Антитела к дельта-подобному лиганду 4 человека и их применение

Приведено описание выделенного антитела, которое специфически связывается с внеклеточным доменом DLL4 человека и влияет на рост опухоли, содержащей раковые стволовые клетки. Кроме того, приведено описание способа лечения рака, включающего в себя введение терапевтически эффективного количества антитела против DLL4. Область применения Настоящее изобретение относится к области онкологии и предоставляет новые композиции и способы для диагностики и лечения рака. Настоящее изобретение относится к антителам против маркера раковой стволовой клетки для диагностики и лечения солидных опухолей. Уровень техники Рак представляет собой ведущую причину смерти в развитых странах, причем более 1 миллиона людей получают диагноз рак и 500000 умирают в год только в Соединенных Штатах. В целом определили, что более чем у 1 из 3 человек разовьется рак в течение жизни. Существует более 200 различных типов рака, четыре из которых - рак молочной железы, легкого, ободочной и прямой кишки и предстательной железы - служат причиной более половины всех новых случаев (Jemal et al., 2003, Cancer. J. Clin. 53:5-26). Рак молочной железы является наиболее распространенным раком у женщин, при этом 12% женщин оценивают как подверженных риску развития заболевания в течение жизни. Хотя уровень смертности уменьшился благодаря более ранней детекции и улучшенным способам лечения, рак молочной железы остается ведущей причиной смерти у женщин средних лет, и метастазирующий рак молочной железы до сих пор является неизлечимым заболеванием. При его проявлении большинство пациентов с метастазирующим раком молочной железы обладают только одной или двумя пораженными системами органов,однако при прогрессировании заболевания множество участков обычно становятся пораженными. Наиболее распространенные участки метастатического поражения представляют собой местные рецидивы на коже и в мягких тканях стенки грудной клетки, так же как в подмышечной впадине и надключичных областях. Наиболее распространенным участком отдаленного метастазирования является кость (30-40% отдаленного метастазирования), затем легкие и печень. И хотя только приблизительно 1-5% женщин с впервые диагностированным раком молочной железы обладают отдаленным метастазированием на время диагноза, приблизительно у 50% пациентов с местным заболеванием, в конечном счете, происходит рецидив с метастазированием в течение пяти лет. В настоящее время медиана выживаемости от проявления отдаленного метастазирования составляет приблизительно три года. Современные способы диагностики и определения стадии рака молочной железы включают в себя систему опухоль-узел-метастаз (TNM), основанную на размере опухоли, присутствии опухоли в лимфатических узлах и присутствии отдаленного метастазирования (American Joint Committee on Cancer.: AJCCPhiladelphia, Lippincott, 1991). Эти параметры используют для определения прогноза и выбора соответствующей терапии. Морфологические признаки опухоли также можно оценивать, однако, поскольку опухоли со сходными гистопатологическими признаками могут обладать значительной клинической изменчивостью, этот способ обладает серьезными ограничениями. Наконец, анализы маркеров поверхности клеток можно использовать для разделения определенных опухолей на подклассы. Например, одним из факторов, учитываемым при прогнозировании и лечении рака молочной железы, является присутствие рецептора эстрогенов (ER), так как ER-положительные типы рака молочной железы, как правило, отвечают более полно на гормональные лекарственные средства, такие как тамоксифен или ингибиторы ароматазы, чем ER-отрицательные опухоли. До сих пор эти анализы, хотя и являются полезными, являются только частично предсказательными для клинического поведения опухолей молочной железы, и существует большое фенотипическое разнообразие, присутствующее в типах рака молочной железы, которое невозможно детектировать современными диагностическими средствами и невозможно лечить современными видами терапии. Рак предстательной железы является наиболее распространенным раком у мужчин в развитых странах, представляющим, как оценивают, 33% от всех новых случаев рака в США, и является второй из наиболее частых причин смерти (Jemal et al., 2003, СА Cancer. J. Clin. 53:5-26). После введения анализа крови на специфический антиген простаты (PSA) ранняя детекция рака предстательной железы чрезвычайно улучшила уровни выживаемости; уровень пятилетней выживаемости пациентов с местной и регионарной стадией рака предстательной железы на время диагностики составляет около 100%. Тем не менее, у более 50% пациентов будет, в конечном счете, развиваться местно распространенное или метастазирующее заболевание (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16). В настоящее время радикальная простатэктомия и радиотерапия обеспечивают радикальное лечение для большинства локализованных опухолей предстательной железы. Однако терапевтические возможности очень ограничены для запущенных заболеваний. В случае метастазирующего заболевания удаление андрогена с помощью агониста гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон(LHRH), отдельно или в сочетании с антиандрогенами, является общепринятым лечением. Тем не менее,несмотря на максимальную блокаду андрогенов, заболевание почти всегда прогрессирует с развитием у большинства андроген-независимого заболевания. В настоящее время не существует единственного принятого лечения для устойчивого к гормонам рака предстательной железы, и общепринятыми являются химиотерапевтические режимы (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16; Trojan et al., 2005,Anticancer Res. 25:551-61). Рак ободочной и прямой кишки является третьим из наиболее распространенных видов рака и четвертой из наиболее частых причин смерти от рака во всем мире (Weitz et al., 2005, Lancet 365:153-65). Приблизительно 5-10% от всех типов рака ободочной и прямой кишки являются наследственными, где одной из основных форм является семейный аденоматозный полипоз (FAP), аутосомно-доминантное заболевание, при котором приблизительно 80% пораженных индивидуумов несут зародышевую мутацию в гене аденоматозного полипоза кишечника (APC). Колоректальные карциномы распространяются локально посредством периферического роста и в других местах посредством лимфатического, гематогенного, чрезбрюшинного и периневрального распространения. Наиболее распространенным участком экстралимфатического поражения является печень, причем легкие являются наиболее часто поражаемым экстраабдоминальным органом. Другие участки гематогенного распространения включают в себя кости,почки, надпочечники и мозг. Современная система определения стадий для рака ободочной и прямой кишки основана на степени проникновения опухоли через стенку кишечника и присутствии или отсутствии поражения лимфатических узлов. Эту систему определения стадий определяют по трем главным классификациям Дюка: заболевание А по Дюку ограничено подслизистыми слоями ободочной или прямой кишки; заболевание В по Дюку обладает опухолями, которые проникают через собственную мускулатуру ободочной или прямой кишки и могут проникать через стенку ободочной или прямой кишки; и заболевание С по Дюку включает в себя любую степень инвазии стенки кишечника с метастазированием регионарного лимфатического узла. В то время как хирургическое удаление является высокоэффективным для ранних стадий рака ободочной и прямой кишки, обеспечивая показатели эффективности лечения 95% для пациентов с заболеванием А по Дюку, показатель снижается до 75% для пациентов с заболеванием В по Дюку, а при присутствии