Композиции, одновалентные в отношении связывания cd28, и способы их применения

WILKINS, Изобретение относится к доменным антителам, одновалентно связывающим CD28. Доменные антитела,которые одновалентно связывают CD28, могут тормозить активность CD28. Дополнительно в объем настоящего изобретения входят нуклеиновые кислоты, кодирующие заявленные антитела, применение и фармацевтические композиции для лечения и/или предотвращения иммунного заболевания, а также лиганды с двойной специфичностью к связыванию, содержащие антитела согласно изобретению. Область техники Изобретение относится к доменным антителам (Ат), которые связывают CD28 и предотвращают связывание CD28 с CD80 и (или) CD86, где эти дАт перекрестно не реагируют с CTLA4, а также к способам их применения. Уровень техники Антиген-неспецифические межклеточные взаимодействия между Т-лимфоцитами и антигенпредставляющими клетками (АПК) генерируют Т-клеточные костимуляторные сигналы, которые индуцируют Т-клеточные ответы на антиген (Jenkins, Johnson (1993) Curr. Орт. Immunol. 5: 361-367). Костимуляторные сигналы определяют выраженность Т-клеточного ответа на антиген, и будет ли этот ответ активировать или инактивировать последующие ответы на антиген (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445- 480). Активация Т-лимфоцитов в отсутствии костимуляции ведет к преждевременно прерванному или слабому Т-клеточному ответу (Schwartz, R. Н. (1992) Cell 71: 1065-1068). Один ключевой костимуляторный сигнал возникает при взаимодействии поверхностного рецептора Т-лимфоцитов CD28 с молекулами, схожими с В 7, на антигенпредставляющих клетках (например, В 7-1 и В 7-2, или CD80 и CD86, соответственно) (P. Linsley и J. Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212). Взаимодействие костимуляторных молекул CD28 с В 7-1 (CD80) и В 7-2 (CD86) является важным механизмом передачи сигнала для усиления и поддержания Т-клеточных ответов (Freedman et al. (1987) J. Immunol. 137: 3260-3267;CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов, практически всех лимфоцитов CD4, в меньшей степени человеческих Т-лимфоцитов CD8, некоторых клеток-естественных киллеров и всех Т-лимфоцитов мыши. CD28 представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа и является членом семейства иммуноглобулинов за счет присутствия одного Ig-подобного вариабельного внеклеточного домена, содержащего мотив MYPPPY (последовательность под номером: 639), необходимый для связывания CD80 и CD86 (Peach et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2049-2058). CD28 содержит остаток цистеина, расположенный после Ig-подобного вариабельного домена, который участвует в гомодимеризации. Последовательность белка CD28 и нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий CD28,описаны, например, Harper et al. J. Immunol. (1991) 147: 1037-44. Последовательность человеческой мРНК, кодирующей CD28, также описана в NCBI, идентификатор NM006139, с последним обновлением 19 апреля 2009 г., например. Полная аминокислотная последовательность человеческого CD28 также описана в NCBI, идентификатор NM006130, с последним обновлением 19 апреля 2009 г., например.CD28 передает сигнал, который обеспечивает синергизм с сигналом Т-клеточного рецептора (TCR),способствуя активации наивных Т-лимфоцитов (Lanzavecchia et al. (1999) Cell 96: 1-4). Передача сигналаCD28 регулирует порог активации Т-лимфоцитов и значительно уменьшает число TCR, необходимых для эффективной активации Т-лимфоцитов (Viola et al. (1996) Science 273: 104-6). Костимуляция CD28 ведет к ускорению пролиферации Т-лимфоцитов, выработке множества цитокинов и цитокиновых рецепторов, усиленной выработке белков, участвующих в продвижении клеточного цикла, и поддержании экспрессии лиганда CD40 (CD40L) на Т-лимфоцитах (Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed.Fifth Edition, Page 396). Сигналы CD28 играют критически важную роль в регуляции дифференцировки Т-лимфоцитов CD4 и CD8. CD28 также оптимизирует ответы уже активированных Т-лимфоцитов, способствуя выработке ИЛ-2 и выживаемости Т-лимфоцитов. Выработка ИЛ-4 наивными Т-лимфоцитами сильно зависит от костимуляции В 7-1/В 7-2. Прерывание механизма с участием CD28/B7 в ходе активации наивных Тлимфоцитов нарушает пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, а прерывание механизма с участием CD28/B7 и уже активированных Т-лимфоцитов уменьшает пролиферацию Т-лимфоцитов, но не выработку эффекторных цитокинов (Sharpe et al. Fundamental Immunology, W.E. Paul Ed. Fifth Edition,pages 393-404). Антительные ответы, зависимые от Т-хелперов, включают механизм с участием B7-CD28 при генерировании костимуляторных сигналов, необходимых для соответствующих взаимодействий Тлимфоцит/В-лимфоцит, необходимых для переключения классов иммуноглобулинов и образования зародышевого центра. У мышей с отсутствующим CD28 после антигенной стимуляции в лимфоидных фолликулах накапливаются потенциально реактивные В-лимфоциты, но они не способны пролиферировать или подвергаться соматической мутации (Ferguson et al. (1996) J. Immunol. 156: 4576-4581).B7-1 и В 7-2 также являются лигандами второго высокоаффинного рецептора CTLA4 (CD152), который присутствует на поверхности активированных Т-лимфоцитов. Костимуляция ингибиторных сигналов В 7-1/В 7-2 происходит, когда В 7-1/В 7-2 связываются с CTLA-4 (Brunet et al. (1987) Nature 328: 267270, Linsley et al. (1991) J. Exp. Med.174: 561-569). Исход иммунного ответа зависит от соотношения между активацией Т-лимфоцитов, опосредованным CD28, и торможением Т-лимфоцитов, опосредованнымCTLA-4. Торможение активации Т-лимфоцитов, опосредованной CD28, может сопровождаться торможением нежелательных Т-клеточных ответов в ходе аутоиммунных процессов, отторжения трансплантата или-1 024585 аллергических реакций. Например, торможение активации Т-лимфоцитов, опосредованной CD28, может замедлять отторжение трансплантата, предупреждать острую реакцию отторжения аллотрансплантата,вызывать толерантность, специфичную в отношении конкретного донора, и предупреждать развитие и останавливать прогрессирование хронического отторжения трансплантата, а также реакцию "трансплантат против хозяина" (ТПХ), например, когда трансплантированные Т-лимфоциты вызывают выраженный иммунный ответ, направленный против аллоантигенов тканей хозяина (Salama et al. (2001) J. Clin. Invest. 108: 943-48). Торможение активации Т-лимфоцитов, опосредованной CD28, не только уменьшает иммунный ответ за счет торможения активации передачи сигнала через CD28, оно не должно нарушать взаимодействие CD86 и CD80 с CTLA-4, таким образом поддерживая торможение Т-клеточного ответа,опосредованное CTLA-4. Таким образом, торможение активации Т-лимфоцитов, опосредованной CD28,можно использовать для предупреждения развития аутоиммунных реакций и влиять на прогрессирование и (или) тяжесть уже имеющихся аутоиммунных заболеваний, включая экспериментальные модели артрита, индуцированного коллагеном, аутоиммунный тиреоидит, аутоммунный увеит, тяжелую миастению и системную красную волчанку (Saloman et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 225-252). Что требуется, так это путь торможения активации Т-лимфоцитов, опосредованной CD28, без стимуляции механизмов передачи сигнала CD28. В описании, содержащемся в данном описании, рассматривается эта потребность и дается ответ на нее.Cущность изобретения Изобретение относится к доменным антителам (дАт), одновалентно связывающим CD28. Из-за явной значимости CD28 в регуляции Т-клеточного ответа и выработки антител взаимодействие CD28/B7(CD80 и CD86) и соответствующие механизмы представляют собой важные мишени при разработке терапевтических подходов для лечения заболеваний, обусловленных аномальными клеточными ответами,такими как отторжение трансплантата, аутоиммунные заболевания и (или) избыточный антительный ответ. Доменные антитела, одновалентные при связывании CD28, могут тормозить активность CD28,уменьшая иммунный ответ и в то же время не вызывая нежелательные эффекты, которые могут наблюдаться в случае двухвалентного или поливалентного связывания CD28. Доменные антитела также можно применять в любом из ряда случаев, в которых принято использовать двухвалентные антитела, например, при обследовании методами визуализации и в диагностике in vivo. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) связывает CD28 и содержит: а) последовательность CDR1, по меньшей мере, на 90% идентичную последовательности CDR1,выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 484, последовательность SEQSEQ ID NO: 520, последовательность SEQ ID NO: 523, последовательность SEQ ID NO: 526, последовательность SEQ ID NO: 529 и последовательность SEQ ID NO: 636: b) последовательность CDR2, по меньшей мере, на 90 % идентичную последовательности CDR2, выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 485, последовательность SEQ ID NO: 488, последовательность SEQ IDNO: 524, последовательность SEQ ID NO: 527, последовательность SEQ ID NO: 530 и последовательность SEQ ID NO: 637, и с) последовательность CDR3, по меньшей мере, на 90 % идентичную последовательности CDR3, выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 486, последовательность SEQ ID NO: 489, последовательность SEQ ID NO: 492, последовательность SEQ ID NO: 495, последовательность SEQ ID NO: 498, последовательность SEQ ID NO: 501, последовательность SEQCD28. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит:a) последовательность CDR1 по меньшей мере на 95% идентичную последовательности CDR1, выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 484, последовательность SEQ IDb) последовательность CDR2, по меньшей мере, на 95% идентичную последовательности CDR2,выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 485, последовательность SEQSEQ ID NO: 521, последовательность SEQ ID NO: 524, последовательность SEQ ID NO: 527, последовательность SEQ ID NO: 530 и последовательность SEQ ID NO: 637, и с) последовательность CDR3 по меньшей мере на 95% идентичную последовательности CDR3, выбранной из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 486, последовательность SEQ IDSEQ ID NO: 531 и последовательность SEQ ID NO: 638. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит:a) последовательность CDR1, выбранную из группы, которая содержит последовательность SEQ IDb) последовательность CDR2, выбранную из группы, которая содержит последовательность SEQ IDc) последовательность CDR3, выбранную из группы, которая содержит последовательность SEQ IDSEQ ID NO: 528, последовательность SEQ ID NO: 531 и последовательность SEQ ID NO: 638. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 58, последовательность SEQ ID NO: 59, последовательность SEQ ID NO: 60, последовательность SEQ IDSEQ ID NO: 600, последовательность SEQ ID NO: 607, последовательность SEQ ID NO: 611, последовательность SEQ ID NO: 617, и последовательность SEQ ID NO: 622. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 58, последовательностиSEQ ID NO: 580, последовательности SEQ ID NO: 599, последовательности SEQ ID NO: 600, последовательности SEQ ID NO: 607, последовательности SEQ ID NO: 611, последовательности SEQ ID NO: 617,или последовательности SEQ ID NO: 622 не более чем на 8 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения период полужизни дАт in vivo увеличен. В одном из вариантов осуществления изобретения дАт присоединено к полиэтиленгликолю (ПЭГ) путем реакции пегилирования. В одном из вариантов осуществления изобретения ПЭГ присоединен через остаток цистеина или лизина. В одном из вариантов осуществления изобретения ПЭГ составляет примерно от 10 до 50 кД. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) оно имеет гидродинамический размер по меньшей мере примерно 24 кД. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) имеет гидродинамический размер по меньшей мере примерно 200 кД. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) имеет период полужизни t примерно от 15 с до 12 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) имеет период полужизни t примерно от 12 ч до 744 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит аминокислотные последовательности FW1, FW2, FW3 и FW4, которые соответствуют FW1, FW2, FW3 и FW4 человеческого антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательности FW1, FW2, FW3 и FW4 отличаются от последовательностей FW1, FW2, FW3 и FW4 человеческого антитела не больше чем на 10 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит аминокислотные последовательности FW1, FW2, FW3 и FW4 идентичные FW1, FW2, FW3 и FW4 человеческого антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность FW2 идентична FW2 человеческого антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) обладает, по меньшей мере, тремя характеристиками, выбранными из группы, в которую входят:a) имеет Kd примерно от 50 нмоль до 1 пмоль в отношении связывания CD28,b) имеет период полужизни t примерно от 15 с до 12 ч,c) имеет период полужизни t примерно от 12 ч до 336 ч,d) содержит последовательность CDR1, которую выбирают из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 484, последовательности SEQ ID NO: 487, последовательности SEQ ID NO: 490,последовательности SEQ ID NO: 493, последовательности SEQ ID NO: 496, последовательности SEQ IDNO: 636; последовательность CDR2, которую выбирают из группы, состоящей из последовательностиSEQ ID NO: 518, последовательности SEQ ID NO: 521, последовательности SEQ ID NO: 524, последовательности SEQ ID NO: 527, последовательности SEQ ID NO: 530 и последовательности SEQ ID NO: 637; и последовательность CDR3, которую выбирают из группы, состоящей из последовательности SEQ IDSEQ ID NO: 528, последовательности SEQ ID NO: 531 и последовательности SEQ ID NO: 638. В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) является 1h-239891(D70C) (последовательность SEQ ID NO: 543). В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит вариабельный домен по меньшей мере, на 90% идентичный аминокислотной последовательности дАт 1h-239891(D70C) (SEQ ID NO: 543). В одном из вариантов осуществления изобретения доменное антитело (дАт) содержит вариабельный домен, который отличается от аминокислотной последовательности дАт 1h-239-891(D70C) (SEQ IDNO: 543) не более чем на 5 аминокислот. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей дАт согласно изобретению. Изобретение также относится к применению доменного антитела (дАт) для изготовления препарата для лечения пациента, когда пациент нуждается в доменном антителе, связывающем CD28. В одном из вариантов осуществления изобретения пациент несет риск иммунологического заболевания. В одном из вариантов осуществления изобретения иммунологическое заболевание является аутоиммунным заболеванием или заболеванием, обусловленным трансплантацией органа. В одном из вариантов осуществления изобретения заболевание, обусловленное трансплантацией органа, выбирают из группы, состоящей из отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата и реакции "трансплантат против хозяина". В одном из вариантов осуществления изобретения аутоиммунное заболевание выбирают из группы,состоящей из системной красной волчанки, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, сахарного диабета, псориаза, склеродермии, атеросклероза, воспалительного заболевания кишечника и неспецифического язвенного колита. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения иммунного заболевания, содержащей терапевтически эффективное количество дАт и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также относится к лиганду с двойной специфичностью к связыванию, содержащему дАт и одиночный вариабельный домен, обладающий специфичностью связывания к антигену, не являющемуся CD28. В одном из вариантов осуществления изобретения антиген представляет собой антиген антигенпредставляющей клетки или поверхностных антиген Т-лимфоцитов. В одном из вариантов осуществления изобретения антиген представляет собой цитокин. Изобретение также относится к фармацевтической композиция для лечения и/или предотвращения иммунного заболевания, содержащей терапевтически эффективное количество антитела по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммунодепрессант и (или) иммуномодулятор и (или) противовоспалительный агент. Краткое описание чертежей Фиг. 1, включающая фиг. 1 А и 1 В, отображает серию изображений, иллюстрирующих тот факт, что доменные антитела к CD28, указанные в данном описании, не обладают активностью агонистов. Фиг. 1 иллюстрирует тот факт, что повышение концентраций различных дАт не активирует CD28, в то время как контрольное антитело к CD3 (ОКТ 3), добавленние к МКПК, вызывает активацию CD28. Доменные антитела (дАт) и антитело добавляли на плашку с 96 лунками, заполненными МКПК, выделенные из цельной крови здоровых доноров. Фиг. 1 В иллюстрирует тот факт, что дАт, антитело к CD28 (9.3), антитело к CD3 (ОКТ 3) или контрольный изотипа, фиксированный на планшете с 96 лунками с круглым донышком, не проявляли активность агонистов в ПКМК, добавленных в лунки. Фиг. 2 графически иллюстрирует тот факт, что доменные антитела к человеческому CD28 не проявляют активности агониста при добавлении на планшет с 96 лунками с плоским донышком, заполненными антителом к CD3 (G19-4, 10 мкг/мл в ФСБ). Каждое дАт добавляли в лунку в конечной концентрации 30 мкг/мл вместе с очищенными Т-лимфоцитами. В качестве положительного контроля вместо дАт добавляли антитело к CD28 (мАт 9.3) в конечной концентрации 1 мкг/мл. Фиг. 3 - это кривая, отображающая торможение in vivo пролиферации Т-лимфоцитов доменным антителом, описанном в данном описании. Фиг. 4, включающая фиг. 4 А и 4 В - это серия изображений, отображающих результаты 9-суточного исследования занятости рецепторов с использованием дАт 1m-74-15-40L. Фиг. 4 А иллюстрирует занятость рецепторов после интраперитонеального введения этого дАт. Фиг. 4 В иллюстрирует занятость рецепторов после подкожного введения этого дАт. Фиг. 5 иллюстрирует концентрацию разветвленного дАт 1h-99-2P40 и линейного дАт 1h-99-2P40 в плазме против времени в исследовании у обезьян циномолгус. Фиг. 6 иллюстрирует твердофазный ИФА со связыванием химеры рекомбинантного человеческогоCD28/Fc и контрольного Fc на плашках с клонами доменных антител, полученных с помощью моноклонального фагового отображения.-5 024585 Фиг. 7 иллюстрирует твердофазный ИФА растворимых моноклональных доменных антител, связывание на планшете с химерой рекомбинантного человеческого CD28/Fc и контрольным Fc. Фиг. 8 иллюстрирует следы связывания клонов дАт с чипом СМ 5, покрытым 12500 единиц CD28Fc, с использованием аппарата BIAcore. Фиг. 9 А и Фиг. 9 В иллюстрируют способность клонов доменных антител тормозить активностьCD28 в анализах двух копий in vitro с использованием клеток. В этих анализах человеческие Тлимфопиты, положительные на CD4, стимулируют антителом к CD3 и трансфицированным клетками СНО, экспрессирующими либо CD80, либо CD86. Фиг. 10 иллюстрирует тот факт что доменные антитела к CD28 не обладают активностью агониста. На Фиг. 10 А МКПК обрабатывали доменным антителом 239-891-D70C к CD28 или митогенным антителом 5.11 А 1 к CD28. Пролиферация клеток измеряли по включению 3[Н]-тимидина на 3-й сутки, как показано на фиг. 10 А, и измеряли продукцию ИЛ-2, как показано на фиг. 10 В. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к доменным антителам, являющимся антагонистами активностиCD28. Доменные антитела могут быть связаны с полимерами для улучшения фармакокинетических свойств, таких как стабильность и период полужизни. В объем настоящего изобретения входят композиции и методики присоединения полимерных молекул (например, полиэтиленгликоля; ПЭГ) к белкам с целью изменения фармакокинетических свойства модифицированных белков. Например, как показано,модификация белков с помощью ПЭГ изменяет их период полужизни в крови in vivo, антигенность, растворимость и устойчивость к протеолизу (Abuchowski et al. (1977) J. Biol. Chem., 252: 3578; Nucci et al.T. ed.); и Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY). 1. Определения и сокращения. 1.1. Определения. В соответствии с подробным описанием применяются следующие сокращения и определения. Следует отметить, что согласно употреблению в данном описании формы существительных в единственном числе включают соответствующее множественное число, если из контекста четко не следует обратное. Так, например, ссылка на "антитело" включает множественную форму таких антител, а ссылка на "дозу" включает ссылку на одну или несколько доз и их эквиваленты из известных в данной области техники, и так далее. Если не указано иное, все технические и научные термины, использующиеся в данном описании,имеют то же самое значение, что и общеупотребительное значение среди специалистов в данной области техники. Если не указано иное, все диапазоны, указанного в данном описании, включают указанные разграничивающие значения. Ниже приведены следующие термины. Согласно употреблению в данном описании термин "человеческий" в отношении доменного антитела или вариабельного домена иммуноглобулина означает, что этот полипептид имеет последовательность - производное человеческого иммуноглобулина. Последовательность является "производным" последовательности, кодирующей человеческий иммуноглобулин, когда эта последовательность соответствует любому из нижеследующих условий: а) она выделена у человека или из клеток или клеточных линий человека; б) она выделена из библиотеки клонированных последовательностей генов человеческих антител (или библиотеки последовательностей домена V человеческих антител); или в) когда клонированная последовательность гена человеческого антитела (или клонированная последовательность человеческого района V) (включая, например, участок гена V антител эмбрионального типа) использована для создания одной или более диверсифицированных последовательностей, которые затем подвергнуты отбору по связыванию с желаемым антигеном-мишенью. По меньшей мере, человеческое доменное антитело по меньшей мере на 70% идентично, по меньшей мере на 75% идентично, по меньшей мере на 80% идентично, по меньшей мере на 85% идентично по аминокислотной последовательности (включая, например, идентичность на 87, 90, 93, 95, 97, 99% или более) последовательности вариабельного домена человеческого иммуноглобулина естественного происхождения, например, последовательности вариабельного домена человеческого иммуноглобулина естественного происхождения, описанной Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991). Согласно употреблению в данном описании "домен" означает структуру свернутого белка, сохраняющую свою третичную структуру вне зависимости от остальной части белка. Как правило, домены отвечают за различные функциональные свойства белков и во многих случаях могут добавляться, отделяться или переноситься на другие белки без утраты функции остальной части белка и (или) этого домена."Доменное антитело" означает домен свернутого полипептида, который включает последовательность, типичную для вариабельных доменов иммуноглобулинов, и который специфически связывается с антигеном (например, с константой диссоциации 500 нмоль или менее). Таким образом, "доменное антитело" включает полные вариабельные домены антител, а также модифицированные вариабельные доме-6 024585 ны, например, в которых одна или несколько петель замещены последовательностями, не являющихся типичными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или включают N- или С-концевые вставки, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют константу диссоциации 500 нмоль или менее (например, 450 нмоль или менее, 400 нмоль или менее, 350 нмоль или менее, 300 нмоль или менее, 250 нмоль или менее, 200 нмоль или менее, 150 нмоль или менее, 100 нмоль или менее) и специфичность полноразмерного домена в отношении антигена-мишени. При необходимости или в случае каких-либо сомнений условия и границы нумерации, описанные Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.), применимы к вариабельным и постоянным доменам иммуноглобулинов,на которые ссылается данный документ."дАт" употребляется в данном описании взаимозаменяемо с "доменным антителом". Согласно употреблению в данном описании "доменное антитело" означает полипептид иммуноглобулина млекопитающих, включая человека, но также оно включает VHH дАт грызунов (например, согласно описанию в WO 00/29004, включенного в данный документ во всей полноте путем ссылки) или верблюдовых. дАт верблюдовых представляют собой полипептиды одиночного вариабельного домена антител, являющиеся производными биологических видов, включая верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, и содержащие антитела из тяжелых цепей, от природы лишенных легких цепей. VHH. МолекулыVHH примерно в 10 раз менее молекул IgG и, будучи одиночными полипептидами, они очень стабильны к крайним значениям рН и температуры. Антитела верблюдовых описаны, например, в патентах США 5759808; 5800988; 5840526; 5874541; 6005079; и 6015695, содержимое каждого из которых включено в данный документ во всей полноте путем ссылки. Гуманизированные полипептиды VHH верблюдовых описаны, например, в WO04/041862,описание идей которого включено в данный документ путем ссылки. Специалисту в данной области техники будет понятно, что полипептиды одиночного вариабельного домена антител верблюдовых можно модифицировать согласно описанию в WO04/041862 (например, замена аминокислот в положениях 45 и 103) с получением гуманизированных полипептидов VHH верблюдовых. Также в объем настоящего изобретения включены полипептиды одиночного вариабельного домена антител, который представляет собой VHH усатой акулы. дАт VHH усатой акулы описаны, например, Greenberg et al. (1995) Nature 374: 168173, и в публикации США 20050043519. Согласно употреблению в данном описании фраза "последовательность, типичная для вариабельных доменов иммуноглобулинов" означает аминокислотную последовательность, которая идентична по больше чем 20, больше чем 25, больше чем 30, больше чем 35, больше чем 40, больше чем 45 или даже больше чем 50 аминокислотам, идущим подряд, последовательности, содержащей последовательность вариабельного домена иммуноглобулинов. Последовательности, схожие или идентичные (например, по меньшей мере на 70%) последовательностям, приведенным в данном описании, также включены в объем настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей на аминокислотном уровне может составлять около 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. На уровне нуклеиновой кислоты идентичность последовательностей может составлять около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. Или же существенная идентичность последовательностей будет существовать, когда участки нуклеиновой кислоты гибридизуются в условиях селективной гибридизации(например, при очень жестких условиях гибридизации) с комплементарным участком цепочки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, клеточном лизате или в частично очищенной или в достаточно чистой форме. Согласно употреблению в данном описании термин "идентичность" означает степень, с которой нуклеотидные или аминокислотные последовательности структурно схожи друг с другом. Согласно употреблению в данном описании "сходство" последовательностей является мерой степени, с которой аминокислотные последовательности обладают одинаковыми аминокислотными остатками в соответствующих положениях при выравнивании последовательностей. Аминокислоты схожи друг с другом, когда схожи их боковые цепи. В частности, "сходство" включает аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга. "Консервативная" замена - это любая замена, которая имеет положительное число в матрице замен blosum62 (Hentikoff and Hentikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Set. USA 89: 1091510919). Утверждение, что "последовательность А на n% схожа с последовательностью В" означает, чтоn% положений при оптимальном общем выравнивании последовательностей А и В состоят из одинаковых аминокислот или консервативных замен. Согласно употреблению в данном описании, две последовательности "схожи" друг с другом или имеют "процент идентичности", когда они выровнены с помощью алгоритма Needleman-Wunsch или алгоритма BLAST 2 sequences, описанного Tatusova и Madden(1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250. Когда аминокислотные последовательности выровнены с использованием алгоритма BLAST 2 sequences, стандартной матрицей является матрица Blosum 62. Оптимальные глобальные выравнивания можно выполнять с использованием следующих параметров в алгоритме выравнивания Needleman-Wunsch.-7 024585 Для полипептидов: Матрица замен: blosum62. Функция подсчета штрафа за пропуск в последовательности: -A -BLG, где А=11 (штраф за пропуск в последовательности), В=1 (штраф за длину пропуска в последовательности) и LG - длина пропуска в последовательности. Для нуклеотидных последовательностей: Матрица замен: 10 для совпадений, 0 для несовпадений. Функция подсчета штрафа за пропуск в последовательности: -A -BLG, где А=50 (штраф за пропуск в последовательности), В=3 (штраф за длину пропуска в последовательности) и LG - длина пропуска в последовательности. С использованием программы AlignX, компонента программного пакета Vector NTI Suite 8.0 (InforMax, Inc.), выполнено выравнивание с помощью алгоритма Clustal W (1994) Nucleic Acid Research, 22(22): 4673-4680. При использовании этой методики рассчитано примерно сходство между всеми парами последовательностей, называемое "попарным выравниванием". Затем полученные значения использованы для расчета "путеводного дерева", или дендрограммы, по которой выбирают порядок на стадии множественного выравнивания, в котором нужно выравнивать последовательности при окончательном множественном выравнивании. После расчета дендрограммы последовательности выравнивают все большими и большими группами до тех пор, пока в окончательное выравнивание не будут включены все последовательности целиком. Или же расчеты идентичности аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проведены в рамках настоящего изобретения с помощью программы AlignX со следующими параметрами: Установлены следующие настройки AlignX для множественного выравнивания: Типичные консервативные замены - это обмен между Met, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между остатками Asp, Glu и Asn; между остатками Gln, Lys и Arg; или ароматическими остатками Phe и Tyr. Согласно употреблению в данном описании термин "эпитоп" означает единицу структуры, обычно связываемую парой VH-VL иммуноглобулина. Эпитопы определяют сайт минимального связывания антитела, и, таким образом, представляют собой мишень, определяющую специфичность антитела. В слу-8 024585 чае доменного антитела эпитоп представляет собой единицу структуры, связываемую отдельным доменным антителом. То есть, сайт связывания обеспечивается одним-единственным вариабельным доменом иммуноглобулина. Эпитопы могут быть линейными или конформационными и могут быть настолько малыми, что состоят не более чем из трех аминокислот. Согласно употреблению в данном описании термин "пролонгированное действие" или эквивалентные термины "контролируемое действие" или "постепенное действие" означает фармацевтические формы, которые высвобождают активное вещество, такое как полипептидное лекарственное вещество, за какой-либо период времени после введения пациенту. Пролонгированное действие полипептидных лекарственных веществ, которое происходит на протяжении желаемых периодов времени, например, минут, часов, суток, недель или дольше, в зависимости от фармацевтической формы данного лекарственного вещества, отличаются от стандартных фармацевтических форм, в которых практически вся разовая доза всасывается сразу или сразу распределяется через кровоток. Фармацевтические формы пролонгированного действия могут обеспечивать концентрацию циркулирующего активного вещества после однократного применения, сохраняющуюся на протяжении, например, 8 ч или дольше, 12 ч или дольше, 24 ч или дольше, 36 ч или дольше, 48 ч или дольше, 60 ч или дольше, 72 ч или дольше, 84 ч или дольше, 96 ч или дольше или даже, например, на протяжении 1 недели или 2 недель или дольше, например на протяжении 1 месяца или дольше. Согласно употреблению в данном описании "активность CD28" - это активность, обусловленная или возникающая в результате связывания CD80, СВ 86 и (или) другого лиганда с CD28, и она включает,но не ограничивается перечисленным, активацию передачи клеточного сигнала, опосредованную CD28. Активность CD28 также включает индукцию пролиферации Т-лимфоцитов и индукцию секреции цитокинов, например, интерлейкина 2, (ИЛ-2) Т-лимфоцитами. Согласно употреблению в данном описании термин "не вызывает достаточного агонизма" означает,что данный агент, например, доменное антитело, не вызывает существенной активации одного или нескольких видов активности CD28 в соответствии со значением термина "активация" в данном описании. В частности, агент, который "не вызывает достаточного агонизма" означает, что это агент не активирует больше чем 20% видов активности, которые активируют CD80 и (или) CD86, связывающиеся с CD28, и В одном из аспектов изобретения это агент не активирует больше чем примерно 10, 8, 5, 3 или 2% или менее, включая нулевую активацию, видов активности, которые актируют CD80 и (или) CD86, связывающиеся с CD28. Пример, не налагающий ограничений - это доменное антитело, описанное в данном описании, которое не проявляет достаточного агонизма в отношении активности CD28, не вызывает агонизма активности CD28 больше чем на 5% от активности, возникающей благодаря агонизму активностиCD28, обусловленной связыванием антителом 9.3 к CD28 (Gibson et al. (1996) JBC, 271: 7079-7083) при одинаковых условиях проведения анализа. Согласно употреблению в данном описании термины "тормозят", "тормозит" или "тормозил" означает снижение определенной измеримой активности (например, активности связывания), по меньшей мере, на 10% по сравнению со стандартом. Если требуется торможение, такое торможение составляет, по меньшей мере, примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более, вплоть до и включая 100%, т.