Гуманизированные антитела против tl1a

ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ TL1A В изобретении раскрыты гуманизированные антитела, которые специфично связываются с 15 членом надсемейства TNF (TNFSF 15), также известным как TL1A. Также описаны способы получения и применения антител против TL1A. Гуманизированные антитела могут представлять собой антагонисты и могут применяться для лечения или диагностирования заболеваний,связанных с функциями TL1A. По данной заявке испрашивается преимущество приоритета к временной патентной заявке США 60/987651, которая подана 13 ноября 2007 г. Таким образом, содержание этой заявки включено в качестве ссылки в полном объеме. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к антителам против TL1A и способам получения и применения таких антител. Ожидается, что эти антитела можно использовать, в частности, для лечения воспалительных состояний, таких как болезнь Крона. Предпосылки создания изобретения Белки, обладающие структурным сходством с фактором некроза опухоли (TNF), в совокупности обозначаются как надсемейство TNF. TL1A, член надсемейства TNF, представляет собой TNF-подобный цитокин, который связывается с рецептором с доменом смерти (DR)3 и предоставляет костимуляторные сигналы активированным лимфоцитам. Посредством этого взаимодействия TL1A индуцирует секрециюIFN- и, следовательно, может принимать участие в развитии эффекторных ответов Т-хелперов 1 типа.TL1A представляет собой трансмембранный белок II типа и обозначается как 15 член надсемействаTNF (TNFSF15). TL1A экспрессируется преимущественно эндотелиальными клетками и моноцитами, и его экспрессия индуцируется под действием TNF- и IL-1a; Migone et al., Immunity, 16:479-92 (2002).TL1A поддается повышающей регуляции провоспалительными цитокинами TNF и IL-1, а также иммунными комплексами (IC); Hsu et al., Exp. Cell Res., 292:241-51 (2004).TL1A опосредует передачу сигналов через свой рецептор узнавания - рецептор смерти DR3, активация которого, как известно, индуцирует как факторы смерти, так и факторы выживания. Также предполагается, что TL1A, подобно TNF, циркулирует в гомотримерной растворимой форме; Kim et al., J.TL1A с высокой аффинностью связывается рецептором смерти 3 (DR3), являющимся членом семейства рецепторов TNF, содержащих домен смерти, а также называется Wsl-1, Apo-3, TRAMP и LARD и в настоящее время обозначается как 25 член надсемейства рецепторов TNF (TNFRSF25). В зависимости от клеточного окружения связывание DR3 с TL1A может запускать один или два пути передачи сигнала, активацию фактора транскрипции NF-B или активацию каспаз и апоптоз. TL1 участвует в костимуляции Т-клеток и поляризации Th1-клеток. На активированные Т-клетки TL1A действует, в частности,через свой поверхностный рецептор DR3, чтобы стимулировать клеточное выживание и секрецию провоспалительных цитокинов. Секретируемый рецептор-приманка 3 (DcR3), растворимый белок из семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR), блокирует действие TL1A; Kim et al., "Identification ofnaturally secreted soluble form of TL1A, a TNF-like cytokine", J. Immunol. Methods, 298:1-8 (2005). Вероятные мишени терапевтического воздействия Аллергия и астма.Th2-поляризация CD4 Т-клеток при повышенных уровнях IgE и образовании IL-13 NKT-клетками является основной причиной воспаления легкого при аллергии и астме. TL1A играет основную роль в аллергическом воспалении легкого (Fang et al. J. Exp. Med. 2008). TL1A костимулирует образование IL-4 и IL-13 в NKT-клетках. Блокирование взаимодействия TL1A и DR3 антителами против TL1A или доминантным отрицательным мутантом TL1A снимает воспаление легкого. Карцинома легких и карцинома толстой кишки. Члены надсемейства TNF и надсемейства рецепторов TNF регулируют иммунологические реакции и индуцируют апоптоз. DR3 предпочтительно экспрессируется Т-лимфоцитами и подвергается повышающей регуляции в процессе активации Т-клеток. Лигандом для DR3 является TL1A. TL1A также связывается с рецептором-приманкой DcR3/TR6, который экспрессируется некоторыми карциномами легких и карциномами толстой кишки и в некоторых здоровых тканях. TL1A подвергается повышающей регуляции под действием провоспалительных цитокинов TNF и IL-1. TL1A является более длинным вариантом TL1 (также обозначается как VEGI). Атеросклероз. Кроме того, также сообщалось, что TL1A обладает ангиостатическим действием и индуцирует экспрессию генов металлопротеиназы и IL-8 (Su et al., Exp. Cell Res., 312:266-277 (2006); Kang et al., Cytokine, 29:229-235 (2005. Действительно, TL1A и DR3 могут быть вовлечены в патогенез атеросклероза путем увеличения образования провоспалительных цитокинов и хемокинов и снижения стабильности бляшек, индуцируя ферменты, разрушающие внеклеточный матрикс (Kang et al., Cytokine, 29:229-235(2005. Ревматоидный артрит. Также существуют данные, которые указывают на то, что TL1A/DR3 вовлечены в этиологию ревматоидного артрита (Bossen et al., J. Biol. Chem., 281 (20):13964-13971 (May 19, 2006). Воспалительное заболевание кишечника. Исследователи обнаружили связь между экспрессией TL1A и воспалительным заболеванием кишечника (Prehn et al., Clin. Immunol., 112:66-77 (2004); Bamias et al., J. Immunol. 