Человеческие антитела, связывающие ген активации лимфоцитов-3 (lag-3), и их применение

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ГЕН АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ-3 (LAG-3), И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Настоящее раскрытие включает выделенные моноклональные антитела, которые специфически связываются с LAG-3 с высокой аффинностью, в частности человеческие моноклональные антитела. Предпочтительно антитела связывают человеческий LAG-3. В некоторых вариантах изобретения антитела связывают как человеческий, так и обезьяний LAG-3, но не мышиный LAG-3. Изобретение включает антитела против LAG-3, которые могут ингибировать связывание LAG-3 с молекулами главного комплекса гистосовместимосги (ГКГ, МНС) класса II и которые могут стимулировагь антигенспецифический Т-клеточный ответ (антигенспецифические Т-клеточные реакции). Изобретение также включает нуклеотидные молекулы, кодирующие антитела по изобретению, экспрессирующие векторы, клетки-хозяева и способы экспрессии антител. Также изобретение охватывает иммуноконъюгаты, биспецифические молекулы и фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению. Данное раскрытие включает также способы детекции LAG-3, а также способы лечения стимулирующих иммунных реакций с помощью антитела против LAG-3 по изобретению. Также охватывается комбинированная терапия, в соответствии с которой антитело против LAG-3 вводят совместно по меньшей мере с одним дополнительным иммуностимулирующим антителом. Уровень техники Ген активации лимфоцитов-3, или LAG-3 (также известный как CD223), является членом семейства"иммуноглобулинового супергена" ("супергена иммуноглобулинов") и структурно и генетически связан с CD4. LAG-3 не экспрессируется на "спящих" лимфоцитах периферической крови, но экспрессируется на активированных Т-клетках и NK-клетках. LAG-3 представляет собой мембранный белок, кодируемый геном, локализованным на дистальном участке короткого плеча хромосомы 12, близ гена CD4, это наводит на мысль, что ген LAG-3 можно выделять генной дупликацией (Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 1393-1405). Показано, что аналогично CD4 LAG-3 не взаимодействует с молекулами ГКГ (МНС) класса II, но в отличие от CD4 LAG-3 не взаимодействует с gp120 белком вируса иммунодефицита человека (Baixeras etal. (1992) J. Exp. Med. 176: 327-337). Исследования с использованием белка слияния LAG-3 с иммуноглобулином (sLAG-3Ig) демонстрируют прямое и специфическое связывание LAG-3 с молекулами ГКГ(МНС) класса II на поверхности клетки (Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26: 1180-1186). В in vitro исследованиях антиген-специфических Т-клеточных реакций добавление антител противLAG-3 приводит к повышенной пролиферации Т-клеток, повышенной экспрессии антигенов активации,таких как CD25, и к повышенным концентрациям цитокинов, таких как интерферон-гамма и интерлейкин-4, подтверждая роль взаимодействия LAG-/MHC класса II в даунрегуляции антигензависимой стимуляции CD4+ Т лимфоцитов (Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 3216- 3221). Показано, что интраплазматическая область LAG-3 взаимодействует с белком, называемым LAP, который предположительно является молекулой сигнальной трансдукции, участвующей в даунрегуляции пути активации CD3/TCR(Iouzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 2885- 2891). Кроме того, показано, что CD4+CD25+ регуляторные Т клетки (Treg) экспрессируют LAG-3 при активации, а антитела к LAG-3 ингибируют супрессию индуцированными клетками Treg как in vitro, так и in vivo, это позволяет предположить, что LAG-3 вносит вклад в супрессорную активность Treg клеток (Huang, С. et al. (2004) Immunity 21: 503-513). Более того, показано, что LAG-3 негативно регулирует Т-клеточный гомеостаз с помощью регуляторных Т-клеток как по Т-клеточно-зависимому, так и по Т-клеточно-независимому механизму (Workman, C.J. and Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174: 688-695). Показано, что в некоторых условиях LAG-3 вызывает также иммуностимулирующий эффект. Например, трансфецированные с помощью LAG-3 опухолевых клеток, трансплантированные в сингенных мышей, проявляют заметный рост снижения или полную регрессию по сравнению с нетрансфецированными опухолевыми клетками, это позволяет предположить, что экспрессия LAG-3 на опухолевых клетках стимулирует противоопухолевый ответ за счт инициирования (запуска, включения) антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул ГКГ (МНС) класса II (Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3867-3876). Помимо этого, показано, что растворимый слитый белок LAG-3Ig стимулирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ при введении мышам вместе с антигеном, это показывает,что растворимый LAG-3Ig может действовать как адъювант в вакцине (El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. 164: 5583-5589). Показано далее, что растворимый человеческий LAG-3Ig усиливает in vitro выработку типа I опухоль-специфического иммунитета (Casati et al. (2006) Cancer Res. 66: 4450-4460). Обзор функциональной активности LAG-3 приводится в Triebel (2003) Trends Immunol. 24: 619-622. На основании вышесказанного становится понятным, что дополнительные агенты для модуляции активности LAG3 представляют интерес. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает выделенные моноклональные антитела или их антегенсвязывающие участки, которые специфически связывают человеческий LAG-3. В одном варианте изобретения антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжлой и/или лгкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 85% гомологичные аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 43. В другом варианте изобретения антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжлой и/или лгкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 90% гомологичные аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 43. В другом варианте антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, 7 и 13 соответственно, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи,как указано в SEQ ID NO: 19, 25 и 31 соответственно. В одном варианте моноклональные антитела, их антигенсвязывающие участки, соответствующие настоящему изобретению, обладают нужными функциональными свойствами. Эти свойства включают высокоаффинное связывание с человеческим LAG-3, связывание с LAG-3 человека и обезьяны (например, LAG-3 макака циномолгус и/или резус), но не с мышиным LAG-3, способность ингибировать связывание LAG-3 с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ, МНС) класса II и/или способность стимулировать антиген-специфические Т-клеточные реакции (ответы). Антитела по изобретению можно применять, например, для обнаружения (детекции) белка LAG-3 или для стимуляции антиген-специфических Т-клеточных реакций, таких как у носителя опухоли или носителя вируса. В одном аспекте изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему участку, отличающемуся тем, что это антитело связывает человеческийLAG-3 и проявляет по меньшей мере одно из нижеследующих свойств:(б) не связывает мышиный LAG-3;(г) стимулирует иммунный ответ. Предпочтительно антитело проявляет по меньшей мере два из этих свойств (а), (б), (в) и (г). Более предпочтительно антитело проявляет по меньшей мере три из этих свойств (а), (б), (в) и (г). Ещ более предпочтительно антитело проявляет все четыре из этих свойств (а), (б), (в) и (г). В предпочтительном варианте изобретения антитело стимулирует антиген-специфический Тклеточный ответ, такой как продуцирование интерлейкина-2 (IL-2) в процессе антиген-специфического Т-клеточного ответа. В других вариантах изобретения антитело стимулирует иммунный ответ, такой как противоопухолевый ответ (противоопухолевую реакцию), например ингибирует рост опухоли на in vivo модели опухолевого трансплантата), или аутоиммунный ответ (например, стимулирует развитие диабета у NOD мышей). В предпочтительном варианте изобретения антитело связывает эпитоп человеческогоLAG-3, содержащий аминокислотную последовательность HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) илиPAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). В других вариантах изобретения антитело связывается с человеческимKD 110-9 М или менее. В одном варианте изобретения антитело окрашивает слизистую ткань в иммуногистохимическом исследовании, тогда как в другом варианте изобретения антитело не окрашивает слизистую ткань в иммуногистохимическом исследовании. В другом аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему участку, содержащему:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37-42;(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43-48; причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3. Предпочтительная комбинация включает:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 43. Антитела по изобретению могут представлять собой, например, полноразмерные антитела (антитела полной длины), например IgG1, IgG2 или IgG4 изотипа. В предпочтительном варианте изобретения антитело представляет собой антитело IgG4 изотипа. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело представляет собой антитело IgG4 изотипа, содержащее мутационную замену серина на пролин на шарнирном участке константной области тяжлой цепи (в положении, соответствующем положению 241 в соответствии с описанием в Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108), так что уменьшается или отменяется гетерогенность за счт дисульфидного мостика между тяжлыми цепями. Или же антитела могут представлять собой фрагменты антител, такие как Fab, Fab' или Fab'2 фрагменты, или одноцепочечные антитела. Данное раскрытие включает также иммуноконъюгат, содержащий антитело по изобретению или его антигенсвязывающий участк, связанное(ый) с терапевтическим агентом, например цитотоксином или радиоактивным изотопом. Изобретение также включает композиции для стимуляции иммунного ответа, содержащие эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Также данное изобретение охватывает молекулы выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельную область антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению, а также экспрессирующие векторы, содержащие такие нукленовые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие экспрессирующие векторы. Также данное изобретение включает способы получения антител против LAG-3 с применением таких экспрессирующих векторов, эти способы могут включать стадии (i) экспрессии антитела в клетке-хозяине и (ii) выделения антитела из клетки-хозяина. Другой аспект изобретения относится к способам стимуляции иммунного ответа (иммунных реакций) с помощью антител против LAG-3 по изобретению. Например, в одном варианте изобретение включает способ стимуляции антигенспецифического Т-клеточного ответа, заключающийся в контактировании указанной Т-клетки с антителом или его антигенсвязывающим участком или композицией по изо-2 023032 бретению, в результате чего стимулируется антигенспецифический Т-клеточный ответ. В указанном способе стимуляции Т-клетка присутствует in vitro или in vivo за исключением тела человека. В предпочтительном варианте изобретения стимулируется продукция интерлейкина-2 антигенспецифической Тклеткой. Другой вариант изобретения включает способ стимуляции иммунного ответа (например, антиген-специфического Т-клеточного ответа) у субъекта, заключающийся во введении субъекту антитела по изобретению, в результате чего стимулируется иммунный ответ организма субъекта (например, антигенспецифический Т-клеточный ответ). В предпочтительном варианте изобретения субъект является носителем опухоли, и стимулируется иммунный ответ против опухоли. В другом предпочтительном варианте изобретения субъект является носителем вируса, и стимулируется иммунный ответ против вируса. Ещ один вариант изобретения включает способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, заключающийся во введении субъекту антитела против LAG-3 и по меньшей мере одного дополнительного иммуностимулирующего антитела, такого как антитело против PD-1, антитело против PD-L1 и/или антитела против CTLA-4, с тем, чтобы у субъекта стимулировался иммунный ответ, например для ингибирования роста опухоли или для стимуляции антивирусной реакции. В одном варианте изобретения субъекту вводят антитело против LAG-3 и антитело против PD-1. В другом варианте изобретения субъекту вводят антитело против LAG-3 и антитело против PD-L1. Ещ в одном варианте изобретения субъекту вводят антитело против LAG-3 и антитело против PD. В еще одном варианте изобретения субъекту вводят антитело против LAG-3 и антитело против CTLA-4. В одном варианте изобретения антитело противLAG-3 представляет собой человеческое антитело, такое как антитело по данному описанию. Или же антитело против LAG-3 может представлять собой, например, химерное или гуманизированное антитело. В другом варианте изобретения по меньшей мере одно дополнительное иммуностимулирующее антитело(например, антитело против PD-1, против PD-L1 и/или против CTLA-4) является человеческим антителом. Или же по меньшей мере одно дополнительное иммуностимулирующее антитело может представлять собой, например, химерное или гуманизированное антитело. Ещ в одном аспекте изобретение относится к способу получения антитела против LAG-3. Этот способ включает:(а) предоставление (i) последовательности вариабельной области тяжлой цепи, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, последовательность CDR2,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-12, и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-14, GGY и 16-18; и/или (ii) последовательности вариабельной области лгкой цепи, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID(б) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в последовательности вариабельной области тяжлой цепи антитела и/или в последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела с целью создать по меньшей мере одну изменнную последовательность антитела; и(в) экспрессию антитела с изменнной последовательностью в виде белка. Еще в одном аспекте изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению или их композиции в иммунотерапии, в частности для стимулирования иммунного ответа у субъекта, ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, лечения вирусной инфекции у субъекта. В одном аспекте изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению или их композиции для изготовления лекарственного средства для иммунотерапии. Другие признаки и преимущества настоящего раскрытия будут очевидны из нижеприведнного подробного описания и примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылочных материалов, данных из Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в данной заявке, однозначно вводится в данное описание в качестве ссылки. Краткое описание фигур На фиг. 1 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 49) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 37) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 25F7. Области CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 7) и CDR3 (SEQ ID NO: 13) выделены, а деривации (источники) V, D и J зародышевой линии указаны. На фиг. 1 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 55) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 43) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 25F7. Области CDR1 (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 25) и CDR3 (SEQ ID NO: 31) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 2 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 50) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 38) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 26 Н 10. Области CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 8) и CDR3 (SEQ ID NO: 14) выделены, а деривации (источники) V, D и J зародышевой линии указаны. На фиг. 2 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 56) и аминокислотная после-3 023032 довательность (SEQ ID NO: 44) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 26 Н 10. Области CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 26) и CDR3 (SEQ ID NO: 32) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 3 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 51) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 39) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 25 Е 3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 9) и CDR3 выделены, а деривации(источники)V, D и J зародышевой линии указаны. На фиг. 3 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 57) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 45) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 25 Е 3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 27) и CDR3 (SEQ ID NO: 33) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 4 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 52) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 40) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 8 В 7. Области CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 10) и CDR3 (SEQ ID NO: 16) выделены, а деривации (источники) V, D и J из зародышевой линии указаны. На фиг. 4 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 58) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 46) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 8 В 7. Области CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 28) и CDR3 (SEQ ID NO: 34) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 5 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 53) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 41) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 11F2. Области CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 11) и CDR3 (SEQ ID NO:17) выделены, а деривации (источники) V, D и J из зародышевой линии указаны. На фиг. 5 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 59) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 47) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 11F2. Области CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) и CDR3 (SEQ ID NO: 35) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 6 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 54) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 42) вариабельной области тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела 17 Е 5. Области CDR1 (SEQ ID NO: 6), CDR2 (SEQ ID NO: 12) и CDR3 (SEQ ID NO: 18) выделены, а деривации (источники) V, D и J из зародышевой линии указаны. На фиг. 6 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 60) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 48) вариабельной области лгкой цепи -человеческого моноклонального антитела 17 Е 5. Области CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) и CDR3 (SEQ ID NO: 36) выделены, а деривации (источники) V и D зародышевой линии указаны. На фиг. 7 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 25F7 (SEQ ID NO: 37) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 4-34 и JH5b (SEQ ID NO: 61 и 62 соответственно). На фиг. 8 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 25F7 (SEQ ID NO: 43) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk L6 и JK2 (SEQ ID NO: 63 и 64 соответственно). На фиг. 9 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 26 Н 10 (SEQ ID NO: 38) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 3-33 И JH6B (SEQ ID NO: 65 и 66 соответственно). На фиг. 10 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 26 Н 10 (SEQ ID NO: 44) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk A27 и JK3 (SEQ ID NO: 67 и 68 соответственно). На фиг. 11 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 25 Е 3 (SEQ ID NO: 39) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 3-20 И JH4b (SEQ ID NO: 69 и 70 соответственно). На фиг. 12 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 25 Е 3 (SEQ ID NO: 45) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk L18 и JK2 (SEQ ID NO: 71 и 64 соответственно). На фиг. 13 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 8 В 7 (SEQ ID NO: 40) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 4-34 и JH5b (SEQ ID NO: 61 и 62 соответственно). На фиг. 14 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 8 В 7 (SEQ ID NO: 46) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk L6 и JK4 (SEQ ID NO: 63 и 72 соответственно). На фиг. 15 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 11F2 (SEQ ID NO: 41) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 1-24 И JH4b (SEQ ID NO: 73 и 70 соответственно). На фиг. 16 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 11F2 (SEQ ID NO: 47) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk L6 и JK1 (SEQ ID NO: 63 и 74 соответственно). На фиг. 17 показановыравнивание аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжлой цепи антитела 17 Е 5 (SEQ ID NO: 42) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии VH 3-33 и 2-2 (SEQ ID NO: 65 и 70 соответственно). На фиг. 18 показано выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела 17 Е 5 (SEQ ID NO: 48) с аминокислотными последовательностями человеческой зародышевой линии Vk L6 (SEQ ID NO: 63 и 75 соответственно). На фиг. 19 показано выравнивание белковой последовательности, кодированной кДНК LAG-3 обезьян клон ра 23-5 (SEQ ID NO: 93), с депонированной в Genbank белковой последовательностью LAG-3 макак- резус (SEQ ID NO: 94) (регистрационныйв Genbank XM001108923). Область внешней пептидной петли и трансмембранный домен подчркнуты. Одно аминокислотное различие между двумя последовательностями (аминокислотное положение 419) выделено полужирным шрифтом. Подробное описание изобретения Настоящее раскрытие относится к выделенным моноклональным антителам, в частности к человеческим моноклональным антителам, которые связываются с человеческим LAG-3 и обладают требуемыми функциональными свойствами. В некоторых вариантах изобретения антитела по изобретению образованы из конкретных последовательностей тяжлых и лгких цепей зародышевой линии и/или имеют конкретные структурные признаки, такие как CDR области, содержащие конкретные аминокислотные последовательности. Данное раскрытие включает выделенные антитела, способы получения таких антител, иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы, содержащие такие антитела, и фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы по изобретению. Данное раскрытие относится также к способам применения антител, таким как детекция LAG-3 белка, а также к способам применения антител против LAG-3 по изобретению для стимуляции иммунного ответа,самостоятельно или в комбинации с другими иммуностимулирующими антителами. Соответственно,данное раскрытие также включает способы применения антител против LAG-3 по изобретению, например для ингибирования роста опухоли или лечения вирусной инфекции. Для того чтобы настоящее раскрытие стало понятнее, прежде всего датся определение некоторых терминов. Дополнительные определения даются по ходу подробного описания. Термин "LAG-3" относится к гену активации лимфоцитов-3. Термин "LAG-3" включает варианты,изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфические к человеческому белкуLAG-3, могут в некоторых случаях перекрстно реагировать с белком LAG-3 другого вида, нежели человеческий белок LAG-3. В других вариантах изобретения антитела, специфические к человеческому белкуLAG-3, могут быть полностью специфическими к человеческому белку LAG-3 и могут не проявлять видовую или другого типа перекрстную реактивность или могут перекрстно реагировать с LAG-3 некоторых, но не всех (например, перекрстно реагировать с LAG-3 обезьяны, но не с мышиным LAG-3). Термин "человеческий LAG-3" относится к человеческой последовательности LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность человеческого LAG-3, имеющая регистрационный номер в GenbankNP002277. Термин "мышиный LAG-3" относится к мышиной последовательности LAG-3, такой как полная аминокислотная последовательность мышиного LAG-3, имеющая регистрационный номер в Genbank NP032505. В уровне техники LAG-3 также известен, например, как CD223. Последовательность человеческого LAG-3 может отличаться от человеческой последовательности LAG-3, имеющей регистрационный номер в Genbank NP002277, тем, что она может иметь, например, консервативные мутации или мутации в неконсервативных областях, и LAG-3 имеет практически такую же биологическую функцию, что и человеческий LAG-3 из Genbank регистрационныйNP002277. Например, биологическая функция человеческого LAG-3 заключается в том, что он имеет эпитоп во внеклеточном домене LAG-3, который специфически связан с антителом по настоящему раскрытию, или биологической функцией LAG-3 является связывание с молекулами класса II ГКГ (МНС). Предполагается, что термин "обезьяний LAG-3 (LAG-3 обезьяны)" охватывает LAG-3 белки, экспрессируемые в клетках обезьян Старого и Нового Света, включая, но без ограничения, LAG-3 обезьян циномолгус и LAG-3 обезьян (макак) резус. Репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой аминокислотную последовательность LAG-3 макак-резус, показанную на фиг. 19 и SEQ ID NO: 85, которая также депонирована в Genbank, регистрационныйXM001108923. Другая репрезентативная аминокислотная последовательность обезьяньего LAG-3 представляет собой альтернативную последовательность макак-резус клона ра 23-5, показанную на фиг. 19 иSEQ ID NO: 84, выделенную, как описано в примере 3 А, подраздел 3. Эта альтернативная аминокислотная последовательность макак-резус имеет единственное отличие в положении 419 от аминокислотной последовательности, депонированной в Genbank. Конкретная последовательность человеческого LAG-3 обычно по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности человеческого LAG-3, депонированной в Genbank, регистрацион-5 023032 ныйNP002277, и содержит аминокислотные остатки, которые определяют аминокислотную последовательность как человеческую последовательность при сравнении с аминокислотными последовательностями LAG-3 других видов (например, мышиного LAG-3). В некоторых случаях аминокислотная последовательность человеческого LAG-3 может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности LAG-3 из Genbank, регистрационныйNP002277. В некоторых вариантах изобретения имеется не более 10 аминокислотных различий между человеческой последовательностью LAG-3 и последовательностью LAG-3 из Genbank, регистрационныйNP002277. В некоторых вариантах изобретения имеется не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотного различия между человеческой последовательностью LAG-3 и последовательностью LAG-3 из Genbank, регистрационныйNP002277. Идентичность в процентах определяют, как указано в данном описании. Термин "иммунный ответ (иммунная реакция)" относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному поражению, деструкции или удалению из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей. Выражение "антигенспецифический Т-клеточный ответ" относится к ответу (реакциям) Т-клетки,который(ые) является результатом стимуляции Т-клетки антигеном, к которому специфична Т-клетка. Неограничивающие примеры ответов Т-клетки на антигенспецифическую стимуляцию включают пролиферацию и продукцию цитокинов (например, продукцию IL-2). Термин "антитело" по данному описанию включает целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающий участок") или их одиночные цепи. Целые антитела представляют собой гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжлых (Н) цепи и две лгких (L) цепи,связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжлая цепь состоит из вариабельной области тяжлой цепи (сокращнно обозначаемой в данном описании VH) и константной области тяжлой цепи. Константная область тяжлой цепи состоит из трх доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая лгкая цепь состоит из вариабельной области лгкой цепи (сокращнно обозначаемой в данном описании VL) и константной области лгкой цепи. Константная область лгкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут также подразделяться на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающимися с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL состоит из трх CDR и четырх FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжлой и лгкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классического пути системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок" антитела (или просто "участок антитела") по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, с LAG-3 белком). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, который практически представляет собой Fab с участком шарнирной области (см.,Fundamental immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1;(V) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH единичного плеча (фрагмента Fab) антитела, (vi) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH домена; (vii) выделенную гипервариабельную область (CDR) и (viii) нанотело, вариабельную область тяжлой цепи, содержащую один вариабельный домен и два константных домена. Помимо этого, хотя два домена фрагмента Fv, VL иVH кодируются отдельными генами, их можно связывать, используя методы рекомбинантной ДНК, синтетическим линкером, который позволяет их получать в виде единой белковой цепи, в которой областиVL и VH "спариваются" с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный фрагмент Fv (scFv); см. например., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающий участок" антитела. Эти фрагменты антитела получают обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и эти фрагменты подвергают скринингу на полезность такими же методами, как и интактные антитела. Предполагается, что выражение "выделенное антитело" по данному описанию относится к антителу, которое практически свободно от других антител, имеющих отличную антигенную специфичность(например, выделенное антитело, которое специфически связывает белок LAG-3, практически не содержат (свободно от) антител, которые специфически связывают антигены, отличные от белков LAG-3). Выделенное антитело, которое специфически связывает человеческий белок LAG-3, может, однако, уча-6 023032 ствовать в перекрстных реакциях с другими антигенами, такими как белок LAG-3 других видов. Кроме того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических агентов. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" по данному описанию относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет единственную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела,имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области образованы из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также образована из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодированные генами для человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии (например, мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом invitro или соматической мутацией in vivo). Однако предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию не включает антитела, у которых последовательности CDR, образованные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, привиты к человеческим каркасным последовательностям. Выражение "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим единственную специфичность связывания, имеющим вариабельные области, в которых как каркасные, так иCDR области образованы из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжлой цепи и трансген лгкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Выражение "рекомбинантное человеческое антитело" по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантным методом,такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которые являются трансгенными или "транс-хромосомными" по человеческим генам иммуноглобулинов, или полученные при их использовании гибридомы (подробнее описаны ниже), (б) антитела, выделенные при использовании клеткихозяина, трансформированной с целью экспрессировать человеческое антитело, например трансфектомы,(в) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими методами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов с другими ДНК- последовательностями. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR области образованы из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться in vitro мутагенезу (или если животное является трансгенным по человеческим Ig последовательностям, in vivo мутагенезу), и, следовательно, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые будучи образованы из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии могут не существовать в природе в спектре человеческих антител зародышевой линии in vivo. Термин "изотип" относится к классу антител (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжлой цепи. Выражения "антитело, узнающее (распознающее) антиген" и "антитело, специфическое к антигену" употребляются в данном описании взаимозаменяемо с выражением "антитело, которое специфически связывается с антигеном". Выражение "производные человеческого антитела" относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например конъюгату антитела и другому агенту или антителу. Предполагается, что термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, у которых последовательности CDR, образованные из зародышевой последовательностей млекопитающего другого вида, такого как мышь, привит к человеческим каркасным последовательностям. В человеческих каркасных последовательностях можно осуществить другие модификации каркасной области. Предполагается, что термин "химерное антитело" относится к антителам, у которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, а последовательности константной области получены из другого вида, например антитело, у которого последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела, а последовательности константных областей получены из человеческого антитела. Предполагается, что выражение по данному описанию "антитело, которое "специфически связывает человеческий LAG-3" относится к антителу, которое связывается с человеческим белком LAG-3 (и, возможно, с белком LAG-3 одного или более других видов, отличных от человека), но практически не связывается с белками, отличными от белка LAG-3. Предпочтительно антитело связывается с человеческимLAG-3 белком с "высокой аффинностью", а именно, с KD 110-7 М или менее, более предпочтительно 510-8 М или менее, более предпочтительно 310-8 М или менее, более предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 510-9 М или менее или даже более предпочтительно 110-9 М или менее. Выражение по данному описанию "практически не связывается" с белком или клеткой означает не связывается или не связывается с высокой аффинностью с белком или клеткой, т.е. связывается с белком или клеткой с KD 110-6 М или более, более предпочтительно 110-5 М или более, более предпочтительно 110-4 М или более, более предпочтительно 110-3 М или более, ещ более предпочтительно 110-2 М или более. Предполагается, что термин "Kassoc" или "Ka" по данному описанию относится к конкретному взаимодействию антитело-антиген, тогда как полагают, что термин "Kdis" или "Kd" по данному описанию относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Предполагается, что термин "KD" по данному описанию относится к константе диссоциации, которую получают из отношения KD к Ka (т.е., Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (М). Величины KD для антител можно определять методами, общепринятыми в уровне техники. Предпочтительным методом определения KD антитела является метод поверхностного плазмонного резонанса, предпочтительно с применением биосенсорной системы, такой как система Biacore. Термин "высокоаффинное" по отношению к IgG антителу, относится к антителу, имеющему KD 110-7 М или менее, более предпочтительно 510-8 М или менее, более предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 510-9 М или менее, более предпочтительно, 110-9 М или менее по отношению к антигену-мишени. Однако "высокоаффинное" связывание может меняться для других изотипов антител. Например, "высокоаффинное" для IgM изотипа относится к антителу, имеющему KD 10-6 М или менее, более предпочтительно 10-7 М или менее, ещ более предпочтительно 10-8 М или менее. Термин "субъект" включает человека или отличного от человека животного. Термин "отличное от человека животное" включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как нечеловекообразные приматы, овцы, собаки, крупный рогатый скот, кошки, лошади, куры, земноводные и рептилии, хотя предпочтительными являются млекопитающие, такие как нечеловекообразные приматы, овцы, собаки, кошки, крупный рогатый скот и лошади. Различные аспекты изобретения более подробно описаны в нижеприведнных подразделах. Антитела против LAG-3, обладающие специфическими функциональными свойствами. Антитела по изобретению характеризуются специфическими функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с человеческим LAG-3 и могут связываться с LAG-3 некоторых других видов, например LAG-3 обезьян (например, обезьян (макак) циномолгус, макак-резус), но практически не связываются с LAG-3 некоторых других видов, например мышиным LAG-3. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с человеческим LAG-3 с высокой аффинностью. На способность антитела стимулировать иммунный ответ, такой как антиген-специфический Тклеточный ответ, может указывать, например, способность антитела стимулировать продукцию интерлейкина-2 (IL-2) при антиген-специфическом Т-клеточном ответе. В некоторых вариантах изобретения антитело по изобретению связывается с человеческим LAG-3 и проявляет способность стимулировать антигенспецифический Т-клеточный ответ. В других вариантах изобретения антитело по изобретению связывается с человеческим LAG-3, но не проявляет способности стимулировать антиген-специфический Т-клеточный ответ. Другие способы определения способности антитела стимулировать иммунный ответ включают способность антитела ингибировать рост опухоли, например, как на in vivo модели трансплантата опухоли (см, например, пример 6), или способность антитела стимулировать аутоиммунный ответ,такую как способность инициировать (промотировать) развитие аутоиммунного заболевания на аутоиммунной модели, напримеръ, способность промотировать развитие диабета на NOD мышиной модели(см., например, пример 7). Связывание антитела по изобретению с LAG-3 можно оценивать одним или более методами, общепринятыми в уровне техники. Например, в предпочтительном варианте изобретения антитело можно проверять методом проточной цитометрии, в котором антитело реагирует с линией клеток, экспрессирующих человеческий LAG-3, таких как клетки СНО, трансфецированные таким образом, чтобы экспрессировать LAG-3 (например, человеческий LAG-3 или обезьяний LAG-3 (например, макак-резус или циномолгус) или мышиный LAG-3) на своей клеточной поверхности (соответствующий анализ см., например, в примере 3 А). Другие подходящие клетки для применения в методах проточной цитометрии включают стимулированные антителами против CD3 активированные CD4+ T-клетки, которые экспрессируют нативный LAG-3. Помимо этого или в качестве альтернативы, связывание антитела, включая кинетику связывания (например, величину KD), можно определять с помощью анализов связыванияBIAcore binding assays (соответствующие анализы см., например, в примере 3 В). Другие подходящие анализы связывания включают методы ELISA, например, с использованием рекомбинантного LAG-3 белка (соответствующие анализы см., например, в примере 1). Предпочтительно антитело по изобретению связывается с LAG-3 белком с KD 510-8 М или менее,-8 023032 связывается с LAG-3 белком с KD 210-8 М или менее, связывается с LAG-3 белком с KD 510-9 М или менее, связывается с LAG-3 белком с KD 410-9 М или менее, связывается с LAG-3 белком с KD 310-9 М или менее, связывается с LAG-3 белком с KD 210-9 М ИЛИ менее, связывается с LAG-3 белком с KD 110-9 М или менее, связывается с LAG-3 белком с KD 510-10 М или менее, или связывается с LAG-3 белком сKD 110-10 М или менее. Как правило, антитело по изобретению связывается с LAG-3 в лимфоидных тканях, таких как миндалины, селезнка или вилочковая железа (тимус), что можно обнаружить иммуногистохимическими методами. Помимо этого, как описано далее в примере 8, некоторые антитела против LAG-3 по изобретению окрашивают ткань гипофиза (например, задерживаются в гипофизе) при иммуногистохимическом исследовании, тогда как другие антитела против LAG-3 по изобретению не окрашивают ткань гипофиза(например, не задерживаются в гипофизе) при иммуногистохимическом исследовании. Так, в одном варианте изобретение включает человеческое антитело против LAG-3, которое окрашивает ткань гипофиза при иммуногистохимическом исследовании, тогда как в другом варианте изобретение включает человеческое антитело против LAG-3, которое не окрашивает ткань гипофиза при иммуногистохимическом исследовании. В одном варианте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок конкурирует за связывание с человеческим LAG-3 с эталонным антителом, причм эталонное антитело включает:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 37, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(б) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 38, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(в) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 39, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(г) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 40, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(д) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 41, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(е) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 42, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 48. В предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43. В другом предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи,содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и вариабельную область лгкой цепи,содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44. В другом предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45. В другом предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46. В другом предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 41, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 47. В другом предпочтительном варианте изобретения эталонное антитело содержит вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. Предпочтительными антителами по изобретению являются человеческие моноклональные антитела. Помимо этого или в качестве альтернативы, антитела могут представлять собой, например, химерные или гуманизированные антитела. Моноклональные антитела 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5. Предпочтительными антителами по изобретению являются человеческие моноклональные антитела 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. VH аминокислотные последовательности антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5 показаны в SEQ ID NO: 37-42 соответственно. VK аминокислотные последовательности антител 25F7, 26 Н 10,-9 023032 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5 показаны в SEQ ID NO: 43-48 соответственно. С учтом того, что каждое из этих антител может связываться с человеческим LAG-3, последовательности VH и VL можно смешивать (технология "mixed and matched"), чтобы создать молекулы других связывающих антител против LAG-3 по изобретению. Предпочтительно, когда смешиваются цепи VH иVL, VH последовательность в конкретной паре VH/VL заменяется на сходную по структуре VH последовательность. Аналогично, предпочтительно VL последовательность в конкретной паре VH/VL заменяется на сходную по структуре VL последовательность. Соответственно, в одном аспекте данное изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий):(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47-42; и(б) вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43-48; причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3. Предпочтительные комбинации тяжлой и лгкой цепи включают:(а) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 37, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(б) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 38, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(в) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 39, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(г) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 40, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(д) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 41, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID(е) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 42, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 48. В другом аспекте данное раскрытие включает антитела, которые содержат области CDR1, CDR2 иCDR3 тяжлой и лгкой цепей антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 или 17 Е 5 или их комбинации. Аминокислотные последовательности VH CDR1 антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5 показаны вof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). С учтом того, что каждое из антител может связываться с человеческим LAG-3 и что специфическое связывание с антигеном обеспечивается прежде всего областями CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности VH CDR1, CDR2 и CDR3 и последовательности VL CDR1, CDR2 и CDR3 можно смешивать("mixed and matched") (т.е. можно смешивать области CDR из различных антител, хотя каждое антитело должно содержать VH CDR1, CDR2 и CDR3 и VL CDR1, CDR2 и CDR3), чтобы создать молекулы других связывающих антител против LAG-3 по изобретению. Связывание LAG-3 такими смешанными (спутанными) ("mixed and matched") антителами можно анализировать, используя описанные выше методы анализа и примеры (например, анализы ELISA, Biacore). Предпочтительно, когда последовательности VHCDR смешиваются (смесь), последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной VH последовательности заменяют на структурно аналогичную(ые) CDR последовательность(и). Аналогично, когда последовательности VL CDR смешиваются, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретнойVL последовательности предпочтительно заменяют на структурно аналогичную(ые) CDR последовательность(и). Опытному специалист в данной области техники ясно, что новые VH и VL последовательности можно создать, заменяя последовательности одной или более областей CDR цепей VH и/или VL на сходные по структуре последовательности из CDR последовательностей, раскрываемых в данном описании для моноклональных антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и 17 Е 5. Соответственно, в другом аспекте данное раскрытие включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий):(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-12;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-14, GGY и 16-18;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-24;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:25-30; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-36; причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3. В предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 1;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 13;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 19;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 25; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 31. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 2;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 14;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 20;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 26; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 32. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 3;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий GGY;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 21;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 27; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 33. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 4;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 16;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 22;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 28; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 34. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 23;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 29; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 35. В другом предпочтительном варианте изобретения антитело содержит:(а) домен CDR1 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 6;(б) домен CDR2 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12;(в) домен CDR3 вариабельной области тяжлой цепи, содержащий SEQ ID NO: 18;(г) домен CDR1 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 24;(д) домен CDR2 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 30; и(е) домен CDR3 вариабельной области лгкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 36. Хорошо известно в уровне техники, что домен CDR3 независимо от домена(ов) CDR1 и/или CDR2 один может определять специфичность связывания антитела со "своим" антигеном и что на основе общей CDR3 последовательности можно с уверенностью получать несколько антител с одинаковой специфичностью связывания. См., например., Klimka et al., British J. of Cancer 83(2): 252-260 (2000); Beiboer etXu and Davis, Immunity 13: 37-45 (2000). См. также патенты США 6951646; 6914128; 6090382; 6818216; 6156313; 6827925; 5833943; 5762905 и 5760185. Каждый из этих ссылочных материалов вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Соответственно, настоящее раскрытие включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 доменов тяжлой и/или лгкой цепи из антитела человека или отличного от человека животного, причм моноклональное антитело способно специфически связываться с человеческим LAG-3. В некоторых аспектах настоящее раскрытие включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи из нечеловеческого антитела, такого как антитело мыши или крысы, причм моноклональное антитело способно специфически связываться с человеческим LAG3. В некоторых вариантах изобретения такие антитела по изобретению, содержащие один или болееCDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи из нечеловеческого антитела: (а) способны конкурировать за связывание с соответствующим исходным нечеловеческим антителом; (б) сохраняют функциональные характеристики соответствующего исходного нечеловеческого антитела; (в) связываются с тем же самым эпитопом, что и соответствующее исходное нечеловеческое антитело; и/или (г) имеют аффинность связывания, аналогичную аффинности связывания соответствующего исходного нечеловеческого антитела. В других аспектах настоящее раскрытие включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи из человеческого антитела, например, такого как человеческое антитело, полученное при использовании нечеловеческого животного, причм человеческое антитело способно специфически связываться с человеческим LAG-3. В других аспектах настоящее раскрытие включает моноклональные антитела, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи первого человеческого антитела, например, такого как человеческое антитело, полученное при использовании нечеловеческого животного, причм человеческое антитело способно специфически связываться с человеческим LAG-3, a домен CDR3 из первого человеческого животного заменяет домен CDR3 в человеческом антителе, у которого отсутствует специфичность связывания с LAG-3, при этом получают второе человеческое антитело, которое способно специфически связываться с человеческим LAG-3. В некоторых вариантах изобретения такие антитела по изобретению, содержащие один или более CDR3 домен тяжлой и/или лгкой цепи из первого человеческого антитела: (а) способны конкурировать за связывание с соответствующим исходным первым человеческим антителом; (б) сохраняют функциональные характеристики соответствующего исходного первого человеческого антитела; (в) связываются с тем же самым эпитопом, что и соответствующее исходное первое человеческое антитело; и/или (г) имеют аффинность связывания, аналогичную аффинности связывания соответствующего исходного первого человеческого антитела. Антитела, имеющие последовательности конкретной зародышевой линии. В некоторых вариантах изобретения антитела по изобретению содержат вариабельную область тяжлой цепи, полученную при использовании гена тяжлой цепи иммуноглобулина конкретной зародышевой линии и/или гена лгкой цепи иммуноглобулина конкретной зародышевой линии. Например, предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-20, человеческого генаVH 4-34, человеческого гена VH 3-33 или человеческого гена VH 1-24, причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3. Другой предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L18,человеческого гена VK L6 или человеческого гена VK A27, причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3 белок. Ещ один предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-20,и включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L18, причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3 белок. Ещ один предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 4-34, и включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6,причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3 белок. Ещ один предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-33, и включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK А 27, причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3 белок. Ещ один предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 1-24, и включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6, причм антитело специфически связывает человеческийLAG-3 белок. Ещ один предпочтительный вариант изобретения включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи,которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-33, и включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6, причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3 белок. В предпочтительном варианте изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий):(а) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 4-34, и вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6;(б) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-33, и вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK A27;(в) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-20, и вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L18;(г) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 1-24, и вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6; или(д) вариабельную область тяжлой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VH 3-33, и вариабельную область лгкой цепи, которая является продуктом или образована при использовании человеческого гена VK L6; причм антитело специфически связывает человеческий LAG-3. Такие антитела могут иметь также одну или более функциональных характеристик, подробно описанных выше, таких как высокоаффинное связывание с человеческим LAG-3, связывание с обезьяньимLAG-3, отсутствие связывания с мышиным LAG-3, способность ингибировать связывание LAG-3 с молекулами ГКГ (МНС) класса II и/или способность стимулировать антигенспецифические Т-клеточные реакции (ответы). Примером антитела, у которого VH и VL представляют собой VH 3-20 и VK L18 соответственно, является антитело 25 Е 3. Примерами антител, у которых VH и VL представляют собой VH 4-34 и VK L6 соответственно, являются антитела 25F7 и 8 В 7. Примером антитела, у которого VH и VL представляют собойVH 3-33 и VK A27 соответственно, является антитело 26 Н 10. Примером антитела, у которого VH и VL представляют собой VH 1-24 и VK L6 соответственно, является антитело 11F2. Примером антитела, у которого VH и VL представляют собой VH 3-33 и VK L6 соответственно, является антитело 17 Е 5. В данном описании человеческое антитело содержит вариабельные области тяжлой или лгкой цепи, которые "являются продуктом" или "образованы при использовании" последовательности конкретной зародышевой линии, если вариабельные области антитела получают с помощью системы, которая использует гены человеческого иммуноглобулина. Такие системы включают иммунизацию трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина с целевым антигеном или скрининг фагдисплейной библиотеки человеческого иммуноглобулина, визуализируемой целевым антигеном. Человеческое антитело, которое "является продуктом" или "образовано при использовании" генов зародышевой линии для человеческих иммуноглобулиновых последовательностей, можно идентифицировать, сравнивая аминокислотную последовательность человеческого антитела с аминокислотными последовательностями человеческих иммуноглобулинов зародышевой линии и отбирая последовательность человеческого иммуноглобулина зародышевой линии, наиболее близкую (т.е. имеющую наибольший % идентичности) последовательности человеческого антитела. Человеческое антитело, которое "является продуктом" или "образовано при использовании" генов зародышевой линии для человеческих иммуноглобулиновых последовательностей, могут содержать аминокислотные различия по сравнению с последовательностью зародышевой линии вследствие, например, природных соматических мутаций или "прицельного" введения сайт-направленной мутации. Однако, как правило, аминокислотная последовательность выбранного человеческого антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодированной геном иммуноглобулина зародышевой линии, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют человеческое антитело именно как человеческое по сравнению с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мыши). В некоторых случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть идентичной по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97,98 или 99% аминокислотной последовательности, кодированной геном иммуноглобулина зародышевой линии. Обычно человеческое антитело, образованное из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, обнаруживает не более 10 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодированной геном человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В некоторых случаях человеческое антитело может иметь не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотного различия по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодированной геном человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Гомологичные антитела. Ещ в одном варианте изобретения антитело по изобретению содержит вариабельные области тяжлой и лгкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям предпочтительных антител по данному описанию, и при этом антитела сохраняют необходимые функциональные свойства антител против LAG-3 по изобретению. Например, данное раскрытие включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащее(ий) вариабельную область тяжлой цепи и вариабельную область лгкой цепи, отличающиеся тем, что:(a) вариабельная область тяжлой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из(b) вариабельная область лгкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из(c) антитело специфически связывается с человеческим LAG-3. Помимо этого или в качестве альтернативы, антитело может обладать одним или более следующих функциональных свойств, обсуждавшихся выше, таких как высокоаффинное связывание с человеческимLAG-3, связывание с обезьяньим LAG-3, отсутствие связывания с мышиным LAG-3, способность ингибировать связывание LAG-3 с молекулами ГКГ (МНС) класса II и/или способность стимулировать антиген-специфические Т-клеточные реакции (ответы). В различных вариантах изобретения антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. В других вариантах изобретения VH и/или VL аминокислотные последовательности могут быть на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичны представленным выше последовательностям. Антитело, имеющее последовательности VH и VL областей, обладающие с высокой гомологией (т.е. 80% или выше) с последовательностями VH и VL областей, представленными выше, можно получать мутагенезом (например, сайт-направленным или ПЦР-опосредованным мутагенезом) нуклеотидных молекул, кодирующихSEQ ID NO: 49-54 или 55-60, с последующим тестированием кодированного изменнного антитела на сохраннную функцию (т.е. на представленные выше функции) с применением функциональных анализов, представленных в данном описании. В данном описании процент гомологии (степень гомологии в процентах) между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентен проценту идентичности (степени идентичности в процентах) между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = число идентичных положений/общее число положений 100), с учтом числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно провести, используя математический алгоритм, как описано в приведнных ниже неограничивающих примерах. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Е. Майерса и У. Миллера (Е. Meyers and W. Miller) (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17(1988, который включн в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу веса остатков РАМ 120,штраф за длину гэпа 12 и штраф за гэп 4. Помимо этого, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять, используя алгорит Нидельмана-Вунша (Needlemanand Wunsch) (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970, который включн в программу GAP в программном обеспечении GCG (доступный по адресу http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ 250, вес (средневзвешенное) гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и средневзвешенное длины гэпа 1, 2,3, 4, 5 или 6. Помимо этого или в качестве альтернативы, белковые последовательности по настоящему раскрытию можно дополнительно использовать в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например для идентификации родственных последователь- 14023032 ностей. Такой поиск можно проводить, используя программу XBLAST (версия 2.0) Altschul et al. (1990) J.Mol. Biol. 215: 403-10. Поиск BLAST белков можно осуществлять с помощью программы XBLAST,оценка = 50, длина слова = 3, получая аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам антител по изобретению. Для проведения с применением гэпов с целью сравнения можно использовать программу Gapped BLAST, описанную Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. www.ncbi.nlm.nih.gov. Антитела с консервативными модификациями. В некоторых вариантах изобретения антитела по изобретению содержат вариабельную область тяжлой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, вариабельную область лгкой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причм одна или более из этих CDR последовательностей содержат конкретные аминокислотные последовательности на основе предпочтительных антител, представленных в данном описании (например, 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2, 17 Е 5), или их консервативные модификации, и при этом антитела сохраняют необходимые функциональные свойства антител против LAG-3 по изобретению. Из уровня техники ясно, что можно осуществить определнную модификацию консервативной последовательности, которая не затронет связывания с антигеном. См.,например, Brummell et al. (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272. 26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and(2000) Clin. Can. Res. 6: 2835- 43. Соответственно, данное раскрытие включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающее(ий) вариабельную область тяжлой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область лгкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где(а) CDR3 последовательность вариабельной области тяжлой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей(б) CDR3 последовательность вариабельной области лгкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей(в) антитело специфически связывает человеческий LAG-3. Помимо этого или в качестве альтернативы, антитело может обладать одним или более следующих функциональных свойств, описанных выше, таких как высокоаффинное связывание с человеческимLAG-3, связывание с обезьяньим LAG-3, отсутствие связывания с мышиным LAG-3, способность ингибировать связывание LAG-3 с молекулами ГКГ (МНС) класса II и/или способность стимулировать антигенспецифические Т-клеточные реакции (ответы). В предпочтительном варианте изобретения CDR2 последовательность вариабельной области тяжлой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7-12 и их консервативных модификаций; a CDR2 последовательность вариабельной области лгкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 25-30 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте изобретения CDR1 последовательность вариабельной области тяжлой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-6 и их консервативных модификаций; a CDR1 последовательность вариабельной области лгкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 19-24. В различных вариантах изобретения антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. Предполагается, что выражение "модификации консервативной последовательности" ("консервативные модификации") по данному описанию относится к аминокислотным модификациям, которые незначительно влияют или незначительно изменяют характеристики связывания антитела, содержащего эту аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации можно вводить в антитело по изобретению обычными методами, известными в уровне техники, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие замены,при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными (аналогичными) боковыми цепями определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин,серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), -разветвлнными боковыми цепями (напри- 15023032 мер, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин,триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в CDR областях антитела по изобретению можно заменить на другие аминокислотные остатки из того же самого семейства боковых цепей, а изменнное антитело можно тестировать на сохраннную функцию (т.е. функции,представленные выше) с помощью функциональных анализов по данному описанию. Антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитела против LAG-3 В другом варианте изобретение включает антитела, которые связываются с тем же эпитопом на LAG-3, что и любое из моноклональных антител против LAG-3 по изобретению (т.