Конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, и способ ее получения
Номер патента: 24849
Опубликовано: 31.10.2016
Авторы: Блакскер Петер, Петерсен Ларс Кольстер, Хансен Нильс Якоб Вест, Хейтнер Тара Рени, Хансен Маргит Хохр
Формула / Реферат
1. Конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, как указано на фиг. 1а-1с, где указанная конструкция образует структуру "звезды", определяемую тремя или более стеблями, идущими от реакционного центра, причем по меньшей мере один стебель идет радиально от центра и каждый стебель содержит дуплекс нуклеиновой кислоты, а химическое соединение расположено в реакционном центре и сформировано в нем как продукт реакции трех или более химических групп и, по меньшей мере, ковалентно связано с нуклеиновой кислотой, указанная нуклеиновая кислота образована тремя или более олигонуклеотидами, ассоциированными с указанными химическими группами, где по меньшей мере одна из указанных ассоциированных химических групп ковалентно связана с одним из указанных трех или более олигонуклеотидов и где конструкция используется для технологии ДНК-дисплея in vitro.
2. Конструкция по п.1, где три или более стебля идут от реакционного центра наружу радиально.
3. Конструкция по п.1 или 2, где нуклеиновая кислота содержит один или несколько кодонов, идентифицирующих одну или несколько химических групп, которые участвуют в образовании указанного химического соединения.
4. Конструкция по п.3, где кодон расположен на конце стебля.
5. Конструкция по любому из пп.1-4, где на конце стебля образована петля.
6. Конструкция по любому из пп.1-5, где кодон расположен в части структуры стебель-петля, в которой не образуются пары оснований.
7. Конструкция по любому из пп.1-6, где в структуре стебель-петля присутствует сайт ферментативной рестрикции.
8. Конструкция по любому из пп.1-7, где петля способна гибридизоваться со вспомогательным олигонуклеотидом, образуя субстрат для фермента рестрикции.
9. Конструкция по п.8, в которой дуплексные связи денатурированы с образованием непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты и на всех стеблях, кроме одного, присутствует петля.
10. Конструкция по любому из пп.1-9, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты может быть ферментативно удлинена.
11. Конструкция по п.10, где нуклеиновая кислота содержит сайт праймирования ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы.
12. Конструкция по п.11, где сайт праймирования находится в стебле, не имеющем петли.
13. Конструкция по любому из пп.1-12, где стебель содержит два сегмента гибридизации, которые по меньшей мере на 80% комплементарны и каждый состоит из 12 или более нуклеотидов.
14. Конструкция по п.13, где каждый сегмент гибридизации содержит 18 или более нуклеотидов.
15. Конструкция по любому из пп.1-14, где один или несколько реагентов, таких как каркасы, сшивающие агенты, активирующие агенты, удаляющие защитные группы, являются свободными реагентами, не ассоциированными с нуклеиновой кислотой.
16. Библиотека конструкций, содержащая множество различных конструкций по любому из пп.1-15.
17. Способ получения одной или нескольких конструкций, содержащих нуклеиновую кислоту и химическое соединение, как представлено на фиг. 1а-1с, по любому из пп.1-15, включающий:
(i) стадию получения N (N=3-100) олигонуклеотидов с ассоциированной химической группой, содержащих:
(1) олигонуклеотид с ассоциированной химической группой первого положения, имеющий
i) сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида положения N, и
ii) сегмент, способный к гибридизации с сегментом олигонуклеотида второго положения,
(2) указанный(ые) олигонуклеотид(ы) положения n (n равен от 2 до N-1), имеющий(ие) сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида n-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида n+1, и
(3) указанный олигонуклеотид положения N, имеющий сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида N-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного первого олигонуклеотида,
где по меньшей мере три из указанных нуклеотидов содержат ассоциированную химическую группу, где по меньше мере одна указанная ассоциированная химическая группа ковалентно связана с одним из указанных по меньшей мере трех олигонуклеотидов;
(ii) стадию приведения в контакт указанных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами в условиях, при которых возможна гибридизация указанных сегментов олигонуклеотидов, так, что олигонуклеотиды образуют нуклеиновую кислоту, имеющую структуру "звезды", определенную N стеблями, идущими от реакционного центра, таким образом обеспечивая взаимодействие химических групп и образование химических соединений, где указанное образованное химическое соединение ассоциировано с нуклеиновой кислотой, что приводит к образованию конструкции по любому из пп.1-17, ассоциированной по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию обеспечения условий, при которых возможно лигирование концов олигонуклеотида n-1 с олигонуклеотидом n и олигонуклеотида N-1 с олигонуклеотидом N, с образованием, таким образом, непрерывной молекулы нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением.
19. Способ по п.17 или 18, где образованное химическое соединение ковалентно ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов или с непрерывной молекулой нуклеиновой кислоты.
20. Способ по п.17, где химические реакции осуществляют последовательно или одновременно и/или где указанное лигирование осуществляют ферментативно или химически и последовательно или одновременно.
21. Способ по любому из пп.1-20, включающий проведение дополнительной стадии ферментативной реакции удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения при условии, что, по меньшей мере, первый олигонуклеотид и/или, по меньшей мере, N-олигонуклеотид содержит сайт праймирования для ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или сайт обратной транскриптазы.
22. Способ по любому из пп.17-21, где N равно 3, 4, 5, 6 или 7.
23. Способ по любому из пп.17-22, где синтезируют более одной конструкции из различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами с образованием библиотеки различных конструкций.
24. Способ по п.23, где олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами, полученные на стадии (i) п.17, представляют собой по меньшей мере 10 различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами для каждого конкретного положения.
25. Способ по любому из пп.23 или 24, где олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами, полученные на стадии (i) п.17, представляют собой по меньшей мере 10 различных олигонуклеотидов с ассоциированными химическими группами для каждого из двух положений.
26. Способ осуществления олигонуклеотидной замены в конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-15, включающий:
а) стадию получения одноцепочечной непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты, как указано на стадии (i) п.17, то есть:
(i) получение N (N=3-100) олигонуклеотидов с ассоциированной химической группой, содержащих:
(1) олигонуклеотид с ассоциированной химической группой в первом положении, имеющий
i) сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида положения N, и
ii) сегмент, способный к гибридизации с сегментом олигонуклеотида второго положения,
(2) указанный(ые) олигонуклеотид(ы) положения n (n равен от 2 до N-1), имеющий(ие) сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида n-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного олигонуклеотида n+1, и
(3) указанный олигонуклеотид положения N, имеющий сегмент, способный к гибридизации с указанным сегментом указанного олигонуклеотида N-1, и сегмент, способный к гибридизации с сегментом указанного первого олигонуклеотида,
где по меньшей мере три из указанных нуклеотидов содержат ассоциированную химическую группу, где по меньше мере одна указанная ассоциированная химическая группа ковалентно связана с одним из указанных по меньшей мере трех олигонуклеотидов;
b) стадию гибридизации одноцепочечной непрерывной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии а), в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием конструкции, содержащей непрерывную нуклеиновую кислоту, содержащую, по меньшей мере, N-1 структуру стебель-петля и один стебель;
c) стадию введения разрыва либо в указанный стебель, либо в N-1 структуру стебель-петля с образованием первого стебля с первым одноцепочечным выступом и первым отступающим концом указанного первого стебля;
d) стадию получения первого олигонуклеотида с ассоциированными химическими группами, имеющего, по меньшей мере, сегмент, способный к гибридизации с указанным первым стеблем, и сегмент, способный к гибридизации со следующим стеблем, или структурой стебель-петля, расположенной рядом с первым стеблем с ассоциированной химической группой, и первый антикодон, способный к гибридизации с первым одноцепочечным выступом указанного первого стебля;
e) стадию обеспечения условий, при которых возможна гибридизация первого антикодона первого олигонуклеотида с ассоциированной химической группой и первого одноцепочечного выступа; и
f) стадию обеспечения условий, при которых возможно ферментативное или химическое лигирование указанного олигонуклеотида с ассоциированной химической группой с первым отступающим концом указанного первого стебля с образованием первой структуры стебель-петля;
и осуществление стадий:
i) стадии расщепления ферментом рестрикции следующего стебля или структуры стебель-петля с образованием следующего стебля с одноцепочечным выступом и следующим отступающим концом указанного следующего стебля; и
ii) стадии денатурации нуклеиновых кислот; и
iii) стадии гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием N-1 структуры стебель-петля и одного стебля с указанным следующим одноцепочечным выступом; и
iv) стадии обеспечения условий, при которых возможна реакция указанных химических групп, с образованием химического соединения, ассоциированного по меньшей мере с одним из указанных олигонуклеотидов конструкции; и
v) стадии получения следующего олигонуклеотида с ассоциированной химической группой, имеющего, по меньшей мере, сегмент, способный к гибридизации с указанным следующим стеблем, и сегмент, способный к гибридизации со стеблем или структурой стебель-петля, расположенной рядом со стеблем, и имеющий следующий сегмент антикодона, способный к гибридизации со следующим одноцепочечным выступом; и
vi) стадии обеспечения условий, при которых возможно ферментативное или химическое лигирование гибридизованного следующего олигонуклеотида со следующим отступающим концом указанного следующего стебля; и
повторение стадий i)-vi) N-1 раз; и
g) стадии введения разрыва в указанную первую структуру стебель-петля, частично состоящую из указанного первого олигонуклеотида, оставляя, по меньшей мере, указанный первый антикодон, соединенный с указанным первым олигонуклеотидом, с ассоциированной первой химической группой; и
h) стадии денатурации нуклеиновых кислот; и
i) стадии гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием конструкции, содержащей, по меньшей мере, N-1 структуру стебель-петля и один стебель; и
j) стадии обеспечения условий, при которых возможна реакция указанных химических групп с образованием химического соединения,
где образованное химическое соединение ковалентно присоединено по меньшей мере к одной из указанных конструкций.
27. Способ по п.26, где разрывы в стеблях или петлях вводят ферментами рестрикции, РНКазой, эндонуклеазой III, эндонуклеазой VIII, APE, Fpg, химическим расщеплением или фоторасщеплением.
28. Способ по п.26, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты стадии а) может быть получена способом по пп.17-25, но без включения химических групп (фиктивная библиотека).
29. Способ по п.26, где непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты стадии а) может быть получена способом по п.21.
30. Способ по п.29, где продукт удлинения по п.24 амплифицируют при помощи ПЦР.
31. Способ по любому из пп.26-30, где непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты стадии а), b) или с) получают путем иммобилизации смысловой цепи продукта ПЦР на твердом носителе, отделения твердого носителя, что делает возможным самогибридизацию смысловой цепи, с образованием, таким образом, структуры "звезды", и путем разрыва стебля, соединяющего самогибридизованную структуру "звезды" с твердым носителем, освобождая, таким образом, структуру "звезды" от твердого носителя.
32. Способ по п.31, где самогибридизацию проводят мгновенным охлаждением.
33. Способ по п.31 или 32, где разрыв стебля, соединяющего твердый носитель и повторно уложенную структуру "звезды", осуществляют с использованием фермента рестрикции.
34. Способ по любому из пп.26-33, дополнительно включающий стадию добавления вспомогательного олигонуклеотида, комплементарного последовательности петли, перед стадией расщепления для создания двухцепочечного субстрата для фермента рестрикции в петле.
35. Способ скрининга библиотеки на химическое соединение, которое образует часть конструкции и обладает желаемым свойством, где указанная библиотека содержит более одной конструкции, полученной, как описано в п.21, где каждая указанная конструкция содержит нуклеиновую кислоту, образованную тремя или более стеблями, и химическое соединение, ковалентно связанное с указанной нуклеиновой кислотой, включающий
стадию зондирования библиотеки на конструкции, имеющие ковалентно присоединенное химическое соединение с желаемым свойством;
отделение конструкций, обладающих желаемым свойством, от конструкций, не обладающих желаемым свойством; и получая пул, обогащенный конструкциями, обладающими желаемым свойством.
36. Способ по п.35, где способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты конструкций обогащенного пула.
Текст
КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ И ХИМИЧЕСКОЕ СОЕДИНЕНИЕ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Описана конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, причем указанная конструкция образует звездообразную структуру, определяемую тремя или более стеблями, простирающимися из реакционного центра. Стебли образованы дуплексом нуклеиновой кислоты, и химическое соединение образовалось в реакционном центре в качестве продукта реакции трех или более химических групп. Преимущество конструкции заключается в том,что обеспечивается тесная близость между химическими группами в реакционном центре с промотированием посредством этого реакции образования химического соединения. Настоящее изобретение относится также к способу получения конструкции. Преимущество данного способа заключается в том, что он не требует предварительного синтеза большого количества матриц и не зависит от узнавания кодон/антикодон для кодируемой молекулы, которая должна быть синтезирована. Хансен Нильс Якоб Вест, Блакскер Петер, Хансен Маргит Хохр, Петерсен Ларс Кольстер, Хейтнер Тара Рени Область техники, к которой относится изобретение Изобретение обеспечивает композиции и способы для технологии ДНК-дисплея in vitro, позволяющие осуществлять дисплей различных молекул, таких как неприродные полимеры и малые молекулы. Преимуществами таких способов является то, что комбинаторные библиотеки могут быть сконструированы и подвергнуты раундам отбора на желаемые активности, амплификации и диверсификации, что делает возможной молекулярную эволюцию. Уровень техники Технологии дисплея были разработаны для объединения способностей хранения информации и амплификации нуклеиновых кислот с функциональными активностями другого соединения. Технологии дисплея основываются на связи между функциональной частицей и последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей информацию о структуре этой функциональной частицы. Преимущество таких способов заключается в том, что очень большие библиотеки могут быть сконструированы и протестированы на желаемую активность функциональных частиц. Члены библиотеки, имеющие желаемую активность, могут быть отделены от членов библиотеки, не имеющих желаемой активности, с получением обогащенной библиотеки с более высокой долей членов, имеющих желаемую активность. Такой процесс называют отбором. Затем структуры членов библиотеки в обогащенной библиотеке могут быть идентифицированы по их родственной последовательности нуклеиновой кислоты, что делает возможной идентификацию даже из незначительных количеств материала. Кроме того, некоторые технологии дисплея делают возможной амплификацию обогащенной библиотеки без знания идентичности ее членов; не только последовательностей нуклеиновых кислот, но также функциональных частиц. Такие технологии дисплея называют амплифицируемыми технологиями дисплея". Указанные технологии являются особенно выгодными при работе с большими библиотеками,так как могут выполняться итеративные (повторяющиеся) раунды отбора и амплификации, делающие возможным увеличенное обогащение желаемых активностей. Другое преимущество амплифицируемых технологий дисплея заключается в том, что могут выполняться раунды отбора, амплификации и диверсификации, т.е. использование того же принципа, что и принцип естественного отбора, для развития молекул с желаемой функцией. Процесс называют молекулярной эволюцией. Были разработаны технологии дисплея, использующие биологические системы, наиболее значительной из которых является фаговый дисплей (Smith, Science, 228, 1315-7, 1985). Однако такие системы ограничиваются дисплеем природных продуктов, таких как белки и пептиды. Были описаны технологии дисплея in vitro, использующие гибкость органической химии. Один пример описан в США 5723598. Данный способ использует бифункциональную молекулу; одна функциональная группа способна присоединять химическую группу, а другая функциональная группа способна присоединять последовательность нуклеиновой кислоты. Способ синтеза такой библиотеки обычно известен как "расщепление и смешивание" и состоит из раундов смешивания и расщепления бифункциональных молекул в компартментах. Добавляют специфическую в отношении компартмента пару химической группы и последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, последовательности нуклеиновых кислот кодируют химические группы. Затем все бифункциональные молекулы смешивают и процесс повторяют для создания большой комбинаторной библиотеки. Затем библиотеку подвергают отбору и отобранные последовательности нуклеиновых кислот амплифицируют при помощи ПЦР, которая может быть использована для идентификации при помощи общепринятых способов молекулярной биологии: клонирования и секвенирования ДНК. Другой пример описан в WO 04/039825A2, где комбинаторную библиотеку создают с использованием раундов направляемого близостью присоединения родственных пар химической группы и кода нуклеиновой кислоты к бифункциональной молекуле; одна функциональная группа способна присоединять химическую группу, а другая функциональная группа способна присоединять последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, используют репертуары так называемых единиц переноса, где химическая группа присоединена к олигонуклеотиду, содержащему кодирующий сегмент и сегмент, способный отжигаться с бифункциональной молекулой. Репертуар единиц переноса отжигают с бифункциональными молекулами, что позволяет коду переноситься ферментативно в бифункциональную молекулу,а также направлять химическую группу на реакцию с той же самой бифункциональной молекулой. Указанный процесс может повторяться циклически для создания большой комбинаторной библиотеки. Описанные выше библиотеки могут быть подвергнуты отбору для образования обогащенной библиотеки. История синтеза членов обогащенных библиотек может быть затем расшифрована через кодирующую нуклеиновую кислоту. Однако ограничением этих подходов является то, что обогащенная библиотека не может быть амплифицирована. Были описаны технологии дисплея in vitro, использующие гибкость органической химии и раунды отбора, амплификации и диверсификации. Эти способы основаны на применении матриц. Один пример описан в WO 00/23458, использующий принцип "расщепления и смешивания". Используют библиотеку одноцепочечных ДНК(ssDNA)-матриц, каждая из которых содержит сайт химической реакции и несколько положений сегментов кодонов. Матрицы компартментализуют на основании гибридизации с репертуаром последовательностей антикодонов для конкретного положения кодона. За-1 024849 тем компартмент-специфическую реакцию осуществляют модификацией реакционного сайта на матрицах. Затем матрицы