171:4868-4874 (2003.Th1-опосредованные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона. Болезнь Крона представляет собой тяжелое воспалительное расстройство кишечника, которое поражает молодых взрослых людей (в возрасте от 20 до 30 лет). Полагают, что причинами этого состояния являются генетическая предрасположенность и факторы внешней среды, которые вызывают дисбаланс эффекторных (провоспалительных) и регуляторных реакций Т-клеток, что приводит к воспалению слизистой желудочно-кишечного тракта и расстройству. Путь TL1A/DR3 играет важную роль в Th1-опосредованных заболеваниях кишечника, таких как болезнь Крона, Konstantinos et al., The Journal of Immunology, 2005, 174: 4985-4990 (2005); Bamias et al., J.Immunol. 171:4868-74 (2003). Следовательно, блокирование пути TL1A/DR3 может дать возможность лечения болезни Крона.TL1A увеличивает образование IFN- посредством анти-CD3 плюс анти-CD28 и IL-12/IL-18 стимулированных Т-клеток периферической крови (ПК). Активация DR3 под действием TL1A индуцирует образование сигнального комплекса, включая TRADD, TRAF2 и RIP и активированные NF-B иChem., 278:39251-8 (2003). Рецепторы смерти и их лиганды играют ключевую роль в поддержании тканевого гомеостаза и физиологическом регулировании запрограммированной клеточной смерти. Связывание лигандов смерти индуцирует олигомеризацию рецептора, вовлечение адаптерного белка посредством консервативного цитоплазматического сигнального элемента, который называется доменом смерти, активацию каспаз и индукцию апоптоза; Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(22):8303-8304 (May 30, 2006). Хотя рецепторы смерти, такие как Fas/Apo-1/CD95, TNF-R1, TRAIL-R1, TRAIL-R2 или DR3, изначально были описаны как индукторы апоптоза, увеличивается количество свидетельств того, что эти рецепторы также имеют функции, не связанные с апоптозом, включая регуляцию адаптивного иммунного ответа. В статье Bamias et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:8441-8446 (2006) сообщается о том, чтоTL1A экспрессируется дендритными клетками собственной пластинки слизистой, и о том, что он действует посредством усиления пролиферации клеток памяти, но не наивных CD4+ Т-клеток, и проявляет синергетический эффект вместе с IL-12 и/или в малых дозах стимулирует рецепторы Т-клеток для резкого повышения экспрессии гена IFN-. Полагают, что экспрессия IFN- в кишечнике является маркером воспаления и многие стратегии лечения болезни Крона основаны на многочисленных попытках подавлять активированное состояние иммунной системы. Однако такие попытки (лечение стероидами и иммуносупрессорными лекарственными средствами) не нацелены именно на кишечник и, таким образом, им присущи определенные сложности. Целенаправленная терапия, основанная на использовании антагонистов TNF-, была успешно введена в 1990-х, и результаты, о которых сообщается в литературном источнике 1, говорят о том, что терапия, направленная именно против TL1A или его рецепторов, может обеспечить альтернативную целенаправленную терапию для этого изнуряющего заболевания. Как сообщается в статье Bamias et al., Proc. Natl. Acad. Sex. USA, 103:8441-8446 (2006), похоже,TL1A обладает самым сильным эффектом, когда он экспрессируется в кишечнике при воспалении. TL1A в сочетании с IL-12/18 проявляет синергетическое действие при индукции экспрессии IFN- Т-клетками человека, хотя увеличенная экспрессия также может наблюдаться в естественных киллерах (Migone et al.,Immunity., 16:479-492 (2002); Papadakis et al., J. Immunol. 174:4985-4990 (2005); Papadakis et al., J. Immunol. 172:7002-7007 (2004. В статье Bamias et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:8441-8446 (2006) впервые сообщалось о схожих наблюдениях, сделанных на моделях болезни Крона на мышах, что расширяет ранее полученные данные, так как указывает на то, что синергизм возникает, когда Т-клеточный рецептор стимулирован слабо или когда Т-клетки подвергаются воздействию IL-12. Несмотря на то что исследователи Bamias et al. не наблюдали синергетического эффекта, когда обработку белком TL1A комбинировали с IL-18, этот результат можно не считать удивительным, поскольку как IL-18, так и TL1A передают сигналы через NF-В. Тогда как в исходном сообщении исследователей Migone et al. было показано, что TL1A являлся костимуляторным сигналом для Т-клеток, исследователи Bamias et al. показали,что она является Т-клеткой памяти, которая отвечала более выраженно, в соответствии с увеличенной способностью этой Т-клеточной популяции экспрессировать IFN-. В силу того, что эта популяция пролиферирует, она также проявляет более высокие уровни экспрессии рецептора TL1A, таким образом дополнительно увеличивая способность клеток пролиферировать и экспрессировать IFN-. Это открытие можно считать в некоторой степени неожиданным в связи с тем, что единственным известным