е. антитела, обладающие способностью конкурировать за связывание с человеческим LAG-3 с любым из моноклональных антител по изобретению). В предпочтительных вариантах изобретения эталонное антитело для изучения конкурентных реакций может представлять собой одно из моноклональных антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 или 17 Е 5. Такие конкурентные антитела можно идентифицировать на основании их способности конкурировать с 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и/или 17 Е 5 в стандартных анализах связывания LAG-3. Например,можно использовать стандартные методы анализа ELISA, в которых рекомбинантный человеческийLAG-3 белок иммобилизуют на плашке, одно из антител метят флуоресцентной меткой и оценивают способность немеченых антител конкурировать с немеченым антителом за связывание. Кроме того или в качестве альтернативы, для оценки способности антител конкурировать можно использовать анализBIAcore. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание, например, 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3,8 В 7, 11F2 и/или 17 Е 5 антител с человеческим LAG-3 показывает, что тестируемое антитело может конкурировать с антителом 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 и/или 17 Е 5 за связывание с человеческим LAG-3 и,следовательно, связывается с тем же самым эпитопом на человеческом LAG-3, что и 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3,8 В 7, 11F2 и/или 17 Е 5. В предпочтительном варианте изобретения антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом на человеческом LAG-3, что и 25 Е 3, 25F7, 8 В 7, 26 Н 10, 11F2 или 17 Е 5, является человеческим моноклональным антителом. Такие человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять как описано в примерах. Как обсуждается далее в примере 3 С, связывание 25 Е 3, 25F7 и 8 В 7 с человеческим LAG-3 картировано в области "внешней петли (extra loop)" в первом внеклеточном домене человеческого LAG-3. Последовательность области внеклеточной (внешней) петли представлена в SEQ ID NO: 79. С помощью пептидного сканирования связывание 25 Е 3 с областью внешней петли картировано в следующей аминокислотной последовательности: PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76), тогда как связывание 25F7 с областью внешней петли картировано в следующей аминокислотной последовательности: HPAAPSSW (SEQ IDNO: 77), а связывание 8 В 7 с областью внешней петли картировано в следующей аминокислотной последовательности: PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78). Соответственно, в предпочтительном варианте изобретение включает антитело против LAG-3, которое связывает эпитоп человеческого LAG-3, содержащий аминокислотную последовательность PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76). В другом предпочтительном варианте изобретение включает антитело против LAG-3, которое связывает эпитоп человеческого LAG-3, содержащий аминокислотную последовательность HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77) или PAAPSSWG (SEQ IDNO: 78). Генно-инженерные и модифицированные антитела. Помимо этого, можно получать антитело по изобретению, используя антитело, имеющее одну или более последовательностей VH и/или VL по данному описанию в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, причм это модифицированное антитело может иметь изменнные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно конструировать (создавать, получать),модифицируя один или более остатков в одной или в обеих вариабельных областях (т.е. VH и/или VL),например в одном или более CDR доменов и/или в одной или более каркасных областей. Помимо этого или в качестве альтернативы, антитело можно создавать (конструировать), модифицируя остатки в константной(ых) области(ях), например, с целью изменения эффекторной(ых) функции(й) антитела. В некоторых вариантах изобретения для создания вариабельных областей антител можно использовать "CDR-прививку". Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно за счт аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных доменах (CDR) тяжлой и лгкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR индивидуальных антител более различны между собой, нежели последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, то можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, конструируя экспрессирующие векторы, которые включают CDR последовательности из специфического природного антитела, привитые к каркасным последовательностям из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033; патенты США 5225539; 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370). Соответственно, другой вариант изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжлой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, SEQ ID NO: 7-12 и SEQ ID NO: 13-14, GGY и 16-18 соответственно, и вариабельную область лгкой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 иVH VL CDR последовательности моноклональных антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 или 17 Е 5, могут содержать каркасные последовательности, отличные от этих антител. Такие каркасные последовательности можно получать из общедоступной базы данных ДНК или из опубликованных ссылочных материалов, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии для генов вариабельных областей тяжлой и лгкой цепи можно найти в базе данных последовательности зародышевой линии человека"VBase" (находящейся в Интернете на сайте www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat et al. (1991),см. выше; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about FiftyDirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827836; содержание каждого из этих материалов однозначно вводится в данное описание в качестве ссылки. В качестве другого примера ДНК-последовательности зародышевой линии для человеческих генов вариабельных областей тяжлой и лгкой цепи можно найти в базе данных Genbank. Например, следующие последовательности зародышевой линии для тяжлой цепи, найденные в НСо 7 HuMAb мыши, имеются вGenbank под прилагаемыми регистрационными 1-69 (NG0010109, NT024637 ВС 070333), 3-33(NG0010109NT024637) и 3-7 (NG0010109NT024637). В качестве другого примера следующие последовательности зародышевой линии для тяжлой цепи, найденные в НСо 7 HuMAb мыши, имеются вGenbank под прилагаемыми регистрационными 1-69 (NG0010109, NT024637 ВС 070333), 5-51(NG0010109NT024637), 4-34 (NG0010109NT024637), 3-30.3 (CAJ556644)3-23 (AJ406678). Белковые последовательности антитела сравнивают с собранной базой данных белковых последовательностей, используя один из методов поиска сходства последовательностей, называемый GappedBLAST (Altschul et al. (1997), supra), общеизвестный в уровне техники. Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах по изобретению являются последовательности, аналогичные по структуре с каркасными последовательностями, используемыми в выбранных антителах по изобретению, например аналогичные каркасным последовательностям VH 3-20 (SEQ ID NO: 69), VH 4-34 (SEQ ID NO: 61), VH 3-33 (SEQ ID NO: 65) или каркасным последовательностям VH 1-24 (SEQ ID NO: 73) и/или каркасным последовательностям VK L18 (SEQ IDNO: 71), VK L6 (SEQ ID NO: 63) или VK A27 (SEQ ID NO: 67), используемым в предпочтительных моноклональных антителах по изобретению. Последовательности VH CDR1, CDR2 и CDR3 и последовательности VK CDR1, CDR2 и CDR3 можно "привить" к каркасным областям, имеющим последовательность,идентичную последовательности, имеющейся в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого происходит эта каркасная последовательность, или CDR последовательности можно "привить" к каркасным областям, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, найдено, что в некоторых случаях целесообразно осуществлять мутацию остатков в каркасных областях, чтобы сохранить или повысить антигенсвязывающую способность антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370). Другой тип модификации вариабельной области представляет собой мутацию аминокислотных остатков в VH и/или VL CDR1, CDR2 и/или CDR3 областях с целью повысить одно или более связывающих свойств (например, аффинность целевого антитела). Можно осуществлять сайт-направленный или ПЦРопосредованный мутагенез для введения мутации(ий), а влияние на связывание или другое целевое функциональное свойство антитела можно определять с помощью анализов in vitro или in vivo, представленных в данном описании и включнных в примеры. Предпочтительно вводят консервативные мутации (обсуждавшиеся выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции, но предпочтительно они являются заменами. Помимо этого, как правило в CDR области изменяют не более одного, двух, трх, четырх или пяти остатков. Соответственно, другой вариант изобретения включает выделенные моноклональные антитела против LAG-3 или их антигенсвязывающие участки, содержащие вариабельную область тяжлой цепи,имеющую: (a) VH CDR1 домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три,четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 1-6; (б) VHSEQ ID NO: 7-12, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 7-12; (в) VH CDR3 домен,содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1314, GGY и 16-18, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 13-14, GGY и 16-18; (г) VLSEQ ID NO: 19-24, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 19-24; (д) VL CDR2 домен,- 17023032 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2530, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 25-30; и (е) VL CDR3 домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-36, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен,делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 31-36. Генно-инженерные (созданные) антитела по изобретению включают такие антитела, в которых сделаны модификации в каркасных остатках в VH и/или VL, например, с целью улучшить свойства антитела. Как правило, такие модификации каркасной последовательности делают, чтобы понизить иммуногенность антитела. Например, один метод представляет собой "обратную мутацию" одного или более каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подвергается соматической мутации, может содержать каркасные остатки, отличающиеся от последовательности зародышевой линии, из которой образовано антитело. Такие остатки можно идентифицировать, сравнивая каркасные последовательности антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых образовано антитело. Например, в табл. А показаны области, в которых аминокислотное положение в каркасной области(используется система нумерации Kabat) отличается от зародышевой линии, и какую обратную мутацию в зародышевую линию можно осуществить в этом положении с помощью указанных замен Другой тип каркасной модификации включает мутацию одного или более остатков в каркасной области или даже в одной или более CDR областей для удаления Т-клеточных эпитопов с целью понизить потенциальную иммуногенность антитела. Этот метод также называется "деиммунизацией", он более подробно описан в опубликованной патентной заявке США 20030153043. Помимо этого или в качестве альтернативы, модификациям в каркасной или CDR областях можно создавать (конструировать) антитела по изобретению, которые включают модификации в Fc области, как правило, с целью изменить одно или более функциональных свойств антитела, таких как сывороточный период полужизни, фиксацию комплемента, Fc-рецепторное связывание и/или антигензависимую клеточную цитотоксичность. Помимо этого, антитело по изобретению можно модифицировать химическими методами (например, одну или более химических групп можно связать с антителом), или его можно модифицировать, изменяя его гликозилирование, чтобы изменить одно или более функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов изобретения более подробно описан ниже. Нумерация остатков в Fc области соответствует EU указателю Kabat. В предпочтительном варианте изобретения антитело представляет собой антитело IgG4 изотипа,содержащее мутацию серина в пролин в положении, соответствующем положению 228 (S228P; EU указатель) на шарнирном участке константной области тяжлой цепи. Сообщалось, что эта мутация вызывает отмену гетерогенности межцепных дисульфидных мостиков в шарнирной области (Angal et al., см. выше; положение 241 соответствует системе нумерации Kabat). Например, в различных вариантах изобретения антитело против LAG-3 по изобретению может содержать вариабельную область тяжлой цепи антитела 25F7 (SEQ ID NO: 37) или 26 Н 10 (SEQ ID NO: 38), связанную с константным доменом человеческого IgG4, в котором серин в положении, соответствующем положению 241, описанному Angal et al., см. выше, мутировал в пролин. Так, в вариабельных областях тяжлой цепи антител 25F7 и 26 Н 10, связанных с константной областью IgG4, эта мутация соответствует мутации S228P по EU index (указателю). В одном варианте изобретения шарнирную область домена СН 1 модифицируют таким образом,чтобы число цистеиновых остатков в шарнирной области менялось, например увеличивалось или уменьшалось. Данный метод подробнее описан в патенте США 5677425. Число цистеиновых остатков в шарнирной области домена СН 1 изменяют, например, с целью способствовать сборке лгкой и тяжлой цепей или повысить или понизить устойчивость антитела. В другом варианте изобретения осуществляют мутации в Fc-шарнирной области антитела, чтобы повысить или понизить биологический период полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в область границы раздела СН 2-CH3 доменов Fc-шарнирного фрагмента таким образом, чтобы связывание антитела со стафилококковым белком A (SpA) ослаблялось по сравнению со связыванием нативного Fc-шарнирного домена с SpA. Этот метод описан более подробно в патенте США 6165745. В другом варианте изобретения антитело модифицируют для повышения его биологического периода полужизни. Возможны различные подходы. Например, можно ввести одну или более нижеприведнных мутаций T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375. Или же для повышения биологического периода полужизни антитело можно изменять в СН 1 или CL области таким образом,чтобы оно содержало эпитоп связывания с рецептором-"мусорщиком", образованный с помощью двух петель СН 2 домена Fc области IgG, как описано в патентах США 5869046 и 6121022. В других вариантах изобретения Fc область меняют, заменяя по меньшей мере один аминокислотный остаток на другой аминокислотный остаток, чтобы изменить эффекторную(ые) функцию(и). Например, одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318,320 и 322, можно заменить другим аминокислотным остатком таким образом, чтобы антитело изменяло аффинность к эффекторной молекуле-лиганду, но сохраняло антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Fc рецептор или С 1 компонент комплемента. Этот подход описан более подробно в патентах США 5624821 и 5648260. В другом примере одну или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменить на другой аминокислотный остаток таким образом, чтобы антитело изменяло C1q связывание и/или снижало или отменяло комплементзависимую цитотоксичность (КЗС, CDC). Подробнее такой подход описан в патенте США 6194551. В другом примере изменяют один или более аминокислотных остатков в аминокислотных положениях 231 и 239, при этом меняется способность антитела фиксировать комплемент. Этот метод более подробно описан в опубликованной международной заявке РСТ WO 94/29351. Ещ в одном примере Fc область модифицируют для повышения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ, ADCC) и/или для повышения аффинности антитела к Fc-рецептору за счт модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289,290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331,333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Более подробно этот метод изложен в опубликованной международной заявке РСТ WO 00/42072. Помимо этого, на человеческом IgG1 были картированы сайты связывания с FcR1, FcRII, FcRIII иFcRn и описаны варианты с повышенным связыванием (см. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 65916604). Показано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 повышают связывание с FcRIII. Помимо этого, показано, что следующие комбинированные мутанты повышают связывание FcRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. Ещ в одном варианте изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, можно получать "негликозилированное (агликозилированное)" антитело (т.