смешивают и процесс повторяют циклически с использованием других положений кодонов для образования комбинаторной библиотеки. В WO 02/074929A2 описан другой пример, использующий принцип "единственного сосуда". Используют библиотеку олигонуклеотидных матриц, каждая из которых содержит сайт химической реакции и несколько положений сегментов кодонов. Кроме того, с использованием репертуара единиц переноса, данный способ включает использование олигонуклеотидной последовательности антикодона и химической реакционноспособной группы. Библиотеку матриц гибридизуют с репертуаром единиц переноса для конкретного положения кодона. Это вводит химическую группу на гибридизованную единицу переноса вблизи реакционного сайта на гибридизованной матрице, которая затем направляет химическую реакцию родственных пар. Затем процесс циклически повторяют с использованием других положений кодонов для образования комбинаторной библиотеки. Недостаток вышеописанного направления по принципу близости родственных пар кода и химической группы заключается в линейной структуре матричного олигонуклеотида. Вследствие линейности расстояние между кодоном и сайтом химической реакции будет различаться от одного положения кодона к другому положению кодона. Для положений кодонов, расположенных дальше от сайта реакции, направление по принципу близости становится компромиссным, так как локальная концентрация падает до показателя степени 3 в зависимости от расстояния. Этот недостаток становится более ярко выраженным для комплексных библиотек, с большим количеством положений кодонов и более сложными кодонами. Эту проблему пытаются решить авторы WO 04/016767A2, где единицы переноса, наряду с сегментом антикодона, содержат также константный сегмент, который комплементарен константной последовательности на матрице вблизи реакционноспособного сайта. Таким образом, гибридизация единицы переноса с матрицей приводит к тому, что последовательность матрицы между положением рассматриваемого кодона и константным сегментом "выпячивается" с образованием так называемой омегаструктуры. Такая концепция предполагает, что сегмент кодона является ответственным за специфичность, и константный сегмент является ответственным за близость. В WO 04/016767A2 предполагается также так называемая Т-структура матриц, где реакционноспособный сайт на матрице расположен в середине матрицы, и положения кодонов расходятся на каждой стороне. Таким образом, проблема расстояния, как говорится, "уменьшена наполовину". В WO 2004/056994A2 описан способ, аналогичный способу WO 02/074929A2 или WO 04/016767A2,с той разницей, что матрица разрезана на минорные последовательности, называемые в данном описании соединительными полинуклеотидами. Соединительные полинуклеотиды соединяют единицы переноса для приведения их в реакционную близость. В некоторых вариантах осуществления соединительные полинуклеотиды могут содержать реакционноспособную химическую группу. Для получения кодируемой молекулы способ зависит от узнавания кодон/антикодон перед реакцией. Затем направляемые матрицами библиотеки, описанные выше, подвергают отбору для образования обогащенных библиотек. Впоследствии история синтеза членов обогащенных библиотек может быть расшифрована через кодирующую нуклеиновую кислоту. Обогащенные библиотеки могут быть также амплифицированы и диверсифицированы, например, склонной к ошибкам ПЦР, что делает возможной молекулярную эволюцию. Недостаток таких подходов заключается в том, что должно быть создано большое количество матриц, что является трудоемким, так как матрицы должны иметь значительную длину, чтобы гарантировать правильную гибридизацию кодон/антикодон. В способах, использующих множество минорных последовательностей для осуществления конечного направленного синтеза, количество последовательностей, которые должны быть синтезированы, является даже более высоким, чем фактический размер библиотеки. Способы предшествующего уровня техники, использующие матрицы, страдают вследствие недостатка, заключающегося в том, что кодирование зависит от гибридизации последовательностей кодонов и антикодонов. Иногда гибридизация между одноцепочечными олигонуклеотидами будет происходить без точных комплементарностей. В случае конструирования библиотек результатом является потеря связи между кодированием и историей синтеза. В результате, после отбора положительные коды могут быть не отобранными, и отрицательные клоны могут быть отобраны. Для более сложных библиотек этот недостаток становится более важным, так как сложность одноцепочечных олигонуклеотидов также увеличивается как в отношении количеств, длины, так и в отношении последовательностей. Это делает указанные способы более трудным для контролирования. Как описано выше, были разработаны технологии дисплея in vitro, допускающими проявление(дисплей) различных классов соединений, отборов, амплификации и диверсификаций. Однако все еще существует растущая потребность в улучшении, особенно в отношении качества в конструировании библиотек и диверсификации. Настоящее изобретение предоставляет способ получения кодируемой молекулы, причем данный способ не требует предварительного синтеза большого количества матриц. Кроме того, данный способ не зависит от узнавания кодон/антикодон для кодируемой молекулы, которая должна быть образована. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к технологии дисплея in vitro, использующей преимущество гибкости органической химии и допускающей раунды отбора, амплификации и диверсификации. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей нуклеиновую кислоту и химическое соединение, причем указанная композиция образует звездообразную структуру, определяющую 3 или более стеблей, простирающихся из реакционного центра, причем стебли образованы дуплексом нуклеиновой кислоты, и химическое соединение образовывалось в реакционном центре в виде продукта реакции 3 или более химических групп. Нуклеиновая кислота образует сверхструктуру, в которой различные сегменты гибридизуются друг с другом таким образом, что образуется структура, похожая на звезду. Звездообразная структура содержит реакционный центр и множество стеблей. В реакционном центре химическое соединение получали в виде продукта реакции из 3 или более химических групп. Стебли являются дуплексами нуклеиновых кислот, т.е. стебель содержит два гибридизующихся сегмента, комплементирующих друг друга в достаточной степени для образования дуплекса в условиях, благоприятствующих реакции химических групп,таким образом, чтобы образовалось химическое соединение. По меньшей мере один из стеблей простирается радиально от центра. Предпочтительно, 3 или более стеблей простираются радиально наружу от реакционного центра. Считают, что дуплексная нуклеиновая кислота стеблей собирает химические группы вместе таким образом, что образуется реакционная близость. Близость, установленная между химическими группами, увеличивает локальную концентрацию и увеличивает шансы протекания реакции. Присутствие 3 или более стеблей в звездообразной структуре создает сильную сверхструктуру, которая является стабильной даже в условиях, в которых единый дуплекс будет разделяться на две дискретные одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Таким образом, звездообразная структура дает возможность использовать гибкие условия реакции для промотирования реакции между химическими группами. Эксперименты, о которых сообщается, показывают, что трехстебельная звездообразная структура является достаточно стабильной для направления органического синтеза в средах, содержащих более 35% ацетонитрила и тетрагидрофурана и более 40% ДМФА. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения звездообразная структура включает 4, 5, 6, 7 или более стеблей, соединенных с общим реакционным центром. При увеличении количества стеблей стабильность звездообразной структуры также увеличивается. Нуклеиновая кислота сегментирована на различные части с определенными функциями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит один или несколько кодонов, идентифицирующих одну или несколько химических групп, которые участвуют в образовании образуемого химического соединения. Присутствие сегмента кодона допускает не только использование нуклеиновой кислоты для промотирования реакционной близости, но также использование нуклеиновой кислоты для кодирования одной или нескольких химических групп, которые участвуют в образовании химического соединения. Присутствие одного или нескольких кодонов особенно полезно для целей декодирования. Когда образованное химическое соединение присутствует в малом количестве или присутствует в смеси с другими соединениями, легкая идентификация может быть выполнена с использованием молекулярно-биологических способов. Кодон, идентифицирующий химическую группу, может присутствовать в любом месте в нуклеиновой кислоте, образующей звездообразную структуру, т.е. кодон может присутствовать в реакционном центре или вблизи от реакционного центра, в сегментах гибридизации или в других частях звездообразной структуры. В определенном аспекте настоящего изобретения кодон расположен на конце стебля. Кодон, расположенный на конце стебля, направленном от центра, дает большую свободу в конструировании звездообразной структуры нуклеиновой кислоты, так как кодон на конце не должен обязательно принимать участие в образовании дуплекса или в образовании окружения для реакционного центра. Стебли могут иметь затупленные концы, липкие концы или может присутствовать петля. Стебель с затупленным концом или липким концом может быть предпочтительным, когда предполагается лигирование стебля с другой нуклеиновой кислотой. В определенном варианте осуществления на конце стебля образована петля. Петля образует физическую связь между двумя цепями, образуя таким образом ковалентную связь между различными частями сверхструктуры нуклеиновой кислоты. В определенном варианте осуществления петли присутствуют на всех концах стеблей, образуя таким образом кольцевую нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления петля присутствует на всех концах стеблей, за исключением одного конца, образуя таким образом непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, непрерывная последовательность содержит сайт праймирования для ферментативного удлинения нуклеиновой кислоты с использованием полимеразы или другого активного в отношении нуклеиновой кислоты фермента. В подходящих случаях сайт праймирования присутствует в стебле,не имеющем петли. Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит сайт праймирования для ДНКполимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы. Таким образом, петли допускают получение двухцепочечного продукта удлинения, демонстрирующего образованное химическое соединение. Важно, что продукт удлинения содержит обычно линейный дуплекс, т.е. комплементирующая цепь была образована реакцией удлинения. Реакция удлинения разрушает реакционный центр, так что хими-3 024849 ческое соединение, ранее образованное реакцией в реакционном центре, проявляется в среде. Проявление (дисплей) химического соединения дает возможность использовать различные стратегии отбора на библиотеке продуктов удлинения, как обсуждается позднее в данном описании. После отбора возможность амплификации нуклеиновой кислоты особенно важна для целей идентификации, так как химическое соединение может быть идентифицировано даже в случаях, в которых оно встречается только в незначительных количествах. Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит кодоны всех реагентов, которые участвуют в образовании кодируемого химического соединения. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кодон расположен в части, не имеющей спаривания оснований, структуры стебель-петля. Присутствие в петле кодона допускает использование любой комбинации нуклеотидов в данном конструировании, так как конкретная последовательность кодона не оказывает существенного влияния на гибридизацию и реакционные свойства. В некоторых аспектах настоящего изобретения в структуре стебель-петля присутствует сайт ферментативной рестрикции. В зависимости от конкретной используемой зндонуклеазы одна или обе цепи структуры стебель-петля могут быть разорваны. В определенном варианте осуществления только одна из цепей вблизи петли разрывается с образованием сегмента одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Сегмент одноцепочечной нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит кодон. Приемлемым для этой цели ферментом является N.Bbvc IA. В другом варианте осуществления обе цепи разрываются и образуется липкий конец, т.е. выступ одноцепочечной нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, кодон присутствует в одноцепочечном выступе. В одном аспекте настоящего изобретения предпочтительно добавлять хелперный (вспомогательный) олигонуклеотид, комплементарный петле по меньшей мере части последовательности нуклеиновой кислоты. В подходящих условиях хелперный олигонуклеотид гибридизуется с последовательностью петли и образует субстрат для фермента рестрикции (рестриктазы). Стебли звездообразной структуры могут иметь любую подходящую длину. Обычно, стебель содержит два сегмента гибридизации, имеющих по меньшей мере 80% комплементарность, и каждый сегмент гибридизации состоит из 12 или более нуклеотидов. Комплементарность обычно составляет 90% или более, например, 95% или более. Сегменты гибридизации могут содержать менее чем 12 нуклеотидов,для определенных применений, в которых стабильность звездообразной структуры может осуществляться, например, 11, 10, 9, 8, 7 или 6 нуклеотидами. Однако обычно желательно более высокая стабильность. Подходящую стабильность вбольшинстве условий получают, когда каждый сегмент гибридизации содержит 18 или более нуклеотидов. При использовании условий, которые не благоприятствуют гибридизации, т.е. температур, гораздо более высоких, чем температура окружающей среды, высоких концентраций соли или присутствия органических растворителей, обычно используют сегменты гибридизации из 20 или более нуклеотидов. После реакции отдельных химических групп образованное химическое соединение предпочтительно присоединяют к нуклеиновой кислоте. В некоторых применениях может быть желательным использование гибридизации для присоединения образованного химического соединения к нуклеиновой кислоте звездообразной структуры; однако ковалентное присоединение гарантирует, что химическое соединение и часть, являющаяся нуклеиновой кислотой, остаются вместе во время последующего отбора. Химическая группа, которая должна реагировать в реакционном центре, может быть связана с нуклеиновой кислотой любым подходящим способом. Например, химические группы перед реакцией ковалентно присоединяют к нуклеиновой кислоте. Обычно одно или несколько из ковалентных присоединений расщепляются одновременно с реакцией или после реакции. Ковалентная связь может быть сконструирована таким образом, что она является расщепляемой или долговременной. Кроме того, расщепляемая связь может быть сконструирована таким образом, что она расщепляется сразу же после реакции,или сконструирована таким образом, что она расщепляется на стадии после реакции. Обычно химическое соединение образуется реакцией химических групп, присоединенных к нуклеиновой кислоте, и, необязательно, одного или нескольких дополнительных реагентов. Реагенты могут происходить из любого источника, включая соединение, добавленное к среде в виде свободного реагента, не связанного с нуклеиновой кислотой. Дополнительный реагент или дополнительные реагенты могут быть каркасами, сшивающими агентами, активирующими агентами, удаляющими защитные группы агентами и т.д. Звездообразные структуры в соответствии с данным изобретением полезны в генерировании библиотек различных химических соединений, ассоциированных с генетическим кодом. Таким образом,настоящее изобретение относится также к библиотеке звездообразных структур. Каждая из звездообразных структур может присутствовать в нескольких копиях в среде, и среда обычно содержит звездообразные структуры, содержащие различные химические соединения. Например, библиотека согласно изобретению может содержать по меньшей мере 1000 различных химических соединений, предпочтительно 106 различных химических соединений и более предпочтительно 109 различных химических соединений. В другом аспекте настоящее изобретение может быть описано как относящееся, например, к способу синтеза больших библиотек, связанных с кодирующими нуклеиновыми кислотами через "звездооб-4 024849 разную структуру", образованную взаимокомплементарными олигонуклеотидами. Ее получают гибридизацией олигонуклеотидов, содержащих два сегмента, где сегмент около 3'-конца одного олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца в следующем олигонуклеотиде и т.д. Наконец, сегмент около 3'-конца последнего олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца первого олигонуклеотида. Таким образом, средняя зона между двумя сегментами гибридизации на каждом олигонуклеотиде направлена к центру образованного кольца, тогда как концы направлены наружу, что образует звездообразную структуру. Таким образом, при использовании трех типов олигонуклеотидов образуются три стебля, при использовании четырех типов олигонуклеотидов образуются четыре стебля и т.д. Химическая реакционноспособная группа ассоциирована со средней зоной на каждом олигонуклеотиде, что допускает протекание химических реакций, направляемых близостью к центру. Кроме того, кодон предпочтительно расположен снаружи от гибридизуемого сегмента на каждом олигонуклеотиде, что допускает кодирование химических групп, участвующих в создании продукта реакции. Олигонуклеотиды с ассоциированными химическими группами называют здесь модулями-носителями. Таким образом модуль-носитель имеет химическую группу, два положения специфических сегментов и кодон. Образование кодированных комбинаторных библиотек становится возможным при использовании репертуаров модулей-носителей для каждого положения. Согласно определенному варианту осуществления собранные олигонуклеотиды становятся удлиняемыми или амплифицируемыми при лигировании концов в каждом стебле, за исключением одного, посредством образования петель для образования непрерывного олигонуклеотида с 5'- и 3'-концами. Таким образом, состоящая из одного стебля и ряда структур стебельпетля звездообразная структура может быть амплифицирована при помощи ПЦР или удлинена подходящим ферментом. Таким образом, комбинаторная библиотека-дисплей может быть подвергнута отбору, и члены обогащенной библиотеки могут быть идентифицированы по кодирующим их олигонуклеотидам. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способу создания одной или нескольких химических структур, предусматривающему стадии:i) сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя положения N, иii) сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения,(2) модуль-носитель (модули-носители) положения n (n равен от 2 до N-1), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты модуляносителя n-1, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя(3) модуль-носитель положения N, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного модуля-носителя N-1, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя,где по меньшей мере три из указанных модулей-носителей содержат ассоциированную химическую группу (CG), расположенную в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи нее, и, необязательно, сегмент кодона, расположенный снаружи относительно одного из сегментов гибридизации;(ii) приведения в контакт указанных модулей-носителей в условиях, допускающих гибридизацию указанных сегментов гибридизации, с приведением таким образом указанных химических групп в близость, причем образованное химическое соединение связано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей.N обозначает общее количество модулей-носителей, используемых в образовании химической структуры. Так, при использовании трех модулей-носителей в образовании химической структуры N равно 3, при использовании четырех модулей-носителей в образовании химической структуры N равно 4,и т.д. n обозначает конкретное положение модуля-носителя. Таким образом, когда N равно 3, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуляносителя третьего положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (n=2), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и (3) используют модуль-носитель третьего положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя. Когда N равно 4, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя четвертого положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуляносителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (n=2), имеющий сег-5 024849 мент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и используют модуль-носитель третьего положения (n=3), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом четвертого модуля-носителя, и (3) используют модуль-носитель четвертого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного третьего модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя. Когда N равно 5, (1) используют модуль-носитель первого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом нуклеиновой кислоты модуля-носителя пятого положения, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом модуля-носителя второго положения; (2) используют модуль-носитель второго положения (n=2), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты первого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом третьего модуля-носителя; и используют модуль-носитель третьего положения (n=3), имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты второго модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом четвертого модуля-носителя (n=4), и используют модуль-носитель четвертого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного третьего модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного пятого модуля-носителя; и (3) используют модуль-носитель пятого положения, имеющий сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным сегментом нуклеиновой кислоты указанного четвертого модуля-носителя, и сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с сегментом указанного первого модуля-носителя. Вышеописанный способ может сопровождаться стадией обеспечения условий, делающих возможным лигирование концов модуля n-1 с модулем п и модуля N-1 с модулем N, с образованием посредством этого молекулы непрерывной нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением. Таким образом, когда N равно 3, концу первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, а концу второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем. Когда N равно 4, концу (n=2) первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, концу(n=3) второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем и концу третьего модуля позволяют лигироваться с четвертым модулем. Когда N равно 5, концу (n=2) первого модуля позволяют лигироваться с концом второго модуля, концу (n=3) второго модуля позволяют лигироваться с третьим модулем, концу (n=4) третьего модуля позволяют лигироваться с четвертым модулем и концу четвертого модуля позволяют лигироваться с концом пятого модуля. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, модули-носители положения N могут быть лигированы с первым модулем-носителем с образованием таким образом кольцевой нуклеиновой кислоты. Композиция, содержащая структуру нуклеиновой кислоты и ассоциированных химических соединений, полученная в соответствии с вышеописанным способом, является новой, так как модули-носители создают новую "звездообразную структуру", которая отличается от структур, созданных в предшествующем уровне техники. См., например, предшествующий уровень техники, описанный в разделе Уровень техники выше. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения обеспечен способ, который гарантирует тесную близость между реакционными химическими группами и амплификацию полного генетического кода истории синтеза образованного химического соединения. Таким образом, в предпочтительном аспекте данный способ предусматривает приведение в контакт модулей-носителей в условиях, допускающих гибридизацию сегментов гибридизации, приводящее таким образом к приведению реакционных групп в необходимую для реакции близость; и обеспечение условий, допускающих реакцию реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним модулем-носителем; и условий, делающих возможным лигирование концов модуля n-1 с модулем n и модуля N-1 с модулем N с образованием посредством этого молекулы непрерывной нуклеиновой кислоты со структурами стебель-петля и ассоциированным химическим соединением. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, N равно 3, 4, 5, 6, 7. Предпочтительно, каждый из модулей-носителей содержит ассоциированную химическую группу (CG), расположенную в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи от нее, и сегмент кодона снаружи от одного из сегментов гибридизации. Контактирование модулей-носителей может выполняться последовательно, т.е. модули-носители могут приводиться в контакт в любом порядке между отдельными модулями-носителями, или указанный контакт может выполняться одновременно, т.е. все модули-носители или по меньшей мере существенное количество модулей-носителей смешивают вместе в условиях гибридизации таким образом, чтобы образовывался надмолекулярный комплекс. При выполнении последовательной реакции химических групп и использовании только части из общего количества модулей-носителей, требуемых для сборки полной звездообразной структуры, могут быть использованы вспомогательные олигонуклеотиды для сборки звездообразной структуры, посредством которой образуется реакционный центр. Таким образом, когда стадия образования химического соединения включает сборку двух модулей-носителей посредством гибридизации соответствующих сегментов гибридизации, вспомогательный олигонуклеотид, имеющий сегменты, обратно комплементарные негибридизовавшимся гибридизационным сегментам, может быть добавлен для образования звездообразной структуры. После того как химические группы, присоединенные к модулям-носителям, приведены в тесную близость в реакционном центре, осуществляют реакцию. Химические группы могут быть сконструированы таким образом, что реакция происходит мгновенно, как только указанные группы приходят в необходимое для реакции расстояние друг от друга, или указанные группы могут быть сконструированы таким образом, что необходим дополнительный (внешний) компонент для того, чтобы произошла реакция. Таким дополнительным (внешним) компонентом может быть реагент, фотон, электромагнетизм или любые другие промоторы, которые влияют на реакцию. В определенном аспекте настоящего изобретения используют ортогональную химию, т.е. химические группы конструируют таким образом, что регулируется последовательность реакции. Реакционный центр определяется стеблями, окружающими указанный центр. Было сделано предположение, что расстояние между двумя реагирующими веществами в реакционном центре составляет меньше 10 нм. Если предположить, что реакционный центр является сферическим, то можно рассчитать,что концентрация реагентов равна 1 мМ. В биологическом контексте концентрация такого размера считается высокой, и можно предположить, что реакция протекает в пределах разумного времени. Кроме того, концентрация свободного реагирующего вещества в среде является очень низкой, когда модулиносители вводят в корректируемых молярных количествах, так что реакция в реакционном центре является в значительной степени превосходящей ненаправленную реакцию. Средняя зона модуля-носителя может содержать любые подходящие химические группы. Для создания возможности ферментативного удлинения, например, полимеразой, средняя зона модуля-носителя предпочтительно содержит химическую связь или 1-20 нуклеотидов. Нуклеотиды могут быть модифицированы для получения определенных условий реакции в реакционном центре. Например, нуклеотиды средней зоны могут быть модифицированы липофильными группами для обеспечения высокой мобильности и реактивности ассоциированных химических групп. Химическая группа может быть ассоциирована с модулем-носителем в различных положениях. В одном аспекте химическая группа ассоциирована с нуклеиновым основанием средней зоны. В другом аспекте, химическая группа ассоциирована с фосфодиэфирной связью средней зоны. Когда химическая группа присоединена к скелету молекулы, точка присоединения обычно находится при фосфоре межнуклеозидной связи. При использовании нуклеинового основания для присоединения химической группы точка присоединения обычно находится в положении 7 пуринов или 7 деазапуринов или в положении 5 пиримидинов. Нуклеотид может быть дистанцирован от реакционноспособной группы химической группы спейсерной молекулой. Спейсер может быть построен таким образом, что конформационное пространство, занимаемое реакционноспособной группой, является оптимизированным для реакции с реакционноспособной группой другой химической группы в реакционном центре. Обычно химическая группа ассоциирована со средней зоной посредством одной или нескольких ковалентных связей. Цитирование может выполняться перед реакцией, одновременно с реакцией или после реакции, и лигирование может выполняться ферментативно или химически по выбору экспериментатора. Для уменьшения количества свободных негибридизующихся модулей-носителей в среде обычно желательно лигировать модули-носители перед реакцией. Образованное химическое соединение может быть ассоциировано с молекулой нуклеиновой кислоты посредством химических взаимодействий. В соответствии с предпочтительным аспектом образованное химическое соединение ковалентно ассоциировано по меньшей мере с одной из указанных молекулносителей или непрерывной молекулой нуклеиновой кислоты. Относительно сильная ассоциация между образованным химическим соединением и нуклеиновой кислотой, такая как ковалентная связь, полезна во время скрининга библиотеки, так как может быть желательным применение жестких условий, которые могут разрушать более слабые связи, такие как водородные связи. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения один или несколько модулей-носителей обеспечиваются сайтом праймирования для ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы или обратной транскриптазы. Присутствие сайта праймирования способствует амплификации генетического кода для химической группы, которая прореагировала при образовании химического соединения. В случае отсутствия лигирования, т.е., когда генетический код для каждой из химических групп остается в виде отдельных частиц, удерживаемых вместе гибридизацией, предпочтительно, чтобы каждый модуль-носитель содержал сайт праймирования. После выполнения отбора библиотеки можно получить информацию в отно-7 024849 шении каждой из химических групп, которые участвовали в образовании успешных химических соединений, т.е. соединений с желаемым свойством. Одним путем получения такой информации является определение количества продукта амплификации с использованием хорошо известных способов, таких какQPCR или стандартная ПЦР, комбинированная с микроматрицей. Данная информация может быть использована в образовании библиотеки второй генерации с уменьшенным расхождением, так как она должна включать только модули-носители в библиотеке, которые являются успешными. Библиотека с уменьшенным расхождением является также сфокусированной библиотекой, так как изобилие химических соединений с желаемым свойством является более высоким. При лигировании вместе двух или более модулей-носителей можно получить информацию о реагентах, которые вместе участвуют в образовании химических соединений с желаемым свойством. Предпочтительно, все модули-носители лигируются вместе таким образом, что образуется линейная нуклеиновая кислота или кольцевая нуклеиновая кислота. Таким образом, при лигировании вместе двух или более модулей-носителей необходим единственный сайт праймирования для амплификации непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей два кодона. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления способ настоящего изобретения предусматривает сайт праймирования для ДНК-полимеразы,РНК-полимеразы или сайт обратной транскриптазы по меньшей мере в первом модуле-носителе и/или в модуле-носителе N. При лигировании вместе всех модулей-носителей, т.е. когда первый модульноситель лигирован с модулем-носителем n (n=2 до N-1), который лигирован с модулем-носителем N,нуклеиновая кислота может быть удлинена, когда сайт праймирования расположен в одном из ее концов. Для уменьшения риска того факта, что образованное химическое соединение останется скрытым в его реакционном центре, удлинение выполняют предпочтительно перед процессом отбора. Удлинение непрерывной нуклеотидной последовательности эффективно демонстрирует образованное химическое соединение среде и любой мишени, которая может присутствовать в ней. Предпочтительно, сайт праймирования для гибридизации прямого праймера расположен на одном конце, а сайт праймирования для гибридизации обратного праймера расположен на другом конце, чтобы сделать возможной амплификацию в соответствии с протоколом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-амплификацию выполняют предпочтительно после выполнения отбора для генерирования большего количества копий генетического материала структур, имеющих желаемые свойства. Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей структуру нуклеиновой кислоты и ассоциированного химического соединения, или библиотеку более чем одной из таких структур, получаемых по описанному выше способу. Библиотека химических соединений, ассоциированная с нуклеиновой кислотой, кодирующей химические группы, которые могут участвовать в образовании химического соединения, может быть образована с использованием репертуара модулей-носителей на одном или нескольких положениях. Библиотека, описываемая в данном описании, может быть использована для скрининга на представляющее интерес соединение. Обычно желательно иметь настолько большую библиотеку, насколько это возможно, для увеличения возможности нахождения соединения с желаемыми свойствами. В определенном аспекте настоящего изобретения таким свойством представляющего интерес соединения является его способность связываться с мишенью. Обычно предполагается, что возможность нахождения соединения с высокой аффинностью и специфичностью в отношении мишени увеличивается с увеличением размера библиотеки. Так, библиотека в соответствии с данным изобретением предпочтительно содержит более чем 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 и 1014 различных химических соединений, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, кодирующей историю синтеза. Для получения библиотеки репертуара модулей-носителей может быть использован ряд положений. В одном аспекте настоящего изобретения, репертуар по меньшей мере в одном положении содержит по меньшей мере 10 различных модулей-носителей. В определенном аспекте, репертуар по меньшей мере в двух положениях содержит по меньшей мере 10 различных модулей-носителей. Для получения библиотеки одного миллиона различных химических соединений в одном и том же контейнере, многочисленные структуры настоящего изобретения могут быть образованы со 100 модулями-носителями в 3 различных положениях. Другими словами, синтез всего лишь 300 модулей-носителей допускает образование библиотеки миллиона соединений. Подобным образом, библиотека 100 миллионов соединений может быть образована с использованием 100 модулей-носителей в 4 различных положениях. Настоящее изобретение относится также к способу выполнения замены модуля. Данный способ предусматривает стадии:a) обеспечения последовательности одноцепочечной непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей N сегментов гибридизации и комплементирующих сегментов гибридизации, а также N-1 негибридизующихся сегментов между сегментами гибридизации и комплементирующими сегментами гибридизации,b) гибридизации нуклеиновой кислоты в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации с образованием посредством этого непрерывной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере N-1 структур стебель-петля и один стебель;c) введения разрыва в указанный стебель или петлю с образованием посредством этого выступа, ко-8 024849 торый содержит по меньшей мере один сегмент кодона;d) обеспечения первой группы модулей-носителей, имеющих, по меньшей мере, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным стеблем, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться со стеблем соседней структуры стебель-петля, необязательно ассоциированную реакционноспособную группу и сегмент антикодона;d) обеспечения условий, допускающих гибридизацию сегментов кодона и антикодона; иe) обеспечения условий, делающих возможным ферментативное или химическое лигирование указанного гибридизованного модуля-носителя с отступающими концами указанного выступа; и проведения стадий:i) расщепления ферментом рестрикции стебля или структуры стебель-петля, смежных с указанной последовательностью кодона, с образованием посредством этого выступов, которые содержат по меньшей мере следующий сегмент кодона; иiii) гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием посредством этого N-1 структур стебель-петля и одного стебля с выступом, содержащим по меньшей мере следующий сегмент кодона; иiv) необязательно обеспечения условий, допускающих реакцию указанных реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей; иv) обеспечения следующей группы модулей-носителей, имеющих, по меньшей мере, сегмент нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с указанным стеблем, и сегмент нуклеиновой кислоты,способный гибридизоваться со стеблем соседней структуры стебель-петля, и необязательно имеющих ассоциированную реакционноспособную группу и сегмент антикодона; иvi) обеспечения условий, делающих возможным ферментативное или химическое лигирование гибридизованного модуля-носителя с отступающими концами указанного выступа; и повторение стадий i)(vi) N-1 раз; иf) введения разрыва в указанную структуру стебель-петля, состоящую частично из первой группы модулей-носителей, с оставлением по меньшей мере указанного сегмента антикодона, соединенного с указанным первым модулем-носителем; иh) гибридизации в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации, с образованием посредством этого N-1 структур стебель-петля и одного стебля; и(i) необязательно обеспечения условий, допускающих реакцию указанных реакционноспособных групп, причем образованное химическое соединение ассоциировано по меньшей мере с одним из указанных модулей-носителей. Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а), может быть обеспечена из ряда источников. В соответствии с первым аспектом, нуклеиновую кислоту обеспечивают описанным выше способом, но с использованием фиктивных модулей-носителей, не несущих химических групп. При лигировании вместе нуклеиновых кислот, представляющих модули-носители, образуется линейная или кольцевая нуклеиновая кислота. В соответствии со вторым аспектом, непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а), может быть получена выполнением ферментативной реакции удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения. Таким образом, после образования звездообразной структуры одноцепочечный продукт удлинения или цепь, комплементирующая продукт удлинения, могут быть использованы на стадии а). Если желательно,продукт удлинения может быть подвергнут полинуклеотидной амплификации, например, ПЦР, для амплификации количества копий нуклеиновой кислоты. В определенном аспекте, непрерывную последовательность нуклеиновой кислоты на стадии а), b) или с) получают иммобилизацией смысловой цепи ПЦР-продукта на твердом носителе, выделением твердого продукта, позволяя смысловой цепи самогибридизоваться таким образом, чтобы образовалась звездообразная структура, и, необязательно, разрыванием стебля, соединяющего самогибридизующуюся звездообразную структуру с твердым носителем, с освобождением посредством этого звездообразной структуры от твердого носителя. Подходящим способом иммобилизации смысловой цепи является присоединение биотина к праймеру, продуцирующему смысловую цепь. Затем эту смысловую цепь присоединяют к твердым носителям, таким как гранулы, покрытые стрептавидином. В зависимости от свойства твердого носителя он может быть выделен из остальной среды рядом способов. В настоящее время предпочтительным является использование магнитных гранул, которые могут быть легко отделены при помощи магнита. После промывания этого твердого носителя несколько раз смысловой цепи позволяют самогибридизоваться с образованием снова звездообразной структуры. В предпочтительном аспекте, рефолдинг выполняют посредством мгновенного охлаждения. Звездообразная структура может сохраняться на твердом носителе во время всего процесса замены модулей, или звездообразная структура может быть отщеплена от твердого носителя. Предпочтительно, расщепление стебля, присоединяющего твердый носитель и подверг-9 024849 нутую рефолдингу звездообразную структуру, выполняют с использованием фермента рестрикции (рестриктазы). Способность рестриктазы выполнять это расщепление является тестом, подтверждающим внутримолекулярную укладку. В определенных аспектах настоящего изобретения может быть удобным расщепление звездообразной структуры в петле. Поскольку большинство рестриктаз узнают только двухцепочечные нуклеиновые кислоты в качестве субстратов, расщепление в петле с использованием рестриктазы сразу является невозможным. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает дополнительную стадию добавления вспомогательного (хелперного) олигонуклеотида, комплементарного последовательности петли, перед стадией расщепления для создания двухцепочечного субстрата для рестриктазы в петле. Настоящее изобретение относится также к способу скрининга библиотеки более чем одного химического соединения, предусматривающему: зондирование библиотеки на члены библиотеки, имеющие химическое соединение с желаемым свойством; отделение членов библиотеки, имеющих химическое соединение с желаемым свойством; и получение посредством этого обогащенного пула членов библиотеки, имеющих желаемое свойство. Обогащенный пул членов библиотеки, имеющих желаемое свойство, может быть выделен и охарактеризован, если желательно. Однако одним из преимуществ данного способа является то, что необязательно выделять обогащенный пул. В предпочтительном варианте осуществления обогащенный пул подвергают амплификации для увеличения генетического материала, показывающего историю синтеза химических соединений, имеющих желаемое свойство. Пул амплифицированной нуклеиновой кислоты,представляющей обогащенную библиотеку соединений с желаемым свойством, может быть декодирован(расшифрован) для идентификации реагентов, которые участвовали в синтезе химического соединения с желаемым свойством. Однако если обогащенный пул является большим, чем пул, который позволяет легко декодировать все количество нуклеиновой кислоты, настоящее изобретение предоставляет возможность повторной сборки химических соединений, кодируемых членами обогащенной библиотеки или нуклеиновой кислотой, представляющей такую обогащенную библиотеку, с использованием вышеописанного способа выполнения замены модулей. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации обогащенного пула членов библиотеки, имеющих желаемое свойство. Данный способ предусматривает то,что амплифицированным при помощи ПЦР олигонуклеотидам позволяют гибридизоваться в условиях,способствующих внутримолекулярной гибридизации, посредством чего повторно создают звездообразную структуру, состоящую из стебля и ряда структур стебель-петля. Стебель без петли содержит сайт узнавания для рестриктазы, которая разрезает вне его сайта узнавания и генерирует выступ после расщепления. Избыточность последовательности в созданном выступе может быть удобным образом использована для содержания в ней кодона. Затем расщепление стебля ферментом рестрикции генерирует кодон-специфические выступы для первого положения. Затем отщепленные ферментом рестрикции звездообразные структуры гибридизуют с репертуаром модулей-носителей, содержащих два константных сегмента для первого положения и родственную пару химической группы и антикодона. Затем гибридизации кодон/антикодон допускают лигирование подходящих пар модулей-носителей и звездообразных структур ДНК-лигазой. Соседняя структура стебель-петля также содержит сайт узнавания для другой рестриктазы, способной оставлять кодон-специфическиий выступ для второго положения. Таким образом, расщепление вторым ферментом рестрикции удаляет ковалентную связь ПЦР-амплифицированного первого модуля с остальной частью данной структуры. Звездообразные структуры денатурируют и затем позволяют им гибридизоваться в условиях, способствующих внутримолекулярной гибридизации. Посредством этого звездообразные структуры воссоздаются, но теперь с новым модулем-носителем в положении один (с ассоциированной химической группой), и стебель, без петли, теперь расположен в положении два. Могут быть выполнены раунды указанного процесса для замены всех положений, чтобы сделать возможными направляемые близостью химические реакции правильных комбинаций химических групп. Таким образом, раунды отбора и амплификации могут выполняться, пока не будет достигнуто желаемое обогащение. Разрывы в стеблях могут вводиться рядом способов, например, при помощи ферментов рестрикции(рестриктаз), при помощи РНКазы, Эндонуклеазы III, эндонуклеазы VIII, APEq, Fpg или химическим расщеплением или фоторасщеплением. Непрерывная последовательность нуклеиновой кислоты, используемая на стадии а) способа замены модулей, описанного выше, может быть обеспечена "скрещиванием". В определенном варианте осуществления способ "скрещивания" предусматривает стадии: расщепления структур межмолекулярных гибридизованных нуклеиновых кислот, полученных из обогащенной библиотеки, двумя последовательными рестриктазами, которые удаляют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой, денатурации расщепленных структур, создания возможности повторной гибридизации фрагментов нуклеиновых кислот из расщепленных структур и, следовательно, создания возможности обмена части нуклеиновой кислоты, определяющей рассматриваемый модуль, для получения "скрещивания", и лигирования соответствующих концов. В соответствии с данным способом, модули-носители или части нуклеиновых кислот, представляющих модули-носители, могут быть перетасованы. Перетасовка делает возможной диверсификацию(создание разнообразия) пула генов, сходную со скрещиванием в мейотической биологической системе. Данный способ может быть модифицирован, когда фрагменты нуклеиновых кислот, представляющие модули-носители, не присутствующие в образовании библиотеки первой генерации, добавляют перед созданием возможности повторной гибридизации. Альтернативно, модуль-носитель как таковой может быть добавлен перед созданием возможности повторной гибридизации. Когда к пулу генов добавляют новый генетический материал, это похоже на мутацию в биологической системе. Возможности выполнения "скрещивания" и операций мутации между генерациями библиотек делают эволюцию поразительно похожей на естественный процесс эволюции в поиске новых лекарственных средств-кандидатов. Таким образом, в определенном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ диверсификации обогащенной библиотеки, создавая, таким образом, возможность молекулярной эволюции. В способе, описанном выше, для амплификации библиотеки-дисплея фракцию библиотеки в каждом раунде замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые элиминируют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют с репертуаром модулей-носителей для рассматриваемого положения. Таким образом, специфические в отношении положения константные сегменты направляют гибридизации, эквивалентно созданию первичной библиотеки. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном собранной фракции библиотеки, что приводит к диверсификации (созданию разнообразия). Таким образом, раунды отбора, амплификации и диверсификации могут выполняться, создавая возможность молекулярной эволюции. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ скрещивания обогащенной библиотеки, что, следовательно, делает возможной молекулярную эволюцию. В описанном выше способе для амплификации библиотеки-дисплея фракцию библиотеки в каждом раунде для замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые элиминируют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют. Таким образом, специфические для положения константные сегменты направляют гибридизации и допускают обмен рассматриваемого модуля, т.е. скрещивание. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном собранной фракцией библиотеки, что приводит к диверсификации. Таким образом, раунды отбора, амплификации, диверсификации и скрещивания могут выполняться, создавая возможность молекулярной эволюции. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ создания комбинаторных библиотек-дисплеев полимеров или малых молекул. Химические реакции могут выполняться либо одновременно, либо последовательно, с использованием, например, способов ортогональной химии, защитных/маскирующих групп, последовательного смешивания модулей-носителей или модулейносителей без CRG. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ создания комбинаторных библиотек-дисплеев каталитической активности. В этом аспекте модули-носители ассоциированы с функциональными группами с реакционноспособными сайтами, и звездообразная структура обеспечивает каркас для трехмерного размещения функциональных групп. Описанные выше аспекты и варианты осуществления показывают явные преимущества в сравнении с предшествующим уровнем техники. Например, различные возможные варианты осуществления настоящего изобретения обнаруживают одно или несколько из следующих преимуществ: 1) уникальный способ сборки комбинаторной библиотеки-дисплея, 2) уникальную структуру близости, направляющую химические реакции, 3) химические реакции являются в высокой степени независимыми от последовательностей кодонов, так как они отделены от реакционного сайта константными сегментами, 4) высокую точность амплификации библиотеки-дисплея, так как только кодоны в релевантном положении способны направлять новые модули-носители, поскольку только они содержат концы для облегчения лигирования, и 5) если случайно произошло неправильное направление кодона/антикодона, ассоциация между кодированием и дисплеем все еще будет существовать, так как новые модули-носители обеспечивают как CRG, так и код. Краткое описание рисунков На фиг. 1 а описаны стадии в образовании звездообразной структуры, в котором химические группы реагируют одновременно. На фиг. 1b описаны стадии в образовании звездообразной структуры, в котором химические группы реагируют последовательно. На фиг. 1 с описан способ, который использует конвергентный синтез химического соединения. На фиг. 1d показан способ в 5 стадиях для образования библиотеки, в которой каждый из членов демонстрирует эффективно образованное химическое соединение. На фиг. 1 е описан способ, в котором петли добавляются после реакции химических групп. На фиг. 2 а описан способ самосборки комбинаторной библиотеки с использованием репертуаров биспецифических олигонуклеотидов. На фиг. 3 показаны 5 стадий в аффинном отборе. На фиг. 4 а описаны стадии в образовании библиотеки. На фиг. 4b описаны принципы скрещивания и мутации обогащенной библиотеки. На фиг. 5 описаны стадии в способе, приводящем к образованию обогащенной библиотеки. На фиг. 6 показан принцип молекулярной эволюции. На фиг. 7 показан вариант изобретения с вовлечением иммобилизованного субстрата. На фиг. 8 описаны экспериментальные результаты примера 1. На фиг. 9 показаны результаты экспериментов, сообщенных в примере 2. На фиг. 10 показан результат экспериментов в соответствии с примером 3. На фиг. 11 описаны результаты экспериментов, сообщенных в примере 4. На фиг. 12 показан гели, полученные в экспериментах, описанных в примере 5. На фиг. 13 показан гель нативного электрофореза в ПААГ из примера 6. На фиг. 14 показан гель из экспериментов, сообщенных в примере 7. На фиг. 15 описан гель эксперимента рефолдинга примера 8. Фиг. 16 является схематической диаграммой плана примера 9. На фиг. 17 показан гель, полученный из экспериментов, сообщенных в примере 9. На фиг. 18 описан гель, полученный из экспериментов, сообщенных в примере 9. На фиг. 19 показаны различные структуры схемы реакций, сообщенных в примере 10. На фиг. 20 показаны два геля, полученных из экспериментов, описанных в примере 12. На фиг. 21 описан гель из эксперимента, сообщенного в примере 13. На фиг. 22 показан гель из эксперимента, сообщенного в примере 14. На фиг. 23 показан гель из эксперимента, сообщенного в примере 15. На фиг. 24 описан гель из эксперимента, описанного в примере 16. На фиг. 25 показаны результаты эксперимента, показанного в примере 17. На фиг. 26 описана схему экспериментальной стратегии, используемой в примере 18. На фиг. 27 показан гель ненативного электрофореза в ПААГ отдельных стадий в способе, используемом в примере 18. На фиг. 28 показан гель ненативного электрофореза анализа связывания, сообщенного в примере 18. На фиг. 29 показана ПЦР-амплификацию геля, сообщенную в примере 18. На фиг. 30 показана картину геля, свидетельствующую о прохождении восстановительного аминирования. На фиг. 31 описана картину геля, свидетельствующую о прохождении присоединения мочевины. На фиг. 32 показаны гели исследования электроподвижности звездообразной структуры. На фиг. 33 показано схематическое представление процесса трансляции. На фиг. 34 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22. На фиг. 35 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22. На фиг. 36 показан результат экспериментов, сообщенных в примере 22. Подробное описание изобретения Нуклеиновая кислота Кодируемый нуклеиновой кислотой химический синтез, описанный в данном описании, допускает получение комбинаторных библиотек-дисплеев и выполнение отбора, амплификации и эволюции большого разнообразия химических соединений, таких как малые молекулы и неприродные полимеры. Нуклеиновая кислота выполняет множественные функции, например, собирает химические реагенты вместе,направляет трехмерное размещение химических реагентов, хранит информацию, касающуюся истории химического синтеза, направляет правильный подбор выбранных комбинаций химических реагентов и допускает диверсификацию и скрещивание химических соединений. Данный способ может быть использован для одновременной сборки одной молекулы, триллионов молекул или даже большего количества молекул. Данный способ позволяет выделять лиганды или лекарственные средства со свойствами, превосходящими свойства лигандов или лекарственных средств, выделенных традиционным рациональным образом и комбинаторными способами обнаружения лекарственных средств, так как химическое пространство может быть подвергнуто системному поиску лигандов, имеющих желаемые свойства. Было показано, что направляемый нуклеиновой кислотой химический синтез является феноменом широкого диапазона, не только ограничиваемый соединениями, имеющими природу нуклеиновых кислот, но также применимый для направления широкого диапазона химических реакций в широком диапазоне условий (WO 2004/0167 67, WO 2002/074929A2). Особенно важно, когда большинство представляющих интерес молекул не похожи на нуклеиновую кислоту или аналоги нуклеиновых кислот. Химические группы, участвующие в образовании конечного химического соединения, могут переноситься в одну стадию для получения химической частицы на скелете молекулы, или химическая группа может переноситься в две стадии, в которых первая стадия включает сшивание между химической группой и принимающей частицей, и вторая стадия включает отщепление химической группы от модуля-носителя для завершения переноса. Примером первого типа реакции является модуль-носитель, имеющий завершения переноса. Примером первого типа реакции является модуль-носитель, имеющий присоединенное 5-членное замещенное N-гидроксисукцинимидное (NHS) кольцо, служащее в качестве активатора, т.е. образуется лабильная связь между атомом кислорода, соединенным с NHS-кольцом, и подлежащей переносу химической группой. Химические группы могут переноситься к реципиентной нуклеофильной группе, обычно аминогруппе, которая может быть представлена на скелете молекулы. Остаток фрагмента превращают в уходящую группу данной реакции. Когда химическая группа соединена с активатором через карбонильную группу и реципиентной группой является аминогруппа, связь, образуемая на данном скелете, будет амидной связью. Примером двухстадийной реакции является так называемая аллилглициновая реакция. На первой стадии химическую группу, содержащую карбоновую кислоту или ее производное, подвергают взаимодействию с нуклеофильной группой, такой как аминогруппа. Химическую группу присоединяют к аллилглициновой группе, которая на второй стадии может быть отщеплена йодом для высвобождения указанной химической группы. Способ двухстадийной реакции описан более подробно в WO 2004/039825,содержание которого включено в данное описание в качестве ссылки. Другой пример стратегии двухстадийной реакции показан более подробно в примере 10. Центральным важным признаком для направляемого нуклеиновой кислотой синтеза комбинаторных библиотек-дисплеев является направляемое создание пространственной близости реагентов, которая гарантирует эффективность реакции и правильную ассоциацию кодирования и дисплея. Пространственную близость реагентов получают ассоциацией вместе реагентов посредством линкера некоторого рода. Близость может быть также описана как локальная концентрация, которая зависит от длины и гибкости линкера. Если предполагается свободная гибкость линкера, локальная концентрация может быть рассчитана с использованием объема сферы с длиной линкера в качестве радиуса. Формула для расчета объема сферы такова: v=4/3 пиr3. Таким образом, близость или локальная концентрация падает в 3-ей степени как функция длины линкера. Например, длина линкера около 10 нм будет эквивалентна концентрации около 1 мМ, тогда как линкер 100 нм будет эквивалентен концентрации около 1 мкМ. Эффективные способы органической химии обычно выполняют в диапазоне миллимолярных-молярных концентраций. Таким образом, для гарантии эффективности в таких химических реакциях длина линкера не должна быть существенно большей, чем 10 нм. Предпочтительно, реакционноспособные группы приводят в требуемую для реакции близость,меньшую, чем 100 нм, более предпочтительно, меньшую, чем 50 нм, даже более предпочтительно,меньшую, чем 25 нм, еще более предпочтительно, меньшую, чем 10 нм, и, наиболее предпочтительно,меньшую, чем 5 нм. В предшествующем уровне техники для синтеза в одном сосуде ДНК-кодируемых библиотекдисплеев использовали ДНК-матрицы с кодонами, простирающимися по всей длине матрицы (WO 2004/016767, WO 2002/074929A2). Матрицы являются ответственными за рекрутинг единиц переноса,имеющих правильные последовательности антикодонов, из репертуара единиц переноса, и, следовательно, сводящими вместе химические группы на матрице и единицы переноса. Таким образом, одноцепочечная матрица действует также в качестве линкера между химической группой на матрице и химической группой на единице переноса, гибридизованной с матрицей. Таким образом, длина линкера и посредством этого локальная концентрация будут зависеть от того, какое положение кодона используется. Развернутый (удлиненный) олигонуклеотид, имеющий, например, 20 нуклеозидов, будет иметь длину приблизительно 10 нм (расстояние шести связей равно приблизительно 0,63 нм), и олигонуклеотид,имеющий 200 нуклеозидов, будет иметь длину приблизительно 100 нм. Таким образом, развернутые олигонуклеотиды, значительно более длинные, чем 200 нуклеозидов (10 нм, эквивалентные концентрации приблизительно 1 мМ), обычно не будут приемлемыми для направления создания близости химических реакций. В одном варианте осуществления настоящее изобретение устраняет необходимость применения чрезмерно удлиненной структуры нуклеиновой кислоты в приведении реагентов в требуемую для реакции близость. Это достигается выбором подходящих последовательностей олигонуклеотидов, способных укладываться в стабильные трехмерные структуры, и посредством этого управлением создания близости посредством положений последовательности, разделенных многими нуклеозидами. Как показано на фиг. 1 а, это достигается при использовании биспецифических олигонуклеотидов (взаимокомплементарных),которые могут гибридизоваться в "звездообразную структуру". Биспецифические олигонуклеотиды содержат два сегмента: один сегмент около 3'-конца одного олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца в следующем олигонуклеотиде и т.д. Наконец, сегмент около 3'-конца последнего олигонуклеотида гибридизуется с сегментом около 5'-конца первого олигонуклеотида. Таким образом, средняя зона между двумя сегментами на каждом олигонуклеотиде ориентирована в направлении центра. Средней зоной может быть связь или сегмент. В противоположность этому, концы ориентированы наружу с образованием таким образом звездообразной структуры. Таким образом, при использовании трех типов олигонуклеотидов образуются три стебля, при использовании четырех типов олигонуклеотидов образуются четыре стебля и т.