рецептором TL1A является DR3-рецептор, содержащий домен смерти, и можно предположить, что включение этого рецептора приводит к клеточной смерти. (TL1A передает сигналы через DR3 - его единственный известный рецептор на поверхности клетки. TL1A также связывается с растворимым рецепторомприманкой (DcR3. Однако было показано, что NF-В-зависимые антиапоптотические гены, такие как ингибитор апоптоза 2, индуцируются белком TL1A (Wen et al., J. Biol. Chem., 278:39251-39258 (2003, и,следовательно, включение апоптоза или пролиферации может зависеть от типа клеток. Существующие в настоящее время варианты лечения болезни Крона включают моноклональные антитела против TNF-, инфликсимаб (Ремикейд; Centocor, Inc., Horsham, PA), моноклональные антитела Адалимумаб (торговое название Humira; Abbott), а также противовоспалительные средства (например,сульфасалазин), кортизон или стероиды (например, преднизон), иммунодепрессанты (например, 6 меркаптопурин) и антибиотики. Однако инфликсимаб является единственным вариантом лечения, который обладает высокой степенью направленности; остальные варианты лечения обладают низкой направленностью; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103(22): 8303-8304 (May 30, 2006). Это означает, что лечение не нацелено на область заболевания. В то время как инфликсимаб обладает высокой направленностью и,как правило, хорошо переносится, инфликсимаб может вызывать рецидивы туберкулезной инфекции и ухудшения при сердечной недостаточности, демиелинизирующих заболеваниях и увеличение частоты возникновения лимфом. Следовательно, в данной области сохраняется потребность в композициях, которые можно использовать для лечения и диагностики различных воспалительных и иммунных заболеваний и расстройств,таких как аллергия/астма, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких, псориаз, диабет 1-го типа и отторжение трансплантата. Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам противTL1A и удовлетворяет эту потребность. Краткое изложение сущности изобретения Раскрыты молекулы антигенсвязывающего полипептида, который специфично связывается с TNFподобным цитокином TL1A (см. GenBank, инвентарный номер AF520785). Настоящее изобретение относится к выделенному антигенсвязывающему полипептиду, специфично связывающемуся с TL1A, который содержит:(a) вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, которая содержит:(1) CDR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7;(2) CDR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;(3) CDR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9;(b) вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, которая содержит:(1) CDR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35;(2) CDR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36;(3) CDR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO:10. В другом варианте осуществления полипептид по изобретению содержит вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ IDNO:38. Также настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему полипептиду, специфично связывающемуся с TL1A, который содержит вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению относится к полипептиду, выбранному из группы, состоящей из молекулы антитела, фрагмента Fab, фрагмента Fab', фрагмента F(ab')2 и молекулы scFv. В другом варианте осуществления полипептид по изобретению представляет собой антитело. Настоящее изобретение относится также к выделенному антигенсвязывающему полипептиду, специфично связывающемуся с TL1A, который содержит:(a) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность SEQ ID NO:38;(b) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность SEQ ID NO:10. Одним вариантом осуществления является также полипептид по изобретению, который представляет собой химерное антитело, содержащее константную область тяжелой цепи человека и константную область легкой цепи человека, предпочтительно указанное антитело представляет собой молекулу IgG(например, молекулу IgG1 или IgG4). Еще одним вариантом осуществления является полипептид по изобретению, представляющий собой молекулу scFv, при этом предпочтительно scFv имеет формулу NH2-L-VH-X-VK-COOH или NH2-LVK-X-VH-COOH; где L представляет собой лидерную последовательность; VH представляет собой вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела; X представляет собой линкерный полипептид и VK представляет собой вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела. Другим вариантом осуществления является полипептид по изобретению, представляющий собой фрагмент Fab, слитый с HSA, при этом предпочтительно фрагмент Fab, слитый с HSA, содержит (i) тяжелую цепь, представленную NH2-VH-CH1-HSA-COOH или NH2-HSA-CH1-VH-COOH, и (ii) легкую цепь, представленную NH2-VK-CK-СООН, где:(a) VH представляет собой вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела;(b) CH1 представляет собой константный домен 1 тяжелой цепи человека;(c) HSA представляет собой сывороточный альбумин человека;(d) VK представляет собой вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела;(e) CK представляет собой константный домен -цепи человека. Настоящее изобретение относится к также к полипептиду, конъюгированному с терапевтическим или диагностическим средством. Примерами терапевтического средства являются цитотоксическое средство, радиоактивная метка, иммуномодулятор, гормон, фермент, олигонуклеотид, фотоактивное терапевтическое средство или их сочетания. Примерами диагностического средства являются радиоактивная метка, фотоактивное диагностическое средство, активируемое ультразвуком средство или нерадиоактивная метка. В одном из вариантов осуществления полипептид по изобретению является антагонистом TL1A. В следующем варианте осуществления полипептид по изобретению не является агонистом TL1A. В еще одном варианте осуществления полипептид по изобретению связывается с TL1A с константой связывания, составляющей по меньшей мере приблизительно 106M-1, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 107M-1, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 108M-1 и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 109M-1. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения или диагностирования воспалительного, иммунного или злокачественного заболеваний или состояний, содержащей полипептид по изобретению в эффективном количестве и носитель. Фармацевтическая композиция по изобретению может также содержать дополнительное терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из цитотоксического средства, радиоактивной метки,иммуномодулятора, гормона, фермента, олигонуклеотида, фотоактивного терапевтического средства или их сочетаний, или диагностическое средство, выбранное из группы, состоящей из радиоактивной метки,фотоактивного диагностического средства, активируемого ультразвуком средства или нерадиоактивной метки. Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения или диагностирования воспалительного,иммунного, злокачественного заболеваний или состояний. Примерами заболеваний или состояний являются аутоиммунное заболевание (например, обыкновенная волчанка), воспалительное заболевание кишечника (IBD), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), артрит (например, ревматоидный артрит), рассеянный склероз, отторжение трансплантата, повреждение центральной нервной системы, Th1-опосредованные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, псориаз, лейкемия или лимфома (например, хронический лимфолейкоз (CLL, атеросклероз, карцинома легких и карцинома толстой кишки. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид по изобретению, рекомбинантному полинуклеотиду, который содержит промоторную последовательность, функционально связанную с указанным полинуклеотидом, и выделенной клетке, трансформированной указанным рекомбинантным полинуклеотидом. Также раскрыт способ получения полипептида, кодируемого рекомбинантным полинуклеотидом по изобретению, где способ включает:a) культивирование клетки, трансформированной рекомбинантным полинуклеотидом для того, чтобы экспрессировать кодируемый полипептид; иb) выделение экспрессированного таким образом полипептида. Как предшествующее общее описание, так и следующее краткое описание чертежей и подробное описание являются иллюстративными и объяснительными и предназначены для того, чтобы предоставить дополнительное объяснение по изобретению, как заявлено. Другие объекты, преимущества и новые признаки будут без труда поняты специалистами в данной области из следующего подробного описания изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано ингибирование активности каспаз, индуцированных с использованием TL1A человека (huTL1A), в клетках TF-1 антителами мыши и хомяка против TL1A. AT1 - 19 Е 06; AT2 12D01; AT3 - 15 Е 09; AT4 - 16H02; AT5 - 14A03; AT6 - 04H08A; AT7 - 12F11; AT8 12D08. На фиг. 2 показано выравнивание домена VH антитела мыши 16 Н 02 против TL1A с ближайшим геном зародышевой линией человека, IGHV7-4-1-02. Выравнивание использовали в качестве шаблона для создания 2 различных версий гуманизированной VH 16 Н 02, обозначенных на чертеже как New Hum 16H02 VH1 и 2. На фиг. 3 показано количество мутаций, отличающих VH мыши от VH человека, и процент гуманизации двух версий VH гуманизированного антитела против TL1A. На фиг. 4 показано выравнивание домена VK антитела мыши 16 Н 02 против TL1A с ближайшим геном зародышевой линии человека, А 17. Выравнивание использовали в качестве шаблона для создания 2 различных версий гуманизированной VH 16H02, обозначенных на чертеже как New Hum 16H02 VK1 и 2. На фиг. 5 показано количество мутаций, отличающих VK мыши от VK человека, и процент гуманизации двух версий VK гуманизированного антитела 16 Н 02 против TL1A. На фиг. 6 показаны результаты временной трансфекции клеток 293F с использованием VH1 и 2 антитела человека 16 Н 02 против TL1A и VK1 и 2 антитела человека 16 Н 02 против TL1A для получения полноразмерной молекулы гуманизированного антитела. На фиг. 7 показана активность моноклональных антител 16 Н 02 