е. полное торможение или отсутствие данной активности. Торможение связывания CD28 с CD80 или CD86 можно измерить, как описано в рабочих примерах в данном описании. Согласно употреблению в данном описании термины "существенно тормозит" означает снижение определенной измеримой активности (например, связывания CD28 с CD80 или CD86) по меньшей мере на 50% по сравнению со стандартом. Например, "существенно тормозит" означает снижение данной измеримой активности по меньшей мере на 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% и вплоть до и включая 100% по сравнению со стандартом. Согласно употреблению в данном описании "тормозит связывание" в отношении связывания доменного антитела сCD28, или связывания CD80 с CD28, или связывания CD86 с CD28 означает уменьшение связывания, по меньшей мере, на 10% по сравнению со стандартом. "Тормозит связывание" означает уменьшение связывания, по меньшей мере, примерно на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более вплоть до и включая 100%. Согласно употреблению в данном описании термины "активируют" "активирует" или "активировал" означает увеличение данной измеримой активности по меньшей мере на 5% по сравнению со стандартом, например по меньшей мере на 10, 25, 50, 75 и даже 100% или более. Согласно употреблению в данном описании термин "антагонист CD28" означает агент, который тормозит, по меньшей мере, один вид активности, опосредованной CD28, за счет торможения связывания CD80 и (или) CD86 с CD28. Активности CD28 "существует противодействие", если эта активность снижена, по меньшей мере, на 10 % и в типичном варианте, по меньшей мере, на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 95, 97 и даже 100% (т.е. активность отсутствует) в присутствии антагониста по сравнению с его отсутствием. В типичном варианте антагонист CD28 как термин, употребляющийся в данном описании,включает доменное антитело, которое одновалентно связывается с CD28. В примере, не налагающем ограничений, антагонист CD28, как определено в данном описании, представляет собой агент, который тормозит часть или всю активность CD28, и в то же время этот агент существенно не противодействует активности CD28 в сочетании с передачей сигнала рецептором Т-лимфоцитов.-9 024585 Согласно употреблению в данном описании термин "предпочтительно тормозит", как это используется в такой фразе, как "где доменное антитело предпочтительно тормозит связывание CD28 с CD86 по сравнению со связыванием CD28 с CD80" означает, что доменное антитело вызывает более выраженное торможение связывания CD86 с CD28, как определено выше, по сравнению со степенью торможения связывания CD80 с CD28, как определено выше. Согласно употреблению в данном описании термин "агонист CD28" означает агент, который активирует по меньшей мере один вид активности, опосредованной CD28, либо отдельно либо в сочетании с другими костимулами, по сравнению со стандартом. "Агонизм" активности имеется, когда активность увеличивается по меньшей мере на 10%, например на 50%, в присутствии агониста по сравнению с его отсутствием. Согласно употреблению в данном описании торможение "активности CTLA4" включает, но не ограничивается перечисленным, торможение функции Т-лимфоцитов. Такие функции включают, среди прочих, передачу сигнала, опосредованную рецептором Т-лимфоцитов, пролиферацию Т-лимфоцитов и индукцию секреции цитокинов. Согласно употреблению в данном описании "иммунологическое заболевание" означает любое заболевание, которое связано с развитием иммунного ответа у пациента, включая клеточный и (или) гуморальный иммунный ответ. Примеры иммунологических заболеваний включают, но не ограничиваются перечисленным, воспаление, аллергию, аутоиммунные заболевания и нарушения, обусловленные трансплантатом. Согласно употреблению в данном описании "аутоиммунное заболевание" означает заболевания и состояния, при которых иммунный ответ у пациента направлен против собственных компонентов пациента, что ведет к нежелательному и часто инвалидизирующему состоянию. Согласно употреблению в данном описании "аутоиммунное заболевание" дополнительно включает аутоиммунные состояния, синдромы и им подобные. Аутоиммунное заболевание включает, но не ограничиваются перечисленным, болезнь Аддисона,аллергию, аллергический ринит, анкилозирующий спондилит, бронхиальную астму, атеросклероз, аутоиммунные болезни уха, аутоиммунные болезни глаз, аутоммунный атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный паротит, аутоиммунный увеит,целиакию, первичный билиарный цирроз, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, ХОБЛ, колит,ишемическую болезнь сердца, болезнь Крона, сахарный диабет (I типа), депрессию, сахарный диабет,включая I и (или) II тип, эпидидимит, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, тиреотоксикоз, синдром Гийенна-Барре, тиреоидит Хашимото, гемолитическую анемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, воспалительные заболевания кишечника, иммунный ответ на рекомбинантные биологические средства, например, фактор VII при гемофилии, ювенильный идиопатический артрит, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, мужское бесплодие, смешанные болезни соединительной ткани, рассеянный склероз, тяжелую миастению, опухоли, остеоартрит, боль, первичную микседему, пемфигус, пернициозную анемию, полимиозит, псориаз, псориатический артрит, реактивный артрит, ревматизм, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, спондилоартропатии, симпатическую офтальмию, Т-клеточную лимфому, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому яичек, тиреоидит, отторжение трансплантата, неспецифический язвенный колит, аутоиммунный увеит и васкулит. Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваются перечисленным, состояния, при которых пораженная ткань является первичной мишенью и, в некоторых случаях, вторичной мишенью. Такие состояния включают, но не ограничиваются перечисленным,СПИД, атопическую аллергию, бронхиальную астму, экзему, лепру, шизофрению, наследственную депрессию, трансплантацию органов и тканей, синдром хронической усталости, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инфаркт миокарда, инсульт, аутизм, эпилепсию, феномен Артюса, анафилаксию и алкоголизм и наркоманию. Согласно употреблению в данном описании термин "полипептид антитела" означает полипептид,который представляет собой само антитело, либо часть антитела, модифицированного или немодифицированного, сохраняющее способность специфически связывать антиген. Таким образом, термин "полипептид антитела" включает антигенсвязывающую тяжелую цепь, легкую цепь, димер тяжелой и легкой цепей, FAb-фрагмент, P(ab')2-фрагмент дАт или Fv-фрагмент, включая одноцепочечный Fv (scFv). Фраза"полипептид антитела" подразумевает рекомбинантные гибридные полипептиды, которые содержат последовательность полипептида антитела, сохраняющую способность специфически связывать антиген,находясь в составе гибрида. Согласно употреблению в данном описании термин "одновалентный" означает, что данное доменное антитело может связывать только одну молекулу мишени. Антитела естественного происхождения,как правило, двухвалентны, то есть они имеют две функциональные антигенсвязывающие петли, каждая из которых содержит домен VH и VL. Когда стерическое торможение не значимо, двухвалентное антитело может связывать две отдельные молекулы одного и того же антигена. "Одновалентное" антитело отличается тем, что способно связывать только одну молекулу такого антигена. Согласно употреблению в данном описании термин "одновалентное" антитело также может содержать один или несколько антигенсвя- 10024585 зывающих сайтов, например, два антигенсвязывающих сайта, но антигенсвязывающие сайты должны относиться к разным антигенам так, чтобы антитело могло связывать за один раз только одну молекулуCD28. Антигенсвязывающий домен одновалентного антитела может содержать домен VH и VL, но В одном из аспектов изобретения содержит только один вариабельный домен иммуноглобулина, например,домен VH или VL, который обладает способностью связывать CD28 без необходимости в присутствии домена VL или VH соответственно. Одновалентное антитело не обладает способностью перекрестно связывать молекулы одного антигена. Согласно употреблению в данном описании термин "стандартный анализ агрегации тромбоцитов" означает анализ, описанный в нижеследующем разделе под заголовком "Анализ агрегации тромбоцитов". Согласно употреблению в данном описании "домен VH" и "домен VL" означают вариабельные участки иммуноглобулина, как определено в Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.), включенного в данный документ путем ссылки. Согласно употреблению в данном описании "присоединенный" означает присоединение полимерной группы, такой как ПЭГ, к аминокислотному остатку доменного антитела. Присоединение ПЭГполимера к аминокислотному остатку доменного антитела, например, доменного антитела, именуется в данном описании как "пегилирование", и его можно выполнить с использованием присоединения нескольких ПЭГ-групп, включая, но не ограничиваясь перечисленным, активный эфир Nгидроксилсукцинимида (NHS), сукцинимидилпропионат (SPA), малеимид (MAL), винилсульфон (VS) или тиол. ПЭГ-полимер или другой полимер можно присоединить к доменному антителу либо в заранее выбранном положении, либо в случайном положении молекулы доменного антитела. ПЭГ-полимер может быть присоединен к доменному антителу в заранее выбранном положении. ПЭГ-полимер может быть присоединен к любому остатку в доменном антителе, однако предпочтительно, чтобы это полимер был присоединен к лизину или цистеину, который встречается в естественных условиях в доменном антителе или встроен в доменное антитело генноинженерными методами, например, путем замены остатка естественного происхождения в доменном антителе на цистеин или лизин. Присоединение ПЭГ также можно осуществить с помощью пептидного линкера, присоединенного к доменному антителу. То есть,ПЭГ-группу можно присоединить к пептидному линкеру, связанному с доменным антителом, где линкер содержит сайт, например, не содержащий цистеин или лизин, для присоединения ПЭГ. Согласно употреблению в данном описании "присоединенный" также означает связь двух или более доменных антител,например мономеров дАт, с образованием димера, тримера, тетрамера или других мультимеров. Мономеры доменного антитела могут быть соединены с образованием мультимера несколькими методами,известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленным, экспрессию мономеров доменного антитела в виде гибридного белка, связывание двух или более мономеров через пептидный линкер между мономерами, или путем химического связывания мономеров после трансляции либо напрямую, либо через линкер с помощью дисульфидных связей, или путем связывания к двух-,трех- или мультивалентной связывающей группе (например, многоцепочечный ПЭГ). В то время как мультимеры дАт специально включены в объем настоящего изобретения, например, в контексте конструктов доменных антител с двойной или множественной специфичностью, следует подчеркнуть, что в отношении какого-либо конструкта данного доменного антитела конструкт должен обладать способностью связывать только одну молекулу CD28, например, конструкт должен иметь только один элемент,связывающий CD28, и не должен перекрестно реагировать с CD28. Согласно употреблению в данном описании "полимер" означает макромолекулу, состоящую из повторяющихся мономерных единиц, и может означать синтетический или природный полимер, такой как линейный или разветвленный, возможно, замещенный, полимер из полиалкилена, полиалкенилена или полиоксиалкилена, или разветвленный или неразветвленный полисахарид. Согласно употреблению в данном описании "полимер" в частности означает на выбор замещенный или разветвленный полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или поливиниловый спирт или их производные. Согласно употреблению в данном описании "ПЭГ" или "ПЭГ-полимер" означает полиэтиленгликоль, и, в частности, может означать производную форму ПЭГ, включая, но не ограничиваясь перечисленным, активные эфиры N-гидроксилсукцинимида (NHS) ПЭГ, такие как сукцинимидилпропионат, активные эфиры бензотриазола, ПЭГ-производное с малеимидом, винилсульфоновые или тиоловые группы. Например, ПЭГ-производные могут включать ПЭГ-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; ПЭГ-О-СН 2-NHS; ПЭГО-CH2CH2-CO2-NHS; ПЭГ-S-CH2CH2-CO-NHS; ПЭГ-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; ПЭГ-NHCO-CH2CH2-CONHS; и ПЭГ-O-CH2-CO2-NHS; где R-(СН 2)4)NHCO2(m-ПЭГ). ПЭГ-полимеры, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть линейными молекулами, или могут быть разветвленными, где несколько ПЭГ-групп присутствуют в виде одного полимера. Некоторые типичные ПЭГ-конформации включают,но не ограничиваются перечисленным, следующее: Согласно употреблению в данном описании "сульфгидрил-селективный реагент" - это реагент, который используется при присоединении ПЭГ-полимера к аминокислоте, содержащей тиол. Тиоловые группы на аминокислотном остатке цистеина особенно полезны при взаимодействии с сульфгидрилселективным реагентом. Сульфгидрил-селективные реагенты, использующиеся для такого присоединения, включают, но не ограничиваются перечисленным, малеимид, винилсульфон и тиол. Использование сульфгидрил-селективных реагентов при присоединении к остаткам цистеина известно в данной области техники и может быть адаптировано в зависимости от конкретных потребностей (см., например, Zalipskyal. (1994) Macromol. Chem. Phys. 195: 203). Присоединение ПЭГ или другого агента, например, ЧСА, к доменному антителу, как описано в типичном примере в данном описании, не должно нарушать способность полипептида специфически связывать CD28. То есть, доменное антитело с присоединенным ПЭГ будет сохранять свою связывающую способность по сравнению с таким же антителом, но без присоединенного ПЭГ. Согласно употреблению в данном описании "сохраняет активность" означает уровень активности доменного антитела с присоединенным ПЭГ, который составляет, по меньшей мере, 10% от уровня активность доменного антитела без присоединенного ПЭГ, включая, по меньшей мере, примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и до 90%, включая вплоть до примерно 95%, 98% и вплоть до 100% от активности доменного антитела без присоединенного ПЭГ, содержащего тот же самый антигенсвязывающий домен или домены. В частности, активность доменного антитела с присоединенным ПЭГ по сравнению с доменным антителом без присоединенного ПЭГ следует определить на молярной основе полипептида антитела; то есть, в каждой попытке следует использовать одинаковое число молей ПЭГ-связанного и не связанного с ПЭГ доменного антитела. При определении, "сохраняет ли активность" конкретное доменное антитело с присоединенным ПЭГ, активность доменного антитела с присоединенным ПЭГ следует сравнить с активностью такого же доменного антитела в отсутствие ПЭГ. Согласно употреблению в данном описании термин "период полужизни in vivo" означает время, за которое сывороточная концентрация какого-либо лиганда (например, доменного антитела) снижается invivo примерно на 50%, например, вследствие разрушения лиганда и (или) выведения или секвестрации лиганда с участием естественных механизмов. Доменные антитела, описанные в данном описании, могут быть стабилизированы in vivo, и период их полужизни может быть увеличен путем связывания с молекулами, такими как ПЭГ, устойчивыми к разрушению и (или) выведению или секвестрации. Период полужизни доменного антитела увеличивается, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение более длительного времени, чем у схожего полипептида антитела, не связанного с ПЭГ- 12024585 полимером. Как правило, период полужизни пегилированного доменного антитела увеличивается, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50% или более по сравнению с непегилированным доменным антителом. Возможно увеличение периода полужизни в диапазоне 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз,40 раз, 50 раз или более. Иначе, или в дополнение, возможно увеличение периода полужизни в диапазоне 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз, 