекул IgE или IgM человека, которые содержат мутации, повышающие или снижающие иммунологическую активность, ассоциированную с участком Fc IgE или IgM. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент константного домена участка Fc в гетеродимерах по данному изобретению включает комбинацию доменов СН 2, СН 3 или СН 4 (т.е. более одного константного субдомена, выбираемого из СН 2, СН 3 и СН 4). Например, фрагмент участка Fc может включать домены СН 2 и СН 3 или домены СН 3 и СН 4. В других некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc может включать два домена СН 3 и не включать домены СН 2 или СН 4 (т.е. только два или более СН 3). Множественные константные субдомены, которые образуют фрагмент участка Fc, могут быть основаны или получены из одной и той же молекулы иммуноглобулина, или одного и того же класса или подкласса молекул иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc представлен IgG CH2CH3 (например, IgG1 CH2CH3, IgG2CH2CH3 и IgG4 CH2CH3) и может быть представлен (например, IgG1, IgG2 и IgG4 человека) СН 2 СН 3 человека Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc включаетIgG1 человека с удаленным последним лизином. В альтернативном варианте множественные константные субдомены могут быть основаны или получены из разных молекул иммуноглобулинов или разных классов или подклассов молекул иммуноглобулинов. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc включает домен СН 3 IgM человека и домен СН 3 IgG1 человека. Множественные константные субдомены, которые образуют фрагмент участка Fc, могут быть напрямую соединены или могут быть соединены друг с другом посредством одной или нескольких (например, примерно 2-10) аминокислот. Типичные фрагменты участка Fc имеют последовательность SEQ ID NO:305-309, 321, 323, 341, 342 и 762. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты участка Fc обоих одноцепочечных полипептидов полипептидного гетеродимера идентичны друг другу. В других некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент участка Fc одного одноцепочечного полипептида полипептидного гетеродимера отличается от фрагмента участка Fc другого одноцепочечного полипептида гетеродимера. Например, фрагмент участка Fc может включать домен СН 3 с мутацией "выступ", в то время как другой фрагмент участка Fc может включать домен СН 3 с мутацией "впадина". Шарнирный участок. Шарнирный участок, содержащийся в одноцепочечном полипептиде полипептидного гетеродимера по данному изобретению, может быть расположен (а) непосредственно сразу в направлении амино-конца относительно фрагмента участка Fc (например, в зависимости от изотипа, в насправлении амино-конца домена СН 2, в то время как фрагмент участка Fc представлен СН 2 СН 3, или в насправлении амино-конца домена СН 3, в то время как фрагмент участка Fc представлен СН 3 СН 4), (б) между и соединяет связывающий домен (например, scFv) и домен гетеродимеризации иммуноглобулина, (в) между и соединяет домен гетеродимеризации иммуноглобулина и фрагмент участка Fc (например, если фрагмент участка Fc представлен СН 2 СН 3 или СН 3 СН 4, в зависимости от изотипа или изотипов), (г) между и соединяет фрагмент участка Fc и связывающий домен, (д) на амино-концеодноцепочечного полипептида, или (е) на карбоксил-конце одноцепочечного полипептида. Одноцепочечный полипептид, включающий шарнирный участок, как это описано в тексте данной заявки, будет способен ассоциировать с другим одноцепочечным полипептидом слияния с образованием описанного здесь полипептидного гетеродимера, и образованный полипептидный гетеродимер будет иметь связывающий домен, сохраняющий свою специфичность относительно мишени или аффинность связывания с отдельной мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок представлен одноцепочечным полипептидом, который образует полипептидный гетеродимер с другим одноцепочечным полипептидом, и может быть представлен шарнирным участком иммуноглобулина, таким как шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа или измененный шарнирный участок иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок представлен шарнирным участком иммуноглобулина человека дикого типа (например, шарнирными участками иммуноглобулина человека с SEQ ID NO:215-221). В других некоторых вариантах осуществления изобретения на аминоили карбоксильный конец шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа в качестве части молекулы белка слияния может быть добавлен один или более аминокислотных остатков. Например, дополнительные соединяющие аминокислотные остатки на аминоконце могут быть представлены "RT", "RSS", "TG",или "Т", или на карбоксильном конце могут быть представлены "SG", или шарнирный участок может иметь делецию в комбинации со вставкой, такой как Р с "SG", добавленным на карбоксильном конце. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок представлен измененным шарнирным участком иммуноглобулина, в котором один или более остатков цистеина в шарнирном уча- 26023674 стке иммуноглобулина дикого типа заменены одним или более остатками аминокислот (например, серином или аланином). Например, шарнирный участок может быть представлен измененным шарнирным участком иммуноглобулина на основе или полученном из шарнирного участка IgG1 человека дикого типа с SEQ ID NO:667, который от амино- до карбокси-конца включает верхний шарнирный участок(EPKSCDKTHT, SEQ ID NO:227) и базовый шарнирный участок (СРРСР, SEQ ID NO:228). Типичные измененные шарнирные участки иммуноглобулина включают шарнирный участок иммуноглобулинаIgG1 человека, имеющий один, два или три остатка цистеина, присутствующих в шарнирном участкеIgG1 человека дикого типа, замененных одним, двумя или тремя остатками других аминокислот (например, серином или аланином). Измененный шарнирный участок иммуноглобулина может дополнительно включать пролин, замененный другой аминокислотой (например, серином или аланином). Например,описанный выше измененный шарнирный участок IgG1 человека может дополнительно включать пролин, расположенный в направлении карбокси-конца относительно трех цистеинов шарнирного участкаIgG1 человека дикого типа, замененный остатком другой аминокислоты (например, серином, аланином). В одном варианте осуществления изобретения пролин основного шарнирного участка не заменен. Типичные измененные шарнирные участки иммуноглобулина имеют последовательность SEQ ID NO:229240, 255, 664-677, и 748-759. Пример измененного шарнирного участка IgG1 представлен измененным шарнирным участком IgG1 человека, в котором первый цистеин заменен на серин. Последовательность такого измененного шарнирного участка IgG1 представлена SEQ ID NO:664 и обозначена как "шарнирный участок IgG1 SCC-P человека" или "шарнирный участок SCC-P". В некоторых вариантах осуществления изобретения на амино- или карбоксильный конец мутированного шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа в качестве части молекулы белка слияния может быть добавлен один или более аминокислотных остатков (например, "RT", "RSS" или "Т"). В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок полипептида включает или представлен последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична шарнирному участку иммуноглобулина дикого типа, такому как шарнирный участок IgG1 человека дикого типа, шарнирный участок IgG2 человека дикого типа или шарнирный участок IgG4 человека дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения шарнирный участок, присутствующий в одноцепочечном полипептиде, который образует полипептидный гетеродимер с другим одноцепочечным полипептидом, может быть представлен шарнирным участком, который не основан или не был получен из шарнирного участка иммуноглобулина (т.е. не является шарнирным участком иммуноглобулина дикого типа или измененным шарнирным участком иммуноглобулина). Такие типы не основанных на иммуноглобулине шарнирных участков могут использоваться на или возле карбоксильного конца (например,расположены в направлении карбокси-конца относительно фрагментов участков Fc) одноцепочечных полипептидов, образующих полипептидные гетеродимеры. Примеры таких шарнирных участков включают пептиды от примерно пяти до примерно 150 аминокислот междоменного или "стволового" участка С-лектинов II типа или молекул CD, например пептиды от примерно восьми до 25 аминокислот и пептиды от примерно семи до 18 аминокислот, и их производные. Термин "междоменный или "стволовой" участок" С-лектина II типа или молекулы CD обозначает участок внеклеточного домена С-лектина II типа или молекулы CD, расположенный между лектинподобным доменом С типа (CTLD; например, подобно CTLD рецепторам клетки естественного киллера) и трансмембранным доменом. Например, в молекуле CD94 человека (GenBank Accession No.AAC50291.1, PRI November 30, 1995) внеклеточный домен соответствует аминокислотным остаткам 34179, в то время как CTLD соответствует аминокислотным остаткам 61-176. В соответствии с этим междоменный или "стволовой" участок молекулы CD94 человека включает аминокислотные остатки 34-60,которые находятся между мембраной и CTLD (см. Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; для описаний других "стволовых" участков, см. также Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; и Figdor etal., Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002). Такие молекулы С-лектина II типа или CD также могут иметь от шести до 10 соединяющих аминокислот между "стволовым" участком и трансмембранным участком илиCTLD. В другом примере белок человека NKG2A с 233 аминокислотами (GenBank Accession No.P26715.1, PRI June 15, 2010) имеет трансмембранный домен, варьирующий с количеством аминокислот 71-93, и внеклеточный домен, варьирующий с количеством аминокислот 94-233. CTLD состоит из аминокислот 119-231, и "стволовой" участок включает аминокислоты 99-116, которые фланкированы соединениями пяти и двух аминокислот. Другие молекулы С-лектина II типа или CD, также как их внеклеточные лиганд-связывающие домены, междоменные или "стволовые" участки и CTLD хорошо известны в науке (см., например, GenBank Accession No. NP001993.2; ААН 07037.1, PRI July 15, 2006; NP001773.1,PRI June 20, 1010; AAL65234.1, PRI January 17, 2002 и САА 04925.1, PRI November 14, 2006, где указаны последовательности CD23, CD69, CD72, NKG2A и NKG2D человека и их описание соответственно)."