против TL1A после одного цикла гуманизации, исходя из ингибирования активности каспаз, индуцированных с помощью TL1A, в клеткахTF-1 гуманизированными антителами по сравнению с контрольными антителами мыши против TL1A. 12D01=отрицательный контроль для антитела мыши против TL1A; 16 Н 02=положительный контроль для антитела мыши противTL1A; 3009=гуманизированное антитело 16 Н 02 VH1+VK1 против TL1A; 3010=гуманизированное антитело VH2+VK1 16 Н 02 против TL1A; 3011=гуманизированное антитело VH1+VK2 16 Н 02 против TL1A; 3012 - гуманизированное антитело VH2+VK2 16 Н 02 против TL1A. На фиг. 8 показаны окончательные мутации, которые необходимы для полной гуманизации каркасаVK 16H02. Для создания полностью гуманизированной легкой цепи 16 Н 02 New Hum 16 Н 02 VK2 (см. фиг. 4) исходную последовательность выравнивали с последовательностью гена зародышевой линии А 17 и идентифицировали 3 отдельных области или блока (закрашенные круги) для последующего мутагенеза. Конструировали синтетические легкие цепи, которые содержали все возможные сочетания или из немутированной последовательности дикого типа VK2 (=W), или из последовательности гена зародышевой линии А 17 (=М) в каждой из 3 областей или блоков. На фиг. 9 показана временная трансфекция ID и LDCдля окончательных версий VK гуманизированного 16 Н 02. Создавали синтетические легкие цепи, которые содержали все возможные сочетания или из последовательности дикого типа (W), или из мутантной последовательности (М) в 3 отдельных областях или блоках в New Hum 16H02 VK2 с фиг. 8. Затем проводили котрансфекцию синтетическими легкими цепями и New Hum 16H02 VH1 с фиг. 2 и полученные антитела тестировали на ингибирование активности каспаз, индуцированных с помощью huTL1A. На фиг. 10 показано ингибирование активности каспаз, индуцированных с использованием TL1A человека (huTL1A), в клетках TF-1 с помощью набора различных гуманизированных антител противTL1A с фиг. 9. Активность полностью гуманизированного антитела 16 Н 02 против TL1A, обозначенного как 3038, сравнивали с активностью исходного антитела мыши 16 Н 02 против TL1A. На фиг. 11 показано выравнивание последовательностей домена VH пяти ведущих кандидатных антител мыши против TL1A: 1 В 4, 25 В 9, 11D8, 27 А 8 и 38D6. На фиг. 12 показано выравнивание последовательностей домена VK пяти ведущих кандидатных антител мыши против TL1A: 1 В 4, 25 В 9, 11D8, 27 А 8 и 38D6. На фиг. 13 показано выравнивание последовательностей гуманизированного домена VH 1B4 (hum 1B4 VH АА) с исходным доменом VH мыши (1 В 4 VH АА) и ближайшим совпадающим доменом VH зародышевой линии человека (VH2-70-10). На фиг. 14 показано выравнивание последовательностей гуманизированного домена VK 1B4 (hum 1B4 VK АА) с исходным доменом VK мыши (1 В 4 VK АА) и ближайшим совпадающим доменом VK зародышевой линии человека (VK-L8). На фиг. 15 показано ингибирование активности каспаз, индуцированных с использованием TL1A,полученного из млекопитающего, в клетках TF-1 гуманизированными антителами (1 В 4, 11D8, 25 В 9) против TL1A в сравнении с антителом мыши 11D8. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления Определения. Антитело, как описано в настоящем документе, относится к полноразмерной (т.е. встречающейся в природе или полученной обыкновенными рекомбинантными процессами с использованием фрагментов генов иммуноглобулинов) молекуле иммуноглобулина (например, к антителу IgG) или к иммунологически активной (т.е. специфично связывающейся) части молекулы иммуноглобулина, такой как фрагмент антитела. Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин "фрагмент антитела" включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин "фрагмент антитела" также включает любые синтетические или полученные способами генной инженерии белки, которые ведут себя как антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, таких как фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером ("белки scFv"), слитые полипептиды Fab HSA,в которых VH-CH1 получен в слитом с HSA виде, который затем укладывается с его родственными VKCK легкой цепи гуманизированного антитела человека с образованием Fab, и минимальные распознаю-5 020886 щие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область. Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR из антитела от животного одного вида, например из антитела грызуна, переносят из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела грызуна в вариабельные домены тяжелой и легкой цепей человека или вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые мутировали таким образом, что они содержат по меньшей мере часть аминокислотной последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей человека (что отражено в "проценте гуманизации"). Константные домены молекулы антитела могут быть получены из константных доменов антитела человека. Как применяют в настоящем документе, "процент гуманизации" вычисляют по количеству аминокислот в каркасной области, различающихся (т.