100 раз или 150 раз. Как предусмотрено в рамках настоящего изобретения, доменное антитело с присоединенным ПЭГ имеет период полужизни между 0,25 и 170 ч, включая между 1 и 100 ч, включая дополнительно между 30 и 100 ч, и еще включая между 50 и 100 ч, и вплоть до 170, 180, 190 и 200 ч или дольше. Согласно употреблению в данном описании "устойчивый к разрушению" в отношении ПЭГ или других мономеров или мультимеров доменных антител с присоединенным ПЭГ означает, что мономер или мультимер доменного антитела, связанного с ПЭГ или другим полимером, разрушается на не больше чем 10% после обработки пепсином при рН 2,0 в течение 30 мин и В одном из аспектов изобретения,совсем не разрушается. Согласно употреблению в данном описании "гидродинамический размер" означает кажущийся размер молекулы (например, белковой молекулы), определенный по диффузии молекулы в водном растворе. Диффузию, или перемещение, белка в растворе можно провести для определения кажущегося размера белка, где размер представляет собой "радиус Стокса" или "гидродинамический радиус" белковой частицы. "Гидродинамический размер" белка зависит от массы и формы (конформации) так, что два белка,имеющие одинаковую молекулярную массу, могут иметь различные гидродинамические размеры из-за разной общей конформации белка. Гидродинамический размер измеряют, например, с помощью эксклюзионной хроматографии. Гидродинамический размер полипептида пегилированного антитела, например,доменного антитела, может находиться в диапазоне примерно от 24 до 500 кД; от 30 до 500 кД; от 40 до 500 кД; от 50 до 500 кД; от 100 до 500 кД; от 150 до 500 кД; от 200 до 500 кД; от 250 до 500 кД; от 300 до 500 кД; от 350 до 500 кД; от 400 до 500 кД; и от 450 до 500 кД. В одном из аспектов изобретения гидродинамический размер пегилированного доменного антитела составляет от 30 до 40 кД; от 70 до 80 кД; или от 200 до 300 кД. Когда доменное антитело предназначено для применения в визуализации, это доменное антитело должен иметь гидродинамический размер между примерно 50 и 100 кД. Или если доменное антитело предназначено для терапевтических вмешательств, это доменное антитело должно иметь гидродинамический размер больше примерно 200 кД. Согласно употреблению в данном описании термин "IC50" означает концентрацию ингибитора, необходимую для торможения данной активности примерно на 50%. IC50 определяют путем измерения данной активности, например, связывания CD28 с CD80 или CD86, в присутствии различных количеств ингибитора (например, доменного антитела) и построения кривой концентрации ингибитора против измеряемой активности. Связывание CD28 с CD80 или CD86 измерено в рамках настоящего изобретения с помощью методики, описанной в рабочих примерах. Или можно применять метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Согласно употреблению в данном описании термин "ЕС 50" означает концентрацию соединения или доменного антитела, которая вызывает у пациента ответ, находящийся посередине между исходным уровнем и максимальным ответом. Исходный уровень и максимальный ответ у пациента на соединение или доменное антитело можно определить с помощью любой методики, известной в данной области техники. Согласно употреблению в данном описании термин "слитый с доменным антителом", как правило,означает, что полипептид слит с данным антителом с помощью методик рекомбинации ДНК, хотя слияние может происходить химически на уровне белка. Таким образом, антитело, "слитое с" другим полипептидом, например, другим антителом с другой специфичностью связывания, не существует в природе и получается с помощью рекомбинантных методик.Термин "слитый с доменным антителом" также подразумевает связь полипептида с данным доменным антителом путем, например, дисульфидных или других химических связей, где слитый (гибридный) полипептид в природе с доменным антителом не сливается. Рекомбинантные и химические методики слияния полипептида с другим полипептидом, например,антителом, известны в данной области техники. Согласно употреблению в данном описании термин "Fc-домен" означает постоянный участок последовательности антитела, содержащий постоянные домены СН 2 и СН 3, как описано Kabat et al., см. выше. Fc-участок полипептида тяжелой цепи обладает способностью к самосборке - функции, которая способствует образованию двухвалентных антител. Термин "не содержит Fc-домен" означает, что данный домен не содержит, по меньшей мере, часть Fc-домена иммуноглобулина (домены как таковые определены согласно Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.), достаточную для участия в димеризации Fc-содержащих доменных антител. Димеризацию Fc-содержащих доменных антител измеряют, например, хроматографическими методами или с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Доменное антитело, не содержащее Fcдомен, не осуществляет взаимодействия между Fc и тромбоцитами и, следовательно, не вызывает агрегацию тромбоцитов. Согласно употреблению в данном описании "лечить", "снижать", "предупреждать" или "облегчать"- 13024585 в отношении симптомов заболевания означают уменьшение симптома по меньшей мере на 10%, что определено по клинически измеримому показателю, или, по меньшей мере, на один пункт по клинически принятой шкале тяжести заболеваний или симптомов. Согласно употреблению в данном описании термин "симптом(ы) системной красной волчанки" означает любые клинически значимые симптомы СКВ,известные в данной области техники. Не налагающие ограничений примеры включают накопление аутоантител IgG (например, к ядерным антигенам, таким как хроматин, snRNPs (особенно U1, Sm, Ro/SSA иLa/SSB), фосфолипиды или молекулы клеточной поверхности), гемолитическую анемию, тромбоцитопению, лейкопению, гломерулонефрит, васкулит, артрит и серозит. Уменьшение симптома - это уменьшение, по меньшей мере, на 10% клинически измеримого показателя или по меньшей мере на один пункт по клинически принятой шкале тяжести заболевания. Согласно употреблению в данном описании фраза "специфически связывается" означает связывание антигена доменным антителом с константой диссоциации (Kd) 1 мкмоль или менее согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием, например, системы для поверхностного плазмонного резонанса BIAcore и программы оценки кинетики BIAcore (например, версия 2.1). Аффинность или IQ специфического связывания В одном из аспектов изобретения составляет примерно 500 нмоль или менее и в другом аспекте - примерно 300 нмоль или менее. Согласно употреблению в данном описании "типовой лиганд" - это лиганд, который связывается с большой частью функционально активных членов в данном репертуаре, например, в библиотеке фагового отображения. Таким образом, один и тот же типовой лиганд может связываться со многими членами репертуара вне зависимости от специфичности лигандов-мишеней. Как правило, присутствие сайта связывания функционального типового лиганда указывает, что член репертуара получен и правильно свернут. Таким образом, связывание типового лиганда с сайтом его связывания представляет собой методику предварительного отбора функционально активных полипептидов из репертуара полипептидов. Типовые лиганды включают, например, белок А, белок G и белок L. Согласно употреблению в данном описании термин "универсальный каркасный участок" означает каркасную последовательность одного антитела, соответствующую участкам антитела, сохраненным в последовательности согласно определению Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest,5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.), или соответствующую репертуару или структуре человеческих иммуноглобулинов эмбрионального типа согласно определению Chothia и Lesk,(1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. Включено использование одного каркасного участка или набора таких каркасных участков, которые, как установлено, обеспечивают появление практически любой специфичности связывания только за счет диверсификации гипервариабельных участков. Термин "примерно" будет понятен специалистам в данной области техники и будет в некоторой степени меняться в зависимости от контекста, в котором он употреблен. Как правило, "примерно" включает диапазон значений, которые составляют плюс-минус 10% от стандартного значения. Термин "соответствует" согласно употреблению в данном описании в отношении последовательностей белков или нуклеиновых кислот и (или) доменов означает аналогичную последовательность или структуру в отдельном белке. Например, кальцийсвязывающий домен мышиного миозина "соответствует" кальцийсвязывающему домену человеческого миозина. 1.2. Сокращения. Ниже приводится список терминов и соответствующих сокращений, использующихся в данном описании; он относится к стандартным терминам, если не указано иное с помощью специальных терминов и сокращений.- 15024585 В объем настоящего изобретения входят доменные антитела, одновалентные в отношении связывания CD28. Без намерения ограничиваться какой-либо из существующих теорий предполагается, что одновалентность связывания CD28 устраняет возможность перекрестного связывания с рецепторами клеточной поверхности, которое наблюдается с антителами, известными из предыдущего уровня техники. Таким образом, В одном из аспектов изобретения доменные антитела, описанные в данном описании, не только тормозят или являются антагонистами связывания CD80 или CD86 с CD28, но они не обладают существенным агонизмом в отношении активности CD28. В одном из аспектов изобретения антитела, одновалентные при связывании CD28, являются человеческими доменными антителами. Человеческие доменные антитела можно вводить больным людям, в основном избегая иммунного ответа против антител, который часто возникает при введении антител других биологических видов, например, мыши. В то время как мышиные антитела можно "гуманизировать" путем встраивания постоянных доменов в мышиные антигенсвязывающие домены, человеческие антитела, как описано в данном описании, получают без необходимости в трудоемких и занимающих много времени генетических манипуляций с последовательностью мышиного антитела. 2. Одновалентные доменные антитела. Тяжелые и легкие полипептидные цепи антител содержат вариабельные (V) участки, которые прямо участвуют во взаимодействии с антигеном, и постоянные (С) участки, которые обеспечивают структурную поддержку и функцию при антиген-неспецифичных взаимодействиях с иммунологическими эффекторами. Антигенсвязывающий домен традиционного антитела состоит из двух отдельных доменов,вариабельного домена тяжелой цепи (VH) И вариабельного домена легкой цепи (VL, которая может быть либо V либо V). Антигенсвязывающий сайт как таковой образован шестью полипептидыми петлями,тремя из домена VH (H1, H2 и Н 3) и тремя из домена VL (L1, L2 и L3). In vivo разнообразный первичный репертуар генов V, которые кодируют домены VH и VL, получается за счет комбинационной перестройки сегментов гена. С-участки включают С-участки легкой цепи (обозначаемые как CL-участки) и С-участки тяжелой цепи (обозначаемые как CH1-, CH2- и CH3-участки). Антитело естественного происхождения обычно содержит два антигенсвязывающих домена и, следовательно, является двухвалентным. Ряд небольших антигенсвязывающих фрагментов антител естественного происхождения идентифицирован после расщепления протеазами. К ним относятся, например, "Fab-фрагмент" (VL-CL/CH1-VH),"Fab'-фрагмент" (Fab с шарнирной областью тяжелой цепи) и "P(ab')2-фрагмент" (димер Fab'-фрагменты,соединенные шарнирной областью тяжелой цепи). Для получения таких фрагментов и создания даже еще более малых антигенсвязывающих фрагментов, например, именуемых как "одноцепочечный Fv"(вариабельный фрагмент) или "scFv", содержащий VL И VH, соединенные пептидным линкером (VLлинкер-VH), использованы рекомбинантные методики. Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты и scFvфрагменты одновалентны в отношении связывания антигена, так как каждый из них содержит только один антигенсвязывающий домен, включающий один димер VH-VL. Доменное антитело, или "дАт", связывает антиген независимо от других V-доменов, однако доменное антитело может представлять собой гомо- или гетеромультимер с другими доменами VH или VL, в то время как другие домены для связывания антигена дАт не требуются, то есть, дАт связывает антиген независимо от дополнительных доменов VH или VL. Получение доменных антител описано и проиллюстрировано на примере ниже в данном описании. Одиночные вариабельные домены антител, например, VHH, являются самыми малыми известными антигенсвязывающими единицами. Для применения в терапии человеческие антитела имеют особые преимущества, в основном благодаря тому, что они с малой вероятностью вызовут иммунный ответ при введении пациенту. Сравнение VHH верблюдовых с доменами VH человеческих антител выявляет несколько ключевых отличий в каркасных участках домена VHH верблюдовых, соответствующего стыкуVH/VL человеческих доменов VH. Выполнены замены остатков человеческого VH3 на более похожую последовательность VHH (В частности, Gly 44Glu, Leu 45Arg и Trp 47Gly) для получения "камелизированных" человеческих доменов VH, которые сохраняют антигенсвязывающую активность (Davies,Riechmann (1994) FEBS Lett. 339: 285-290), но при повышенной экспрессии и растворимости. (Нумерация аминокислот в вариабельных доменах, использующаяся в данном описании, соответствует системе нумерации Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHumanServices, Washington, D.C В WO 03/035694 (Muyldermans) сообщается, что замена Trp 103Arg повышает растворимость доменов VH, не относящихся к доменам верблюдовых. Davies, Riechmann (1995) Biotechnology N.Y. 13: 475-479, также описывают производство репертуара фагового отображения "камелизированных" человеческих доменов VH и выбор клонов, которые связывают гаптен с аффинностью в диапазоне 100-400 нмоль, но клоны, отобранные для связывания белкового антигена, обладали более слабой аффинностью. Доменные антитела можно получить несколькими разными путями. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелые и легкие цепи антитела, обладающего известной способностью связывать CD28, можно изменить с получением ряда различных доменных антител, являющихся одновалентными при связывании CD28. Таким образом, имея последовательности, которые коди- 16024585 руют полипептиды тяжелых и легких цепей, составляющих антитело, и пользуясь стандартными методиками молекулярного клонирования, можно получить одновалентный антигенсвязывающий полипептидный конструкт, такой как Fab-фрагменты, scFv, дАт или даже биспецифичные антитела (например, антитела, которые содержат две различные антигенсвязывающие группы и поэтому могут связывать два разных антигена и, В одном из аспектов изобретения, одновременно), одновалентные при связывании CD28. 