д. Таким образом химические реакционноспособные группы приводятся в требуемую для реакции близость, так как диаметр двойной спирали ДНК равен приблизительно 2 нм, что допускает протекание направляемых близостью химических реакций в центре или вблизи центра. Химическую реакцию осуществляют таким образом, что образованный продукт ассоциирован по меньшей мере с одним олигонуклеотидом. Кроме того, кодон предпочтительно расположен снаружи от одного или обоих гибридизованных сегментов на каждом олигонуклеотиде, что допускает кодирование химических групп. Олигонуклеотиды с ассоциированной химической группой, двумя положениями сегментов гибридизации и кодоном называют модулями-носителями. Для получения созданной комбинации олигонуклеотидов, амлифицируемых, например, посредством ПЦР, концы в каждом стебле, за исключением одного, лигируют посредством образования петли с образованием непрерывного олигонуклеотида с 5'- и 3'-концами. В одном аспекте структура состоит из одного стебля и ряда структур стебель-петля, которые могут быть амплифицированы при наличии сайтов ПЦР-праймирования на концах (фиг. 1d и фиг. 1 е). Альтернативно, все концы лигируют с образованием замкнутого кольца, которое может быть амплифицировано удлинением праймера ДНК-полимеразой без активности вытеснения цепи. Способ, использующий постадийную реакцию химических групп, показан на фиг. 1b. Сначала два модуля-носителя приводят в контакт в условиях гибридизации. Модуль-носитель А содержит сегмент гибридизации а, который отжигается с гибридизационным сегментом а' модуля-носителя В. После стадии отжига позволяют протекать химической реакции между химической группой СА на модуленосителе А и Св на модуле-носителе В. На третьей стадии добавляют модуль-носитель С в условиях гибридизации. Модуль-носитель С содержит сегмент гибридизации b', который комплементирует сегмент гибридизации d модуля-носителя В. Требуемая для реакции близость продукта СА-СВ к химической группе Сс допускает протекание химической реакции таким образом, что образуется продукт СА-СВ-СС. Добавляют четвертый модуль-носитель в условиях гибридизации. Модулю-носителю D позволяют гибридизоваться с растущей звездообразной структурой, чтобы привести реагент CD в тесную близость с продуктом предыдущей реакции, посредством чего реакция промотируется для образования конечного химического соединения CA-CB-CC-CD. На фиг. 1 с описан способ конвергентного синтеза, в котором начальные стадии реакции протекают в виде двух отдельных путей. На первой серии реакций модули-носители А и В приводят в контакт отдельно в условиях гибридизации в первом контейнере. Сегмент гибридизации модуля-носителя А и сегмент гибридизации модуля-носителя В будут отжигаться друг с другом и будет выполняться реакция между химическими группами СА и CB. Во втором контейнере модули-носители С и D смешивают в условиях гибридизации таким образом, чтобы образовывался продукт гибридизации, в котором сегмент гибридизации с модуля-носителя С отожжен с гибридизационным сегментом с' модуля-носителя D. Затем происходит реакция между химической группой Сс и химической группой CD с образованием промежуточного продукта CC-CD. Промежуточным продуктам позволяют отжигаться друг с другом в условиях гибридизации, посредством чего образуется звездообразная структура. Затем или одновременно с образованием звездообразной структуры реакции между двумя промежуточными продуктами реакции СА-СВ и CC-CD позволяют образовываться конечному химическому соединению CA-CB-CC-CD. При выполнении постадийного или конвергентного синтеза может быть полезным перед реакцией химических групп обеспечение вспомогательного олигонуклеотида для образования реакционного центра. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию петли в структурах стебель-петля, обеспечиваемых модулями-носителями, как показано на фиг. 1d. Альтернативно, петли образуются лигированием структур стебель-петля, обеспечиваемых другими олигонуклеотидами, как показано на фиг. 1 е, или любой их комбинацией вариантов осуществления, показанных на фиг. 1d и 1 е. Конечные модули-носители могут содержать сайты ПЦР-праймирования, или сайты праймирования могут быть обеспечены лигированием других олигонуклеотидов. Вариант осуществления, описанный на фиг. 1d, показан пятью стадиями. На первой стадии четыре модуля-носителя, каждый из которых несет реакционноспособные группы R и биспецифические олигонуклеотиды, подвергаются контакту в условиях гибридизации. Модули-носители находятся в равновесии со звездообразной структурой. На второй стадии гибридизационный комплекс лигируют на концах модулей-носителей таким образом, чтобы образовывалась непрерывная нуклеиновая кислота. Близость химических групп в центре звездообразной структуры промотируют данную реакцию, и на стадии 3 образуется продукт, который присоединен линкерной частицей к нуклеиновой кислоте, кодирующей химические группы, которые участвовали в образовании химического соединения. На стадии 4 сайт праймирования для полимеразы лигируют со звездообразной структурой для обеспечения удлинения нуклеиновой кислоты. Последняя стадия показывает продукт удлинения, в котором двухцепочечная ДНК была образована с использованием нуклеиновой кислоты звездообразной структуры в качестве матрицы. На фиг. 1 е показана версия варианта осуществления фиг. 1d, в которой структуру стебель-петля добавляют отдельно и лигируют со звездообразной структурой. На первой стадии смешивают четыре модуля-носителя. Вследствие существования сегментов гибридизации звездообразная структура образуется в условиях гибридизации. После образования гибридизационного комплекса осуществляют реакцию с образованием химического соединения. После образования соединения реакцией четырех химических групп, добавляют 3 структуры стебель-петля и сайт праймирования для полимеразы. Структуры стебель- 14024849 петля и сайт праймирования содержат выступ, который комплементарен выступу звездообразной структуры. При добавлении лигазы структуры стебель-петля и сайт праймирования лигируют в звездообразную структуру с образованием таким образом непрерывной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к лигированию модулейносителей, например, с использованием ферментов, таких как ДНК-лигаза Т 4, ДНК-лигаза Taq, РНКлигаза Т 4 или ДНК-лигаза Е. Coli, или химическому лигированию (Shabarova et al., Nucleic Acids Res, 19,4247-51, 1991). Модули-носители - олигонуклеотидная часть В данном изобретении для направления химических реакций используют олигонуклеотиды. Олигонуклеотидами в данном контексте называют модули-носители, которые содержат по меньшей мере два положение-специфических олигонуклеотидных сегмента гибридизации, необязательно олигонуклеотидный сегмент кодона и реакционноспособную химическую группу. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, в которых олигонуклеотидная часть состоит из ДНК, РНК или их аналогов в любых их комбинациях. Олигонуклеотидная часть способна, по меньшей мере после модификации, быть подходящей матрицей в стандартных протоколах для репликации нуклеиновой кислоты и/или амплификации. Модули-носители могут быть синтезированы с использованием методологий, известных в данной области. Например, олигонуклеотид может быть получен любым способом, известным в данной области для синтеза олигонуклеотидов, например, твердофазным синтезом с использованием автоматического синтезатора. После синтеза олигонуклеотиды могут быть ассоциированы, если желательно, (например,ковалентно или нековалентно связаны), с представляющей интерес CRG с использованием стандартных химических способов связывания, известных в данной области. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом находится в средней зоне между сегментами гибридизации или вблизи нее. Средняя зона может быть фосфодиэфирной связью, ее производными или сегментом нуклеиновой кислоты. "Вблизи средней зоны" обозначает местоположения на стебле дуплексной нуклеиновой кислоты, предпочтительно местоположения, близкие к средней зоне. Предпочтительно, термин "вблизи от средней зоны" относится к менее чем 20 нуклеотидам, более предпочтительно, менее чем 10 нуклеотидам, даже более предпочтительно, менее чем 5 нуклеотидам, и наиболее предпочтительно, менее чем 2 нуклеотидам. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом происходит посредством линкеров или спейсеров, которые являются достаточно длинными и гибкими, чтобы позволить реагирующим веществам приходить в требуемую для реакции близость (реакционную близость). Линкеры предпочтительно имеют длину и состав, которые допускают реакции между реагентами, спаренными с олигонуклеотидами, но все еще минимизируют реакции с неспаренными молекулярными частицами. Кроме того, ассоциация между олигонуклеотидом и CRG может осуществляться через ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления могут присутствовать более чем одна ковалентная связь. Связь может быть расщепляемой, например, светом, окислением, гидролизом, действием кислоты,действием основания или восстановлением. Разнообразие связей, полезных в практике настоящего изобретения, описано в предшествующем уровне (Fruchtel and Jung, Angew Chem Int Ed Engl, 35, 17, 1996). Линкер способствует контакту реагентов и в определенных вариантах осуществления в зависимости от желаемой реакции, определяет местоположение ДНК в качестве уходящей группы, причем линкер расщепляется как природное следствие данной реакции. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от желаемых обстоятельств, за реакцией одной реакционноспособной группы следует расщепление линкера, присоединенного ко второй реакционноспособной группе, с образованием продуктов, не оставляя дополнительных атомов, способных обеспечиватьхимическую функциональную группу. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом осуществляется через скелет молекулы нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом осуществляется посредством основания. В предпочтительном варианте осуществления CRG ассоциирована с частями водородных связей не-Уотсона-Крика. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом допускает прочитывание ДНК-полимеразой, по меньшей мере после его удаления. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где ассоциация CRG с олигонуклеотидом является нековалентной. Например, если биотин присоединен к олигонуклеотиду, а стрептавидин присоединен к CRG, следовательно, взаимодействие между биотином и стрептавидином ассоциирует олигонуклеотид и CRG друг с другом нековалентно. Модули-носители - химия С использованием описываемых способов может быть получен широкий диапазон соединений и/или библиотек соединений. В некоторых вариантах осуществления соединения, которые не являются нуклеиновыми кислотами или их аналогами или не похожи на нуклеиновые кислоты или их аналоги,синтезируют в соответствии со способом настоящего изобретения. В некоторых других варианте осуществления соединения, которые не являются белками или их аналогами или не похожи на белки или их аналоги, синтезируют в соответствии со способами настоящего изобретения. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к последовательным химическим реакциям направляемых пространственной близостью реагентов, например, с использованием способов ортогональной химии или с использованием ортогональных защитных/маскирующих групп или последовательной сборки и реакции молекул-носителей. Сборка модулей-носителей без образования кольца, т.е. без образования непрерывной нуклеиновой кислоты, может сама приводить подходящим образом расположенные CRG в пространственную близость, так как диаметр двойной спирали равен приблизительно 2 нм, что, следовательно, позволяет помещать несколько последовательных CRG в требуемую для реакции близость. Условия реакции, линкеры, реагенты и сайт реакции выбирают таким образом, чтобы избежать не направляемых олигонуклеотидом реакций и ускорить направляемые олигонуклеотидом реакции. Последовательное или одновременное приведение в контакт молекул-носителей может выполняться в зависимости от конкретного соединения, которое должно быть синтезировано. В определенном представляющем особый интерес варианте осуществления предполагается многостадийный синтез химических соединений, в котором три или более молекул-носителей приводят в контакт последовательно для облегчения многостадийного синтеза комплексных химических соединений. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к отжигу модулей-носителей,который дает возможность использовать модули-носители при концентрациях, более низких, чем концентрации, используемые во многих традиционных химических синтезах. Таким образом, модулиносители могут быть использованы в субмиллимолярных концентрациях. Предпочтительно, концентрации модулей-носителей могут быть использованы в субмиллимолярных концентрациях, меньших, чем 100-микромолярные, более предпочтительно, меньших, чем 10-микромолярные, даже более предпочтительно, меньших, чем 1-микромолярные, еще более предпочтительно, меньших, чем 100-наномолярные,и наиболее предпочтительно, меньших, чем 10-наномолярные концентрации. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к CRG, образующим малые молекулы или полимеры. В практике настоящего изобретения могут быть использованы известные химические реакции для синтеза полимеров или малых молекул. Выбранные реакции являются предпочтительно совместимыми с нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК и РНК или их аналоги. Применимые реакции включают, например, реакции замещения, реакции образования углерод-углеродной связи, реакции элиминирования и реакции присоединения.CRG или реагенты включают разнообразные реагенты и могут быть любой химической группой или реакционноспособной частью молекулы (например, электрофилы, нуклеофилы), известной в области химии. В синтезе малых молекул с использованием способа настоящего изобретения модуль-носитель может иметь скелет, с которым ассоциирована малая молекула, которая должна быть собрана. Таким скелетом может быть любое химическое соединение с двумя или более сайтами для функциональных групп. Защитные группы могут быть ортогональными относительно друг друга, чтобы они могли удаляться по отдельности. Реагентами для модификации скелета могут быть, например, электрофилы (например, ацетил, амиды, хлорангидриды кислот, сложные эфиры, имины), нуклеофилы (например, амины, гидроксильные группы, тиолы) или боковые цепи. В некоторых вариантах осуществления полимеры, в частности неприродные полимеры, синтезируют в соответствии со способом настоящего изобретения. Неприродные полимеры, которые могут быть синтезированы с использованием способа и системы настоящего изобретения, включают любые неприродные полимеры. Например, неприродные полимеры включают, но не ограничиваются ими, пептиднуклеиновую кислоту (ПНК), полимеры, поликарбаматы, полимочевины, сложные полиэфиры, полиакрилаты (например, полиэтилен, полипропилен), поликарбонаты, полипептиды с неприродной стереохимией, полипептиды с неприродными аминокислотами и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полимеры включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 мономерных звеньев или более. В некоторых вариантах осуществления мономерные звенья могут содержать димеры, тримеры или тетрамеры, или олигомеры. Полимеры, синтезированные с использованием системы настоящего изобретения,могут быть использованы, например, в качестве катализаторов, фармацевтических веществ или диагностических аффинных лигандов. При получении некоторых неприродных полимеров мономерные звенья присоединяют к модулюносителю. Такими мономерными звеньями могут быть, например, карбаматы, D-аминокислоты, неприродные аминокислоты, ПНК, мочевины, гидроксикислоты, сложные эфиры, карбонаты, акрилаты или простые эфиры. В некоторых вариантах осуществления мономерные звенья имеют две реакционноспо- 16024849 собные группы, используемые для связывания мономерного звена в растущую цепь полимера. Предпочтительно, две реакционноспособные группы не являются одинаковыми, так что мономерное звено может быть включено в полимеры направленным образом, например, на одном конце может быть электрофил,и на другом конце может быть нуклеофил. Реакционные группы могут включать, но не ограничиваются ими, сложные эфиры, амиды, карбоксильные кислоты, активированные карбонильные группы, хлорангидриды кислот, амины, гидроксильные группы и тиолы. В некоторых вариантах осуществления CRG являются маскированными или защищенными (Green et al., (1999) Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, Wiley), так что полимеризация может не происходить до желаемого времени, когда CRG будут освобождены от защитных групп. Как только мономеры собирают вместе посредством сборки с использованием модулей-носителей, инициирование полимеризации приводит к каскаду стадий полимеризации и удаления защитных групп, где полимеризация приводит к удалению защитной группы реакционноспособной группы, которая должна быть использована на последующей стадии полимеризации. Мономерные звенья, подлежащие полимеризации, могут включать два или более мономеров. Мономерные звенья могут содержать любые химические группы, известные в данной области. Реакционноспособные химические группы, особенно группы, которые могут препятствовать полимеризации, гибридизации и т.д., предпочтительно маскируют с использованием известных защитных групп(Green et al. , (1999) Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, Wiley). Обычно, защитные группы,используемые для маскирования реакционноспособных групп, являются ортогональными относительно защитных групп, используемых в защите групп, используемых на стадиях полимеризации. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, причем реакционноспособный сайт ассоциирован с одним и тем же модулем-носителем для всех химических реакций. Например, скелет малой молекулы ассоциирован с одним модулем-носителем, и остальные модули-носители обеспечивают частицы, модифицирующие данный скелет. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модулям-носителям, где реакционноспособный сайт будет смещать положения во время химических реакций. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ассоциации образованного химического соединения с олигонуклеотидом, при сохранении считывания ДНК-полимеразой, например,по меньшей мере после его удаления. Получение комбинаторной библиотеки Важным практическим различием между традиционным и направляемым нуклеиновой кислотой синтезом библиотеки является масштаб каждой манипуляции. Вследствие количеств материала, необходимого для скрининга и идентификации соединений, традиционные комбинаторные синтезы обычно протекают в масштабе наномолей-микромолей на один член библиотеки. В отличие от этого, направляемый нуклеиновой кислотой синтез может иметь место в масштабе фемптомолей-пикомолей, так как для отбора и ПЦР-амплификации требуются лишь незначительные количества (например, приблизительно 10-30 моль) каждой из связанных с нуклеиновой кислотой синтетических молекул. Это огромное различие в масштабе, в соединении с форматом одного раствора в направляемом нуклеиновой кислотой синтезе библиотек существенно упрощает получение требуемых материалов. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию комбинаторной библиотеки-дисплея. Библиотеки могут быть получены с использованием репертуаров модулейносителей на некоторых или на всех положениях (фиг. 2 а). На первой стадии обеспечивают репертуар модулей-носителей для каждого положения. При смешивании модулей-носителей в условиях гибридизации они будут собираться в звездообразную структуру, направляемую последовательностью сегментов гибридизации. После сборки модулей-носителей выполняют лигирование и реакцию в любом порядке. В одном аспекте настоящего изобретения лигирование выполняют перед реакцией для увеличения стабильности звездообразной структуры. После направляемой пространственной близостью реакции сайт праймирования полимеразы лигируют со звездообразной структурой и осуществляют реакцию удлинения для проявления (дисплея) образованного химического соединения наружной среде. Как будет понятно специалисту в данной области, библиотеки малых молекул и полимеров могут быть синтезированы с использованием описываемых принципов. Таким образом, комбинаторная библиотека-дисплей может быть подвергнута отбору и члены обогащенной библиотеки могут быть идентифицированы посредством кодирующего их олигонуклеотида. В зависимости от обстоятельств репертуары модулей-носителей для двух или более положений сначала объединяют и подвергают направляемым нуклеиновыми кислотами химическим реакциям между присоединенными CRG. В зависимости от обстоятельств библиотека может быть образована множественными химическими реакциями, в которых каждый промежуточный продукт очищают перед следующим раундом реакций. Предпочтительно, требуются менее чем 20 стадий химических реакций, для создания библиотеки. В других вариантах осуществления требуются менее чем 10 стадий химических реакций и, более предпочтительно, требуются 3-9 стадий для создания библиотеки. Отбор Отбор и/или скрининг на продукты реакции с желаемыми активностями (такими как каталитическая активность, аффинность связывания, специфичность связывания или конкретное действие в анализе активности) может быть выполнен в соответствии с любым стандартным протоколом. Например, могут быть выполнены аффинные отборы (см. фиг. 3) в соответствии с принципами, используемыми в способах на основе библиотек, таких как фаговый дисплей (Smith, Science, 228, 1315-7, 1985), рибосомный дисплей (Hanes et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95, 14130-5, 1998), мРНК-дисплей (Roberts and Szostak,Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-302, 1997) или ДНК-кодируемые химические библиотеки (WO 2004/016767, WO 2002/074929A2). Отбор на каталитические активности может, например, выполняться аффинным отбором на аффинных колонках с аналогом переходного состояния (Васа et al., Proc Natl AcadSci USA, 94, 10063-8, 1997) или с использованием схем отбора на основе функции (Pedersen et al., ProcNatl Acad Sci USA, 95, 10523-8, 1998). Поскольку при помощи ПЦР могут быть амплифицированы незначительные количества ДНК (100 молекул), такие отборы, следовательно, могут проводиться в масштабе данного размера, что допускает действительно широкий поиск на желаемые активности, как экономичный, так и эффективный. Библиотека-дисплей может быть отобрана или отделена по связыванию с молекулой-мишенью. В данном контексте отбор и отделение означают любой процесс, посредством которого член библиотеки,связанный с молекулой-мишенью, может быть отделен от членов библиотеки, не связанных с молекулами-мишенями. Отбор может выполняться различными способами, известными в данной области. В большинстве применений предпочтительно селективным является связывание с молекулой-мишенью,так что связывание с мишенью является предпочтительным в сравнении с другими событиями связывания. В конечном счете, связывающая молекула, идентифицированная с использованием настоящего изобретения, может быть применима в качестве терапевтического реагента и/или диагностического реагента. Стратегия отбора может проводиться таким образом, чтобы сделать возможным отбор против почти любой мишени. Важным является то, что стратегия отбора не требует какой-либо подробной структурной информации о молекуле-мишени или о членах библиотеки-дисплея. Весь процесс запускается аффинностью связывания и специфичностью, участвующих в связывании членов библиотеки с конкретной молекулой-мишенью. Отобранные члены библиотеки могут быть легко идентифицированы через кодирующую их нуклеиновую кислоту с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Настоящее изобретение допускает широкую идентификацию связывающих молекул для любой известной молекулымишени. Кроме того, новые неизвестные мишени могут быть обнаружены выделением связывающих молекул отобранных членов библиотек и использованием их для идентификации и валидизации молекулы-мишени. Отбор связывающих молекул из библиотеки-дисплея может выполняться в любом формате для идентификации связывающих членов библиотек. Отбор с использованием связывания обычно включает иммобилизацию желаемой молекулы-мишени, добавление библиотеки-дисплея, предоставление возможности связывания и удаление не связывающихся/слабо связывающихся членов промыванием. Остающаяся библиотека, связанная с мишенью, может быть элюирована, например, кислотой, хаотропными солями, нагреванием, конкурентным элюированием известным лигандом, высокой концентрацией соли, основанием, протеолитическим высвобождением мишени, ферментативным высвобождением нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления элюированные члены библиотеки подвергают дополнительным раундам связывания и элюирования с использованием тех же самых условий или более жестких условий или с использованием другого формата связывания, который будет увеличивать обогащение. В других вариантах осуществления связывающие члены библиотеки не элюируют из мишени. Для отбора на члены библиотеки, которые связываются с белком, экспрессируемым на поверхности клетки, например, ионным каналом или трансмембранным рецептором, клетки могут быть сами по себе использованы в качестве агентов отбора. Процедура отбора может также включать отбор на связывание с рецепторами поверхности клетки, которые интернализуются таким образом, что рецептор вместе со связывающей молекулой проходит в цитоплазму, ядро или другой клеточный компартмент, например, в аппарат Гольджи или лизосомы. Выделение рассматриваемого компартмента приводит к отделению членов библиотеки,являющихся интернализованными, от неинтернализованных членов библиотеки (Hart et al., J. Biol.Chem., 269, 12468-74, 1994). Процедура отбора может также включать отбор in vivo. Например, посредством нацеливания на орган in vivo, при котором библиотеку инъецируют в животное, и затем представляющий интерес орган выделяют и посредством этого получают обогащенный пул членов библиотеки,нацеленный на указанный орган (Pasqualini and Ruoslahti, Nature, 380, 364-6, 1996). Часть, содержащая нуклеиновую кислоту, обогащенной библиотеки может быть амплифицирована, например, при помощи ПЦР, что приводит ко многим порядкам амплификации, что делает возможной идентификацию, например, посредством клонирования и секвенирования ДНК. Согласно конкретному варианту аффинного отбора, показанному на фиг. 3, библиотеку продуктов реакции, полученную из варианта, показанного на фиг. 2 а, приводят в контакт с мишенью в условиях связывания. Если одно или несколько образованных химических соединений имеют аффинность в отношении мишени, будет происходить связывание. На следующей стадии связывающие члены библиотеки или нуклеиновую кислоту, полученную из них, разделяют. Затем нуклеиновую кислоту, присоединен- 18024849 ную к образованному химическому соединению, амплифицируют, например, при помощи ПЦР для получения множественных копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует историю синтеза соединения,проявляющего желаемую аффинность. Амплифицированная нуклеиновая кислота может быть секвенирована рядом хорошо известных способов декодирования, для определения какие химические группы участвовали в образовании успешно полученного соединения. Альтернативно, амплифицированная нуклеиновая кислота может быть использована для образования библиотеки следующей генерации. Другие отборы Могут выполняться отборы по другим свойствам, таким как каталитическая или другая функциональная активность. Обычно отбор должен быть спланирован таким образом, чтобы члены библиотеки с желаемой активностью могли быть отделены от других членов библиотеки. Например, отбор членов библиотек со способностью катализировать расщепление связи, может выполняться, когда биотин присоединен к каждому члену библиотеки рассматриваемой связью. Разделение с использованием стрептавидина может затем отделить члены библиотеки, имеющие каталитическую активность, от других членов. Другим примером отбора является отбор членов библиотеки со способностью образования связи. Он может выполняться присоединением субстрата к каждому члену библиотеки и затем добавлением субстрата, к которому присоединен биотин. Реакция между двумя субстратами, образующими связь, будет присоединять биотин к каталитическим членам библиотеки. Затем использование стрептавидина может отделить члены библиотеки, имеющие каталитическую активность, от других членов. Отбор по другим свойствам, таким как димеризация и/или полимеризация, также может выполняться. В этом случае члены библиотеки могут быть разделены по размеру образованного комплекса, с использованием, например, ВЭЖХ, акриламидного или агарозного геля или гель-фильтрационных колонок. Амплификация нуклеиновых кислот Амплификация части, являющейся нуклеиновой кислотой, членов обогащенной библиотеки может выполняться с использованием стандартных протоколов для амплификации нуклеиновых кислот. Указанные способы включают, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (Saiki et al., Science, 230,1350-4, 1985), амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA) (Compton,Nature, 350, 91-2, 1991), амплификацию с вытеснением цепи (Nycz et al., Anal Biochem, 259, 226-34,1i998), самоподдерживаемую репликацию (Mueller et al., Histochem Cell Biol, 108, 431-7, 1997), праймерное удлинение и плазмидную амплификацию (см., например, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т.(1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Сборка библиотеки-дисплея посредством замены модулей В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к повторной сборке/амплификации членов обогащенной библиотеки для повторного создания дисплея. Таким образом в случае обогащенной библиотеки обогащенную библиотеку-дисплей образуют, выполняя раунды отбора и амплификации и повторной сборки. Например, как показано на фиг. 4 а, вышеописанным ПЦР-амплифицированным олигонуклеотидам членов обогащенной библиотеки позволяют гибридизоваться в условиях, благоприятствующих внутримолекулярной гибридизации, посредством чего снова создается звездообразная структура, состоящая из стебля и ряда структур стебель-петля. Стебель без петли может содержать сайт узнавания для фермента рестрикции (рестриктазы), который генерирует выступ с неопределенным основанием (неопределенными основаниями). Неопределенное основание (неопределенные основания) в созданном выступе предпочтительно используется для того, чтобы содержать кодон. Таким образом, расщепление ферментом рестрикции стебля генерирует кодон-зависимые выступы для первого положения. Затем расщепленные ферментом рестрикции звездообразные структуры гибридизуют с репертуаром модулей-носителей, содержащих два константных сегмента для первого положения и родственную пару CRG и антикодона. Следовательно, гибридизация кодон/антикодон допускает возможность лигирования подходящих пар модулей-носителей и звездообразных структур. Соседние структуры стебель-петля могут также содержать сайт узнавания для другой рестриктазы, способной оставлять кодонспецифический выступ для второго положения. Таким образом, расщепление вторым ферментом рестрикции удаляет ковалентную связь ПЦР-амплифицированного первого модуля с остальной частью структуры. Звездообразную структуру денатурируют и затем позволяют гибридизоваться в условиях,способствующих внутримолекулярной гибридизации. Посредством этого повторно создаются звездообразные структуры, но теперь с новым модулем-носителем в положении 1 (с CRG), и стебель, без петли,локализован теперь в положении 2. Раунды данного процесса выполняют для замены всех положений,для создания возможности направляемых пространственной близостью реакций правильных комбинацийCRG; посредством этого библиотека-дисплей амплифицируется и повторно собирается. Наконец, сайты ПЦР-праймирования могут быть лигированы со звездообразной структурой. Таким образом, раунды отбора и амплификации и повторной сборки могут выполняться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое обогащение (см. фиг. 5). В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к образованию кодонспецифических выступов, создаваемых ферментами рестрикции (рестриктазами). Подходящие рестриктазы способны образовывать выступы с более чем одной конкретной последовательностью. Такие ферменты включают i) рестриктазы с неопределенными основаниями в их последовательности узнавания, ii) рестриктазы, разрезающие снаружи относительно их последовательности узнавания, и iii) рестриктазы,выполняющие разрывы в одной цепи (ники) (образующие ники эндонуклеазы). Примеры таких рестриктаз включают: Кодирующая емкость (количество различных возможных кодонов) выступа дана в виде количества неопределенных оснований в выступе, созданном ферментом рестрикции. Следовательно, для любого N(N=A, T, G или С) могут быть выбраны четыре различных остатка, для каждого Н (Н=А, С или Т), V(V=A, С или G), В (В=С, G или Т) и D (D=A, G или Т) могут быть выбраны три различных остатка, и для любого R (R=A или G), K (K=G или Т), Y (Y=C или Т), S (S=C или G) и М (М=А или С) и W (W=A или Т) могут быть выбраны два различных остатка. Следовательно, кодирующую емкость рассчитывают умножением количества различных остатков в каждом положении друг на друга. Например, SfiI: создает выступ из четырех N, имеющий следовательно, кодирующую емкость 256 (=4444). Особой группой рестриктаз являются рестриктазы, разрезающие только одну цепь (разрезающая одну цепь эндонуклеаза). Такие ферменты могут, в принципе, иметь неопределенную кодирующую емкость; например, когда i) последовательность узнавания расположена в стебле структуры стебель-петля,или ii) используется для создания концевого выступа, или iii) в комбинации с другим ферментом рестрикции. Это связано с тем, что длина созданного выступа может быть, в принципе, неопределенной длины. Например, N.BbvCIA, расположенная в стебле структуры стебель-петля: в данном примере шесть N присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 1024 (=444444). Однако очевидно, что количество N может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы. Кроме того, разрезающая только одну цепь эндонуклеаза может создавать концевой выступ произвольной длины, например, N.BbvCIA и в данном примере восемь N присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 65536 (= 4 в восьмой степени). Однако очевидно, что количество N может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы. Кроме того, разрезающая только одну цепь эндонуклеаза в комбинации с ферментом рестрикции может создавать концевой выступ произвольной длины без какой-либо необходимости структуры стебель-петля. Например, N.BbvCIA в комбинации с EcoRI: в данном примере восемь N присутствуют в образованном выступе, давая, следовательно, кодирующую емкость 65536 (=4 в восьмой степени). Однако очевидно, что количество N может быть выбрано произвольно, что дает, следовательно, неопределенную кодирующую емкость. Небольшая доля общего количества возможных последовательностей в данном примере не может быть использована, а именно, последовательности, образующие последовательность узнавания используемой рестриктазы. Хотя длина сегментов кодонов может варьироваться, сегменты кодонов могут быть в диапазоне 150 нуклеотидов, 1-40, 1-30, 1-15, 1-10. Но предпочтительно сегменты кодонов имеют длину 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 или 10 нуклеотидов. Хотя длина образующих стебель сегментов может варьироваться, сегменты стебля могут быть предпочтительно в диапазоне 5-50 нуклеотидов, 5-40, 5-30, 5-15, 5-10. Но предпочтительно сегменты стебля имеют длину 10, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Длина средней зоны между образующими стебель сегментами может варьироваться. Средняя зона может быть предпочтительно в диапазоне от единственной фосфодиэфирной связи (или аналогичной связи) до отрезка из 20 нуклеотидов. Однако предпочтительно средняя зона является единственной фосфодиэфирной связью или имеет длину 1, 2, 3 4, 5 или 6 нуклеотидов. В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где звездообразные структуры после расщепления ферментом рестрикции дополнительно обрабатывают фосфатазой, которая удаляет 5'-фосфат и, следовательно препятствует лигированию двух звездообразных структур. Несколько подходящих фосфатаз известны в данной области, например, антарктическая (antarctic) фосфатаза и щелочная фосфатаза кишечника теленка. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где модули-носители содержат 5'-фосфат для облегчения лигирования со звездообразной структурой. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где модули-носители являются фосфорилированными после лигирования со звездообразной структурой. Это препятствует лигированию между свободными модуляминосителями. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея, где 5'-конец ПЦР-амплифицированной звездообразной структуры может быть создан другими средствами, отличными от рестриктазы, например: с использованием РНКазы, эндонуклеазы III, эндонуклеазы VIII, АРЕ 1, Fpg, химическим расщеплением или фоторасщеплением. ПЦР-продукт состоит из праймера в его 5'-конце и остальной последовательности, образованной ДНК-полимеразой. Праймер может содержать остатки, не обнаруживаемые в сегменте, образуемом ДНК-полимеразой, такие как dUTP или РНК. Такие остатки могут специфически узнаваться и отщепляться подходящим образом с образованием определенного точного конца (Smith et al., PCR Methods Appl, 2, 328-32, 1993). В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повторной сборки/амплификации библиотеки-дисплея. ПЦР-амплифицированные концы обогащенной библиотеки могут быть модифицированы перед образованием звездообразной структуры любым из вышеуказанных способов. Диверсификация В одном варианте осуществления настоящее изобретение обсуждает способ диверсификации демонстрируемого соединения или библиотеки демонстрируемых соединений, который делает возможной молекулярную эволюцию. Это может достигаться рядом способов без отклонения от объема настоящего изобретения. Например, (см. фиг. 4b) фракцию молекул в раунде для замены модуля расщепляют двумя последовательными рестриктазами, которые удаляют ковалентные связи между рассматриваемым модулем и остальной структурой. Звездообразные структуры денатурируют и гибридизуют с репертуаром модулей-носителей для рассматриваемого положения. Таким образом, положение-специфические константные сегменты направляют гибридизации таким же образом, как и при создании первичной библиотеки. Подходящие концы лигируют и образованный продукт объединяют с направляемой кодоном фракцией, что приводит к диверсификации. Это может выполняться в одном, нескольких или всех раундах замены модулей. В другом примере одну фракцию молекул в раунде для замены модуля подвергают удалению кодон-специфических выступов для рассматриваемого положения, например, экзонуклеазой. Затем репертуар модулей-носителей для рассматриваемого положения гибридизуют и лигируют. Затем образованные не направляемые кодоном продукты объединяют с направляемой кодонами собранной фракцией, что приводит к диверсификации. Это может выполняться в одном, некоторых или всех раундах замены модулей. Диверсификацию можно выполнять также перетасовкой/рекомбинацией (скрещиванием) модулей между членами библиотеки перед процессом замены модулей. Например, являющуюся нуклеиновой кислотой часть члена обогащенной библиотеки амплифицируют и расщепляют ферментом рестрикции,разрезающей в константном сегменте (константных сегментах), с образованием, следовательно, двух или более фрагментов. Фрагменты могут быть лигированы с фрагментами, происходящими из других членов библиотеки, с образованием полноразмерного продукта, посредством чего произошли перетасовка/рекомбинации. Другим примером способов перетасовки/рекомбинаций является способ с использованием звездообразной структуры (см. фиг. 4b). Звездообразную структуру расщепляют двумя последовательными рестриктазами, денатурируют и позволяют гибридизоваться, что приводит к обмену рассматриваемого модуля. Таким образом, могут быть выполнены раунды отбора, амплификации и диверсификации, делающие, следовательно, возможной молекулярную эволюцию (см. фиг. 6). Отбор на каталитическую активность Описанный принцип может быть также применен к отбору на каталитическую активность. В этом случае модули-носители включают функциональные группы реакционноспособного сайта, и звездообразная структура обеспечивает скелет для трехмерного размещения функциональных групп, имитируя посредством этого белки-ферменты. Обсуждаются схемы отбора на различные каталитические активности. Например, i) отбор на связывание с аналогом переходного состояния, ii) отбор на образование связи посредством ассоциации одного субстрата со звездообразными структурами, тогда как другой субстрат иммобилизован, например, с гранулами (вследствие чего члены библиотеки, ассоциированные с этими гранулами способны к образованию связи), или iii) отбор на расщепление связи посредством присутствия субстрата, ассоциированного как со звездообразной структурой, так и гранулой (вследствие чего члены библиотеки, не ассоциированные с гранулой, способны к расщеплению связи). (См. фиг. 7). Кодон-специфическая компартментализация Звездообразная структура позволяет каждому положению кодона становиться концевым и одноцепочечным посредством использования, например, подходящей рестриктазы, делая, таким образом, возможной высокоспецифическую компартментализацию посредством гибридизации и необязательно лигирования для конкретного положения кодона. Различные способы компартментализации известны в данной области, например, микроматрицы последовательностей антикодонов (Lockhart et al., Nat Biotechnol,14, 1675-80, 1996), столбцы последовательностей антикодонов (Halpin and Harbury, PLoS Biol, 2, E173,2004) или использование гранул, где отдельные гранулы содержат последовательность антикодонов и флуоресцентную метку, которая затем допускает сортинг, например, посредством сортинга клеток с возбуждением флуоресценции (Iannone et al., Cytometry, 39, 131-40, 2000). Такая компартментализация может быть полезна в практике настоящего изобретения, например: i) во время синтеза библиотеки для модификаций после химической реакции, ii) анализа отдельных клонов,iii) анализа прогрессирования в отборах или iv) анализа разнообразия. Следовательно, компартментализация в ситуации ii)-iv) может быть быстрой и экономичной альтернативой секвенированию ДНК для обращения свертки единственной последовательности или библиотеки последовательностей. Во всем данном описании, где композиции описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или где процессы описаны, как имеющие, включающие или содержащие конкретные стадии процесса, предполагается, что композиции настоящего изобретения также состоят по существу или состоят из перечисленных компонентов и что способы настоящего изобретения также состоят по существу или состоят из перечисленных стадий процессинга. Кроме того, должно быть понятно,что последовательность стадий или последовательность выполнения определенных действий является несущественной, пока настоящее изобретение остается действующим. Кроме того, две или более стадий или два или более действий могут проводиться одновременно. Способ и композиции настоящего изобретения представляют собой новые пути генерирования молекул с желаемыми свойствами. Такой подход объединяет чрезвычайно чувствительную и эффективную молекулярную биологию с гибкостью органической химии. Способность получать, амплифицировать и развивать (эволюционировать) неприродные полимеры и малые молекулы посредством молекулярной эволюции может привести к новым классам катализаторов, новым лигандам или лекарственным средствам со свойствами, превосходящими свойства продуктов, выделенных с использованием более медленных традиционных способов обнаружения. Настоящее изобретение обеспечивает также наборы и композицию для применения в способах настоящего изобретения. Определения Термины "нуклеиновая кислота" или "олигонуклеотид" относятся к полимеру нуклеотидов. Полимер может включать, без ограничения, природные нуклеозиды (т.е. аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин), аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С 5-бромуридин, С 5-фторуридин, С 5-уроуридин, С 5-пропинилуридин, С 5-пропинилцитидин,С 5-метилцитидин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, О(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин), химически модифицированные основания, биологически модифицированные основания (например, метилированные основания), интеркалированные основания, модифицированные сахара(например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) или модифицированные фосфатные группы (например, фосфоротиоатные и 5'-N-фосфорамидитные связи). Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды могут также включать другие полимеры оснований, имеющие модифицированный скелет, такие как замкнутая нуклеиновая кислота (LNA), пептиднуклеиновая кислота (PNA), треозонуклеиновая кислота (TNA) и любые другие полимеры, способные служить в качестве матрицы для реакции амплификации, использующей способ амплификации, например, полимеразной цепной реакции или лигазной цепной реакции. Термин "сегмент", используемый в данном описании, относится к непрерывному участку олигонуклеотидной последовательности. Термины "кодон" и "антикодон", используемые в данном описании, относятся к олигонуклеотидной последовательности, которая кодирует определенную химическую группу, ассоциированную с указанным кодоном или антикодоном. Ряд кодонов кодирует комбинацию конкретных химических реагентов,которые участвуют в образовании кодированной молекулы. Термин "структура стебель-петля", используемый в данном описании, относится к любой вторичной структуре, включающей по меньшей мере одну нуклеотидную часть, в которой цепь последовательности нуклеиновой кислоты, связана через внутримолекулярные водородные связи, с другой частью той же самой молекулы нуклеиновой кислоты для образования "самоспаренной" области, называемой "стеблем", большей частью двухцепочечной природы, и неспаренной области "петли", расположенной на одном конце указанного стебля. Когда длина петли равна нулю, это приводит к особому случаю, называемому "шпилькой" или палиндромом. Термин "малая молекула", используемый в данном описании, относится к органическому соединению, либо синтезированному в лаборатории, либо обнаруженному в природе, имеющему молекулярную массу, меньшую, чем 10000 г/моль, необязательно, меньшую, чем 5000 г/моль, и, необязательно, меньшую, чем 2000 г/моль, например, меньшую, чем 1000 г/моль. Предпочтительные малые молекулы пригодны для перорального введения. Термины "скелет малой молекулы" или "молекулярный скелет", используемые в данном описании,относятся к химическому соединению, имеющему по меньшей мере один сайт или химическую группу,пригодные для функционализации. Скелет малой молекулы или молекулярный скелет может иметь два,три, четыре, пять или более сайтов или химических групп, пригодных для функционализации. Сайты функционализации могут быть защищенными или маскированными, как это будет понятно квалифицированному специалисту в данной области. Сайты могут быть также обнаружены на лежащих в основе кольцевой структуры или кольцевом скелете. Термины "химическая реакционноспособная группа" или "химические группы" или "реакционноспособная единица", используемые в данном описании, относятся к любой химической группе, способной к модификации другой химической группы, присоединению к другой химической группе или отделению от другой химической группы. Они включают, но не ограничиваются ими, элемент структуры,мономер, мономерное звено макромолекулы, молекулярный скелет или другой реагент, применимый в опосредованном близостью химическом синтезе. В некоторых случаях химическая группа не является нуклеотидом или его производным. В другом аспекте по меньшей мере одной из химических групп, которые участвуют в синтезе образуемого химического, является неприродная аминокислота. Термин "ассоциированная с", используемый в данном описании, описывает взаимодействие между двумя или более группами, частями молекул, соединениями, мономерами и т.д. Когда две или более мо- 23024849 лекулярных частиц "ассоциированы" друг с другом, как описано в данном описании, они связаны прямым или опосредованным ковалентным или нековалентным взаимодействием. Предпочтительно, ассоциация является ковалентной. Ковалентная ассоциация может осуществляться, например, но без ограничения, через амидную, углерод-углеродную, дисульфидную, карбаматную, простую эфирную, простую тиоэфирную, мочевинную, аминную или карбонатную связь. Ковалентная ассоциация может также включать линкерную часть, например, фоторасщепляемый линкер. Желаемые нековалентные взаимодействия включают образование водородных связей, ван-дер-ваальсовы межмолекулярные взаимодействия,диполь-дипольные взаимодействия, взаимодействия пи-упаковки, гидрофобные взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия и т.д. Две или более частицы или два или более агентов могут быть "ассоциированы" друг с другом будучи присутствующими вместе в одной и той же композиции. Термин "модуль-носитель", используемый в данном описании, относится к химической группе, ассоциированной с олигонуклеотидом, и сегменту около 3'-конца, который может гибридизоваться с сегментами около 5'-конца во втором олигонуклеотиде, и сегменту около 5'-конца, который может гибридизоваться с сегментом около 3'-конца третьего олигонуклеотида. Модуль-носитель необязательно содержит сегмент кодона или антикодона. Термин "сегмент гибридизации", используемый в данном описании,относится к указанному сегменту олигонуклеотида. Термин "звездообразная структура", используемый в данном описании, относится к любой вторичной структуре, включающей по меньшей мере три стебля в основном двухцепочечной природы. 0, 1, 2, 3,5, 6, 7, 8, 9 или более нуклеотидных остатков могут разделять стебли. В особом случае, где нуль остатков разделяют четыре стебля, точку соединения называют соединением Hollyday. Звездообразная структура может состоять из одной молекулы нуклеиновой кислоты, или она может состоять из множества молекул нуклеиновых кислот. Термин "реакционная близость", используемый в данном описании, относится к расстоянию между реагирующими веществами, при котором реакция между указанными реагирующими веществами может происходить контролируемым, эффективным и удобным по времени образом. Термин "направляемая близостью реакция", используемый в данном описании, относится к химическим реакциям между реагирующими веществами (реагентами), которые приведены в реакционную близость гибридизацией нуклеиновых кислот, с которыми ассоциированы реагенты. Примеры Пример 1. Демонстрирует образование тримерной и тетрамерной звездообразной структуры ДНК взаимокомплементарными биспецифическими олигонуклеотидами. ДНК-олигонуклеотиды (получаемые DNA Technology Arhus, Denmark) смешивали, как показано в таблице на фиг. 8, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1 лигазном буфере (New England Biolabs), 50 мМNaCl. Полученные смеси инкубировали при 80 С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. Продукты анализировали нативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид) с последующим окрашиванием этидийбромидом с использованием стандартных протоколов(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Олиго 6 и олиго 7 (соответствующие Vip006 и vip007, соответственно), олиго 6 и олиго 8 (соответствующие vip006 и vip008, соответственно) и олиго 7 и олиго 8 (соответствующие vip007 и vip008, соответственно), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, способный, следовательно, образовывать отожженный димер. Таким образом, полосы, соответствующую димерам, наблюдали на дорожках 1-3.Vip006, vip007 и vip008, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент в отношении двух соседних олиго, способный, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру (см. фиг. 8). Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожке 4. Олиго 6, олиго 7 и олиго 9 (соответствующие Vip006, vip007 и vip009, соответственно), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент в отношении двух соседних олиго, способный, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру. Однако структура является открытой, так какvip008 и vip006 не имеют комплементарных сегментов (см. фиг. 8). Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожке 5. Ожидается, что этот открытый тример имеет слегка более низкую подвижность в данном геле, чем более компактная замкнутая форма тримера. Различие в подвижности действительно наблюдается при сравнении дорожки 4 с дорожкой 5. Равноценное наблюдение медленно мигрирующей тримерной полосы получали с использованием олиго 6, олиго 7 и олиго 10 (соответствующих vip006, vip007 и vip010, соответственно), где vip006 и vip010 не отжигаются непосредственно друг с другом (сравните дорожку 4 и дорожку 6). Для оценки эффективности образования замкнутых тримерных форм, олиго 6, олиго 7 и олиго 8 (соответствующие vip006,vip007 и vip008, соответственно) отжигали в присутствии двукратного избытка олиго 9 или олиго 10 (соответствующих vip009 или vip010, соответственно). Представляет интерес то, что основная полоса в обеих дорожках 7 и 8 соответствует замкнутым тримерным быстро мигрирующим частицам, состоящим из vip006, vip007 и vip008. Успешное образование замкнутого терамера выполняли отжигом олиго 6, олиго 7, олиго 9 и олиго 10 (соответствующихvip006, vip007, vip009 и vip010, соответственно) и наблюдали в виде одной основной полосы на дорожке 9. Следует обратить внимание, что предполагаемую валентность во всех классах получали с высокой эффективностью; наблюдаемую в виде единственной основной полосы. Пример 2. Превращение тримерной звездообразной структуры ДНК в единственную непрерывную цепь ДНК с использованием ДНК-лигазы Т 4. В данном примере продемонстрировано успешное создание трехстебельной звездообразной структуры ДНК, состоящей из единственной непрерывной цепи ДНК. Взаимокомплементарные биспецифические олигонуклеотиды отжигали и затем лигировали для образования непрерывной цепи ДНК. ДНКолиго (получаемые DNA Technology Arhus, Denmark) смешивали, как показано на фиг. 9, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1 лигазном буфере (New England Biolabs), 50 мМ NaCl. Полученные смеси инкубировали при 80 С в течение 2 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. 5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т 4. Готовили смесь, состоящую из 1,67 мкМ звездообразной структуры, 1 ДНК-лигазного буфера (New England Biolabs), 50 мМ NaCl и 0,2 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т 4 (New England Biolabs, cat M0201) и инкубировали в течение 30 минут при 37 С. Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т 4 (New England Biolabs, cat M0202). 1/3 объема лигазной смеси, 1 ДНКлигазный буфер (New England Biolabs), 50 мМ NaCl и 100 Е/мкл ДНК-лигазы Т 4 (New England Biolabs,cat M0202) добавляли к описанной выше обработанной киназой смеси и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Продукты анализировали ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, мочевина SM) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).Vip076 (25 нт) и vip017 (42 нт), каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, в который после отжига помещают 3'-конец vip076 рядом с 5'-концом vip017, образуя таким образом субстрат для ДНКлигазы Т 4. Таким образом, заметную полосу, соответствующую vip076-vip017 (67 нт), наблюдали на дорожке 1 (ненативный электрофорез в ПААГ). Подобным образом, образование заметной полосы, соответствующей vip017-vip078 (100 нт), наблюдали на дорожке 3. В отличие от этого, vip017-vip078 (58 нт),каждый имеет взаимокомплементарный сегмент, но не образуют отожженных соседних концов, и не ожидается, что они должны быть лигированы. Таким образом, на дорожке 2 наблюдали только полосы,соответствующие мономерам vip076 и vip078. Следует обратить внимание, что полоса, соответствующаяvip076, является более слабой, и поэтому ожидается, что vip076 является меньшим, и олигонуклеотиды находятся в эквимолярных концентрациях. Кроме того, vip078 (58 нт) мигрирует медленнее, чем vip076vip017 (67 нт), в геле, что не является неожиданным, так как vip076-vip017 содержит последовательности для создания структуры стебель-петля, дающие более компактную укладку и, следовательно, более высокую подвижность в геле.Vip076, vip017 и vip078, каждый имеют взаимокомплементарный сегмент, в который после отжига помещают 3'-конец vip076 рядом с 5'-концом vip017, и 3'-конец vip017 рядом с 5'-концом vip078, образуя,следовательно, два субстрата для ДНК-лигазы Т 4. Таким образом, значительную полосу, соответствующую vip07 6-vip017-vip078, наблюдали на дорожке 4. Таким образом, продемонстрировано создание тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из непрерывной цепи ДНК. Пример 3. Амплификация трехстебельнрой звездообразной структуры ДНК. В данном примере продемонстрирована успешная амплификация тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из одной непрерывной цепи ДНК. Взаимокомплементарные биспецифические олигонуклеотиды отжигали, лигировали и затем использовали в качестве матрицы в праймерной реакции удлинения. ДНК-олиго (получаемые DNA Technology Arhus, Denmark) смешивали, как указано ниже, в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1 лигазном буфере (New England Biolabs), 50 мМ NaCl. Полученные смеси инкубировали при 80 С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. 5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т 4. Готовили смесь, состоящую из 1,67 мкМ звездообразной структуры, 1 ДНК-лигазного буфера (New England Biolabs), 50 мМ NaCl и 0,2 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т 4 (New England Biolabs, cat M0201) и инкубировали в течение 30 минут при 37 С. Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т 4 (New England Biolabs, cat M0202). 1/3 объема лигазной смеси, 1 ДНКлигазный буфер (New England Biolabs), 50 мМ NaCl и 100 Е/мкл ДНК-лигазы Т 4 (New England Biolabs,cat M0202) добавляли к описанной выше обработанной киназой смеси и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Праймерную реакцию удлинения выполняли добавлением 3 объемов смеси для удлинения, 1,33Vent-буфер (New England Biolabs), 1,33 мкМ vip038, 2,67 мМ dNTP с 1,33 Е/мкл ДНК-полимеразойVent(exo-) (New England Biolabs, catM0257) или без ДНК-полимеразы к 1 объему реакционной смеси для лигирования. Раствор инкубировали в течение 1 мин при 92 С, 1 мин при 50 С и 10 мин при 74 С и помещали на лед. Реакции анализировали нативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (Sambrook, J., Fritsch, E.F.Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Результаты экспериментов показаны на фиг. 10. Vip038 является обратно комплементарным относительно 20 наиболее 5'-концевых (левых) оснований в vip078 и, следовательно, может праймировать реакцию удлинения с использованием vip078 или слияний vip078 в качестве матриц. Таким образом, получали единственную явную полосу, соответствующую двухцепочечному vip078, в реакции удлинения,содержащей vip038, vip076 и vip078 (дорожка 2). Следует обратить внимание, что полоса не присутствовала на дорожке 6, которая является эквивалентной, но без включенной ДНК-полимеразы. В отличие от этого, дорожка 6 содержит две полосы, которые предположительно состоят из отожженныхvip076/vip078/vip038 и отожженных vip078/vip038. Специфичность данной реакции продемонстрирована с использованием vip038, vip07 6 и vip017,где не было видимого различия между вариантами с ДНК-полимеразой и без ДНК-полимеразы, сравните дорожки 1 и 5. Успешное удлинение праймера наблюдали также с использованием реакции лигирования vip017vip078, иллюстрируемое заметной полосой на дорожке 3. Следует обратить внимание, что наблюдали также более слабую полосу, соответствующую двухцепочечному vip078, что является иллюстрацией того, что не весь vip078 был лигирован с vip017. На соответствующей дорожке 7 без ДНК-полимеразы наблюдали более слабую полосу почти с такой же подвижностью, что и подвижность двухцепочечногоvip017-vip078. Данная полоса предположительно состоит из отожженного vip038/vip017-vip078. Успешное удлинение праймера наблюдали также с использованием реакционной смеси vip076vip017-vip078 в качестве матрицы. Наблюдали две полосы с более низкой подвижностью в данном геле,чем в случае двухцепочечного vip017-vip078. Нижняя полоса соответствует отожженному vip038/vip076vip017-vip078, как видно при сравнении с эквивалентной дорожкой 8 без ДНК-полимеразы. Однако верхняя полоса на дорожке 4 является уникальной и, следовательно, состоит из двухцепочечного vip076vip017-vip078. Таким образом, данный пример демонстрирует, что ДНК-структуры могут быть превращены в двухцепочечную ДНК и, следовательно, являются амплифицируемыми. Пример 4. Химическая реактивность в центре звездообразной структуры. Химическая реактивность в центре звездообразных структур проявлялась при использовании следующего трехфункционального сшивающего линкера (TSAT, Трис-сукцинимидиламинотриацетат, Pierce ДНК-олиго: vip016/vip017 или vip016/vip017/vip018 (получаемые DNA Technology Arhus, Denmark),все имеющие внутренний амино-модифицированный dT (GlenResearch, cat. No.: 10-1038-xx) смешивали в 150 мМ NaCl, 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2 с получением 20 мкМ общей концентрации олиго. Полученные смеси инкубировали при 80 С в течение 2 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры на водяной бане. TSAT растворяли в ДМФА. Готовили 10-кратное серийное разведение в ДМФА. 1 объем ДМФА или разведение TSAT смешивали с 9 объемами буфера с получением конечной концентрации буфера 150 мМ NaCl, 100 мМ фосфат натрия, рН 7,2. 