е. гликозилирование антитела отсутствует). Гликозилирование можно изменять, например, чтобы повысить аффинность антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, изменяя один или более сайтов гликозилирования в аминокислотной последовательности. Например, можно провести одну или более аминокислотных замен, в результате чего элиминируется один или более сайтов гликозилирования в каркасном участке вариабельной области, тем самым исключается гликозилирование по этому сайту. Такое"агликозилирование" (отсутствие гликозилирования) может повысить аффинность антитела к антигену. См., например, патенты США 5714350 и 6350861. Помимо этого или в качестве альтернативы, можно получать антитело с изменнным типом гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее пониженное число фукозильных остатков, или антитело, имеющее улучшенные структуры GlcNac с биссекторной плоскостью. Показано,что такие изменнные паттерны гликозилирования повышают ADCC способность антител. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, экспрессируя антитело в клетке-хозяине с изменнным механизм гликозилирования. Клетки с изменнным механизмом гликозилирования описаны в уровне техники и могут использоваться в качестве клеток-хозяев для экспрессии в них рекомбинантных антител по изобретению с целью продуцировать таким образом антитело с изменнным паттерном гликозилирования. Например, в линиях клеток Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы,FUT8 1,6)-фукозилтрансферазы), так среди углеводов антител, экспрессированных в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, отсутствует фукоза. Клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/- получают нацеленным распадом (разрушением) гена FUT8 в клетках CHO/DG44, используя два замещающих вектора (опубликованная патентная заявка США 20040110704 и Yamane-Ohnuki et al. (2004) BiotechnolBioeng 87: 614-22). Другой пример, в европейском патенте ЕР 1176195 описывается линия клеток с нарушенной функцией гена FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, поэтому наблюдается гипофукозилирование антител, экспрессированных в такой линии клеток за счт уменьшения или исключения фермента с -1,6 связью. В европейском патенте ЕР 1176195 также описываются линии клеток, обладающих пониженной ферментной активностью в реакции присоединения фукозы к N-глюкозамину, который связывается с Fc областью антитела, или не обладающих активностью, например линия клеток миеломы YB2/0 (АТСС CRL 1662). В опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 03/035835 описывается вариант СНО клеточной линии, клетки Lec 13 с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессированных в этой клетке-хозяине (см. также Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. TIT. 2673326740). Антитела с модифицированным профилем гликозилирования также можно получать в куриных яйцах, как описано в опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 06/089231. Или же антитела с модифицированным профилем гликозилирования можно получать в растительных клетках, таких как Lemna. Методы получения антител в растительной системе раскрываются в патентной заявке США, соответствующей заявке с регистрационным номером в патентном реестре AlstonBird LLP No. 040989/314911, поданной 11 августа 2006 г. В опубликованной международной патентной заявке РСТ(GnTIII, так что у этих антител, экспрессированных в генно-инженерных линиях клеток, наблюдаются усовершенствованные GlcNac структуры с биссекторной плоскостью, что вызывает повышенную ADCC активность антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17. 176- 180). Или же, фукозные остатки антитела можно отщеплять, используя фермент глюкозидазу; например фукозидаза -L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23). Другой модификацией антител по данному описанию, рассматриваемой в данном раскрытии, является пегилирование. Антитело можно пегилировать, например, для повышения биологического (например, сывороточного) периода полужизни. Для пегилирования антитело или его фрагмент, как правило,реагирует с полиэтиленгликолем (ПЭГ, PEG), таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или более групп ПЭГ присоединяется к антителу или к фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование осуществляют реакцией ацилирования или алкилирования реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Предполагается, что термин "полиэтиленгликоль" по данному описанию охватывает любую из форм ПЭГ, которую используют для дериватизации других белков, такую как моно(С 1-С 10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В некоторых вариантах изобретения пегилируемое представляет собой негликозилированное (агликозилированное) антитело. Методы пегилирования белков известны в уровне техники и могут применяться для пегилирования антител по изобретению См., например, европейские патенты ЕР 0154316 и ЕР 0401384. Физические свойства антител. Антитела по данному изобретению можно характеризовать различными физическими свойствами,чтобы их детектировать и/или дифференцировать различными классами антител. Антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в каждой вариабельной области лгкой или тяжлой цепи. Такие сайты гликозилирования могут вызывать повышенную иммуногенность антитела или изменение pK антитела вследствие изменения связывания с антигеном (Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41: 673- 02; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172: 5489-94; Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh etal. (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al. (2000) Mol. Immunol. 37. 697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело против LAG-3, которое не является гликозилированным в вариабельной области. Этого можно достичь отбором антител, которые не содержат мотива гликозилирования в вариабельной области, или мутацией остатков в области гликозилирования. В предпочтительном варианте изобретения антитела по настоящему раскрытию не содержат сайтов изомерии аспарагина. Деамидирование аспарагина может происходить по последовательностям N-G илиD-G, приводя к образованию остатка изоаспарагиновой кислоты, которая вызывает изгиб (петлю) полипептидной цепи и снижает е устойчивость (эффект изоаспарагиновой кислоты). Каждое антитело имеет уникальную изоэлектрическую точку (pI), которая обычно находится в интервале рН между 6 и 9,5. pI для антитела IgG1, как правило, попадает в интервал рН 7-9,5, a pI для антитела IgG4, как правило, попадает в интервал рН 6-8. Существует гипотеза, что антитела с pI вне интервала нормальных значений рН могут до некоторой степени претерпевать раскручивание и неустойчивость в условиях in vivo. Таким образом, предпочтительно иметь антитело против LAG-3, значение pI которого попадает в интервал нормальных значений рН. Этого можно достичь либо отбором антител со значениемpI в интервале нормальных значений рН, либо мутацией заряжнных поверхностных остатков. Каждое антитело имеет характеристическую температуру плавления, причм более высокая темпе- 20023032 ратура плавления указывает на повышенную общую стабильность (устойчивость) in vivo (Krishnamurthy(температура начального раскручивания) была выше 60C, предпочтительно выше 65C, ещ более предпочтительно выше 70C. Точку плавления антитела можно определять методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Chen et al. (2003) Pharm. Res. 20: 1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol. Lett. 68: 47-52) или методом кругового дихроизма (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9). В предпочтительном варианте изобретения выбирают антитела, которые не распадаются быстро. Распад антитела можно количественно определять методами капиллярного электрофореза (СЕ) иMALDI-MS (Alexander A.J. and Hughes D.E. (1995) Anal Chem 67: 3626-32). В другом предпочтительном варианте изобретения выбирают антитела с минимальным агрегационным эффектом, который может привести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или изменнным или нежелательным фармакокинетическим свойствам. Как правило, приемлемыми являются антитела с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, ещ более предпочтительно 15% или менее,ещ более предпочтительно 10% или менее и ещ более предпочтительно 5% или менее. Агрегацию количественно определяют несколькими методами, включая колоночную высокоэффективную гельхроматографию (SEC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ, HPLC) и рассеяние света. Методы инжиниринга антител. Как обсуждается выше, антитела против LAG-3, имеющие VH и VL последовательности по данному описанию, можно использовать для создания новых антител против LAG-3 модификацией последовательностей VH и/или VL или связанных с ними константных областей. Так, в другом аспекте изобретения структурные признаки антитела против LAG-3 по изобретению, например 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 или 17 Е 5, используют для создания родственных по структуре антител против LAG-3, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с человеческим LAG-3. Например, одну или более областей CDR антител 25F7, 26 Н 10, 25 Е 3, 8 В 7, 11F2 или 17 Е 5 или их мутанты можно объединять методами рекомбинантной ДНК с известными каркасными областями и/или другими CDR с целью создания дополнительных полученных методами рекомбинантной ДНК антител против LAG-3 по изобретению, обсуждавшихся выше. Другие типы модификации включают типы модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для метода инжиниринга является одна или более последовательностей VH и/или VL по данному описанию или их один или более CDR доменов. Для создания генно-инженерного антитела нет необходимости действительно получать (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или более последовательностей VH и/или VL по данному описанию или е один или более CDR доменов. Скорее информация, содержащаяся в последовательности(ях), используется как исходный материал для создания последовательности(ей)"второго поколения", образованной(ых) из оригинальной(ых) последовательности(ей), а затем последовательность(и) "второго поколения" получают и экспрессируют в виде белка. Соответственно, другой вариант изобретения включает способ получения антитела против LAG-3,содержащий:(а) предоставление (i) последовательности вариабельной области тяжлой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6, последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-12, и/или последовательность CDR3,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-14, GGY и 16-18; и/или (ii) последовательности вариабельной области лгкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-24, последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из(б) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в последовательности вариабельной области тяжлой цепи антитела и/или последовательности вариабельной области лгкой цепи для создания по меньшей мере одной изменнной последовательности антитела; и(в) экспрессирование изменнной последовательности антитела в виде белка. Для получения и экспрессии антитела с изменнной последовательностью можно применять стандартные методы молекулярной биологии. Предпочтительно антитело, кодированное изменнной(ыми) последовательностью(ями) гена антитела, представляет собой антитело, которое сохраняет одно, некоторые или все функциональные свойства антител против LAG-3 по данному описанию, причм эти функциональные свойства включают, но без ограничения:(iv) способность ингибировать связывание LAG-3 с молекулами МНС класса II и(v) способность стимулировать иммунный ответ (например, антиген-специфический Т-клеточный ответ). Функциональные свойства изменнных антител можно оценивать стандартными методами анализа,известными в уровне техники и/или представленными в данном описании, такими как методы, приведнные в примерах. В некоторых вариантах методов инжиниринга антител по изобретению можно вводить мутации,случайно или селективно, в последовательность, кодирующую целое антитело или участок антитела, а полученные модифицированные антитела против LAG-3 можно подвергнуть скринингу на связывающую активность и/или другие функциональные свойства по данному описанию. Мутационные методы описаны в уровне техники (см., например, опубликованные международные заявки РСТ WO 02/092780 и WO 03/074679). Нуклеотидные молекулы, кодирующие антитела по изобретению. Другой аспект изобретения относится к нуклеотидным молекулам, которые кодируют антитела по изобретению. Нуклеиновые кислоты могут находиться в целых клетках, клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "приведнной в практически чистое состояние", если она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами,включая обработку в щелочной электрофоретической системе с SDS, центрифугирование в растворахWiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой ДНК,РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности или не содержать их. В предпочтительном варианте изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получать обычными методами молекулярной биологии. В случае антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными от трансгенных мышей, несущих гены человеческих иммуноглобулинов, подробнее описанные ниже), к ДНК кодирующие лгкую и тяжлую цепи антитела, продуцируемого гибридомой, можно получать стандартной ПНР-амплификацией или клонированием кДНК. В случае антител, получаемых из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с применением методов фагового дисплея), нуклеиновую кислоту, кодирующую такие антитела, можно выделять из библиотеки генов. Предпочтительные нуклеотидные молекулы по изобретению представляют собой такие нуклеотидные молекулы, которые кодируют VH и VL последовательности моноклональных антител 25 Е 3, 25F7,8 В 7, 26 Н 10, 11F2 и 17 Е 5. Последовательности ДНК, кодирующие VH последовательности 25 Е 3, 25F7,8 В 7, 26 Н 10, 11F2 и 17 Е 5, показаны в SEQ ID NO: 49-54 соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие VL последовательности антител 25 Е 3, 25F7, 8 В 7, 26 Н 10, 11F2 и 17 Е 5, показаны в SEQ ID NO: 55-60 соответственно. Когда получены ДНК-фрагменты, кодирующие сегменты VH и VL, эти ДНК фрагменты можно далее обрабатывать обычными методами ркомбинантной ДНК, например, чтобы превратить гены вариабельной области в гены полноразмерного антитела, в гены фрагмента Fab или в ген scFv. При этом ДНКфрагмент, кодирующий VL- или VH-, функционально связывают с другим ДНК-фрагментом, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Предполагается, что выражение "функционально связанный" в данном контексте означает, что два фрагмента ДНК связываются таким образом, чтобы аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, оставались в рамке считывания. Выделенную ДНК, кодирующую область VH, можно превратить в ген полноразмерной тяжлой цепи, функционально связывая ДНК, кодирующую VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжлой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности генов константных областей тяжлой цепи известны в уровне техники (например, см. выше, Kabat et al. (1991, а фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получать обычной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжлой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно является константной областью IgG1 или IgG4. Для гена тяжлой цепи фрагментаFab ДНК, кодирующая VH, может функционально связываться с молекулой другой ДНК, кодирующей только константную область СН 1 тяжлой цепи. Выделенную ДНК, кодирующую область VL, можно превратить в ген полноразмерной лгкой цепи(а также ген лгкой цепи Fab) за счт функционального связывания ДНК, кодирующей VL, с молекулой другой ДНК, кодирующей константную область лгкой цепи, CL. Последовательности человеческих генов константной области лгкой цепи известны в уровне техники (например, Kabat et al., см. выше), а ДНК-фрагменты, охватывающие эти области, можно получать обычной ПЦР-амплификацией. В предпочтительных вариантах изобретения константная область лгкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. Для создания scFv гена ДНК-фрагменты, кодирующие VH- и VL-области, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующий аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так что последовательности VH и VL могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, в котором области VL и VH связаны гибким линкером (см., например, Bird et al.(1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348: 552-554). Получение моноклональных антител по изобретению. Моноклональные антитела (mAbs) по настоящему раскрытию можно получать хорошо известным методом гибридизации соматических клеток (методом гибридом) Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Другие варианты получения моноклональных антител включают трансформацию В лимфоцитов с помощью вирусов или онкогенов и методы фагового дисплея. Химерные или гуманизированные антитела также общеизвестны в уровне техники. См., например, патенты США 4816567; 5225539; 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, содержание которых специально вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. В предпочтительном варианте изобретения антитела по изобретению представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, специфические к человеческому LAG-3, можно получать, используя трансгенных или "транс-хромосомных" мышей, несущих скорее компоненты иммунной системы человека, нежели компоненты мышиной системы. Эти трансгенные и "транс-хромосомные" мыши включают мышей, называемых в данном описании "мышь HuMAb""мыши с (несущие) Ig человека". Мыши HuMAb (Medarex, Inc.) содержат минилокусы неаранжированных генов человеческого иммуноглобулина, которые кодируют человеческие последовательности тяжлой ( и ) и лгкой цепииммуноглобулина, совместно с нацеленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусыицепей (см., например, Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Соответственно, у этих мышей наблюдается пониженная экспрессия мышиного IgM илицепи, и в ответ на иммунизацию введнные человеческие трансгены тяжлой и лгкой цепи вызывают переключение класса антител и соматическую мутацию, генерируя высокоаффинные человеческие моноклональные антитела IgG (Lonberg et al.and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, и Harding and Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). Получение и использование мышей HuMAb Mouse и геномные модификации, которые несут эти мыши, подробнее описаны в Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen et al.Nature Biotechnology 14: 845-851, содержание всех этих материалов вводится специально в данное описание ссылкой во всей полноте. Помимо этого, см. патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; 5770429 и 5545807; опубликованные международные патентные заявки РСТWO 92/03918; WO 93/12227; WO 94/25585; WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 и WO 01/14424, содержание которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. В другом варианте изобретения можно вызвать образование человеческих антител по изобретению,используя мышь, которая нест последовательности генов человеческого иммуноглобулина на трансгенах и "транс-хромосомах", такую как мышь, которая нест трансген человеческой тяжлой цепи и"транс-хромосому" человеческой лгкой цепи. Такую мышь в данном описании называют "KM mouse",она подробно описана в опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 02/43478. Модифицированная форма этой мыши, которая дополнительно включает дизрупцию гена эндогенного FcRIIB рецептора в гомозиготном состоянии, также описана в опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 02/43478 и называется в данном описании мышью "KM/FCGR2D mouse". Помимо этого,можно использовать мышей с трансгенами тяжлой цепи либо НСо 7, либо НСо 12. Другие варианты трансгенных животных включают XenoMouse (Abgenix, Inc., патенты США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963). Другие варианты изобретения включают "ТС мышей""транс-хромосомы" человеческой тяжлой и лгкой цепи (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894; опубликованная международная заявка РСТ WO 02/092812). Содержание этих патентов и опубликованной патентной заявки вводится специально в данное описание ссылкой во всей полноте. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела по изобретению получают методами фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческого иммуноглобулина. См., например, патенты США 5223409; 5403484; 5571698; 5427908; 5580717; 5969108; 6172197; 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, содержание которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно получать, используя мышей SCID,в которых проведена такая реконституция человеческих иммунных клеток, что при иммунизации вырабатываются человеческие антитела (антительный ответ). См., например, патенты США 5476996 и 5698767, содержание которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. В другом варианте изобретения человеческие антитела против LAG-3 получают методом фагового дисплея, в котором фаги содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, вырабатывающиеся в организме трансгенных животных, заранее иммунизированных белком LAG-3. В предпочтительном варианте изобретения трансгенное животное представляет собой мышь HuMab, KM или Kirin. См., например,патент США 6794132, содержание которого вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Иммунизация мышей, несущих человеческий Ig (Human Ig). В одном варианте изобретения мышей с человеческим Ig иммунизируют очищенным или обогащенным препаратом LAG-3 антигена, рекомбинантного белка LAG-3 или клетками, экспрессирующими белок LAG-3. Например, Lonberg et al. (1994), см. выше; Fishwild et al. (1996), см. выше; опубликованные международные заявки РСТ WO 98/24884 или WO 01/14424, содержание которых вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. В предпочтительном варианте изобретения мышей в возрасте 6-16 недель иммунизируют, вводя 5-50 мкг белка LAG-3. Или же используют участок LAG-3, слитый с отличным от LAG-3 полипептидом. В одном варианте изобретения трансгенных мышей иммунизируют интраперитонеально (IP) или внутривенно (IV, в.в.) LAG-3 антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующей IP или IV иммунизацией в неполном адъюванте Фрейнда. В других вариантах изобретения используют адъюванты, отличные от адъюванта Фрейнда, или целые клетки в отсутствие адъюванта. Плазму можно подвергнуть скринингу методом ELISA, а клетки мышей с удовлетворительными титрами человеческого иммуноглобулина против LAG-3 можно использовать для слияния. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению. Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей можно выделять и сливать с соответствующей линией иммортализованных клеток, такой как линия клеток мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно подвергнуть скринингу на продукцию антиген-специфических антител. Получение гибридом хорошо известно в уровне техники. См., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York. Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению. Антитела по изобретению можно также продуцировать в клетках-хозяевах-трансфектомах, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и трансфекции генов, хорошо известных в уровне техники (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). В одном варианте изобретения ДНК, кодирующую частичную или полноразмерную лгкую и тяжлую цепь, полученную обычными методами молекулярной биологии, встраивают в один или более экспрессирующих векторов таким образом, чтобы гены функционально связывались с последовательностями, регулирующими (регуляторными) транскрипцию и трансляцию. Предполагается, что в этом контексте выражение "функционально связанный" означает, что ген антитела сшивают с вектором таким образом, чтобы последовательности контроля транскрипции и трансляции в векторе служили их заданной функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны,например, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые контролируют высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры из цитомегаловируса (CMV),вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP) и вируса полиомы. Или же можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор -глобина. Помимо этого, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из разных источников, такие как промоторная система промотора SR, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор вируса Тклеточного лейкоза типа 1 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-72). Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессией клеткой-хозяином. Ген лгкой цепи антитела и ген тяжлой цепи антитела можно встроить в один и тот же экспрессирующий вектор или в разные экспрессирующие векторы. В предпочтительных вариантах изобретения вариабельные области используют для создания генов полноразмерных антител любого изотипа путм встраивания их в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константные области тяжлой и лгкой цепи заданного изотипа, так чтобы VH сегмент функционально связывался с CH сегментом (сегментами) в векторе, а VL сегмент функционально связывался с CL сегментом в векторе. Помимо этого или в качестве альтернативы, вектор для экспрессии рекомбинантных генов может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела клеткой- хозяином. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, чтобы сигнальный пептид связывался в рамке считывания с аминоконцом цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (например, сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка). Помимо генов цепи антитела и регуляторных последовательностей, вектор для экспрессии рекомбинантных генов по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген способствует селекции клетокхозяев, в которые вводят вектор (см., например, патенты США 4399216; 4634665 и 5179017). Например, как правило, селективный маркерный ген придат устойчивость к лекарствам, таким как G418,гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую водится вектор. Предпочтительные селективные маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в селекции/амплификации в dhfr-клетках-хозяевах в присутствии метотрексата) и ген пео (для G418 селекции). Для экспрессии лгкой и тяжлой цепей экспрессирующий(е) вектор(ы), кодирующий(е) тяжлую и лгкую цепи, транфецируют в клетку-хозяина стандартными методами. Предполагается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают широкий ряд методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию,осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с использованием полимера ДЭАЭ (DEAE)-декстрана и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих, является наиболее предпочтительной, потому что такие эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих, скорее чем прокариотические клетки,собирают и секретируют соответствующим образом сложенное (имеющее подходящую пространственную структуру) и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячкаand P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621), NSO миеломные клетки, клетки COS и клетки SP2. В частности, другая предпочтительная система экспрессии для применения с NSO миеломными клетками представляет собой GS систему экспрессии генов, раскрываемую в международных патентных заявкахWO 87/04462, WO 89/01036 и в европейском патенте ЕР 338841. Если векторы для рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительн, для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела можно выделять из культуральной среды обычными методами очистки белков. Характеристика связывания антитела с антигеном. Антитела по изобретению можно тестировать на связывание с человеческим LAG-3, например,стандартными методами ELISA. Человеческие IgG против LAG-3 можно дополнительно проверять на реактивность в отношении LAG-3 антигена Вестерн-Блоттингом. Специфичность связывания антитела по изобретению можно также определять, проводя мониторинг связывания антитела с клетками, экспрессирующими белок LAG-3, например, методами проточной цитометрии. Эти методы известны в уровне техники. См., например, Harlow and Lane (1988), supra. Иммуноконъюгаты. Антитела по данному изобретению могут конъюгироваться с терапевтическим агентом с образованием иммуноконъюгата, такого как конъюгат антитело-лекарство (ADC). Подходящие терапевтические агенты включают антиметаболиты, алкилирующие агенты, связующие малых бороздок ДНК, ДНК интеркаляторы, ДНК кросс-линкеры, ингибиторы деацетилазы гистонов, ингибиторы экспорта из ядра, ингибиторы протеасом, ингибиторы топоизомеразы I или II, ингибиторы белков теплового шока, ингибиторы тирозинкиназ, антибиотики и антимитотические агенты. В ADC антитело и терапевтический агент предпочтительно конъюгируются с помощью отщепляемого линкера, такого как пептидильный, дисульфидный или гидразоновый линкер. Более предпочтительно линкер представляет собой пептидильный линкер, такой как Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 15), Ala-AsnVal, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser или Glu. Конъюгаты ADC можно получать,как описано в патентах США 7087600; 6989452 и 7129261; опубликованных международных заявках РСТ WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312 и WO 08/103693; опубликованных патентных заявках США 20060024317; 20060004081 и 20060247295; раскрытие которых вводится в данное описание в качестве ссылки. Биспецифические молекулы. В другом аспекте настоящее раскрытие включает биспецифические молекулы, содержащие антитело против LAG-3, связанное по меньшей мере с одной отличной функциональной молекулой, например с другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора), образуя биспецифическую молекулу, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Таким образом, "биспецифическая молекула" по данному описанию включает молекулы, которые имеют три или более специфичностей. В предпочтительном варианте изобретения биспецифическая молекула содержит первую специфичность связывания с LAG-3 и вторую специфичность связывания с молекулой, обладающей триггерными свойствами, которая рекрутирует цитотоксические эффекторные клетки, способные убивать экспрессирующую LAG-3 клетку-мишень. Примерами подходящих триггерных (запускающих, инициирующих) молекул являются CD64, CD89,CD16 и CD3. См., например, Kufer et al, TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004). В одном варианте изобретения биспецифическая молекула содержит третью специфичность, помимо специфичности связывания против Fc и специфичности связывания против LAG-3. Третья специфичность может представлять собой специфичность к антифактору усиления (EF), например к молекуле,связывающейся с поверхностным белком, который задействован в цитотоксической активности и тем самым усиливает иммунный ответ против клетки-мишени. Например, антифактор усиления может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, с помощью CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 или ICAM1) или другую иммунную клетку, вызывая в результате усиленный иммунный ответ против клеткимишени. Биспецифические молекулы могут быть различных форматов и размеров. Одну крайность представляют собой биспецифические молекулы, сохраняющие обычный формат антитела за исключением того, что вместо двух связывающих плеч с идентичной специфичностью они имеют два связывающих плеча с различной специфичностью. Другую крайность представляют собой биспецифические молекулы,состоящие из двух фрагментов одноцепочечного антитела (scFv), связанных пептидной цепью, так называемая конструкция Bs(scFv)2. Биспецифические молекулы промежуточного размера включают два различных фрагмента F(ab), связанных пептидильным линкером. Биспецифические молекулы этих и других форматов можно получать генной инженерией (методами рекомбинантной ДНК), соматической гибридизацией или химическими методами. См., например, Kufer et al., supra; Cao and Suresh, BioconjugateChemistry, 9 (6), 635-644 (1998); van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000) и приведнные в этих материалах ссылки. Фармацевтические композиции. В другом аспекте настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело по настоящему раскрытию, приготовленное совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Она (композиция) может содержать один или более фармацевтически активных ингредиентов,таких как другое антитело или лекарство. Фармацевтические композиции по изобретению можно также применять в комбинированной терапии, например, с другим иммуностимулирующим агентом, противораковым агентом и антивирусным агентом или вакциной с тем, чтобы антитело против LAG-3 усиливало иммунный ответ против вакцины. Фармацевтическая композиция может содержать некоторое число эксципиентов. Эксципиенты, которые можно использовать, включают носители, поверхностно-активные агенты, загустители или эмульгаторы, тврдые связующие, диспергирующие или суспендирующие агенты, солюбилизаторы, красители, корригенты вкуса или запаха, покрытия, разрыхлители, смазки, подсластители, консерванты, изотонические агенты и их комбинации. Отбор и применение подходящих эксципиентов описаны в руководстве-справочнике Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott WilliamsWilkins 2003), раскрытие которого вводится ссылкой в данное описание. Предпочтительно фармацевтическая композиция применима для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, в виде инъекции или инфузии (вливания. В зависимости от способа введения активное соединение можно покрывать материалом для его защиты от действия кислот и других естественных условий, которые могут его инактивировать. Выражение "парентеральное введение" по данному описанию означает способы введения, отличные от энтерального (тонкокишечного) и местного введения, обычно в виде инъекций, и включает, но без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную(подоболочечную), внутрикапсульную, интраорбитальную (внутриглазничную), внутрисердечную, интрадермальную, интраперитонеальную (внутрибрюшинную), транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсульную, субарахноидальную, интраспинальную и подложечную (надчревную) инъекцию и инфузию. Или же антитело по изобретению можно вводить непарентеральным путм, таким как топический (локальный, местный), эпидермальный или чресслизистый (в слизистую оболочку) путь введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально(подъязычно) или местно. Фармацевтические соединения по изобретению могут быть в виде фармацевтически приемлемых солей. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет нужную биологическую активность исходного соединения и не вызывает нежелательных токсикологических эффектов. Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, образованные из нетоксических неорганических кислот,таких как хлористо-водородная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная,фосфористая и т.п., а также из нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещнные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматиче- 26023032 ские кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, образованные из щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксических органических аминов, таких как N,Nдибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. Фармацевтические композиции могут быть в виде стерильных водных растворов или дисперсий. Их можно приготовить также в виде микроэмульсий, липосом или других упорядоченных структур, применимых для высоких концентраций лекарства. Количество активного ингредиента, которое можно смешивать с материалом носителя для получения разовой (стандартной) лекарственной формы, меняется в зависимости от субъекта, проходящего лечение, и конкретного способа введения и обычно представляет собой количество композиции, которое вызывает терапевтический эффект. Как правило, из 100% это количество составляет примерно от 0,01 примерно до 99% активного ингредиента, предпочтительно примерно, 0,1-70%, наиболее предпочтительно примерно 1-30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Схемы прима лекарственного средства корректируют таким образом, чтобы вызвать оптимальный заданный ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить единичный болюс, можно вводить несколько небольших доз через определнные промежутки времени, или дозу можно пропорционально снижать или увеличивать в зависимости от терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно готовить композиции для парентерального введения в виде стандартной (однократной) лекарственной дозы для простоты введения и однородности доз. Выражение "разовая" (однократная) лекарственная доза" по данному описанию относится к физически дискретным единицам, применимым в качестве единичной лекарственной формы для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное на достижение заданного терапевтического эффекта, в сочетании с нужным фармацевтическим носителем. Или же антитело можно вводить в виде препарата с пролонгированным высвобождением, в этом случае требуется не такое частое введение. Вводимые дозы антитела составляют примерно 0,0001-100 мг/кг, чаще 0,0-5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозы могут быть 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг массы тела или составлять интервал 1-10 мг/кг. Типичная схема лечения включает введение один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в 3 месяца или один раз через каждые 3-6 месяцев. Предпочтительные схемы введения антитела против LAG-3 по изобретению включают введение 1 или 3 мг/кг массы тела внутривенно, причм антитело дают, используя одну из нижеприведнных схем введения доз: (i) шесть доз каждые четыре недели, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела однократно, затем 1 мг/кг массы тела каждые три недели. В некоторых методах дозу корректируют таким образом, чтобы достичь концентрации антитела в плазме примерно 11000 мкг/мл, а в некоторых методах около 25-300 мкг/мл."Терапевтически эффективная доза" антитела против LAG-3 по изобретению предпочтительно вызывает снижение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и длительности бессимптомных периодов заболевания или предупреждение ухудшения состояния или нетрудоспособности вследствие болезни. Например, у лечения носителей опухолей "терапевтически эффективная доза" предпочтительно ингибирует рост опухоли по меньшей мере примерно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, ещ более предпочтительно по меньшей мере примерно на 60% и ещ более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% по сравнению с непролеченными субъектами. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом уменьшить интенсивность симптомов у субъекта, которым, как правило, является человек или может быть другое млекопитающее. Фармацевтическая композиция может представлять собой препарат с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пэтчи (пластыри) и системы доставки микроинкапсулированных продуктов. Можно применять биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., MarcelDekker, Inc., New York, 1978. Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, таких как (1) безыгольные гиподермические инъекторы (см., например, патенты США 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 и 4596556); (2) микроинфузионные насосы (патент США 4487603); (3) устройства для трансдермальной доставки (патент США 4486194); (4) инфузионные аппараты (патенты США 4447233 и 4447224) и (5) осмотические устройства (патенты США 4439196 и 4475196); раскрытие этих патентов вводится в данное описание ссылкой. В некоторых вариантах изобретения человеческие моноклональные антитела по изобретению можно приготовить таким образом, чтобы гарантировать необходимое распределение in vivo. Например, чтобы гарантировать, что терапевтическое соединение по изобретению проникает через гематоэнцефалический барьер, их можно приготовить в липосомах, которые, помимо этого, могут содержать нацеливаю- 27023032 щие частицы для активизации селективного переноса к конкретным клеткам или органам. См., например,патенты США 4522811; 5374548; 5416016 и 5399331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685;Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4: 273. Применение и методы по изобретению. Антитела, композиции антител и методы по настоящему изобретению имеют различную in vitro и invivo полезность, включая, например, обнаружение LAG-3 или усиление иммунного ответа с помощью блокады LAG-3. В предпочтительном варианте изобретения антитела по настоящему изобретению представляют собой человеческие антитела. Например, эти молекулы можно вводить в клетки в культуре invitro или ex vivo, или людям, например in vivo, для повышения иммунитета в различных ситуациях. Соответственно, в одном аспекте изобретение включает метод модификации иммунного ответа у субъекта,заключающийся в введении субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению таким образом, чтобы иммунный ответ у субъекта модифицировался. Предпочтительно ответ усиливается, стимулируется или апрегулируется. Предпочтительные субъекты включают больных людей, нуждающихся в усилении иммунного ответа. Методы особенно применимы для лечения больных людей с расстройством, которое можно лечить,усиливая (повышая) иммунный ответ (например, опосредованный Т-клетками иммунный ответ). В конкретном варианте изобретения методы особенно пригодны для лечения рака in vivo. Для достижения антиген-специфического усиления иммунитета антитела против LAG-3 можно вводить вмести с целевым антигеном или антиген может уже присутствовать в организме подлежащего лечению субъекта (например, субъект-носитель опухоли или носитель вируса). Когда антитела к LAG-3 вводят вместе с другим агентом, два агента можно вводить в любом порядке или одновременно. Помимо этого, изобретение включает методы обнаружения (детекции) человеческого LAG-3 антигена в образце или количественное определения человеческого LAG-3 антигена, заключающиеся в контактировании образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом или его антигенсвязывающим участком, которое(ый) специфически связывается с человеческим LAG-3 в условиях,которые способствуют образованию комплекса между антителом или его антигенсвязывающим участком и человеческим LAG-3. Затем детектируют образование комплекса, причм различие в образовании комплекса между образцом по сравнению с контрольным образцом свидетельствует о присутствии человеческого LAG-3 антигена в образце. Более того, антитела против LAG-3 по изобретению можно использовать для очистки человеческого LAG-3 с помощью иммуноаффинной хроматографии. Принимая во внимание способность антител против LAG-3 по изобретению ингибировать связывание LAG-3 с молекулами ГКГ (МНС) класса II и стимулировать антиген-специфический Т-клеточный ответ, изобретение также включает in vitro и in vivo методы применения антител по изобретению для стимуляции, усиления или апрегуляции антиген-специфических Т-клеточных реакций (ответов). Например, изобретение включает метод стимуляции антиген-специфического Т-клеточного ответа, заключающийся в контактировании указанной Т-клетки с антителом по изобретению таким образом, чтобы стимулировался антиген-специфический Т-клеточный ответ. Для количественного определения антигенспецифического Т-клеточного ответа можно использовать любой подходящий индикатор антигенспецифического Т-клеточного ответа. Неограничивающие примеры подходящих индикаторов (указателей) включают повышенную пролиферацию Т-клеток в присутствии антитела и/или повышение продукции цитокинов в присутствии антитела. В предпочтительном варианте изобретения антигенспецифический Т-клеточный ответ стимулирует продукцию интерлейкина-2. Изобретение включает также метод стимуляции иммунного ответа (например, антигенспецифического Т-клеточного ответа) у субъекта, заключающийся во введении антитела по изобретению субъекту таким образом, чтобы у субъекта стимулировался иммунный ответ (например, антигенспецифический Т-клеточный ответ). В предпочтительном варианте изобретения субъектом является носитель опухоли, а стимулируется иммунный ответ против опухоли. В другом предпочтительном варианте изобретения субъектом является носитель вируса, а стимулируется иммунный ответ против вируса. В другом аспекте изобретение включает метод ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта,заключающийся в введении субъекту антитела по изобретению таким образом, чтобы у субъекта ингибировался рост опухоли. Ещ в одном аспекте изобретение включает метод лечения вирусной инфекции у субъекта, заключающийся в введении субъекту антитела по изобретению таким образом, чтобы проводилось лечение инфекции у субъекта. Эти и другие методы по изобретению подробнее обсуждаются ниже. Рак. Блокада LAG-3 антителами может усилить иммунный ответ на раковые клетки у пациента. В одном аспекте настоящее изобретение относится к лечению субъекта in vivo с помощью антитела против LAG-3 таким образом, чтобы ингибировался рост раковых опухолей. Антитело против LAG-3 можно использовать самостоятельно для ингибирования роста раковых опухолей. Или же антитело против LAG-3 можно использовать в сочетании с другими иммуногенными агентами, обычными противораковыми лекарственными средствами или другими антителами, как описывается ниже. Соответственно, в одном варианте изобретение включает метод ингибирования роста раковых клеток у субъекта, заключающийся в введении субъекту терапевтически эффективного количества антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего участка. Предпочтительно антитело представляет собой человеческое антитело против LAG-3 (такое как любое из человеческих антител против человеческогоLAG-3 по данному описанию). Помимо этого или в качестве альтернативы, антитело может являться химерным или гуманизированным антителом против LAG-3. Предпочтительные раковые опухоли, рост которых можно ингибировать, используя антитела по изобретению, включают раковые опухоли, как правило, восприимчивые к иммунотерапии. Неограничивающие примеры предпочтительных для лечения раковых заболеваний включают меланому (например,метастатическую злокачественную меланому), рак почки (например, светло-клеточную карциному), рак предстательной железы (например, гормон-резистентную аденокарциному предстательной железы), рак молочной железы, рак толстой кишки и рак лгкого (например, немелкоклеточный рак лгкого). Помимо этого, изобретение включает стойкие (резистентные или рецидивирующие злокачественные опухоли,рост которых может ингибироваться под действием антител по изобретению. Примеры других раковых заболеваний, которые можно лечить методами по изобретению, включают рак кости, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, тестикулярный рак, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному наружных половых органов, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягкой ткани, рак уретры, рак пениса, хронические или острые лейкозы, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, солидные опухоли у детей, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, опухоль центральной нервной системы (ЦНС, CNS), первичную лимфому ЦНС, ангиогенез опухолей, опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак. Т-клеточную лимфому, раковые заболевания, вызванные экологическими причинами,включая раковые заболевания, вызванные асбестозом, и комбинации указанных раковых заболеваний. Настоящее изобретение применимо также для лечения метастатических форм рака, в частности метастатической раковой опухоли, экспрессирующей PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17: 133-144). Необязательно, антитела к LAG-3 можно объединять с иммуногенным агентом, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая молекулы рекомбинантных белков, пептидов и углеводов), клетки и клетки, трансфецированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины(Не et al. (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). Неограничивающие примеры опухолевых вакцин, которые можно использовать, включают пептиды антигенов меланомы, такие как пептиды gp100, MAGE антигенов, Trp-2, MART1 и/или тирозиназы, или опухолевые клетки, трансфецированные для экспрессии цитокина GM-CSF (подробно обсуждается ниже). Показано, что у людей некоторые опухоли являются иммуногенным, такие как меланомы. Повышая порог активации Т-клеток с помощью блокады LAG-3, можно активировать ответ (реакцию) хозяина на опухоль. По-видимому, блокада LAG-3 является более эффективной в сочетании с протоколом вакцинации. Разработано множество экспериментальных методик (стратегий) вакцинации против опухолей (см. Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C,2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428;Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; см. также Restifo, N. и Sznol, M., Cancer Vaccines,Ch. 61, pp. 3023-3043 в DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). По одной из этих методик вакцину готовят, используя аутологичные или аллогенные опухолевые клетки. Показано, что эти клеточные вакцины наиболее эффективны, если опухолевые клетки трансфецированы таким образом, чтобы экспрессировать GM-CSF. Обнаружено, что GM-CSF является мощным активатором презентации антигенов для вакцинации против опухолей (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. SciU.S.A. 90: 3539-43). Изучение экспрессии генов и примеров крупномасштабной экспрессии генов различных опухолях позволило дать определение так называемых опухолеспецифических антигенов (Rosenberg, S.A. (1999)Immunity 10. 281-7). Во многих случаях эти опухолеспецифические антигены представляют собой дифференцировочные антигены, экспрессируемые в опухолях и в клетке, из которой образована опухоль,например меланоцитарные антигены gp100, MAGE антигены и Trp-2. Более того, можно показать, что многие из этих антигенов представляют собой мишени опухолеспецифических Т-клеток, обнаруживаемых у хозяина. Блокаду LAG-3 можно использовать в сочетании с группой рекомбинантных белков и/или пептидов, экспрессируемых в опухоли, чтобы выработать иммунный ответ на эти белки. Эти белки в норме рассматриваются иммунной системой как аутоантигены, и, следовательно, к ним поддерживает- 29