2.1. Общая стратегия и методики конструирования доменных антител. Один из путей получения доменных антител, специфичных к CD28 - это амплификация и экспрессия участков VH И VL выделенных последовательностей генов тяжелых и легких цепей, например, из гибридомы (например, мышиной гибридомы), которая вырабатывает доменное антитело. Границы доменовHealthHuman Services, Washington, D.C.). Сведения о границах доменов VH и VL В генах тяжелых и легких цепей используются для конструирования праймеров для ПЦР, которая амплифицирует домен V из кодирующей последовательности тяжелых или легких цепей, кодирующей антитело с известной способностью связывать CD28. Амплифицированные домены V встраивают в подходящий вектор экспрессии, например, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) и экспрессируют, например, в виде гибрида VH и VL В scFv или другом подходящем одновалентном формате. Полученный полипептид затем подвергают скринингу на высокоаффинное одновалентное связывание с CD28. Вместе с методиками, описанными в данном описании, скрининг на связывание проводят согласно методикам,известным в данной области техники, или как описано ниже в данном описании. Или для идентификации белков, специфически и одновалентно связывающих CD28, можно использовать методики скрининга библиотек. Методика фагового отображения (см., например, Smith (1985)Science 228: 1315; Scott, Smith (1990) Science 249: 386; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552) представляет собой подход для отбора доменных антител, которые связываются с желаемой мишенью, из большого разнообразного репертуара доменных антител. Библиотеки фагового отображения можно сгруппировать по двум категориям, естественные библиотеки, где использованы перестроенные гены V, взятые из человеческих В-лимфоцитов (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol, 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309), или синтетические библиотеки, где участки гена V эмбрионального типа или другие последовательности, кодирующие доменное антитело, "реорганизованы" in vitro (Hoogenboom, Winter(1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol, 248: 97) и где синтетические CDR встроены в один реорганизованный ген V (Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Методики, включающие генетическое отображение (например, фаговое отображение, полисомное отображение), хорошо подходят для отбора конструктов одновалентных антител, специфичных к CD28, так как, как правило, при отображении они экспрессируют только одновалентные фрагменты, а не целые двухвалентные антитела. Методики получения библиотек фагового отображения, содержащих различные фрагменты антител, описаны в вышеуказанных ссылках. Такие методики также описаны, например, в патенте США 6696245, включенном в данный документ путем ссылки. Методики, описанные в патенте '245, как правило, включают рандомизацию выбранных участков из кодирующих районов гена иммуноглобулина, в частности, участков,кодирующих VH и VL, в то время как другие участки рандомизации не подвергают (см. ниже). Также в патенте '245 описано получение конструктов scFv, содержащих отдельно рандомизированные домены VH и VL. Анализ структур и последовательностей антител выявил, что пять из шести антигенсвязывающих петель (H1, Н 2, L1, L2, L3) обладают ограниченным числом конформаций главной цепи или каноническими структурами (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877). Конформации главной цепи определяются (i) длиной антигенсвязывающей петли и (ii) определенными остатками, или типом остатков, в некоторых ключевых положениях в антигенсвязывающей петле и каркасном участке антител. Например, анализ длин петель и ключевых остатков позволил предсказать конформации главной цепи H1, H2, L1, L2 и L3, кодируемых большинством последовательностей человеческих антител (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220). Хотя участок Н 3 более разнообразен по строению последовательности, длине и структуре (из-за использования сегментов D), он также образует ограниченное число конформаций главной цепи с короткими длинами петли, что зависит от длины и присутствия определенных остатков, или типов остатков, в ключевых положениях в петле и каркасном участке антител (Martinet al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399: 1. В то время как при одном подходе разнообразие в синтетический репертуар можно вносить в любом сайте CDR различных антигенсвязывающих петель, этот подход ведет к большей доле доменов V,которые не свертываются соответствующим образом и, следовательно, дают меньшую долю молекул,способных связывать антиген. Понимание того, как остатки, обусловливающие конформации главной цепи антигенсвязывающих петель, позволяет идентифицировать конкретные остатки для диверсификации синтетического репертуара доменов VH или VL. To есть, различия лучше вносить в остатки, которые не являются необходимыми для поддержания конформации главной цепи. В качестве примера для диверсификации петли L2 традиционный подход будет состоять в диверсификации всех остатков в соот- 17024585 ветствующих CDR (CDR2), как определено Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequences of ImmunologicalInterest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.), примерно семи остатков. Однако в отношении L2 известно, что положения 50 и 53 различаются в антителах естественного происхождения и, согласно наблюдениям, вступают в контакт с антигеном. Один подход заключался бы в диверсификации только тех двух остатков в этой петле. Это представляет собой существенное усовершенствование в отношении функционального разнообразия, необходимого для создания различной антигенсвязывающей специфичности. По заранее заданной конформации главной цепи вариабельного домена можно создать библиотеки полипептидов иммуноглобулинов, что дает преимущества. Такие библиотеки можно сконструировать,как описано в заявке на международный патент WO 99/20749, содержание которого включено в данный документ путем ссылки. Таким образом, В одном из аспектов изобретения доменное антитело содержит аминокислотную последовательность данного сегмента гена района V человеческих антител эмбрионального типа, например, сегмент DP-47 гена VH эмбрионального типа, или сегмент DPK9 гена V эмбрионального типа. Такие полипептиды вариабельных участков можно использовать для получения scFv или Fab, например, scFv или Fab, содержащих (i) вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), ИЛИ его антигенсвязывающий фрагмент, который включает аминокислотную последовательность сегментаDP-47 VH эмбрионального типа, и (ii) вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит аминокислотную последовательность сегмента DPK9 V эмбрионального типа. Диверсификация последовательностей в контексте выбранных сегментов генов тяжелых и легких цепей эмбрионального типа, например, DP-47, DPK 9, DP45, DP38 и т.д., может привести к созданию репертуара разнообразных последовательностей, кодирующих иммуноглобулин. Один подход к диверсификации описан ниже в контексте создания библиотеки разнообразных последовательностей доменного антитела или scFv. Полипептиды этих вариабельных участков также можно экспрессировать в виде доменных антител и подвергать скринингу на высокоаффинное связывание с CD28. Репертуар можно клонировать или встраивать в вектор, подходящий для фагового отображения, например,вектор отображения лямбда или нитевидный бактериофаг, а затем подвергать скринингу на связывание с определенным антигеном-мишенью, например, CD28. 3. Получение доменных антител. Доменное антитело представляет собой свернутый полипептидный домен, который содержит последовательность, типичную для вариабельных доменов иммуноглобулина, и который специфически связывает антиген (например, с константой диссоциации 500 нмоль или менее), и который связывает антиген как один вариабельный домен; то есть, имеется один сайт связывания, обеспечивающийся доменным антителом без какого-либо комплементарного вариабельного домена. Таким образом, доменное антитело включает полные вариабельные домены антитела, а также модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или несколько петель замещены последовательностями, не являющихся типичными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или включают N- или С-концевые вставки, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов,которые сохраняют константу диссоциации 500 нмоль или менее (например, 450 нмоль или менее, 400 нмоль или менее, 350 нмоль или менее, 300 нмоль или менее, 250 нмоль или менее, 200 нмоль или менее,150 нмоль или менее, 100 нмоль или менее) и специфичность полноразмерного домена в отношении антигена-мишени. В типичном примере один вариабельный домен антитела, использующийся в композициях и способах, описанных в данном описании, выбирают из группы VH И VL, включая Vkappa и Vlambda. В типичном варианте доменные антитела, входящие в объем настоящего изобретения, представляют собой"человеческие" согласно определению в данном описании. 3.1.1. Структура лигандов. Согласно одному из аспектов, изложенных в данном описании, два или более доменов, связывающих некомплементарные эпитопы, связаны так, что они находятся в закрытой конформации, как определено в данном описании. Преимуществом является то, что их можно дополнительно присоединить к скелету, который в качестве альтернативы или дополнения к линкеру, описанному в данном описании, способствует образованию и (или) поддержанию закрытой конформации сайтов связывания эпитопов относительно друг друга. Или доменные антитела, входящие в объем настоящего изобретения, можно сконструировать с использованием каркасных или скелетных участков, как описано в данном описании. Скелеты лигандов могут иметь в своей основе молекулы иммуноглобулина или могут не относиться к иммуноглобулинам по происхождению, как описано в других разделах данного документа. Скелеты иммуноглобулинов согласно определению в данном описании могут включать один или несколько из тех, что выбраны из следующего: молекула иммуноглобулина, содержащая, по меньшей мере, (i) доменCL (подкласс каппа или лямбда) антитела; или (ii) домен CH1 тяжелой цепи антитела; молекула иммуноглобулина, содержащая домены CH1 и CH2 тяжелой цепи антитела; молекула иммуноглобулина, содержащая домены CH1, CH2 и СН 3 тяжелой цепи антитела; или любой из наборов (ii) вместе с доменомCL (подкласс каппа или лямбда) антитела. Также может быть включен домен шарнирной области. Такие комбинации доменов могут, например, имитировать антитела естественного происхождения, такие какIgG или IgM, или их фрагменты, такие как молекулы Fv, scFv, Fab или F(ab')2. Специалисту в данной области техники будет понятно, что этот список не является исчерпывающим. Каждый домен, связывающий эпитоп, содержит белковый каркас и один или несколько CDR, которые участвуют в специфическом взаимодействии домена с одним или несколькими эпитопами. Преимущества дает тот факт, что домен, связывающий эпитоп и описанный в данном описании, содержит триCDR. Подходящие белковые каркасы, помимо тех, что основаны на доменах иммуноглобулина, также могут быть основаны на белковых каркасах или скелетах доменов, не относящихся к доменам иммуноглобулина. Например, природные бактериальные рецепторы, такие как SpA, использованы как каркасы для встраивания CDR с получением лигандов, которые специфически связываются с одним или несколькими эпитопами. Детально эта процедура описана в патенте США 5831012. Другие подходящие каркасы включают основанные на фибронектине и аффителах (Affibody, Bromma, Швеция). Детально подходящие процедуры описаны в WO 98/58965. Другие подходящие каркасы включают липокаллин и CTLA4,как описано van den Beuken et al., (2001) J. Mol. Biol.310: 591-601, и каркасы, как описанные в WO 00/69907 (Medical Research Council), которые основаны, например, на кольцевой структуре бактериального GroEL или других полипептидах шаперонов. Другие каркасы, не относящиеся к иммуноглобулинам, которые можно использовать, включают те, что основаны на рецепторах ЛВНП класса А, мономерах и мультимерах домена ЭФР и каркасах производства компании "Biorexis" (Король Пруссии, штат Пенсильвания) или "Avidia" (Маунтин-Вью, штат Калифорния). Другие каркасы, не относящиеся к иммуноглобулинам, которые пригодны для применения, включают, например, описанные в WO 05/040229,WO 04/044011 и США 2005/0089932. 3.1.2. Выбор конформации главной цепи. Все члены суперсемейства иммуноглобулинов имеют одинаковый тип свертывания своих полипептидных цепей. Например, хотя антитела существенно различаются по первичной последовательности,сравнение последовательностей и кристаллографические исследования обнаружили, что вопреки ожиданиям пять из шести антигенсвязывающих петель антител (H1, Н 2, L1, L2, L3) принимают ограниченное число конформации главной цепи, или канонические структуры (Chothia, Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Анализ длин петель и ключевых остатков позволил предсказать конформации главной цепи H1, H2, L1, L2 и L3, обнаруженные в большинстве человеческих антителJ. Mol. Biol., 264: 220). Хотя участок Н 3 более разнообразен по строению последовательности, длине и структуре (из-за использования сегментов D), он также образует ограниченное число конформаций главной цепи с короткими длинами петли, что зависит от длины и присутствия определенных остатков, или типов остатков, в ключевых положениях в петле и каркасном участке антител (Martin et al. (1996) J. Mol.Biol, 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399:1). Лиганды, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть отобраны и (или) собраны из библиотек доменов, таких как библиотеки доменов VH и (или) библиотеки доменов VL. Кроме того, лиганды,входящие в объем настоящего изобретения, могут быть сами по себе получены в виде библиотек. В одном из аспектов изобретения, описанном в данном описании, создаются библиотеки лигандов и (или) доменов, где выбраны некоторые длины петель и ключевые остатки, чтобы гарантировать, что известна конформация главной цепи членов. Преимуществом является тот факт, что они представляют собой реальные конформации молекул суперсемейства иммуноглобулинов, обнаруженных в природе, что сводит к минимуму шансы, что они окажутся функционально неактивными, как обсуждается выше. Сегменты гена V эмбрионального типа служат одной типичной каркасной основой для конструирования библиотек антител или рецепторов Т-лимфоцитов; также используются другие последовательности. Варианты могут встречаться с низкой частотой, поэтому небольшое число функционально активных членов может обладать измененной конформацией главной цепи, что не влияет на функцию. Теорию канонических структур тоже применяют для оценки числа различных конформации главной цепи, кодируемых лигандами, для предсказания конформации главной цепи по последовательности лигандов и для выбора остатков для диверсификации, которая не влияет на каноническую структуру. Известно, что в человеческом домене V петля L1 может иметь одну из четырех канонических структур,петля L2 имеет одну каноническую структуру и 90% от человеческих доменов V имеют одну из четырех канонических структур петли L3 (Tomlinson et al. (1995), см. выше); таким образом, только в домене V можно объединить различные канонические структуры для создания различных конформаций главной цепи. Учитывая, что домен V кодирует различные канонические структуры петель L1, L2 и L3 и что домены V и V могут образовывать пару с любым доменом VH, который может кодировать несколько канонических структур петель H1 и Н 2, число комбинаций канонических структур, наблюдаемых в отношении этих пяти петель, очень велико. Это подразумевает, что внесение разнообразия в конформации главной цепи может быть необходимым для получения широкого диапазона специфичности связывания. Однако при конструировании библиотеки антител по одной известной конформации главной цепи обнаружено, что вопреки ожиданиям, разнообразие конформации главной цепи не является необходимым для создания достаточного разнообразия при нацеливании практически на все антигены. Еще удивительнее- 19024585 тот факт, что одна конформация главной цепи необязательно должна представлять собой консенсусную структуру. Одна конформация естественного происхождения может быть использована как основа для всей библиотеки. Таким образом, в одном из аспектов изобретения лиганды, описанные в данном описании, обладают одной известной конформацией главной цепи. Одна выбранная конформация главной цепи является В одном из аспектов изобретения общей для молекул интересующего типа суперсемейства иммуноглобулинов. Конформация является общей, когда ее принимает существенное число молекул естественного происхождения. Соответственно, в одном из аспектов изобретения, описанном в данном описании, наличие различных конформаций для каждой связывающей петли домена иммуноглобулина в естественных условиях рассматривают отдельно, а затем выбирают вариабельный домен естественного происхождения, который обладает желаемой комбинацией конформаций главной цепи в разных петлях. Если ни одного такого не имеется, можно выбрать ближайший эквивалент. Предпочтительно, чтобы желаемая комбинация конформаций главной цепи в разных петлях создавалась путем выбора сегментов гена эмбрионального типа, который кодирует желаемые конформации главной цепи. Еще более предпочтительно, чтобы выбранные сегменты гена эмбрионального типа часто экспрессировались в естественных условиях, и еще предпочтительнее, чтобы они чаще всего экспрессировались среди всех сегментов гена эмбрионального типа естественного происхождения. При конструировании лигандов или их библиотек частоту распространенности различных конформаций главной цепи для каждой антигенсвязывающей петли можно рассматривать отдельно. В отношении H1, Н 2, L1, L2 и L3, выбирают конформацию, которую принимают от 20 до 100% антигенсвязывающих петель в молекулах естественного происхождения. Как правило, наблюдается частота распространенности более 35% (например, между 35 и 100%) и, в идеальном случае, больше 50% и даже больше 65%. Поскольку подавляющее большинство петель Н 3 не имеют канонических структур, предпочтительно выбирать конформацию главной цепи, которая является общей для тех петель, для которых выявляются канонические структуры. Для каждой петли, следовательно, выбирают конформацию, которая чаще всего встречается в репертуаре естественного происхождения. В человеческих антителах самыми популярными каноническими структурами (КС) для каждой петли являются следующие: H1-CS 1 (79% экспрессирующегося репертуара), Н 2-CS 3 (46%), L1-CS 2 V(39%), L2-CS1 (100%), L3-CS 1V (36%)Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). В отношении петель Н 3, которые имеют канонические структуры,длина CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Healthand Human Services) из семи остатков с солевым мостиком от остатка 94 до остатка 101 встречается чаще всего. Имеются, по меньшей мере, 16 последовательностей человеческих антител в библиотеке данныхEMBL с нужной длиной Н 3 и ключевыми остатками для образования этой конформации и, по меньшей мере, две кристаллографические структуры в банке данных белков, которые можно использовать как основу для моделирования антител (2cgr и 1tet). Чаще всего экспрессирующиеся сегменты гена эмбрионального типа в этой комбинации канонических структур - это сегмент 3-23 (DP-47) из VH, сегмент JH из 4bJH, сегмент O2/O12 (DPK9) из V и сегмент J1 из J. Также пригодны сегменты DP45 и DP38 из VH. Следовательно, эти сегменты можно использовать в комбинации как основу для конструирования библиотеки с желаемой конформацией главной цепи. Или вместо выбора одной конформации главной цепи на основе частоты распространенности в естественных условиях различных конформаций главной цепи для каждой связывающей петли отдельно,при выборе одной конформации главной цепи как основа используется частота распространенности комбинаций конформаций главной цепи в естественных условиях. В случае антител, например, можно определить частоту распространенности в естественных условиях комбинации канонических структур для любых двух, трех, четырех, пяти или всех шести антигенсвязывающих петель. Здесь предпочтительно,чтобы выбранная конформация являлась общей для антител естественного происхождения, и более предпочтительно, чтобы она была самой частой из наблюдающихся в репертуаре естественного происхождения. Таким образом, в человеческих антителах, например, где рассматриваются естественные комбинации пяти антигенсвязывающих петель, H1, H2, L1, L2 и L3, определяют самую часто встречающуюся комбинацию канонических структур, а затем объединяют ее с самой популярной конформацией петли Н 3 как основу для выбора одной конформации главной цепи. 3.2. Получение доменных антител. Доменные антитела получают несколькими путями. При каждом из этих подходов применимы хорошо известные методики получения (например, амплификации, модификации и т.