положительного лимфатического узла при заболевании С по Дюку предсказывают 60% вероятность рецидива в течение пяти лет. Лечение пациентов с заболеванием С по Дюку с помощью послеоперационного курса химиотерапии снижает частоту рецидива до 40-50% и в настоящее время является стандартом лечения для этих пациентов. Рак легкого является наиболее распространенным раком во всем мире, третьим из наиболее часто диагностируемых типов рака в Соединенных Штатах и, несомненно, наиболее частой причиной смерти от рака (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96; Jemal et al., 2003, CA Cancer. J. CHn. 53:5-26). Считают, что курение сигарет является ответственным за приблизительно 87% всех типов рака легкого, что делает их наиболее смертельными из предотвращаемых заболеваний. Рак легкого разделяют на два главных типа, которые составляют более 90% всех типов рака легкого: мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). SCLC составляет 15-20% случаев и характеризуется его возникновением в крупных центральных дыхательных путях и гистологическим составом из слоев мелких клеток с небольшим количеством цитоплазмы. SCLC является более активным, чемNSCLC, быстро растущим и рано метастазирующим. NSCLC составляет 80-85% от всех случаев, и его дополнительно разделяют на три главных подтипа на основании гистологии: аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома (эпидермоидная карцинома) и крупноклеточная недифференцированная карцинома. Рак легкого, как правило, проявляется поздно в его течении и, таким образом, обладает медианой выживаемости только 6-12 месяцев после диагноза, и общий уровень 5-летней выживаемости составляет только 5-10%. Хотя хирургия предоставляет наилучший шанс на излечение, она применима только для небольшой части пациентов с раком легкого, причем большинство полагается на химиотерапию и радиотерапию. Несмотря на попытки варьировать время и интенсивность дозы этих видов терапии, уровни выживаемости только немного увеличились за последние 15 лет (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit.Care Med. 166:1166-96). Эти четыре типа рака, так же как многие другие, проявляются как солидные опухоли, состоящие из гетерогенных популяций клеток. Например, при раке молочной железы присутствует смесь раковых клеток и нормальных клеток, включая мезенхимальные (стромальные) клетки, воспалительные клетки, и эндотелиальные клетки. Несколько моделей рака предоставляют различные объяснения присутствия этой гетерогенности. Одна модель, классическая модель рака, подразумевает, что все фенотипически различные популяции клеток обладают способностью пролиферировать и давать начало новой опухоли. В классической модели гетерогенность клеток опухоли является результатом внешних факторов, так же как непрерывных мутаций в раковых клетках, что приводит к разнообразной популяции вызывающих образование опухоли клеток. Эта модель основана на идее, что все популяции опухолевых клеток до некоторой степени обладают потенциалом к образованию опухоли (Pandis et al., 1998, Genes, ChromosomesCancer. 12:122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer. Res. 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer. 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes ChromosomesCancer. 82:173-183; Beerman H. et al., 1991,Cytometry. 12:147-54; Aubele M.Werner M., 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53; Shen L. et al., 2000, Cancer.Res. 60:3884). Альтернативная модель для наблюдаемой гетерогенности клеток солидной опухоли вытекает из вклада стволовых клеток в развитие опухоли. Согласно этой модели рак возникает в результате нарушения регуляции механизмов, контролирующих нормальное развитие и поддержание тканей (Beachy et al.,2004, Nature. 432:324). Во время нормального развития животного клетки большинства или всех тканей происходят из нормальных предшественников, называемых стволовыми клетками (Morrison et al., 1997,Cell. 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell.Dev. Biol. 11:35-71). Стволовые клетки представляют собой клетки, которые:(1) обладают избыточной способностью к пролиферации;(2) способны к асимметричному делению клеток с образованием одного или нескольких видов потомства со сниженной способностью к пролиферации и/или развитию и(3) способны к симметричным делениям клеток для самообновления или самоподдержания. Наиболее хорошо изученным примером обновления взрослых клеток посредством дифференцировки стволовых клеток является гематопоэтическая система, где незрелые по развитию предшественники(гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники) отвечают на молекулярные сигналы с образованием различных типов клеток крови и лимфоидных клеток. Другие клетки, включая клетки кишечника, системы протоков молочной железы и кожи, постоянно пополняются из небольшой популяции стволовых клеток в каждой ткани, и недавние исследования позволяют предполагать, что большинство других взрослых тканей также несут стволовые клетки, включая мозг. Опухоли, происходящие из "стволовой клетки солидной опухоли" (или "раковой стволовой клетки" из солидной опухоли), затем подвергаются хаотическому развитию посредством циклов как симметричного, так и асимметричного деления клеток. В этой модели стволовых клеток солидные опухоли содержат отдельную и ограниченную (возможно, даже редкую) подгруппу клеток, которые обладают общими свойствами с нормальными "стволовыми клетками", в том, что они интенсивно пролиферируют и эффективно дают начало как дополнительным стволовым клеткам солидной опухоли (самообновление), так и большинству опухолевых клеток солидной опухоли, у которых отсутствует потенциал к образованию опухоли. Действительно, мутации внутри долгоживущей популяции стволовых клеток могут вызывать формирование раковых стволовых клеток, которые лежат в основе роста и поддержания опухолей и присутствие которых вносит вклад в неудачу современных терапевтических способов. Происхождение рака из стволовых клеток впервые выявили для рака крови, острого миелоидного лейкоза (AML) (Lapidot et al., 1994, Nature. 17:645-8). Позднее показали, что злокачественные опухоли молочной железы и ободочной кишки человека подобным образом содержат небольшую отдельную популяцию раковых стволовых клеток, обогащенных по способности формировать опухоли у мышей с иммунодефицитом. Обнаружили, что популяция клеток ESA+, CD44+, CD24-/низкий, Lin- в опухолях молочной железы является в 50 раз обогащенной вызывающими образование опухоли клетками по сравнению с нефракционированными опухолевыми клетками (Al-Hajj et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 100:3983-8). Подобным образом обнаружили, что субпопуляция ESA+, CD44+ в опухолях ободочной и прямой кишки содержит единственно вызывающие образование опухоли клетки, и добавление CD166 к этому профилю позволяет дополнительное обогащение по стволовым клеткам рака ободочной кишки(CoCSC) (Dalerba et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. 