Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ К DICKKOPF-1 И/ИЛИ -4 В изобретении описаны антитела и фрагменты, которые обладают способностью связываться с белком-мишенью Dickkopf (DKK1), а также способы применения и наборы, предназначенные для лечения клетки-мишени, прежде всего клетки, ассоциированной с остеолитическим состоянием. 015538 Область применения Настоящее изобретение относится к композициям и способам применения антитела к Dickkopf-1(DKK1), антитела к Dickkopf-4 (DKK4) или их обоих для лечения связанных с DKK аномалий плотности костной ткани, метаболизма, диабета, различных форм рака и т.п. Предпосылки создания изобретения Путь передачи сигнала Wnt принимает участие в контроле эмбрионального развития и в неопластических процессах. Внеклеточные белки Wnt ответственны за рост и дифференцировку многих типов клеток, включая, в частности, рост, дифференцировку и регуляцию остеобластов, остеокластов и адипоцитов. Многие формы рака ассоциированы с костными тканями и могут приводить к остеобластическим(остеогенным) повреждениям, которые могут иметь место, например, при раке предстательной железы,или к остеолитическим повреждениям, которые могут иметь место при раке легкого, раке молочной железы и множественной миеломе (см., например, Tian и др., New England J. Med. 349, 2003, c. 2483-2494). Представители семейства генов Wnt кодируют секретируемые гликопротеины, необходимые для различных процессов развития (Fedi и др., J. Bio. Chem. 274, 1999, c. 19465-19472). Белки-представители семейства Wnt инициируют путь передачи сигнала, важный для роста и дифференцировки остеобластов,который приводит к отложению костной ткани. Помимо формирования костной ткани резорбция костной ткани является продолжением нормального процесса, осуществляемого клетками, которые называют остеокластами. В противоположность этому лиганд рецептора-активатора ядерного фактора-каппа B(RANKL) представляет собой конечный медиатор осуществляемой остеокластами резорбции костной ткани, при этом он играет основную роль в патогенезе постменопаузального остеопороза, а также в потере костной ткани, ассоциированной с ревматоидным артритом, метастатическим раком, множественной миеломой, терапией с использованием ингибиторов ароматазы и терапией, основанной на депривации андрогена (см., например, Lewiecki, Expert. Opin. Biol. Ther. 6, 2006, c. 1041-1050). Остеопротегрин(OPG), который экспрессируется остеобластами, ингибирует RANKL, снижая тем самым активность и формирование остеокластов. Баланс между анаболическим формированием костной ткани и аналитической резорбцией костной ткани регулирует нормальную плотность костной ткани, в повышение уровня одного или другого процесса снижает плотность костной ткани или приводит к повышенной потери костной ткани соответственно.Wnt связывается и проявляет действие через другие белки клеточной поверхности, и передача сигнала Wnt может принимать участие в неопластических процессах. Кроме того, генетические изменения могут воздействовать на комплекс клеточных белков, известный как аденоматозный полипозный коли, в котором участвует белок -катенин, и эти комплексы обнаружены в клетках пациентов, страдающих такими заболеваниями, как человеческий рак ободочной кишки, меланомы и печеночно-клеточные карциномы, что свидетельствует о том, что аберрации путей передачи сигнала Wnt ответственны за развитие указанных и возможно других типов рака у человека (Fedi и др., J. Bio. Chem. 274, 1999, c. 19465-19472). Известно по меньшей мере два семейства белков, которые ингибируют передачу сигнала Wnt, а именно семейство секретируемых белков, родственных белку Frizzle, и семейство белков Dickkopf(DKK). DKK-семейство по современным сведениям состоит из 4 представителей, а именно DKK1 (человеческая ДНК, рег. номер NM012242; PRT, рег. номер 094907), DKK2 (человеческая, рег. номерDKK1 представляет собой секретируемый ингибитор пути передачи сигнала Wnt/-катенина (см.,например, заявку на патент США 2005-0079173 на имя Niehrs; заявку на патент США 2004-0234515 на имя McCarthy). DKK1 обладает способностью ингибировать индуцируемую Wnt дупликацию оси, и генетический анализ свидетельствует о том, что DKK1 действует против хода пути передачи сигнала, ингибируя передачу сигнала Wnt. DKK1 также важен для развития скелета, что продемонстрировано по его воздействию на потерю костных структур в куриных и обезьяньих эмбрионах после их контакта с высокими уровнями DKK1 (Tian и др., New England J. Med. 349, 2003, c. 2483-2494). Повышенные уровни DKK1 в сыворотке ассоциированы с раком предстательной железы, а повышенные уровни DKK1 и RANKL в плазме костного мозга и периферической крови пациентов, страдающих множественной миеломой, ассоциированы с присутствием локальных повреждений костной ткани (см., например, Tian, 2003, OMIM, рег. номер 605189). DKK1 играет также роль в адипогенезе, хондрогенезе,пролиферации желудочно-кишечного эпителия, потере костной ткани, ассоциированной с ревматизмом,и инициации формирования волосяного фолликулярного плакода (OMIM, рег. номер 605189).DKK4 охарактеризован недостаточно полно, но, по-видимому, он также представляет собой секретируемый ингибитор Wnt-пути. Установлено, что DKK4 откладывается в бляшках пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, и экспрессируется в мышце. Роль Wnt в развитии мышечной ткани пока не известна, поэтому можно предположить, что DKK4 играет роль ингибитора развития мышечной ткани.-1 015538 Таким образом, существует необходимость в разработке композиций и способов лечения рака и аномальной плотности костной ткани, основанных на применении таких агентов, которые оказывают воздействие или нейтрализуют опосредуемое DKK1 и/или DKK4 антагонистическое воздействие на путь передачи сигнала Wnt. Краткое изложение сущности изобретения Вариантом осуществления настоящего изобретения является антитело или его антигенсвязывающий участок, который избирательно связывается и нейтрализует полипептид DKK1 и/или DKK4 или его фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой антитело, нейтрализующее DKK1/4. В различных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий участок антитела, нейтрализующего DKK1/4, не связывается с DKK2 или DKK3. В одном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок имеет иммуноглобулиноподобный каркас, такой как каркасный участок (остов), выбранный, например, из человеческого, гуманизированного, гуманированного, акульего, верблюжьего каркаса, и/или они могут представлять собой также рекомбинантные, химерные антитела или антитела с трансплантированнымиCDR. Например, под объем изобретения подпадает технология, направленная на минимизацию человеческого гуморального иммунного ответа на мышиное антитело (технология получения гуманированных антител, разработанная фирмой Kalobios, или технология получения гуманизированных антител, разработанная фирмой PDL). Кроме того, антигенсвязывающие участки, специфические для DKK1 или DKK4,могут присутствовать также и в структуре, не имеющей иммуноглобулиноподобного каркаса, включая,например, организацию в таких типах остовов, как аденектин, фибриноген, полученные из анкирина повторы и т.д. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к DKK1 отличается наличием антигенсвязывающего участка, специфического для белка-мишени DKK1, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с DKK1 или его фрагментом. Согласно родственному варианту осуществления изобретения антитело к DKK4 отличается наличием антигенсвязывающего участка, специфического для белка-мишени DKK4, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с DKK4 или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок связывается с полипептидом DKK1 и DKK4, но не связывается с полипептидом DKK2 или DKK3. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок является моноклональным. В следующем варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий участок является поликлональным. В различных вариантах осуществления изобретения антитело к DKK1 или его антигенсвязывающий участок связывается с пептидами, состоящими из 30 смежных аминокислот полипептида DKK1 или DKK4. В родственном варианте осуществления изобретения связывание DKK1 или DKK4 определяют по меньшей мере с помощью одного анализа, выбранного из группы, включающей анализ ингибирования антагонистического действия DKK1 или DKK4 в отношении транскрипции, обусловленной передачей сигнала Wnt; определение аффинности с помощью резонанса поверхностного плазмона, твердофазный иммуноферментный анализ связывания; основанный на электрохемилюминесценции анализ связывания;FMAT (анализ связывания, основанный на технологии флуорометрического микрообъемного анализа);SET (уравновешивающее титрование раствора); SPR (резонанс поверхностного плазмона); ALP, TopFlash, определение в сыворотке крови концентрации биомаркеров, таких как остеокальцин (OCN), нитрогенный пропептид проколлагена типа 1 (P1NP) и остеопротегерин (OPG), и определение связывания с рецептором(ами), расположенным(и) на клеточной поверхности, такими как Frizzled (Fz), LRP (LRP5/6) или Kremen (Krm). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к DKK1 или его антигенсвязывающий участок обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: селективность в отношении DKK1, которая по меньшей мере в 103, 104 или 105 раз выше, чем в отношении человеческогоDKK2 или DKK3; связывание с DKK1 или DKK4, характеризующее значением Kon (константа ассоциации) менее 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 1,0 нМ, 500 пМ, 100 пМ, 50 пМ или 10 пМ; и имеет скорость диссоциации с DKK1 менее 10-2, 10-3, 10-4 или 10-5 с-1. В родственном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, конкурирует с DKK1 и/или DKK4 за связывание с LRP5/6. В родственном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, конкурирует с DKK1 и/или DKK4 за связывание с Krm. Еще одним вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок любого из указанных выше антител или функциональных фрагментов этих антител и их аминокислотные последовательности. Таким образом, конкретными вариантами осуществления изобретения являются выделенные аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ IDNO: 2-20 и 40-72 и консервативные или гуманированные варианты указанных последовательностей. Кроме того, конкретными дополнительными вариантами осуществления изобретения являются аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2-20, 65-72 и консервативные или гуманированные варианты указанных последовательностей, которые являются выделенными антигенсвязывающими участками, каждый из которых представляет собой H-CDR3.-2 015538 В родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой H-CDR2-участок, аминокислотная последовательность которого выбрана из SEQ IDNO: 2-20, 57-64 их консервативных или гуманированных вариантов. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой консенсусный H-CDR2-участок, последовательность которого выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 40,имеющей аминокислотную последовательность GISGSGSYTYYADSVKF, SEQ ID NO: 41, имеющей аминокислотную последовательность GISYYGGNTYYADSVKF, и SEQ ID NO: 42, имеющей аминокислотную последовательность GISYYGGSTYYADSVKF, и консервативных или гуманированных вариантов аминокислотных остатков указанных последовательностей. Конкретным вариантом осуществления изобретения является новая последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56 и их консервативных или гуманированных вариантах, которые содержат выделенный антигенсвязывающий участок, представляющий собой H-CDR1-участок. В родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой консенсусный H-CDR1-участок, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности (указанные в виде однобуквенного кода аминокислот) GFTFSSYGMT (SEQ ID NO: 43), GFTFNSYGMT (SEQ ID NO: 44),GFTFSNYGMT (SEQ ID NO: 45), GFTFSSYWMT (SEQ ID NO: 46), GFTFSSYAMT (SEQ ID NO: 47),GFTFSSYGMS (SEQ ID NO: 48) и консервативные или гуманированные варианты любой из указанных последовательностей. Другим вариантом осуществления изобретения являются аминокислотные последовательности,представляющие собой выделенные антигенсвязывающие участки, которые несут L-CDR3-участок, указанные аминокислотные последовательности выбраны из SEQ ID NO: 21-39, 89-96 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой L-CDR1-участок,аминокислотная последовательность которого выбрана из SEQ ID NO: 21-39, 73-80 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой L-CDR2 участок, аминокислотная последовательность которого выбрана из SEQ ID NO: 21-39, 81-88 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. В конкретных вариантах осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21-39 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 97-103. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность, и консервативные или гуманированные варианты указанных кодируемых аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения любая нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 97100, кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения любая нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 101-103, кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. Согласно другому родственному варианту осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей дополнительно оптимизируют для экспрессии в клетке. Предпочтительными клетками являются (но не ограничиваясь только ими), например,клетки китайского хомячка (например, CHO-клетки), клетки бакуловирусов, дрожжей, бактерий, миеломы и/или H. sapiens. Предпочтительно последовательности оптимизируют для экспрессии и для получения и клинического применения. Для клинического применения подлежащими оптимизации характеристиками являются (но не ограничиваясь только ими), например, время полужизни, фармакокинетические (ФК) параметры, антигенность, эффекторная функция, клиренс FcRn и ответ пациента, включая антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность(CDC). Следующим вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы,включающей SEQ ID NO: 101-103. Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 97-100. Еще одним родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 97-100, и тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 101-103.-3 015538 Конкретным вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность,выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 104-110. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность, и консервативные или гуманированные варианты указанных аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения каждая из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 104-107 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения каждая из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 108-110 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. В следующем родственном варианте осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 108-110. Другим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 104-107. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 104-107, и тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 108-110. Другим вариантом осуществления изобретения является аминокислотная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 111-117 и консервативные варианты указанных последовательностей. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из SEQ ID NO: 111-114 обозначает антигенсвязывающую легкую цепь. В другом варианте осуществления изобретения каждая из SEQID NO: 115-117 обозначает антигенсвязывающую тяжелую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения аминокислотную последовательность оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы,включающей SEQ ID NO: 115-117, а также консервативные варианты указанных последовательностей. Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 111-114, а также консервативные варианты указанных последовательностей. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115-117, а также консервативные варианты указанных последовательностей, и легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQID NO: 111-114, а также консервативные варианты указанных последовательностей. Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 120, 121, и/или выделенный антигенсвязывающий участок,содержащий вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи, кодируемую соответствующими нуклеотидными последовательностями. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность, и консервативные или гуманированные варианты указанных аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 120 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. Еще в одном родственном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 121 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. В следующем родственном варианте осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей дополнительно оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения. Конкретным вариантом осуществления изобретения является аминокислотная последовательность,выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 118, 119 и консервативных или гуманированных вариантов этих последовательностей. Родственным вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающая вариабельная область легкой цепи, представленная в SEQ ID NO: 118. Другим родственным вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающая вариабельная область тяжелой цепи, представленная в SEQ ID NO: 119. В следующем родственном варианте осуществления изобретения аминокислотную последовательностей оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения. В других вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% CDR-участкам, представленным в SEQ ID NO: 239. В родственном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ IDNO: 111-120. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная-4 015538 последовательность, идентичная по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 97-110 и 120, 121. В конкретном варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных выделенных антител представляет собой IgG. В родственном варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных выделенных антител представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой IgE, IgM, IgD или IgA. Родственным вариантом осуществления изобретения является композиция моноклонального или поликлонального антитела. В следующих вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой химерное, гуманизированное, гуманированное, рекомбинантное антитело и др. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное человеческое или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, антигенсвязывающий участок которого является специфическим в отношении эпитопа DKK1, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с DKK1 или DKK4 или в другом варианте блокирует связывание DKK1 или DKK4 с рецептором, находящимся на клеточной поверхности (например, с такими рецепторами, как LRP5/6, Kremen, Frizzled). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент обладает способностью предупреждать, лечить или уменьшать интенсивность развития остеолитических повреждений. В других вариантах осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, которая содержит антитело к DKK, обладает способностью предупреждать, лечить или уменьшать интенсивность ассоциированного с DKK1 или DKK4 рака или другого заболевания. Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенное человеческое или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, антигенсвязывающий участок которого является специфическим в отношении эпитопа-мишени DKK1 или DKK4, и эпитоп содержит 6 или большее количество аминокислотных остатков полипептидного фрагмента, содержащего домены CYS1 линкер-CYS2 DKK1 и/или DKK4. В родственном варианте осуществления изобретения эпитоп представляет собой конформационный эпитоп. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпитоп локализован в CYS2-домене. В конкретном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит модифицированный аминокислотный остаток. В родственном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит по меньшей мере один гликозилированный аминокислотный остаток. Функциональные фрагменты представляют собой Fv- и Fab-фрагменты (включая одноцепочечные версии, такие как scFv), а также другие антигенсвязывающие участки антитела, включая участки, сцепленные с неиммуноглобулиновым каркасом и состоящими только из тяжелых цепей антителами, такими как верблюжьи и акульи антитела и нанотела. В родственном варианте осуществления изобретения выделенное описанное выше антитело представляет собой IgG. В другом родственном варианте осуществления изобретения описанное выше выделенное антитело представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой IgE, IgM или IgA. Родственным вариантом осуществления изобретения является композиция поликлонального антитела. Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно из любых указанных выше антител или функциональных фрагментов или консервативных вариантов и фармацевтически приемлемый носитель или экспициент. Еще одним вариантом осуществления изобретения является трансгенное животное, несущее ген,который кодирует указанные выше антитела или их функциональные фрагменты. Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ лечения нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессией DKK1 или DKK4. В контексте настоящего описания понятия"ассоциированные с DKK1 заболевания" или "ассоциированные с DKK4 заболевания" включают (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения - прежде всего остеолитические повреждения,ассоциированные в миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани,ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (HCC), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную атрофию, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос. Способ заключается в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в эффективном количестве любую из указанных выше фармацевтических композиций. В родственном варианте осуществления изобретения подлежащее лечению нарушение или состояние представляет собой аномальную плотность костной ткани. В другом родственном варианте осуществления изобретения подлежащая лечению аномальная плотность костной ткани представляет собой наличие остеолитического повреждения у индивидуума. В другом варианте осуществления изобретения подлежащее лечению нарушение или состояние представляет собой остеопорозное состояние, такое как остеолитическое повреждение, ассоциированное с раком. В родственном варианте осуществления изобретения подлежащий лечению рак представляет собой миелому, например множественную миелому, или рак костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной-5 015538 железы или поджелудочной железы или его метастазы. В других вариантах осуществления изобретения остеопорозное состояние представляет собой остеопороз, или остеопению, или остеосаркому. В конкретных вариантах осуществления изобретения любой из указанных выше способов предусматривает также введение химиотерапевтического агента. В родственном варианте осуществления изобретения химиотерапевтический агент представляет собой противораковый агент. В другом родственном варианте осуществления изобретения химиотерапевтический агент представляет собой антиостеопорозный агент. Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ лечения клетки-мишени, который заключается в том, что блокируют взаимодействие DKK1 или DKK4 с клеткой с помощью любого из указанных выше антител или их функциональных фрагментов. В целом клетка-мишень содержит рецептор, с которым связывается DKK1 или DKK4. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-мишень представляет собой остеобласт, при этом лечение с использованием композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемой в изобретении, должно усиливать пролиферацию и стимулировать формирование костной ткани. В другом варианте осуществления изобретения клетка-мишень представляет собой мышечную клетку, при этом лечение должно противодействовать мышечной атрофии. В родственном варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает то,что пациента, в организме которого присутствуют клетки-мишени, лечат химиотерапевтическим агентом или облучением. В родственном варианте осуществления изобретения в любом из указанных выше способов после введения или приведения с контакт дополнительно предусматривается обнаружение уменьшения интенсивности или замедление развития остеолитического повреждения. Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ выявления DKK1 или DKK4 в сыворотке. Указанный способ заключается в том, что выявляют DKK1 или DKK4 с помощью любого из вышеуказанных антител или фрагментов антител, дополнительно содержащих выявляемую метку. Метка представляет собой радиоактивную, флуоресцентную, магнитную, парамагнитную или хемилюминесцентную метку. В другом варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных человеческих или гуманизированных антител или фрагментов антител является синтетическим. Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая любое из вышеуказанных антител или функциональных фрагментов этих антител и дополнительный терапевтический агент. Дополнительный терапевтический агент можно выбирать из группы,включающей противораковый агент; антиостеопорозный агент; антибиотик; антиметаболический агент; антидиабетический агент; противовоспалительный агент; антиангиогенный агент; фактор роста и цитокин. Изобретение относится также к способу предупреждения или лечения пролиферативных болезней или таких заболеваний, как рак, у млекопитающего, прежде всего у человека, с помощью комбинации фармацевтических агентов, включающей:(б) одно или несколько фармацевтических действующих веществ; где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей:(б) фармацевтическое действующее вещество и(в) фармацевтически приемлемый носитель; где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент. Настоящее изобретение относится также к поступающей в продажу упаковке или продукту, которые содержат:(а) фармацевтический препарат нейтрализующего антитела к DKK1/4 и(б) фармацевтический препарат фармацевтического действующего вещества для одновременного,сопутствующего, раздельного или последовательного применения; где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент. Конкретным вариантом осуществления изобретения является антитело, которое имеет первую аминокислотную последовательность, представляющую собой тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 220, и последовательность, которая идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности CDR-участков, где CDR-участки имеют последовательность, представленную в SEQID NO: 2-20; и вторую аминокислотную последовательность, представляющую собой легкую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 21-39, и последовательность, которая идентична по меньшей мере на 60, 70, 80,90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности CDR-участков, где CDR-участки имеют последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21-39.-6 015538 И еще одним вариантом осуществления изобретения является иммуноконъюгат, состоящий из первого компонента, который представляет собой антитело или его фрагмент, как они описаны выше, и второй компонент, имеющий вторую аминокислотную последовательность. Например, иммуноконъюгат представляет собой цитотоксин, или иммуноконъюгат представляет собой связывающий белок или антитело, которое обладает специфичностью к связыванию с мишенью, отличной от DKK1 или DKK4. Например, мишенью для специфического связывания, отличной от DKK1 или DKK4, является опухолевый антиген или ассоциированный с опухолью белок, находящийся на поверхности раковой клетки. В конкретных вариантах осуществления изобретения любое из описанных выше антител представляет собой биспецифическое антитело. Другим вариантом осуществления изобретения является набор, в состав которого входят любые указанные выше антитела или фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор содержит также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В других родственных вариантах осуществления изобретения любое из входящих в состав набора вышеуказанных антител присутствует в виде стандартной дозы. В другом варианте осуществления изобретения набор представляет собой диагностический набор для ELISA. В родственном варианте осуществления изобретения набор содержит инструкции по применению любого из вышеуказанных антител для введения индивидууму. Краткое описание чертежей На чертежах показано: на фиг. 1 - график, на котором продемонстрирована несущественная потеря меченного с помощьюHis-Strep DKK1 из гранул, покрытых Strep-Tactin, выявленная при сравнении неотмытых гранул с гранулами после отмывки HuCAL в условиях различной строгости; на фиг. 2 - столбиковая диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа активности Wnt с использованием 100 мкл реагента, представляющего собой Bright-Glo-люциферазу, который проводили согласно методу, описанному в примере 3; на фиг. 3 - график, иллюстрирующий результаты, полученные с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Флуоресценцию оценивают с помощью планшет-ридера типа TECANSpectrafluor и результаты представляют в виде кривых связывания; на фиг. 4 - график, иллюстрирующий результаты стандартного Wnt3a-зависимого TCF/LEF lucрепортерного анализа, описанного в примере 6; на фиг. 5 - график, иллюстрирующий результаты, полученные с помощью усовершенствованной версии TCF/LEF luc-репортерного анализа, которые свидетельствуют о значительно повышенной чувствительности к DKK1, опосредуемой совместной экспрессией с корецептором белка Kremen; на фиг. 6 А - график, иллюстрирующий результаты анализа связывания антитела к DKK1/4 с DKK1,проведенного методом резонанса поверхностного плазмона; на фиг. 6 Б - таблица рассчитанных значений аффинности к связыванию и кинетических данных; на фиг. 7 А - схематическое изображение полноразмерного и укороченного DKK1 для применения в картировании эпитопов; на фиг. 7 Б - данные о связывании антитела, предлагаемого в изобретении, с белками и фрагментамиDKK1, представленными на фиг. 7 А; на фиг. 8 - график, иллюстрирующий связывание антитела к DKK1/4 по данным конкурентногоELISA; на фиг. 9 - график, иллюстрирующий ассоциированную с антителом к DKK1/4 реактивацию регулируемой Wnt транскрипции гена, расположенного по ходу пути (передачи сигнала); на фиг. 10 - график, иллюстрирующий, что антитело к DKK1/4 аннулирует ингибируемую DKK1 секрецию ALP; на фиг. 11 - график, иллюстрирующий воздействие антитела к DKK1/4 на ксенотрансплантаты invivo; на фиг. 12 - график, иллюстрирующий ассоциированное с антителом к DKK1/4 увеличение плотности костной ткани in vivo; на фиг. 13 - график, на котором приведено сопоставление антиостеолитической эффективностиZometa и антитела к DKK1/4; на фиг. 14 - график, иллюстрирующий зависимость от дозы эффективности антитела к DKK1/4 в отношении анаболизма костной ткани.-7 015538 Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к выделенным антителам к DKK1/4, прежде всего человеческим антителам, которые специфически связываются с DKK1 или DKK4 и ингибируют функциональные свойства DKK1 или DKK4. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к DKK1/4 не обладает специфической способностью к связыванию с DKK2 или DKK3. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, выведены из конкретных последовательностей тяжелых и легких цепей и/или содержат конкретные структурные особенности, такие какCDR-участки, содержащие конкретные аминокислотные последовательности. Изобретение относится к выделенным антителам, способам получения указанных антител, иммуноконъюгатов и биспецифических молекул, которые содержат указанные антитела, и к фармацевтическим композициям, содержащим антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы, предлагаемые в изобретении. Изобретение относится также к способам применения антител для ингибирования нарушения или состояния, ассоциированного с DKK1 или DKK4. Соответствующие заболевания и нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения, прежде всего остеолитические повреждения,ассоциированные в миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани,ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (HCC), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную атрофию,болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос. С целью лучшего понимания настоящего изобретения сначала приведены определения некоторых понятий. Дополнительные понятия будут разъяснены при подробном описании изобретения. Понятие "иммунный ответ" относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), результатом которого является избирательное повреждение, деструкция или элиминация из организма-хозяина внедряющихся патогенов,клеток или тканей, зараженных патогенами, раковых клеток, или, как в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, здоровых человеческих клеток или тканей. Понятие "путь трансдукции сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между различными молекулами трансдукции сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. В контексте настоящего описания фраза "рецептор клеточной поверхности (рецептор,расположенный на поверхности клетки)" включает, например, молекулы и комплексы молекул, которые обладают способностью получать сигнал и обладают способностью передавать указанный сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером "рецептора клеточной поверхности" в контексте настоящего описания является рецептор, с которым связывается молекула белка DKK1 или DKK4. К таким рецепторам клеточной поверхности относятся (но не ограничиваясь только ими) Frizzled (Fz), LRP (LRP5 иLRP6) и Kremen (Krm). В контексте настоящего описания понятие "антитело" относится к поликлональным антителам, моноклональным антителам, гуманизированным антителам, одноцепочечным антителам и их фрагментам,таким как Fab, F(ab')2, Fv и другие фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию родительского антитела. Само по себе понятие "антитело" может относиться к иммуноглобулину, или гликопротеину, или их фрагменту, или участку, или к конструкции, содержащей антигенсвязывающий участок, который находится в модифицированном иммуноглобулиноподобном каркасе, или к антигенсвязывающему участку, который находится в конструкции, имеющей остов или каркас не иммуноглобулинового типа. В контексте настоящего описания понятие "моноклональное антитело" относится к композиции антитела, содержащей гомогенную популяцию антител. Понятие не ограничено видами или источниками антитела, также подразумевается, что понятие не ограничено методом его получения. Под понятие подпадают полные иммуноглобулины, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2, Fv и другие, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию антитела. В контексте настоящего изобретения можно использовать моноклональные антитела из любых видов млекопитающих. Однако на практике антитела,как правило, представляют собой крысиные или мышиные антитела благодаря доступности линий крысиных или мышиных клеток, которые можно применять для создания требуемых гибридных клеточных линий или гибридом, которые применяют для получения моноклональных антител. В контексте настоящего описания понятие "поликлональное антитело" относится к композиции антитела, содержащей гетерогенную популяцию антител. Поликлональные антитела часто получают из объединенной сыворотки, полученной из организма иммунизированных животных или отобранных людей. В контексте настоящего описания понятие "одноцепочечные антитела" относится к антителам, полученным путем определения связывающих доменов (и легких, и тяжелых цепей) связывающегося антитела и введения сцепляющего фрагмента, который обеспечивает сохранение связывающей функции. Эти формы, в сущности, представляют собой радикально сокращенное антитело, которое несет только часть-8 015538 вариабельной области, необходимой для связывания с антигеном. Определение и конструирование одноцепочечных антител описано в US 4946778 на имя Ladner и др."Встречающееся в естественных условиях антитело" представляет собой гликопротеин, который содержит по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная области тяжелой цепи состоит из трех доменов, т.е. CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как VL) и константной области легкой цепи. Константная области легкой цепи состоит из одного домена, т.е. CL.VH- и VL-области можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, которые называют гипервариабельными участками (CDR), которые перемежаются с более консервативными участками, которые называют каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR,которые в направлении от аминоконца к карбоксильному концу расположены в следующем порядке:FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (Clq) классической системы комплемента. Понятие "антигенсвязывающий участок" антитела (или просто "антигенный центр" ("область детерминанты" в контексте настоящего описания относится к белковой последовательности, которая связывается с мишенью, например, представляет собой один или несколько CDR. Понятие относится, например, к полноразмерному антителу, одному или нескольким фрагментам антитела и/или CDR на каркасе не иммуноглобулинового типа, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, DKK1). Антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться посредством фрагментов полноразмерного антитела. Примерами связывающихся фрагментов, подпадающих под понятие "антигенсвязывающий участок" антитела, являются Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; F(ab)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двухFab-фрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Fd-фрагмент, состоящий из(Ward и др., Nature, 341, 1989, c. 544-546), который состоит из VH-домена; и выделенный гипервариабельный участок (CDR). В контексте настоящего описания понятие "антиген" или "эпитоп" используют взаимозаменяемо, и они относятся к полипептидной последовательности на белке-мишени, которая специфически распознается антигенсвязывающим участком антитела, фрагмента антитела или их эквивалентами. Антиген или эпитоп содержат по меньшей мере 6 аминокислот, которые могут быть смежными или несмежными в последовательности-мишени. Конформационный эпитоп может содержать несмежные остатки и необязательно может содержать встречающиеся в естественных условиях или синтетическим путем модифицированные аминокислотные остатки. Модификации остатков включают (но не ограничиваясь ими): фосфорилирование, гликозилирование, ПЭГилирование, убикитинизацию, фуранилизирование и т.п. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, т.е. VL и VH, кодируются различными генами, их можно соединять с помощью методов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет создавать из них одну белковую цепь, в которой пара VL- и VH-областей формирует одновалентные молекулы, известные под названием одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (см., например, Bird и др., Science 242, 1988,c. 423-426; Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, c. 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подпадают под понятие "антигенсвязывающий участок" антитела. Указанные фрагменты антитела получают с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении возможности их применения, аналогичного применению интактных антител. Как указано в настоящем описании, консервативные варианты включают идентифицированные аминокислотные остатки в любой последовательности, прежде всего консервативные замены, которые хорошо известны обычному специалисту в области конструирования белков. Понятие "выделенное антитело" в контексте настоящего описания относится к антителу, которое практически свободно от других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с DKK1, практически свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от DKK1). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с DKK1, может давать перекрестную реакцию с другими антигенами, такими как молекулы DKK1 из других видов или представители другого семейства, такого как DKK4, или родственные паралоги. Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. Подразумевается, что понятие "человеческое антитело" в контексте настоящего описания относится к антителам, несущим вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-участки выведены из последовательностей человеческого происхождения. Кроме того, если антитело содержит константную-9 015538 область, то константную область также выводят из таких человеческих последовательностей, например из последовательностей человеческой зародышевой линии или мутантных версий последовательностей человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать также аминокислотные остатки, которые не кодируются человеческими последовательностями (например, в результате мутаций, интродуцированных путем случайного или сайт-направленного мутагенеза invitro или соматической мутации in vivo). Однако не подразумевается, что понятие "человеческое антитело" в контексте настоящего описания относится к антителам, в которых последовательности CDR, выведенные из зародышевой линии других млекопитающих, таких как мышь, трансплантированы в человеческие последовательности каркасных участков. Понятие "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, которые обладают одинаковой специфичностью связывания, имеют вариабельные области, в которых как каркасные участки, так и CDR-участки выводят из человеческих последовательностей. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает B-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека,например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой. В контексте настоящего описания понятие "гуманизированные антитела" означает, что по меньшей мере часть каркасных участков иммуноглобулина выведена из человеческих последовательностей иммуноглобулина. "Гуманизированные" антитела представляют собой антитела, CDR-последовательности которых выведены из зародышевой линии других видов, прежде всего видов млекопитающих, например мыши, которые трансплантированы в последовательности человеческих каркасных участков. Примером такой технологии является технология гуманизации, разработанная фирмой PDL. В контексте настоящего описания понятие "гуманированные антитела" относится к антителам, которые связываются с тем же эпитопом, но отличаются их последовательностью. Примером такой технологии является получение гуманированных антител с помощью технологии гуманирования, разработанной фирмой Kalobios, при использовании которой антигенсвязывающий участок получают, например, с помощью мутации, а не с помощью консервативных аминокислотных замен. Понятие "рекомбинантное человеческое антитело" в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например к антителам, выделенным из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным благодаря интродукции генов человеческого иммуноглобулина, или полученным из гибридомы, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированного с целью экспрессии человеческого антитела, например, с использованием трансфектомы, к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и к антителам,полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими путями, которые включают сплайсинг последовательности всего гена человеческого иммуноглобулина или его части посредством лигирования с другими последовательностями ДНК. Указанные рекомбинантные человеческие антитела несут вариабельные области, в которых каркасные и CDR-участки выводят из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения указанные рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу in vitro(или, когда для получения человеческих последовательностей Ig используют трансгенных животных,соматическому мутагенезу in vivo), и в результате аминокислотные последовательности VH- и VLобластей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя и выведены и являются родственными последовательностям VH и VL человеческой зародышевой линии, могут не встречаться в естественных условиях в популяции антител человеческой зародышевой линии in vivo. В контексте настоящего описания понятие "изотип" относится к классу антител (например, IgA,IgD, IgM, IgE, IgG, такому как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфическое в отношении антигена" в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо с понятием "антитело, которое специфически связывается с антигеном". В контексте настоящего описания антитело, которое "специфически связывается с человеческим DKK1", означает антитело, связывание которого с человеческим DKK1 характеризуется значением KD, составляющим 510-9 М или менее, 210-9 М или менее либо 110-10 М или менее. Антитело, которое "дает перекрестную реакцию с антигеном, отличным от человеческого DKK1",означает антитело, связывание которого с антигеном характеризуется значением KD, составляющим 510-8 М или менее, 510-9 М или менее либо 210-9 М или менее. Антитело, которое "не дает перекрестную реакцию с конкретным антигеном", означает антитело, связывание которого с антигеном характеризуется значением KD, составляющим 1,510-8 М или более, или значением KD, составляющим 5-1010-8 М или 110-7 М или более. В конкретных вариантах осуществления изобретения те антитела, которые не дают перекрестную реакцию с антигеном, представляют собой антитела, которые характеризуются практически не выявляемым связыванием с указанными белками при оценке с помощью стандартных анализов связывания.- 10015538 В контексте настоящего описания антитело, которое "ингибирует связывание DKK1 с рецептором клеточной поверхности", таким как LRP, Fz или Krm, относится к антителу, ингибирование которым связывания DKK1 с рецептором, характеризуется значением KD, составляющим 1 нМ или менее, 0,75 нМ или менее, 0,5 нМ или менее либо 0,25 нМ или менее. В контексте настоящего описания понятие "остеолиз" относится к снижению плотности костной ткани, что является результатом различных механизмов действия, включая, например, пониженную активность остеобластов, повышенную активность остеокластов. Таким образом, остеолиз обусловлен механизмами, которые в целом воздействуют на плотность минерального вещества костной ткани. В контексте настоящего описания подразумевается, что антитело, которое "ингибирует остеолитическую активность", относится к антителу, которое ингибирует снижение плотности костной ткани либо путем усиления формирования костной ткани, либо путем блокирования резорбции костной ткани. Подразумевается, что понятие "Kassoc" или "Ka" в контексте настоящего описания относится к скорости ассоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена, а понятие "Kdis" или "Kd" в контексте настоящего описания относится к скорости диссоциации взаимодействия конкретного антителаантигена. В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие "KD" относится к константе диссоциации, которую получают на основе соотношения Kd и Ka (т.е. Kd/Ka) и выражают в молярной концентрации (M). Значения KD для антител можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области. Метод определения значения KD антитела представляет собой метод, основанный на резонансе поверхностного плазмона, FMAT, или метод, основанный на применении биосенсорной системы, такой как система Biacore. В контексте настоящего описания понятие "аффинность" относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в индивидуальных антигенных сайтах. В каждом антигенном сайте вариабельная область "плеча" антитела взаимодействует через слабые нековалентные силы с антигеном в многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность. В контексте настоящего описания понятие "авидность" относится к информативному критерию общей стабильности или силе комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью антитела к эпитопу; валентностью и антигена, и антитела; и структурной организацией взаимодействующих участков. В конечном счете эти факторы определяют специфичность антитела,т.е. вероятность того, что конкретное антитело связывается с определенным антигенным эпитопом. Для получения зонда, обладающего большей авидностью, можно конструировать димерный конъюгат (две молекулы JWJ-1, сшитые с FACS-маркером), создавая тем самым обладающие низкой аффинностью взаимодействия (как в случае зародышевой линии антитела), которые легче выявлять с помощьюFACS. Кроме того, другие методы повышения авидности антигенного связывания предусматривают создание димеров или мультимеров любой из представленных в настоящем описании содержащих фибронектин конструкций антител к DKK1 или DKK4. Указанные мультимеры можно создавать, осуществляя ковалентное связывание между индивидуальными модулями, например, путем имитации встречающегося в естественных условиях связывания C-конца с N-концом или путем имитации димеров антител, которые объединяются друг с другом через их константные области. Связи, создаваемые на границе разделаFc/Fc, могут быть ковалентными или нековалентными. Кроме того, в гибридах DKK1 или DKK4 можно использовать партнеров для димеризации или мультимеризации, отличных от Fc, для создания структур более высокого порядка. В контексте настоящего описания понятие "перекрестная реактивность" относится к антителу или популяции антител, которые связываются с эпитопами на других антигенах. Это может быть обусловлено либо низкой авидностью или низкой специфичностью, либо наличием множества различных антигенов, которые имеют одинаковые или очень сходные эпитопы. Иногда перекрестная реактивность является желательной, когда существует потребность в общем связывании с родственной группой антигенов или при попытке осуществления мечения скрещивающихся видов (кросс-видов), когда последовательность антигенного эпитопа в процессе эволюции не приобретает высокую консервативность. В контексте настоящего описания понятие "высокая аффинность" или "высокая специфичность" касательно антитела изотипа IgG относится к антителу, для которого значение KD в отношении антигенамишени составляет 10-8 М или менее, 10-9 М или менее либо 10-10 М или менее. Однако "высокая аффинность" связывания может быть иной для других изотипов антител. Например, "высокая аффинность" связывания касательно изотипа IgM относится к антителу, для которого значение KD составляет 10-7 М или менее или 10-8 М или менее. В контексте настоящего описания понятие "индивидуум" относится к любому человеку или животному кроме человека. Понятие "животное кроме человека" включает всех позвоночных животных, например млекопитающих и животных, не относящихся к млекопитающим, таких как приматы кроме человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д. В контексте настоящего описания понятие "оптимизированная" означает, что нуклеотидная последовательность изменена в отношении кодирования аминокислотной последовательности с помощью кодонов, предпочтительных для продуктивных клеток или организмов, и/или нуклеотидная последователь- 11015538 ность изменена для удаления скрытых донорских или акцепторных сайтов сплайсинга. Таблицы оптимизированных кодонов хорошо известны в данной области для широкого разнообразия видов. Последовательности донорских или акцепторных сайтов сплайсинга также известны в данной области, а скрытые сайты сплайсинга можно идентифицировать, например, анализируя данные о транскрипции или экспрессии. Продуктивные клетки включают (но не ограничиваясь ими) прокариотические клетки, такие как,например, клетки бакуловирусов или бактерий (E.coli), или эукариотические клетки, например клетку дрожжей (например, Pichia), клетку яичника китайского хомячка (CHO), клетку миеломы или человеческую клетку. Оптимизированную нуклеотидную последовательность создают так, чтобы она полностью или максимально возможно сохраняла способность кодировать аминокислотную последовательность и количество остатков, которые кодируются первоначально исходной нуклеотидной последовательностью,которую называют также "родительской" последовательностью. В контексте настоящего описания оптимизированные последовательности создают так, чтобы они имели кодоны, предпочтительные для продуктивных клеток, однако предусматривается также оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических и прокариотических клетках. Аминокислотные последовательности,кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, необязательно обозначают также как оптимизированные. В родственных вариантах осуществления изобретения полипептидные последовательности композиций нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемых в изобретении, и нуклеотиды, которые их кодируют, предпочтительно оптимизируют для производства и клинического применения. Характеристики, которые можно оптимизировать для клинического применения, включают (но не ограничиваясь только ими), например, время полужизни, фармакокинетические (ФК) параметры, антигенность, эффекторную функцию, клиренс FcRn и ответ пациента, включая антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). В контексте настоящего описания "ассоциированные с DKK1 болезни" или "ассоциированные сDKK4 болезни" включают (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения, прежде всего остеолитические повреждения, ассоциированные с миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани, ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (HCC), миелому, включая множественную миелому,диабет, ожирение, мышечную атрофию, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос. В контексте настоящего описания "лечение" представляет собой вмешательство, осуществляемое с целью предупреждения развития или изменения патологии нарушения. Таким образом, понятие "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Пациенты, которые нуждаются в лечении, включают пациентов, которые уже имеют нарушение, а также пациентов, у которых нарушение можно предупреждать. При лечении опухоли (например, при раке) терапевтический агент может непосредственно снижать патологию опухолевых клеток или придавать опухолевым клеткам более высокую чувствительность к лечению другими терапевтическими агентами, например облучением и/или химиотерапией. "Патология" рака включает все явления, которые подвергают риску здоровье пациента. Она включает (но не ограничиваясь только ими) аномальный или неконтролируемый рост клеток, метастазы, воздействие на нормальную функцию соседних клеток, аномальные уровни высвобождение цитокинов или других секретируемых продуктов, подавление или ухудшение воспалительного или иммунологического ответа и т.д. Лечение пациентов, страдающих клиническими, биохимическими, радиологическими или субъективными симптомами болезни, такой как остеолиз, может представлять собой облегчение некоторых или всех указанных симптомов или снижение предрасположенности к заболеванию. В целом композиция нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемая в изобретении, обладает способностью предупреждать, лечить или облегчать связанные с Wnt заболевания, ассоциированные сDKK1 или DKK4 или с ними обоими, но не болезни, ассоциированные с DKK2, DKK3 или другими модуляторами Wnt-пути. В следующих подразделах различные объекты изобретения описаны более подробно.Wnt-путь представляет собой основной регулятор дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в остеобласты. Он является важным фактором выживания для активных остеобластов.Dickkopf-1 (DKK1) представляет собой антагонист Wnt-пути, который главным образом экспрессируется в костной ткани взрослых особей, и его повышающая регуляция характерна для страдающих миеломой пациентов с остеолитическими повреждениями. Нейтрализующие антитела к DKK1/4 являются истинным анаболическим агентом, действие которого проявляется в повышении остеобластической активности с одновременным снижением остеокластической активности. В отличие от современных лекарственных средств, таких как PTH (гормон околощитовидных желез), которые поступают в продажу в качестве анаболических агентов, они действительно повышают уровень маркеров, ассоциированных как с остео- 12015538 бластами, так и с остеокластами. В изобретении предложены поликлональные и моноклональные антитела, отобранные по признаку связывания с DKK1. Аффинность связывания предпочтительного антитела с человеческим DKK1 составляет менее 10 пМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к DKK1 обладают перекрестной реактивностью с DKK4 (Kd 300 пМ), но не с DKK2 (по данным анализа аффинности). Путем картирования установлено, что предпочтительный эпитоп антитела к DKK1 или антитела кDKK4 локализован в домене Cys-2 (ак 189-263), который, как известно, ответствен за связывание и сLRP6, и с Kremen. В одном из вариантов осуществления изобретения эпитоп включает по меньшей мере 6 и максимум 30 аминокислотных остатков из домена Cys-2 полипептида DKK1 или DKK4. В конкретном варианте осуществления изобретения эпитоп включает участок, состоящий по меньшей мере из 6 смежных аминокислот. В других вариантах осуществления изобретения предпочтительный сайт связывания является нелинейным, т.е. включает несмежные аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание зависит от N-гликозилирования. Предсказанным является только один сайт N-гликозилирования на остатке 256 в домене Cys-2. Согласно настоящему изобретению нейтрализующее антитело к DKK1 блокирует взаимодействиеDKK1 с LRP6, что доказано как с помощью ELISA, так и с помощью анализа связывания с клеточной поверхностью. Как и ожидалось, оно эффективно нейтрализует подавляющую Wnt активность DKK1,что характеризуется значением EC50 ниже 1 нМ in vitro. В качестве модели in vitro дифференцировки остеобластов мышиные клетки линии 10T1/2 обрабатывают Wnt3A для стимуляции секреции щелочной фосфатазы (AP), маркера активности остеобластов.DKK1 блокирует производство AP при использовании этой модели, а антитела, предлагаемые в изобретении, полностью аннулируют указанное ингибирование. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, обладает линейно зависящими от дозы фармакокинетическими характеристиками (AUC) в организме мышей,при этом зависящее от дозы время полужизни составляет для мышей 35-96 ч при использовании дозы 20200 мкг/мышь. При использовании интратибиальной (внутри большеберцовой кости) модели метастазов остеолитической опухоли предстательной железы установлено, что антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют индуцируемое опухолью повреждение кортикального слоя кости. При оценке воздействия на трабекулярную кость при использовании этой модели были получены неожиданные результаты, заключающиеся в том, что и имплантаты опухоли, и имплантаты-имитаторы вызывали механическое повреждение кости, что приводило к первоначальному разрастанию переплетенной костной ткани с последующем ее ремоделированием, приводящим к снижению видимого объема кости. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, снижает производство переплетенной костной ткани в большеберцовой кости как с имплантами опухоли, так и с имплантами-имитаторами и ингибирует снижение объема опухоли при ремоделировании. В родственных вариантах осуществления изобретения изменения маркеров костной ткани (остеокальцин, sRANKL, OPG, АР, TRAP) применяют для демонстрации клинических воздействий антител,предлагаемых в изобретении, на связанные с костной тканью заболевания и для предсказания клинических результатов лечения с использованием фармацевтически эффективных уровней нейтрализующих антител к DKK1, предлагаемых в изобретении. Krm связывается с DKK примерно в той же области, что иLRP. Krm необходим для ингибирования передачи сигнала Wnt посредством взаимодействия DKK сLRP. Комплекс Krm-DKK-LRP должен быть интернализован для деактивации Wnt-пути. Композиция нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемая в изобретении, предпочтительно связывается с DKK1 или DKK4, блокируя их взаимодействие с LRP и/или Krm, нейтрализуя тем самым воздействие DKK1 или DKK4 на путь передачи сигнала Wnt. Реактивация Wnt-пути происходит только при ограничении уровня DKK1 и/или DKK4. Стандартные анализы, предназначенные для оценки способности к связыванию антител с DKK1 различных видов, известны в данной области, и они включают, например, ELISA, Вестерн-блоттинг и РИА. Приемлемые анализы описаны подробно в примерах. Кинетические характеристики связывания(например, аффинность к связыванию) антител можно также оценивать стандартными анализами, известными в данной области, такими как Biacore-анализ, BioVeris SET-анализ, FMAT, анализ хемилюминесценции и/или SPR-анализы, которые позволяют оценивать ингибирование сигнала или анализировать высвобождение. Анализы, предназначенные для оценки воздействия антител на функциональные свойства DKK1, более подробно описаны в примерах. Таким образом, подразумевается, что способность антитела "ингибировать" одно или несколько указанных функциональных свойств DKK1 (например, биохимическую, иммунохимическую, клеточную,физиологическую или другие виды биологической активности или т.п.) при оценке с помощью методологий, известных в данной области и представленных в настоящем описании, относится к статистически значимому снижению конкретной активности относительно активности, имеющей место в отсутствие антитела (или, например, когда присутствует контрольные антитела или антитело с несоответствующей специфичностью). Антитело, которое ингибирует активность DKK1, вызывает статистически значимое- 13015538 снижение оцениваемого параметра по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50, 80 или 90%, и в конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, может ингибировать более чем на 95, 98 или 99% функциональную активность DKK1. Представители Dickkopf-семейства. Правильный костный метаболизм опосредуется сложной сетью регуляторных путей и взаимосвязей между остеобластами, остеокластами и окружающей стромой. Нарушение баланса этих регуляторных механизмов обусловливает остеолитические состояния, такие как остеопороз, индуцируемые опухолью остеолитические повреждения, потеря костной ткани, индуцируемая почечными и печеночными трансплантатами, потеря костной ткани, индуцируемая противогормональной химиотерапией. Эти состояния могут сопровождаться серьезными симптомами, включая костную боль, переломы, компрессию позвоночника и снижение подвижности. Большинство разрешенных к применения или находящихся в настоящее время на стадии клинических исследований путей лечения оказывают воздействие главным образом путем ингибирования функции остеокластов. Например, бифосфонаты, такие как золендроновая кислота(Zometa), являются в настоящее время стандартными средствами ухода и лечения, и их действие заключается в ингибировании функции и выживания остеокластов. Хотя бифосфонаты в целом являются эффективными, у некоторых пациентов не достигается выраженного ответа или они прекращают применение этих лекарственных средств из-за токсичности для почек или остеонекроза (Markowitz, 2003,Ruggiero, 2004). Кроме того, известно большое количество проходящих клиническое испытание лекарственных препаратов, мишенью которых является развитие остеокластов, например, таких препаратов, как нейтрализующие антитела к RANKL и M-CSF, или функция остеокластов, например, таких препаратов,как ингибиторы катепсина K. Стимуляция активности остеокластов представляет собой новый механизм лечения остеолитического заболевания. Wnt-путь играет основную роль в дифференцировке и активности остеобластов, причем антагонисты из семейства Dickkopf (DKK) идентифицированы прежде всего в качестве ключевых регуляторов этого процесса in vitro (см. обзор Krishnan, 2006). Wnt является имеющим решающее значение фактором выживания и дифферецировки остеобластов in vitro. Клиническое подтверждение ролиWnt-пути можно получать путем мутаций корецептора Wnt LRP5. Инактивирующие мутации LRP5 приводят к остеопорозному-псевдоглиомному синдрому (OPPG) (Ai, 2005), в то время как активирующие мутации приводят к созданию большой костной массы (Boyden, 2002). Обнаружено, что указанные активирующие мутации находятся во внеклеточном домене и, как установлено, нарушают связывание антагонистов Wnt с представителями семейства Dickkopf (DKK). Опубликованы данные о сверхэкспрессии DKK1 в клетках миеломы у пациентов с повреждениями кости, но она не выявлена в здоровых плазматических клетках или плазматических клетках пациентов,не страдающих повреждениями кости (Tian, 2004; Politou, 2006). Указанная сверхэкспрессия DKK1 в клетках миеломы может нарушать нормальный баланс между остеобластами и остеокластами, блокируя дифференцирвку остеобластов и усиливая в результате этого резорбцию кости. Кроме того, установлено,что применение некоторых противоопухолевых средств лечения миеломы, например применение дексаметазона, приводит к повышающей регуляции DKK1 (Ohnaka, 2004). Таким образом, нейтрализующее антитело к DKK1 должно приводить к реактивации Wnt-пути при остеолитических повреждениях, не оказывая воздействия на передачу сигнала Wnt в других тканях, в которых уровни DKK1 относительно низки или в которых основную роль играют другие антагонисты. Как установлено, у взрослых особей высокий уровень экспрессии DKK1 происходит только в кости (Li, 2006), это позволяет предположить,что DKK1 играет основную роль в регуляции метаболизма костной ткани у взрослых. У трансгенных мышей, у которых происходит сверэкспрессия Wnt1 в ткани молочной железы, развиваются карциномы молочной железы (Tsukamoto, 1988), а y 90% людей, страдающих колоректальными видами рака, обнаружена мутация либо в APC, либо в -катенине, двух цитоплазматических компонентах Wnt-пути (Morin, 1997; Rowan, 2000). Эти данные позволяют выдвинуть концепцию о том, что активация Wnt-пути может приводить к повышенному риску возникновения или развития опухолей. Кроме того, обнаружена понижающая регуляция DKK при колоректальных опухолях и маланомах, это позволяет предположить, что они могут играть роль в подавлении опухолей. К полипептидам DKK, предлагаемым в изобретении, относятся DKK1 (SEQ ID NO: 1) и DKK4DKK несут два CYS-домена (CYS1 и CYS2), представленных в табл. А далее. Белки DKK содержат кислотный N-концевой сигнальный пептид, два CYS-домена, содержащих кластеры остатков цистеина,разделенных дивергентной линкерной областью, и потенциальный C-концевой сайт Nгликозилирования. CYS2-домен в DKK4 обладает липидсвязывающей функцией и может облегчать взаимодействие WNT/DKK на плазматической мембране (OMIM, рег. номер 605417).- 14015538 Таблица А Перечень представителей семейства DKK1 Антитела к DKK1 и DKK4. В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, обладают специфичностью в отношении человеческого белка DKK. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой нейтрализующее антитело к DKK1 или DKK4, действие которого отличается от модификаций Wnt-пути, которые связаны с усилением развития опухолей. Wnt-путь регулируется сложной сетью внеклеточных лигандов, рецепторов и антагонистов, при этом DKK1 является только одним из них. Из-за ограниченной экспрессииDKK1 в организме взрослых особей и его более высокой функциональной активности по сравнению с другими антагонистами Wnt мало вероятно, что нейтрализующее антитело к DKK1 может приводить к повсеместной активации передачи сигнала Wnt или к онкогенезу. Это предположение дополнительно подтверждено двумя фактами: во-первых, активирующие мутации LRP5 (ингибирующие связываниеDKK) индуцируют фенотип повышенной костной массы, но не приводят к заметному повышению риска развития рака (Moon, 2004), а у мышей, гетерозиготных по молчащему аллелю DKK1, или мышей линииDoubleridge с пониженными уровнями DKK, обнаружен фенотип повышенной костной массы, но отсутствуют сведения о повышенной скорости образования опухолей (MacDonald, 2004).- 15015538 Антитело к DKK1 оказывает позитивное действие на индуцируемое миеломой остеолитическое заболевание, не повышая риск онкогенеза de novo. Следует ожидать, что такое антитело можно применять в сочетании с противоопухолевыми химиотерапевтическими агентами и, по-видимому, с лекарственными средствами, препятствующими резорбции кости, которые ингибируют функцию остеокластов. Поликлональные антитела. Антитела, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой поликлональные антитела, прежде всего человеческие поликлональные антитела. Поликлональные антитела получают из объединенной сыворотки иммунизированных животных или отобранных людей. Моноклональные антитела. Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно представляют собой человеческие моноклональные антитела, например, выделенные и имеющие охарактеризованную структуру антитела, которые описаны, в частности, в примерах 1-8. Конкретные аминокислотные последовательности VH антител представлены, например, в SEQ ID NO: 2-20. Конкретные аминокислотные последовательности VL антител представлены, например, в SEQ ID NO: 21-39. Аминокислотную последовательность VH антитела можно оптимизировать с целью экспрессии в клетке млекопитающего, такая последовательность представлена, например, в SEQ ID NO: 119. Аминокислотную последовательность VL антитела можно оптимизировать с целью экспрессии в клетке млекопитающего, такая последовательность представлена, например, в SEQ ID NO: 118. Аналогично этому,последовательности можно оптимизировать для экспрессии, например, в клетках дрожжей, бактерий,китайского хомячка и других клетках, в зависимости от того, какая система экспрессии является предпочтительной для подлежащей оптимизации характерной особенности. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты, но при этом CDR-участки идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% CDR-участкам, представленным в указанных выше последовательностях. Кроме того, родительские нуклеотидные последовательности полноразмерной легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 97-100. Родительские нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 101-103. Оптимизированные нуклеотидные последовательности полноразмерной легкой цепи, оптимизированные для экспрессии в клетке млекопитающего, представлены в SEQ ID NO: 104-107. Оптимизированные нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи, оптимизированные для экспрессии в клетке млекопитающего, представлены в SEQ ID NO: 108-110. Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями легкой цепи, представлены в SEQ ID NO: 111-114. Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями тяжелой цепи, представлены в SEQ ID NO: 115-117. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты или нуклеиновые кислоты, но при этом их последовательности идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% описанным выше последовательностям. Поскольку каждое их этих антител может связываться с DKK1, то последовательности VH, VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности) могут быть "смешаны и совмещены (соответствующим образом подобраны друг к другу)" для создания других связывающих молекул антител к DKK1, предлагаемых в изобретении. Связывание DKK1 с указанными "смешанными и совмещенными" антителами можно оценивать с помощью анализов связывания, которые описаны выше и в примерах (например, ELISA). Когда указанные цепи смешивают и совмещают, то VH-последовательность из конкретной пары VH/VL можно заменять структурно подобной VH-последовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерная легкая цепь/полноразмерная тяжелая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной тяжелой цепи. Аналогично этому VL-последовательность из конкретной пары VH/VL можно заменять структурно схожей VLпоследовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной легкой цепи из конкретной пары полноразмерная тяжелая цепь/полноразмерная легкая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной легкой цепи. Последовательности VH, VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи антител, предлагаемых в настоящем изобретении, наиболее пригодны для смешения и совмещения, поскольку в этих антителах применяют последовательности VH,VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи, выведенные из одних и тех же последовательностей зародышевой линии, поэтому они обладают структурным сходством. Таким образом, одним из объектов изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH-область, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 119; и VL-область, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 118; где антитело специфически связывается с DKK1.- 16015538 Примерами комбинаций тяжелой и легкой цепей являютсяVH-область, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VL-область, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; илиVH-область, имеющая SEQ ID NO: 119, и VL-область, имеющая SEQ ID NO: 118. Другим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий полноразмерную тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 115-117; и полноразмерную легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 111-114. Так, примерами комбинаций полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи являются соответственно SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 111; или SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 112; или SEQID NO: 117 и SEQ ID NO: 113; или SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 114. Другим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий полноразмерную тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 101-103; и полноразмерную легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая выбрана из группы, включающей SEQID NO: 97-100. Так, примерами нуклеотидов, которые кодируют полноразмерные тяжелые и легкие цепи соответственно, которые можно объединять, включают SEQ ID NO: 101 и 97; или SEQ ID NO: 102 и 98; или SEQID NO: 103 и 99; или SEQ ID NO: 103 и 100. Следующим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь, нуклеотидная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ IDNO: 108-110; и полноразмерную легкую цепь, нуклеотидная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 104-107. Следующим объектом изобретения являются антитела, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и легкой цепи антител или их комбинации. Аминокислотные последовательности CDR1 VH антител представлены в SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20 и 49-56. Аминокислотные последовательности CDR2 VH антител представлены в SEQ ID NO: 2-20 и 57-64. Аминокислотные последовательности CDR3 VH антител представлены в SEQ ID NO: 2-20 и 65-72. Аминокислотные последовательности CDR1 VL антител представлены в SEQ ID NO: 21-39 и 73-80. Аминокислотные последовательности CDR2 VL антител представлены в SEQ ID NO: 21-39 и 81-88. Аминокислотные последовательности CDR3 VL антител представлены в SEQ ID NO: 21-39 и 89-96. CDR-участки описывают по системе Кэбота (Kabat E.А. и др.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242, 1991). С учетом того, что каждое из указанных антител может связываться с DKK1 и что специфичность к связыванию с антигеном обеспечивается прежде всего CDR1-, 2- и 3-участками, последовательностиCDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL можно "смешивать и совмещать", т.е. можно смешивать и совмещать CDR из различных антител, хотя каждое антитело должно содержать CDR1, 2 и 3VH и CDR1, 2 и 3 VL для создания других направленных против DKK1 связывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Связывание DKK1 с такими "смешанными и совмещенными антителами" можно тестировать с использованием анализов связывания, которые описаны в примерах (например, ELISA). Когда смешивают и совмещают CDR-последовательности VH, то последовательности CDR1, CDR2 и/илиCDR3 из конкретной последовательности VH следует замещать структурно сходной(ими) CDRпоследовательностью(ями). Аналогично этому, когда CDR-последовательности VL смешивают и совмещают, то последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VL следует замещать структурно сходной(ими) CDR-послудовательностью(ями). Кроме того, последовательностиCDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VH или VL можно специфически или произвольно подвергать мутации, создавая антитела, аффинность или характеристики связывания которых можно тестировать. Как должно быть очевидно обычному специалисту в данной области, новые последовательности VH и VL можно создавать путем замены одой или нескольких последовательностей CDRучастка VH и/или VL структурно сходными последовательностями из CDR-последовательностей, описанных для моноклональных антител, предлагаемых в настоящем изобретении.- 17015538 Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок содержат CDR1 VHобласти, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQID NO: 2-5; 8-11, 20 и 49-56; CDR2 VH-области, который имеет аминокислотную последовательность,выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 57-64; CDR3 VH-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 65-72; CDR1 VLобласти, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 21-39 и 73-80; CDR2 VL-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группыSEQ ID NO: 21-39 и 81-88; и CDR3 VL-области, который имеет аминокислотную последовательность,выбранную из группы SEQ ID NO: 21-39 и 89-96, где антитело специфически связывается с DKK1. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; CDR2 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7; CDR1 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQVL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; CDR2 VH-области, имеющего последовательность,представленную в SEQ ID NO: 12; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную вCDR2 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25; и CDR3 VLобласти, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26. В еще одном варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; CDR2 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15; CDR1 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ IDVL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. В следующем варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5; CDR2 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17; CDR1 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQVL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8; CDR2 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19; CDR1 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQVL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. В другом варианте осуществления изобретения антитело состоит из CDR1 VH-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9; CDR2 VH-области, имеющего последовательность,представленную в SEQ ID NO: 10; CDR3 VH-области, имеющего последовательность, представленную вCDR2 VL-области, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37; и CDR3 VLобласти, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38. Согласно настоящему описанию человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой(VH) или легкой (VL) цепи или полноразмерную тяжелую или легкую цепи, которые "являются продуктом" или "выведены из" последовательности конкретной зародышевой линии, если вариабельные области или полноразмерные цепи антитела получают из системы, основанной на применении генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Для создания таких систем осуществляют иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулинов, с использованием представляющего интерес антигена или осуществляют скрининг презентируемой фагом библиотеки человеческих генов иммуноглобулинов с использованием представляющего интерес антигена. Человеческое антитело, которое "является продуктом" или "выведено из" последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, можно идентифицировать индивидуально путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела и аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии и отбора последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. имеет самый высокий % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое "является продуктом" или "выведено из" конкретной последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, может иметь различия в аминокислотах по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, в результате встречающихся в естественных условиях соматических мутаций или- 18015538 преднамеренной интродукции сайт-направленной мутации. Однако аминокислотная последовательность отобранного человеческого антитела, как правило, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют, что человеческое антитело является человеческим,при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевых линий других видов (например, последовательности мышиной зародышевой линии). В определенных случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть по меньшей мере на 60, 70, 80, 90 или по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, человеческое антитело, выведенное из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии,должно иметь не более 10 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В определенных случаях человеческое антитело может иметь не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотное различие по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Гомологичные антитела. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении,имеет аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи или вариабельные области тяжелой и легкой цепи, аминокислотные последовательности которых гомологичны аминокислотным последовательностям представленных в настоящем описании антител, и при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемой в изобретении. Например, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат VH-область и VL-область, где VH-область содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 119; VL-область содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 118; антитело специфически связывается с DKK1 и/или DKK4, и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело нейтрализует связывание белка DKK1 с LRP6, Fz и/или Krm, или антитело нейтрализует связывание белка DKK4 с LRP, Fz и/или Krm. Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь,где полноразмерная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающейSEQ ID NO: 115-117; полноразмерная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы,включающей SEQ ID NO: 111-114; антитело специфически связывается с DKK1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белкаDKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или уменьшая интенсивность симптомов, облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь,где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ IDNO: 101-103; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 97-100; антитело специфически связывается с DKK1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности,выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 108-110; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последова- 19015538 тельности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 104-107; антитело специфически связывается с DKK1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептораDKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. Следующим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат VH-область иVL-область, где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 121; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 120; антитело специфически связывается с DKK1, и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1,предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений,или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя из описанных выше функциональных свойств. Антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. Согласно настоящему описанию процент гомологии двух аминокислотных последовательностей эквивалентен проценту идентичности двух последовательностей. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % гомологии=количество идентичных положений/общее количество положений 100), принимая во внимание количество брешей и длину каждой бреши, которую необходимо интродуцировать для оптимального сравнительного анализа первичной структуры двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять с помощью математического алгоритма, описанного ниже в примерах, которые не ограничивают объем изобретения. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 988, c. 11-17), который включен в программуALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы взвешенных остатков РАМ 120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970, c. 444-453), который включен в программу GAP, входящую в пакет программ GCG (которая доступна на сайтеhttp://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossom 62 или матрицы РАМ 250 и веса бреши 16, 14,12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом или дополнительном варианте белковые последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также в качестве "запрашиваемой последовательности" при осуществлении поиска в общественных базах данных, например, в отношении идентичности с родственными последовательностями. Такой поиск можно осуществлять с использованием программы XBLAST (версия 2.0),разработанной Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, c. 403-410. BLAST-поиск белков можно осуществлять с помощью программы XBLAST, в которой балл = 50, длина слова = 3, для установления уровня гомологии аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями молекул антител, предлагаемых в изобретении. Для создания содержащих бреши линеаризированных последовательностей для целей сравнения можно использовать программу Gapped BLAST, описанную у Altschul и др., Nucleic Acids Res. 25(17), 1997, c. 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать принимаемые по умолчанию параметры, которые применяются в соответствующих программах (например, XBLAST и NBLAST) (см. http://www.ncbi.nhn.nih.gov). Антитела с консервативными модификациями. В конкретных вариантах осуществления антитело, предлагаемое в изобретении, имеет VH-область,которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и VL-область, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или нескольких указанных последовательностей CDR представляет собой специфические аминокислотные последовательности, характерные для антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из VH-области, которая содержит последовательности CDR1,CDR2 и CDR3, и VL-области, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где CDR1 VHобласти имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56 и их кон- 20015538 сервативные модификации; CDR2 VH-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательностиSEQ ID NO: 2-20, 57-64 и их консервативные модификации; CDR3 VH-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2-20, 65-72 и их консервативные модификации; CDR1 VLобласти имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21-39, 73-80 и их консервативные модификации; CDR2 VL-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQID NO: 21-39, 81-88 и их консервативные модификации; CDR3 VL-области имеет последовательности,содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21-39, 89-96 и их консервативные модификации; антитело специфически связывается с DKK1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза,или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела. В других вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, имеет последовательность полноразмерной тяжелой цепи и последовательность полноразмерной легкой цепи, где одна или несколько из указанных последовательностей имеет специфические аминокислотные последовательности, характерные для представленных в настоящем описании антител или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, где полноразмерная тяжелая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 115-117 и их консервативные модификации; и полноразмерная легкая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 111-114 и их консервативные модификации; антитело специфически связывается с DKK1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела. В других вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, оптимизированное для экспрессии в клетке, имеет последовательность VH-области и последовательность VLобласти, где одна или несколько из указанных последовательностей имеют специфические аминокислотные последовательности, характерные для представленных в настоящем описании антител, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из VHобласти и VL-области, где VH-область имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119 и ее консервативные модификации; и VL-область имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118 и ее консервативные модификации; антитело специфически связывается с DKK1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1 или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.- 21015538 В контексте настоящего описания понятие "консервативные модификации последовательностей" относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают существенного влияния или не существенно изменяют характеристики связывания антитела, которое содержит указанную аминокислотную последовательность. Указанные консервативные модификации включают аминокислотные замены,добавления или делеции. Модификации можно интродуцировать в антитело, предлагаемое в изобретении, с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями известны в данной области. Эти семейства включают аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин,пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин,изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CDR-участках антитела можно заменять на другие аминокислотные остатки из одного и того же семейства боковых цепей, и измененное антитело можно оценивать в отношении сохранения им функции с помощью представленных в настоящем описании функциональных анализов. Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и композиция нейтрализующих антител кDKK1/4, предлагаемая в изобретении. Другим вариантом осуществления изобретения являются антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и композиция различных нейтрализующих антител к DKK1/4, предлагаемая в изобретении. Такие дополнительные антитела можно идентифицировать по их способности к перекрестной конкуренции (например, способности к статистически значимому конкурентному ингибированию связывания) с другими антителами, предлагаемыми в изобретении, при оценке с помощью стандартных анализов связывания DKK1. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител, предлагаемых в настоящем изобретении, с человеческим DKK1 демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с антителом за связывание с человеческим DKK1; согласно одной из возможных теорий такое антитело может связываться с тем же или родственным (например, структурно подобным или находящимся в пространственной близости) эпитопом на человеческом DKK1, что и антитело, с которым оно конкурирует. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, которое связывается с тем же эпитопом на человеческом DKK1, что и антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Указанные человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять согласно описанным в примерах методам. Верблюжьи и другие состоящие из тяжелых цепей антитела. Белки антител, полученные из представителей семейства двугорбых и одногорбых верблюдов(Camelus bactrianus и Calelus dromaderius), включая представителей животных Нового Света, таких как различные виды лам (Lama paccos, Lama glama и Lama vicugna), охарактеризованы в отношении их размера, структурной комплексности и антигенности в отношении человека. Установлено, что некоторые антитела типа IgG из этого семейства млекопитающих в естественных условиях лишены легких цепей и поэтому отличаются по структуре от типичной состоящей из четырех цепей четвертичной структуры с двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, характерной для антител из организма других животных (см.PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, опубликовано 3 марта 1994 г Участок верблюжьего антитела, представляющий собой небольшую индивидуальную вариабельную область, обозначенную как VHH, можно создавать с помощью генной инженерии с получением небольшого белка, обладающего высокой аффинностью к мишени, что приводит к образованию низкомолекулярного выведенного из антитела белка, обозначенного как "верблюжье нанотело" (см. US 5759808,выданный 2 июня 1998 г.; см. также Stijlemans В. и др., J. Biol. Chem., 279, 2004, c. 1256-1261; DumoulinCortez-Retamozo V. и др., Int. J. Cancer, 89, 2002, c. 456-462; и Lauwereys M. и др., EMBO J., 17, 1998,c. 3512-3520). Созданные библиотеки верблюжьих антител и фрагментов антител доступны на коммерческой основе, например, от фирмы Ablynx, Гент, Бельгия. Аналогично другим антителам, полученным из видов кроме человека, аминокислотную последовательность верблюжьего антитела можно изменять рекомбинантно с получением последовательности в большей степени, напоминающей человеческую последовательность, т.е. нанотело можно "гуманизировать". Таким образом, естественную низкую антигенность верблюжьих антител для людей можно дополнительно понижать. Верблюжье нанотело имеет молекулярную массу, составляющую примерно 1/10 от молекулярной массы человеческого IgG, а физический диаметр белка составляет лишь несколько нанометров. Одной из связанных с малым размером особенностей является способность верблюжьих антител связываться с антигенными сайтами, которые являются функционально незаметными для более крупных белковых ан- 22015538 тител, т.е. верблюжьи нанотела можно применять в качестве реагентов, выявляющих антигены, которые остаются скрытыми при использовании классических иммунологических методов, и возможно в качестве терапевтических агентов. Таким образом, другой связанной с малым размером особенностью верблюжьего нанотела, является способность ингибировать связывание со специфическим сайтом в бороздке или узкой расщелине белка-мишени, и поэтому их можно применять в качестве субстанции, более напоминающей по своей функции классическое низкомолекулярное лекарственное средство, чем классическое антитело. Небольшая молекулярная масса и компактный размер обусловливает также очень высокую термостабильность, стабильность при экстремальных значениях pH и стабильность к протеолитическому расщеплению и низкую антигенность верблюжьих нанотел. Еще одним следствием указанных особенностей является то, что верблюжьи нанотела легко проникают из кровеносной системы в ткани и даже проникают через гематоэнцефалический барьер и их можно применять для лечения заболеваний, поражающих нервную ткань. Нанотитела могут облегчать также транспорт лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер (см. заявку на патент США 20040161738, опубликованную 19 августа 2004 г). Эти особенности в сочетании с низкой антигенностью в отношении людей свидетельствуют об их большом терапевтическом потенциале. Кроме того, эти молекулы можно полностью экспрессировать в прокариотических клетках, таких как E.coli, и экспрессировать в виде слитых белков с бактериофагом, и они являются функционально активными. Таким образом, отличительным признаком настоящего изобретения является верблюжье антитело или нанотело, обладающее аффинностью к DKK1. В конкретных вариантах осуществления изобретения верблюжье антитело или нанотело получают в естественных условиях в животном из семейства верблюжьих, т.е. оно продуцируется в организме представителя верблюжьих после иммунизации DKK1 или его пептидным фрагментом при применении методов, описанных для других антител. В другом варианте нейтрализующее верблюжье антитело к DKK1/4 конструируют, т.е. получают путем отбора, например,из фаговых дисплейных библиотек соответствующих образом мутированных белком верблюжьих нанотел с помощью метода пэннинга с использованием в качестве мишени DKK1 и/или DKK4, как описано в приведенных в настоящем описании примерах. Сконструированные нанотела можно дополнительно усовершенствовать с помощью генной инженерии таким образом, чтобы время из полужизни в реципиенте составляло от 45 мин до 2 недель. Кроме верблюжьих антител, антитела, состоящие из тяжелых цепей, встречаются в естественных условиях в других животных, включая (но не ограничиваясь только ими), например, определенные виды акул и рыб-собак (см., например, публикацию PCT WO 03/014161). Хотя вариабельные области, выведенные из таких антител, состоящих из тяжелых цепей, можно применять согласно изобретению, для применения согласно изобретению и/или для клинического применения на людях предпочтительно осуществляют оптимизацию, гуманизацию, гуманирование и т.п. антител, выведенных из представителей верблюжьих, которые состоят из тяжелых цепей, и/или последовательностей их вариабельных областей Сконструированные и модифицированные антитела. Антитело, предлагаемое в изобретении, можно получать с использованием антитела, которое имеет одну или несколько указанных в настоящем описании последовательностей VH и/или VL, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, где модифицированное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно создавать путем модификации одного или нескольких остатков в одной или обеих вариабельных областях (т.е. VH и/или VL),например, в одном или нескольких CDR-участках и/или в одном или нескольких каркасных участках. В дополнительном или альтернативном варианте антитело можно создавать путем модификации остатков в константной(ых) области(ях), например, для изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела. Для осуществления одного из типов конструирования вариабельной области можно применять трансплантацию CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине между аминокислотными остатками в CDR индивидуальных антител имеются более существенные различия, чем между последовательностями, локализованными вне CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большую часть взаимодействий антитело-антиген,можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных встречающихся в естественных условиях антител, путем конструирования экспрессионных векторов, которые содержат последовательности CDR из конкретного встречающегося в естественных условиях антитела,полученные путем трансплантации в последовательности каркасных участков из других антител с другими свойствами (см., например Riechmann L. и др., Nature 332, 1998, c. 323-327; Jones P. и др., Nature,321, 1986, c. 522-525; Queen C. и др., Proc. Natl. Acad. See. USA, 86, 1989, c. 10029-10033; US 5225539 на имя Winter и US 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen с соавторами). Таким образом, следующим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы,включающей SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56; последовательность CDR2, которые содержат аминокис- 23015538 лотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 57-64; последовательности CDR3, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 65-72 соответственно; и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 73-80; последовательность CDR2, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 81-88; и последовательностиCDR3, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQID NO: 21-39 и 89-96 соответственно. Таким образом, указанные антитела содержат последовательностиCDR VH и VL моноклональных антител, кроме того, они могут содержать различные последовательности каркасных участков указанных антител. Указанные последовательности каркасных участков, которые содержат последовательности генов антител зародышевой линии, можно получать из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылок. Например, последовательности ДНК человеческой зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей можно найти в базе данных последовательностей человеческой зародышевой линии "Vbase" (доступной в Интернете на сайте www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), а также у Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-e изд., изд-во U.S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991; Tomlinson I.M. и др., J. fol. Biol. 227, 1992, c. 776-798; и Cox J.P.L. и др., Eur. J. Immunol. 24, 1994, c. 827-836; содержание каждой из которых специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. Примером последовательностей каркасных участков, предназначенных для применения в антителах, предлагаемых в изобретении, являются последовательности, структурно подобные последовательностям каркасных участков, которые входят в отобранные антитела, предлагаемые в изобретении, например, консенсусные последовательности и/или последовательности каркасных участков, которые входят в моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL можно трансплантировать в каркасные участки, которые имеют последовательность, идентичную с последовательностью гена иммуноглобулина зародышей линии, из которого выведена последовательность каркасного участка, или последовательности CDR можно трансплантировать в каркасные участки, которые содержат одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было установлено, что в определенных случаях целесообразно изменять посредством мутации остатки в каркасных участках для поддержания или повышения способности антитела связываться с антигеном (см., например, US 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen с соавторами). Другим типом модификации вариабельной области является мутация аминокислотных остатков вCDR1, CDR2 и/или CDR3 VH- и/или VL-областей, которая повышает тем самым одну или несколько способностей к связыванию (например, аффинность) представляющего интерес антитела, что называют "созреванием аффинности". Для интродукции мутации(й) и воздействия на связывание антитела или на другое представляющее интерес функциональное свойство можно применять сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредуемый мутагенез, что можно оценивать с помощью анализов in vitro или in vivo, описанных ниже в примерах. Можно интродуцировать консервативные модификации (указанные выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции. Кроме того, как правило, изменяют не более 1, 2, 3, 4 или 5 остатков в CDR-участке. Таким образом, другим вариантом осуществления изобретения является композиция выделенных нейтрализующих антител к DKK1/4 или их антигенсвязывающих участков, которые состоят изVH-области, содержащей CDR1 VH-области, который состоит из аминокислотной последовательности,выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56 или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56; CDR2 VH-области, который состоит из аминокислотной последовательности,выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 57-64, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 220 и 57-64; CDR3 VH-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 65-72, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 2-20 и 65-72;CDR1 VL-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы,включающей SEQ ID NO: 21-39 и 73-80, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 21-39 и 73-80; CDR2VL-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 81-88, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 21-39 и 81-88; CDR3 VLобласти, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающейSEQ ID NO: 21-39 и 89-96, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 21-39 и 89-96.- 24015538 К созданным антителам, предлагаемым в изобретении, относятся также антитела, в которых сделаны модификации в остатках каркасных участков в VH и/или VL, например, с целью улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркасных участков осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например, один из подходов представляет собой "обратное мутирование" одного или нескольких остатков каркасного участка с получением соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать остатки каркасного участка, отличающиеся от последовательности зародышевой линии, из которой выведено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасных участков антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой выведено антитело. Для возвращения последовательностей каркасного участка к исходной конфигурации зародышей линии соматические мутации можно подвергать "обратному мутированию" с получением последовательности зародышевой линии, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредуемого мутагенеза. Такие антитела с "обратными мутациями" подпадают также под объем настоящего изобретения. Другой тип модификации каркасного участка включает изменение путем мутации одного или нескольких остатков в каркасном участке или даже в одном или нескольких CDR-участках для удаления Tклеточных эпитопов с целью снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход обозначают также как "деиммунизация", и он описан более подробно в опубликованном US 20030153043 на имя Carr с соавторами. В дополнительном или альтернативном варианте помимо модификаций в каркасных участках илиCDR, антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать модификации в Fc-фрагменте, как правило,для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность. Кроме того, антитело, предлагаемое в изобретении, можно модифицировать химически (например, к антителу можно присоединять один или несколько химических фрагментов) или можно модифицировать для изменения его гликозилирования, и в этом случае с целью изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Каждый из указанных вариантов осуществления изобретения будет дополнительно описан ниже. Нумерация остатков в Fc-фрагменте соответствует EUиндексу или нумерации Кэбота. В одном из вариантов осуществления изобретения модифицируют шарнирную область CH1 так,чтобы изменять, например увеличивать или снижать, количество цистеиновых остатков в шарнирной области. Этот подход описан также в US 5677425 на имя Bodmer с соавторами. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области CH1 изменяют, например, для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для повышения или снижения стабильности антитела. В другом варианте осуществления изобретения шарнирную область Fc-фрагмента антитела можно изменять с помощью мутации для снижения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно, интродуцируют одну или несколько аминокислотных мутаций в область контакта CH2-CH3 доменов шарнирной области Fc-фрагмента для ухудшения связывания антитела с протеином A золотистого стафилококка Staphylococcyl (SpA) по сравнению со связыванием нативной шарнирной области Fcфрагмента с SpA. Этот подход описан более подробно в US 6165745 на имя Ward с соавторами. В другом варианте осуществления изобретения антитело модифицируют для удлинения биологического времени полужизни. При этом возможно применение различных подходов. Например, можно интродуцировать одну или несколько из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, описанных вUS 6277375 на имя Ward. В другом варианте для удлинения биологического времени полужизни можно изменять антитело в CH1- или CL-области путем интродукции связывающегося с рецептором"спасателем" эпитопа, полученного из двух петель CH2-домена Fc-фрагмента IgG, как описано вUS5869046 и 6121022 на имя Presta с соавторами. В других вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, один или несколько аминокислотных остатков можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы у такого антитела изменялась аффинность к эффекторному лиганду,но сохранялась антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Fc-рецептор или CL-компонент комплемента. Этот подход описан более подробно в US5624821 и 5648260, оба на имя Winter с соавторами. В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности можно заменять другим аминокислотным остатком так, чтобы антитело имело измененную способность к Clq-связыванию и/или пониженную комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или ее отсутствие. Этот подход описан более подробно в US 6194551 на имя Idusogie с соавторами. В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков изменяют, изменяя тем самым способность антитела к фиксации комплемента. Этот подход описан также в опубликованной заявке PCT WO 94/29351 на имя Bodmer с соавторами.- 25015538 В еще одном варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент модифицируют для повышения способности антитела вызывать антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) и/или для повышения аффинности антитела к Fc-рецептору посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот подход описан более подробно в опубликованной заявке PCT WO 00/42072 на имя Presta. Кроме того, были картированы сайты связывания человеческого IgG1 с FcR1, FcRII,FcRIII и FcRn, и описаны варианты с улучшенной способностью к связыванию (см. Shields R.L. и др., J.Biol. Chem. 276, 2001, c. 6591-6604). В следующем варианте осуществления изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, можно создавать агликозилированное антитело (т.е. антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменять, например, для повышения аффинности антитела к"антигену". Такие углеводные модификации можно осуществлять путем, например, изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования каркасного участка вариабельной области, устраняя тем самым гликозилирование в этом сайте. Указанное агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Этот подход описан более подробно в US5714350 и 6350861 на имя Co с соавторами. В дополнительном или альтернативном варианте можно создавать антитело с измененным типом гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело, которое имеет пониженное количество фукозильных остатков, или антитело с повышенным содержанием разделяющих пополам GlcNacструктур. Было продемонстрировано, что такие измененные схемы гликозилирования повышают ADCCактивность антител. Указанные углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования известны в данной области и их можно применять в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела, предлагаемые в изобретении, для получения тем самым антител с измененным гликозилированием. Например, в EP 1176195 на имя Hang с соавторами описана линия клеток с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего экспрессируемые в такой клеточной линии антитела характеризуются гипофукозилированием. В опубликованной заявке PCT WO 03/035835 на имя Presta описан вариант линии CHOклеток, Lecl3-клетки, с пониженной способностью присоединять фукозу к связанным с Asn(297) углеводам, что приводит также к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяинеWO 99/54342 на имя Umana с соавторам, описаны линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII, в результате чего антитела, которые экспрессируются в сконструированных линиях клеток, характеризуются повышенным содержанием разделяющих пополам GlcNac-структур, что приводит к повышенной ADCC-активности антител (см. также Umana и др., Nat. Biotech. 17, 1999, c. 176180). Другой модификацией антител, подпадающей под объем изобретения, является пэгилирование. Антитело можно пэгилировать, например, для удлинения биологического (например, в сыворотке) времени полужизни антитела. Для пэгилирования антитела, как правило, антитело или его фрагмент подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, при которых одна или несколько ПЭГ-групп присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Пэгилирование можно осуществлять с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие "полиэтиленгликоль" относится к любым формам ПЭГ, которые используют для дериватизации других белков, таким как моно(C1-C10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, подлежащее пэгилированию,представляет собой агликолизированное антитело. Методы пэгилирования белков известны в данной области, и их можно применять к антителам, предлагаемым в изобретении (см., например, EP 0154316 на имя Nishimura с соавторами и EP 0401384 на имя Ishikawa с соавторами). Неиммуноглобулиновые каркасы. Можно применять широкое разнообразие остовов или каркасов антитела/иммуноглобулина при условии, что образующийся полипептид включает по меньшей мере один связывающий участок, который является специфическим для белка-мишени. Такие остовы или каркасы включают пять основных идиотипов человеческих иммуноглобулинов или их фрагментов (например, которые представлены в настоящем описании), и включают иммуноглобулины других видов животных, которые предпочтительно имеют гуманизированные компоненты. Состоящие только из тяжелых цепей антитела, которые идентифицированы в представителях верблюжьих и/или акульих, в этом плане являются особенно интересными. Специалисты в данной области продолжают выявлять и создавать новые остовы, каркасы и фрагменты.- 26015538 Один из объектов изобретения относится к созданию антител на неиммуноглобулиновой основе с использованием неиммуноглобулиновых каркасов, в которые можно трансплантировать CDR, предлагаемые в изобретении. Можно применять известные неиммуноглобулиновые каркасы или те, которые будут обнаружены в дальнейшем, если они содержат связывающий участок, специфический для белкамишени, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1 или 122. Такие соединения обозначены в контексте настоящего описания как "полипептиды, содержащие специфический для мишени связывающий участок". Известные неиммуноглобулиновые остовы или каркасы включают (но не ограничиваясь только ими) аднектины (фибронектин) (фирма Compound Therapeutics, Inc., Уолтем, шт. Массачусетс), анкирин (фирма Molecular Partners AG, Цюрих, Швейцария), домены антител (фирма Domantis, Ltd(фирма Pieris Proteolab AG, Фрейзинг, Германия), небольшие модульные иммунологические фармацевтические агенты (фирма Trubion Pharmaceuticals Inc., Сиэтл, шт. Вашингтон), макси-тела (фирма Avidia,Inc. (Маунтин-Вью, шт. Калифорния, протеин А (фирма Affibody AG, Швеция) и аффилин (гаммакристаллин или убикитин) (фирма Scil Proteins GmbH, Галле, Германия).(I) Аднектины - фирма Compound Therapeutics. Основой аднектиновых каркасов является домен фибронектина типа III (например, десятый модуль фибронектина типа III (домен 10 Fn3. Домен фибронектина типа III несет 7 или 8 -цепей, которые распределены между двумя -складками, которые сами упакованы друг напротив друга с образованием ядра белка, и дополнительно содержат петли (аналоги CDR), которые соединяют -цепи друг с другом и являются доступными для растворителя. Известно по меньшей мере три таких петли на каждом крае складчатого сэндвича, при этом край является границей белка, перпендикулярной к направлению цепей (US 6818418). Эти каркасы, основой которых является фибронектин, не представляют собой иммуноглобулин, хотя общая укладка очень похожа на укладку наименьшего обладающего функциональной активностью фрагмента антитела, т.е. вариабельной области тяжелой цепи, который содержит полный распознающий антиген компонент в IgG представителей верблюжьих и лам. Благодаря указанной структуре антитело,не представляющее собой иммуноглобулин, имитирует антигенсвязывающие свойства, которые напоминают по природе и аффинности свойства антител. Эти каркасы можно применять для стратегии рандомизации петель и перестановки in vitro, подобной процессу созревания аффинности антител in vivo. Такие молекулы, основой которых является фибронектин, можно применять в качестве каркасов, в которых области петель молекулы можно заменять на CDR, предлагаемые в изобретении, с помощью стандартных методов клонирования.(II) Анкирин - фирма Molecular Partners. Технология основана на применении белков, несущих выведенные из анкирина повторяющиеся модули в качестве каркасов для вариабельных областей, которые можно использовать для связывания с различными мишенями. Повторяющийся анкириновый модуль представляет собой состоящий из 33 аминокислот полипептид, который содержит две антипараллельные -спирали и -петли. Связывание вариабельных областей максимально оптимизируют на основе доступности для рибосом.(III) Макси-тела/авимеры - фирма Avidia. Авимеры получают из встречающегося в естественных условиях содержащего A-домен белка, такого как LRP-1. Эти домены используются в естественных условиях для взаимодействий типа белок-белок,и у человека структурной основой более чем 250 белков являются A-домены. Авимеры состоят из нескольких различных мономеров "A-домена" (2-10), сцепленных с помощью аминокислотных линкеров. Можно создавать авимеры, которые могут связываться с антигеном-мишенью, с использованием методологии, описанной, например, в 20040175756; 20050053973; 20050048512 и 20060008844.(IV) Протеин A - фирма Affibody. Обладающие аффинностью лиганды Affibody представляют собой небольшие простые белки, состоящие из трехспирального пучка, основой которого является каркас одного из IgG-связывающих доменов протеина А. Протеин A представляет собой поверхностный белок бактерии Staphylococcus aureus. Этот каркасный домен состоит из 58 аминокислот, 13 из которых произвольно использовали для создания библиотек Affibody с большим количеством вариантов лиганда (см., например, US 5831012). Молекулы Affibody напоминают антитела, их молекулярная масса составляет 6 кДа, для сравнения молекулярная масса антител составляет 150 кДа. Несмотря на небольшой размер, сайт связывания молекулAffibody подобен сайту связывания антитела.Anticalins представляют собой продукты, разработанные компанией Pieris ProteoLab AG. Их получают из липокалинов, широко распространенной группы небольших и эффективных белков, которые,как правило, принимают участие в физиологическом транспорте или хранении чувствительных к химическим агентам или нерастворимых соединений. Несколько встречающихся в естественных условиях липокалинов обнаружено в тканях или общей воде организма человека.- 27015538 Их белковая архитектура напоминает структуру иммуноглобулинов с гипервариабельными петлями на вершине жесткого остова. Однако в отличие от антител или их рекомбинантных фрагментов липокалины состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 160-180 аминокислотных остатков, т.е. несколько более крупной, чем один домен иммуноглобулина. Набор из четырех петель, которые образуют связывающий карман, обладает выраженной структурной пластичностью и допускает широкое разнообразие боковых цепей. Таким образом, при использовании соответствующего процесса сайту связывания можно придавать новую форму, предназначенную для распознавания с высокой аффинностью и специфичностью заранее определенных молекул-мишеней различной формы. Один из белков семейства липокалинов, а именно связывающий билин белок (BBP) из Pieris brassicae (капустная белянка), использовали для создания антикалинов путем мутагенеза, затрагивающего четыре петли. Одной из заявок на патент, в которых описаны "антикалины", приведенной в качестве примера, является PCT WO 199916873.(VI) Аффилин (Affilin) - белки фирмы Scil Proteins. Молекулы Affilin представляют собой небольшие неиммуноглобулиновые белки, которые разработаны с целью достижения специфических аффинностей к белкам и небольшим молекулам. Новые молекулы Affilin можно очень быстро отбирать из двух библиотек, основой каждой из которых являются различные полученные из человеческого организма белки-каркасы. Молекулы Affilin не обладают какой-либо структурной гомологией с белками иммуноглобулинов. На фирме Scil Proteins применяют два Affilin-каркаса, одним из которых является гаммакристаллин, человеческий структурный белок хрусталика глаза, а другим являются белки суперсемейства "убикитина". Оба человеческих каркаса имеют очень малый размер, характеризуются высокой температуростойкостью и практически устойчивы к изменениям значений pH и действию денатурирующих агентов. Указанная высокая стабильность главным образом является результатом расширенной бетаскладчатой конформации белков. Примеры выведенных из гамма-кристаллина белков описаны вWO 200104144, а примеры "убкитиноподобных" белков описаны в WO 2004106368. Методы создания антител. Как указано выше, антитела к DKK1, которые имеют последовательности VH и VL или последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, представленные в настоящем описании, можно применять для создания новых антител к DKK1/4 путем модификации последовательностей полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, последовательностей VH и/или VL или присоединенных к ним константных областей. Таким образом, согласно другому объекту изобретения структурные особенности антитела к DKK1, предлагаемого в изобретении, используют для создания структурно родственных антител к DKK1/4, которые сохраняют по меньшей мере одно из функциональных свойств антител, предлагаемых в изобретении, таких как связывание с человеческим DKK1 или DKK4 или с ними обоими, а также ингибирование одного или нескольких функциональных свойств DKK1 или DKK4 или их обоих. Например, один или несколько CDR-участков антител, предлагаемых в настоящем изобретении,или их мутантов можно объединять рекомбинантно с известными каркасными участками и/или другимиCDR для создания дополнительных, созданных с использованием рекомбинантной ДНК антител к DKK1,предлагаемых в изобретении, с помощью указанных выше методов. Другие типы модификаций включают модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для метода конструирования является одна или несколько последовательностей VH и/или VL, представленных в настоящем описании,или один или несколько из их CDR-участков. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т.е. экспрессия в виде белка) антитела, которое имеет одну или несколько из последовательностей VH и/или VL, представленных в настоящем описании, или одного или нескольких их CDR-участков. Предпочтительно информацию, содержащуюся в последовательности(ях),используют в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) "второго поколения",выведенной(ых) из исходной(ых) последовательности(ей), и затем получают последовательность(и) второго поколения и экспрессируют в виде белка. Таким образом, еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к DKK1, состоящего из последовательности VH-области, которая содержит последовательностьCDR1, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-5, 8-11, 20, 49-56, последовательность CDR2,выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 57-64, и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-20 и 65-72; и последовательности VL-области антитела, которая содержит последовательность CDR1, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 73-80,последовательность CDR2, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 81-88, и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 21-39 и 89-96; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности VH-области антитела и/или VL-области антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.- 28015538 Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к DKK1, состоящего из последовательности полноразмерной тяжелой цепи антитела, которая содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 115-117; и последовательности полноразмерной легкой цепи антитела, которая содержит последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 111-114; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности полноразмерной тяжелой цепи антитела и/или последовательности полноразмерной легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка. Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения композиции нейтрализующих антител к DKK1/4, оптимизированных для экспрессии в млекопитающих, которые состоят из последовательности VH-области антитела, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 119; и последовательности VL-области антитела, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 118; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности VHобласти антитела и/или в последовательности VL-области антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка. Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно применять стандартные методы молекулярной биологии. Антитело, кодируемое измененной(ыми) последовательностью(ями), представляет собой антитело, которое сохраняет одну, несколько или все функциональные свойства композиций нейтрализующих антител к DKK1/4, представленных в настоящем описании, где функциональные свойства представляют собой (но не ограничиваясь только ими) специфическое связывание с человеческим DKK1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка DKK1 с рецептором DKK1, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора DKK1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. Измененное антитело может область одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из указанных выше функциональных свойств. Функциональные свойства измененных антител можно оценивать с помощью стандартных анализов, известных в данной области и/или представленных в настоящем описании, таких как описанные в примерах (например, ELISA). В конкретных вариантах способов создания антител, предлагаемых в изобретении, мутации можно интродуцировать произвольно или избирательно во всю или в часть кодирующей последовательности антитела к DKK1 и полученные в результате модифицированные антитела к DKK1 можно подвергать скринингу в отношении связывающей активности и/или других описанных выше функциональных свойств. Методы интродукции мутаций известны в данной области. Например, в опубликованной заявкеPCT WO 02/092780 на имя Short описаны методы создания и скрининга мутаций антител с помощью насыщающего мутагенеза, синтетической сборки лигированием или с помощью комбинации этих методов. В опубликованной заявке PCT WO 03/074679 на имя Lazar с соавторами описаны альтернативные методы, основанные на вычислительном скрининге для оптимизации физико-химических свойств антител. Константная область Fc-фрагмента антитела имеет решающее значение в отношении времени полужизни в плазме и эффекторных функций, т.е. таких видов активности, как антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Можно создавать специфические мутации Fc-фрагмента для изменения эффекторной функции и/или времени полужизни в сыворотке (см., например, технологию фирмы Xencor, описанную, например,в WO 2004029207). Одним из путей изменения эффекторной функции и времени полужизни в сыворотке является трансплантация вариабельной области фрагмента антитела с использованием Fc-фрагмента, который обладает соответствующей эффекторной функцией. Изотипы IgG1 или IgG4 можно отбирать для достижения способности уничтожать клетки, а изотип IgG2 можно применять для получения молчащих или нейтрализующих антител (не обладающих способностью уничтожать клетки). Молчащие антитела с продолжительным временем полужизни в плазме можно получать путем химерного слияния вариабельных областей антитела с сывороточным белком, таким как ЧСА (человеческий сывороточный альбумин), или связывания белка с указанным сывороточным белком, получая слияние ЧСА - связывающий белок. Эффекторные функции можно изменять также, модулируя схему гликозилирования антитела. На фирмах Glycart (например, US 6602684), Biowa (например, US 6946292) и Genentech (например,WO 03/035835) созданы линии клеток млекопитающих, продуцирующих антитела с усиленной или ослабленной эффекторной функцией. Для усиления ADCC-активности можно применять прежде всего нефукозилированные антитела. На фирме Glycofi разработаны также линии клеток дрожжей, которые обладают способностью продуцировать специфические гликоформы антител.