д.) и манипуляции с последовательностями нуклеиновых кислот. Один из способов получения доменного антитела заключается в амплификации и экспрессии района VH или VL гена тяжелой или легкой цепи клонированного антитела, известного своей способностью связывать желаемый антиген. То есть, домен VH или VL кодирующего района известного доменного антитела можно амплифицировать и экспрессировать как один домен (или гибрид из одного домена) и изучить на связывание с CD28. Границы доменов VH и VL описаны Kabat et al. (Kabat et al. (1991) Sequencesof Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. HealthHuman Services, Washington, D.C.). Сведения о грани- 20024585 цах доменов VH и VL в генах тяжелых и легких цепей используются для конструирования праймеров для ПЦР, которая амплифицирует домен V из клонированной кодирующей последовательности тяжелых или легких цепей, которая кодирует антитело, обладающее известной способностью связывать CD28. Амплифицированные домены V встраивают в подходящий вектор экспрессии, например, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) и экспрессируют либо отдельно, либо в виде гибрида с другой полипептидной последовательностью. Ген VH получается при рекомбинации трех сегментов гена VH, D И JH. У человека существует примерно 51 функционально активный сегмент VH (Cook, Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25 функционально активных сегментов D (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69) и 6 функционально активных сегментов JH (Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583), в зависимости от гаплотипа. Сегмент VH кодирует участок полипептидной цепи, который образует первую и вторую антиген связывающую петлю доменаVH (H1 И Н 2), В то время как сегменты VH, D и JH комбинируются с образованием третьей антигенсвязывающей петли домена VH(Н 3). Ген VL получается рекомбинацией только двух сегментов гена - VL и JL. У человека существует примерно 40 функционально активных сегментов V (Schble, Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001), 31 функционально активный сегмент V, (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasakiet al. (1997) Genome Res. 7: 250), 5 функционально активных сегментов J (Hieter et al. (1982) J. Biol.Chem. 257: 1516) и 4 функционально активных сегментов J, (Vasicek, Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609),в зависимости от гаплотипа. Сегмент VL кодирует участок полипептидной цепи, который образует первую и вторую антигенсвязывающую петлю домена VL (L1 и L2), в то время как сегменты VL и JL комбинируются с образованием третьей антигенсвязывающей петли домена VL (L3). Антитела, выбранные из этого первичного репертуара, считаются достаточно разнообразными для связывания практически всех антигенов, по меньшей мере, с умеренной аффинностью. Высокоаффинные антитела получают in vivo путем "созревания аффинности" перестроенных генов, куда вносят точковые мутации и отбирают с помощью иммунной системы на основе улучшенного связывания. При одном подходе репертуар доменов VH или VL, В одном из аспектов изобретения человеческих доменов VH или VL, подвергают скринингу с помощью, например, фагового отображения, на связывание желаемого антигена. Методики конструирования библиотек отображения бактериофагами и библиотеки экспрессии фага лямбда известны в данной области техники и описаны, например, у: McCafferty et al.Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins, Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem.,267: 16007; и Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313. Библиотеки фагового отображения Fab описаны, например, в патенте США 5922545. Библиотеки фагового отображения scFv описаны, например, у Huston etal. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990), см. выше; Clackson et al. (1991), см. выше; Marks et al. (1991), см. выше; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech. 10: 80; и Marks et al. (1992), см. выше. Описаны различные варианты библиотек scFv, отображенных на белках оболочки бактериофага. Также известны усовершенствования методик с использованием фагового отображения, например, как описано в WO96/06213 иWO92/01047 (Medical Research Council et al.) и WO97/08320 (Morphosys, см. выше). Репертуар доменов VH или VL может быть репертуаром последовательностей иммуноглобулинов естественного происхождения или синтетическим репертуаром. Репертуар естественного происхождения получают, например, из клеток, экспрессирующих иммуноглобулины, взятых у одного или нескольких пациентов. Такие репертуары могут быть "наивными", т.е. полученными, например, из человеческого плода или клеток новорожденного, экспрессирующих иммуноглобулины, или реорганизованными, т.е. полученными из, например, В-лимфоцитов взрослого человека. Репертуары естественного происхождения описаны, например, Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581, и Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. 14: 309. При необходимости клоны, идентифицированные в репертуаре естественного происхождения или любом репертуаре и связывающие антиген, подвергают мутагенезу и дополнительному скринингу для получения и отбора вариантов с улучшенными характеристиками связывания. Синтетические репертуары доменных антител получают путем внесения искусственного разнообразия в клонированный домен V. Синтетические репертуары описаны, например, Hoogenboom, WinterEMBO J. 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al. (1995) J. Mol. Biol. 248: 97; и в WO 99/20749. В одном из аспектов изобретения синтетические репертуары вариабельного домена получают из VH или V на основе искусственно диверсифицированных последовательностей VH или V эмбрионального типа. Например, репертуар домена VH может быть основан на клонированных сегментах V3-23/DP47 гена VH эмбрионального типа (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776) и JH4b. Репертуар домена V- 21024585 может быть основан на сегментах O2/O12/DPK9 гена V эмбрионального типа (Cox et al. (1994) Eur. J.Immunol. 24: 827) и J1. Разнообразие вносят в те или иные сегменты гена путем, например, мутагенеза с помощью ПЦР. Разнообразие можно вносить случайным методом, например, с помощью ПЦР пониженной точности (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889), или химического мутагенеза. Как обсуждалось выше, однако, В одном из вариантов внесение разнообразия нацелено на конкретные остатки. В другом варианте нацеливание на желаемые остатки происходит путем встраивания кодона NNK с использованием мутагенных праймеров (согласно номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC), где N = G, А, Т или С, и K = G или Т), который кодирует все аминокислоты и стоп-кодонTAG Другие кодоны, у которых достигнуты такие же концы, тоже используются, включая кодон NNN(A/G/C)T), кодон DVC A/G/T)(A/G/C)C), и кодон DVY A/G/T)(A/G/C)(C/T). Кодон DVT кодирует 22% серина и 11% тирозина, аспарагина, глицина, аланина, аспартата, треонина и цистеина, которые в наибольшей мере имитируют распределение аминокислотных остатков в антигенсвязывающих сайтах человеческих антител естественного происхождения. Репертуары получают с использованием ПЦРпраймеров, содержащих выбранный вырожденный кодон или кодоны в каждом сайте, подлежащем диверсификации. ПЦР-мутагенез хорошо известен в данной области техники. В одном из аспектов изобретения диверсифицируют последовательность сегментов V3-23/DP47 человеческого гена VH эмбрионального типа (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 7768) и JH4b с использование кодона NNK в сайтах Н 30, Н 31, Н 33, Н 35, Н 50, Н 52, Н 52 а, Н 53, Н 55, Н 56, Н 58, Н 95, Н 97 и Н 98, соответствующих разнообразию в CDRs 1, 2 и 3, с нумерацией, как использованная в патенте США 6696245. В другом аспекте разнообразие также вносят в сегменты V3-23/DP47 человеческого гена VH эмбрионального типа и JH4b, например, с использование кодона NNK в сайтах Н 30, Н 31, Н 33, Н 35, Н 50,Н 52, Н 52 а, Н 53, Н 55, Н 56, Н 58, Н 95, Н 97, Н 98, Н 99, Н 100, H100 а и H100b, соответствующих разнообразию в CDRs 1, 2 и 3, с нумерацией, как использованная в патенте США 6696245. В другом аспекте разнообразие вносят в последовательность сегментов O2/O12/DPK9 и J1 человеческого гена V эмбрионального типа, например, используя кодон NNK в сайтах L30, L31, L32, L34, L50,L53, L91, L92, L93, L94, и L96, соответствующих разнообразию в CDR 1, 2 и 3 с нумерацией, как использованная в патенте США 6696245. Диверсифицированные репертуары клонируют в векторы фагового отображения, как известно в данной области техники и как описано, например, в WO 99/20749. Как правило, молекулы нуклеиновых кислот и конструкты векторов, необходимые для композиций и способов, заявленных в настоящем изобретении, известны в данной области техники и конструируются и видоизменяются, как описано в стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, USA, и последующие издания. Манипуляции с нуклеиновыми кислотами, как описано в данном описании, выполняют в рекомбинантных векторах. Согласно употреблению в данном описании "вектор" означает отдельный элемент,который используется для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии и (или) репликации. Методики, с помощью которых выбирают или конструируют и впоследствии используют такие векторы,хорошо известны специалисту в данной области техники. Общедоступны многочисленные векторы,включая бактериальные плазмиды, бактериофаги, искусственные хромосомы и эписомные векторы. Такие векторы можно использовать для простого клонирования и мутагенеза; или, что типично для векторов, которые используются как носители репертуара (или пре-репертуара) членов, используется вектор экспрессии генов. Вектор, использующийся в рамках настоящего изобретения, выбирают, чтобы он мог вместить последовательность, кодирующую полипептид, нужного размера, обычно от 0,25 тысячи пар оснований (kb) до 40 kb в длину. Подходящую клетку-хозяин трансформируют с использованием вектора после манипуляций клонирования in vitro. Все векторы содержат функциональные компоненты, которые обычно включают сайт клонирования (или "полилинкер"), начало репликации и, по меньшей мере, один селектируемый маркерный ген. Если данный вектор является вектором экспрессии, он дополнительно содержит один или несколько из следующего: энхансер, промотор, терминатор транскрипции и сигнальные последовательности, все из которых находятся вблизи сайта клонирования так, что они функционально связаны с геном, кодирующим член полипептидного репертуара, как описано в данном описании. И вектор клонирования, и вектор экспрессии, как правило, содержат последовательности нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают репликацию вектора в одной или нескольких выбранных клетках хозяина. Для векторов клонирования типично, что последовательность представляет собой ту, что обеспечивает репликацию вектора независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает начало репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны в отношении ряда бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, начало двухмикронной плазмиды подходит для дрожжей, и различные начала вирусных последовательностей (например, SV40, аденовирус) пригодны для векторов клонирования в клетках млекопитающих. Как правило, начало репликации для векторов экспрессии в- 22024585 клетках млекопитающих не требуется, если они не используются в клетках млекопитающих, способных к репликации больших количеств ДНК, таких как клетки COS. Преимущества дает тот факт, что вектор клонирования или экспрессии также содержит ген отбора,также именуемый как селектируемый маркер. Это ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток хозяина на селективной питательной среде. Следовательно, клетки хозяина, не трансформированные вектором, который содержит селектируемый ген, не будут выживать на этой питательной среде. Типичные селектируемые гены кодируют белки, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам и другим токсическим веществам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, восполняют дефицит питательных веществ у ауксотрофов или обеспечивают критические питательные вещества, отсутствующие в питательной среде. Поскольку репликацию векторов, предусмотренных в настоящем изобретении, удобнее всего выполнять в Е. coli, можно использовать селектируемый маркер Е. coli, например, ген Р-лактамазы, который несет устойчивость к антибиотику ампициллину. Их можно получить из плазмид Е. coli, таких какpBR322, или плазмиды pUC, такой как pUC18 или pUC19. Однако также можно умеренно замещать комбинации плазмид других микроорганизмов. Векторы экспрессии обычно содержат промотор, который распознается организмом хозяина и функционально связан с нужной кодирующей последовательностью. Такой промотор может быть индуцируемым или конститутивным. Термин "функционально связанный" означает соседнее положение, где описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей иммуноглобулин функционировать предназначенным им образом. Контрольная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, сшита таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Промоторы, подходящие для использования с прокариотами-хозяевами включают, например, системы промоторов -лактамазы и лактозы, щелочную фосфатазу, систему промотора триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Промоторы для использования в бактериальных системах, как правило, будут также содержать последовательность Шайна-Дальгарно, функционально связанную с кодирующей последовательностью. В библиотеках или репертуарах, описанных в данном описании, векторы могут быть векторами экспрессии, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей какому-либо члену библиотеки полипептидов. Таким образом, отбор проводят путем отдельной пролиферации и экспрессии одного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов, или с использованием любой системы отбора с отображением. Как описано выше, одна система отбора с отображением использует бактериофаговое отображение. Таким образом, можно использовать фаговые или фагмидные векторы. Векторы могут быть фагмидными векторами, которые имеют начало репликации Е. coli (для двухцепочечной репликации), а также фаговое начало репликации (для получения одноцепочечной ДНК). Манипуляции и экспрессия таких векторов хорошо известны в данной области техники (Hoogenboom, Winter (1992), см. выше; Nissim et al. (1994), см. выше). Вкратце, вектор содержит -лактамазный или другой селектируемый маркерный ген для обеспечения селективности на фагмиде, и промотор lac в 3'-5' направлении от кассеты