104:10158-63). Возможность в перспективе выделять вызывающие образование опухоли раковые клетки позволяет исследование критических биологических путей, лежащих в основе способности этих клеток образовывать опухоли, и, таким образом, обещает развитие лучших диагностических анализов и лекарственных средств для пациентов с раком. Это приближает к цели, на которую направлено это изобретение. Краткое изложение сущности изобретения Представлены антитела, которые специфически связываются с эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4) человека, сформированного сочетанием N-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и домена DSL человека (SEQ ID NO: 26), где антитело влияет на рост опухоли. Представлена также фармацевтическая композиция, содержащая антитело по настоящему описанию и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, представлен способ лечения рака, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела против DLL4 по настоящему описанию. Дополнительные объекты и преимущества изобретения частично будут описаны в последующем описании, и частично будут являться очевидными из описания, или их можно будет узнать из практического осуществления изобретения. Объекты и преимущества изобретения можно осуществить и получить посредством элементов и сочетаний, в частности, указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что как приведенное выше общее описание, так и последующее подробное описание являются только примерными и разъясняющими и не являются ограничивающими изобретение, как указано в формуле изобретения. Приложенные чертежи, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют несколько вариантов осуществления изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения. В описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылку на множественное число, если контекст явно не требует иного. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Специфическое связывание антител 21 М 18 против DLL4 с нативным белком поверхности клеток DLL4. Клетки HEK 293, трансфицированные совместно полноразмерным DLL4 и GFP, инкубировали с антителами против DLL4 и сортировали посредством FACS. Для антител против DLL4 21 М 14 и 21 М 18 показали специфическое связывание с клетками, экспрессирующими DLL4, как видно по линейной взаимосвязи между связыванием антитела против DLL4 и экспрессией GFP. Фиг. 2. Антитела против DLL4 блокируют взаимодействие DLL4 человека с рецептором Notch: А) Клетки HEK 293, экспрессирующие DLL4, инкубировали с Notch-Fc или контрольным белком Fc в присутствии антител против DLL4 или контрольных антител. Высокая интенсивность флуоресценции указывает на присутствие связывания Notch и DLL4 в присутствии контрольного антитела (линия 2) и антител 21 М 12 против DLL4 (линия 5). Низкая интенсивность флуоресценции указывает на отсутствие взаимодействий Notch и DLL4 в отсутствие Notch (линия 1) и нарушение взаимодействий Notch и DLL4 в присутствии антител против DLL4 21 М 18 (линия 3) и 21 М 14 (линия 4). В) Клетки HEK 293, экспрессирующие Notch 1, инкубировали с DLL4-FC либо человека, либо мыши. Связывание детектировали посредством флуоресцентно меченых анти-Fc и анализировали посредством FACS, где высокая интенсивность флуоресценции является показательной для связывания междуDLL4 и клетками, экспрессирующими Notch1. 21 М 18 блокирует связывание DLL4 человека (серые квадраты), но не DLL4 мыши (черные круги) с рецептором Notch. Фиг. 3. Картирование эпитопов антител против DLL4: А) Слитые белки с вложенными делециями внеклеточного домена DLL4 человека инкубировали в анализе ELISA с антителами против DLL4 21 М 14 и 21 М 18. Не обнаружили связывания выше фонового в присутствии слитых белков, содержащих аминокислоты между 1 и 154 (ак 1-96, белый столбец с черными точками; ак 1-154, черный столбец с белыми точками). В отличие от этого, детектировали связывание между антителами против DLL4 и всеми слитыми белками, содержащими аминокислоты между 1 и 217,включая домен DSL, из DLL4 (ак 1-217, столбец с горизонтальными полосами; ак 1-251, столбец с диагональными полосами; ак 1-283, заштрихованный столбец; ак 1-323, серый столбец с белыми точками). В) На вестерн-блотах показали экспрессию белков DLL4 человека (h-DLL4) с С-концевыми делециями и химерных слитых белков мышиный-человеческий DLL4 (анти-hFc; верх). Слитые белки с DLL4 содержат один или несколько из доменов 1-6, где домены 1 и 2 представляют собой N-концевые аминокислоты 1-154; домен 3 представляет собой домен DSL от аминокислоты 155 до 217; и каждый из доменов 4, 5 и 6 представляет собой домен EGF, как графически изображено на С. Антитела 21 М 18 узнают белок h-DLL4 только в присутствии аминокислот 1-217 (h-DLL4 домен 1-3). В отличие от белка человека 21 М 18 не узнает слитые белки (m-DLL4 домен 1-3:h-DLL4 домен 4-6), содержащие аминокислоты 1-217(домен 1-3) DLL4 мыши (m-DLL4). 21M18 еще узнает слитые белки, содержащие аминокислоты 1-154h-DLL4 (домен 1-2) в присутствии домена 3 мыши (h-DLL4 домен 1-2:m-DLL4 домен 3-6). С) Показано схематическое обобщение данных связывания. Сверху показана доменная структураDLL4 со слитыми белками с DLL4, перечисленными и показанными схематически на левой стороне, где белок человека представлен светло-серым, а белок мыши представлен темно-серым. Связывание 21 М 18 с каждым фрагментом DLL4 отмечено "+" в сопоставлении с "-".D) Анализ ELISA связывания 21 М 18 с фрагментами белка DLL4, содержащих замену соответствующих мышиных остатков на человеческие остатки в выбранных положениях. Для 21 М 18 показали нарушенное связывание с фрагментами белка DLL4 с заменами аминокислот 68, 69 и 71 (замена валина,валина и пролина) или аминокислот 142 и 144 (замена лизина и аланина). Е) Анализ ELISA связывания антител 21 М 18 и 21 М 21 с фрагментами белка DLL4, содержащими замену соответствующих мышиных остатков на человеческие остатки в выбранных положениях внутри домена DSL. Для антитела 21 М 21 показали нарушенное связывание с фрагментами белка DLL4 человека, содержащими аминокислотные замены аминокислот 161 и 162 (замена треонина и серина). Поскольку 21 М 21 не нарушает функциюDLL4 в анализах передачи сигнала (см. фиг. 6), это показывает, что не все антитела, связывающиеся с областью DSL, влияют на функцию DLL4. Фиг. 4. Выравнивание последовательности вариабельной области тяжелой цепи: А) Показаны исходная последовательность антитела мыши 21 М 18 (m-21M18-Vh, сверху), человеческая экспрессированная каркасная последовательность (h-EST-каркас, в середине) и последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного 21 М 18 (21 М 18-Н 7, снизу) с консервативными аминокислотными остатками, закрашенными черным. Отмечены три CDR, что показывает сохранение исходных мышиных последовательностей в гуманизированном антителе 21 М 18. Остаток цистеина в положении 52 а по Kabat в CDR2 заменен на остаток серина и валина без потери специфического связывания с D114 в 21 М 18 Н 7 и 21 М 18 Н 9, соответственно. Замены внутри каркасной области, показанные на 4 А, пронумерованы 1-6 с соответствующими положениями по Kabat в положениях 16, 20, 27, 28, 38,48 в цепи Vh. В) Показаны исходная последовательность антитела 21 М 18 мыши (m-21Ml8-Vh, сверху), последовательность Vh зародышевой линии человека (h-зародышевая-Vh, в середине) и последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного 21 М 18 (21 М 18-H2, снизу) с консервативными аминокислотными остатками, закрашенными черным. Отмечены три CDR, что показывает сохранение исходных мышиных последовательностей в гуманизированном антителе 21 М 18. Остаток цистеина в положении 52 а по Kabat в CDR2 заменен на остаток серина и валина без потери специфического связывания с D114 в 21 М 18 Н 7 и 21 М 18 Н 9 соответственно. Пять сохраненных мышиных остатков внутри вариабельной каркасной области всех вариантов тяжелой цепи пронумерованы 1-5 в соответствующих им положениях по Kabat 20, 28, 38, 48 и 69. Фиг. 5. Выравнивание последовательности вариабельной области легкой цепи. Показаны исходная последовательность антитела мыши 21 М 18 (m-21M18-Vk, сверху), последовательность зародышевой линии человека (h-зародышевая Vk, снизу) и последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного 21 М 18 (21M18-L2, в середине) с консервативными аминокислотными остатками, закрашенными черным. Отмечены три CDR, что показывает сохранение исходных мышиных последовательностей в гуманизированном антителе 21 М 18. Два сохраненных мышиных остатка внутри вариабельной каркасной области пронумерованы 1-2 в соответствующих им положениям по Kabat 22 и 36. Фиг. 6. Антитела против DLL4 блокируют передачу сигнала Notch. Клетки HeLa, трансфицированные совместно векторами с репортером HES1-Luc и с репортером люциферазы Renilla, инкубировали с белком DLL4-FC в присутствии или в отсутствие антител против DLL4. Сниженные уровни люциферазы показывают ослабление активации DLL4 пути Notch посредством антител 21 М 14 и 21 М 18. Фиг. 7. Антитела против DLL4 модулируют экспрессию генов-мишеней для Notch в опухолях ободочной кишки: А) Выделяли опухоли ободочной кишки С 8, обработанные антителами 21 М 18 против DLL4 илиPBS (контроль), и определяли экспрессию HES1 и ATOH-1 посредством количественной RT-ПЦР. Относительная экспрессия гена (y-ось) по сравнению с клетками после контрольной обработки показывает,что обработка антителами против DLL4 уменьшала экспрессию HES1 и увеличивала экспрессию АТОН-1. В) Показано соотношение относительной экспрессии (у-ось) HES1 относительно АТОН 1 в колониях линейно истощенных клеток опухоли ободочной кишки ОМР-С 11 мыши. Для колоний С 11, покрытых клетками 3T3 со сверхэкспрессией DLL4 (3T3+DLL4), показали увеличение соотношения экспрессииHES1/ATOH1 по сравнению с клетками ободочной кишки, покрытых клетками 3T3 (3 Т 3) или не подвергавшихся воздействию покрывающего слоя клеток (контроль). Это увеличение соотношения экспрессииHES1/ATOH1 прекращали посредством инкубации с 10 мкг/мл антител 21 М 18 (21 М 18) или с 5 мкМ ингибитором секретазы DBZ (5 мкМ GSI). Фиг. 8. Антитела против DLL4 уменьшают рост опухоли. Мышам NOD/SCID вводили инъекции диссоциированных клеток UM-C4 и обрабатывали их антителами 21 М 18 против DLL4 (n=5) или PBS (n=10). Обработка антителами 21 М 18 (ромбы) уменьшала рост опухоли начиная с суток 23, и уменьшение вплоть до 54% наблюдали на сутки 48 по сравнению с контролями после инъекции PBS (черные квадраты). Фиг. 9. Обработка антителами против DLL4 снижает число пролиферирующих опухолевых клетокin vivo. Выделяли опухоли ободочной кишки С 8, обработанные антителами 21 М 18 против DLL4 или контрольными Ab. Иммуногистохимически с помощью антитела против Ki67 показали снижение числа пролиферирующих клеток в опухолях, обработанных 21 М 18, по сравнению с контролем. Фиг. 10. Обработка антителами против DLL4 в сочетании с фторурацилом (5-FU) уменьшает рост опухоли. Мышам NOD/SCID вводили инъекции диссоциированных клеток UM-C4, и обрабатывали их антителами против DLL4 или PBS в присутствии или в отсутствие 5-FU: А) Обработка антителами 21 М 18 в сочетании с 5-FU (круги, штриховая линия) уменьшала рост опухоли через 46 суток после инъекции опухолевых клеток в большей степени, чем обработка либо 5-FU(треугольники, сплошная линия), либо антителами 21 М 18 (ромбы, пунктирная линия) по отдельности, и в большей степени, чем в контролях после инъекции PBS (квадраты, сплошная линия). Объем опухоли в мм 3 указан на y-оси. В) Графики измерений опухоли индивидуальных животных на сутки 46. Каждая точка представляет одного животного. Каждая из обработок антителами 21 М 18 или 5-FU уменьшала размер опухоли (мм 3) по сравнению с контролем. Более того, комбинированная обработка антителами 21 М 18 и 5-FU обладала аддитивным эффектом, снижая размер опухоли до 1/5 размера контроля. Фиг. 11. Обработка антителами против DLL4 в сочетании с антителами против EGFR уменьшает рост опухоли. Мышам NOD/SCDD вводили инъекции диссоциированных клеток UM-C4, и обрабатывали их антителами против DLL4 или PBS в присутствии или в отсутствие антител против EGFR. Показаны графики измерений опухолей индивидуальных животных на сутки 46. Каждая точка представляет одного животного. Каждая из обработок антителами 21 М 18 или антителами против EGFR уменьшала размер опухоли (мм 3) по сравнению с контролем. Более того, комбинированная обработка антителами 21 М 18 и антителами против EGFR обладала аддитивным эффектом, снижая размер опухоли до менее чем 1/5 от размера контроля. Фиг. 12. mAb 21M18 против DLL4 и иринотекан действуют синергически для ингибирования роста опухоли ободочной кишки. Мышам NOD/SCID вводили инъекции диссоциированных клеток С 8 и обрабатывали их антителами против DLL4 или контрольным антителом в присутствии или в отсутствие ири-5 018260 нотекана: А) Каждая из обработок антителами 21 М 18 мыши (круги) или иринотеканом (треугольники) по отдельности уменьшала объем опухоли (у-ось, мм 3) по сравнению с животными после контрольной обработки (черные квадраты). Однако комбинированное лечение 21 М 18 и иринотеканом (перевернутые треугольники) обладало синергическим эффектом, полностью прекращая рост опухоли вплоть до 55 суток после инъекции клеток. В) Обработка гуманизированным 21 М 18 (h21M18) в сочетании с иринотеканом (irtcn) (круги) обладала эффективностью, сходной с эффективностью мышиного 21 М 18 (m21 М 18) (треугольники) по сравнению с контрольным антителом (черные квадраты) или контрольным антителом с иринотеканом (треугольники). Фиг. 13. Комбинированная обработка анти-DLL4 21M18 и иринотеканом предупреждает повторный рост опухоли ободочной кишки. Мышам NOD/SCID вводили инъекции диссоциированных клеток С 8, и обрабатывали их иринотеканом или иринотеканом в сочетании с антителами 21 М 18 против DLL4 (n=10 на группу): А) Обработка одним иринотеканом замедляла рост опухоли, однако рост продолжался после прекращения лечения на сутки 56 ( стрелка) у всех, кроме двух животных после лечения. В) В отличие от этого, обработка сочетанием иринотекана и антител 21 М 18 против DLL4 прекращала рост опухоли ободочной кишки как во время лечения, так и в течение вплоть до пяти недель после прекращения лечения на сутки 56 у всех десяти животных после лечения. Каждая линия представляет кривую роста для индивидуального животного. Фиг. 14. Комбинированная обработка анти-DLL4 21M18 и иринотеканом ингибирует рост прижившихся опухолей ободочной кишки более эффективно, чем обработка монотерапией. Мышам NOD/SCID вводили инъекции диссоциированных клеток С 8 и обрабатывали их антителами против DLL4 или контрольным антителом в присутствии или в отсутствие иринотекана. Каждая из обработок антителами 21 М 18 (ромбы) или иринотеканом (треугольники) по отдельности уменьшала объем опухоли (у-ось, мм 3) по сравнению с животными после контрольной обработки (черные квадраты). Однако комбинированная обработка 21 М 18 плюс иринотекан (перевернутые треугольники) ингибировала рост опухоли более эффективно, чем обработка либо 21 М 18, либо иринотеканом по отдельности. Фиг. 15. Для опухолей, обработанных антителами против DLL4, показали сниженное число вызывающих образование опухоли клеток. Мышам с иммунной недостаточностью (n=10 на группу) вводили инъекции уменьшающихся доз опухолевых клеток из эксперимента, показанного на фиг. 14, которые обрабатывали контрольным антителом, иринотеканом плюс контрольное антитело, только антителами 21 М 18 против DLL4, или сочетанием антител против DLL4 21 М 18 и иринотекана (сочетание): А) Результаты для частоты приобретения опухолей на сутки 81. Объем опухоли (мм 3) наносили на график по сравнению с числом инъецированных клеток опухоли человека: 900, 300, 100 и 50 для каждой группы обработки. Число животных с поддающимися детекции опухолями из десяти животных после инъекции для каждой дозы опухолевых клеток записано под графиком объема опухоли для каждой дозы клеток,где опухолевые клетки после контрольной обработки - слева (закрашенные круги), обработанные антителом 21 М 18 против DLL4 опухолевые клетки - вторые слева (незакрашенные квадраты), обработанные иринотеканом опухолевые клетки - вторые справа (закрашенные треугольники), и опухолевые клетки после комбинированной обработки - справа (незакрашенные круги). В) Подсчитывали частоту стволовых клеток на сутки 81. Доля раковых стволовых клеток (у-ось) от контрольной обработки (слева) по сравнению с опухолевыми клетками, обработанными анти-DLL4 (вторые слева), обработанными только иринотеканом (вторые справа) и после комбинированной обработки(справа), нанесена на график с 95% доверительным интервалом. Группа после обработки анти-DLL4 обладает статистически значимой разницей по сравнению с контрольной группой , и комбинированная группа значимо отличается как от контрольной группы , так и от группы одного иринотекана . Фиг. 16. Комбинированная обработка анти-DLL4 21M18 и иринотеканом задерживает рецидив опухоли. Мышам с иммунной недостаточностью вводили инъекции диссоциированных клеток С 8 и прижившиеся опухоли приблизительно 150 мм 3 обрабатывали сочетанием иринотекана (45 мг/кг, дозировка дважды в неделю) либо с антителами 21 М 18 против DLL4, либо с контрольными антителами в течение 32 суток, после чего обработку иринотеканом прекращали. Обработку либо контрольным антителом,либо 21 М 18 продолжали. Повторное возникновение опухолей по объему опухолей (у-ось) задерживалось у обработанных 21 М 18 животных (треугольники) по сравнению с контрольными (круги). Фиг. 17. Комбинированная обработка анти-DLL4 21M18 и иринотеканом задерживает рецидив опухоли. Показаны индивидуальные животные из эксперимента, показанного на фиг. 16. Показан общий объем опухоли (у-ось) у каждого животного через 47 суток после прекращения обработки иринотеканом. Фиг. 18. Сочетание анти-DLL4 21M18 и анти-VEGF уменьшает рост опухоли. Имплантировали опухолевые клетки С 17 и спустя двое суток начинали обработку контрольным антителом (черные квадраты, сплошная линия), 21 М 18 (треугольники, штриховая линия), анти-VEGF (ромбы, сплошная линия) или сочетанием обоих антител (круги, пунктирная линия). Каждое антитело дозировали при 10 мг/кг,вводили дважды в неделю, и присутствовало по 10 животных на группу. Как 21 М 18, так и анти-VEGF снижали рост опухоли, и сочетание являлось более эффективным, чем любое отдельное антитело. Описание вариантов осуществления Термин "антитело" используют для обозначения молекулы иммуноглобулина, который распознает и специфически связывает мишень, такую как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или сочетания вышеупомянутого посредством по меньшей мере одного участка узнавания антигена внутри вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению включают в себя антитела-антагонисты, которые специфически связывают маркерный белок раковой стволовой клетки и мешают, например, связыванию лиганда, димеризации рецептора, экспрессии маркерного белка раковой стволовой клетки и/или нижележащую передачу сигнала маркерным белком раковой стволовой клетки. В конкретных вариантах осуществления описанные антитела включают в себя антитела-агонисты, которые специфически связывают маркерный белок раковой стволовой клетки и способствуют, например, связыванию лиганда, димеризации рецептора и/или передаче сигнала маркерным белком раковой стволовой клетки. В конкретных вариантах осуществления описанные антитела не препятствуют или не способствуют биологической активности маркерного белка раковой стволовой клетки, однако ингибируют рост опухоли посредством, например, интернализации и/или распознавания иммунной системой антитела. Как применяют здесь, термин "антитело" охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv), одноцепочечные мутанты Fv (scFv), мультиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, полученные по меньшей мере из двух интактных антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, слитые белки, содержащие узнающую антиген часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина,содержащую участок узнавания антигена, пока антитела обладают желаемой биологической активностью. Антитело может относиться к любому из пяти главных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE,IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), основанных на идентичности константных доменов их тяжелых цепей, обозначаемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов обладают различными и хорошо известными субъединичными структурами и трехмерными конфигурациями. Антитела могут являться голыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоактивные изотопы и т.д. Как применяют здесь, термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела и относится к узнающим антиген вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя в качестве неограничивающих примеров фрагментыFab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител."Fv антитело" относится к минимальному фрагменту антитела, содержащему полный участок узнавания и связывания антигена либо в виде двух цепей, в которых вариабельный домен одной тяжелой и одной легкой цепи формируют нековалентный димер, либо в виде одной цепи (scFv), в которой вариабельные домены одной тяжелой и одной легкой цепей ковалентно связаны гибким пептидным линкером,так что две цепи соединены в подобную димерную структуру. В этой конфигурации определяющие комплементарность области (CDR) каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антигенсвязывающей специфичности димера Fv. Альтернативно, один вариабельный домен (или половину изFv) можно использовать для узнавания и связывания антигена, хотя, как правило, с более низкой аффинностью."Моноклональное антитело", как применяют здесь, относится к гомогенной популяции антител, вовлеченных в высокоспецифичное узнавание и связывание одной антигенной детерминанты, или эпитопа. В этом их отличие от поликлональных антител, которые, как правило, включают в себя различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин "моноклональное антитело" охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, так же как фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные мутанты (scFv), слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую участок узнавания антигена. Более того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, полученным любым числом способов, включая в качестве неограничивающих примеров гибридому, фаговый отбор, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных. Как применяют здесь, термин "гуманизированное антитело" относится к формам не относящихся к человеку (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулинов, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, содержащие минимальные не относящиеся к человеку последовательности. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из определяющих комплементарность областей (CDR) внутри области узнавания антигена (или гипервариабельной области) из вариабельной области цепи или цепей антитела заменены остатками из CDR не относящихся к человеку видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), обладающей желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) вариабельной цепи иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками антитела из не относящихся к человеку видов, обладающего желаемой специфично-7 018260 стью, аффинностью и емкостью. Гуманизированное антитело можно дополнительно модифицировать посредством замены дополнительного остатка или в вариабельной каркасной области и/или внутри замененных не относящихся к человеку остатков для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или емкости антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все по меньшей мере из одного и, как правило, двух, или трех, или четырех вариабельных доменов, содержащих все или по существу все из областей CDR, соответствующих не относящемуся к человеку иммуноглобулину, в то время как все или в основном все области FR являются областями FR с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека. Примеры способов, применяемых для получения гуманизированных антител, описаны в патенте США 5225539. Термин "антитело человека", как применяют здесь, обозначает антитело, продуцируемое человеком, или антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей антителу, продуцируемому человеком, полученное с использованием любого способа, известного в данной области. Это определение "антитело человека" охватывает интактные или полноразмерные антитела, их фрагменты, и/или антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой и/или легкой цепи человека,например, такое как антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека."Гибридные антитела" представляют собой молекулы иммуноглобулина, в которых пары тяжелых и легких цепей из антител с различными областями антигенных детерминант объединены вместе, так что полученный тетрамер может узнавать и связывать два различных эпитопа или два различных антигена. Термин "химерные антитела" относится к антителам, где аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена из двух или нескольких видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител, полученных из одного вида млекопитающих (например, мышь, крыса, кролик и т.д.), с желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью, в то время как константные области являются гомологичными последовательностям антител, полученных из другого вида (обычно человек), чтобы избежать вызывания иммунного ответа у этого вида. Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" используют здесь взаимозаменяемо, и они обозначают ту часть антигена, которую может узнавать и специфически связывать конкретное антитело. Когда антиген представляет собой полипептид, эпитопы могут быть сформированы как из соседних аминокислот, так и не из соседних аминокислот, располагаемых рядом посредством четвертичного сворачивания белка. Эпитопы, сформированные из соседних аминокислот, как правило, сохраняются при денатурации белка, в то время как эпитопы, сформированные посредством четвертичного сворачивания, как правило, теряются при денатурации белка. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3 и более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Конкуренцию между антителами определяют посредством анализа, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном. Известны многочисленные типы анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунный анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноанализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology. 9:242-253 (1983; твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986; твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвич-анализ с меткой (см. Harlow and Lane,"Antibodies, A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Press (1988; твердофазный прямой анализ RIA с меткой с использованием метки I-125 (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988; твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (Cheung et al., Virology. 176:546-552 (1990 и прямой RIA с меткой(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990. Как правило, такой анализ включает в себя использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих какой-либо из них, немеченого тестируемого иммуноглобулина и меченого контрольного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют посредством определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные посредством конкурентного анализа (конкурирующие антитела), включают в себя антитела, связывающиеся с тем же самым эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно близким к эпитопу, связываемому контрольным антителом, чтобы возникало стерическое препятствие. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50 или 75%. То, что антитело "избирательно связывается" или "специфически связывается", означает, что антитело реагирует или связывается более часто, более быстро, с большей продолжительностью, с большей аффинностью или с каким-нибудь сочетанием вышеуказанного с эпитопом, чем с другими веществами,включая неродственные белки. "Избирательно связывается" или "специфически связывается" означает,например, что антитело связывается с белком с KD по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ, однако более обычно по меньшей мере приблизительно 1 мкм. "Избирательно связывается" или "специфически связывается" иногда означает, что антитело связывается с белком иногда с KD по меньшей мере приблизительно 0,1 мкм или лучше и иногда по меньшей мере приблизительно с 0,01 мкм или лучше. Из-за идентичности последовательности между гомологичными белками в различных видах специфическое связывание может включать в себя антитело, которое узнает маркерный белок раковой стволовой клетки более чем в одном виде. Как применяют здесь, термины "неспецифическое связывание" и "фоновое связывание" при использовании в отношении взаимодействия антитела и белка или пептида относятся к взаимодействию,которое не зависит от присутствия конкретной структуры (т.е. антитело связывается с белками вообще, а не с конкретной структурой, такой как эпитоп). Термины "выделенный" или "очищенный" относятся к материалу, который является по существу или в основном свободным от компонентов, которые в норме сопровождают его в его естественном состоянии. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с использованием способов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок (например, антитело) или нуклеиновая кислота из настоящего описания, который является преобладающей молекулой, присутствующей в препарате, является, по существу, очищенным. В частности, выделенная нуклеиновая кислота отделена от открытых рамок считывания, которые естественно фланкируют ген и кодируют белки, отличные от белка, кодируемого геном. Выделенное антитело отделено от других не относящихся к иммуноглобулину белков и от других иммуноглобулиновых белков с другой антигенсвязывающей специфичностью. Он означает также, что нуклеиновая кислота или белок в некоторых вариантах осуществления являются по меньшей мере на 80% чистыми, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 85% чистыми, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 90% чистыми, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 95% чистыми и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 99% чистыми. Как применяют здесь, термины "рак" и "раковый" обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких типов рака включают в себя плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак ободочной и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи. Термины "пролиферативное нарушение" и "пролиферативное заболевание" относятся к нарушениям, связанным с аномальной пролиферацией клеток, таким как рак."Опухоль" и "неоплазия", как применяют здесь, относятся к любой массе ткани, образованной в результате избыточного роста или пролиферации клеток, либо доброкачественной (не раковой), либо злокачественной (раковой), включая предраковые очаги."Метастаз", как применяют здесь, обозначает процесс, посредством которого рак распространяется или переносится от участка возникновения к другим областям организма с развитием сходного ракового очага в новой локализации. "Метастатическая" или "метастазирующая" клетка представляет собой клетку, теряющую адгезионные контакты с соседними клетками и мигрирующую через кровоток или лимфу от первичного участка заболевания для проникновения в соседние структуры организма. Термины "раковая стволовая клетка", "стволовая клетка опухоли" или "стволовая клетка солидной опухоли" используют здесь взаимозаменяемо, и они обозначают популяцию клеток из солидной опухоли, которые:(1) обладают обширной способностью к пролиферации;(2) способны к асимметричному делению клеток с образованием одного или нескольких видов дифференцированного потомства со сниженной способностью к пролиферации и/или развитию;(3) способны к симметричным делениям клеток для самообновления или самоподдержания. Эти свойства "раковых стволовых клеток", "стволовых клеток опухоли" или "стволовых клеток солидной опухоли" придают этим раковым стволовым клеткам способность формировать пальпируемые опухоли при серийной трансплантации мыши с иммунной недостаточностью, в отличие от большинства раковых клеток, которые неспособны формировать опухоли. Раковые стволовые клетки подвергаются самообновлению, в противоположность дифференцировке хаотическим образом с формированием опухолей с аномальными типами клеток, которые могут меняться с течением времени при возникновении мутаций. Стволовые клетки солидной опухоли отличаются от "раковой стволовой линии", представленной в патенте США 6004528. В этом патенте "раковую стволовую линию" определяют как медленно растущий тип клеток-предшественников, который сам обладает немногими мутациями, но который подвергается симметричным, а не асимметричным делениям клеток в результате вызывающих образование опухоли изменений, происходящих в окружении клеток. Эта гипотеза "раковой стволовой линии", таким образом, предполагает, что опухолевые клетки с высоким уровнем мутаций, быстро пролиферирующие,возникают в основном в результате аномального окружения, которое заставляет относительно нормальные стволовые клетки накапливаться и затем подвергаться мутациям, что заставляет их становиться раковыми клетками. В патенте США 6004528 предполагают, что такую модель можно использовать для улучшения диагностики рака. Модель стволовой клетки солидной опухоли фундаментально отличается от модели "раковой стволовой линии" и в результате обладает полезными свойствами, не предоставляемыми моделью "раковой стволовой линии". Во-первых, стволовые клетки солидной опухоли не являются"избавленными от мутаций". "Избавленную от мутаций раковую стволовую линию", описанную в патенте США 6004528, можно считать предраковым очагом, в то время как стволовые клетки солидной опухоли представляют собой раковые клетки, которые сами по себе могут содержать мутации, ответственные за образование опухолей, начиная от предракового состояния до поздней стадии рака. То есть стволовые клетки солидной опухоли ("раковые стволовые клетки") будут включены в клетки с высоким уровнем мутаций, которые отличают от "раковой стволовой линии" в патенте США 6004528. Вовторых, генетические мутации, которые приводят к раку, могут в основном являться свойственными стволовым клеткам солидной опухоли, так же как являться внешними. Модель стволовой клетки солидной опухоли предсказывает, что выделенные стволовые клетки солидной опухоли могут вызывать дополнительные опухоли при трансплантации (таким образом, объясняя метастазирование), в то время модель "раковой стволовой линии" будет предсказывать, что клетки трансплантированной "раковой стволовой линии" будут неспособны вызывать новую опухоль, поскольку это их аномальное окружение являлось вызывающим образование опухоли. Действительно, возможность трансплантировать диссоциированные и выделенные по фенотипу стволовые клетки солидной опухоли мышам (в окружение, которое очень отличается от нормального окружения в опухоли), где они еще формируют новые опухоли, отличает настоящее изобретение от модели "раковой стволовой линии". В-третьих, стволовые клетки солидной опухоли, по-видимому, делятся как симметрично, так и асимметрично, так что симметричное деление клеток не является обязательным свойством. В-четвертых, стволовые клетки солидной опухоли могут делиться быстро или медленно, в зависимости от многих переменных, так что медленная скорость пролиферации не является определяющей характеристикой. Термины "раковая клетка", "опухолевая клетка" и грамматические эквиваленты относятся к общей популяции клеток, полученных из опухоли или предракового очага, включая как не вызывающие образование опухоли клетки, составляющие большинство популяции опухолевых клеток, так и вызывающие образование опухоли стволовые клетки (раковые стволовые клетки). Как применяют здесь, термин "вызывающий образование опухоли" относится к функциональным свойствам стволовой клетки солидной опухоли, включая свойства самообновления (образование дополнительных вызывающих образование опухоли раковых стволовых клеток) и пролиферации для получения всех других клеток опухоли (образование дифференцированных и, таким образом, не вызывающих образование опухоли опухолевых клеток), что позволяет стволовым клеткам солидной опухоли образовывать опухоль. Как применяют здесь, термины "раковый(ые) маркер(ы) стволовой клетки", "маркер(ы) раковой стволовой клетки", "маркер(ы) стволовой клетки опухоли" или "маркер(ы) стволовой клетки солидной опухоли" относятся к гену или генам, или к белку, полипептиду, или пептиду, экспрессируемому посредством гена или генов, уровень экспрессии которого, отдельно или в сочетании с другими генами, коррелирует с присутствием вызывающих образование опухоли раковых клеток в отличие от не вызывающих образование опухоли клеток. Корреляция может относиться либо к увеличенной, либо к уменьшенной экспрессии гена (например, увеличенным или уменьшенным уровням мРНК или пептида, кодируемого геном). Как применяют здесь, термины "биопсия" или "биоптат ткани" относятся к образцу ткани или жидкости, который отбирают у субъекта с целью определения, содержит ли образец раковую ткань. В некоторых вариантах осуществления биоптат ткани или жидкости получают, поскольку подозревают, что субъект страдает раком, и затем биоптат ткани или жидкости исследуют на присутствие или отсутствие рака. Как применяют здесь, термин "субъект" относится к любому животному (например, млекопитающему), включая в качестве неограничивающих примеров человека, не относящихся к человеку приматов,грызунов и т.п., которое предназначено, чтобы являться реципиентом конкретного лечения. Как правило,термины "субъект" и "пациент" используют взаимозаменяемо здесь по отношению к субъекту-человеку."Фармацевтически приемлемый" относится к тому, что одобрено или может быть одобрено органом регулирования федерального или государственного правительства или перечислен в U.S. Pharmacopeia или другой общеизвестной фармакопее для применения для животных, включая человека."Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения, которая является фармацевтически приемлемой и обладает желаемой фармакологической активностью исходного соединения."Фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или адъювант" относится к наполнителю,носителю или адъюванту, который можно вводить субъекту вместе по меньшей мере с одним антителом из настоящего описания и который не нарушает его фармакологическую активность и является не ток- 10018260 сичным при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения."Фармацевтически приемлемый носитель" относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят по меньшей мере одно антитело из настоящего описания."