Антиген-связывающая конструкция и ее применение

Изобретение относится к антиген-связывающей конструкции, способной связывать более чем один антиген, один из которых представляет собой интерлейкин-13 (IL-13), представляющей собой полноразмерную молекулу антитела, связанную с двумя отдельными вариабельными доменами иммуноглобулина, где указанная антиген-связывающая конструкция имеет 4 антигенсвязывающих сайта, два из которых имеют происхождение из спаренных доменов VH/VL молекулы антитела и два из которых имеют происхождение из указанных отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина, присоединенных к молекуле антитела, к полинуклеотиду, кодирующему указанную конструкцию, и содержащей его рекомбинантной клетке-хозяину, а также к способу получения такой конструкции и ее применению для лечения воспалительных заболеваний. Ашман Клэр, Батувангала Тил,Берден Майкл Нейл, Клегг Стефани Джейн, Де Уилдт Рудольф Мария,Эллис Джонатан Генри, Хамблин Пол Эндрю, Хуссейн Фархана, Джесперс Лорент, Льюис Алан, Ореккья Мартин Анибал, Шах Радха, Стюард Майкл (GB) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) Терапевтические применения антител хорошо известны. Антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые и две легкие цепи. За исключением IgM, интактные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных легких цепей (L-цепей) и двух идентичных тяжелых цепей (Н-цепей). Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулинов варьирует. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет дисульфидные связи внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следуют несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) и константную область на ее другом конце; константная область легкой цепи расположена на одном уровне с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи расположен на одном уровне с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи антител от большинства видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей человеческие антитела могут быть отнесены к пяти различным классам, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA могут быть дополнительно подразделены на подклассы, lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4; и lgA1 и lgA2. Видовые варианты существуют у мышей и крыс, имеющих, по меньшей мере, lgG2a, lgG2b. Вариабельный домен антитела придает антителу специфичность связывания посредством определенных областей, демонстрирующих исключительную вариабельность, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR). Более консервативные части вариабельной области называют каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен интактных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, соединенные тремя CDR. В каждой цепиFR-области удерживают CDR вместе в непосредственной близости, и эти CDR вместе с CDR другой цепи вовлечены в образование антиген-связывающего сайта антител. Константные области не являются непосредственно вовлеченными в связывание антигена антителом, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности(ADCC), фагоцитозе посредством связывания FcY-рецептора, периоде полувыведения/скорости клиренса через неонатальный Fc-рецептор (FcRn) и комплемент-зависимой цитотоксичности посредством C1q компонента системы комплемента. Характер структуры антитела IgG таков, что в нем присутствуют два антиген-связывающих сайта,специфичных в отношении одного и то же эпитопа. Таким образом, они являются моноспецифичными. Биспецифичное антитело представляет собой антитело, имеющее специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Способы получения таких антител известны в данной области техники. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар Н-цепь-L-цепь иммуноглобулина, где две Н-цепи имеют различные специфичности связывания, см. Millstein et al, Nature 305537-539 (1983), WO 93/08829 и Traunecker et al. EMBO, 10,1991, 3655-3659. Ввиду случайного распределения Н- и L-цепей возможно получение смеси десяти различных структур антител, из которых только одна имеет желаемую специфичность связывания. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов с желаемыми специфичностями связывания с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, областями СН 2 и СН 3. Предпочтительно по меньшей мере в одном из компонентов, подвергаемых слиянию,присутствует область СН 1, содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующую эти компоненты, подвергаемые слиянию, и, если желательно, L-цепь, вводят в раздельные векторы экспрессии и затем котрансфицируют ими подходящий организм-хозяин. Тем не менее, возможно введение кодирующих последовательностей для двух или всех трех цепей в один вектор экспрессии. В одном способе, биспецифичное антитело состоит из Н-цепи с первой специфичностью связывания на одном плече и парой Н-цепь-L-цепь, обеспечивающей вторую специфичность связывания, на другом плече, см. WO 94/04690. Также см. Suresh et al. Methods in Enzymology 121, 210, 1986. Другие подходы включают молекулы антител, содержащие однодоменные сайты связывания, изложенные в WO 2007/095338. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к антиген-связывающей конструкции, способной связывать более чем один антиген, один из которых представляет собой интерлейкин-13 (IL-13), представляющей собой полноразмерную молекулу антитела, связанную с двумя отдельными вариабельными доменами иммуноглобулина, где указанная антиген-связывающая конструкция имеет 4 антиген-связывающих сайта, два из которых имеют происхождение из спаренных доменов VH/VL молекулы антитела, и два из которых имеют происхождение из указанных отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина, присоединенных к молекуле антитела. Предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека. Также предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдель-1 023031 ный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представителя семейства Верблюдовых. Также предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина акулы (NARV). Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, способная связывать интерлейкин-4 (IL-4). Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, способная связывать интерлейкин-5 (IL-5). Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, как она определена выше, где молекула антитела относится к изотипу иммуноглобулинов G (IgG). Предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция, как она определена выше, где по меньшей мере один из отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина непосредственно присоединен к молекуле антитела линкером, содержащим 1-50 аминокислот. Более предпочтительной является такая антиген-связывающая конструкция по изобретению, где линкер имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-11 или GS, либо является любой их комбинацией. Также более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция по изобретению, где линкер содержит последовательность SEQ ID NO:7. Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция,как она определена выше, в которой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина присоединен к молекуле антитела на С-конце тяжелой цепи. Более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против IL-13 с присоединенным к С-концу или N-концу тяжелой цепи либо к С-концу или N-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против IL-4. Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, в которой последовательность легкой цепи антитела представляет собой SEQ ID NO: 13. Также более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против IL-5 с присоединенным отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против IL-13. Еще более предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, представляющая собой антитело против IL-5 с присоединенным к С-концу или N-концу тяжелой цепи либо к С-концу или Nконцу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина против IL-13. Наиболее предпочтительной является антиген-связывающая конструкция, в которой тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:65, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:66, и особенно антигенсвязывающая конструкция, в которой последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:72, которая включает SEQ ID NO:66. Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция,представляющая собой антитело против IL-4 с присоединенным к С-концу или N-концу тяжелой цепи либо к С-концу или N-концу легкой цепи отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина противIL-13. Также предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция по изобретению, в которой тяжелая цепь антитела представляет собой SEQ ID NO: 12, последовательность линкера представляет собой SEQ ID NO: 7 и отдельный вариабельный домен иммуноглобулина имеет последовательность SEQ ID NO: 3. Еще один предпочтительный аспект изобретения составляет антиген-связывающая конструкция по изобретению, способная связывать IL-13 и IL-4, в которой последовательность тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 26, и последовательность легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 13. Согласно настоящему изобретению предложен также полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела антиген-связывающей конструкции, как она определена выше. Изобретение также относится к рекомбинантной трансформированной или трансфицированной клетке-хозяину, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, как он определен выше. Соглано изобретению предложен способ получения антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, как она определена выше, и выделения антиген-связывающей конструкции. Также изоретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антиген-связывающую конструкцию, как она определена выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно изобретению также предложено применение антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, в изготовлении лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний. Изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего от воспалительного заболевания, такого как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит, включающий введение терапевтического количества антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению. Согласно изобретению также предложено применение антиген-связывающей конструкции, как она определена выше, для лечения воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит. Определения При использовании здесь термин "белковый каркас" включает, без ограничения, каркас на основе иммуноглобулина (lg), например иммуноглобулина G (IgG), который может представлять собой четырехцепочечное или двуцепочечное антитело, или который может содержать только Fc-область антитела,или который может содержать одну или более чем одну константную область антитела, которая может иметь происхождение из человека или примата, или которая может представлять собой искусственную химерную конструкцию константных областей человека и примата. Такие белковые каркасы могут содержать антиген-связывающие сайты в дополнение к одной или более чем одной константной области,например, где белковый каркас содержит полный IgG. Будет возможным связывание таких белковых каркасов с другими белковыми доменами, например, белковыми доменами, имеющими антигенсвязывающие сайты, например, эпитоп-связывающими доменами или доменами ScFv."Домен" представляет собой прошедшую фолдинг белковую структуру, имеющую третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев, домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. "Отдельный вариабельный домен антитела" представляет собой прошедший фолдинг полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петли были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены, которые были процессированы или содержат N- или С-концевые расширения, а также прошедшие фолдинг фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие по меньшей мере связывающую активность и специфичность связывания полноразмерного домена. Фраза "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от другой вариабельной области (V-области) или домена. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не являются необходимыми для связывания антигена отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (то есть, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Однодоменное антитело" или "dAb" в качестве используемого здесь термина является тем же,что и "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина", способный связывать антиген. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий вариабельный домен антитела,но также включает отдельные вариабельные домены антител от других видов, такие как dAb грызунов(например, как раскрыто в WO 00/29004), акулы-няньки и VHH dAb представителей семейства Верблюдовых. VHH представителей семейства Верблюдовых являются полипептидами отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, имеющими происхождение из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, одногорбого верблюда и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. Такие домены VHH могут быть гуманизированы по стандартным методикам, доступным в данной области техники, и такие домены все еще рассматривают как "однодоменные антитела" по изобретению. При использовании здесь "VH" включает домены VHH представителей семейства Верблюдовых. NARV представляют собой другой тип отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, обнаруженных у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельная область нового рецептора антигенов (Novel Antigen Receptor variable region, обычно сокращаемая как V(NAR) или NARV). Более подробно см. Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) и US 20050043519 А. Термин "эпитоп-связывающий домен" относится к домену, специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от другой V-области или домена, он может представлять собой однодоменное антитело (dAb), например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека, представителя семейства Верблюдовых или акулы. При использовании здесь термины "спаренный домен VH", "спаренный домен VL" и "спаренные домены VH/VL" относятся к вариабельным доменам антител, специфично связывающим антиген только в паре с их вариабельным доменом-партнером. В любой паре всегда присутствует один VH и один VL, и термин "спаренный домен VH" относится к VH-партнеру, термин "спаренный домен VL" относится кVL-партнеру, и термин "спаренные домены VH/VL" относится к двум доменам вместе. В одном воплощении изобретения антиген-связывающий сайт связывает антиген с Kd по меньшей мере 1 мМ, например Kd 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 200 пМ, 100 пМ, для каждого антигена, как измерено посредством Biacore, как например способ Biacore, как описано в способе 4 или 5. При использовании здесь термин "антиген-связывающий сайт" относится к сайту на конструкции,способному специфично связывать антиген, он может представлять собой отдельный домен, например,эпитоп-связывающий домен, или он может представлять собой спаренные домены VHA/L, которые можно обнаружить в стандартном антителе. В некоторых аспектах изобретения антиген-связывающие сайты могут быть обеспечены одноцепочечными доменами Fv (ScFv). Термины "mAb/dAb" и "dAb/mAb" использованы здесь для обозначения антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению. Два термина могут быть использованы взаимозаменяемо, и подразумевают, что при использовании здесь они имеют одинаковое значение. Термин "константный домен тяжелой цепи 1" использован здесь для обозначения домена СН 1 тяжелой цепи иммуноглобулина. Термин "константный домен легкой цепи" использован здесь для обозначения константного домена легкой цепи иммуноглобулина. Подробное описание изобретения Некоторые примеры антиген-связывающих конструкций по изобретению изложены на фиг. 1. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению также называют mAbdAb. В одном воплощении белковый каркас антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению представляет собой lg, например, IgG или IgA. IgG может включать все домены антитела (то есть,СН 1, СН 2, СН 3, VH, VL). Антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может содержать IgG, выбранный из lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 или lgG4PE. В одном воплощении настоящего изобретения эпитоп-связывающий домен представляет собойdAb. Следует понимать, что любая из антиген-связывающих конструкций, описанных здесь, будет способна нейтрализовать один более чем один антиген. Термин "нейтрализует" и его грамматические вариации при использовании в настоящем описании в отношении антиген-связывающих конструкций по изобретению обозначают, что биологическая активность мишени снижена, полностью или частично, в присутствии антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению по сравнению с активностью мишени в отсутствие таких антигенсвязывающих конструкций. Нейтрализация может быть обусловлена, без ограничения, одним или более из следующего: блокады связывания лиганда, предотвращения активации рецептора лигандом, понижающей регуляции рецептора или воздействия на эффекторную функцию. Степени нейтрализации могут быть измерены несколькими способами, например, применением любого из анализов, как изложено в примерах и способах ниже, например, в анализе, при котором измеряют ингибирование связывания лиганда с рецептором, который может быть проведен, например, как описано в любом из способов 12, 19 или 21 или примере 32. Нейтрализацию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина-4 (IL-4), IL-13 или фактора роста гепатоцитов (HGF) в этих анализах измеряли оценкой сниженного связывания между лигандом и его рецептором в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции. Степени нейтрализации могут также быть измерены, например, в анализе TF1, который может быть проведен, например, как описано в способе 8, 9, 10, 20 или 21. Нейтрализацию IL-13, IL-4 или обоих этих цитокинов в этом анализе измеряют оценкой ингибирования пролиферации клеток TF1 в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции. Альтернативно, нейтрализация может быть измерена в анализе фосфорилирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который может быть проведен, например, как описано в способе 13. Нейтрализацию EGFR в этом анализе измеряют оценкой ингибирования фосфорилирования тирозинкиназы рецептора в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции. Или нейтрализация может быть измерена в анализе секреции IL-8 клетками MRC-5, который может быть проведен, например, как описано в способе 14 или 15. Нейтрализацию фактора некроза опухоли-а (TNFa) или рецептора интерлейкина-1 1 типа (IL-1R1) в этом анализе измеряют оценкой ингибирования секреции IL-8 в присутствии нейтрализующей антиген-связывающей конструкции. В данной области техники известны другие способы оценки нейтрализации, например оценкой сниженного связывания между лигандом и его рецептором в присутствии нейтрализующей антигенсвязывающей конструкции, и они включают, например, анализы Biacore. В альтернативном аспекте настоящего изобретения предложены антиген-связывающие конструкции, имеющие по меньшей мере по существу эквивалентную нейтрализующую активность по сравнению с антителами, примеры которых приведены здесь, например, антиген-связывающие конструкции, сохраняющие нейтрализующую активность 586H-TVAAPS-210 или PascoH-G4S-474, или PascoH-474, PascoH474 с удаленным GS, PascoL-G4S-474 или PascoHL-G4S-474, в анализе пролиферации клеток TF1 или анализе ингибирования сигналинга pSTAT6, как изложено в примерах 4 и 20, соответственно, или, например, антиген-связывающие конструкции, сохраняющие нейтрализующую активность ВРС 1603,-4 023031 ВРС 1604, ВРС 1605, ВРС 1606 в анализе связывания VEGFR или ингибирования фосфорилирования рецепторов инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1R), как изложено в примерах 14.6 и 14.7. Антиген-связывающие конструкции по изобретению представляют собой антиген-связывающие конструкции, имеющие специфичность в отношении IL-13, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать IL-13, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий IL-13. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать IL-13. Антигенсвязывающая конструкция может включать dAb, способное связывать IL-13. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из IL-13, IL-5 и IL-4, например, где она способна связывать IL-13 и IL4, или где она способна связывать IL-13 и IL-5, или где она способна связывать IL-5 и IL-4. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из IL-13, IL-5 и IL-4, например, где она способна связывать IL-13 и IL-4 одновременно, или где она способна связывать IL-13 и IL-5 одновременно, или где она способна связывать IL-5 и IL-4 одновременно. Следует понимать, что любая из антиген-связывающих конструкций, описанных здесь, может быть способна связывать два или более чем два антигена одновременно, например, как определено стехиометрическим анализом с применением подходящего анализа, такого как описанный в разделе примеры, способе 7. Примеры антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к IL-13, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-4, например dAb против IL-4, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 16-39, SEQ ID NO: 4143, SEQ ID NO: 87-90, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 или SEQ ID NO: 155. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитоп-связывающим доменом кIL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к Nконцу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитопсвязывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-4, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении IL-13, например, dAb против IL-13, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например, mAbdAb,имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 48-53, SEQ ID NO: 91, SEQ IDNO: 92, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150 или SEQ ID NO: 157-160, и/или последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 54-59. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом кIL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к Сконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к IL-13,имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-5, например, dAb против IL5, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитопсвязывающим доменом к IL-5, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5,присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-13 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL13 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/илиN-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении IL-13, например, dAb против IL-13, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например mAbdAb,имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 72. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом кIL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к Сконцу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций по изобретению включают антитела к IL-4,имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-5, например dAb против IL-5,присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитопсвязывающим доменом к IL-5, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5,присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-4 с эпитоп-связывающим доменом к IL-5, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/илиN-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении IL-4, например, dAb против IL-4, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например, mAbdAb, имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 71. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом кIL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антигенсвязывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/илиN-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Согласно изобретению также предложена триспецифичная связывающая конструкция, способная связывать IL-4, IL-13 и IL-5. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-5, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении IL-4, например, dAb против IL-4, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-13, например, dAb против IL-13, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-5 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении IL-18, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать IL-18, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий IL-18. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать IL-18. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать IL-18. Согласно изобретению также предложена триспецифичная связывающая конструкция, способная связывать IL-4, IL-13 и IL-18. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-18, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении IL-4, например dAb против IL-4, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-13, например, dAb против IL-13, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к N-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу тяжелой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-18 с эпитоп-связывающим доменом к IL-4, присоединенным к С-концу легкой цепи, и эпитоп-связывающим доменом к IL-13, присоединенным к N-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении TNF, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать TNF, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий TNF. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать TNF. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать TNF. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из TNFa, EGFR и VEGF, например, где она способна связывать TNFa иEGFR, или где она способна связывать TNFa и VEGF, или где она способна связывать EGFR и VEGF. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к TNFa, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении EGFR, например, dAb против EGFR, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 74, и/или последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 79. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к EGFR, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом кEGFR, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к EGFR, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к EGFR, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к EGFR с эпитоп-связывающим доменом к TNF, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к EGFR с эпитопсвязывающим доменом к TNF, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к EGFR с эпитоп-связывающим доменом кTNF, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к EGFR с эпитоп-связывающим доменом к TNF, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена,присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к TNF, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении VEGF, например, dAb против VEGF, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 75, 78 или 185. Антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может иметь специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать TNF, и один или оба антигена, выбранные из IL-4 и IL-13, например, где она способна связывать TNF и IL-4, или где она способна связывать TNF и IL-13, или где она способна связывать TNF и IL-13 и IL-4. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IL-13, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении TNF, например, аднектин против TNF, присоединенный к С-концу илиN-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например, mAbdAb, имеющее последова-8 023031 тельность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 134 или 135. Другие примеры таких антигенсвязывающих конструкций включают антитела к IL-4, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении TNF, например, аднектин против TNF, присоединенный к С-концу или Nконцу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например, mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 146 или 147. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к VEGF, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом кVEGF, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к VEGF, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к TNF с эпитоп-связывающим доменом к VEGF, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитопсвязывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом к TNF, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитопсвязывающим доменом к TNF, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом кTNF, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом к TNF, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена,присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении CD-20, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать CD-20, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий CD-20. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать CD-20, например, она может включать антитело, имеющее последовательности тяжелой и легкой цепи SEQ ID NO: 120 и 117. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать CD-20. Примеры mAbdAb со специфичностью в отношении CD-20 представляют собой mAbdAb, имеющие последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 116, 118, или mAbdAb, имеющие последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 119 или 121. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении IL-1R1, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать IL-1R1, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий IL-1R1. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать IL-1R1. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать IL-1R1. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать IL-1 R1 и второй антиген, например, где она способна связывать IL-1 R1 и VEGF. Примеры таких антигенсвязывающих конструкций включают антитела к IL-1R1, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении VEGF, например, dAb против VEGF, присоединенный к С-концу или Nконцу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например, mAbdAb, имеющее последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 77. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-1R1 с эпитоп-связывающим доменом к VEGF, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антигенсвязывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-1R1 с эпитопсвязывающим доменом к VEGF, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-1R1 с эпитоп-связывающим доменом кVEGF, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к IL-1R1 с эпитоп-связывающим доменом к VEGF, присоединенным к С-концу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена,присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом к IL-1R1, присоединенным к N-концу тяжелой цепи. Антиген-9 023031 связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитопсвязывающим доменом к IL-1R1, присоединенным к N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом к IL-1R1, присоединенным к С-концу тяжелой цепи. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению включают антитела к VEGF с эпитоп-связывающим доменом к IL-1R1, присоединенным к Сконцу легкой цепи. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена,присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении EGFR, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать EGFR, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий EGFR. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать EGFR. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать EGFR. Некоторые примеры такой антиген-связывающей конструкции будут способны связывать эпитоп на EGFR, содержащий SEQID NO: 103, например, антиген-связывающая конструкция, содержащая одну или более чем одну CDR,изложенную в SEQ ID NO: 97 - SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 104-SEQ ID NO: 107. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более антигена, выбранные из EGFR, IGF-1R, рецептора VEGF 2 типа (VEGFR2) и VEGF, например, где она способна связывать EGFR и IGF-1R, или где она способна связывать EGFR и VEGF, или где она способна связывать VEGF и IGF-1R, или где она способна связывать EGFR и VEGFR2, или где она способна связывать IGF-R1 и VEGFR2, или где она способна связывать VEGF и VEGFR2, или где она способна связывать EGFR, IGF-1R и VEGFR2, или где она способна связывать VEGF, IGF-1R и VEGFR2, или где она способна связывать EGFR, VEGF, и VEGFR2, или где она способна связывать EGFR, VEGF и IGF1R. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к EGFR, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении VEGFR2, например, аднектин против VEGFR2,присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 136, 140 или 144,и/или последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 138, 142 или 145. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к EGFR, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении VEGF, например, dAb против VEGF, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 165, 174, 176, 178, 184 или 186, и/или последовательность легкой цепи, изложенную B SEQ ID NO: 188 или 190. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к VEGF, имеющие эпитопсвязывающий домен со специфичностью в отношении EGFR, например, dAb против EGFR, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 180. Такие mAbdAb могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 182. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IGF-1R, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении VEGF, например, липокалин против VEGF,присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи, например,mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 123 или 125. ТакиеmAbdAb могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 113. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела к IGF-1 R, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении VEGFR2, например, аднектин противVEGFR2, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи,например, mAbdAb, имеющее последовательность тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 124 или 133. Такие mAbdAb могут также содержать последовательность легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 113. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении IL-23, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать IL-23, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий IL-23. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать IL-23. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать IL-23. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из цитокинов ТН 17-типа, например, IL-17, IL-22 или IL-21, например,где она способна связывать IL-23 и IL-17, или где она способна связывать IL-23 и IL-21, или где она способна связывать IL-23 и IL-22. Примеры таких антиген-связывающих конструкций включают антитела кIL-23, имеющие эпитоп-связывающий домен со специфичностью в отношении IL-17, например, dAb против IL-17, присоединенный к С-концу или N-концу тяжелой цепи или С-концу или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении а-рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFRa), например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать PDGFRa, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий PDGFRa. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать PDGFRa. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать PDGFRa. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении рецептора фактора роста фибробластов 1 типа (FGFR1), например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать FGFR1, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий FGFR1. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать FGFR1. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связыватьFGFR1. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении рецептора фактора роста фибробластов 3 типа (FGFR3), например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать FGFR3, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий FGFR3. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать FGFR3. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связыватьFGFR3. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении VEGFR2, например, содержащие эпитоп-связывающий домен,способный связывать VEGFR2, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий VEGFR2. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать VEGFR2. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать VEGFR2. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении рецетора VEGF 3 типа (VEGFR3), например, содержащие эпитопсвязывающий домен, способный связывать VEGFR3, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий VEGFR3. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать VEGFR3. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать VEGFR3. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении VE-кадгерина, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать VE-кадгерин, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий VEкадгерин. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать VE-кадгерин. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать VE-кадгерин. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении нейропилина, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать нейропилин, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий нейропилин. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать нейропилин. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать нейропилин. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении Flt-3, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать Flt-3, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий Flt-3. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать Flt-3. Антигенсвязывающая конструкция может включать dAb, способное связывать Flt-3. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении ron, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать ron, или содержащие спаренные домены VH/VL, связывающие ron. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать ron. Антигенсвязывающая конструкция может включать dAb, способное связывать ron. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении Trp-1, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать Trp-1, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий Trp-1. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать Trp-1. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать Trp-1. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению имеет специфичность в отношении более чем одного антигена, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, вовлеченные в рак, например, где она способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из PDGFRa, FGFR1, FGFR3, VEGFR2, VEGFR3, IGF1R, EGFR и VEGF, VEкадгерина, нейропилина, Flt-3, ron, Trp-1, CD-20, например, где она способна связывать PDGFR иFGFR1, или где она способна связывать PDGFR и VEGF, или где она способна связывать PDGFR иFGFR3, или где она способна связывать PDGFR и VEGFR2, или где она способна связывать PDGFR иVEGFR3, или где она способна связывать PDGFR и IGF1R, или где она способна связывать PDGFR иEGFR, или где она способна связывать PDGFR и VEGF, или где она способна связывать PDGFR и VEкадгерин, или где она способна связывать PDGFR и нейропилин, или где она способна связыватьPDGFR и Flt-3, или где она способна связывать PDGFR и ran, или где она способна связыватьPDGFR и Trp1, или где она способна связывать PDGFR и CD-20, или где она способна связыватьFGFR1 и FGFR3, или где она способна связывать FGFR1 и VEGFR2, или где она способна связыватьFGFR1 и VEGR3, или где она способна связывать FGFR1 и IGF1R, или где она способна связыватьFGFR1 и EGFR, или где она способна связывать FGFR1 и VEGF, или где она способна связывать FGFR1 и VE-кадгерин, или где она способна связывать FGFR1 и нейропилин, или где она способна связыватьFGFR1 и Flt-3, или где она способна связывать FGFR1 и ron, или где она способна связывать FGFR1 иTrp-1, или где она способна связывать FGFR1 и CD-20, или где она способна связывать FGFR3 иVEGFR2, или где она способна связывать FGFR3 и VEGFR3, или где она способна связывать FGFR3 иIGF1R, или где она способна связывать FGFR3 и EGFR, или где она способна связывать FGFR3 и VEGF,или где она способна связывать FGFR3 и VE-кадгерин, или где она способна связывать FGFR3 и нейропилин, или где она способна связывать FGFR3 и Flt-3, или где она способна связывать FGFR3 и ron, или где она способна связывать FGFR3 и Trp-1, или где она способна связывать FGFR3 и CD-20, или где она способна связывать VEGFR2 и VEGFR3, или где она способна связывать VEGFR2 и IGF1R, или где она способна связывать VEGFR2 и EGFR, или где она способна связывать VEGFR2 и VEGF, или где она способна связывать VEGFR2 и VE-кадгерин, или где она способна связывать VEGFR2 и нейропилин,или где она способна связывать VEGFR2 и Flt-3, или где она способна связывать VEGFR2 и ron, или где она способна связывать VEGFR2 и Trp-1, или где она способна связывать VEGFR2 и CD-20, или где она способна связывать VEGFR3 и IGF-1 R, или где она способна связывать VEGFR3 и EGFR, или где она способна связывать VEGFR3 и VEGF, или где она способна связывать VEGFR3 и VE-кадгерин, или где она способна связывать VEGFR3 и нейропилин, или где она способна связывать VEGFR3 и Flt-3, или где она способна связывать VEGFR3 и Trp-1, или где она способна связывать VEGFR3 и CD-20, или где она способна связывать IGF1R и EGFR, или где она способна связывать IGF1R и VEGF, или где она способна связывать IGF1R и VE-кадгерин, или где она способна связывать IGF1R и нейропилин, или где она способна связывать IGF1R и Flt-3, или где она способна связывать IGF1R и ron, или где она способна связывать IGF1R и Тrр-1, или где она способна связывать IGF1R и CD-20, или где она способна связывать EGFR и VEGF, или где она способна связывать EGFR и VE-кадгерин, или где она способна связывать EGFR и нейропилин, или где она способна связывать EGFR и Flt-3, или где она способна связыватьEGFR и ron, или где она способна связывать EGFR и Тrр-1, или где она способна связывать EGFR и CD20, или где она способна связывать VEGF и VE-кадгерин, или где она способна связывать VEGF и нейропилин, или где она способна связывать VEGF и Flt-3, или где она способна связывать VEGF и ron, или где она способна связывать VEGF и Тrр-1, или где она способна связывать VEGF и CD-20, или где она способна связывать VE-кадгерин и нейропилин, или где она способна связывать VE-кадгерин и Flt-3, или где она способна связывать VE-кадгерин и ron, или где она способна связывать VE-кадгерин и Trp-1, или где она способна связывать VE-кадгерин и CD-20, или где она способна связывать нейропилин и Flt-3,или где она способна связывать нейропилин и ron, или где она способна связывать нейропилин и Trp-1,или где она способна связывать нейропилин и CD-20, или где она способна связывать Flt-3 и ron, или где она способна связывать Flt-3 и Trp-1, или где она способна связывать Flt-3 и CD-20, или где она способна связывать ran и Trp-1, или где она способна связывать гоп и CD-20, и или где она способна связыватьTrp-1 и CD-20. Такие антиген-связывающие конструкции могут также иметь один или более чем один другой эпитоп-связывающий домен с такой же или другой специфичностью в отношении антигена, присоединенный к С-концу и/или N-концу тяжелой цепи и/или С-концу и/или N-концу легкой цепи. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении бета-амилоида, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать бета-амилоид, или содержащие спаренный домен VHA/L, связывающий бетаамилоид. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать бета-амилоид. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать бета-амилоид. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении CD-3, например, содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать CD-3, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий CD-3. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать CD-3. Антигенсвязывающая конструкция может включать dAb, способное связывать CD-3. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении gpIIIb/IIa, например, содержащие эпитоп-связывающий домен,- 12023031 способный связывать gpIIIb/IIa, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий gpIIIb/IIa. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать gpIIIb/IIa. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать gpIIIb/IIa. Антиген-связывающие конструкции по изобретению включают антиген-связывающие конструкции,имеющие специфичность в отношении трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета), например,содержащие эпитоп-связывающий домен, способный связывать TGF-бета, или содержащие спаренный домен VH/VL, связывающий TGF-бета. Антиген-связывающая конструкция может включать антитело, способное связывать TGF-бета. Антиген-связывающая конструкция может включать dAb, способное связывать TGF-бета. В одном воплощении настоящего изобретения предложена антиген-связывающая конструкция по изобретению, описанная здесь и содержащая такую константную область, что антитело имеет сниженную функцию ADCC и/или активации комплемента, или эффекторную функцию. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи может включать естественную неполноценную константную область изотипа lgG2 или lgG4 или мутированную константную область lgG1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР 0307434. Один пример включает замены аланиновых остатков в положениях 235 и 237 (нумерация EU). В одном воплощении антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению будут сохранять Fc-функцию, например, будут способны к ADCC-активности и/или CDC-активности. Такие антиген-связывающие конструкции могут содержать эпитоп-связывающий домен, расположенный на легкой цепи, например на С-конце легкой цепи. Согласно изобретению также раскрыт способ сохранения функции ADCC и CDC антигенсвязывающих конструкций расположением эпитоп-связывающего домена на легкой цепи антитела, в частности, расположением эпитоп-связывающего домена на С-конце легкой цепи. Такая функция ADCC и CDC может быть измерена любым подходящим анализом, например, анализом ADCC, изложенным в примере 15.3, и анализом CDC, изложенным в примере 15.4. Согласно изобретению также раскрыт способ снижения функции CDC антиген-связывающих конструкций расположением эпитоп-связывающего домена на тяжелой цепи антитела, в частности, расположением эпитоп-связывающего домена на С-конце тяжелой цепи. Такая функция CDC может быть измерена любым подходящим анализом, например, анализом CDC, изложенным в примере 15.4. В другом воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению способна связывать два или более чем два антигена, выбранные из VEGF, IGF-1R и EGFR, например, она способна связывать EGFR и VEGF, или EGFR и IGF-1R, или IGF-1R и VEGF, или, например, она способна связывать TNF и IL1-R. В воплощениях изобретения, включающих связывающий сайт для IGF-1R, связывающий сайт для IGF-1R антиген-связывающей конструкции по изобретению может содержать спаренный домен VH/VL в белковом каркасе, причем спаренный домен VH/VL может содержать одну или более чем одну из CDR, выбранных из CDR, изложенных в SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82,SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 86, например, он может содержать по меньшей мере третью область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (CDRH3), как изложено в SEQ ID NO: 80, например, он может содержать все CDR, изложенные в SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81,SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 86. В воплощениях изобретения, включающих связывающий сайт для EGFR, антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению может связывать эпитоп, включающий остатки 273-501 зрелой или нормальной последовательности EGFR или последовательности EGFR дикого типа, например, она может связывать эпитоп, включающий остатки 287-302 зрелого или нормального EGFR или EGFR дикого типа (SEQ ID NO: 103). В одном воплощении связывающий сайт для EGFR антиген-связывающей конструкции по изобретению может содержать спаренный домен VH/VL в белковом каркасе, причем спаренный домен VH/VL может содержать одну или более чем одну из CDR, выбранных из CDR, изложенных в SEQ ID NO: 104,SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102, например, он может содержать CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 106, или он может содержать все шесть CDR, изложенные в SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 и SEQID NO: 102. Такой спаренный домен VH/VL может дополнительно содержать дополнительные остатки, в частности, в CDR тяжелой цепи, и в одном воплощении CDRH1 может содержать SEQ ID NO: 104 и еще до пяти дополнительных остатков, например, один или более чем один из пяти дополнительных остатков, изложенных в SEQ ID NO: 97, CDRH2 может содержать SEQ ID NO: 105 и еще до двух дополнительных остатков, например, один или оба из двух дополнительных остатков, изложенных в SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 107, и CDRH3 может содержать SEQ ID NO: 106 и еще до двух дополнительных остатков, например, один или оба из двух дополнительных остатков, изложенных в SEQ ID NO: 99. В одном таком воплощении спаренный домен VH/VL содержит одну или более чем одну CDR, изложенную вSEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102, например, он может содержать по меньшей мере CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 99, например, он может содержать все шесть CDR, изложенные в SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ IDNO: 100, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102 (более подробно о подходящих антителах см. WO 02/092771 и WO 2005/081854). Антиген-связывающие конструкции по изобретению содержат эпитоп-связывающий домен, представляющий собой однодоменное антитело (dAb), например, эпитоп-связывающий домен может представлять собой человеческий