е. различия не в CDR) между гуманизированным доменом и доменом зародышевой линии, которое вычитают из общего количества аминокислот и затем делят разность на общее количество аминокислот, умноженное на 100. Как применяют в настоящем документе, "CDR" обозначает "гипервариабельный участок", который присутствует в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) антитела или в вариабельном домене легкой цепи антитела (VL или VK). Каждый вариабельный домен содержит по три CDR, среди них CDR, которые присутствуют в вариабельном домене тяжелой цепи, обозначаются как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3,и CDR, которые присутствуют в вариабельном домене легкой цепи, обозначаются как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. В настоящем документе используется система нумерации по Кабату. По существу, CDR-H1 начинается приблизительно с 31-й аминокислоты (т.е. приблизительно через 9 остатков после первого остатка цистеина), содержит приблизительно 5-7 аминокислот и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-H2 начинается с пятнадцатого остатка после конца CDR-H1, содержит приблизительно 16-19 аминокислот и заканчивается на следующем остатке аргинина или лизина. CDR-Н 3 начинается приблизительно с тридцать третьего аминокислотного остатка после конца CDR-H2; содержит 3-25 аминокислот и заканчивается на последовательности W-G-X-G, где X обозначает любую аминокислоту.CDR-L1 начинается приблизительно с 24 остатка (т.е. после остатка цистеина); содержит приблизительно 10-17 остатков и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-L2 начинается приблизительно с шестнадцатого остатка после конца CDR-L1 и содержит приблизительно 7 остатков. CDR-L3 начинается приблизительно с тридцать третьего остатка после конца CDR-L2 (т.е. после остатка цистеина); содержит приблизительно 7-11 остатков и заканчивается на последовательности F или W-G-X-G, гдеX обозначает любую аминокислоту. Конъюгирование с терапевтическим или диагностическим средством. Антигенсвязывающие полипептиды, описываемые в настоящем документе, можно конъюгировать или слить с терапевтическим средством, которое может включать радиоактивные метки, иммуномодуляторы, гормоны, фотоактивные терапевтические средства, цитотоксические средства, которые могут представлять собой лекарственные средства или токсины, и их сочетания. Лекарственные средства могут включать любые лекарственные средства, которые обладают фармакологическими свойствами, выбранными из группы, состоящей из антимитотических, антикиназных, алкилирующих, антиметаболических средств, антибиотиков, алкалоидов, антиангиогенных, апоптотических средств и их сочетаний. Более конкретно, эти лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из азотистых ипритов, производных этиленимина, алкилсульфонатов, нитрозомочевин, триазенов, аналогов фолиевой кислоты, ингибиторов ЦОГ-2, аналогов пиримидина, аналогов пурина, антибиотиков, ферментов, эпиподофиллотоксинов, координационных комплексов платины, алкалоидов барвинка, замещенных мочевин, производных метилгидразина, супрессоров коры надпочечников, антагонистов, эндостатина, таксолов, камптотецинов,антрациклинов, таксанов и их аналогов, и их сочетаний. Токсины, включенные в настоящее изобретение,могут быть выбраны из группы, состоящей из рицина, арбина, -токсина, сапорина, рибонуклеазы(РНКазы), например онконазы, ДНКазы I, стафилококкового энтеротоксина-А, антивирусного белка лаконоса, гелонина, дифтерийного токсина, экзотоксина Pseudomonas и эндотоксина Pseudomonas. Иммуномодуляторы могут быть выбраны из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста стволовых клеток, лимфотоксина, гемопоэтического фактора, колониестимулирующих факторов (CSF),интерферонов (IFN), эритропоэтина, тромбопоэтина и их сочетаний. Особенно эффективны такие лимфотоксины, как фактор некроза опухоли (TNF), гемопоэтические факторы, такие как интерлейкины (IL),колониестимулирующие факторы, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, интерфероны, такие как интерфероны-, - или -, и факторы роста стволовых клеток, например фактор, обозначаемый как"фактор S1". Более конкретно, иммуномодуляторы могут включать IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL18, IL-21, интерферон-, TNF- или их сочетания. Антигенсвязывающие полипептиды, описываемые в настоящем документе, могут быть конъюгированы или слиты с диагностическим средством. Диагностические средства могут включать фотоактивные диагностические средства или радиоактивные метки, которые обладают энергией между 60 и 4000 кэВ,или нерадиоактивные метки. Радиоактивные метки предпочтительно представляют собой -, - и позитрон испускающие изотопы, выбранные из группы, состоящей из 125I, 131I, 123I, 124I, 86Y, 186Re, 188Re, 62Cu,-6 020886 64Cu, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 18F, 11C, 13N, 15O, 76Br и их сочетаний. Диагностические средства могут включать контрастные средства, например, такие как марганец, железо или гадолиний. Типичные способы получения антител против TL1A с использованием гибридомной