экспрессии, который состоит (от N- к С-концу) из лидерной последовательности pelB (которая направляет экспрессированный полипептид в периплазматическое пространство),сайт множественного клонирования (для клонирования нуклеотидной версии члена библиотеки), на выбор, одну или несколько пептидных меток (для выявления), на выбор, один или несколько стоп-кодоновTAG и фаговый белок pIII. В одном из вариантов вектор, а не лидерная последовательность pelB, кодирует лидерную последовательность GAS1 эукариотов, которая служит для направления секреции гибридного полипептида в периплазматическое пространство в Е. coli или в питательную среду в системах клеток эукариотов. Используя различные супрессорные и несупрессорные штаммы Е. coli и при добавлении глюкозы, изопропилтиоD-галактозида (ИПТГ) или фага-хелепера, такого как VCS M13, вектор способен реплицироваться как плазмида без экспрессии, вырабатывать только большие количества члена библиотеки полипептидов, или продуцировать фаги, некоторые из которых содержат по меньшей мере одну копию гибрида полипептид-pIII на своей поверхности. Пример вектора - фагмидный вектор pHEN1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 41334137; последовательность доступна, например, как последовательность SEQ ID NO: 7 в WO 03/031611), в котором продукция гибридного белка pIII находится под контролем промотора LacZ, который ингибируется в присутствии глюкозы и индуцируется в присутствии ИПТГ. При выращивании в супрессорных штаммах Е. coli, например, TG1, гибридный белок гена III вырабатывается и упаковывается в фаг, в то время как выращивание в несупрессорных штаммах, например, HB2151 обеспечивает секрецию гибридного белка в периплазматическое пространство бактерии и в питательную среду. Поскольку экспрессия гена III предотвращает дальнейшую инфекцию фагом-хелпером, бактерии, несущие фагмидные векторы,выращивают в присутствии глюкозы до инфекции фагом-хелпером VCSM13 для спасения фага. В конструкциях векторов, описанных в данном описании, используются традиционные методики сшивания. Выделенные векторы или ДНК-фрагменты расщепляют, адаптируют и повторно сшивают в- 23024585 форме, желаемой для создания требуемого вектора. При необходимости по стандартным протоколам проводят анализ последовательности для подтверждения, что в сконструированном векторе присутствуют соответствующие последовательности. Соответствующие методики конструирования векторов экспрессии, получения транскриптов in vitro, встраивания ДНК в клетки хозяина и проведение анализов для оценки экспрессии и функции известны специалистам в данной области техники. Выявляют присутствие последовательности гена в образце, или его амплификацию и (или) экспрессию, оцененную количественно с помощью традиционных методик, таких как блоттинг по Саузерну, Нозерн-блоттинг, Вестернблоттинг, дот-блоттинг ДНК, РНК или белка, гибридизация in situ, иммуноцитохимический анализ или секвенирование молекул нуклеиновых кислот или белков. Специалисту в данной области техники будет нетрудно понять, как можно модифицировать эти методики, если это необходимо. 3.3. Скрининг доменных антител на связывание антигена. После экспрессии репертуара доменных антител на поверхности фага проводят отбор путем создания контакта между фаговым репертуаром с иммобилизованным антигеном-мишенью, отмывания несвязанного фага и выращивания связанного фага, при этом весь процесс часто называют "пэннингом". Это процесс применим к скринингу доменных антител, а также других фрагментов антител, которые могут экспрессироваться в библиотеке отображения, например, scFv, Fab и т.д. Или фаг выбирают предварительно на экспрессию правильно свернутых вариантов членов с помощью пэннинга против иммобилизованного типового лиганда (например, белка А или белка L), который связывается только свернутыми членами. Это имеет то преимущество, что доля функционально неактивных членов уменьшается, что увеличивает долю членов, вероятно связывающих антиген-мишень. Предварительный отбор по типовым лигандам описан, например, в WO 99/20749. Скрининг библиотек фагов-антител в общем описан, например, Harrison et al. (1996) Meth. Enzymol. 267: 83-109. Скрининг часто проводят с использованием очищенного антигена, иммобилизованного на твердой подложке, например, пластмассовой пробирке или лунке, или на хроматографической матрице, например, Sepharose (Pharmacia). Скрининг или отбор также можно провести по составным антигенам, таким как поверхность клеток (Marks et al. (1993) BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al. (1995) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 92: 3938). Другой альтернативный процесс включает отбор по связыванию биотинилированного антигена в растворе с последующим захватом на микросферах, покрытых стрептавидином. В одном из аспектов изобретения пэннинг поводят путем иммобилизации антигена (типового или конкретного) в пробирке или лунке на планшете, например, на узких плашках Nunc MAXISORP immunotube 8. Лунки покрывают 150 мкл антигена (100 мкг/мл в ФСБ) и инкубируют в течение ночи. Затем лунки промывают трехкратно ФСБ и блокируют 400 мкл ФСБ-2% обезжиренного молока (2% МФСБ) при 37 С в течение 2 ч. Лунки промывают 3 раза ФСБ и добавляют фаг в 2% МФСБ. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 90 минут, а затем сливают жидкость, содержащую несвязанный фаг. Лунки промывают 10 раз ФСБ - 0,1% раствором Tween 20, а затем 10 раз ФСБ для удаления детергента. Связанный фаг вымывают добавлением 200 мкл свежеприготовленного триэтиламина, 100 ммоль, тщательно перемешивая и инкубируя в течение 10 мин при комнатной температуре. Вымытый фаг переносят в пробирку, содержащую 100 мкл 1 М Tris-HCl, pH 7,4, и перемешивают для нейтрализации триэтиламина. Экспоненциально растущие клетки хозяина Е. coli (например, TG1) инфицируют, например, 150 мл вымытого фага с помощью инкубации в течение 30 мин при 37 С. Инфицированные клетки осаждают центрифугированием, вновь взвешивают в свежей питательной среде и сеют на агарозу. Бляшки фага вымывают или собирают в свежие культуры клеток хозяина для выращивания для анализа или дальнейших циклов отбора. Проводят один или несколько циклов очистки фага, если необходимо обеспечить чистые популяции отобранного фага. Другие методики скрининга описаны Harrison et al. (1996), см. выше. После идентификации фага, экспрессирующего доменное антитело, которое связывается с желаемой мишенью, если использован такой фагмидный вектор, как pHEN1, гибридные белки вариабельного домена легко получаются в растворимой форме путем инфицирования несупрессорных штаммов бактерий, например, НВ 2151, что обеспечивает секрецию растворимого гибридного белка гена III. Если вектором кодируется сигнальный пептид секреции GAS1, гибридный полипептид могут секретировать клетки эукариотов (например, дрожжей или млекопитающих) или прокариотов (например, Е. coli). Или последовательность домена V можно субклонировать в соответствующем векторе экспрессии для получения растворимого белка согласно методикам, известным в данной области техники. 3.4. Очистка и концентрирование доменных антител. Доменные антитела, секретирующиеся в периплазматическое пространство или в питательную среду для бактерий, собирают и очищают согласно известным методикам (Harrison et al. (1996), см. выше).Skerra, Pluckthun (1988) Science 240: 1038, и Breitling et al. (1991) Gene 104: 147, описывает сбор доменных антител из периплазмы; и Better et al. (1988) Science 240: 1041, описывает сбор из надосадочной жидкости культуры. В отношении некоторых доменных антител очистки можно добиться путем связывания с типовыми лигандами, такими как белок А или белок L. Или вариабельные домены можно экспрессировать с пептидной меткой, например, Мус, НА или 6X-His (последовательность SEQ ID NO: 644),что облегчает очистку с помощью аффинной хроматографии.- 24024585 При необходимости доменные антитела концентрируют с помощью любого из нескольких методов,известных в данной области техники, включая, например, ультрафильтрацию, диафильтрацию и тангенциальную проточную фильтрацию. В процессе ультрафильтрации используются полупроницаемые мембраны и давление для разделения различных молекул по размеру и форме. Давление обеспечивается давлением газа или центрифугированием. Коммерческие продукты для ультрафильтрации широко доступны, например, производства компании "Millipore" (Бедфорд, штат Массачусетс; примеры включают концентраторы Centricon и Microcon) и "Vivascience" (Ганновер, Германия; примеры включают концентраторы Vivaspin). При выборе разграничивающего значения молекулярной массы менее молекулярной массы полипептида (обычно от 1/3 до 1/6 молекулярной массы полипептида-мищени, хотя можно успешно использовать даже такие малые различия, как 10 кД) полипептид остается, когда растворитель и растворенные вещества меньшей массы проходят через мембраны. Таким образом, разграничивающее значение молекулярной массы 5 кД полезно при концентрировании доменных антител, описанных в данном описании. Диафильтрация, где используются мембраны для ультрафильтрации с процессом промывания, применяется, когда нужно удалить или произвести обмен соли или буфера в составе, содержащем полипептид. Полипептид концентрируют путем пропускания растворителя и небольших растворенных веществ через мембрану, а оставшиеся соли или буфер удаляют путем растворения оставшегося полипептида новым буферным или солевым раствором или водой, как это желательно, вместе с непрерывной ультрафильтрацией. При непрерывной диафильтрациии новый буферный раствор добавляют с той же скоростью, с какой фильтрат проходит через мембрану. Объем диафильтрации - это объем раствора полипептида до начала диафильтрации; используя непрерывную диафильтрацию, больше чем 99,5% полностью проникающего растворенного вещества можно удалить путем промывания через шесть объемов диафильтрации новым буферным раствором. Или процесс можно провести в прерывистом режиме, когда образец многократно разводят, а затем фильтруют до исходного объема, чтобы удалить или обменять соли или буферный раствор и, в итоге, сконцентрировать полипептид. Оборудование для диафильтрации и подробное описание методики его использования доступно, например, от компании "Pall Life Sciences"(Энн-Арбор, штат Мичиган) и "Sartorius AG/Vivascience" (Ганновер, Германия). В тангенциальной проточной фильтрации (ТПФ), также известной как "фильтрация в перекрестном потоке", тоже используется мембрана для ультрафильтрации. Жидкость, содержащая нужный полипептид, нагнетается по касательной к поверхности мембраны. Давление заставляет часть жидкости проходить сквозь мембрану, в то время как нужный полипептид задерживается над фильтром. Однако в отличие от стандартной ультрафильтрации остающиеся молекулы не накапливаются на поверхности мембраны, а уносятся тангенциальным потоком. Раствор, который не проходить через фильтр (содержащий нужный полипептид) можно многократно прогнать через мембрану, пока не будет достигнута нужная степень концентрации. Оборудование для ТПФ и подробные методики ее использования доступны, например, от компании "Millipore" (например, система ProFlux M12 Benchtop TFF и система Pellicon), "Pall Life Sciences" (например, система тангенциальной проточной фильтрации MinimTangential Flow Filtration system). Концентрацию белка измеряют несколькими путями, известными в данной области техники. К ним относятся, например, анализ аминокислот, поглощение при 280 нм, методики Брэдфорда и Лоури и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Самый точный метод - полный гидролиз с последующим анализом аминокислот с помощью ВЭЖХ, затем определяют концентрацию, а затем проводят сравнение с известной последовательностью доменного антитела. Хотя этот метод самый точный, он дорогостоящий и трудоемкий. Определение белка путем измерения УФ-поглощения при 280 нм - более быстрый и более дешевый метод, хотя лишь относительно точный и представляющий собой компромисс по сравнению с анализом аминокислот. Поглощение при 280 нм использовано для определения концентрации белка, приведенной в примерах в данном описании. Анализы на белок по методике Брэдфорда и Лоури (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254;Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275) сравнивают концентрацию белка в образце со стандартной кривой, чаще всего построенной для бычьего сывороточного альбумина (БСА). Эти методики менее точны, они могут давать заниженную концентрацию доменных антител. Однако их точность можно повысить, используя в качестве стандарта полипептид одного домена VH или V. Дополнительный метод количественного анализа белка, который можно использовать - это анализ с бицинхониновой кислотой, описанный в патенте США 4839295 (включен в данный документ путем ссылки) и продаваемый компанией "Pierce Biotechnology" (Рокфорд, штат Иллинойс) под названием"Анализ белка БСА" (например, в каталоге Пирса каталожный номер 23227). В электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия используется гель-электрофорез и окраска Кумасси синим в сравнении со стандартами известных концентраций, например, известных количеств доменного антитела. Количественный анализ можно провести на глаз или с помощью денситометрии. Доменные антитела, описанные в данном описании, сохраняют свою растворимость при высоких концентрациях (например, по меньшей мере, при 4,8 мг (400 мкмоль) в водном растворе (например,- 25024585 ФСБ), и В одном из аспектов изобретения, по меньшей мере, при 5 мг/мл (417 мкмоль), 10 мг/мл (833 мкмоль), 20 мг/мл (1,7 ммоль), 25 мг/мл (2,1 ммоль), 30 мг/мл (2,5 ммоль), 35 мг/мл (2,9 ммоль), 40 мг/мл (3,3 ммоль), 45 мг/мл (3,75 ммоль), 50 мг/мл (4,2 ммоль), 55 мг/мл (4,6 ммоль), 60 мг/мл (5,0 ммоль), 65 мг/мл (5,4 ммоль), 70 мг/мл (5,8 ммоль), 75 мг/мл (6,3 ммоль), 100 мг/мл (8,33 ммоль),150 мг/мл (12,5 ммоль), 200 мг/мл (16,7 ммоль), 240 мг/мл (20 ммоль) или выше). Одна структурная особенность, которая обеспечивает высокую растворимость - это относительно малый размер доменных антител. Полноразмерное традиционное четырехцепочечное антитело, например, IgG, имеет молекулярную массу 150 кД. В отличие от него доменные антитела, которые имеют общую структуру, включающую 4 каркасных участка и 3 CDR, имеют размер примерно 12 кД или менее 1/10 размера традиционного антитела. Так же доменные антитела по размеру составляют примерно половину от молекулы scFv(26 кД) и примерно одну пятую от размера молекулы Fab (60 кД). Размер структуры, содержащей доменное антитело, описанное в данном описании, может быть 100 кД или менее, включая структуры размером, например, примерно 90 кД или менее, 80 кД или менее, 70 кД или менее, 60 кД или менее, 50 кД или менее, 40 кД или менее, 30 кД или менее, 20 кД или менее, вплоть до и включая примерно 12 кД, или доменное антитело отдельно. Растворимость доменного антитела в основном определяется взаимодействиями аминокислотных цепей с окружающим растворителем. Гидрофобные боковые цепи обычно обращены внутрь полипептидных складок, в направлении от поверхности взаимодействия полипептида с растворителем. И наоборот, гидрофильные остатки обычно располагаются на границе взаимодействия полипептида с растворителем. Как правило, полипептиды, имеющие первичную последовательность, которая обеспечивает свертывание молекулы с обращением большего числа гидрофильных остатков в сторону водного окружения,более растворимы, чем те, которые свертываются с обращением в сторону поверхности менее числа гидрофильных остатков. Таким образом, организация и число гидрофобных и гидрофильных остатков являются важными факторами, определяющими растворимость. Другие факторы, которые определяют растворимость полипептидов, включают рН растворителя, температуру и ионную силу. В обычной практике растворимость полипептидов можно поддерживать или усиливать за счет добавления в раствор глицерина (например, 10% объема к объему). Как обсуждалось выше, в консервативных остатках человеческих доменов VH идентифицированы определенные аминокислотные остатки, которые отличаются в доменах VH верблюдовых, обычно более растворимых, чем человеческие домены VH. К ним относятся, например, Gly 44 (Glu у верблюдовых),Leu 45 (Arg у верблюдовых) и Тrр 47 (Gly у верблюдовых). Аминокислотный остаток в положении 103 вVH тоже играет предположительную роль в растворимости, при этом замена Trp на Arg ведет к повышенной растворимости. В некоторых аспектах, рассмотренных в данном описании, доменные антитела основаны на сегменте DP47 гена VH эмбрионального типа или сегменте DPK9 гена V эмбрионального типа. Таким образом,эти сегменты генов эмбрионального типа способны, особенно после диверсификации в выбранных структурных положениях, изложенных в данном описании, вырабатывать специфически связывающие доменные