Производное" междоменного или "стволового" участка, или его фрагмента, молекулы С-лектина II типа или CD включает от примерно восьми до примерно 150 аминокислот в последовательности, в которой одна, две или три аминокислоты "стволового" участка молекулы С-лектина II типа или CD дикого типа имеют делецию, вставку, замену или любую другую их комбинацию, например одно или более изменений представлены заменами или одна или более мутаций включают только одну делецию. В дополнительных вариантах осуществления изобретения производное междоменного или "стволового" участка более устойчиво к протеолитическому расщеплению в сравнении с последовательностью междоменного или "стволового" участка дикого типа, такой как последовательность из от примерно восьми до примерно 20 аминокислот NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 или CD94. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирные участки междоменного или "стволового" участка имеют от семи до 18 аминокислот и могут образовывать -спиральную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирные участки междоменного или "стволового" участка содержат 0, 1, 2, 3 или 4 цистеина. Типичные шарнирные участки междоменного или "стволового" участка представлены пептидными фрагментами междоменного или "стволового" участков, такими как фрагменты от десяти до 150 аминокислот из "стволовых" участков CD69, CD72, CD94, NKG2A иNKG2D с последовательностью SEQ ID NO:241-244, 716 и 601. Дополнительные типичные шарнирные участки междоменного или "стволового" участка включают участки с последовательностью SEQ IDNO:78, 734-737, 742-747 и 766-790. Альтернативные шарнирные участки, которые могут использоваться в одноцепочечных полипептидах полипептидных гетеродимеров, получают из участков рецепторов клеточной поверхности (междоменные участки), которые соединяют V-образные домены или С-образные домены иммуноглобулина. Участки между V-образными доменами Ig, в которых рецептор клеточной поверхности содержит множество V-образных доменов Ig в тандеме и между С-образными доменами Ig, в которых рецептор клеточной поверхности содержит множественные тандемные участки С-образных доменов Ig, также предусмотрены в качестве шарнирных участков, используемых в одноцепочечных полипептидах полипептидных гетеродимеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности шарнирных участков междоменных участков рецептора клеточной поверхности могут дополнительно содержать встречающийся в природе или дополненный мотив, такой как последовательность основного шарнирного участка IgG, который содержит одну или более дисульфидных связей для стабилизации образования полипептидного гетеродимера. Примеры шарнирных участков включают междоменные участки междуV-образными участками Ig и С-образными участками Ig CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66,CD80, CD86, CD150, CD166 и CD244. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности шарнирных участков имеют от примерно 5 до 150 аминокислот, от 5 до 10 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот, от 20 до 30 аминокислот, от 30 до 40 аминокислот, от 40 до 50 аминокислот, от 50 до 60 аминокислот, от 5 до 60 аминокислот, от 5 до 40 аминокислот, от 8 до 20 аминокислот или от 10 до 15 аминокислот. Шарнирный участок может быть первоначально гибким, но также может обеспечивать более жесткие характеристики или может содержать первично -спиральную структуру с минимальной -складчатой структурой. Длина или последовательности шарнирных участков могут влиять на аффинность связывания связывающих доменов, к которым присоединяются шарнирные участки прямым или непрямым образом (посредством другого участка или домена, такого как домен гетеродимеризации иммуноглобулина), а также на одну или более видов активности фрагмента участка Fc, к которому присоединяются шарнирные участки прямым или непрямым образом (см. примеры 9 и 10). В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности шарнирных участков устойчивы в плазме и сыворотке и устойчивы к протеолитическому расщеплению. Первый лизин в верхнем шарнирном участке IgG1 может быть мутирован для сведения к минимуму протеолитического расщепления, например, лизин может быть заменен метионином, треонином, аланином или глицином, или удален (см., например, SEQ ID NO:379-434, которые могут включать соединяющие аминокислоты на аминоконце, такие как RT). В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности шарнирных участков могут содержать встречающийся в природе или добавленный мотив, такой как структура основного шарнирного участка иммуноглобулина СРРСР (SEQ ID NO:228), которая характеризуется способностью образовывать дисульфидную связь или множество дисульфидных связей для стабилизации карбоксильного конца молекулы. В других вариантах осуществления изобретения последовательности шарнирных участков могут содержать один или более сайтов гликозилирования. Типичные шарнирные участки, включая измененные шарнирные участки иммуноглобулина, имеют последовательность SEQ ID NO:379-434, 618-749, и 763-791. В некоторых вариантах осуществления изобретения одноцепочечный полипептид полипептидного гетеродимера по данному изобретению включает более одного шарнирного участка. Например, одноцепочечный полипептид, имеющий два связывающих домена, один из которых находится на аминоконце и другой находится на карбоксильном конце, может иметь два шарнирных участка. Один шарнирный уча- 28023674 сток может быть прямым или непрямым образом (например, посредством домена гетеродимеризации иммуноглобулина) соединен со связывающим доменом в месте или около аминоконца, и другой шарнирный участок может быть присоединен (например, прямым образом) к другому связывающему домену в месте или около карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления изобретения, даже если одноцепочечный полипептид имеет только один связывающий домен, он может включать более одного шарнирного участка, например, на амино- или карбоксильном конце. Такой шарнирный участок может взаимодействовать с соответствующим шарнирным участком в другой цепи гетеродимера с образованием одной или более межцепочечных дисульфидных связей для облегчения или повышения гетеродимеризации двух цепей. Шарнирный участок (H-I) SCP-I полипептидного гетеродимера "соответствует" шарнирному участку (Н-II) SCP-II гетеродимера, при этом H-I и Н-II расположены на одном и том же конце фрагмента участка Fc соответствующего одноцепочечного полипептида. Например, полипептидный гетеродимер может включать следующие два одноцепочечных полипептида: Первую цепь полипептида от амино- до карбоксильного конца, включающую первый связывающий домен, СН 1, шарнирный участок, СН 2 и СН 3, и вторую цепь полипептида от амино- до карбоксильного конца, которая включает СК, первый шарнирный участок, СН 2, СН 3, второй шарнирный участок и второй связывающий домен. Шарнирный участок в первой цепи будет рассматриваться как "соответствующий" первому шарнирному участку второй цепи при сравнении аминоконца и фрагментов участка Fc, к которым он присоединяется. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых одноцепочечный полипептид полипептидного гетеродимера включает связывающий домен на или возле карбоксильного конца, шарнирный участок может присутствовать для соединения связывающего домена с другим участком одноцепочечного полипептида (например, фрагмента участка Fc или домена гетеродимеризации иммуноглобулина). В одном варианте осуществления изобретения такой шарнирный участок не имеет происхождения иммуноглобулина (т.е. шарнирный участок не основан или не получен из шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа) и может быть представлен "стволовым" участком С-лектина II или молекулы CD,междоменным участком, который соединяет V-образные или С-образные домены Ig рецептора клеточной поверхности, или производным, или их функциональным вариантом. Типичные карбокси-концевые шарнирные участки, иногда обозначаемые как "задние" шарнирные участки, включают участки с последовательностью SEQ ID NO:78, 734-737, 742-747 и 766-790. В некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок одноцепочечного полипептида полипептидного гетеродимера идентичен соответствующему шарнирному участку другой одноцепочечной полипептидной цепи гетеродимера В других некоторых вариантах осуществления изобретения шарнирный участок одной цепи отличается от такового участка второй цепи (по своей длине или последовательности). Разные участки в разных цепях обеспечивают различную манипуляцию аффинностью связывания связывающих доменов, к которым присоединяются шарнирные участки, таким образом,гетеродимер способен преимущественно связываться с мишенью одного связывающего домена через мишень второго связывающего домена. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидный гетеродимер имеет связывающий домен CD3 или TCR в одной цепи и связывающий домен относительно опухолевого антигена в другой цепи. Наличие двух разных шарнирных участков в двух цепях может обеспечивать связывание гетеродимера вначале с опухолевым антигеном, а затем с молекулой CD3 или TCR. Таким образом, гетеродимер может задействовать CD3+ Т-клетки для опухолевых клеток, несущих опухолевый антиген, который, в свою очередь, может повредить или уничтожить опухолевые клетки. Другие компоненты или модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения одноцепочечный полипептид, образующий гетеродимер с другим одноцепочечным полипептидом, может содержать один или более дополнительных доменов или участков. Такие дополнительные участки могут быть представлены лидерной последовательностью (также обозначаемой "сигнальным пептидом") на аминоконце для секреции экспрессируемого одноцепочечного полипептида. Типичные лидерные пептиды по данному изобретению включают естественные лидерные последовательности или другие последовательности, такие как SEQ ID NO:110 и 111. Дополнительные участки также могут быть представлены последовательностями на карбоксильном конце для идентификации или очистки одноцепочечных полипептидов (например, теги антигенных детерминант для определения или очистки, такие как тег гистидина, биотин, антигенная детерминантаFLAG или любая другая их комбинация). Дополнительные необязательные участки могут быть представлены дополнительными аминокислотными остатками (обозначаемыми как "соединяющие аминокислоты" или "соединяющие аминокислотные остатки"), имеющими в длину от 1 до примерно 10 аминокислот (например, от примерно 2 до 5 аминокислот), которые могут возникнуть в результате использования специфических систем экспрессии или построения вектора для одноцепочечных полипептидов по данному изобретению. Такие дополнительные аминокислотные остатки (например, одна, две, три, четыре или пять дополнительных аминокислот) могут присутствовать на амино- или карбоксильном конце или между различными участками или доменами одноцепочечного полипептида, такими как между связывающим доменом и доменом гетеродимеризации иммуноглобулина, между доменом гетеродимеризации иммуноглобулина и шарнирным