технологии. Мышей BALB/c можно иммунизировать рекомбинантным белком TL1A (внеклеточный домен). В типичной процедуре 10 мг белка в 50 мл полного адъюванта Фрейнда (Sigma) вводят подкожно. Через 2 недельные интервалы можно вводить от двух до четырех дополнительных инъекций в неполном адъюванте Фрейнда, за которыми следует конечная иммунизация антигеном в PBS. Альтернативно, инъекции можно вводить в подушечку стопы. Через три дня мышей забивают, удаляют селезенки или подколенные лимфатические узлы, а лимфоциты можно выделять для слияния. Лимфоциты можно сливать с клетками плазмоцитомы P3X63Ag8.653 в соотношении 5:1 с использованием PEG/DMSO (Sigma) в качестве средства для слияния. После слияния клетки можно ресуспендировать в селективной среде HAT и высеять по 106 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Используя супернатанты от гибридом, которые выжили при отборе в HAT, можно проводить скрининг в прямом ELISA на присутствие антител, связывающихся с TL1A. Можно идентифицировать гибридомы, которые секретируют антитела, связывающиеся с TL1A,и можно проводить дополнительный скрининг из супернатантов на антитела, ингибирующие связываниеTL1A с его рецептором DR3, посредством ингибирования связывания в ELISA. Затем гибридомы, для которых подтверждено ингибирование связывания TL1A, можно использовать в скрининге на ингибирование активности каспаз, индуцированных с использованием TL1A, в клетках TF-1, чтобы идентифицировать клоны, продуцирующие антагонисты TL1A. Типичная стратегия гуманизации антитела. Одной из задач гуманизации антител против TL1A является получение доменов VH и VK, которые гуманизированы на 70-100% и сохраняют исходную аффинность и специфичность связывания на 90100%. Сайт-специфический мутагенез отдельных положений с высоким риском в VH и VK можно использовать для дальнейшей гуманизации антител при сохранении аффинности и специфичности связывания. Гуманизацию можно осуществлять посредством переноса CDR и структурного анализа и воссоздания поверхности вариабельной области (см. Jones et ah, NATURE (1986) May 29-Jun. 4; 321(6069):522-5;Roguska et al., PROTEIN ENGINEERING, 1996, 9(10):895-904 и Studnicka et ah, Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. PROTEIN ENGINEERING, 1994, vol. 7, с. 805). Данные об исходной последовательности антитела и трехмерной структуре можно использовать для того, чтобы идентифицировать ключевые каркасные остатки, которые необходимы для сохранения аффинности и специфичности связывания. Веб-сайт "Blast for Ig sequences", поддерживаемый NCBI, можно использовать для того, чтобы идентифицировать ближайшие совпадения с областями VH и VK мыши, использованными в исследовании. Гены VH и VK зародышевой линии человека можно выбрать в качестве генов,лучше всего совпадающих с последовательностями VH и VK мыши. Альтернативно, последовательности из естественно экспрессируемого репертуара антител человека можно использовать в качестве шаблона для гуманизации в отдельности или в сочетании с ближайшим совпадающим геном зародышевой линии человека. После выравнивания VH и VK антитела мыши против TL1A с ближайшими генами зародышевой линии человека или с генами из экспрессируемого репертуара можно оценить вероятное влияние каждого аминокислотного положения на связывание и иммуногенность. Эту информацию можно использовать для того, чтобы определить низкую, умеренную или высокую степень риска для мутации в каждом положении. В одном из вариантов осуществления мутациям подвергаются только положения с низким или умеренным риском и при этом избегают положений с высоким риском. При необходимости, можно использовать способ созревания аффинности посредством встраивания тирозинов попарно в каждое положение в CDR VH, VK или обоих. Типичное клонирование и секвенирование доменов VH и VK антитела мыши против TL1A из гибридомных клеточных линий. Гибридомные клетки можно осадить, промыть три раза в PBS и выделить РНК с помощью тризола(Invitrogen, номер по каталогу 15596-026), придерживаясь протокола производителя. Из общей РНК можно получить кДНК с использованием набора 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen,номер по каталогу 18374-058), придерживаясь протокола производителя. В кратком изложении РНК можно лигировать со случайным гексамерным праймером, Random N6, а одноцепочечную кДНК можно получить с использованием отрицательной РНК-зависимой ДНК-полимеразы Superscript II RNAase H. кДНК можно очистить с помощью картриджа для центрифугирования GlassMax, который предоставлен с набором, и провести реакцию с TdT (терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза) в присутствииdCTP, чтобы присоединить к 5'-концу кДНК пару оснований С. кДНК с dC на хвосте можно амплифицировать в ПЦР с использованием якорного праймера со специфичностью к dC-хвосту и праймеров со специфичностью к генам, которые гибридизуются с высококонсервативными последовательностями ДНК в константном домене 1 тяжелой цепи мыши (СН 1) для получения VH и в константном домене(CK) для получения