VH или человеческий VL, или VHH представителя семейства Верблюдовых или dAb акулы (NARV). Белковые каркасы по настоящему изобретению могут быть связаны с эпитоп-связывающими доменами с применением линкеров. Примеры подходящих линкеров включают аминокислотные последовательности, которые могут иметь длину от 1 аминокислоты до 150 аминокислот, или от 1 до 140 аминокислот, например, от 1 до 130 аминокислот, или от 1 до 120 аминокислот, или от 1 до 80 аминокислот,или от 1 до 50 аминокислот, или от 1 до 20 аминокислот, или от 1 до 10 аминокислот, или от 5 до 18 аминокислот. Такие последовательности могут иметь свою собственную третичную структуру, например, линкер по настоящему изобретению может содержать отдельный вариабельный домен. В одном воплощении размер линкера эквивалентен отдельному вариабельному домену. Подходящие линкеры могут иметь размер 1-20 ангстрем (0,1-2 нм), например, менее 15 ангстрем (1,5 нм) или менее 10 ангстрем (1 нм), или менее 5 ангстрем (0,5 нм). В одном воплощении настоящего изобретения по меньшей мере один из эпитоп-связывающих доменов непосредственно присоединен к каркасу IgG линкером, содержащим от 1 до 50 аминокислот, например, от 1 до 20 аминокислот, например, от 1 до 10 аминокислот. Такие линкеры могут быть выбраны из любого, изложенного в SEQ ID NO: 6-11, "STG" (серин, треонин, глицин), "GSTG" или "RS", например, линкер может представлять собой "TVAAPS", или линкер может представлять собой "GGGGS". Линкеры, используемые в антиген-связывающих конструкциях по настоящему изобретению, могут содержать, сами по себе или в дополнение к другим линкерам, одну или более чем одну группу остатковGS, например, "GSTVAAPS" или "TVAAPSGS", или "GSTVAAPSGS". В другом воплощении между эпитоп-связывающим доменом, например, dAb, и каркасом lg нет линкера. В другом воплощении эпитопсвязывающий домен, например, dAb, связан с каркасом lg линкером "TVAAPS". В другом воплощении эпитоп-связывающий домен, например, dAb, связан с каркасом lg линкером "TVAAPSGS". В другом воплощении эпитоп-связывающий домен, например, dAb, связан с каркасом lg линкером "GS". В одном воплощении антиген-связывающая конструкция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один эпитоп-связывающий домен, способный связывать человеческий сывороточный альбумин. В одном воплощении антиген-связывающая конструкция способна связывать 3 или 4 антигена, например, она способна связывать 3 или 4 антигена одновременно. Согласно изобретению также предложены антиген-связывающие конструкции для применения в медицине, например, для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит. Согласно изобретению также предложен способ лечения пациента, страдающего от рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит, включающий введение терапевтического количества антиген-связывающей конструкции по изобретению. Антиген-связывающие конструкции по изобретению могут быть использованы для лечения рака или воспалительных заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит или остеоартрит. Антиген-связывающие конструкции по изобретению могут иметь некоторую эффекторную функцию. Например, если белковый каркас содержит Fc-область, имеющую происхождение из антитела с эффекторной функцией, например, если белковый каркас содержит СН 2 и СН 3 из lgG1. Уровни эффекторной функции могут быть изменены в соответствии с известными методиками, например, мутациями в домене СН 2, например, где домен СН 2 lgG1 имеет одну или более чем одну мутацию в положениях, выбранных из выбранных из 239 и 332, и 330, например, мутации выбраны из S239D и I332E, и A330L, таким образом, что антитело имеет усиленную эффекторную функцию, и/или, например, изменением профиля гликозилирования антиген-связывающей конструкции по изобретению, таким образом, что фукозилирование Fc-области снижено. Белковые каркасы, используемые в настоящем изобретении включают полные каркасы моноклональных антител, содержащие все домены антитела, или белковые каркасы по настоящему изобретению могут содержать структуру необычного антитела, такого как моновалентное антитело. Такие моновалентные антитела могут содержать спаренные тяжелые и легкие цепи, где шарнирная область тяжелой цепи модифицирована таким образом, что тяжелые цепи не образуют гомодимеров, как например моновалентное антитело, описанное в WO 2007059782. Другие моновалентные антитела могут содержать спаренную тяжелую и легкую цепь, образующую димеры со второй тяжелой цепью без функциональной вариабельной области и области СН 1, где первая и вторая тяжелые цепи модифицированы таким образом, что они скорее будут образовывать гетеродимеры, а не гомодимеры, что приводит к образованию моновалентного антитела с двумя тяжелыми цепями и одной легкой цепью, как например моновалентное антитело, описанное в WO 2006015371. Такие моновалентные антитела могут обеспечить белковый каркас по настоящему изобретению, к которому могут быть присоединены эпитоп-связывающие домены,- 14023031 например, такие как антиген-связывающие конструкции, описанные в примере 32. Эпитоп-связывающие домены, используемые в настоящем изобретении, представляют собой домены, специфично связывающие антиген или эпитоп, независимо от другой V-области или домена, он может представлять собой однодоменное антитело. Эпитоп-связывающие домены могут быть связаны с белковым каркасом в одном или более чем одном положении. Эти положения включают С-конец и N-конец белкового каркаса, например, С-конец тяжелой цепи и/или С-конец лекой цепи IgG, или, например, N-конец тяжелой цепи и/или N-конец легкой цепи IgG. В одном воплощении первый эпитоп-связывающий домен связан с белковым каркасом, а второй эпитоп-связывающий домен связан с первым эпитоп-связывающим доменом, например, там, где белковый каркас представляет собой каркас IgG, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с Сконцом тяжелой цепи каркаса IgG, и этот эпитоп-связывающий домен может быть связан своим Сконцом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с С-концом легкой цепи каркаса IgG, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим С-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с N-концом легкой цепи каркаса IgG, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим N-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом, или, например, первый эпитоп-связывающий домен может быть связан с N-концом тяжелой цепи каркаса IgG, и этот первый эпитоп-связывающий домен может также быть связан своим N-концом со вторым эпитоп-связывающим доменом. Примеры таких антиген-связывающих конструкций описаны в примере 31. Если эпитоп-связывающий домен представляет собой однодоменное антитело, некоторые однодоменные антитела могут быть подходящими для определенных положений в пределах каркаса. Однодоменные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть связаны с Сконцевой областью тяжелой цепи и/или легкой цепи обычных IgG. В дополнение, некоторые dAb могут быть связаны с С-концевыми областями как тяжелой цепи, так и легкой цепи обычных антител. В конструкциях, где N-конец dAb слит с константным доменом антитела (либо СН 3, либо CL), пептидный линкер может способствовать связыванию dAb с антигеном. Действительно, N-концевая областьdAb расположена близко к областям, определяющим комплементарность (CDR), вовлеченным в антигенсвязывающую активность. Таким образом, короткий пептидный линкер действует как спейсер между эпитоп-связывающим доменом и константным доменом белкового каркаса, что может облегчить достижение антигена CDR dAb, которые, следовательно, могут связывать с высокой аффинностью. Окружение, в котором dAb связаны с IgG, будут варьировать в зависимости от того, с какой цепью антитела они слиты. При слиянии с С-концевой областью легкой цепи антитела каркаса IgG ожидают, что каждое dAb будет расположено вблизи шарнирной области антитела и Fc-части. Вероятно, такие dAb будут расположены на большом расстоянии друг от друга. В обычных антителах угол между Fab-фрагментами и угол между каждым Fab-фрагментом и Fc-областью может существенно варьировать. Вероятно, в mAbdAb угол между Fab-фрагментами не будет сильно отличаться, поскольку можно наблюдать определенные угловые ограничения для угла между каждым Fab-фрагментом и Fc-частью. При слиянии с С-концевой областью тяжелой цепи антитела каркаса IgG ожидают, что каждое dAb будет расположено вблизи доменов СН 3 Fc-части. Полагают, что это не будет оказывать влияния на связывающие свойства Fc в отношении Fc-рецепторов (например, FcRI, II, III и FcRn), поскольку эти рецепторы взаимодействуют с доменами Сн 2 (для класса рецепторов FcyRI, II и III) или с шарнирной областью между доменами Сн 2 и СН 3 (например, рецептор FcRn). Другое свойство таких антигенсвязывающих конструкций состоит в том, что, как полагают, dAb будут расположены пространственно близко друг к другу и при условии, что гибкость обеспечена предоставлением подходящих линкеров, этиdAb могут даже образовывать гомодимерные разновидности, воспроизводя, таким образом, четвертичную структуру "застежки-молнии" Fc-части, что может повышать стабильность конструкции. Такие структурные соображения могут способствовать выбору наиболее подходящего положения для присоединения эпитоп-связывающего домена, например, dAb, к белковому каркасу, например антителу. Размер антигена, его локализация (в крови или на клеточной поверхности), его четвертичная структура (мономерная или мультимерная) могут варьировать. Обычные антитела естественным образом устроены для функционирования в качестве адаптерных конструкций ввиду наличия шарнирной области,где ориентация двух антиген-связывающих сайтов на конце Fab-фрагментов может варьировать в широких пределах, и, таким образом, возможна ее адаптация к молекулярным свойствам антигена и его окружения. Наоборот, dAb, связанные с антителом или другим белковым каркасом, например, с белковым каркасом, содержащим антитело без шарнирной области, могут иметь меньшую структурную гибкость,либо непосредственно, либо косвенно. Также полезно понимание состояния в растворе и характера связывания dAb. Накоплены доказательства того, что в растворе in vitro dAb могут преимущественно существовать в мономерных, гомоди- 15023031 мерных или мультимерных формах (Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 P685-698; Ewert et al (2003) J Molp1161-1165; Martin et al. (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol. 333 p355-365). Это в известной степени напоминает мультимеризационные события, наблюдаемые in vivo с доменамиIgG, как например белки Бенс-Джонса (представляющие собой димеры легких цепей иммуноглобулинов(1997) Mol Immunol 34 p1291-1301 и амилоидные волокна (James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8). Например, может быть желательным присоединение однодоменных антител, имеющих тенденцию к димеризации в растворе, к С-концевой области Fc-части вместо С-концевой области легкой цепи, поскольку присоединение к С-концевой области Fc сделает возможной димеризацию этих dAb в контексте антиген-связывающей конструкции по изобретению. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут содержать антигенсвязывающие сайты, специфичные в отношении одного антигена, или могут иметь антиген-связывающие сайты, специфичные в отношении двух или более чем двух антигенов, или в отношении двух или более чем двух эпитопов на одном антигене, или могут присутствовать антиген-связывающие сайты, специфичные в отношении разных эпитопов на одном и том же антигене или на разных антигенах. Каждый антиген-связывающий сайт может иметь специфичность связывания в отношении антигена, такого как белки человека или животных, включая цитокины, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста, ферменты (например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводы. Подходящие мишени, включая цитокины, факторы роста, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста и другие белки, включают, без ограничения: аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеинSAA (Apo-SAA), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кардиотрофин-1, раковоэмбриональный антиген (СЕА), CD40, лиганд CD40, CD56, CD38, CD138, эпидермальный фактор роста (EGF),рецептор EGF, ENA-78, эотаксин, эотаксин-2, Exodus-2, EpoR, FAPa, кислый фактор роста фибробластов(FGF), основной FGF, фактор роста фибробластов-10, лиганд FLT3, фракталкин (СХЗС), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), GF-J31, человеческий сывороточный альбумин, инсулин, интерферон- (IFN-), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF-II), интерлейкин-1 (IL-1), IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 аминокислоты (а/к, IL-8 (77 а/к), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IFN-индуцирующий фактор (IGIF, ингибин , ингибин , IP-10, фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2),KGF, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (LIF), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор, ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный аттрактантный белок, моноцитарный колониестимулирующий фактор (M-CSF), c-fms, v-fmsMDC (67 а/к), MDC (69 а/к), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор(MCAF, МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а/к), MDC (69 а/к), MIG, макрофагальный воспалительный белок-1 (MIP-1), MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP-4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (MPIF-1), нейтрофил-активирующий белок-2 (NAP-2), неуртурин, фактор роста нервов,фактор роста нервов- (-NGF), нейротрофин-3 (NT-3), NT-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (PDGF-AA), PDGF-AB, PDGF-BB, тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), RANTES, фактор стромальных клеток-1 (SDF1), SDF1, фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста стволовых клеток(SCGF), фактор стволовых клеток (SCF), тимус-ассоциированные регуляторные хемокины (TARC),трансформирующий фактор роста-a (TGF-), TGF-, TGF-2, TGF-33, фактор некроза опухоли (TNF),TNF-, TNF-, рецептор TNF I типа, рецептор TNF II типа, TNIL-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), VEGF A, VEGF В, VEGF С, VEGF D, рецептор VEGF 1 типа, рецептор VEGF 2 типа, рецептор VEGF 3 типа, гранулоцитарный хемотаксический белок-2 (GCP-2), GRO/MGSA, GRO-3,GRO-Y, HCC1, 1-309, рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (HER 1), HER 2, HER 3 иHER 4, сывороточный альбумин, фактор фон Виллебранда (vWF), амилоидные белки (например, альфаамилоид), матриксную металлопротеиназу-12 (ММР 12), фосфолипид-зависимую киназу-1 (PDK1), IgE, и другие мишени, раскрытые здесь. Следует понимать, что этот список никоим образом не является исчерпывающим. В некоторых воплощениях устойчивый к протеазам пептид или полипептид связывает мишень в легочной ткани, такую как мишень, выбранная из группы, состоящей из рецептора TNF 1 типа (TNFR1),IL-1, рецептора IL-1 (IL-1R), IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R,IL-13, IL-13R1, IL-13R2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2,CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганда CD40 (CD40L), CD56, CD138, ALK5,EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, фактора роста соединительной ткани (CTGF), CXCL12(SDF-1), химазы, FGF, фурина, эндотелина-1, эотаксинов (например, эотаксина, эотаксина-2, эотаксина 3), GM-CSF, молекулы межклеточной адгезии 1 типа (ICAM-1), ICOS, IgE, IFN, I-309, интегринов, Lселектина, MIF, MIP4, MDC, МСР-1, ММР, нейтрофильной эластазы, остеопонтина, ОХ-40, PARC, PD-1,RANTES, SCF, SDF-1, Siglec 8, TARC, TGFb, тромбина, Tim-1, TNF, TRANCE, триптазы, VEGF, аль- 16023031 фа 4 бета 1 (VLA-4), сосудистой молекулы адгезии (VCAM), 47, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7,CCR8, альфаубета 6, альфаубета 8, cMET, CD8, vWF, амилоидных белков (например, альфа-амилоида),ММР 12, PDK1 и IgE. В частности, антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с IL-13, IL-5 и IL-4, например, атопического дерматита, аллегрического ринита, болезни Крона, хронической обструктивной болезни легких (COPD), фибротических заболеваний или расстройств, таких как идиопатический легочный фиброз, прогрессирующий системный склероз, фиброз печени, гранулемы печени, шистосомоз, лейшманиоз, заболевания регуляции клеточного цикла, такие как болезнь Ходжкина, В-клеточный хронический лимфоидный лейкоз, например, конструкции могут быть полезны в лечении астмы. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с факторами роста, такими как IGF-1R, VEGF и EGFR, например, рака или ревматоидного артрита, примерами типов злокачественных новообразований, при которых могут быть применимы такие терапии, являются рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легкого и миелома. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с TNF, например, артрита, например, ревматоидного артрита или остеоартрита. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с IL-1R, например, артрита, например, ревматоидного артрита или остеоартрита. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с CD-20, например, аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз, воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, системная красная волчанка, нейродегенеративных заболеваний, например рассеянного склероза, связанных с нейтрофилами заболеваний, например, COPD, васкулита Вегенера, муковисцидоза, синдрома Шегрена, хронического отторжения трансплантата, диабета 1 типа, болезни "трансплантат против хозяина", астмы, аллергических заболеваний, атопического дерматита, экзематозного дерматита, аллергического ринита, других аутоиммунных заболеваний, включая тиреоидит, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, увеит, полихондрит или склеродермию, или злокачественных новообразований, например, В-клеточных лимфом, или зрелых В-клеточных опухолей,таких как хронический лимфолейкоз (CLL) или лимфома из малых лимфоцитов (SLL). Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении заболеваний, ассоциированных с IL-17 и IL-23, например, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, системной красной волчанки, нейродегенеративных заболеваний, например, рассеянного склероза, связанных с нейтрофилами заболеваний, например, COPD, васкулита Вегенера, муковисцидоза, синдрома Шегрена, хронического отторжения трансплантата, диабета 1 типа, болезни трансплантат против хозяина, астмы, аллергических заболеваний, атопического дерматита, экзематозного дерматита, аллергического ринита, других аутоиммунных заболеваний, включая тиреоидит, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, увеит, полихондрит или склеродермию. Антиген-связывающие конструкции по настоящему изобретению могут быть получены трансфекцией клетки-хозяина вектором экспрессии, содержащим кодирующую последовательность антигенсвязывающей конструкции по изобретению. Вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают функциональным объединением этих кодирующих последовательностей антиген-связывающей конструкции с обычными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в клетке-хозяине и/или секрецию из клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности, например, промотор цитомегаловируса(CMV), и сигнальные последовательности, которые могут иметь происхождение из других известных антител. Сходным образом, второй вектор экспрессии может получен при наличии последовательности ДНК, кодирующей комплементарную тяжелую или легкую цепь антиген-связывающей конструкции. В определенных воплощениях этот второй вектор экспрессии идентичен первому, за исключением случаев,когда затронуты кодирующие последовательности и селектируемые маркеры, обеспечивая, по возможности, функциональную экспрессию каждой полипептидной цепи. Альтернативно, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепи антиген-связывающей конструкции могут быть расположены на одном векторе, например, в двух экспрессионных кассетах в одном и том же векторе. Осуществляют котрансфекцию выбранной клетки-хозяина как первым, так и вторым вектором с применением обычных методик (или просто трансфицируют ее одним вектором) с получением трансфицированной клетки-хозяина по изобретению, содержащей рекомбинантные и/или синтетические тяжелые и легкие цепи. Трансфицированную клетку затем культивируют с применением обычных методик с получением конструированной антиген-связывающей конструкции по изобретению. Проводят скрининг антиген-связывающей конструкции, включающей объединение рекомбинантных тяжелой цепи и/или легкой цепи, из культуры подходящим анализом, таким как твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA) или радиоиммунный анализ (RIA). Сходные обычные методики могут быть применены для конструирования других антиген-связывающих конструкций. Подходящие векторы для стадий клонирования и субклонирования, используемые в способах и конструировании композиций по данному изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, может быть использована обычная серия клонирующих векторов pUC. Один вектор, pUC19, имеется в продаже от таких поставщиков, как Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). В дополнение, для клонирования может быть использован любой вектор, способный к быстрой репликации, имеющий множество сайтов клонирования и селектиуремых генов (например, устойчивости к антибиотикам) и простой в обращении. Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором в данном изобретении. Векторы экспрессии также могут отличаться генами, подходящими для усиления экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, например, гена дигидрофолатредуктазы млекопитающих(DHFR). Другие предпочтительные векторные последовательности включают сигнальную последовательность поли-А, такую как сигнальная последовательность бычьего гормона роста (BGH) и промоторная последовательность бетаглобина (betaglopro). Векторы экспрессии, применимые здесь, могут быть синтезированы методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники. Компоненты таких векторов, например, репликоны, селектируемые гены, энхансеры, промоторы,сигнальные последовательности и тому подобное, могут быть получены из коммерческих или природных источников или синтезитрованы известными способами для применения в управлении экспрессией и/или секрецией продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. С этой целью могут также быть выбраны другие подходящие векторы экспрессии, многие типы которых известны в данной области техники для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибов. Настоящее изобретение также включает клеточную линию, трансфицированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности антиген-связывающих конструкций по настоящему изобретению. Клекти-хозяева, применимые для клонирования и других манипуляций с этими клонирующими векторами, также общеприняты. Тем не менее, клетки различных штаммов Е. coli могут быть использованы для репликации клонирующих векторов и других стадий при конструировании антиген-связывающих конструкций по данному изобретению. Подходящие клетки-хозяева или клеточные линии для экспрессии антиген-связывающих конструкций по изобретению включают клетки млекопитающих, такие как NSO, Sp2/0, CHO (например, DG44),COS, HEK, клетку-фибробласт (например, 3 Т 3) и клетки миеломы, например, она может быть экспрессирована в клетке СНО или клетке миеломы. Могут быть использованы человеческие клетки, делая, таким образом, возможным модификацию молекулы с человеческими паттернами гликозилирования. Альтернативно, могут быть использованы другие эукариотические клеточные линии. Селекция подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта хорошо известны в данной области техники (см., например, Sambrook etal., приведенную выше). Бактериальные клетки могут оказаться полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии рекомбинантных Fab-фрагментов или других воплощений настоящего изобретения (см., например, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992. Тем не менее, ввиду склонности белков, экспрессированных в бактериальных клетках, к существованию в состоянии, не прошедшем фолдинг или прошедшем неправильный фолдинг, или в негликозилированной форме будет необходим скрининг любого рекомбинантного Fab-фрагмента, полученного в бактериальной клетке, на предмет сохранения способности связывать антиген. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, была образована в форме, прошедшей правильный фолдинг, такая бактериальная клетка будет желательным хозяином, или в альтернативных воплощениях может быть осуществлена экспрессия молекулы в бактериальном хозяине и затем проведен ее повторный фолдинг. Например, различные штаммы Е. coli, используемые для экспрессии, хорошо известны в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. Различные штаммы В.subtilis, Streptomyces, другие бациллы и тому подобное могут также быть использованы в данном способе. Там, где желательно, штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, также доступны в качестве клеток-хозяев, а также клетки насекомых, например, Drosophila иLpidoptere, и вирусные системы экспрессии. См., например, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298,Plenum Press (1986) и приведенные там ссылки. Все общие способы, которыми могут быть конструированы векторы, способы трансфекции, необходимые для получения клеток-хозяев по изобретению, и способы культивирования, необходимые для получения антиген-связывающей конструкции по изобретению из такой клетки-хозяина, могут представлять собой обычные методики. Обычно способ культивирования по настоящему изобретению представляет собой способ культивирования, свободный от сыворотки, обычно культивирование клеток в суспензии, свободной от сыворотки. Аналогично, после получения антиген-связывающих конструкций по изо- 18023031 бретению они могут быть очищены от содержимого клеточной культуры в соответствии со стандартными способами данной области техники, включая преципитацию с сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, хроматографию на колонках, гель-электрофорез и тому подобное. Такие методики входят в объем знаний специалиста в данной области техники и не ограничивают данное изобретение. Например, получение измененных антител описано в WO 99/58679 и WO 96/16990. В еще одном способе экспрессии антиген-связывающих конструкций может быть применена экспрессия в трансгенном животном, такая как описана в патенте США 4873316. Он относится к системе экспрессии с использованием промотора казеина животного, который делает возможным, при трансгенном введении млекопитающему, образование желаемого рекомбинантного белка в молоке самки. В другом аспекте изобретения предложен способ получения антитела по изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором,кодирующим легкую и/или тяжелую цепь антитела по изобретению, и выделение полученного таким образом антитела. Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антиген-связывающей конструкции по настоящему изобретению, включающий стадии: а) предоставления первого вектора, кодирующего тяжелую цепь антиген-связывающей конструкции; б) предоставления второго вектора, кодирующего легкую цепь антиген-связывающей конструкции; в) трансформации клетки-хозяина млекопитающего (например, СНО) указанными первым и вторым векторами; г) культивирования клетки-хозяина по стадии (в) в условиях, приводящих к секреции антигенсвязывающей конструкции из указанной клетки-хозяина в указанную культуральную среду; д) выделения секретированной антиген-связывающей конструкции по стадии (г). После ее экспрессии желаемым способом антиген связывающую конструкцию исследуют на предмет активности in vitro с применением подходящего анализа. В настоящее время для качественной и количественной оценки связывания антиген-связывающей конструкции с ее мишенью используют обычные форматы ELISA-анализа. В дополнение, другие анализы in vitro могут также быть использованы для верификации эффективности нейтрализации перед последующими клиническими исследованиями у людей, проводимыми для оценки персистенции антиген-связывающей конструкции в организме, кроме обычных механизмов клиренса. Доза и продолжительность лечения связаны с относительной продолжительностью персистенции молекул по настоящему изобретению в кровообращении у человека, и они могут быть скорректированы специалистом в данной области техники в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и общего состояния здоровья пациента. Предполагают, что для достижения максимальной терапевтической эффективности может быть необходимым повторное введение (например, один раз в неделю или один раз в две недели) в течение продолжительного периода времени (например, от четырех до шести месяцев). Способ введения терапевтического агента по изобретению может представлять собой любой подходящий способ введения, обеспечивающий доставку агента хозяину. Антиген-связывающие конструкции и фармацевтические композиции по изобретению особенно полезны для парентерального введения, то есть подкожно (п/к), интратратекально, внутрибрюшинно, внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в) или интраназально. Терапевтические агенты по изобретению могут быть изготовлены как фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество антиген-связывающей конструкции по изобретению в качестве активного ингредиента в фарамацевтически приемлемом носителе. В профилактическом агенте по изобретению предпочтительна водная суспензия или раствор, содержащий антиген-связывающую конструкцию, предпочтительно, забуференный при физиологическом рН, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального введения будут обычно содержать раствор антиген-связывающей конструкции по изобретению или их смесь, растворенную в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно, водном носителе. Может быть использовано множество водных носителей, например, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Эти растворы могут быть изготовлены стерильными и в целом свободными от твердых частиц. Эти растворы могут быть стерилизованы обычными хорошо известными методиками стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, как необходимо для приближения к физиологическим условиям, как например, коррекция рН и буферные агенты, и тому подобное. Концентрация антиген-связывающей конструкции по изобретению в такой фармацевтической композиции может варьировать в широких пределах, то есть от менее чем приблизительно 0,5%, обычно от 1% или от по меньшей мере 1 до 15 или 20 мас.%, и будет выбрана в первую очередь на основании объемов жидкостей,вязкостей и тому подобного в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутримышечных инъекций может быть изготовлена так, чтобы содержать 1 мл стерильной забуференной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг, или более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг антиген-связывающей конструкции по изобретению. Сходным образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенных инфузий может быть изготовлена так, чтобы содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 до приблизительно 30 и предпочтительно от 5 до приблизительно 25 мг антиген-связывающей конструкции по изобретению на мл раствора Рингера. Существующие способы изготовления композиций для парентерального введения хорошо известны или будут очевидны специалистам в данной области техники, и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Для изготовления композиций антигенсвязывающих конструкций по изобретению для внутривенного введения см. Lasmar U and Parkins D "The"Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки, и на которые особым образом сделана ссылка для читателя. Предпочтительно, чтобы терапевтический агент по изобретению в фармацевтическом препарате был представлен в стандартных лекарственных формах. Подходящая терапевтически эффективная доза будет легко определена специалистами в данной области техники. Подходящие дозы могут быть вычислены для пациентов в соответствии с их массой тела, например, подходящие дозы могут составлять от 0,01 до 20 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг, например 1 до 20 мг/кг, например от 10 до 20 мг/кг, или например от 1 до 15 мг/кг, например от 10 до 15 мг/кг. Для эффективного лечения состояний, используемого в настоящем изобретении у человека, подходящие дозы могут составлять от 0,01 до 1000 мг, например от 0,1 до 1000 мг, например от 0,1 до 500 мг, например 500 мг, например от 0,1 до 100 мг, или от 0,1 до 80 мг, или от 0,1 до 60 мг, или от 0,1 до 40 мг, или, например от 1 до 100 мг, или от 1 до 50 мг антиген-связывающей конструкции по данному изобретению, которые могут быть введены парентерально,например, подкожно, внутривенно или внутримышечно. Такую дозу можно, при необходимости, повторять через подходящие промежутки времени по соответствующему выбору врача. Антиген-связывающие конструкции, описанные здесь, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Была продемонстрирована эффективность данной методики с обычными иммуноглобулинами, и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления. В данной области техники известны несколько способов, которые могут быть применены для поиска эпитоп-связывающих доменов для использования в настоящем изобретении. Термин "библиотека" относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет одну полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты. В этой степени "библиотека" является синонимом "репертуара". Различия последовательностей между членами библиотеки обеспечивают разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может иметь форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть представлена в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. Предпочтительно, нуклеиновые кислоты включены в векторы экспрессии, чтобы сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Таким образом, в одном аспекте библиотека может иметь форму популяции организмов-хозяев, каждый из которых содержит одну или более чем одну копию вектора экспрессии, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с образованием соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев может кодировать широкий репертуар различных полипептидов."Универсальная каркасная область" представляет собой последовательность отдельной каркасной области антитела, соответствующую областям антитела, имеющим консервативную последовательность,как определено Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) или соответствующую репертуару человеческих иммуноглобулинов зародышевого типа или структуре, как определено Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. Каркасная область может быть одна, или возможно наличие набора таких каркасных областей, что, как было обнаружено, делает возможным получение практически любой специфичности связывания посредством изменения только гипервариабельных областей. В одном воплощении выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей осуществляют и гомологию, сходство или идентичность, как определено здесь, определяют с применением алгоритма BLAST 2 Sequences, с использованием параметров по умолчанию (Tatusova T. A. et al., FEMSMicrobiol Lett, 174:187-188 (1999). Каждый эпитоп-связывающий домен и антиген-связывающий сайт может иметь специфичность связывания в отношении лиганда общего типа или любого желаемого лиганда-мишени, такого как белки человека или животных, включая цитокины, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста, ферменты(например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводы. Подходящие мишени, включая цитокины, факторы роста, рецепторы цитокинов, рецепторы факторов роста и другие белки, включают, без ограничения: аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеин SAA (Apo-SAA),нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кардиотрофин-1, раковоэмбриональный антиген(СЕА), CD40, лиганд CD40, CD56, CD38, CD138, эпидермальный фактор роста (EGF), рецептор EGF,ENA-78, эотаксин, эотаксин-2, Exodus-2, EpoR, FAP, кислый фактор роста фибробластов (FGF), основной FGF, фактор роста фибробластов-10, лиганд FLT3, фракталкин (СХ 3 С), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарномоноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), GF-B1, человеческий сывороточный альбумин, инсулин, интерферон- (IFN-), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF-II), интерлейкин-1 (IL-1), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 аминокислоты (а/к, IL-8 (77 а/к), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IFNиндуцирующий фактор (IGIF, ингибин , ингибин 6, IP-10, фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2), KGF, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (LIF), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор,ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный аттрактантный белок, моноцитарный колониестимулирующий фактор (M-CSF), c-fms, v-fmsMDC (67 а/к), MDC (69 а/к), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (MCAF, МСР-2, МСР-3,МСР-4, MDC (67 а/к), MDC (69 а/к), MIG, макрофагальный воспалительный белок-1 (MIP-1), MIP-1,MIP-3, MIP-3, MIP-4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (MPIF-1), нейтрофил-активирующий белок-2 (NAP-2), неуртурин, фактор роста нервов, фактор роста нервов- (NGF), нейротрофин-3 (NT-3), NT-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (PDGF-AA),PDGF-AB, PDGF-BB, тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), RANTES, фактор стромальных клеток-1(SDF1), SDF1, фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста стволовых клеток (SCGF), фактор стволовых клеток (SCF), тимус-ассоциированные регуляторные хемокины (TARC), трансформирующий фактор роста- (TGF-), TGF-, TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухоли (TNF), TNF-, TNF-, рецепторTNF I типа, рецептор TNF II типа, TNIL-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF),VEGF A, VEGF В, VEGF С, VEGF D, рецептор VEGF 1 типа, рецептор VEGF 2 типа, рецептор VEGF 3 типа, гранулоцитарный хемотаксический белок-2 (GCP-2), GRO/MGSA, GRO-B, GRO-Y, HCC1, 1-309,рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (HER 1), HER 2, HER 3 и HER 4, сывороточный альбумин, фактор фон Виллебранда (vWF), амилоидные белки (например, альфа-амилоид), матриксную металлопротеиназу-12 (ММР 12), фосфолипид-зависимую киназу-1 (PDK1), IgE, и другие мишени, раскрытые здесь. Следует понимать, что этот список никоим образом не является исчерпывающим. В некоторых воплощениях связывание представляет собой связывание мишени в легочной ткани,такой как мишень, выбранная из группы, состоящей из рецептора TNF 1 типа (TNFR1), IL-1, рецептораIL-1 (IL-1R), IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ra1,IL-13R2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a,CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, лиганда CD40 (CD40L), CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1,TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, фактора роста соединительной ткани (CTGF), CXCL12 (SDF-1), химазы,FGF, фурина, эндотелина-1, эотаксинов (например, эотаксина, эотаксина-2, эотаксина-3), GM-CSF, молекулы межклеточной адгезии 1 типа (ICAM-1), ICOS, IgE, IFN, I-309, интегринов, L-селектина, MIF,MIP4, MDC, МСР-1, ММР, нейтрофильной эластазы, остеопонтина, ОХ-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF,SDF-1, Siglec 8, TARC, TGFb, тромбина, Tim-1, TNF, TRANCE, триптазы, VEGF, альфа 4 бета 1 (VLA-4),сосудистой молекулы адгезии (VCAM), 47, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, альфаvбета 6,альфаvбета 8, cMET, CD8, vWF, амилоидных белков (например, альфа-амилоида), ММР 12, PDK1 и IgE. При использовании дисплейной системы (например, дисплейной системы, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные свойства пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой) в способах, описанных здесь, например, в селекции dAb или другого эпитоп-связывающего домена, часто может быть полезно амплифицировать или увеличивать число копий нуклеиновых кислот, кодирующих селетируемые пептиды или полипептиды. Это обеспечивает эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с применением способов, описанных здесь, или других подходящих способов или для получения дополнительных репертуаров (например, репертуаров созревания аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способы селекции эпитоп-связывающих доменов включают применение дисплейной системы (например, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные свойства пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, такой как фаговый дисплей) и дополнительно включают амплификацию или увеличение числа копий нуклеиновой кислоты, кодирующей селетируемый пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты можно амплифицировать с применением любых подходящих способов, таких как фаговая амплификация, клеточный рост или полимеразная цепная реакция. В одном примере в способах использована дисплейная система, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные свойства полипептида,кодируемого нуклеиновой кислотой. Такая дисплейная система может включать множество реплицируемых генетических компонентов, таких как бактериофаги или клетки (бактерии). Дисплейная система может включать библиотеку, такую как бактериофаговая дисплейная библиотека. Примером дисплейной системы является бактериофаговый дисплей. Были описаны несколько подходящих бактериофаговых дисплейных систем (например, моновалентные дисплейные системы и мультивалентные дисплейные системы). (См., например, Griffiths et al.,патент США 6555313 В 1 (включенный сюда посредством ссылки); Johnson et al., патент США 5733743 (включенный сюда посредством ссылки); McCafferty et al, патент США 5969108 (включенный сюда посредством ссылки); Mulligan-Kehoe, патент США 5702892 (включенный сюда посредством ссылки); Winter, G. et al.,Annu. Rev. Immunol. 72:433-455 (1994); Soumillion, P. et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133(2001).) Пептиды или полипептиды, представленные в бактериофаговой дисплейной системе, могут быть представлены на любом подходящем бактериофаге, таком как, например, нитчатый фаг (например, fd,М 13, F1), литический фаг (например, Т 4, Т 7, лямбда) или РНК-фаг (например, MS2). В большинстве случаев получают или предоставляют библиотеку фагов, на которой представлен репертуар пептидов или фаговых полипептидов в виде слитых белков с подходящим белком оболочки фага (например, белком pIII fd). В слитом белке пептиды или полипептиды могут быть представлены на верхушке белка оболочки фага или, если желательно, во внутреннем положении. Например, представленный пептид или полипептид может присутствовать в положении, расположенном ближе к N-концу по отношению к домену 1 pIII. (Домен 1 pIII также называют N1.) Представленный полипептид может быть непосредственно слит с pIII (например, N-концом домена 1 pIII) или слит с pIII с использованием линкера. Если желательно, слитый белок может также включать метку (например, тус-эпитоп, His-метку). Библиотеки, содержащие репертуар пептидов или полипептидов, представленных в виде слитых белков с белком оболочки фага, могут быть получены любыми подходящими способами, как например введением библиотеки фаговых векторов или фагмидных векторов, кодирующих представленные пептиды или полипептиды, в подходящие бактерии-хозяева и культивированием полученных бактерий с получением фагов (например, с использованием подходящего хелперного фага или комплементарной плазмиды, если желательно). Библиотека фагов может быть выделена из культуры с применением любого подходящего способа, такого как преципитация и центрифугирование. Дисплейная система может включать репертуар полипептидов, включающий любую желаемую степень разнообразия. Например, репертуар может включать пептиды или полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, соответствующие встречающимся в природе полипептидам, экспрессируемым организмом, группой организмов (например, репертуар последовательностей VHH dAb, выделенных от представителя семейства Верблюдовых), желаемым типом тканей или желаемым типом клеток, или может включать пептиды или полипептиды, имеющие случайные или рандомизированные аминокислотные последовательности. Если желательно, пептиды могут иметь общую сердцевину или каркас. Например, все полипептиды в таком репертуаре или библиотеке могут содержать определенные области случайной или рандомизированной аминокислотной последовательности и области общей аминокислотной последовательности. В определенных воплощениях все или по существу все полипептиды в репертуаре представляют собой полипептиды желаемого типа, такого как желаемый фермент (например,полимераза) или желаемый антиген-связывающий фрагмент антитела (например, человеческий VH или человеческий VL). В некоторых воплощениях полипептидная дисплейная система включает репертуар полипептидов, где каждый полипептид содержит вариабельный домен антитела. Например, каждый полипептид в репертуаре может содержать VH, VL или FV (например, одноцепочечный Fv). Разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в любую желаемую область пептида или полипептида, или каркаса, с применением любого желаемого способа. Например, разнообразие аминокислотной последовательности может быть введено в целевую область, такую как область,определяющая комплементарность, вариабельного домена антитела или гидрофобный домен, получением библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих диверсифицированные полипептиды, с применением любых подходящих способов мутагенеза (например, ПЦР со сниженной точностью (low fidelity PCR),олигонуклеотид-опосредованного или сайт-направленного мутагенеза, диверсификации с применениемNNK-кодонов) или любого другого подходящего способа. Если желательно, область полипептида, подлежащая диверсификации, может быть рандомизирована. Размер полипептидов, составляющих репертуар, в значительной степени является предметом свободного выбора, и в одинаковом размере полипептидов нет необходимости. Полипептиды в репертуаре могут иметь по меньшей мере третичную структуру(образовывать по меньшей мере один домен). Селекция/выделение/получение Эпитоп-связывающий домен или популяция доменов может быть селектированы, выделены и/или получены из репертуара или библиотеки (например, в дисплейной системе) с применением любого подходящего способа. Например, домен селектируют или выделяют на основании селектируемого свойства(например, физического свойства, химического свойства, функционального свойства). Подходящие селектируемые функциональные свойства включают биологические активности пептидов или полипептидов репертуара, например, связывание лиганда общего типа (например, суперантигена), связывание лиганда-мишени (например, антигена, эпитопа, субстрата), связывание с антителом (например, через эпитоп, экспрессированный на пептиде или полипептиде) и каталитическую активность. (См., например,Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655). В некоторых воплощениях устойчивый к протеазам пептид или полипептид селектируют и/или выделяют из библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, в котором по существу все домены имеют общее селектируемое свойство. Например, домен может быть селектирован из библиотеки или репертуара, в котором по существу все домены связывают общий лиганд общего типа, связывают общий лиганд-мишень, связывают общее антитело (или их связывает общее антитело) или обладают общей каталитической активностью. Этот тип селекции особенно применим для получения репертуара доменов,основанных на исходном пептиде или полипептиде, имеющем желаемую биологическую активность,например, при проведении созревания аффинности отдельного вариабельного домена иммуноглобулина. Селекция на основании связывания общего лиганда общего типа может привести к образованию совокупности или множества доменов, включающего все или по существу все домены, которые являлись компонентами исходной библиотеки или репертуара. Например, домены, связывающие лиганд-мишень или лиганд общего типа, такой как белок А, белок L или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или получены паннингом или с использованием подходящей аффинной матрицы. Паннинг может быть осуществлен добавлением раствора лиганда (например, лиганда общего типа, лиганда-мишени) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и обеспечением возможности осаждения лиганда на стенки сосуда или их покрытия лигандом. Избыток лиганда можно отмыть и в сосуд можно добавить домены, и сосуд можно содержать в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов и иммобилизованного лиганда. Несвязанные домены можно отмыть, а связанные домены могут быть выделены с применением любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или снижение рН. Подходящие аффинные матрицы для лигандов в большинстве случаев включают твердую подложку или гранулу (например, агарозу), к которой ковалентно или нековалентно присоединен лиганд. Аффинную матрицу можно комбинировать с пептидами или полипептидами (например, репертуаром, инкубированным с протеазой) с применением серийного способа, способа с применением колонок или любого другого подходящего способа в условиях, подходящих для связывания доменов с лигандом на матрице. Домены, не связанные с аффинной матрицей, можно отмыть, а связанные домены можно элюировать и выделить с применением любого подходящего способа, такого как элюирование буфером с меньшим рН, мягким денатурирующим агентом (например, мочевиной) или пептидом или доменом, конкурирующим за связывание лиганда. В одном примере биотинилированный лиганд-мишень комбинируют с репертуаром в условиях, подходящих для связывания доменов репертуара с лигандом-мишенью. Связанные домены выделяют с применением иммобилизованного авидина или стрептавидина (например, на грануле). В некоторых воплощениях лиганд общего типа представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела или антиген-связывающие фрагменты, связывающие структурные элементы пептидов или полипептидов, по существу консервативные в пептидах или полипептидах библиотеки или репертуара, особенно применимы в качестве лигандов общего типа. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, подходящие для применения в качестве лигандов для выделения, селекции и/или получения устойчивых к протеазам пептидов или полипептидов, могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены с применением любого подходящего способа. Библиотеки/репертуары Библиотеки, кодирующие и/или включающие устойчивые к протеазам эпитоп-связывающие домены, могут быть образованы или получены с применением любого подходящего способа. Библиотека может быть разработана, чтобы кодировать домены, основанные на интересующем домене или каркасе (например, домене, селектированном из библиотеки), или может быть селектирована из другой библиотеки с применением способов, описанных здесь. Например, библиотека, обогащенная доменами, может быть получена с применением подходящей полипептидной дисплейной системы. Библиотеки, кодирующие репертуар желаемого типа доменов, могут быть легко получены с применением любого подходящего способа. Например, может быть получена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая желаемый тип полипептида (например, вариабельный домен иммуноглобулина), и может быть получена совокупность нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит одну или более чем одну мутацию, например, амплификацией нуклеиновой кислоты с применением системы полимеразной цепной реакции (ПЦР) пониженной точности, химическим мутагенезом (Deng et al., J. Biol. Chem.,- 23023031 269:9533 (1994 или с использованием бактериальных мутаторных штаммов (Low et al., J. Mol.Biol.,260:359 (1996. В других воплощениях диверсификация может быть направлена на определенные области нуклеиновой кислоты. Способы мутации выбранных положений также хорошо известны в данной области техники и включают, например, применение некомплементарных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов, с или без применения ПЦР. Например, библиотеки синтетических антител были получены направлением мутаций в антиген-связывающие петли. Случайные или полуслучайные области антител Н 3 и L3 были присоединены к сегментам генов вариабельных областей (V-генов) иммуноглобулинов зародышевого типа с образованием больших библиотек с немутированными каркасными областями(1995) supra). Такая диверсификация была расширена для включения некоторых или всех других антиген-связывающих петель (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology,13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). В других воплощениях диверсификация может быть направлена на определенные области нуклеиновой кислоты посредством, например, двухстадийной ПЦР-стратегии с использованием продукта первой ПЦР в качестве "мегапраймера" ("mega-primer"). (См., например, Landt,О. et al, Gene 96:125-128 (1990).) Направленная диверсификация может также быть осуществлена, например, посредством ПЦР с перекрывающейся элонгацией (SOE PCR). (См., например, Horton, R.M. etal., Gene 77:61-68 (1989).) Разнообразие последовательностей в выбранных положениях может быть достигнуто изменением кодирующей последовательности, задающей последовательность полипептида, таким образом, что в данное положение могут быть введены несколько возможных аминокислот (например, все 20 или их подгруппа). По номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии (InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry (IUPAC наиболее универсальным кодоном является NNK, кодирующий все аминокислоты, а также стоп-кодон TAG. Кодон NNK может быть использован для введения необходимого разнообразия. Также применимы другие кодоны, позволяющие добиться таких же результатов, включая кодон NNN, приводящий к образованию дополнительных стоп-кодонов TGA и ТАА. Такой целевой способ позволяет обследовать все пространство последовательности в целевой области. Некоторые библиотеки включают домены, являющиеся членами суперсемейства иммуноглобулинов (например, антитела и их части). Например, библиотеки могут включать домены, имеющие известную конформацию главной цепи (См., например, Tomlinson et al., WO 99/20749.) Библиотеки могут быть получены в подходящей плазмиде или векторе. При использовании здесь вектор относится к дискретному элементу, используемому для введения в клетки гетерологичной ДНК для ее экспрессии и/или репликации. Можно использовать любой подходящий вектор, включая плазмиды (например, бактериальные плазмиды), вирусные или бактериофаговые векторы, искусственные хромосомы и эписомные векторы. Такие векторы можно использовать для простого клонирования и мутагенеза, или вектор экспрессии можно использовать для управления экспрессией библиотеки. Векторы и плазмиды обычно содержат один или более чем один сайт клонирования (например, полилинкер), репликатор и по меньшей мере один селектируемый маркерный ген. Векторы экспрессии могут дополнительно содержать элементы управления транскрипцией и трансляцией полипептида, такие как энхансерный элемент, промотор, сигнал терминации транскрипции, сигнальные последовательности и тому подобное. Эти элементы могут быть расположены таким образом, что они функционально связаны с клонируемой вставкой, кодирующей полипептид, таким образом, что экспрессия и образование полипептида происходит при содержании такого вектора экспрессии в условиях, подходящих для экспрессии (например, в подходящей клеткехозяине). Клонирующие векторы и векторы экспрессии в большинстве случаев содержат последовательности нуклеиновых кислот, которые делают возможной репликацию вектора в одной или более чем одной выбранной клетке-хозяине. Обычно в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, которая делает возможной независимую от хромосомной ДНК хозяина репликацию вектора, и включает репликаторы или автономно реплицируемые последовательности. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Репликатор плазмиды pBR322 является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий, 2 мкм плазмидный репликатор является подходящим для дрожжей, и репликаторы различных вирусов (например, вируса обезьян 40(SV40), аденовируса) являются подходящими для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. В большинстве случаев репликатор не является необходимым для векторов экспрессии млекопитающих,если их не используют в клетках млекопитающих, способных реплицировать большие количества ДНК,таких как клетки COS. Клонирующие векторы или векторы экспрессии могут содержать селектируемый ген, также называемый селектируемым маркером. Такие маркерные гены кодируют белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых на селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим селектируемый ген, следовательно, не будут выживать на культуральной среде. Типичные селектируемые гены кодируют белки, придающие устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, возмещающие ауксотрофные недостаточности или обеспечивающие жизненно необходимые питательные вещества, не доступные в питательных средах. Подходящие векторы экспрессии могут содержать несколько компонентов, например, репликатор,селектируемый маркерный ген, один или более чем один элемент контроля экспрессии, такой как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энхансер, терминатор), и/или один или более чем один трансляционный сигнал, сигнальную последовательность или лидерную последовательность, и тому подобное. Элементы контроля экспрессии и сигнальная или лидерная последовательность, если они присутствуют, могут быть предоставлены вектором или другим источником. Например, для управления экспрессией могут быть использованы последовательности контроля транскрипции и/или трансляции клонированной нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела. Для экспрессии в желаемой клетке-хозяине может быть предоставлен промотор. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его часть, таким образом, что он управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты. Доступны множество подходящих промоторов для прокариотических (например, промоторные системы 3-лактамазы и лактозы, промоторная система щелочной фосфатазы, триптофановая (trp) промоторная система, промоторы lac, tac, Т 3, Т 7 для E. coli) и эукариотических (например, ранний или поздний промотор вируса обезьян 40, промотор длинных терминальных повторов вируса саркомы Рауса, цитомегаловирусный промотор, поздний аденовирусный промотор, промотор EG-1 а) хозяев. В дополнение, векторы экспрессии обычно содержат селектируемый маркер для селекции клетокхозяев, несущих вектор, и, в случае реплицируемого вектора экспрессии, репликатор. Гены, кодирующие продукты, придающие устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, являются распространенными селектируемыми маркерами и могут быть использованы в прокариотических (например,ген -лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Tet устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например, гены устойчивости к неомицину (G418 или генетицину), gpt (микофеноловой кислоте), ампициллину или гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы делают возможной селекцию с использованием метотрексата у множества хозяев. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, LEU2, URA3, HIS3) часто используют в качестве селектируемых маркеров у дрожжей. Также предполагают применение вирусных (например, бакуловирусных) или фаговых векторов, и векторов, способных к интеграции в геном клетки-хозяина, таких как ретровирусные векторы. Подходящие векторы экспрессии для экспрессии в прокариотических клетках (например, бактериальных клетках, таких как Е. coli) или клетках млекопитающих включают, например, вектор рЕТ (например, рЕТ-12 а, рЕТ-36, рЕТ-37, рЕТ-39, рЕТ-40, Novagen и другие), фаговый вектор (например,pCANTAB 5 Е, Pharmacia), pRIT2T (вектор, слитый с белком A (Protein A fusion vector), Pharmacia),pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB,pSG5, pXTI (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al, Biotechniques, 27:1013-1015 (1996,pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al, Nucleic Acids Res., 78:5322 (1990 и тому подобное. Доступны векторы экспрессии, подходящие для применения в различных хозяевах для экспрессии, таких как прокариотические клетки (Е. coli), клетки насекомых (клетки Schnieder S2 Drosophila, Sf9), клетки дрожжей (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) и клетки млекопитающих (например,клетки COS). Некоторые примеры векторов представляют собой векторы экспрессии, делающие возможной экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей члену библиотеки полипептидов. Таким образом, селекция лигандами общего типа и/или лигандами-мишенями может быть проведена раздельным размножением и экспрессией отдельного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов. Как описано выше, заслуживающей особого внимания дисплейной системой для селекции является бактериофаговый дисплей. Таким образом, можно использовать фаговые или фагмидные векторы, например, векторы могут представлять собой фагмидные векторы, имеющие репликатор Е. coli (для двуцепочечной репликации) и также фаговый репликатор (для образования одноцепочечной ДНК). Манипуляция такими векторами и их экспрессия хорошо известны в данной области техники (Hoogenboom and Winter(1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). Кратко, вектор может содержать ген -лактамазы для придания фагмиде селективности и промотор lac ближе к 5'-концу от экспрессионной кассеты, которая может содержать подходящую лидерную последовательность, множественный сайт клонирования, одну или более чем одну пептидную метку, один или более чем один стоп-кодон TAG и фаговый белок pIII. Таким образом, с использованием различных супрессорных и несупрессорных штаммов Е. coli и с добавлением глюкозы, изопропилтиоD-галактозида (IPTG) или хелперного фага, такого как VCS M13, вектор способен проходить репликацию, как плазмида, без экспрессии, вырабатывать большие количества члена библиотеки полипептидов самого по себе или образуемых фагов, некоторые из которых содержат на своей поверхности по меньшей мере одну копию слитого белка полипептид-pIII. Вариабельные домены антител могут содержать сайт связывания лиганда-мишени и/или сайт свя- 25023031 зывания лиганда общего типа. В определенных воплощениях сайт связывания лиганда общего типа представляет собой сайт связывания суперантигена, такого как белок А, белок L или белок G. Вариабельные домены могут быть основаны на любом желаемом вариабельном домене, например, человеческом VH (например, VH1 а, VH1b, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6), человеческом V (например, VI, VII, VIII,VIV, VV, VVI ИЛИ VKI) или человеческом VK (например, VK2, VK3, VK4, VK5, VK6, VK7, VK8, VK9 илиVK10). Еще одна категория методик включает селекцию репертуаров в искусственных компартментах, что делает возможной связь гена с его генным продуктом. Например, селекционная система, в которой нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемые генные продукты, могут быть селектированы в микрокапсулах, сформированных эмульсиями типа "вода в масле", описана в WO 99/02671, WO 00/40712 и TawfikGriffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Генетические элементы, кодирующие генный продукт,имеющий желаемую активность, компартментализуют в микрокапсулах и затем транскрибируют и/или транслируют для образования их соответствующих генных продуктов (РНК или белка) в микрокапсулах. Затем сортируют генетические элементы, вырабатывающие генный продукт, имеющий желаемую активность. В таком способе селектируют интересующие генные продукты выявлением желаемой активности множеством способов. Описание эпитоп-связывающих доменов Связывание домена с его специфичным антигеном или эпитопом можно исследовать способами,которые будут знакомы специалистам в данной области техники и включают ELISA. В одном примере связывание исследуют с применением моноклонального фагового ELISA. Фаговый ELISA может быть проведен в соответствии с любым подходящим способом, типичный протокол изложен ниже. Популяции фага, полученные на каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу на предмет связывания с выбранным антигеном или эпитопом посредством ELISA для идентификации "поликлональных" фаговых антител. Фаг из отдельных инфицированных бактериальных колоний из этих популяций может затем быть подвергнут скринингу посредством ELISA для идентификации "моноклональных" фаговых антител. Также желательно провести скрининг растворимых фрагментов антител на связывание с антигеном или эпитопом, и это также может быть проведено посредством ELISA с использованием реагентов, например, против С- или N-концевой метки (см., например, Winter et al. (1994) Ann.Rev. Immunology 12, 433-55 и ссылки, приведенные там). Разнообразие селектируемых фаговых моноклональных антител может также быть оценено гельэлектрофорезом продуктов ПЦР (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), зондированием(Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227, 776) или секвенированием векторной ДНК. Д. Структура dAb В случае, если dAb выбраны из репертуаров V-генов, селектируемых, например, с применением технологии фагового дисплея, как описано здесь, эти вариабельные домены содержат универсальную каркасную область, таким образом, что они могут быть распознаны определенным лигандом общего типа, как определено здесь. Применение универсальных каркасных областей, лигандов общего типа и тому подобного описано в WO 99/20749. Там где используют репертуары V-генов, разнообразие полипептидной последовательности может быть локализовано в структурных петлях вариабельных доменов. Полипептидные последовательности каждого домена могут быть изменены перетасовкой ДНК или мутацией с целью усиления взаимодействия каждого вариабельного домена с его комплементарной парой. ДНК-перетасовки известны в данной области техники и о них сообщают, например, Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 и патент США 6297053, оба из которых включены сюда посредством ссылки. Другие способы мутагенеза хорошо известны специалистам в данной области техники. Е. Каркасы для использования в конструировании dAb 1. Выбор конформации главной цепи Все члены суперсемейства иммуноглобулинов имеют сходную конформацию их полипептидной цепи. Например, несмотря на то, что антитела сильно отличаются в отношении их первичной последовательности, сравнением последовательностей и кристаллографических структур было выявлено, что, вопреки ожиданиям, пять из шести антиген-связывающих петель антител (Н 1, Н 2, L1, L2, L3) принимают ограниченное число конформации главной цепи или канонических структур (Chothia и Lesk (1987) J.Mol. Biol, 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877). Анализ длин петель и ключевых остатков сделал, таким образом, возможным предсказание конформации главной цепи Н 1, Н 2, L1, L2 и L3, обнаруженных в большинстве человеческих антител (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol, 227: 799; Tomlinson et al.(1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol, 264: 220). Несмотря на то, что область Н 3 намного более разнообразна в отношении последовательности, длины и структуры (ввиду использованияD-сегментов), она также образует ограниченное число конформаций главной цепи для коротких длин петель, которые зависят от длины и присутствия определенных остатков или типов остатка в ключевых положениях в петле и каркасной области антитела (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol, 263: 800; Shirai et al.dAb преимущественно образованы из библиотек доменов, таких как библиотеки доменов VH и/или библиотеки доменов VL. В одном аспекте разработаны библиотеки доменов, в которых длины определенных петель и ключевые остатки были выбраны для обеспечения известной конформаций главной цепи их членов. Преимущественно, они представляют собой реально существующие конформаций молекул суперсемейства иммуноглобулинов, обнаруженные в природе, для сведения к минимуму шансов, что они нефункциональны, как обсуждено выше. Сегменты V-генов зародышевого типа служат в качестве одной подходящей основной каркасной области для конструирования библиотек антител или Т-клеточных рецепторов; также применимы другие последовательности. Изменения могут происходить с низкой частотой таким образом, что малое число функциональных членов может обладать измененной конформацией главной цепи, что не влияет на ее функцию. Теорию канонических структур также применяют для оценки числа различных конформаций главной цепи, кодируемых лигандами, для предсказания конформаций главной цепи на основании последовательностей лигандов, и для выбора остатков для внесения разнообразия, которые не влияют на каноническую структуру. Известно, что в человеческом домене VK петля L1 может принимать одну из четырех канонических структур, петля L2 имеет одну каноническую структуру, и что 90% человеческих доменов VK принимают одну из четырех или пяти канонических структур для петли L3 (Tomlinson et al.(1995) supra); таким образом, в домене VK самом по себе различные канонические структуры могут сочетаться с образованием ряда различных конформаций главной цепи. При условии, что домен V кодирует отличный ряд канонических структур для петель L1, L2 и L3, и что домены VK и V могут образовывать пару с любым доменом VH, который может кодировать несколько канонических структур для петель Н 1 и Н 2, число комбинаций канонических структур, наблюдаемых для этих пяти петель, очень велико. Это предполагает, что формирование разнообразия в конформации главной цепи может быть необходимым для получения широкого диапазона специфичностей связывания. Тем не менее, конструированием библиотеки антител, основанной на одной известной конформации главной цепи, было обнаружено, вопреки ожиданиям, что разнообразие в конформации главной цепи не является необходимым для формирования достаточного разнообразия для нацеливания на практически все антигены. Даже более удивительно, нет необходимости, чтобы одна конформация главной цепи представляла собой консенсусную структуру,одна встречающаяся в природе конформация может быть использована в качестве основы для всей библиотеки. Таким образом, в одном определенном аспекте, dAb обладают одной известной конформацией главной цепи. Одна выбранная конформация главной цепи может быть общей для молекул суперсемейства иммуноглобулинов обсуждаемого типа. Конформация является общей, если согласно наблюдениям значительное число встречающихся в природе молекул принимают ее. Соответственно, в одном аспекте изобретения, по отдельности принимают во внимание распространенность в природе различных конформаций главной цепи для каждой связывающей петли домена иммуноглобулина и затем выбирают встречающийся в природе вариабельный домен, обладающий желаемой комбинацией конформаций главной цепи для различных петель. Если таковые недоступны, может быть выбран ближайший эквивалент. Желаемую комбинацию конформаций главной цепи для различных петель можно получить выбором сегментов генов зародышевого типа, кодирующих желаемые конформации главной цепи. В одном примере выбранные сегменты генов зародышевого типа часто экспрессированы в природе, и, в частности, из всех естественных сегментов генов зародышевого типа они могут быть экспрессированы чаще всего. При разработке библиотек встречаемость различных конформаций главной цепи для каждой из шести антиген-связывающих петель может быть рассмотрена отдельно. Для Н 1, Н 2, L1, L2 и L3 выбирают заданную конформацию, которую принимают от 20% до 100% антиген-связывающих петель встречающихся в природе молекул. Типично, наблюдаемая распространнность составляет более 35% (то есть, от 35 до 100%) и, в идеальном случае, более 50% или даже более 65%. Поскольку подавляющее большинство петель НЗ не имеет канонических структур, предпочтительно выбрать конформацию главной цепи,являющуюся общей для тех петель, в которых представлены канонические структуры. Для каждой из петель, следовательно, выбирают конформацию, наиболее часто наблюдаемую в природном репертуаре. В человеческих антителах наиболее распространенные канонические структуры (CS) для каждой петли представляют собой следующие: Н 1 - CS 1 (79% экспрессируемого репертуара), Н 2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 VK (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 VK (36%) (при вычислениях предполагали соотношение к:Л 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Для петель Н 3, имеющих канонические структуры, длина CDR3 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Министерство здравоохранения и социальных услуг США (U.S. Department of Health and Human Services в семь остатков с ионной связью от остатка 94 к остатку 101, по-видимому, является наиболее распространенной. В библиотеке данных EMBL имеются последовательности по меньшей мере 16 человеческих антител с длиной Н 3 и ключевыми остатками, необходимыми для образования этой конформации, и по меньшей мере две кристаллографические структуры в белковой базе данных, которые могут быть использованы в качестве основы для моделирования антител (2cgr и 1 tet). Наиболее часто экспрессируе- 27023031 мые сегменты генов зародышевого типа, кодирующие эту комбинацию канонических структур, представляют собой сегмент VH 3-23 (DP-47), сегмент JH JH4b, сегмент VK 02/012 (DPK9) и JK сегмент JK1. Сегменты VH DP45 и DP38 также являются подходящими. Эти сегменты, следовательно, могут быть использованы в комбинации в качестве основы для конструирования библиотеки с желаемой одной конформацией главной цепи. Альтернативно, вместо выбора одной конформации главной цепи на основании распространенности в природе различных конформации главной цепи отдельно для каждой из связывающих петель, распространенность в природе комбинаций конформации главной цепи используют в качестве основания для выбора одной конформации главной цепи. В случае антител, например, может быть определена распространенность в природе комбинаций канонических структур для любых двух, трех, четырех, пяти или для всех шести антиген-связывающих петель. В данном случае, выбранная конформация может быть общей у встречающихся в природе антител, и, возможно, в природном репертуаре ее наблюдают чаще всего. Таким образом, в человеческих антителах, например, когда рассматривают естественные комбинации пяти антиген-связывающих петель, Н 1, Н 2, L1, L2 и L3, определяют наиболее распространенную комбинацию канонических структур и затем комбинируют ее с наиболее распространенной конформацией для петли Н 3 как основание для выбора одной конформации главной цепи. Внесение разнообразия в каноническую последовательность После выбора нескольких известных конформации главной цепи или одной известной конформации главной цепи, можно конструировать dAb изменением связывающего сайта молекулы с целью создания репертуара со структурным и/или функциональным разнообразием. Это означает, что варианты создают таким образом, что они обладают достаточным разнообразием в их структуре и/или в их функции таким образом, что они способны обеспечить ряд активностей. Желаемое разнообразие обычно создают изменением выбранной молекулы в одном или более чем одном положении. Положения, подлежащие изменению, могут быть выбраны случайно, или они могут быть селектированы. Изменение может в таком случае быть достигнуто либо рандомизацией, когда резидентную аминокислоту заменяют любой аминокислотой или ее аналогом, природным или синтетическим, с образованием очень большого числа вариантов, либо заменой резидентной аминокислоты одной или более сем одной аминокислотой из определенной подгруппы аминокислот с образованием более ограниченного числа вариантов. Было сообщено о различных способах внесения такого разнообразия. Для введения случайных мутаций в гены, кодирующие молекулу, могут быть применены ПЦР пониженной точности (Hawkins et al.(1992) J. Mol. Biol., 226: 889), химический мутагенез (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) или бактериальные мутаторные штаммы (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359). Способы мутирования выбранных положений также хорошо известны в данной области техники и включают использование некомплементарных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов, с или без применения ПЦР. Например, несколько библиотек синтетических антител были созданы нацеливанием мутаций на антиген-связывающие петли. Область Н 3 человеческого Fab, связывающего столбнячный анатоксин, была рандомизирована для создания ряда новых специфичностей связывания (Barbas et al. (1992) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89: 4457). Рандомизированные или полурандомизированные области Н 3 и L3 были присоединены к сегментам V-генов зародышевого типа для создания обширных библиотек с немутированными каркасными областями (HoogenboomWinter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J.,13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol, 248: 97). Такая внесение разнообразия было расширено для включения некоторых или всех других антиген-связывающих петель (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra). Поскольку рандомизация петель имеет потенциал для создания приближенно более чем 1015 структур только для Н 3 и похожего большого числа вариантов для других пяти петель, создание библиотеки,отражающей все возможные комбинации, неосуществимо с применением современной технологии трансформации или даже с применением систем, свободных от клеток. Например, в одной из наиболее обширных библиотек, конструированных на настоящий момент, были созданы 61010 различных антител, что представляет собой лишь часть возможного разнообразия для библиотеки такого плана (Griffithset al. (1994) supra). В одном воплощении, разнообразие вносят только в те остатки, которые непосредственно вовлечены в создание или модификацию желаемой функции молекулы. Для многих молекул функцией будет связывание мишени и, следовательно, разнообразие следует концентрировать в сайте связывания мишени, избегая в то же время изменения остатков, имеющих решающее значение для общей упаковки молекулы или для поддержания выбранной конформации главной цепи. В одном аспекте используют библиотеки dAb, в которых изменяют только те остатки, которые расположены в антиген-связывающем сайте. Эти остатки чрезвычайно разнообразны в репертуаре человеческих антител, и известно, что они образуют контакты в комплексах антитело/антиген высокого разрешения. Например, в L2 известно, что положения 50 и 53 различаются во встречающихся в природе антите- 28023031 лах, и, согласно наблюдениям, они образуют контакт с антигеном. В отличие от этого, обычным способом было бы внесение разнообразия во все остатки в соответствующей области, определяющей комплементарность (CDR1), как определено Kabat et al. (1991, supra), некоторые семь остатков по сравнению с двумя, в которые вносят разнообразие, в библиотеке для использования по изобретению. Это отражает значимое улучшение в отношении функционального разнообразия, необходимого для создания ряда специфичностей связывания антигена. В природе разнообразие антител является результатом двух процессов: соматической рекомбинации сегментов генов V, D и J зародышевого типа с образованием интактного первичного репертуара (так называемые гаметное разнообразие и множественность J-сегментов) и соматической сверхмутации полученных перестроенных V-генов. Анализом последовательностей человеческих антител было показано,что разнообразие в первичном репертуаре сфокусировано в центре антиген-связывающего сайта, в то время как соматическая сверхмутация распространяет разнообразие на области на периферии антигенсвязывающего сайта, высококонсервативной в первичном репертуаре (см. Tomlinson et al. (1996) J. Mol.Biol., 256: 813). Эта комплементарность, возможно, эволюционировала как эффективная стратегия поиска пространства последовательностей, и, хотя, вероятно, она присуща только антителам, она может легко быть применена к другим полипептидным репертуарам. Изменяемые остатки представляют собой подгруппу остатков, формирующих сайт связывания для мишени. В различные (включая перекрывающиеся) подгруппы остатков в области связывания мишени разнообразие вносят на различных стадиях в течение селекции, если желательно. В случае репертуара антител создают начальный "интактный" репертуар, где в некоторые, но не во все остатки в антиген-связывающем сайте внесено разнообразие. При использовании здесь в данном контексте термин "интактный" или "модельный" относится к молекулам антител, не имеющим предопределенной мишени. Эти молекулы имеют сходство с молекулами, кодируемыми генами иммуноглобулинов индивида, не прошедшего иммунную диверсификацию, как в случае с плодами и новорожденными индивидами, иммунная система которых еще не была подвержена воздействию широкого спектра антигенных стимулов. Этот репертуар затем подвергают селекции против ряда антигенов или эпитопов. Если необходимо, дополнительное разнообразие может затем быть внесено вне области, в которую внесено разнообразие в начальном репертуаре. Этот зрелый репертуар может быть подвергнут селекции на предмет модифицированной функции, специфичности или аффинности. Следует понимать, что последовательности, описанные здесь, включают последовательности, являющиеся, по существу, идентичными, например последовательности, являющиеся по меньшей мере на 90% идентичными, например являющиеся по меньшей мере на 91 или по меньшей мере на 92, или по меньшей мере на 93, или по меньшей мере на 94, или по меньшей мере на 95, или по меньшей мере на 96,или по меньшей мере на 97, или по меньшей мере на 98, или по меньшей мере на 99% идентичными последовательностям, описанным здесь. Для нуклеиновых кислот, термин "по существу идентичные" обозначает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности, при их оптимальном выравнивании и сравнении, идентичны, с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями, в по меньшей мере приблизительно 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно от 90 до 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно от 98 до 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, идентичность, по существу,присутствует при гибридизации сегментов, в селективных условиях гибридизации, с комплементом цепи. Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "идентичный" указывает на степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями при их оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делециями. Альтернативно, существенная идентичность присутствует при гибридизации сегментов ДНК, в селективных условиях гибридизации, с комплементом цепи. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в обеих последовательностях (то есть % идентичности = число идентичных положений/общее число положений х 100), при учете числа разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с применением математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже. Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с применением программы GAP в пакете программного обеспечения GCG с использованием матрицыNWSgapdna.CMP и значения разрыва 40, 50, 60, 70 или 80, и значения длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может также быть определен с применением алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput . Appl . Biosci., 4:11-17 (1988,включенного в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы масс остатков РАМ 120,штрафа за длину пропуска в последовательности 12 и штрафа за пропуск в последовательности 4. В дополнение, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol . 48:444-453 (1970, включенного