антитела, обладающие высокой растворимостью. В частности, четыре каркасных участка, которые В одном из аспектов изобретения не диверсифицированы, могут вносить свой вклад в высокую растворимость получающихся белков. Ожидается, что доменное антитело, которое имеет какой-либо процент идентичности с антителом,обладающим известной растворимостью, тоже будет хорошо растворимым. Таким образом, как один из путей предсказать или распознать, что данное доменное антитело будет иметь высокую растворимость,указанную в данном описании, можно сравнить последовательность доменного антитела с одним или несколькими доменными антителами с известной растворимостью. Таким образом, когда доменное антитело идентифицировано как имеющее высокую аффинность, но не известную растворимость, сравнение аминокислотной последовательности с последовательностью одного или нескольких (В одном из аспектов изобретения нескольких) доменных антител с известной растворимостью (например, последовательность дАт, описанная в данном описании) может помочь в предсказании его растворимости. В то время как такой путь не является абсолютно точным в плане прогнозирования, когда имеется высокая степень сходства с хорошо растворимой последовательностью, например, на 90-95% или более, и особенно когда имеется большое сходство в отношении гидрофильных аминокислотных остатков или остатков, которые с высокой вероятностью будут находиться на границе с растворителем, весьма вероятно, что вновь идентифицированный полипептид будет обладать растворимостью, схожей с растворимостью известной хорошо растворимой последовательности. Также для предсказания растворимости полипептидной последовательности по полипептиду с известной растворимостью можно использовать программу молекулярного моделирования. Например, замена или добавление гидрофобного остатка на поверхности, контактирующей с растворителем по сравнению с молекулой с известной растворимостью, которая имеет менее гидрофобных или даже гидрофильных остатков, находящихся в этих положениях, должны уменьшать относительную растворимость этого полипептида. Аналогично замена или добавление более гидрофильного остатка в таком положении должно увеличивать относительную растворимость. То есть, изменение числа гидрофильных или гидро- 26024585 фобных остатков, расположенных на поверхности молекулы (или общего характера гидрофобных или гидрофильных остатков, обращенных к поверхности) относительно структуры доменного антитела с известной растворимостью может предсказать относительную растворимость доменного антитела. Иначе, или вместе с таким предсказанием можно определить пределы растворимости доменного антитела просто путем концентрирования полипептида. 3.5. Определение аффинности. Выделенные полипептиды, содержащие доменное антитело, согласно описанию в данном описании, В одном из аспектов изобретения обладают аффинностью (константа диссоциации Kd = Koff/Kon), по меньшей мере, примерно 500 нмоль или менее, а в другом аспекте изобретения, по меньшей мере, примерно 400 нмоль-50 рМ, 300 нмоль-50 рМ, 200 нмоль - 50 пмоль, и еще а одном из аспектов изобретения,по меньшей мере, примерно 100 нмоль - 50 пмоль, 75 нмоль - 50 пмоль, 50 нмоль - 50 пмоль, 25 нмоль 50 пмоль, 10 нмоль - 50 пмоль, 5 нмоль - 50 пмоль, 1 нмоль - 50 пмоль, 950 пмоль - 50 пмоль, 900 пмоль 50 пмоль, 850 пмоль - 50 пмоль, 800 пмоль - 50 пмоль, 750 пмоль - 50 пмоль, 700 пмоль - 50 пмоль, 650 пмоль - 50 пмоль, 600 пмоль - 50 пмоль, 550 пмоль - 50 пмоль, 500 пмоль - 50 пмоль, 450 пмоль - 50 пмоль, 400 пмоль - 50 пмоль, 350 пмоль - 50 пмоль, 300 пмоль - 50 пмоль, 250 пмоль - 50 пмоль, 200 пмоль - 50 пмоль, 150 пмоль - 50 пмоль, 100 пмоль - 50 пмоль, 90 пмоль - 50 пмоль, 80 пмоль - 50 пмоль,70 пмоль - 50 пмоль, 60 пмоль - 50 пмоль, или даже менее вплоть до 50 пмоль. В другом варианте осуществления доменное антитело тормозит связывание CD28 с CD80 с IC50 в диапазоне от 1 пмоль до 1,5 мкмоль включительно; IC50 в отношении торможения связывания CD28 сCD80. IC50 может быть в диапазоне от 1 пмоль до 1 мкмоль, от 1 пмоль до 900 нмоль, от 1 пмоль до 800 нмоль, от 1 пмоль до 700 нмоль, от 1 пмоль до 600 нмоль, от 1 пмоль до 500 нмоль, от 1 пмоль до 400 нмоль, от 1 пмоль до 300 нмоль, от 1 пмоль до 200 нмоль, от 1 пмоль до 100 нмоль, от 1 пмоль до 50 нмоль, от 1 пмоль до 10 нмоль, от 1 пмоль до 1 нмоль, от 1 пмоль до 500 пмоль, от 1 пмоль до 100 пмоль,от 1 пмоль до 50 пмоль, от 1 пмоль до 10 пмоль, или от 1 пмоль до 5 пмоль. Дополнительные приемлемые диапазоны включают, например, от 50 пмоль до 1 мкмоль, от 100 пмоль до 500 нмоль, от 125 пмоль до 250 нмоль, от 150 пмоль до 200 нмоль, от 150 пмоль до 100 нмоль, и от 200 пмоль до 50 нмоль. В другом варианте осуществления доменное антитело тормозит связывание CD28 с CD86 с IC50 в диапазоне от 1 пмоль до 1,5 мкмоль включительно; IC50 в отношении торможения связывания CD28 сCD86. IC50 может быть в диапазоне от 1 пмоль до 1 мкмоль, от 1 пмоль до 900 нмоль, от 1 пмоль до 800 нмоль, от 1 пмоль до 700 нмоль, от 1 пмоль до 600 нмоль, от 1 пмоль до 500 нмоль, от 1 пмоль до 400 нмоль, от 1 пмоль до 300 нмоль, от 1 пмоль до 200 нмоль, от 1 пмоль до 100 нмоль, от 1 пмоль до 50 нмоль, от 1 пмоль до 10 нмоль, от 1 пмоль до 1 нмоль, от 1 пмоль до 500 пмоль, от 1 пмоль до 100 пмоль,от 1 пмоль до 50 пмоль, от 1 пмоль до 10 пмоль, или от 1 пмоль до 5 пмоль. Дополнительные приемлемые диапазоны включают, например, от 50 пмоль до 1 мкмоль, от 100 пмоль до 500 нмоль, от 125 пмоль до 250 нмоль, от 150 пмоль до 200 нмоль, от 150 пмоль до 100 нмоль, и от 200 пмоль до 50 нмоль. Антигенсвязывающая аффинность доменного антитела можно измерить удобным путем с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor; Пискатавей, штат Нью-Джерси). При этой методике антиген связывают с чипом BIAcore при известных концентрациях и вводят полипептиды вариабельного домена. Специфическое связывание между полипептидом вариабельного домена и иммобилизованным антигеном ведет к повышению концентрации белка на матрице чипа и изменению сигнала ППР. Изменения сигнала ППР записывают в виде единиц резонанса (RU) и отображают графически против времени вдоль оси Y сенсограммы. Базовый сигнал измеряют в присутствии только растворителя (например, ФСБ), проходящего через чип. Абсолютная разность между базовым сигналом и сигналом по окончании введения доменного антитела отражает значение связывания в данном образце. Для определения скорости диссоциации (Koff), скорости ассоциации(Kon) и константы диссоциации используется программа BIAcore для оценки кинетики (например, версия 2.1). Таким образом, ППР можно использовать для наблюдения антагонизма связывания CD28 с CD80 или CD86 со стороны доменного антитела путем измерения вытеснения или торможения связыванияCD28 с CD80 или CD86, обусловленного составом, содержащим одновалентное антитело. ППР также можно использовать для наблюдения димеризации, или, В одном из аспектов изобретения, отсутствия димеризации, происходящей с участием Fc-фрагмента в составе, содержащем антитело, как описано в данном описании. Высокая аффинность определяется комплементарностью между поверхностью антигена и CDR антитела или фрагмента антитела. Комплементарность определяется типом и силой молекулярных взаимодействий, возможных между частями мишени и CDR, например, возможных ионных взаимодействий,сил Ван-дер-Ваальса, водородных связей или других взаимодействий, которые могут произойти. CDR3 в большей мере участвует во взаимодействиях при связывании антигена, чем CDR 1 и 2, возможно, из-за большего общего размера, что создает больше возможностей, благоприятствующих поверхностным взаимодействиям. (См., например, Padlan et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 169-217; Chothia, Lesk (1987) J. Mol.Biol. 196: 904-917; и Chothia et al. (1985) J. Mol. Biol. 186: 651-663.) Высокая аффинность указывает на парное взаимодействие между доменным антителом и антигеном, которые обладают высокой степенью- 27024585 комплементарности, что прямо зависит от структур вариабельного домена и мишени. В одном из аспектов изобретения доменное антитело связывается с другим доменным антителом с образованием гетеродимера, в котором каждое отдельное антитело способно связывать отличающийся родственный антиген. Слияние доменных антител в гетеродимеры, где каждый мономер связывает разные антигены-мишени, может приводить к образованию лиганда с двойной специфичностью, способного, например, соединять мостиками соответствующие антигены-мишени. Такие лиганды с двойной специфичностью можно использовать для нацеливания на цитокины и другие молекулы, которые действуют синергетически в терапевтических ситуациях в живом организме. Таким образом, в данном описании описывается способ обеспечения синергетической активности двух или более цитокинов, заключающийся во введении гетеродимера антитела с двойной специфичностью, способного связывать два или более цитокинов. Доменные антитела, описанные в данном описании, включают клоны доменных антител, связывающие CD28, и клоны, обладающие достаточным сходством или процентом идентичности с теми, что тоже связывают антиген-мишень с высокой аффинностью. Согласно употреблению в данном описании"достаточное" сходство последовательности или идентичности означает по меньшей мере 70% сходства или идентичности. Дополнительной мерой идентичности или сходства является способность гибридизоваться в жестких условиях гибридизации. Таким образом, первая последовательность, кодирующая доменное антитело, достаточно схожа со второй кодирующей последовательностью, если первая последовательность гибридизуется со второй последовательностью (или комплементарной ей последовательностью) при жестких условиях гибридизации (таких как описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel,Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York). "Жесткие условия гибридизации" означают гибридизацию в 6 Х SSC при примерно 45 С с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2 Х SSC,0,1 % додецилсульфате натрия при 65 С. "Очень жесткие условия гибридизации" означают гибридизацию в 0,5 М фосфата натрия, 7 % додецилсульфате натрия при 65 С с последующим одним или несколькими промываниями в 0,2 Х SSC, 1 % додецилсульфате натрия при 65 С. В одном из вариантов осуществления доменные антитела включают: 4. Анализы активности CD28. В одном типичном варианте доменное антитело, согласно описанию в данном описании, связывается с CD28, но не вызывает достаточного агонизма передаче сигнала с участием CD28. Активация механизма с участием CD28 ведет к нескольким различным исходам, которые можно измерить, чтобы оценить эффект данного доменного антитела в отношении активности этого механизма. Однако для оценки функции доменных антител, описанных в данном описании, а в качестве антагонистов или агонистов,можно использовать, по меньшей мере, один из следующих анализов CD28. В одном из вариантов осуществления измеряют активацию Т-лимфоцитов. В этом анализе человеческие Т-лимфоциты, положительные на CD3, стимулируют антителом к CD3 и трансфицированным клетками СНО, экспрессирующими либо CD80, либо CD86. Это ведет к пролиферации Т-лимфоцитов, и этот процесс зависит от CD28, так как доменное антитело блокирует пролиферативный ответ. В другом варианте осуществления измеряют индукцию пролиферации Т-лимфоцитов и индукцию секреции цитокинов. Анализ включает стимуляцию человеческих Т-лимфоцитов, положительных наCD3, мАт 9.3. к CD28 (Gibson et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 7079-7083). Это ведет к увеличению передачи сигнала, опосредованной Т-лимфоцитами, и секреции цитокинов, и это процесс зависит от CD28,так как мАт 9.3 блокирует пролиферативный ответ. Секретирующиеся цитокины, которые можно измерить, включают, но не ограничиваются перечисленным, ГМ-КСФ, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10,ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-24, ТФР, ФНО-, ФНО-, ИФН-, ИФН-, ИФН-. Один или несколько таких цитокинов можно выявить и (или) измерить согласно описанию, приведенном в данном описании. Как издожено в других разделах данного описания, анализ активности CD28 также может включать оценку активности CTLA4. В частности, доменное антитело согласно настоящему описанию не тормозит ингибирование функций Т-лимфоцитов, опосредованное CTLA4, включая ингибирование передачи сигнала, опосредованное рецептором Т-лимфоцитов, ингибирование пролиферации Т-лимфоцитов и ингибирование секреции цитокинов. Из приведенного описания будет понятно, что доменные антитела, предложенные в нем, могут обладать несколькими функциями и видами активности и, следовательно, могут быть проанализированы несколькими различными путями. Как описано в других разделах данного документа, доменные антитела обладают множеством типичных характеристик (например, аффинностью связывания CD28, идентичностью домена CDR и аминокислотной последовательности, среди прочих) и, следовательно, каждое отдельное доменное антитело может быть охарактеризовано множеством путей и по многим показателям. Определение характеристик каждого доменного антитела, по отдельности или вместе с активностью и (или) свойствами связывания CD28 доменным антителом, может, в итоге, предоставить уникальные идентификационные характеристики доменного антитела. 5. Пегилирование доменных антител.- 28024585 Также настоящее изобретении относится к пегилированным доменным антителам, которые обладают увеличенным периодом полужизни и, В одном из аспектов изобретения, устойчивостью к разрушению без потери активности (например, аффинности связывания) по сравнению с непегилированными доменными антителами. И сайт-спецфическое, и случайное пегилирование белковых молекул известно в данной области техники (см., например, Zalipsky, Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) pp 347-370, Plenum, NY; Goodson, Katre (1990) Bio/Technology, 8: 343; Hershfield et al.(1991) PNAS 88: 7185). В частности, случайное пегилированое молекул антител описано в положениях,где расположены остатки лизина и тиолированные производные (Ling, Mattiasson (1983) Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al. (1987) Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et al. (1991) Cancer Res. 51: 4310;Delgado et al. (1996) Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley et al. (1994) Br. J. Cancer, 70: 1126). Соответственно доменные антитела согласно этому аспекту могут быть связаны с помощью методик, известных в данной области техники, с молекулами полимера (В одном из аспектов изобретения ПЭГ), полезным для достижения увеличенного периода полужизни и устойчивости к разрушению, входящим в объем настоящего изобретения. Полимерные группы, которые можно использовать, могут быть синтетическими или иметь естественное происхождение и включают, но не ограничиваются перечисленным, линейные или разветвленные полимеры полиалкилена, полиалкенилена или полиоксиалкилена, или разветвленные или неразветвленные полисахариды, такие как гомо- или гетерополисахариды. Примеры синтетических полимеров, которые можно использовать, включают линейные или разветвленные полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или поливиниловый спирт и их производные или замещенные формы. Полезные замещенные полимеры включают замещенный ПЭГ, включая метолксиполиэтиленгликоль. Полимерные группы естественного происхождения, которые можно использовать в рамках настоящего изобретения вдобавок к или вместо ПЭГ, включают лактозу, амилозу, декстран или гликоген, а также их производные, которые известны специалисту в данной области техники. Производные формы молекул полимеров, описанные в данном описании, включают, например, производные, которые имеют дополнительные группы или реакционно-способные группы, обеспечивающие взаимодействие с аминокислотным остатками доменных антител, описанных в данном описании. Такие производные включают активные эфиры N-гидроксилсукцинимида (NHS), полимеры сукцинимидилпропионата и сульфгидрил-селективные реакционно-способные агенты, такие как малеимид, винилсульфон и тиол. Производные полимеры включают, но не ограничиваются перечисленным, ПЭГ-полимеры, имеющие формулы: ПЭГ-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; ПЭГ-О-СН 2-NHS; ПЭГ-O-CH2CH2-CO2-NHS; ПЭГ-S-CH2CH2CO-NHS; ПЭГ-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; ПЭГ-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; и ПЭГ-O-CH2-CO2-NHS; где R (CH2)4)NHCO2(mPEG). ПЭГ-полимеры, предусмотренные в данном описании, могут быть линейными молекулами, или могут быть разветвленными, где несколько ПЭГ-групп присутствуют в виде одного полимера. Полезные производные ПЭГ включают, но не ограничиваются перечисленным, mPEG-MAL,mPEG2-MAL, mPEG-(MAL)2, многоцепочечный PEG, mPEG-SPA, mPEG2-NHS, и mPEG2-(MAL)2, проиллюстрированные ниже: