Связывающие элементы для пептида с5а с высоким ингибирующим действием

СВЯЗЫВАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ДЛЯ ПЕПТИДА С 5 А С ВЫСОКИМ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Го Жэньфэн (US), Ридеман Нильс Кристоф (DE), Ли Янь, Шэнь Бэйфэнь Настоящее изобретение относится к связывающим элементам, которые специфически связывают конформационный эпитоп С 5 а, в частности человеческий С 5 а. Предпочтительными связывающими элементами являются антитела против С 5 а, которые связывают этот конформационный эпитоп. Связывающие эпитопы, описанные в данном документе, пригодны в качестве активных агентов в фармацевтических композициях для лечения и профилактики различных острых и хронических заболеваний, в частности острых воспалительных заболеваний,таких как синдром системной воспалительной реакции (ССВР) и различные степени сепсиса,включая сепсис, тяжелый сепсис и септический шок. Настоящее изобретение относится к связывающим элементам, которые специфически связываются с конформационным эпитопом фрагмента С 5 а, в особенности человеческим С 5 а. Предпочтительными связывающими элементами являются антитела к С 5 а, которые связываются с данным конформационным эпитопом. Связывающие элементы, описываемые здесь, целесообразно использовать в качестве активных веществ фармацевтических композиций для лечения и профилактики различных острых и хронических заболеваний, в особенности острых воспалительных заболеваний, таких как синдром системной воспалительной реакции (ССВР), и сепсиса различной степени тяжести, включая сепсис, тяжелый сепсис и септический шок. Уровень техники С 5 а является продуктом расщепления компонента С 5 после активации комплемента. Среди продуктов активации комплемента пептид С 5 а является одним из наиболее сильных медиаторов воспаления,обладая широким спектром функций (Guo и Ward, 2005). С 5 а является гликопротеином, присутствующим в крови здоровых людей, с молекулярной массой 11,2 кДа. Полипептидная цепь С 5 а содержит 74 аминокислоты и имеет молекулярную массу 8,2 кДа, в то время как молекулярная масса углеводного компонента приблизительно 3 кДа. Фрагмент С 5 а оказывает свое воздействие за счет высокоаффинных рецепторов С 5 а (C5aR и C5L2) (Ward, 2009). C5aR принадлежит к семейству родопсинподобных рецепторов, связанных с G-белком, и имеет семь трансмембранных сегментов; C5L2 имеет с ним сходство, но не связан с G-белком. В настоящее время считается, что С 5 а выполняет свои биологические функции за счет взаимодействия между С 5 а и C5aR, так как для взаимодействия C5a-C5L2 было обнаружено лишь небольшое число биологических реакций. C5aR широко экспрессирован на миелоидных клетках, включая нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и моноциты, а также на немиелоидных клетках многих органов,в особенности легких и печени, что указывает на значимость сигнальных реакций C5a/C5aR. C5a выполняет различные биологические функции (Guo и Ward, 2005). С 5 а является сильным хемоаттрактантом для нейтрофилов, а также обладает хемотактической активностью в отношении моноцитов и макрофагов. С 5 а вызывает окислительный взрыв (потребление O2) в нейтрофилах и усиливает фагоцитоз и высвобождение гранулярных ферментов. Как было обнаружено, С 5 а обладает сосудорасширяющим действием. Как было продемонстрировано, С 5 а задействован в модуляции экспрессии цитокинов различными видами клеток в целях усиления экспрессии адгезивных молекул на нейтрофилах. Было обнаружено, что С 5 а становится чрезвычайно вредным, когда он вырабатывается в чрезмерных количествах при заболеваниях, так как он является сильным индуцирующим и усиливающим фактором воспалительных реакций, выполняя функцию положительной обратной связи в цепи воспалительных реакций. Высокие дозы С 5 а могут привести к неспецифической хемотаксической десенсибилизации для нейтрофилов, вызывая тем самым обширную дисфункцию (Huber-Lang и соавт., 2001 а). Сообщалось, что С 5 а вызывает многочисленные провоспалительные реакции и представляет опасность во время сепсиса. Ингибирование С 5 а или рецептора С 5 а (C5aR) антителами существенно улучшает выживаемость, как было показано для сепсиса на различных моделях с мышами и крысами (Czermak и соавт., 1999; Guo и соавт., 2000; Huber-Lang и соавт., 2001b; Riedemann и соавт., 2002 а). Кроме того, в различных сообщениях было продемонстрировано пагубное воздействие С 5 а на работу здоровой врожденной иммунной системы и органов при экспериментальном сепсисе (Guo и соавт., 2000; Guo и соавт.,2002; Huber-Lang и соавт., 2001 а; Huber-Lang и соавт., 2002; Laudes и соавт., 2002; Riedemann и соавт.,2003; Riedemann и соавт., 2004 а; Riedemann и соавт., 2004b). C5a выступает в качестве анафилатоксина и,как сообщается, вызывает многочисленные провоспалительные реакции. У людей, как сообщалось в различных исследованиях, высокий уровень С 5 а при сепсисе был связан с существенным ухудшением исхода (Bengtson и Heideman, 1988; Nakae и соавт., 1994; Nakae и соавт., 1996). При экспериментальном сепсисе воздействие С 5 а на нейтрофилы может вызвать дисфункцию нейтрофилов и блокирование сигнальных путей, приводя к дефектной сборке НАДФН-оксидазы, блокированию сигнального каскада MAPK, сильно подавленному окислительному взрыву, фагоцитозу и хемотаксису (Guo и соавт., 2006 а; Huber-Lang и соавт., 2002). Апоптоз тимоцитов и замедленный апоптоз нейтрофилов являются двумя важными патогенными событиями для развития сепсиса, они зависят от присутствия С 5 а (Guo и соавт., 2000; Guo и соавт., 2006b). Во время экспериментального сепсиса С 5 а приводит к повышению уровня экспрессии интегрина 2 на нейтрофилах, стимулируя миграцию клеток в органы (Guo и соавт., 2002), что является одной из главных причин функциональной недостаточности многих органов (MOF). Также было обнаружено, что С 5 а обуславливает активацию каскада коагуляции,которая происходит во время экспериментального сепсиса (Laudes и соавт., 2002). С 5 а стимулирует синтез и высвобождение из лейкоцитов человека провоспалительных цитокинов, таких как TNF-, ИЛ-,ИЛ-6, ИЛ-8 и фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF) (Hopken и соавт., 1996; Riedemann и соавт., 2004 а; Strieter и соавт., 1992). С 5 а производит сильное синергическое воздействие вместе с липополисахаридом на выработку фактора TNF-, воспалительного белка макрофагов (MIP)-2, цитокининдуцированного хемоаттрактанта нейтрофилов (CINC)-1 и ИЛ-1 в альвеолярных эпителиальных клетках(Riedemann и соавт., 2002b; Rittirsch и соавт., 2008). Если учесть, что активация комплемента является событием, происходящим во время появления первых симптомов сепсиса, то С 5 а может начать действо-1 022759 вать до появления воспалительной реакции - цитокиновой бури. Похоже, что С 5 а играет ведущую роль в управлении функционированием цитокиновой сети и формировании синдрома системной воспалительной реакции (ССВР). Ингибирование С 5 а в условиях экспериментального сепсиса чрезвычайно ослабляет развитие MOF и ССВР. Многократное повышение уровня экспрессии C5aR происходит при появлении первых симптомов сепсиса, и блокирование взаимодействия С 5 а и C5aR антителами к С 5 или антителами к C5aR, или же антагонистами C5aR оказывает сильное защитное действие в случае сепсиса в моделях с грызунами (Czermak и соавт., 1999; Huber-Lang и соавт., 2001b; Riedemann и соавт., 2002 а). Кроме случаев заболевания сепсисом было подтверждено, что блокирование С 5 а имеет защитное действие во многих других моделях с воспалительными процессами, таких как ишемия/реперфузионное повреждение, почечная недостаточность, отторжение трансплантата, малярия, ревматоидный артрит,кишечные инфекции, воспалительные заболевания легких, аутоиммунные заболевания с волчаночноподобным синдромом, нейродегенеративные заболевания и т.д., у различных биологических видов, неполный обзор дается в работах Klos А. и соавт. (Klos и соавт., 2009) и Allegretti M. и соавт. (Allegretti и соавт., 2005). Более того, недавно было открыто, что ингибирование С 5 а принесло большую терапевтическую пользу в модели с мышами, больными раком (Markiewski и соавт., 2008). Технические проблемы, лежащие в основе настоящего изобретения Антитела, которые специфически связываются с фрагментом С 5 а, но не фрагментом С 5b компонента С 5, известны из уровня техники (Klos и соавт. (1998) J. Immunol. Meth. Ill: 241-252; WO 01/15731;WO 03/015819). Однако полученные ранее антитела к С 5 а проявляли лишь умеренное блокирующее воздействие на биологические эффекты, вызванные С 5 а. Как следствие, антитела к С 5 а известного уровня техники не были способны привести к полной блокаде вызванных С 5 а биологических эффектов, или их нужно было использовать в сверхстехиометрических количествах для достижения достаточно высокого ингибирования активности С 5 а. Таким образом, в особенности с точки зрения потенциального клинического применения для пациентов, исходя из известного уровня техники, существует потребность в антителах к С 5 а или других связывающих элементах, обладающих более сильной блокирующей активностью по отношению к вызванным С 5 а биологическим эффектам в результате специфического связывания с С 5 а с высокой аффинностью. Также предпочтительно, чтобы такие антитела не связывались с фрагментом С 5b и, следовательно,не оказывали бы влияния на биологическую активность С 5b. Довольно неожиданно изобретатели настоящего изобретения смогли идентифицировать новый конформационный связывающий эпитоп с соответствующими связывающими антителами, которые отвечают упомянутым выше повышенным требованиям и другим условиям. Во время длительных экспериментов, лежащих в основе настоящего изобретения, из более чем 2000 антител могли быть получены два антитела к С 5 а, которые проявляют беспрецедентную блокирующую активность по отношению к биологическим эффектам, вызванным С 5 а, если их использовать в стехиометрических количествах, т.е. 0,5 моль бивалентного антитела на моль С 5 а. Приводимый выше обзор отнюдь не описывает все проблемы, решенные настоящим изобретением. Краткое изложение сущности изобретения В первом аспекте настоящее изобретение относится к связывающему элементу, который связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностямиI. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему: (i) последовательность тяжелой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 6; или (ii) последовательность тяжелой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 7; где последовательность тяжелой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей: (а) связывающий элемент в соответствии с первым аспектом или (b) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии со вторым аспектом и дополнительно включающей один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, вспомогательных веществ, наполнителей, вяжущих веществ, смазывающих веществ, скользящих веществ, разрыхлителей, адсорбентов и/или консервантов. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению (а) связывающего элемента в соответствии с первым аспектом или (b) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии со вторым аспектом для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения различных заболеваний, протекающих с острым воспалительным процессом, таких как синдром сис-2 022759 темной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок, ишемия/реперфузионные повреждения, такие как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких, острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции трансплантат против хозяина, а также заболевания, включающие хронические воспалительные процессы, такие как гломерулярные заболевания почек, такие как гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки, воспаления кишечника, болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов. В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения синдрома системной воспалительной реакции (ССВР), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, ишемии/реперфузионных повреждений, таких как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких, острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции трансплантат против хозяина, гломерулярные заболевания почек, такие как гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки, воспаления кишечника, болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов у пациентов, нуждающихся в нем, причем способ включает введение пациенту эффективного количества (а) связывающего элемента в соответствии с первым аспектом или (b) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии со вторым аспектом. Данное краткое изложение сущности изобретения отнюдь не описывает все отличительные черты изобретения. Детальное описание изобретения Определения Прежде чем настоящее изобретение будет описано подробно ниже, следует понять, что это изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описываемыми в данном документе, так как они могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, применяется исключительно в целях описания конкретных вариантов осуществления и не направлена на ограничение объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемыми пунктами формулы изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины,используемые в данном документе, имеют то же самое значение, которое обычно понимается под этим термином средним специалистом в данной области. Термины в контексте данного описания используются, как правило, в соответствии с Многоязычным словарем терминов по биотехнологии: (рекомендации IUPAC), под ред. Leuenberger,H.G.W, Nagel В. and Kolbl H. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland). Во всем данном описании и пунктах формулы изобретения, приводимой ниже, если контекст не требует другого толкования, понятие включать и его формы включает и включая должны пониматься как подразумевающие включение указываемого целого числа или этапа или группы целых чисел или этапов, но не исключение любого другого целого числа или этапа или группы целых чисел или этапов. В тексте данного описания цитируются некоторые документы. Каждый из документов, цитируемых в данном описании (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителей, инструкции, описания последовательностей в базе данных GenBank под соответствующими номерами доступа и т.д.), вне зависимости выше или ниже по тексту, включен целиком путем ссылки в данное описание. Ничто из этого не должно толковаться как допущение, что изобретение не в праве датировать такое раскрытие сущности задним числом на основании предшествующего изобретения. Понятие человеческий С 5 а в контексте настоящего описания относится к следующему пептиду из 74 аминокислотных остатков:TLQKKIEEIA AKYKHSWKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECCWASQ LRANISHKDM QLGR (SEQ ID NO: 1). Понятие связывающий элемент в контексте настоящего описания относится к любой молекуле или части молекулы, которая может специфически связываться с молекулой-мишенью или эпитопоммишенью. Предпочтительными связывающими элементами в контексте настоящей заявки являются (а) антитела или их антигенсвязывающие фрагменты; (b) олигонуклеотиды; (с) подобные антителам белки; или (d) пептидомиметики. Связывающие элементы, которые могут использоваться для практического осуществления настоящего изобретения, способны связываться с конформационным эпитопом С 5 а млекопитающих, который образован двумя аминокислотными последовательностями X1X2ETCEX3RX4 (SEQX8 выбран из группы, состоящей из М, L, I и V; и Х 9 выбран из группы, состоящей из Q, L и I. Связывающие элементы, которые являются особенно пригодными для практического осуществления настоящего изобретения, способны связываться с конформационным эпитопом С 5 а человека, который образован двумя аминокислотными последовательностями NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) и SHKDMQL(SEQ ID NO: 3). В контексте настоящего описания первое соединение (например, антитело), как считается, должно связываться со вторым соединением (например, антигеном, таким как белок-мишень), если его константа диссоциации Kd по отношению ко второму соединению составляет 1 мМ или менее, предпочтительно 100 мкМ или менее, предпочтительно 50 мкМ или менее, предпочтительно 30 мкМ или менее,предпочтительно 20 мкМ или менее, предпочтительно 10 мкМ или менее, предпочтительно 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее, более предпочтительно 900 нМ или менее, более предпочтительно 800 нМ или менее, более предпочтительно 700 нМ или менее, более предпочтительно 600 нМ или менее, более предпочтительно 500 нМ или менее, более предпочтительно 400 нМ или менее, более предпочтительно 300 нМ или менее, более предпочтительно 200 нМ или менее, еще более предпочтительно 100 нМ или менее, еще более предпочтительно 90 нМ или менее, еще более предпочтительно 80 нМ или менее, еще более предпочтительно 70 нМ или менее, еще более предпочтительно 60 нМ или менее, еще более предпочтительно 50 нМ или менее, еще более предпочтительно 40 нМ или менее, еще более предпочтительно 30 нМ или менее, еще более предпочтительно 20 нМ или менее и еще более предпочтительно 10 нМ или менее. Понятие связывание в соответствии с изобретением предпочтительно относится к специфическому связыванию. Понятие специфическое связывание означает, что связывающий элемент (например,антитело) связывается сильнее с мишенью, такой как эпитоп, по отношению к которой он является специфическим, по сравнению со связыванием с другой мишенью. Связывающий элемент связывается сильнее с первой мишенью по сравнению со второй мишенью, если он связывается с первой мишенью с константой диссоциации (Kd), которая ниже константы диссоциации для второй мишени. Предпочтительно, если константа диссоциации (Kd) для мишени, с которой связывающий элемент связывается специфически, более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 50 раз, еще более предпочтительно более чем в 100, 200, 500 или 1000 раз ниже, чем константа диссоциации (Kd) для мишени, с которой связывающий элемент не связывается специфически. Понятие Kd (измеряется в моль/л, для которого иногда используется сокращение М) в контексте данного описания предназначено для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия между связывающим элементом (например, антителом или его фрагментом) и молекулой-мишенью (например, антигеном или его эпитопом). Эпитоп, известный также под названием антигенная детерминанта, является частью макромолекулы, которая распознается иммунной системой, конкретнее распознается антителами, В-клетками или Т-клетками. В контексте настоящего описания эпитоп является частью макромолекулы, способной связываться со связывающим элементом (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом),как описывается в данном документе. В данном контексте термин связывание предпочтительно обозначает специфическое связывание. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют характеристики специфической трехмерной структуры, а также специфические характеристики зарядов. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с эпитопами первого,но не второго типа нарушается в присутствии денатурирующих растворителей. Понятие конформационный эпитоп в контексте настоящего описания относится к эпитопу линейной макромолекулы (например, полипептида), который образован трехмерной структурой указанной молекулы. В контексте настоящей заявки конформационный эпитоп является детерминантой прерывистого типа, т.е. конформационным эпитопом на макромолекуле (например, полипептиде), который образован по меньшей мере из двух отдельных участков в первичной последовательности макромолекулы (например, аминокислотной последовательности полипептида). Другими словами, эпитоп рассматривается в качестве конформационного эпитопа в контексте настоящего изобретения, если эпитоп состоит по меньшей мере из двух отдельных участков в первичной последовательности, с которыми связывающий элемент по изобретению (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается одновременно, где данные по меньшей мере два участка прерываются еще одним участком в первичной последовательности, с которым связывающий элемент по изобретению не связывается. Предпочтительно, если такой конформационный эпитоп присутствует на полипептиде и два отдельных участка в первичной последовательности являются двумя отдельными аминокислотными последовательностями,с которыми связывается связывающий элемент по изобретению (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), где данные по меньшей мере два участка аминокислотной последовательности прерываются еще одним участком в первичной последовательности, с которым связывающий элемент по изобретению не связывается. Предпочтительно, чтобы прерывающая аминокислотная последовательность была смежной аминокислотной последовательностью, включающей две или более аминокислоты,с которыми связывающий элемент не связывается. По меньшей мере две аминокислотные последовательности, с которыми связывается связывающий элемент по изобретению, не имеют конкретного огра-4 022759 ничения по своей длине. Такая отдельная аминокислотная последовательность может состоять лишь из одной аминокислоты до тех пор, пока общее число аминокислот в составе указанных по меньшей мере двух отдельных аминокислотных последовательностей будет достаточно большим для осуществления специфического связывания между связывающим элементом и конформационным эпитопом. Паратоп является частью антитела, которая распознает эпитоп. В контексте настоящего изобретения паратоп является частью связывающего элемента (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента), предлагаемого в изобретении, который распознает эпитоп. Понятие антитело, как правило, относится к гликопротеину, включающему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающий фрагмент. Понятие антитело также включает все рекомбинантные формы антител, в частности антител, описываемых в контексте данного изобретения, например антитела, экспрессированные в прокариотических системах, негликозилированные антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты антител и их производные, как это описывается ниже. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (для которой здесь использовано сокращение VH или VH) И константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (для которой здесь использовано сокращение VL или VL) И константной области легкой цепи. Участки VH и VL могут быть, в свою очередь, подразделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех участков CDR и четырех FR-участков,расположенных в направлении от N- к С-концу домены в следующей последовательности: FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы(например, эффекторные клетки) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Понятие антигенсвязывающий фрагмент антитела в контексте настоящего описания (или просто участок, отвечающий за связывание), относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Как было показано, антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами антитела полной длины. Примеры участков связывания, охватываемых понятием антигенсвязывающий участок антитела, включают (i) Fabфрагменты, моновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и СН; (ii) F(ab')2-фрагменты,бивалентные фрагменты, включающие два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагменты, состоящих из доменов VH и СН; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из доменов VL и VH одного плеча молекулы антитела; (v) dAb-фрагменты (Ward и соавт. (1989) Nature 341: 544-546), которые состоят из домена VH; (vi) выделенные определяющие комплементарность участки(CDR), и (vii) комбинации двух или более выделенных CDR-участков, которые опционально могут быть соединены синтетическим линкером. Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть связаны с помощью способов получения рекомбинантного белка посредством рекомбинантного линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный фрагмент Fv (scFv); см., например, Bird и соавт. (1988) Science 242: 423-426; и Huston и соавт.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. Дальнейшим примером является слитый белок с иммуноглобулинсвязывающим доменом, включающий (i) полипептид со связывающим доменом, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина СН 2, слитую с шарнирной областью, и (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина СН 3, слитую с константной областью СН 2. Полипептид со связывающим доменом может быть в составе вариабельного участка тяжелой цепи или вариабельного участка легкой цепи. Слитые белки с иммуноглобулинсвязывающим доменом раскрыты дополнительно в патентных заявках США US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Данные фрагменты антител были получены с помощью общепринятых методов, известных среднему специалисту данной области из уровня техники, и был проведен их скрининг на применимость таким же способом, как и интактных антител. Дальнейшими примерами антигенсвязывающих фрагментов являются так называемые микроантитела, которые получены из отдельных вариабельных участков CDR. Например, Heap и соавт., 2005, описывают микроантитела из 17 аминокислотных остатков, полученных из CDR3 тяжелой цепи антитела, направленного против гликопротеина gpl20 оболочки вируса ВИЧ-1. Другие примеры включают небольшие миметические антитела, включающие два или более гипервариабельных участка CDR, которые слиты друг с другом предпочтительно за счет родственных каркасных участков. Такое небольшое миметическое антитело,включающее VH CDR1 и VL CDR3, связанные с родственным участком VH FR2, было описано в работеQiu и соавт., 2007. Таким образом, понятие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в контексте данного описания относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным участкам молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммунно реагирует) с антигеном. Также включены иммуноглобулинподобные белки, которые выбираются методами, включающими, например, метод фагового дисплея для специфического связывания с молекулой-мишенью или эпитопом-мишенью, например, с конформационным эпитопом С 5 а,образованным аминокислотными последовательностями X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) иX5X6KX7X8X9L (SEQ ID NO: 19) фрагмента С 5 а, где X1 выбран из группы, состоящей из N, H, D, F, K, Y и Т; X2 выбран из группы, состоящей из D, L, Y и Н; X3 выбран из группы, состоящей из Q, Е и K; X4 выбран из группы, состоящей из А, V и L; X5 выбран из группы, состоящей из S, Н, Р и N; Х 6 выбран из группы, состоящей из Н и N; X7 выбран из группы, состоящей из D, N, Н, Р и G; X8 выбран из группы,состоящей из М, L, I и V; и X9 выбран из группы, состоящей из Q, L и I; или с конформационным эпитопом С 5 а человека, образованным аминокислотными последовательностями в соответствии с SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; или с конформационным эпитопом С 5 а человека, образованным аминокислотными последовательностями DETCEQR (SEQ ID NO: 4) и KDM. Молекулы иммуноглобулина, предлагаемые в изобретении, могут быть любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) и подкласса (например, IgG1, IgG2, предпочтительно IgG2a и IgG2b, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) молекулы иммуноглобулина. Их антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, применимые в данном изобретении, могут быть любого животного происхождения, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно, если антитела или их фрагменты получены от человека, шимпанзе, грызунов (например, мышей, крыс, морских свинок или кроликов), кур, индеек, свиней, овец, коз, верблюдов, коров, лошадей, ослов, кошек или собак. Особенно предпочтительно, если антитела имеют человеческое или мышиное происхождение. Антитела,предложенные в изобретении, включают также химерные молекулы, в которых константная область антитела, полученная от одного вида, предпочтительно человека, конъюгируется с антигенсвязывающим сайтом другого вида, например мыши. Более того, антитела, предложенные в изобретении, включают гуманизированные молекулы, в которых антигенсвязывающие сайты антител, полученных от видов, отличных от человека (например, мышей), конъюгированы с константной и каркасной областью человеческого происхождения. Как приводится в примерах воплощения настоящего изобретения, антитела, предложенные в изобретении, могут быть получены непосредственно из гибридом, которые экспрессируют антитело, или же могут быть клонированы и экспрессированы в рекомбинантном организме в клетке-хозяине (например,клетке СНО или лимфоцитарной клетке). Дополнительными примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. coli, и грибы, такие как дрожжи. В качестве альтернативы они могут быть получены рекомбинантным путем в трансгенном животном, отличном от человека, или растении. Понятие химерное антитело относится к таким антителам, в которых одна часть каждой аминокислотной последовательности тяжелой или легкой цепей гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида, или относящихся к конкретному классу, тогда как остальная часть цепи гомологична соответствующим последовательностям антител другого вида или класса. Как правило, вариабельный участок как легкой, так и тяжелой цепей имитирует вариабельные участки антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные области гомологичны последовательностям антител, полученных от другого вида. Одним четким преимуществом таких химерных форм является то, что вариабельный участок может, как правило, быть получен из известных на данный момент источников с помощью общедоступных В-клеток или гибридом из клеток организмов-хозяев нечеловеческого происхождения в комбинации с константными участками, полученными,например, из человеческих клеточных препаратов. Тогда как преимуществом вариабельного участка является простота получения, при том, что специфичность не подвержена воздействию источника, то, мало вероятно, что константный участок, имеющий человеческое происхождение, будет вызывать иммунный ответ у человеческого субъекта при введении антител в виде инъекции, по сравнению с тем случаем, если бы константный участок был нечеловеческого происхождения. Однако это определение не ограничивается данным конкретным примером. Понятие гуманизированное антитело относится к молекуле, имеющей антигенсвязывающий сайт,который, по существу, получен из иммуноглобулина нечеловеческих видов, в которой оставшаяся часть молекулы иммуноглобулиновой структуры имеет в своей основе структуру и/или последовательность человеческого иммуноглобулина. Антигенсвязывающий сайт может включать целые вариабельные домены, слитые с константными доменами, или лишь последовательности определяющего комплементарность участка (CDR), трансплантированные на подходящий каркасный участок в вариабельных доменах. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированными одной или несколькими аминокислотными заменами, например, с модификацией, чтобы иметь большее сходство с человеческими иммуноглобулинами. Некоторые гуманизированные антитела сохраняют все последовательностиCDR-участка (например, гуманизированные антитела мыши, которые содержат все шесть CDR-участков мышиного антитела). Другие формы имеют один или более гипервариабельных участков CDR, которые изменены по сравнению с исходным антителом. Среднему специалисту данной области известны различные способы гуманизации антител, описан-6 022759 ные в обзорной статье Almagro и Fransson, 2008, которая включена в данное описание полностью путем ссылки. Обзорная статья Almagro и Fransson вкратце рассмотрена ниже. Almagro и Fransson делают различие между рациональными и эмпирическими подходами. Рациональные подходы характеризуются получением нескольких вариантов сконструированного антитела и оценкой их связывания или любого другого свойства, представляющего интерес. Если сконструированные варианты не дают ожидаемых результатов, то начинают новый цикл разработок и оценки связывания. Рациональные подходы включают трансплантацию гипервариабельных участков CDR, ремоделирование поверхности, супергуманизацию и оптимизацию гуманизированности антител (Human String Content Optimization). В отличие от этого, эмпирические подходы основаны на создании крупных библиотек гуманизированных вариантов и селекции лучших клонов с помощью технологий обогащения или метода скрининга высокой производительности. Таким образом, эмпирические подходы зависят от надежности метода селекции и/или скрининга, которая способна проводить поиск в огромных количествах вариантов антител. Технологии отображения in vitro, такие как метод фагового дисплея и рибосомного дисплея, отвечают данным требованиям и хорошо известны среднему специалисту данной области. Эмпирические подходы включают создание библиотек FR-участков, управляемую селекцию, рекомбинацию сегментов каркаса и методикуHumaneering. Трансплантация гипервариабельных участков CDR Протокол трансплантации гипервариабельных участков CDR, как правило, включает три решающие отправные точки: (1) выявление областей, определяющих специфичность донорского антитела, т.е. объекта пересадки, (2) идентификация источника аминокислотных последовательностей белков человека для использования в качестве доноров FR-участков, и (3) и выбор остатков вне участка, определяющего специфичность, т.е. определение аминокислотных позиций, которые станут объектами обратной мутации для восстановления или улучшения аффинности гуманизированного антитела.(1) Участки, определяющие специфичность антител Экспериментальная структура нечеловеческого антитела в комплексе с антигеном позволяет создать подробную карту остатков, вступающих в контакт с антигеном и, таким образом, отвечающих за специфичность антитела. Информация о структуре может быть дополнена с помощью сканирующего аланином мутагенеза и/или комбинаторного мутагенеза в целях идентификации остатков, которые в наибольшей степени определяют энергию связывания или связывающую активность паратопа. Так как функциональный паратоп является набором остатков, вступающих в контакт, прививка только функционального паратопа снизила бы число остатков нечеловеческого происхождения в гуманизированном продукте. Однако лишь в редких случаях экспериментальная структура комплекса антиген-антитело и/или функционального паратопа доступна в начале выполнения протокола гуманизации. При отсутствии точного определения остатков, отвечающих за заданную специфичность антитела, в качестве определяющих специфичность структур часто используют гипервариабельные участки CDR. В качестве объектов трансплантации можно также использовать комбинацию CDR и гипервариабельной петли. Чтобы сократить число остатков, прививаемых на человеческие FR-участки, была описана трансплантация SDR- части гипервариабельного участка, отвечающего за специфичность, т.е. прививка определяющих специфичность остатков (SDR).(2) Источники человеческих FR-участков Вторым этапом стандартного протокола прививки гипервариабельных участков CDR является определение человеческих донорских FR-участков. В первоначальных работах использовались участки FR человеческих антител известной структуры без учета их гомологии по отношению к нечеловеческому антителу. Данный подход известен под названием Fixed FR method (Метод фиксированных FRучастков). В более поздних работах использовались человеческие последовательности, имеющие наибольшую гомологичность по отношению к нечеловеческому антителу. Данный подход получил названиеBest Fit (наилучшее соответствие). В то время как стратегии методики наилучшего соответствия направлены на подбор антител с более высокой аффинностью, при выборе участков FR для гуманизации также должны быть учтены и другие параметры, такие как иммуногенность и выход продукта. Таким образом, также возможны комбинации методов фиксированных FR-участков и наилучшего соответствия. Например, участок VL может быть гуманизирован в соответствии с методом фиксированных участков FR, а участок VH может быть гуманизирован в соответствии с методом наилучшего соответствия, или наоборот. Использовали два источника человеческих последовательностей: последовательности зрелых и зародышевых линий клеток. Зрелые последовательности, которые являются продуктами иммунных ответов, несут соматические мутации, возникшие в результате случайных процессов и не подпадающие под селекцию видов, приводя к потенциально иммуногенным остатками. Таким образом, чтобы избежать получения иммуногенных остатков, в качестве источников FR-участков все чаще используют гены человеческих зародышевых линий. Нуклеотидные последовательности участков FR человеческих зародышевых линий раскрыты, например, в приложениях А и В к статьям Dall'Acqua и соавт., 2005. Кроме того,антитела эмбрионального типа имеют тенденцию быть более гибкими в сравнении со зрелыми антитела-7 022759 ми. Эта более высокая гибкость, как считается, позволяет лучше приспосабливаться различным участкамCDR с меньшим числом или без обратных мутаций в FR для восстановления аффинности гуманизированного антитела.(3) Обратные мутации для восстановления или усиления аффинности Обычно аффинность снижается после трансплантации участка CDR как следствие несовместимости между нечеловеческими гипервариабельными участками CDR и человеческими каркасными участкамиFR. Поэтому третьим этапом в стандартном протоколе трансплантации CDR является определение мутаций, которые могли бы восстановить аффинность или предупредить потери аффинности. Обратные мутации должны быть тщательно индуцированы, исходя из структуры или модели гуманизированного антитела, и испытаны экспериментальным путем. Веб-страницу компьютерного моделирования антителWAM можно посмотреть по адресу http://antibody.bath.ac.uk. Программное обеспечение для моделирования белковой структуры можно загрузить на сайтах: http://salilab.org/modeller/modeller.html (Modeller) иhttp://spdbv.vital-it.ch (Swiss PdbViewer). Ремоделирование поверхности Метод ремоделирования поверхности похож на трансплантацию гипервариабельного участка CDR и разделяет с этим методом первые две решающие отправные точки. В отличие от трансплантации гипервариабельного участка CDR при ремоделировании поверхности сохраняются остатки нечеловеческого антитела, не подвергшиеся конструированию. На остатки человеческого происхождения заменяются только поверхностные остатки нечеловеческого антитела. Супергуманизация В то время как метод трансплантации гипервариабельного участка CDR основан на сравнении FRучастков нечеловеческих и человеческих последовательностей, в основе метода супергуманизации лежит сравнение CDR-областей, так что FR-гомология становится несущественной. Подход включает сравнение нечеловеческой последовательности с набором функциональных генов зародышевой линии человека. Затем выбирают те гены, которые кодируют такие же или близкородственные канонические структурные компоненты мышиных последовательностей. Далее, из генов, имеющих одинаковые канонические структурные компоненты с нечеловеческим антителом, в качестве доноров FR-участков выбирают те, которые имеют наибольшую гомологию внутри областей CDR. Наконец, нечеловеческие областиCDR трансплантируют на эти участки FR. Оптимизация гуманизированности антител (Human String Content Optimization) Данная методика основана на мере гуманизированности антитела, называемой Human String Content (HSC). Вкратце, в рамках этой методики мышиную последовательность сравнивают с набором генов человеческой зародышевой линии. Различия записываются как показатели HSC. Целевая последовательность гуманизирована за счет максимизации ее HSC, а не при использовании критерия глобальной идентичности в целях получения множества различных гуманизированных вариантов. Библиотеки каркасных участков (сокр. библиотеки FR) В рамках методики создания библиотек FR коллекция вариантов остатков вводится в участок FR в конкретные положения, за чем следует просеивание библиотеки для выбора участка, который наилучшим образом подходит к трансплантированному участку CDR. Таким образом, у этой методики есть сходства с методом трансплантации гипервариабельных участков CDR, но вместо создания нескольких обратных мутаций участка FR создается комбинаторная библиотека, состоящая, как правило, из более чем 100 вариантов мутации. Управляемая селекция Данная методика включает комбинирование домена VH или VL заданного нечеловеческого антитела,специфичного к конкретному антигену, с библиотекой человеческих доменов VH и VL. После этого специфические человеческие домены V выбираются так, чтобы они были направлены против интересующего антигена. Например, нечеловеческое антитело может быть гуманизировано, во-первых, посредством комбинации нечеловеческого домена VH с библиотекой человеческих легких цепей. Затем с помощью фагового дисплея выбирают библиотеку, направленную против антигена-мишени, и выбранный доменVL клонируют в библиотеку человеческих цепей VH и производят отбор по направленности против антигена-мишени. Возможно также начинать с комбинирования нечеловеческого домена VL с библиотекой человеческих тяжелых цепей. Затем с помощью фагового дисплея производят отбор библиотеки по направленности против антигена-мишени и выбранный домен VH клонируют в библиотеку человеческих цепей VL и производят отбор по направленности против антигена-мишени. В результате может быть выделено полностью человеческое антитело с такой же аффинностью, как и у антитела нечеловеческого происхождения. Чтобы избежать возникновение дрейфа эпитопов, возможно внедрение так называемого анализа ингибирования методом ELISA, который позволяет выбрать клоны, распознающие те же эпитопы, что и родительское антитело. Альтернативно, чтобы избежать дрейфа эпитопов, можно применить методику удержания вариабельного участка CDR. При удержании участка CDR сохраняют один или более нечеловеческих вариабельных участков CDR, предпочтительно тяжелую цепь CDR3, так как этот участок CDR находится в центре антигенсвязывающего сайта. Рекомбинация каркасных участков (сокр. рекомбинация FR) В рамках методики рекомбинации FR целые участки FR комбинируют с нечеловеческими вариабельными участками CDR. С помощью рекомбинации участков FR Dall'Acqua и соавт. гуманизировали мышиное антитело. Все шесть вариабельных участков CDR мышиного антитела были клонированы в библиотеку, содержащую все участки FR зародышевой линии человека (Dall'Acqua и соавт., 2005). Был проведен скрининг библиотек на связывание с помощью двухэтапного процесса селекции, сначала гуманизация VL, затем - VH. В более позднем исследовании был успешно использован одноэтапный процесс рекомбинации FR (Damschroder и соавт., 2007). Олигонуклеотидные последовательности, кодирующие все известные каркасные участки легкой цепи зародышевой линии человека (k) раскрыты в работеDall'Acqua и соавт., 2005, в приложении А. Олигонуклеотидные последовательности, кодирующие все известные каркасные участки тяжелой цепи зародышевой линии человека, раскрыты в работе Dall'Acqua и соавт., 2005, в приложении В. Способ Humaneering Способ Humaneering позволяет выделить антитела, которые на 91-96% гомологичны антителам зародышевой линии человека. Способ основан на экспериментальной идентификации необходимого минимума детерминант специфичности (MSD) и последовательной замене нечеловеческих фрагментов на библиотеки человеческих участков FR и оценке связывания. Ее начинают с участков CDR3 нечеловеческих цепей VH и VL и постепенно заменяют другие участки нечеловеческого антитела на человеческие участки FR, включая CDR1 и CDR2 обеих цепей VH и VL. Способы гуманизации антител, поясненные выше, являются предпочтительными для получения гуманизированных антител, которые специфически связываются с конформационными эпитопами, описываемыми в данном документе. Несмотря на это, настоящее изобретение не ограничивается упомянутыми выше способами гуманизации антител. Некоторые из приведенных выше способов гуманизации антител могут быть выполнены без информации о последовательностях участков FR в антителе-доноре, а именно Метод фиксированных FRучастков (Fixed FR Method, вариант трансплантации участков CDR), супергуманизация, рекомбинация каркасных участков и метод Humaneering. Вариации Метода фиксированных FR-участков были успешно осуществлены Qin и соавт., 2007 и Chang и соавт., 2007. В частности, Qin и соавт. сконструировали фрагмент антитела, включающий вариабельный участок тяжелой цепи человека, в котором три вариабельных участка CDR были заменены на антигенные пептиды, которые были получены из последовательностей CDR мышиного антитела. Chang и соавт. продолжили эти эксперименты и сконструировали фрагмент scFv, в котором все вариабельные участки CDR цепи VH и участок CDR3 цепи VL были заменены на антигенные пептиды, которые были получены из последовательностей CDR мышиного антитела. Понятие человеческие антитела в контексте данного описания включает антитела, имеющие вариабельные и константные участки, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями генов человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, внесенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или при соматической мутации in vivo). Человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, включают антитела, выделенные из библиотек человеческого иммуноглобулина или трансгенных животных с одним или нескольким генами человеческого иммуноглобулина, которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как это описано для примера в патенте США 5939598 Kucherlapati и Jakobovits. Понятие моноклональное антитело в контексте данного описания относится к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют один молекулярный состав. Моноклональное антитело проявляет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. В одном варианте осуществления моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от животного, отличного от человека, например мыши, слитую с иммортализованной клеткой. Понятие рекомбинантное антитело в контексте данного описания включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, такие как (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулина, или из гибридомы, полученной из него, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной таким образом, чтобы она экспрессировала антитело,например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина до других последовательностей ДНК. Понятие трансфектома в контексте данного описания включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитела, такие как клетки СНО, клетки NS/0, клетки HEK293, клеткиHEK293 Т, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей. Понятие гетерологическое антитело в контексте данного описания определяется отношением к трансгенному организму, вырабатывающему такое антитело. Данное понятие относится к антителу,-9 022759 имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую той, что была обнаружена в организме, не состоящем из трансгенного организма, и которое, как правило, получают от видов, отличных от трансгенного организма. Понятие гетерогибридное антитело в контексте данного описания относится к антителу, имеющему легкие и тяжелые цепи различного организменного происхождения. Например, антитело, имеющее человеческую тяжелую цепь, связанную с легкой цепью мыши, является гетерогибридным антителом. Таким образом, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, пригодные для применения в контексте настоящего изобретения, включают без ограничения поликлональные, моноклональные, моновалентные, биспецифические, гетероконъюгаты, мультиспецифические, рекомбинантные, гетерологичные,гетерогибридные, химерные, гуманизированные (в частности, трансплантацией CDR), деиммунизированные или человеческие антитела, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, фрагменты, полученные из библиотеки векторов экспрессии Fab, Fd, Fv, Fvs с дисульфидной связью (dsFv), одноцепочные антитела (например, scFv), диатела или тетратела (Holliger P. и соавт. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90(14), 6444-6448), нанотела (известные также как антитела с одним доменом), антиидиотипические (anti-Id) антитела (включая, например, антитела anti-Id к антителам по изобретению) и эпитопсвязывающие фрагменты любых из приведенных выше видов. Антитела в контексте данного описания предпочтительно являются выделенными. Понятие выделенное антитело в контексте настоящего изобретения предназначено для описания антитела, которое, по существу, свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с С 5 а, по существу, свободно от антител,которые специфически связываются с антигенами, отличными от С 5 а). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого антигена С 5 а, может,однако, иметь кросс-реактивность по отношению к другим родственным антигенам, например, других видов организмов (например, гомологи вида С 5 а, такие как крысиные антигены С 5 а). Более того, выделенное антитело может быть, по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте осуществления данного изобретения комбинация выделенных моноклональных антител относится к антителам, имеющим различные специфичности и сконструированным в четко определенном составе. Понятие встречающийся в природе в контексте настоящего описания в отношении объекта относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лаборатории, является встречающейся в природе. Понятие аптамер нуклеиновой кислоты в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована путем повторных циклов селекции in vitro или с помощью способа SELEX (Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), чтобы связываться с молекулой-мишенью (обзорную информацию см. Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1): 5-13). Аптамер нуклеиновой кислоты может быть молекулой ДНК или РНК. Аптамеры могут содержать модификации, например модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-фторзамещенные пиримидины. Понятие антителоподобный белок в контексте настоящего описания относится к белку, который был сконструирован (например, мутагенезом, мишенью которого являются полипептидные петли), чтобы специфически связываться с молекулой-мишенью. Характерно, что такой антителоподобный белок включает по меньшей мере одну вариабельную пептидную петлю, присоединенную обоими концами к протеиновому каркасу. Такое двойное структурное ограничение чрезвычайно повышает аффинность антителоподобного белка до уровней, сравнимых с антителом. Длина вариабельной пептидной петли, как правило, составляет 10-20 аминокислот. Каркасный белок может быть белком, имеющим хорошие характеристики растворимости. Предпочтительно, если каркасный белок является небольшим глобулярным белком. Антителоподобные белки включают без ограничения аффитела, антикалины и сконструированные белки с анкириновыми повторами (обзор см. Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteinsfrom nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10): 1257-1268). Антителоподобные белки могут быть получены из крупных библиотек мутантов, например, с помощью методов пэннинга крупных библиотек фагового дисплея и выделены по аналогии с обычными антителами. Антителоподобные белки связывания могут быть также получены методом комбинаторного мутагенеза поверхностных остатков в молекулах глобулярных белков. Антителоподобные белки называют иногда пептидными аптамерами. В контексте данного описания пептидомиметиком является малая белковоподобная цепь, предназначенная для имитации пептида. Пептидомиметики, как правило, возникают вследствие модификации существующего пептида в целях изменения свойств молекулы. Например, они могут возникнуть в результате модификаций, направленных на изменение стабильности молекул или биологической активности. Это может играть роль при разработке лекарствоподобных соединений из существующих пептидов. Данные модификации включают изменения пептида до такого вида, который не встречается в природе(такие как изменения остова и внедрение синтетических аминокислот). Консервативные замещения могут быть сделаны, к примеру, на основе сходства по полярности,заряду, размеру, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичной природе задействованных аминокислотных остатков. Аминокислоты могут быть сгруппированы в следующие шесть стандартных аминокислотных групп:(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Понятие консервативные замещения в контексте настоящего описания определяется как замена одной аминокислоты другой аминокислотой, входящих в одну и ту же группу списка шести стандартных групп аминокислот, представленного выше. Например, при замещении Asp на Glu в модифицированном таким образом полипептиде сохраняется один отрицательный заряд. Кроме того, глицин и пролин могут быть заменены друг другом, исходя из их способности разрывать альфа-спирали. Некоторыми предпочтительными консервативными замещениями внутри представленных выше шести групп являются замещения внутри следующих подгрупп: (i) Ala, Val, Leu и Ile; (ii) Ser и Thr; (ii) Asn и Gln; (iv) Lys и Arg; и(v) Tyr и Phe. Если известен генетический код и методики получения рекомбинантной и синтетической ДНК, опытный исследователь может легко сконструировать ДНК, кодирующие консервативные последовательности аминокислот. Понятие неконсервативные замещения или неконсервативные аминокислотные замены в контексте настоящего описания определяются как замены одной аминокислоты на другую, находящихся в различных группах списка шести стандартных групп аминокислот (1) по (6), представленного выше. Биологическая активность в контексте настоящего описания относится к любой активности, которую может проявлять полипептид, включая без ограничения: ферментативную активность; активность связывания с другим соединением (например, связывание с другим полипептидом, в частности связывание с рецептором или связывание с нуклеиновой кислотой); ингибирующую активность (например, активность, ингибирующую ферменты); активирующую активность (например, активность, активирующую ферменты); или токсические эффекты. По отношению к вариантам или производным полипептида не требуется, чтобы вариант или производное проявляли такую активность с той же силой, что и родительский полипептид. Вариант считается вариантом в контексте настоящей заявки, если он проявляет соответствующую активность, составляющую не менее 10% активности родительского полипептида. Аналогично производное считается производным в контексте настоящей заявки, если он проявляет соответствующую биологическую активность, составляющую не менее 10% активности родительского полипептида. Понятие соответствующая биологическая активность в контексте настоящего изобретения является связывающей активностью по отношению к конформационному эпитопу С 5 а, образованному аминокислотными последовательностями X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) и X5X6KX7X8X9L (SEQ IDNO: 19) фрагмента С 5 а, где X1 выбран из группы, состоящей из N, H, D, F, K, Y и Т; Х 2 выбран из группы, состоящей из D, L, Y и Н; X2 выбран из группы, состоящей из Q, Е и K; Х 4 выбран из группы, состоящей из А, V и L; X5 выбран из группы, состоящей из S, Н, Р и N; X6 выбран из группы, состоящей из Н и N; Х 7 выбран из группы, состоящей из D, N, Н, Р и G; X8 выбран из группы, состоящей из М, L, I и V; и Х 9 выбран из группы, состоящей из Q, L и I. Особенно соответствующей биологической активностью в контексте настоящего изобретения является активность связывания с конформационным эпитопом человеческого антигена С 5 а, образованного аминокислотными последовательностями в соответствии сSEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, если соответствующей биологической активностью в контексте настоящего изобретения является активность связывания с конформационным эпитопом человеческого антигена С 5 а, образованного аминокислотными последовательностями DETCEQR (SEQ IDNO: 4) и KDM. Методы определения связывающей активности известны специалисту среднего уровня данной области и включают анализы по методике ELISA, такие как один из описываемых в разделе примеры. В контексте настоящего описания пациент обозначает любое млекопитающее или птицу, которые могут получить пользу от лечения введением описываемых в данном документе элементов, связывающихся с мишенью. Предпочтительно пациент выбирается из группы, состоящей из лабораторных животных (например, мышь или крыса), домашних животных (включая, например, морских свинок, кроликов, кур, индеек, свиней, овец, коз, верблюдов, коров, лошадей, ослов, кошек или собак) или приматов,включая шимпанзе и человека. Особенно предпочтительно, чтобы пациент был человеком. В соответствии с Американской коллегией специалистов в области торакальной медицины и Общества интенсивной терапии (American College of Chest Physicians and the Society of Critical Care Medicine)(Bone R.C. et al. (1992). "Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. - Определения, применяющиеся при сепсисе и органной недостаточности, и руководство к применению инновационных методов лечения при сепсисе. The ACCP/SCCM Consensus ConferenceCommittee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine". Chest 101 (6): 1644-55),существуют различные уровни сепсиса. Синдром системной воспалительной реакции (ССВР): определяется присутствием двух или более следующих симптомов: Температура тела 36 С (97F) или 38 С (100F) (гипотермия или жар). Пульс 100 ударов в минуту (тахикардия). Частота дыхания 20 вдохов в минуту или по содержанию газа в крови, парциальное давление (Ра) СО 2 менее 32 мм рт.ст. (4,3 кПа) (учащенное дыхание или гипокапния в связи с гипервентиляцией). Количество лейкоцитов 4000 клеток/мм 3 или 12000 клеток/мм 3 ( 4109 или 12109 клеток/л) или более чем 10% палочкоядерных нейтрофильных лейкоцитов (незрелые лейкоциты), (лейкопения, лейкоцитоз или сдвиг лейкоцитарной формулы влево). Сепсис: определяется как ССВР на подтвержденный инфекционный процесс. Инфекция может предполагаться или быть подтверждена (анализом культуры, окрашиванием или полимеразной цепной реакцией (ПЦР или имеется клинический синдром, характерный для инфекции. Специфические доказательства наличия инфекции включают присутствие лейкоцитов в обычно стерильной жидкости (такой как моча или в спинномозговая жидкость (СМЖ, признак повреждения внутреннего органа (обнаружение свободного воздуха в брюшной полости при рентгеновском исследовании или КТ, симптомы острого перитонита), аномальная рентгенограмма грудной клетки (РГК), соответствующая воспалению легких (с фокальным затемнением), или петехиальное кровоизлияние, пурпура или молниеносная пурпура. Тяжелый сепсис: определяется как сепсис с органной недостаточностью, гипоперфузией или гипотензией. Септический шок: определяется как сепсис с рефрактерной артериальной гипотензией или аномальной гипоперфузией вместо адекватной регидратации. Признаками системной гипоперфузии могут быть как дисфункция органов-мишеней или уровень сывороточного лактата свыше 4 ммоль/дл. Другие признаки включают олигурию и изменение психического статуса. Пациентам ставится диагноз септический шок, если у них имеется сепсис в сочетании с гипотензией после агрессивной регидратации (как правило, свыше 6 л или кристаллоидные растворы в дозе 40 мл/кг массы тела больного). Понятие "опухоль" обозначает группу аномальных клеток или ткань, которая растет за счет быстрой не поддающейся контролю клеточной пролиферации и продолжает свой рост после воздействий,которые инициировали прекращение нового роста. Опухоли демонстрируют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно образуют отличающуюся тканевую массу, которая может быть как добро-, так и злокачественной. Понятие "метастаз" обозначает распространение раковых клеток из места их возникновения в другую часть тела. Образование метастазов является чрезвычайно сложным процессом и зависит от отделения злокачественных клеток из первичной опухоли, инвазии во внеклеточный матрикс, проникновения через базальные мембраны эндотелия, чтобы попасть в органы и сосуды организма, а затем после переноса кровью поразить органы-мишени. Наконец, рост новой опухоли в месте назначения зависит от ангиогенеза. Опухолевые метастазы появляются часто даже после удаления первичной опухоли, так как опухолевые клетки или их компоненты могут остаться в организме и сделать возможным развитие метастазов. В одном варианте осуществления понятие "метастаз" в соответствии с изобретением относится к понятию "отдаленный метастаз", который относится к метастазу, который удален от первичной опухоли и системы региональных лимфатических узлов. В контексте данного описания понятия "лечить", "лечебный" и "лечение" заболевания или нарушения означают осуществление одного из следующих действий: (а) снижение тяжести и/или продолжительности нарушения; (b) ограничение или предупреждение развития симптомов, характерных для нарушения(й), подвергающегося(ихся) лечению; (с) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для нарушения(й), подвергающегося(ихся) лечению; (d) ограничение или предупреждение рецидива нарушения(й) у пациентов, имевших прежде это(и) нарушение(я); и (е) ограничение или предупреждение рецидива симптомов у пациентов, у которых наблюдались ранее симптомы этого(их) нарушения(й). В контексте данного описания понятия "предупреждать", "предупреждающий" и "предупреждение" или "профилактика" заболевания или нарушения означают предупреждение появления нарушения у субъекта. В контексте данного описания понятие "введение" включает введение in vivo , a также непосредственное введение в ткань ex vivo, такоекак венозный трансплантат."Эффективное количество" является количеством терапевтического средства, достаточным для достижения поставленной цели. Эффективное количество данного терапевтического средства будет различным в зависимости от таких факторов, как природа средства, способ введения, размер и вид животного,которому должно вводиться терапевтическое средство, и цель введения. Эффективное количество в каждом отдельном случае будет определяться эмпирическим путем опытным специалистом в соответствии с установленными методами данной области."Фармацевтически приемлемый" означает одобренный регуляторными органами Федерального правительства или правительства штата или приводимый в перечне Фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для использования на животных и, более конкретно, на человеке. Понятие "носитель" в контексте настоящего описания относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или наполнителю, с которым вводится терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как физиологический раствор в воде или масле, включая те, что имеют нефтяное, животное, овощное или синтетическое происхождение,такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Физиологический раствор является предпочтительным носителем, если фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Физиологические растворы и водные растворы глюкозы и глицерина могут быть также применены в качестве водных носителей, в частности для введения путем инъекции. Подходящие вспомогательные вещества фармацевтического назначения включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин,солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция при желании может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих веществ или буферные добавки. Такие композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, гранул,капсул, порошков, составов пролонгированного действия и т.п. Композиция может быть переведена в лекарственную форму в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями,такими как триглицериды. Соединения, предлагаемые в изобретении, могут переведены в нейтральную или солевую лекарственную форму. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные свободными аминогруппами и кислотами: соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной и т.д., а также соли, образованные свободными карбоксильными группами и гидроксидами натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описываются в работе "Remington's Pharmaceutical Sciences" под авторством Martin Е.W. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения предпочтительно в очищенной форме вместе с подходящим количеством носителя, так чтобы обеспечивалось надлежащее введение пациенту. Лекарственная форма должна соответствовать способу введения. Общеизвестные и практикуемые способы в области молекулярной биологии, клеточной биологии,химии белков и способы получения антител полностью описаны в постоянно обновляемых публикацияхal., Curr. Opin., Biotechnol. 8: 148, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991); and "Suspension Culture of Mammalian Cells" (Birch et al. Bioprocess Technol. 19: 251, 1990). Варианты осуществления изобретения Ниже последует подробное описание настоящего изобретения. Далее различные аспекты настоящего изобретения получат более подробное определение. Каждый аспект, определенный таким образом,может комбинироваться с любым другим аспектом или аспектами, если отчетливо не указано иное. В частности, любой признак, охарактеризованный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, охарактеризованными как предпочтительные или преимущественные. В первом аспекте настоящее изобретение относится к связывающему элементу, который связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностямиI. Другими словами, связывающий элемент в соответствии с первым аспектом изобретения связывается одновременно как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 18, так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 19.SEQ ID NO: 18 является консенсусной последовательностью при сравнении аминокислот 30-38 человеческого антигена С 5 а с соответствующими аминокислотными последовательностями видов Pan troglodytes, Macaca mulatto, Sus scrofa, Equus caballus, Bos Taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis lupus и Monodelphis domestica. SEQ ID NO: 19 является консенсусной последовательностью, определенной при сравнении аминокислот 66-72 человеческого антигена С 5 а с соответствующими аминокислотными последовательностями видов Pan troglodytes, Macaca mulatto, Sus scrofa, Equus caballus, Bos Taurus, Musmusculus, Rattus norvegicus, Canis lupus и Monodelphis domestica. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности X2ETCEX3R (SEQ IDNO: 20), где Х 2 и X3 определены выше. SEQ ID NO: 20 является более короткой версией консенсусной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 18 и соответствует аминокислотам 31-37 человеческого С 5 а. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности X6KX7X8X9 (SEQ IDNO: 21), предпочтительно KX7X8, где Х 6, Х 7, X8, и X9 определены выше. SEQ ID NO: 21 является более короткой версией консенсусной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 19 и соответствует аминокислотам 67-71 человеческого С 5 а. KX7X8 является более короткой версией консенсусной последовательности в соответствии SEQ ID NO: 21 и соответствует аминокислотам 68-70 человеческого С 5 а. В особенно предпочтительных вариантах осуществления связывающий элемент связывается одновременно как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательностиX2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20), так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности KX7 X8, где X2, Х 3, Х 7 и X8 определены выше. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта конформационный эпитоп образован (а) аминокислотными последовательностями NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) и SHKDMQL (SEQ IDID NO: 34) и SNKPLQL (SEQ ID NO: 35) фрагмента С 5 а (последовательности вида Canis lupus); или (i) аминокислотными последовательностями THETCEKRL (SEQ ID NO: 36) и NHKPVTL (SEQ ID NO: 37) фрагмента С 5 а (последовательности вида Monodelphis domestica). В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из (a) DETCEQR (SEQ ID NO: 4); (b) DETCEER (SEQ ID NO: 38); (c) LETCEQR (SEQ IDNO: 39); (e) YETCEER (SEQ ID NO: 40); (f) YETCEQR (SEQ ID NO: 41) и (g) HETCEKR (SEQ ID NO: 42). В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из (a) HKDMQ (SEQ ID NO: 5), предпочтительно KDM; (b) HKDLQ (SEQ ID NO: 43),предпочтительно KDL; (с) HKNIQ (SEQ ID NO: 44), предпочтительно KM; (d) HKHIQ (SEQ ID NO: 45),предпочтительно KHI; (e) HKNMQ (SEQ ID NO: 46), предпочтительно KNM; (f) HKPVQ (SEQ ID NO: 47), предпочтительно KPV; (g) HKGML (SEQ ID NO: 48), предпочтительно KGM; (h) NKPLQ (SEQ IDNO: 49), предпочтительно KPL; и (i) HKPVI (SEQ ID NO: 50), предпочтительно KPV. В особенно предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта С 5 а является человеческим С 5 а. Таким образом, предпочтительно, если связывающий элемент связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотами NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) и SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) человеческого С 5 а. Другими словами, связывающий элемент в соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления первого аспекта связывается одновременно как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии сSEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 2 соответствует аминокислотам 30-38 человеческого С 5 а. SEQ ID NO: 3 соответствует аминокислотам 66-72 человеческого С 5 а. Аминокислотная последовательность человеческого С 5 а представлена в SEQ ID NO: 1. В более предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной из аминокислот DETCEQR (SEQ ID NO: 4).SEQ ID NO: 4 соответствует аминокислотам 31-37 человеческого С 5 а. В более предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент связывается по меньшей мере с одной из аминокислот HKDMQ (SEQ ID NO: 5), более предпочтительно по меньшей мере с одной из аминокислотKDM. SEQ ID NO: 5 соответствует аминокислотам 67-71 человеческого С 5 а; последовательность KDM соответствует аминокислотам 68-70 человеческого С 5 а. В особенно предпочтительных вариантах осуществления связывающий элемент связывается одновременно как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности DETCEQR (SEQ ID NO: 4), так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности KDM. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта две последовательности, образую- 14022759 щие конформационный эпитоп (например, пары последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 18 и 19; SEQ ID NO: 2 и 3; SEQ ID NO: 22 и 23; SEQ ID NO: 24 и 25; SEQ ID NO: 26 и 27; SEQ ID NO: 28 и 29;SEQ ID NO: 30 и 31; SEQ ID NO: 32 и 33; SEQ ID NO: 34 и 35; SEQ ID NO: 36 и 37), разделены 1-50 смежными аминокислотами, которые не участвуют в связывании со связывающим элементом, предложенным в изобретении. В дальнейшем такие аминокислоты, которые не участвуют в связывании со связывающим элементом, предложенным в изобретении, будут называться "не участвующие в связывании аминокислоты". Две последовательности, образующие конформационный эпитоп, предпочтительно разделены 6-45 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами, более предпочтительно 12-40 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами, более предпочтительно 18-35 смежными,не участвующими в связывании аминокислотами, более предпочтительно 24-30 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами, более предпочтительно 25-29 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами, еще более предпочтительно 26-28 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами, и наиболее предпочтительно 27 смежными, не участвующими в связывании аминокислотами. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта связывающий элемент имеет константу связывания с С 5 а, предпочтительно человеческим С 5 а, со значением Kd, равным 10 нМ или меньше, предпочтительно 9 нМ или меньше, более предпочтительно 8 нМ или меньше, более предпочтительно 7 нМ или меньше, более предпочтительно 6 нМ или меньше, более предпочтительно 5 нМ или меньше, более предпочтительно 4 нМ или меньше, более предпочтительно 3 нМ или меньше, более предпочтительно 2 нМ или меньше и еще более предпочтительно 1 нМ или меньше. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта один связывающий элемент проявляет по меньшей мере 75% блокирующей активности, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующей активности по отношению к биологическим эффектам, вызванным одной молекулой С 5 а, предпочтительно человеческого С 5 а. Данная предпочтительная блокирующая активность относится к тем вариантам осуществления изобретения, в которых связывающий элемент включает один паратоп, связывающийся с С 5 а, предпочтительно человеческим С 5 а. В вариантах осуществления, в которых связывающий элемент включает два или более С 5 а-специфических паратопа, указанная блокирующая активность, составляющая по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и т.д., достигается, когда одна молекула связывающего элемента контактирует с числом молекул С 5 а, равным числу С 5 а-специфических паратопов, присутствующих в связывающем элементе. Другими словами, когда паратопы связывающего элемента в соответствии с первым аспектом и С 5 а представлены в эквимолярных концентрациях, связывающий элемент в соответствии с первым аспектом изобретения проявляет по меньшей мере 75% блокирующей активности, предпочтительно по меньшей мере 80% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующей активности,более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующей активности и более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующей активности по отношению к биологическим эффектам, вызванным С 5 а. Предпочтительным биологическим эффектом, подвергаемым блокировке, является вызванное С 5 а высвобождение лизоцима из клеток цельной крови человека. Методы определения этой секреции лизоцима, вызванной С 5 а, и ее блокировки описываются в разделе примеров. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент не ингибирует активность СН 50 в человеческой плазме. Анализы для определения активности СН 50 известны специалисту данной области и описываются в разделе примеров. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент не проявляет блокирующую активность по отношению по меньшей мере к одному биологическому эффекту, вызванному С 5b, предпочтительно, если связывающий элемент не проявляет блокирующую активность по отношению ни к одному биологическому эффекту, вызванному С 5b. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент способен снизить вызванную Е. coli выработку ИЛ-8 клетками цельной крови человека. Анализы для измерения выработки ИЛ-8 клетками цельной крови известны специалисту данной области и будут описаны ниже в разделе примеров. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент выбирается из: (а) антител или их антигенсвязывающих фрагментов; (b) олигонуклеотидов; (с) антителоподобных белков или (d) пептидомиметиков. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем указанное антитело выбирается из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, моновалентных антител,биспецифических антител, гетероконъюгата антител, мультиспецифических антител, деиммунизированных антител, химерных антител, гуманизированных (в частности, методом трансплантации CDR) антител и человеческих антител. В предпочтительных вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является антигенсвязывающим фрагментом антитела, причем указанный фрагмент выбирается из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fab'-фрагментов, F(ab')2-фрагментов, Fd-фрагментов, Fv-фрагментов,фрагментов Fvs с дисульфидной связью (dsFv), однодоменных антител (известных также как нанотела) и одноцепочечных антител Fv (scFv). В особенно предпочтительном варианте осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, включающим (i) последовательность тяжелой цепи CDR3, представленную в SEQ ID NO: 6; или (ii) последовательность тяжелой цепиCDR3, представленную в SEQ ID NO: 7; где последовательность тяжелой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены,1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если антитело или его фрагмент дополнительно включает: (i) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 8; или (ii) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 9; где последовательность легкой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если антитело или его фрагмент дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих последовательностей: (i) последовательность тяжелой цепи CDR2 в соответствии с SEQID NO: 10; (ii) последовательность тяжелой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 11; (iii) последовательность легкой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 12; (iv) последовательность легкой цепиCDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 13; (v) последовательность тяжелой цепи CDR1 в соответствии сSEQ ID NO: 14; (vi) последовательность тяжелой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 15; (vii) последовательность легкой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 16; или (viii) последовательность легкой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 17; где последовательность тяжелой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность легкой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность тяжелой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность легкой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в каждой из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQID NO: 17, т.е. общее число замен, делеций и инсерций в каждой последовательности составляет 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является олигонуклеотидом. В этих вариантах осуществления дополнительно предпочтительно, чтобы олигонуклеотид являлся аптамером нуклеиновой кислоты, таким как аптамер ДНК, или аптамер РНК, или смешанным аптамером, включающим нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления один или более нуклеотидов могут быть замещены модифицированными нуклеотидами, такими как 2'фторзамещенные пиримидины. Аптамеры нуклеиновых кислот могут быть также конъюгированы с флуоресцентными молекулами-репортерами, метками аффинности и/или макромолекулами. Например,конъюгация аптамера с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или со сравнимой макромолекулой увеличит время биологической полужизни аптамера. В некоторых вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является антителоподобным белком, например антителоподобным белком, как это было пояснено выше в разделе "определения". В некоторых вариантах осуществления первого аспекта изобретения связывающий элемент является пептидомиметиком. Пептидомиметики, подходящие для практического осуществления настоящего изобретения, предпочтительно являются производными антителоподобных белков, описанных выше. Предпочтительный вариант осуществления первого аспекта относится к связывающему элементу для профилактики или лечения различных заболеваний, охватывающих острые воспалительные процессы, такие как синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок, ишемия/реперфузионные повреждения, такие как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких, острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции "трансплантат против хозяина", но и также заболевания, охватывающие хронические виды воспалительных процессов, такие как гломерулярные заболевания почек, например гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки, воспаления кишечника,болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему (i) последовательность тяжелой цепи CDR3, представленную в SEQ ID NO: 6; или (ii) последовательность тяжелой цепи CDR3, представленную в SEQ ID NO: 7; где последовательность тяжелой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает: (i) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ IDNO: 8; или (ii) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 9; где последовательность легкой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. Второй аспект настоящего изобретения относится также к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему: (i) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 8; или(ii) последовательность легкой цепи CDR3, изложенную в SEQ ID NO: 9; где последовательность легкой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, т.е. общее число замен, делеций или инсерций составляет 1 или 2. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере одну из последующих последовательностей: (i) последовательность тяжелой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 10; (ii) последовательность тяжелой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 11; (iii) последовательность легкой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 12; (iv) последовательность легкой цепи CDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 13; (v) последовательность тяжелой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 14; (vi) последовательность тяжелой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 15; (vii) последовательность легкой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 16; (viii) последовательность легкой цепи CDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 17; где последовательность тяжелой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены,предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1,2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность легкой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность тяжелой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где последовательность легкой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Предпочтительно, если общее число данных необязательных изменений в каждой из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, т.е. общее число замен, делеций и инсерций в каждой последовательности составляет 1 или 2. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело выбирается из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, моновалентных антител,биспецифических антител, гетероконъюгата антител, мультиспецифических антител, деиммунизированных антител, химерных антител, гуманизированных (в частности, методом трансплантации CDR) антител и человеческих антител. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антигенсвязывающий фрагмент антитела выбирается из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fab'-фрагментов, F(ab')2 фрагментов, Fd-фрагментов, Fv-фрагментов, фрагментов Fvs с дисульфидной связью (dsFv), однодоменных антител (известных также как нанотела) и одноцепочечных антител Fv. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностями X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) или X5X6KX7X8X9L (SEQ ID NO: 19) C5a, гдеV; и Х 9 выбирается из группы, состоящей из Q, L и I. Другими словами, антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии со вторым аспектом одновременно связывается как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 18, так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствииSEQ ID NO: 19. Предпочтительно, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20), где Х 2 и Х 3 определены выше. Предпочтительно, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательностиX6KX7X8X9 (SEQ ID NO: 21), более предпочтительно KX7X8, где Х 6, X7, Х 8 и X9 определены выше. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент одновременно связывается как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20), так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности KX7X8, где Х 2, Х 3, Х 7 и X8 определены выше. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения конформационный эпитоп образован (а) аминокислотными последовательностями NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) иNHKPVIL (SEQ ID NO: 37) фрагмента С 5 а (последовательности вида Monodelphis domestica). В более предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (а) DETCEQR (SEQ ID NO: 4); (b) DETCEER (SEQ IDNO: 38); (с) LETCEQR (SEQ ID NO: 39); (е) YETCEER (SEQ ID NO: 40); (f) YETCEQR (SEQ ID NO: 41); и (g) HETCEKR (SEQ ID NO: 42). В еще более предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (a)KPV; (g) HKGML (SEQ ID NO: 48), предпочтительно KGM; (h) NKPLQ (SEQ ID NO: 49), предпочтительно KPL; и (i) HKPVI (SEQ ID NO: 50), предпочтительно KPV. В особенно предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта С 5 а является человеческим С 5 а. Таким образом, предпочтительно, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотами NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) иSHKDMQL (SEQ ID NO: 3) человеческого С 5 а. Другими словами, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с этим предпочтительным вариантом осуществления второго аспекта одновременно связывается как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2, так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 3. В более предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности DETCEQR (SEQID NO: 4). В более предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности HKDMQ (SEQ ID NO: 5), более предпочтительно по меньшей мере с одной аминокислотой из аминокислотной последовательности KDM. В особенно предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент одновременно связывается как по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательности DETCEQR (SEQ IDNO: 4), так и по меньшей мере с одной аминокислотой внутри аминокислотной последовательностиKDM. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет константу связывания с С 5 а, предпочтительно человеческим С 5 а, со значением Kd, равным 10 нМ или меньше, предпочтительно 9 нМ или меньше, более предпочтительно 8 нМ или меньше, более предпочтительно 7 нМ или меньше, более предпочтительно 6 нМ или меньше,более предпочтительно 5 нМ или меньше, более предпочтительно 4 нМ или меньше, более предпочтительно 3 нМ или меньше, более предпочтительно 2 нМ или меньше и еще более предпочтительно 1 нМ или меньше. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент проявляет по меньшей мере 75% блокирующей активности, предпочтительно по меньшей мере 80% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующей активности по отношению к биологическим эффектам,вызванным молекулой С 5 а, предпочтительно человеческого С 5 а. Данные значения предпочтительной блокирующей активности относятся к тем вариантам осуществления, где антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) включает один паратоп, связывающийся с С 5 а, предпочтительно человеческим С 5 а. В вариантах осуществления, где антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) включает два или более С 5 а-специфических паратопа, указанные показатели блокирующей активности, составляющей по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и т. д., достигаются, когда одна молекула связывающего элемента вступает в контакт с числом молекул С 5 а, равным числу С 5 а-специфических паратопов, присутствующих в антителе (или его антигенсвязывающем фрагменте). Например, обычное антитело к С 5 а класса IgG включает два паратопа, способных связываться с С 5 а, тогда как обычное антитело к С 5 а класса IgM включает десять паратопов,способных связываться с С 5 а. Таким образом, блокирующую активность антитела класса IgG следует определять посредством приведения в контакт указанного антитела с С 5 а в молярном соотношении 1:2. Блокирующую активность антитела класса IgM следует определять посредством приведения в контакт указанного антитела с С 5 а в молярном соотношении 1:10. При выборе данных молярных соотношений паратопы антитела и С 5 а представлены в эквимолярных концентрациях. Другими словами, когда паратопы антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) в соответствии со вторым аспектом и С 5 а присутствуют в эквимолярных концентрациях, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент проявляет по меньшей мере 75% блокирующей активности, предпочтительно по меньшей мере 80% блокирующей активности, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующей активности,более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующей активности и более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующей активности по отношению к биологическим эффектам, вызванным С 5 а. Предпочтительным биологическим эффектом, подвергаемым блокировке, является вызванное С 5 а высвобождение лизоцима из клеток цельной крови человека. Методы определения этой секреции лизоцима, вызванной С 5 а, и ее блокировки описываются в разделе примеров. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не ингибирует активность CH50 в человеческой плазме. Анализы для определения активности CH50 известны специалисту данной области и описываются в разделе примеров. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не проявляет блокирующей активности по отношению по меньшей мере к одному биологическому эффекту, вызванному С 5b, предпочтительно, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не проявляет блокирующей активности по отношению ни к одному биологическому эффекту, вызванному С 5b. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способен снизить вызванную Е. coli выработку ИЛ-8 в цельной крови человека. Анализы для измерения выработки ИЛ-8 в цельной крови известны специалисту данной области и будут описаны ниже в разделе примеров. Предпочтительный вариант осуществления второго аспекта относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту для предупреждения или лечения различных заболеваний, охватывающих острые воспалительные процессы, такие как синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис,тяжелый сепсис, септический шок, ишемия/реперфузионные повреждения, такие как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких, острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции "трансплантат против хозяина", но также заболевания, охватывающие хронические виды воспалительных процессов, такие как гломерулярные заболевания почек, такие как гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки,воспаления кишечника, болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов. В предпочтительных вариантах осуществления второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает один из наборов последовательностей тяжелой цепи CDR3, тяжелой цепи CDR2 и тяжелой цепи CDR1, как они приводятся в табл. 1, где каждая последовательность тяжелой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность тяжелой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 ами- 19022759 нокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; и где каждая последовательность тяжелой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Таблица 1. Наборы последовательностей тяжелой цепи CDR, пригодные для применения в антителах и их фрагментах, предложенных в настоящем изобретении В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает один из следующих наборов последовательностей легкой цепи CDR3, легкой цепи CDR2 и легкой цепи CDR1, как они приводятся в табл. 2, где каждая последовательность легкой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность легкой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; и где каждая последовательность легкой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. Так как последовательность легкой цепи CDR2 антитела INab308 (SEQ ID NO: 12) идентична последовательности легкой цепи CDR2 антитела INab708 (SEQ ID NO: 13), то наборы последовательностей, включающие SEQ ID NO: 13, будут избыточными по отношению к наборам последовательностей,включающим SEQ ID NO: 12. Поэтому в табл. 2 приводятся только четыре набора последовательностей легкой цепи CDR. Таблица 2. Наборы последовательностей легкой цепи CDR, пригодные для применения в антителах и их фрагментах, предложенных в настоящем изобретении В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает один из наборов А-Н последовательностей тяжелой цепи CDR, как они приводятся в табл. 1, и один из наборов I-IV последовательностей легкой цепи CDR,как они приводятся в табл. 2, т.е. одну из следующих комбинаций наборов: A-I, А-II, А-III, A-IV, B-I, ВII, В-III, B-IV, C-I, С-II, С-III, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, Е-II, Е-III, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, GII, G-III, G-IV, H-I, Н-II, Н-III или H-IV, где каждая последовательность тяжелой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2, или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность тяжелой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность тяжелой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность легкой цепи CDR3 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; где каждая последовательность легкой цепи CDR2 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции; и где каждая последовательность легкой цепи CDR1 необязательно включает 1, 2 или 3 аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, 1, 2 или 3 аминокислотные делеции и/или 1, 2 или 3 аминокислотные инсерции. В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает домен VH, который включает, по существу состоит из или состоит из (i) домена VH антитела INab308 или (ii) домена VH антитела INab708.INab308 и INab708, представлены в табл. 4. В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает домен VL, который включает, по существу состоит из или состоит из (i) домена VL антитела INab308 или (ii) домена VH антитела INab708. Последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, определяющие домены VL антителINab308 и INab708, представлены в табл. 4. В других предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает домен VH и домен VL, где(i) указанный домен VH включает, по существу состоит из или состоит из домена VH антителаINab308 и указанный домен VL включает, по существу состоит из или состоит из домена VL антитела(ii) указанный домен VH включает, по существу состоит из или состоит из домена VH антителаINab708 и указанный домен VL включает, по существу состоит из или состоит из домена VL антителаINab708. В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго аспекта изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий один или более вариабельных участков CDR, набор участков CDR или комбинацию наборов участков CDR, описываемых в настоящем изобретении, содержит указанные участки CDR в каркасном участке человеческого антитела. Здесь дается ссылка на антитело, включающее в отношении его тяжелой цепи конкретную цепь или конкретный участок или последовательность, и предпочтительно относится к ситуации, где все тяжелые цепи указанного антитела включают указанную конкретную цепь, участок или последовательность. Это применимо соответственно к легкой цепи антитела. Идеи, предлагаемые в данном изобретении, в отношении конкретных нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей, например, представленных в списке последовательностей, должны истолковываться как идеи, относящиеся также к модификациям указанных конкретных последовательностей с получением последовательностей, которые функционально эквивалентны указанным конкретным последовательностям, например аминокислотным последовательностям, проявляющим идентичные или подобные свойства в сравнении с теми конкретными аминокислотными последовательностями и последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, проявляющие идентичные или подобные свойства в сравнении с теми из аминокислотных последовательностей, которые кодируются конкретными последовательностями нуклеиновых кислот. Важным свойством при этом является сохранение способности антитела связываться с его мишенью или поддержание эффекторных функций антитела. Предпочтительна последовательность, модифицированная по отношению к конкретной последовательности; когда она замещает конкретную последовательность, при которой сохраняется способность указанного антитела связываться с С 5 а, в частности с конформационным эпитопом С 5 а, идентифицированным в настоящем описании, и предпочтительно сохраняются функции указанного антитела в соответствии с настоящим описанием, например блокировка высвобождения лизоцима, вызванного С 5 а, из клеток цельной крови человека и/или снижение вызванной Е. coli выработки ИЛ-8 в цельной крови человека. Специалисту данной области будет понятно, что, в частности, последовательности CDR, гипервариабельных и вариабельных участков могут быть модифицированы без потери способности связываться с С 5 а. Например, участки CDR могут быть как идентичными, так и высоко гомологичными по отношению к участкам, указанным в данном изобретении. Под понятием "высоко гомологичных" понимается возможность проведения от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, также как от 1 до 3 или 1 или 2 замен, делеций или инсерций на участках CDR. Кроме того, гипервариабельные и вариабельные участки могут быть модифицированы, так чтобы они проявляли существенную гомологию по отношению к участкам,конкретно раскрытым в данном описании. Более того, в соответствии с настоящим изобретением желательной может быть модификация аминокислотных последовательностей, описываемых в данном изобретении, в частности тех константных областей тяжелой цепи человека, чтобы привести последовательность в соответствие с желаемым аллотипом, например аллотипом, встречающимся у европеоидного населения. Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, в которых были произведены изменения в Fc-участке в целях изменения функциональных и фармакокинетических свойств антител. Такие изменения могут привести к снижению или повышению связывания с компонентом Clq и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) или связывания с рецептором FcR и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Замены, например, могут быть сделаны в одном или более аминокислотном остатке константной области тяжелой цепи, тем самым приводя к изменению эффекторной функции,тогда как способность связывания с антигеном в сравнении с модифицированным антителом сохраняется, см. патент США 5624821 и 5648260. Время полужизни антител in vivo может быть увеличено с помощью модификации рецептора ре- 21022759 утилизации константного домена Ig или Ig-подобного константного домена, так что молекула не будет включать интактный домен СН 2 или интактный Fc-участок Ig, см. патент США 6121022 и патент США 6194551. Время полужизни in vivo может быть дополнительно увеличено путем введения мутаций в Fc-участок, например, посредством замены треонина на лейцин в позиции 252, посредством замены треонина на серин в позиции 254 или посредством замены треонина на фенилаланин в позиции 256,см. патент США 6277375. Более того, картина гликозилирования антител может быть модифицирована в целях изменения эффекторной функции антител. Например, антитела могут быть экспрессированы в тансфектому, которая не добавляет фукозный остаток, обычно связанный с Asn в позиции 297 Fc-участка, в целях усиления аффинности Fc-участка для рецепторов Fc, что, в свою очередь, приведет к увеличению АЗКЦ в присутствии NK-клеток, см. Shield и соавт. (2002) JBC, 277: 26733. Более того, в целях модификации КЗЦ может быть произведена модификация галактозилирования. Альтернативно, в другом варианте осуществления вдоль всей кодирующей последовательности антитела к С 5 а или ее части могут быть введены случайные мутации, таким способом, как насыщающий мутагенез, и полученные в результате антитела к С 5 а могут быть подвергнуты скринингу на активность связывания. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей (а) связывающий элемент в соответствии с первым аспектом или (b) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии со вторым аспектом и дополнительно включающей один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, вспомогательных веществ, наполнителей,вяжущих веществ, смазывающих веществ, скользящих веществ, разрыхлителей, адсорбентов и/или консервантов. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению (а) связывающего элемента в соответствии с первым аспектом или (b) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии со вторым аспектом для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения различных заболеваний, охватывающих острые воспалительные процессы, такие как синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок, ишемия/реперфузионные повреждения, такие как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких,острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции"трансплантат против хозяина", но и также заболевания, охватывающие хронические виды воспалительных процессов, такие как гломерулярные заболевания почек, такие как гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки, воспаления кишечника, болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов. В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения различных заболеваний, охватывающих острые воспалительные процессы, такие как синдром системной воспалительной реакции (ССВР), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок, ишемия/реперфузионные повреждения, такие как ишемическая болезнь сердца, острые повреждения легких, воспаление легких, острое и хроническое отторжение трансплантата у пациентов, перенесших трансплантацию, реакции "трансплантат против хозяина", но и также заболевания, охватывающие хронические виды воспалительных процессов, такие как гломерулярные заболевания почек, такие как гломерулонефрит и другие виды почечной недостаточности, ревматоидный артрит и подобные аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Бехтерева, заболевания типа волчанки, воспаления кишечника, болезнь Крона, рост опухоли или солидный рак органов у пациента, нуждающегося в нем; способ включает введение пациенту эффективного количества (а) связывающего элемента в соответствии с первым аспектом или (b) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии со вторым аспектом. При практическом осуществлении любого аспекта настоящего изобретения фармацевтическую композицию, описанную выше, или связывающий элемент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) можно вводить пациенту любым способом, утвердившимся в данной области, который обеспечивает достаточный уровень связывающего элемента в организме пациента. Введение может быть системным или локальным. Такое введение может быть парентеральным, трансмукозальным, например оральным, назальным, ректальным, внутривагинальным, сублингвальным, субмукозальным,трансдермальным или производиться с помощью ингаляции. Предпочтительно, если введение производится парентерально, например посредством внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, а также включая без ограничения внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение. Если фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится локально, то инъекция может быть произведена в орган или ткань, требующие лечения, например в орган, пораженный опухолью. Фармацевтические композиции, приспособленные для орального введения, могут быть предложены в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных растворах); в виде съедобной пены или соломки; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут включать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или ее соли. Мягкие желатино- 22022759 вые капсулы могут включать растительные масла, воск, животные жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут включать воду, полиолы и сахара. Активное вещество, предназначенное для орального введения, может быть покрыто или иметь примесь материала, который задерживает разрушение и/или всасывание активного вещества в желудочнокишечном тракте (например, могут быть использованы моностеарат глицерина или дистеарат глицерина). Таким образом, может быть достигнуто пролонгированное высвобождение активного вещества в течение многих часов и, при необходимости, активное вещество может быть защищено от распада внутри желудка. Фармацевтические композиции для орального введения могут быть переведены в лекарственную форму таким образом, чтобы упростить высвобождение активного вещества в конкретном месте желудочно-кишечного тракта в связи со специфическим уровнем рН или ферментативных условий. Фармацевтические композиции, приспособленные для трансдермального введения, могут быть предложены в виде пластырей, предназначенных для пребывания в непосредственном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения, могут быть предложены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов,порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Мазь или крем для местного введения предпочтительно используются для местного применения на коже, во рту, в глазах или других внешних тканях. Если лекарственной формой является мазь, то активное вещество может использоваться с парафиновой или смешиваемой с водой мазевой основой. Альтернативно активное вещество может иметь лекарственную форму крема с основой типа "масло в воде" или "вода в масле". Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения в глаза, включают глазные капли. В этих композициях активное вещество может быть растворено или суспендировано в подходящем носителе, например в водном растворителе. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения в рот,включают леденцы, пастилки и полоскания для рта. Фармацевтические композиции, приспособленные для назального введения, могут включать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно имеющие размер частиц в диапазоне от 20 до 500 мкм). Порошки могут вводиться таким же способом, как и лекарственный порошок для вдыхания через нос, т.е. посредством быстрого вдыхания через нос из емкости с порошком, расположенной близко к носу. Альтернативно композиции, приспособленные для назального введения, могут включать жидкостные носители, например спреи или капли в нос. Эти композиции могут включать водные или масляные растворы активного вещества. Композиции для введения посредством ингаляции могут поставляться в специально подготовленных приспособлениях, включая, но без ограничения, герметичные аэрозоли, распылители или инсуффляторы, которые могут быть изготовлены так, чтобы обеспечить введение определенных заранее доз активного вещества. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции по изобретению вводят через слизистую оболочку носа в легкие. Фармацевтические композиции, приспособленные для ректального введения, могут быть предложены в виде свечей или клизм. Фармацевтические композиции, приспособленные для вагинального введения, могут быть предложены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, составов в виде пенок или спреев. Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения, могут включать водные и неводные стерильные растворы или суспензии для введения инъекцией, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают составы, по существу, изотоничными крови реципиентов, которым они назначены. В таких композициях могут присутствовать другие компоненты, включая, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции, приспособленные для парентерального введения, могут быть представлены в емкостях, содержащих однократную или многократную дозу, например в запаянных ампулах или запечатанных флаконах, и могут храниться в лиофилизированной форме, в которую требуется лишь добавление стерильного жидкого носителя, например стерильного физиологического раствора для инъекций, непосредственно перед применением. Экстемпоральные растворы и суспензии для инъекций могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток. В предпочтительном варианте осуществления композиция переведена в лекарственную форму в соответствии с рутинными процедурами для фармацевтической композиции, приспособленной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном водном изотоническом буфере. Там, где это необходимо, композиция может включать солюбилизатор и средство для местного обезболивания, такое как лидокаин, для снятия боли в месте инъекции. В целом, ингредиенты поставляются как в отдельности, так и в виде смесей, в форме единиц дозирования, например, в виде лиофилизированного порошка или обезвоженного концентрата в герметично запечатанной емкости, такой как ампула или саше с указанием количества активного вещества. Если композиция должна вводиться путем вливания, она может быть растворена в бутыли для вливаний, содержащей воду фармацевтической степени стерильности или физиологический раствор. Если композиция должна вводиться путем инъекции, в наборе может быть ампула стерильного физиологического раствора, так чтобы ингредиенты могли быть смешаны до введения. В другом варианте осуществления, например, ингибитор хемоаттракции может быть доставлен в системе контролируемого высвобождения. К примеру, ингибитор может быть введен с помощью внутривенного вливания, вживляемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, лизосом или других видов введения. В одном варианте осуществления может использоваться насос (см. Sefton (1987)Med. 321: 574). В другом варианте осуществления соединение может быть доставлено в везикуле, в частности в липосоме (см. Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; патент США 4704355). В другом варианте осуществления могут быть использованы полимерные материалы (см.Science 228: 190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105). В еще одном варианте осуществления система контролируемого высвобождения может быть расположена в непосредственной близости от терапевтической мишени, т.е. клеток-мишеней, ткани или органа, таким образом, что требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson (1984) 115-138 в Medical Applications of Controlled Release, т. 2). Другие системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзорной работе Langer (1990, Science 249: 1527-1533). В конкретном варианте осуществления желательным может быть введение фармацевтических композиций, предложенных в изобретении, местно на участке, нуждающемся в лечении; это может быть достигнуто, например, и без ограничения, посредством местного вливания во время хирургической операции, местного применения, например, вместе с раневой повязкой после операции, путем инъекции, с помощью катетера, с помощью свечи или имплантата, указанный имплантат является пористым, непористым или желатинообразным материалом, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны или волокна. Выбор предпочтительных эффективных доз может быть произведен опытным специалистом, приняв во внимания несколько факторов, которые известны среднему специалисту данной области. Такие факторы включают конкретную форму фармацевтической композиции, например полипептид или вектор, и ее фармакокинетические параметры, такие как биологическая доступность, метаболизм, время полужизни и т.д., которые устанавливают во время обычных процессов разработки, проводимых, как правило, для получения разрешения применения фармацевтического препарата от регуляторных органов. Дополнительные факторы в отношении определения дозы включают состояние или заболевание, против которого направлена профилактика или лечение, или пользу, которую должен получить здоровый индивид, массу тела пациента, способ введения, является ли введение однократным или многократным, сопутствующие лекарственные препараты и другие факторы, хорошо известные по своему воздействию на эффективность вводимых фармацевтических средств. Таким образом, точную дозировку необходимо устанавливать согласно заключению врача-терапевта и обстоятельств, связанных с каждым отдельным пациентом, например, в зависимости от состояния и статуса иммунной системы отдельного пациента в соответствии со стандартными клиническими методиками. При практическом осуществлении любого аспекта настоящего изобретения в отношении профилактики и/или лечения роста опухоли или солидного рака органов, субъект, которому вводится связывающий элемент или антитело по изобретению, проходит дополнительное лечение химиотерапевтическим средством, лучевой терапией или веществом, которое модулирует, например, усиливает или ингибирует экспрессию или активность Fc-рецептора, например рецептора Fc-, такого как цитокин. Стандартные цитокины для введения во время лечения включают гранулоциты, колониестимулирующий фактор (ГКСФ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон- (IFN) и фактор некроза опухоли (TNF). Стандартные терапевтические вещества включают, помимо прочих,антинеопластические вещества, такие как доксорубицин, цисплатин, таксотер, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабин и циклофосфамид. Приводимые ниже фигуры и примеры служат только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны ни в коем случае толковаться как ограничивающие объем изобретения, как это указано в прилагаемых пунктах формулы изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано воздействие мутантов С 5 а на высвобождение ферментов из клеток крови. Аминокислоты молекул С 5 а, потенциально пригодные для получения эпитопов антител, подвергли мутации до аланина и провели испытания данных мутантов С 5 а на их биологическую активность по индуцированию выхода лизоцима из клеток цельной крови человека. Сайты в С 5 а с мутациями, приводящие к более чем 50% потери биологической активности в сравнении с человеческим С 5 а, рассматривались как критические сайты для биологической функции фрагмента С 5 а. Такими сайтами являются 24,29, 31, 37, 68 и 69. На фиг. 2 показана способность к связыванию молекул INab308 с мутантами С 5 а. С 5 а и мутанты С 5 а помещали в лунки 96-луночного планшета. Способность к связыванию INab308 с этими белками оценивали методом ELISA. Потерю способности к связыванию, составляющую более чем 50%, рассматривали как значительную. Данные указывают на то, что молекула INab308 связывается с двумя участками 31-37 и 68-69. На фиг. 3 показана способность к связыванию молекул INab708 с мутантами С 5 а. С 5 а и мутанты С 5 а помещали в лунки 96-луночного планшета. Способность к связыванию INab708 с этими белками оценивали методом ELISA. Потерю способности к связыванию, составляющую более чем 50%, рассматривали как значительную. Данные указывают на то, что молекула INab708 связывается с двумя участками 31-37 и 68-70. Фиг. 4. INab308 и INab708 не влияют на активность СН 50 в человеческой плазме. Гемолитическую активность в человеческой плазме определяли классическим анализом активности СН 50. Моноклональные антитела к человеческому С 5 а, включая INab708, INab308 и F20, предварительно инкубировали с человеческой плазмой, а затем проводили определение СН 50. Среди этих антител F20 сильно ингибирует активность СН 50, тогда как INab708 и INab308 не имеют никакого влияния, если используются в концентрации прибл. 5 мкМ, которая значительно выше, чем концентрация С 5, встречающаяся в цельной крови человека (прибл. 0,4 мкМ). На фиг. 5 показано сравнение блокирующего воздействия антител INab308, INab708 и L2B23 на биологическую активность С 5 а. Блокирующую активность антител INab308, INab708 и L2B23 оценивали с помощью определения лизоцима, выделившегося под воздействием С 5 а. Молярное соотношение количеств антитела и С 5 а было установлено равным 1:2, чтобы оценить биологический эффект блокирования двух молекул с 5 а одним антителом. Данные показывают, что антитела INab308 и INab708 обладают очень высоким блокирующим действием (90%) по отношению к биологической активности С 5 а, тогда как L2B23 производит лишь минимальное воздействие. На фиг. 6 показано ингибирующее воздействие антител INab308 и INab708 на вызванную E.coli выработку ИЛ-8 клетками цельной крови человека. Е. coli инкубировали с цельной кровью в течение 4 ч, и уровни ИЛ-8 оценивали с помощью методаELISA. В присутствии антител INab308 и INab708 во время инкубации уровни ИЛ-8 были значительно пониженными (Р 0,01), тогда как в присутствии L2B23 значимого снижения не наблюдалось. Примеры 1. Методы 1.1 Получение рекомбинантных С 5 а и мутантов С 5 а Последовательности ДНК, кодирующие человеческий фрагмент С 5 а, были получены путем полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) с использованием РНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови. С 5 а-мутанты были получены с помощью методов ПЦР посредством вставки кодона GCT (аланина) в сайт мутации. Фрагмент С 5 а молекулы ДНК лигировали с рЕТ-32 а (Novagen, Gibbstown, NJ) и лигационную смесь использовали для трансформации JM109-компетентных клеток. Плазмиды экспрессии трансформировали в BL21 с помощью стандартного метода с раствором хлорида кальция. С чашки с бульоном Луриа-Бертани (LB-бульоном) собирали отдельную колонию, высевали в LB-агар с ампициллином и инкубировали при 37 С в течение ночи. Культуру переносили в 2 л питательной среды LB и инкубировали при 37 С до середины экспоненциальной фазы роста (А 6000,6),затем добавляли изопропилD-тиогалактопиранозид (IPTG) до получения конечной концентрации 0,1 мМ. Клеткам давали расти дальше при 30 С в течение ночи и собирали их с помощью центрифугирования при 7000 об/мин, 4 С, в течение 15 мин. После однократной промывки фосфатно-солевым буфером(PBS; 10 мМ фосфатного буфера, 150 мМ NaCl [pH 7,4]) осажденную бактериальную массу ресуспендировали в PBS и обрабатывали ультразвуком на льду. После центрифугирования со скоростью 12000 об/мин, 4 С, в течение 15 мин, от нерастворимой массы отделяли растворимую фракцию. Для очистки человеческих рекомбинантных фрагментов С 5 а супернатант клеточного лизата загружали в колонку для никель-хелатной аффинной хроматографии, уравновешенную PBS. Затем колонку промывали 50 мМ имидазолом и 200 мМ имидазолом в PBS соответственно. Наконец, связанные белки элюировали 500 мМ имидазолом, диализовали против PBS в течение ночи и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). 1.2 Иммунизация и скрининг гибридомы с помощью метода ELISA Моноклональные антитела были созданы с помощью метода гибридом. Иммунизацию и получение моноклональных антител производили при использовании стандартных протоколов. Пять самок мышей линии BALB/c четырехнедельного возраста иммунизировали подкожным введением 100 мкг на животное очищенного рекомбинантного С 5 а в полном адъюванте Фрейнда. Животных стимулировали дважды с 4-недельным интервалом с помощью 100 мкг антигена в неполном адъюванте Фрейнда. Через три дня после последней стимуляции мышей умерщвляли, и их спленоциты сливали с клетками NS-1 в соотношении 5:1, и по 200 мкл клеток высевали в каждую лунку на пять 96-луночных планшетов. Гибриды выбирали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и 510-3 М гипоксантина, 210-5 М аминоптерина и 810-4 М тимидина (HAT). 8 дней спустя клоны клеток, секретирующие антитела против человеческого С 5 а, подвергали скринингу методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Вкратце, в лунки 96-луночного планшета помещали 2 мкг/мл рекомбинантного человеческого С 5 а при 4 С в течение ночи. После блокировки 5% обезжиренным молоком в PBS при 37 С в течение 1 ч в каждую лунку добавляли 50 мкл культуральной среды растущих клонов и инкубировали при 37 С в течение 1 ч, а затем с 100 мкл козьих антимышиных антител, меченых пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч. Реакция, катализируемая пероксидазой, проходила с раствором для окрашивания, содержащим 5,5 мМ o-фенилендиамин гидрохлорида(OPD) и 8,5 мМ Н 2 О 2. Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм на ELISA-ридере (Anthos, Wals/Salzburg, Австрия). 1.3 Получение и очистка моноклональных антител Для получения моноклональных антител в больших количествах 5106 гибридомных клеток вводили в брюшинную полость мыши. 14 дней спустя асцитическую жидкость удаляли и центрифугировали при 1500 об/мин, 4 С, в течение 5 мин. Супернатант собирали и загружали в колонку с белок-Асефарозой 4 В, которая была предварительно уравновешена PBS. Связанные моноклональные антитела элюировали лимонной кислотой (рН 4,0) и диализовали против PBS в течение ночи. Очищенные белки анализировали по методике SDS-PAGE. 1.4 Анализ ферментативной гранулосекреции для оценки биологической активности С 5 а Индукция выделения ферментов при дегрануляции является важным биологическим признаком С 5 а. В нашем исследовании для оценки влияния С 5 а на высвобождение лизоцима использовали свежую цельную человеческую кровь здоровых добровольцев. Уровни лизоцима, которые секретируют клетки цельной крови, анализировали с помощью комплекта EnzChek Lysozyme Assay Kit (Invitrogen, шт. Калифорния, США). Для изучения блокирующей активности антител к С 5 а, rhC5a (100 нМ) смешивали с различной концентрацией антител. После этого сразу же добавляли клетки цельной крови, чтобы избежать предварительной инкубации антител с С 5 а. После инкубации 50 мкл супернатанта проб добавляли к 50 мкл разбавленного раствора субстрата. Чашку инкубировали при 37 С в течение 30 мин в темноте и затем проводили считывание с помощью прибора-счетчика Perkin Elmer 1420 multilabel Counter (шт. Массачусетс, США). Измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны испускания 525 нм и из всех проб вычитали стандартное нулевое значение (холостая проба). Блокирующую активность антитела подсчитывали после вычета значения интенсивности флуоресценции, связанной с независимой от rhC5a секрецией лизоцима (буферный контроль), из значения интенсивности флуоресценции, связанной с rbC5 а-индуцированным высвобождением лизоцима. Блокирующую активность подсчитывали по следующей формуле 1.5 Анализ методом ELISA способности молекул INab308 и INab708 к связыванию с человеческим С 5 а или С 5 а-мутантами Для определения способности INab308 и INab708 к связыванию с человеческим С 5 а и С 5 амутантами проводили анализ связывания по методике Elisa. С 5 а-мутанты получены посредством замены соответствующей аминокислоты на аланин с помощью вставки кодона GCT в сайт мутации на уровне кДНК. Эти С 5 а-мутанты включают мутацию в сайте 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, двойную мутацию в 30/37, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70 и C-del (12 аминокислот были удалены на С-конце фрагмента С 5 а). Человеческий С 5 а (Sigma C5788), рекомбинантный С 5 а и С 5 а-мутанты (2 мкг/мл) были помещены в лунки 96-луночного планшета EIA (Costar 9018) при 4 С на ночь. После блокировки 5% обезжиренным молоком в PBS при 37 С в течение 1 ч в каждую лунку добавляли 0,08, 0,4, при 2 мкг/мл антител к С 5 а(INab308 и INab708), приготовленных с буфером для разведения, и инкубировали при 37 С в течение 1 ч,а затем с 100 мкл козьих антимышиных антител, меченых пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч. Реакция, катализируемая пероксидазой, проходила с раствором для окрашивания, содержащим 5,5 мМ офенилендиамин гидрохлорида (OPD) и 8,5 мМ Н 2 О 2. Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм на ELISA-ридере (Антос, Вальз/Зальцбург, Австрия). Значение оптической плотности (OD) для рекомбинантного фрагмента С 5 а было принято за 100% связывающей активности. Способность к связыванию С 5 а-мутантов подсчитывали по формуле ODC5a мутант/ODC5a. 1.6 Гемолитическая активность в плазме (СН 50) Вкратце, овечьи эритроциты (sRBC) получали из свежей цельной крови овец с помощью центрифугирования, затем их сенсибилизировали антителами анти-sRBC. Проводили серийные разведения проб плазмы здоровых доноров и инкубировали их с сенсибилизированными овечьими эритроцитами. Через полчаса после инкубации клетки, не подвергшиеся лизису, были отцентрифугированы, и проводили считывание супернатантов при длине волны 542 нм на планшетном ридере. Для определения влияния антител к С 5 а на активацию компонента С 5 равные объемы антител к С 5 а и плазмы до добавления сенсибилизированных овечьих эритроцитов предварительно инкубировали в течение 1 ч. 1.7 Выработка ИЛ-8 в модели с цельной кровью при инфекции Е. coli В целях оценки эффективности антител к С 5 а в условиях, близких к клиническому сепсису, в 250 мкл цельной крови здоровых добровольцев вводили антитела к С 5 а, а затем добавляли 250 мкл клеток Е.coli, разведенных физиологическим раствором с концентрацией 1107/мл. После 4-часовой инкубации при 37 С, супернатанты центрифугировали и собирали для анализа по методике ELISA на уровень ИЛ-8. Уровни ИЛ-8 в супернатантах анализировали с помощью набора IL-8 ELISA kit (BioLegend, США). 1.8 Анализ для исследования связывания антител с новым конформационным эпитопом В трехмерной структуре С 5 а, полученной методом компьютерного моделирования, пептид, содержащий пространственные эпитопы С 5 а 28-40 (VNNDETCEQRAAR, SEQ ID NO: 67), и пептид С 5 а 6570(ISHKDM, SEQ ID NO: 68) могут рассматриваться как спирали с неупорядоченной структурой. Если два пептида связаны гибким пептидным линкером, GGGGS (SEQ ID NO: 69), то конформационные эпитопы реконструируются аналогично конформации родительского антигена, так как слабое гидрофобное взаимодействие между двумя пептидами гарантирует двухъярусную (карманообразную) конформацию. При анализе методом компьютерного моделирования пептид NH2-28-40-линкер(GGGGS)-65-70-СООН сохраняет ту же самую конформацию, что и родительский антиген. Этот новый пептид 24-АА может быть синтезирован и конъюгирован с гемоцианином фиссуреллы (KLH) для получения иммуногена для иммунизации мышей, и традиционная гибридомная технология может быть применена впоследствии для получения антител INab308 и INab708 с использованием основанного на новом пептиде 24-АА инструмента для скрининга по методике ELISA. В 96-луночный планшет для ELISA переносят 1-2 мкг/мл синтетических пептидов с конформационным эпитопом и выдерживают при 4 С в течение ночи. После блокировки 5% обезжиренным молоком в PBS при 37 С в течение 1 ч в каждую лунку добавляли по 50 мкл культуральной среды для выращивания клонов гибридомы и инкубировали при 37 С в течение 1 ч, а затем добавляли 100 мкл козьих антимышиных антител, помеченных пероксидазой хрена (HRP), и инкубировали в течение 1 ч. Реакция, катализируемая пероксидазой, проходила с раствором для окрашивания, содержащим 5,5 мМ о-фенилендиамин гидрохлорида (OPD) и 8,5 мМ Н 2 О 2. Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм на ELISA-ридере. 2. Результаты 2.1 Идентификация аминокислот, определяющих активность С 5 а Несколько аминокислот внутри молекулы С 5 а, которые образуют, возможно, эпитопы антител, были подвергнуты мутациям с заменой на аланин. В частности, С 5 а-мутанты включают мутации в сайтах 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, двойную мутацию в 30/37, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70 и C-del(12 аминокислот были удалены на С-конце фрагмента С 5 а). С 5 а-мутанты были испытаны на их биологическую активность по индуцированию высвобождения лизоцима из клеток цельной крови человека (фиг. 1). Сайты С 5 а с мутациями, приводящими к более чем 50% потере биологической активности в сравнении с человеческим С 5 а, рассматривались как критические сайты для биологической функции фрагмента С 5 а. Таким образом, аминокислотные остатки 24, 29, 31, 37, 68 и 69 были идентифицированы как сайты, критические для функции (фиг. 1). 2.2 Характеристика эпитопов на фрагментах С 5 а, связанных с антителами INab308 и INab708 2000 клеточных клонов, секретирующих антитела к человеческому С 5 а, были подвергнуты скринингу с помощью функционального анализа (на выделение ферментов). Только два антитела проявляли превосходную блокирующую активность. Эти два антитела, INab308 и INab708, были затем охарактеризованы в отношении конкретных аминокислот на С 5 а, распознанных этими двумя антителами. В частности, были созданы мутанты С 5 а, в которых одна или несколько аминокислот были заменены на аланин. Антитела INab308 и INab708 приводили в контакт с этими мутантами, и степень связывания определяли методом ELISA (см. раздел 1.5 выше). Потерю способности к связыванию, составляющую более чем 50% (в сравнении с диким видом С 5 а), рассматривали как значительную. Данные указывают на то, что молекула INab308 связывается с участками 31-37 и 68-69 (фиг. 2). В равной степени данные указывают на то, что молекула INab708 связывается с участками 31-37 и 68-70(фиг. 3). Примечательно, что участки, идентифицированные для обоих антител, покрывают четыре аминокислотных остатка (31, 37, 68 и 69), которые были идентифицированы как сайты, критические для функционирования С 5 а, в разделе 2.1 выше. 2.3 Влияние антител INab308, INab708 и F20 на гемолитическую активность в человеческой плазме Определение титра комплемента гемолитическим методом (CH50) является общепринятым методом для определения активации классического каскада комплемента (см. раздел 1.6). Моноклональные антитела к С 5 а (INab708, INab308 и F20) предварительно инкубировали с человеческой плазмой при концентрации, составляющей прибл. 5 мкм, а затем проводили анализ активности комплемента СН 50. Среди этих антител F20 сильно ингибирует активность СН 50, тогда как INab708 иINab308 не имеют никакого влияния (фиг. 4). Данные результаты демонстрируют, что INab708 и INab308 не препятствуют активации комплемен- 27022759 та, опосредованной фрагментом С 5b. 2.4 Влияние антител INab308, INab708 и L2B23 на биологическую активность С 5 а Блокирующую активность антител INab308, INab708 и L2B23 оценивали с помощью анализа вызванного С 5 а высвобождения лизоцима (см. раздел 1.4). Молярное соотношение антитела и С 5 а было установлено как 1:2, чтобы оценить блокирующую активность одного антитела по отношению к вызванному двумя молекулами С 5 а биологическому эффекту. Данные антитела были бивалентными антителами. Соответственно при выборе указанного выше молярного соотношения 1:2 паратопы антител, с одной стороны, и С 5 а, с другой стороны, присутствуют в эквимолярных концентрациях. Данные на фиг. 5 показывают, что антитела INab308 и INab708 обладают очень высокой блокирующей активностью по отношению к биологической активности С 5 а (94 и 100% соответственно), тогда как L2B23 имеет лишь минимальное влияние (около 12%). 2.5 Влияние антител INab308 и INab708 на вызванную E.coli выработку ИЛ-8 в цельной крови человека Для оценки эффективности антител к С 5 а в условиях, близких к клиническому сепсису, определяли уровень выработки ИЛ-8, вызванным Е. coli . Этот анализ может рассматриваться как модель инфекции,вызванной Е. coli (см. также раздел 1.7). В присутствии антител INab308 и INab708 во время инкубации уровни ИЛ-8 были значительно пониженными (Р 0,01), тогда как в присутствии L2B23 значительного снижения не наблюдалось (фиг. 6). 3. Обобщение Важные свойства предпочтительных антител INab308 и INab708, предложенных в изобретении,обобщены в табл. 3, которая приводится ниже. Дополнительно включены антитела сравнения 8g8, MAb 137-26, Ab11876, G57, F20, L2B23 и G13, которые не связываются одновременно с обеими аминокислотными последовательностями конформационного эпитопа, идентифицированными в настоящем изобретении, т.е. аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Антитела сравнения 8g8, MAb 137-26, F20, G57, L2B23 и G13 связываются только с одной из этих аминокислотных последовательностей (8g8, MAb 137-26, F20, G57 и G13) или с отличной от них аминокислотной последовательностью (L2B23). Эпитоп-мишень антитела Ab11876 не известен. Моноклональные антитела к человеческому С 5 а были получены по классической гибридомной технологии. Сайты связывания моноклональных антител с человеческим С 5 а были определены методом аланинового скрининга. Количественная оценка блокирующей активности моноклональных антител была произведена с помощью ингибирования С 5 а-индуцированного высвобождения лизоцима из клеток цельной крови человека. Таблица 3. Нейтрализующие антитела к С 5 а и его эпитопамND: не определено;клона в АТСС РТА-3650, относящийся к антителу, раскрытому в Европейской патентной заявке 1878441 А 2; Ab11876 является моноклональным мышиным антителом к С 5/С 5 а, имеющимся в наличии в компании АВСАМ (Кембридж, Великобритания). Как показано в табл. 3, некоторые антитела сравнения (8g8, MAb 137-26) проявляют более высокую аффинность по отношению к С 5 а, чем предпочтительные антитела по изобретению, INab308 и INab708. Несмотря на это, антитела INab308 и INab708 проявляют более высокую блокирующую активность, чем любое исследованное антитело сравнения. Более конкретно, каждое из антител INab308 и INab708 проявляет очень высокую блокирующую активность (90%), даже если используются в стехиометрических количествах, т.е. в соотношении 1 паратоп на 1 эпитоп; т.е. 0,5 молекулы антитела на 1 молекулумишень. Антитела из уровня техники (MAb 137-26, Ab11876) достигают приемлемого уровня блокирующей активности, только если их использовать в сверхстехиометрических количествах. Эти сведения указывают на то, что высокую аффинность не всегда можно отождествлять с высокой блокирующей активностью. В качестве обобщения, в настоящем изобретении впервые предложены антитела, которые проявляют чрезвычайно высокую блокирующую активность, даже если они используются всего лишь в стехиометрических количествах. Аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков тяжелой и легкой цепей антител INab308 и INab708 приводятся ниже в табл. 4.