1 объем забуференного ДМФА или забуференногоTSAT разведения смешивали с 1 объемом отожженной смеси ДНК-олиго с получением конечных соотношений олиго:TSAT: 1:0, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 и давали возможность инкубироваться в течение 2 часов при комнатной температуре. Данные реакции анализировали электрофорезом в ПААГ: как нативным (7,5% полиакриламид), так и ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, 8 М мочевина), с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryVip016 и vip017, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент и способен, следовательно, образовывать отожженную димерную структуру. Vip016, vip017 и vip018, каждый имеет взаимокомплементарный сегмент относительно соседнего олиго и способен, следовательно, образовывать замкнутую отожженную тримерную структуру (см. фиг. 12). Как и ожидалось, на дорожках 1-5 нативного геля основная полоса соответствует димерной структуре, тогда как основная полоса на дорожках 6-10 соответствует тримерной структуре. В ненативном геле отжиг разрушается. Как и ожидалось, наблюдали полосу на дорожках 1 и 6 в ненативном геле, соответствующую мономеру. Однако при включении TSAT наблюдали структуры более высокой упорядоченности (дорожки 2-5, 7-10, ненативный гель), свидетельствующие о том, что TSAT действительно сшивал данные олиго. Интересно, что, когда присутствовали только vip016 и vip017, сшитая структура наивысшей упорядоченности была димерной (ненативный гель, дорожки 2-5), тогда как, когда присутствовали vip016, vip017, vip018, наблюдали дополнительную тримерную структуру (ненативный гель, дорожки 7-10), что свидетельствует, следовательно, о том, что сшивание зависит от отжига ДНКолигонуклеотидов. Заслуживающим внимания является также то, что, как и ожидалось, наблюдали куполообразную реакцию доза-ответ; при низкой концентрации TSAT реакция будет медленно ведущей к низким выходам, когда концентрация TSAT увеличивается, реакция будет протекать быстрее, приводя к более сшитому продукту, однако при более высоких концентрациях TSAT сшивание будет конкурировать с молекулами TSAT, реагирующими только с одним ДНК-олиго, приводя к снижению сшитого продукта. Таким образом, наивысший выход сшитого продукта наблюдали с использованием 1000 эквивалентов TSAT (дорожки 4 и 9, ненативный гель). Кроме того, преимущество замкнутой отожженной структуры для сшивания иллюстрировалось гораздо более высокими общими выходами, полученными на дорожках 7-10, в сравнении с их копиями на дорожках 2-5 с такой же концентрацией TSAT. Пример 5. Химические реакции, направляемые звездообразной структурой ДНК. Олигонуклеотид, vip017, функционализировали сшиванием аминокислоты (L-Leu или Gly Fluca,61820 и 50052) через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на внутреннем модифицированном dT в vip017, гомобифункциональным линкером BSOCOES Бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси) этил]сульфон), Pierce cat 21600) обработкой олигонуклеотида (5 нмоль) в 200 мМ рН 7,4 растворе фосфата натрия (200 мкл) 0,1 объемами 100 мМ раствора BSOCOES в ДМФА в течение 10 мин при 25 С с последующей обработкой 0,3 объемами 300 мМ раствора аминокислоты (Leu или Gly) в 300 мМ NaOH в течение 2 часов при 25 С. Общий объем реакций составлял 200 мкл. Неочищенные связанные аминокислотные реагенты выделяли осаждением EtOH и использовали без дополнительной очистки. ДНК осаждали NaOAc/EtOH в соответствии с (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) in "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Осадок ресуспендировали в воде. Олигонуклеотиды отжигали приготовлением: 3,125 мкМ каждого из олигонуклеотидов, 125 мМMES рН 6,0, 187,5 мМ NaCl. Полученную смесь инкубировали при 80 С в течение 2 мин с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры на водяной бане. ДНК-направляемую химическую реакцию (образование амидной связи) выполняли добавлением EDC и sNHS к предварительно отожженным олигонуклеотидам: 2,5 мкМ предварительно образованных звездообразных структур, 100 мМ MES рН 6,0, 150 мМ NaCl, 20 мМ EDC и 15 мМ sNHS (конечные концентрации). Полученную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и осаждали EtOH, как описано выше. Данные реакции анализировали электрофорезом в ПААГ: как нативным (7,5% полиакриламид), так и ненативным электрофорезом в ПААГ (7,5% полиакриламид, 8 М мочевина) с последующим окрашиванием этидийбромидом, с использованием стандартных протоколов (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Олигонуклеотид, vip017, функционализировали сшиванием аминокислоты, Leu или Gly, через альфа-аминогруппу с первичной аминогруппой на модифицированном внутреннем dT в vip017, гомобифункциональным линкером BSOCOES. Модифицированный dT расположен между двумя сегментами гибридизации в vip017. Vip076 имеет модифицированный dT, содержащий первичную аминогруппу, за которой следует 3'-сегмент гибридизации, комплементарный 5'-сегменту гибридизации в vip017. Таким образом, отжигом vip017 и vip076 создается близость между аминокислотой, конъюгированной с vip017,и первичной аминогруппой на vip076. Таким образом, полосу, соответствующую димеру, наблюдали на дорожках 4-6 в нативном геле. Vip008 имеет комплементарные сегменты в отношении как vip076, так иvip017 и, следовательно, способен образовывать замкнутую тримерную звездообразную структуру и размещать химические функциональные группы vip017 и vip076 в реакционной камере в центре звездообразной структуры. Таким образом, полосу, соответствующую тримеру, наблюдали на дорожках 1-3 в нативном геле. После активации с использованием EDC/sNHS может быть образована амидная связь между аминокислотой, конъюгированной с vip017, и первичной аминогруппой в vip076 и посредством этого сшиваниеvip017 и vip076. Как и ожидалось, когда образовывались звездообразные структуры (в присутствииvip008), действительно появлялась уникальная полоса, соответствующая сшитым vip076/vip017 как сvip017-Gly, так и с vip017-Leu (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожки 2 и 3, соответственно), которая не присутствовала без активации EDC/sNHS (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожки 8 и 9) или в неацетилированным vip017 (ненативный электрофорез в ПААГ, дорожка 1). Интересно, что эта уникальная полоса не детектировалась, когда не присутствовал vip008 (ненативный электрофорез в ПААГ,дорожки 5 и 6). Это является иллюстрацией того, что химическая реакция может направляться звездообразной структурой и что звездообразная структура, является, по-видимому, более эффективной в направлении химических реакций, чем два отожженных олиго. Пример 6. Сборка и лигирование звездообразной структуры. В данном примере продемонстрирована успешная амплификация тримерной звездообразной структуры ДНК, состоящей из двухцепочечной ДНК (dsDNA). Взаимокомплементарные специфические олигонуклеотиды отжигали, лигировали и затем использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции. Использовали следующие олигонуклеотиды: vip029-vip031-vip0132-vip0133-vip030. На фиг. 13 показана схематически гибридизация указанных олигонуклеотидов. ДНК-олигонуклеотиды (получаемые DNA Technology Arhus, Denmark) смешивали в концентрациях 2 мкМ, каждый, в 1 лигазном буфере (New England Biolabs), 50 мМ NaCl. Полученные смеси инкубировали следующим образом: 94 С в течение 5 мин, 80 С в течение 30 с, 65 С в течение 30 с, 50 С в течение 30 с, 35 С в течение 30 с, 20 С в течение 30 с, 10 С до следующей стадии. Процедуру отжига выполняли на ПЦР-установке Applied Biosystems AB2720. 5'-концы олигонуклеотидов фосфорилировали ДНК-полинуклеотидкиназой Т 4. Готовили смесь, состоящую из 1,5 мкМ звездообразной структуры, 1 ДНК-лигазного буфера (New England Biolabs), 50 мМNaCl и 0,17 Е/мкл ДНК-полинуклеотидкиназы Т 4 (New England Biolabs, cat M0201) и инкубировали в течение 30 мин при 37 С. Фосфодиэфирная связь образовывалась между расположенными рядом концами отожженных олигонуклеотидов ДНК-лигазой Т 4 (New England Biolabs, cat M0202) в 1 ДНК-лигазном буфере (New England Biolabs), содержащем 50 мМ NaCl и 200 Е ДНК-лигазы Т 4 (New England Biolabs, cat M0202), в объеме 10 мкл и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. ПЦР-амплификацию выполняли с использованием следующих условий. Реакцию выполняли в lThermoPol-буфере (New England Biolabs B9004S) с 0,2 мМ dNTP (New England Biolabs O447S), 8 мМ MgSO4, 0,2 мкМ СМЫСЛОВЫМ праймером и 0,2 мкМ антисмысловым праймером, 1 М бетаином (Sigma B0300), 1 Е/100 мкл Vent (exo-) (New England Biolabs M0257L). Используемыми праймерами были vip027 и vip028. Биотинилированными версиями двух праймеров являются vip034 иvip038, соответственно. ПЦР-амплификацию выполняли с использованием следующих условий проведения циклов: 2 мин при 95 С и 20 циклов 95 С/30 с, 60 С/30 с, 74 С/30 с. Очистку ПЦР-продукта, который должен использоваться для фолдинга, и одноцепочечной ДНК (ssDNA), сообщенную в примере 7 ниже, выполняли с праймерами vip034 и vip028. ПЦР-продукт анализировали нативным электрофорезом в ПААГ. Полоса 201 п.н. ясно виден на геле, изображенном на фиг. 13. Пример 7. Рефолдинг ПЦР-продукта. Фолдинг (укладку) ПЦР-продуктов выполняли следующим образом. Процедуру очистки ПЦР выполняли с использованием PerfectPrep (Eppendorf, cat 0032 007.740) в соответствии с инструкциями,прилагаемыми к набору. Фолдинг выполняли в 0,1 М NaCl, 0,1% Тритоне Х-100, 0,1 мкМ vip027, 0,1 мкМvip028, в объеме 10 мкл (5 мкл на продукт, смешанный с 5 мкл 2 смеси буфер/праймер). ПЦР-продукт использовали в 4 различных концентрациях (в диапазоне от 1:2 до 1:20). В одной серии полученную смесь инкубировали в течение 2 мин в кипящей воде и затем охлаждали на бане со смесью воды и льда. Во второй серии полученную смесь нагревали и охлаждали с использованием следующей программы ПЦР-установки Applied Biosystems AB2720: 94 С в течение 5 мин, 80 С в течение 30 с, 65 С в течение 30 с, 50 С в течение 30 с, 35 С в течение 30 с, 20 С в течение 30 с, 10 С до следующей стадии. В третьей серии не проводили нагревание и охлаждение. Полученные продукты анализировали на геле 20% ТВЕ-мочевина (Invitrogen). Гель окрашивали красителем SYBR зеленым (Molecular Probes S7563, разведение 1:10000 в буфере 1TBE, в соответствии с инструкциями). На фиг. 14 дорожки геля содержат следующее: Дорожка 1: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, быстрое охлаждение; Дорожка 2: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, быстрое охлаждение; Дорожка 3: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, быстрое охлаждение; Дорожка 4: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, быстрое охлаждение; Дорожка 5: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, ступенчатое охлаждение; Дорожка 6: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, ступенчатое охлаждение; Дорожка 7: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, ступенчатое охлаждение; Дорожка 8: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, ступенчатое охлаждение; Дорожка 9: ПЦР-продукт, разведенный 1:2, без обработки; Дорожка 10: ПЦР-продукт, разведенный 1:4, без обработки; Дорожка 11: ПЦР-продукт, разведенный 1:10, без обработки; Дорожка 12: ПЦР-продукт, разведенный 1:20, без обработки; Дорожка 13: Только ПЦР-продукт. Данный эксперимент показывает, что одноцепочечная структура ДНК мигрирует при приблизительно 1000 п.н. в отличие от двухцепочечного ДНК-продукта (dsDNA) 201 п.н. По-видимому, оптимальным условием для образования звездообразной структуры является нагревание с последующим быстрым охлаждением указанных реакций. Пример 8. Очистка подвергнутой рефолдингу (повторной укладке) звездообразной структуры. Звездообразную структуру двухцепочечной ДНК (ssDNA) очищали с использованием покрытых стрептавидином магнитных гранул (Dynal Cat 650.02). 10 мкл гранул промывали два раза 2 BWT (2MNaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ EDTA, 0,2% Тритон-Х-100). После конечного промывания гранулы суспендировали в одном объеме 2 BWT и добавляли один объем подвергнутого рефолдингу ПЦРпродукта. Полученную суспензию инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, перемешивая время от времени. Пробирку помещали в магнит и после сбора гранул супернатант удаляли. Гранулы суспендировали в теплом (50 С) промывном буфере (2 М мочевина, 0,1% Тритон Х-100) и инкубировали в течение 2 мин при 50 С. Пробирку помещали на магнит и процедуру промывки выполняли в целом три раза. Одну конечную промывку выливали в 1 BWT (1M NaCl, 5 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA, 0,1% Тритон-Х-100). После удаления конечного промывного буфера гранулы суспендировали в 1,5 мл NT (10 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100) и инкубировали при 50 С в течение 5 мин. Пробирку переносили на баню со смесью воды со льдом для быстрого охлаждения и процедура приводила к образованию звездообразной структуры, иммобилизованной на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. Пробирку после быстрого охлаждения помещали на магнит и супернатант удаляли. Гранулы суспендировали в 50 мкл NT, и они были готовы для расщепления BsaI для освобождения одноцепочечной ДНК от гранул. К 17 мкл гранул добавляли 2 мкл 10 NEB3-буфера и 1 мкл BsaI (10 Е/мкл; NEB R0535L). Реакцию инкубировали 14 ч при 50 С. Продукт расщепления анализировали денатурирующим электрофорезом в полиакриламиднром геле (гель 10% ТВЕ-мочевина, Invitrogen) добавлением денатурирующего буфера для нанесения к пробам и нанесением всей смеси, включающей гранулы, в лунки геля. Гель окрашивали красителем SYBR зеленым (Molecular Probes S7563, разведение 1:10000 в буфере 1TBE, в соответствии с инструкциями). На фиг. 15 наблюдается одна полоса на дорожке 1 (+BsaI) и отсутствие полос на дорожке 2 (-BsaI). Таким образом, ssDNA подверглась укладке на покрытых стрептавидином магнитных гранулах с образованием таким образом субстрата для BsaI, демонстрируемым способностью данного фермента расщеплять одноцепочечный продукт. Пример 9. Формат расщепления петли. Конструировали два генома, оба из которых могли расщепляться в петлях звездообразных структур. Рестриктазы обычно не способны расщеплять одноцепочечную ДНК (ssDNA). Однако отжиг 10-мерных олигонуклеотидов с петлями генерируют субстраты для ферментов, и посредством этого последовательности узнавания для указанных ферментов становятся двухцепочечными. План данного эксперимента схематически показан на фиг. 16. Собирали две структуры, s129 и sl49. s129 состояла из следующих олигонуклеотидов: vip029vip161-vip162-vip163-vip170. s149 состояла из следующих олигонуклеотидов: vip029-vip161-vip192vip193-vip070. Vip162, vip163, vip192 и vip193, все содержали последовательности узнавания двух рестриктаз (vip162: ApaI и BaraHI, vip163: EcoRI и KpnI, vip192: PvuII и SacI, vip193: SmaI и VspI). ДНК-олиго (получаемые TAGC, Copenhagen, Denmark) смешивали в концентрациях 2 мкМ, каж- 29
МПК / Метки
МПК: C07B 61/00, C12N 15/10
Метки: нуклеиновую, соединение, конструкция, кислоту, способ, химическое, получения, содержащая
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-24849-konstrukciya-soderzhashhaya-nukleinovuyu-kislotu-i-himicheskoe-soedinenie-i-sposob-ee-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту и химическое соединение, и способ ее получения</a>
Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, днк-полимеразы и эндонуклеазы
Номер патента: 5577
Опубликовано: 28.04.2005
Авторы: Асада Киезо, Морияма Марико, Ямамото Юнко, Мияке Казуе, Като Икуносин, Хагия Митио, Мукаи Хироюки, Сато Есими, Такеда Осаму, Савараги Харухиза, Уемори Такаси
МПК: C12N 15/10, C12Q 1/68
Метки: эндонуклеазы, днк-полимеразы, участием, способом, праймера, нуклеиновую, содержащий, полученный, продукт, иммобилизованную, кислоту, олигонуклеотидного, химерного
Формула / Реферат:
1. Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид и имеющий структуру, в которой рибонуклеотид расположен на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, для применения в способе, включающем (a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и...
Соединение 3-аминокарбазола, фармацевтическая композиция, его содержащая, и способ их получения
Номер патента: 19068
Опубликовано: 30.12.2013
Авторы: Гарофало Барбара, Каццолла Никола, Мауджери Катерина, Драгоне Патриция, Гульельмотти Анджело, Фурлотти Гвидо, Колетта Изабелла, Ализи Мария Алессандра, Мангано Джорджина
МПК: A61P 29/00, A61K 31/403, C07D 209/88...
Метки: получения, соединение, содержащая, фармацевтическая, композиция, способ, 3-аминокарбазола
Формула / Реферат:
1. Соединение 3-аминокарбазола, отличающееся тем, что имеет общую формулу (I), приведенную нижев которой R1 представляет собой атом галогена, метильную группу или тригалогенметильную группу, нитрогруппу или цианогруппу;R2 представляет собой линейную или разветвленную гидроксиалкильную группу, содержащую от 1 до 8 атомов углерода, или линейную или разветвленную карбонилалкильную группу, содержащую от 1 до 8 атомов углерода,его фармацевтически...
Трициклическое индазольное соединение, способ его получения и содержащая его фармацевтическая композиция
Номер патента: 21417
Опубликовано: 30.06.2015
Авторы: Мангано Джорджина, Гарроне Беатриче, Ализи Мария Алессандра, Каццолла Никола, Фурлотти Гвидо, Магаро' Габриеле
МПК: A61K 31/5517, A61K 31/4985, A61P 1/00...
Метки: способ, фармацевтическая, получения, соединение, трициклическое, композиция, содержащая, индазольное
Формула / Реферат:
1. Трициклическое индазольное соединение общей формулы (I)где Y обозначает СН или N;W обозначает СН или N;при условии, что по крайней мере один из Y и W является атомом азота;Х1 и Х3 могут независимо обозначать s-связь, двухвалентную алкильную цепь, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, карбонильную группу, двухвалентную алканоильную цепь типа -CO-(СН2)1-4- или -(СН2)1-4-СО-, где атомы водорода указанной алкильной или алканоильной цепи...
Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген cs возбудителя малярии, и белкового антигена, содержащего белок cs или его фрагмент, для лечения или профилактики малярии
Номер патента: 16648
Опубликовано: 30.06.2012
Авторы: Гоудсмит Яап, Хеппнер Доналд, Стюарт В.Энн, Пау Мария Грация, Коэн Джозеф Д., Дюбуа Патрис М.
МПК: A61K 39/015
Метки: кислоту, лечения, рекомбинантного, нуклеиновую, профилактики, применение, дефектного, антиген, содержащего, фрагмент, возбудителя, антигена, белкового, малярии, белок, аденовируса, репликации, кодирующую, гетерологичную
Формула / Реферат:
1. Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген CS возбудителя малярии, и смешанного с адъювантом белкового антигена, содержащего белок CS или его иммуногенный фрагмент, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики малярии, где указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 11, 24, 26, 34, 35, 48,...
Соединение для лечения инфекционных заболеваний, соответствующий способ и фармацевтическая композиция, содержащая указанное соединение
Номер патента: 22060
Опубликовано: 30.10.2015
Автор: Гиверкман Биргит Кджэлдгаард
МПК: A61P 31/00, C07D 409/06, A61K 31/5415...
Метки: указанное, инфекционных, соответствующий, фармацевтическая, заболеваний, композиция, соединение, лечения, способ, содержащая
Формула / Реферат:
1. Соединение общей формулы (I)где V представляет собой S;W представляет собой C=CH-(CHX)n-CX(R9)(R10) или W представляет собой C=CH-(CHX)n-1-CH=C(R9)(R10);n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 5;каждый X отдельно выбран из группы, включающей водород, галоген, гидрокси, амино, нитро, C1-6-алкил и C1-6-алкокси;R1, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 представляют собой водород;R2 выбран из группы, включающей F, Cl, Br, I, CH2Y, CHY2 и CY3, где...
Предыдущий патент: Катализатор окислительной конверсии углеводородных газов с получением оксида углерода и водорода
Следующий патент: Способ получения соединения алкоксида алкилолова и способ получения эфира карбоновой кислоты с использованием указанного соединения
Случайный патент: 6-галогено[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидины для борьбы с вредителями