VK. Полученный продукт ПЦР можно анализировать электрофорезом в геле, чтобы подтвердить соответствие размеров продуктов размерам интактных доменов VH или VK, затем очистить и лиги-7 020886 ровать в вектор ТОРО ТА (Invitrogen, номер по каталогу K4575-01), придерживаясь протокола производителя. После трансформации в бактерии ДНК можно получить из клонов, содержащих вставку правильного размера, а последовательность ДНК можно определить с использованием реакционной смеси для секвенирования Big Dye Terminator (Applied Biosystems, номер по каталогу 4336699) и ДНКанализатора 3700 ABI/Prism, придерживаясь протокола производителя. Типичная гуманизация антител мыши против TL1A. Антитела мыши против TL1A можно идентифицировать на основе данных о связывании и данных о последовательности, полученных, как описано выше. Аминокислотную последовательность доменов VH и VK этих антител можно выровнять с доменами VH и VK зародышевой линии человека с использованием доступных на сегодняшний день публичных баз данных (т.е. "Blast for IgG" в NCBI и "V-base" вMRC). В тех положениях, в которых каркас последовательности мыши отличается от зародышевой линии человека, можно использовать итеративный процесс для того, чтобы превратить или мутировать каркас мыши так, чтобы он совпадал с соответствующим каркасом зародышевой линии человека. Кроме того, или альтернативно, определенные аминокислотные остатки в CDR VH и VK можно мутировать посредством замены на тирозин (т.е. сделать аффинно зрелыми), чтобы с некоторой вероятностью компенсировать любое снижение аффинности, вызванное изменениями каркасных остатков. Аффиннозрелые и гуманизированные домены VH и VK мыши можно создать с помощью полимеразной цепной реакции с использованием набора перекрывающихся синтетических олигонуклеотидных ДНК. В качестве части процесса конструирования синтетического гена можно использовать способ оптимизации кодонов, другими словами, во все аминокислотные позиции можно встроить кодоны, которые предпочтительно используются клетками млекопитающих для экспрессии генов. Синтетические домены VH и VK можно клонировать в специализированные векторы для экспрессии в млекопитающих, которые делают возможной экспрессию соответствующих доменов в случае полностью гуманизированного остова антитела IgG1, G4 или . Мелкомасштабное получение гуманизированных антител можно осуществить посредством котрансфекции клеток 293F конструкцией IgGl или IgG4 совместно с -конструкцией с использованием Lipofectamine (Invitrogen), придерживаясь протокола производителя. Супернатанты от временно трансфицированных клеток можно пропустить через смолу с белком А или с белком G, и IgG можно очистить до гомогенности для тестирования в клеточных тестах. Следующие примеры приведены для того, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение. Однако следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными условиями или деталями, описанными в этих примерах. Все опубликованные и/или общедоступные документы, описываемые в настоящем документе, в полном объеме включены по ссылке. Пример 1. Ранее продемонстрировано получение аминокислотных последовательностей доменов VH и VK моноклональных антител мыши и хомяка против TL1A, как описано в настоящем документе. Области Пример 2. В этом примере описан протокол теста для измерения ингибирования активности каспаз, индуцированных с использованием TL1A, в клетках TF-1. Для определения нейтрализующей активности антител против TL1A определяли их влияние на активность каспаз, индуцированных с использованием TL1A, в клетках TF-1; см. фиг. 1. Клетки TF-1 высевали по 75000 клеток на лунку в черный 96-луночный планшет с прозрачным дном в среду RPMI, содержащую 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл циклогексамидом и 100 нг/мл TL1A в присутствии или в отсутствие различных концентраций родительских антител мыши или хомяка против TL1A в течение 6 ч при 37 С. Активность каспаз измеряли с помощью Apo-One Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit (Promega). В каждую лунку с клетками добавляли равные объемы буфераApo-One Homogeneous Caspase-3/7 Assay, содержащего субстрат каспаз Z-DEVD-Rhodamine. После инкубирования в течение ночи измеряли флуоресценцию во флуоресцентном ридере планшетов Wallac Victor2 с фильтром для возбуждающего света 485 нм и фильтром для испускаемого света 535 нм. Результаты, приведенные на фиг. 1, показывают, что уровень флуоресценции, который коррелирует с активностью каспаз, снижается при увеличении концентрации четырех (4) различных антител противTL1A: AT1 - 19 Е 06, AT3 - 15 Е 09, AT4 - 16 Н 02 и AT 8 - 12D08. Специалистам в данной области будет ясно, что различные модификации и изменения можно выполнять в способах и композициях по настоящему изобретению без отклонения от сущности или объема изобретения. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение покрывает модификации и изменения по данному изобретению, предусмотренные объемом прилагаемыми пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.