Пролекарство" относится к производному терапевтически эффективного соединения, которому необходима трансформация внутри организма для получения терапевтически эффективного соединения. Пролекарства могут являться фармакологически неактивными до перевода в терапевтически эффективное исходное соединение. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антитела, полипептида,полинуклеотида, малой органической молекуле или другому лекарственному средству, эффективному для "лечения" заболевания или нарушения у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать или останавливать инфильтрацию раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкую ткань и кость; ингибировать и останавливать метастазирование опухоли; ингибировать и останавливать рост опухоли; облегчать до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком, уменьшать заболеваемость и смертность; улучшать качество жизни; или сочетать такие эффекты. В тех случаях, когда лекарственное средство предупреждает рост существующих раковых клеток и/или убивает их, его можно обозначать цитостатическим и/или цитотоксическим. Как применяют здесь, "постановка диагноза" или "диагностическая информация" относится к любой информации, включая, например, присутствие раковых стволовых клеток, которая является полезной для определения, обладает ли пациент заболеванием или состоянием, и/или для классификации заболевания или состояния по фенотипической категории или любой категории, имеющей значение по отношению к прогнозу или возможному ответу на лечение (либо на лечение вообще, либо на любое конкретное лечение) заболевания или состояния. Подобным образом, диагноз относится к предоставлению любого типа диагностической информации, включая в качестве неограничивающих примеров информацию, обладает ли субъект, вероятно, состоянием (таким как опухоль), содержит ли опухоль субъекта раковые стволовые клетки, информацию относительно характера или классификации опухоли, например, опухоль с высоким риском или опухоль с низким риском, информацию относительно прогноза и/или информацию, полезную для выбора подходящего лечения. Выбор лечения может включать в себя выбор конкретного химиотерапевтического средства или другого способа лечения, такого как хирургия или радиоактивное облучение, или выбор относительно остановки или проведения лечения. Как применяют здесь, термины "предоставление прогноза", "прогностическая информация" или"предсказательная информация" относятся к предоставлению информации, включая, например, присутствие раковых стволовых клеток в опухоли субъекта, информацию относительно влияния наличия рака(например, как определено диагностическими способами по настоящему изобретению) на будущее здоровье субъекта (например, ожидаемую заболеваемость или смертность, вероятность приобретения рака и риск метастазирования). Такие термины, как "лечение" или "обработка", или "лечить", или "облегчение", или "облегчать",относятся как к 1) терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или нарушения, так и к 2) профилактическим или предупреждающим мерам, которые предупреждают и/или замедляют развитие намеченного патологического состояния или нарушения. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают в себя тех, кто уже обладает нарушением, тех, кто предрасположен к приобретению нарушения, и тех, кто подлежит предупреждению нарушения. Субъекта успешно "лечат" согласно способам по настоящему изобретению, если для пациента показывают одно или несколько из следующего: снижение числа или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкую ткань и кость; ингибирование или отсутствие метастазирования опухоли; ингибирование или отсутствие роста опухоли; облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; или какое-либо сочетание эффектов. Как применяют здесь, термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" относятся к полимеру,состоящему из множества нуклеотидных единиц (рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид или родственные структурные варианты), связанных посредством фосфодиэфирных связей, включая в качестве неограничивающих примеров ДНК или РНК. Термин охватывает последовательности, которые содержат любой из известных аналогов оснований из ДНК и РНК, включая в качестве неограничивающих примеров 4-ацетилцитозин,8-гидрокси-N6-метиладенозин,азиридинилцитозин,псевдоизоцитозин,5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2 тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин,1-метиладенин,1-метилпсевдоурацил,1-метилгуанин,1-метилинозин,2,2-диметилгуанин,2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин,5-метиламинометилурацил,5-метоксиаминометил-2-тиоурацил,бета-D-маннозилквеуозин,- 11018260N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, псевдоурацил, квеуозин,2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Фраза "строгие условия гибридизации" относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться с его подпоследовательностью-мишенью, как правило, в сложной смеси нуклеиновых кислот, но не с другими последовательностями. Строгие условия являются зависимыми от последовательности и будут различными в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот обнаружено в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with NucleicProbes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Как правило,выбирают строгие условия, представляющие собой приблизительно 5-10 С ниже термической точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов заняты при равновесии). Строгих условий можно также достигать с помощью добавления дестабилизаторов,таких как формамид. Для избирательной или специфической гибридизации положительный сигнал по меньшей мере в два раза превышает фон, предпочтительно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию. Примерные строгие условия гибридизации могут являться следующими: 50% формамид, 5SSC и 1%SDS, инкубация при 42C, или 5SSC, 1% SDS, инкубация при 65 С, с промывкой в 0,2SSC и 0,1% SDS при 65 С. Термин "ген" относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая содержит кодирующие последовательности, необходимые для получения полипептида, предшественника или РНК (например, рРНК, тРНК). Полипептид может кодировать полноразмерная кодирующая последовательность или любая часть кодирующей последовательности, пока сохраняются желательная активность или функциональные свойства (например, ферментативная активность, связывание лиганда, передача сигнала, иммуногенность и т.д.) полноразмерного полипептида или фрагмента. Термин охватывает также кодирующую область структурного гена и последовательности, локализованные рядом с кодирующей областью как с 5'-, так и с 3'-концов на расстоянии приблизительно 1 т.п.н. или более на каждом конце, так что ген соответствует длине полноразмерной мРНК. Последовательности, локализованные на 5' кодирующей области и присутствующие в мРНК, обозначают как 5'-нетранслируемые последовательности. Последовательности, локализованные на 3' или ниже кодирующей области и присутствующие в мРНК, обозначают как 3'-нетранслируемые последовательности. Термин "ген" охватывает как кДНК, так и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, прерываемую некодирующими последовательностями, называемыми "интроны" или "встроенные области", или"встроенные последовательности". Интроны представляют собой фрагменты гена, которые транскрибируются в ядерную РНК (гяРНК); интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Интроны удаляются или "подвергаются сплайсингу" из ядерного или первичного транскрипта; интроны,таким образом, отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). мРНК функционирует во время трансляции для определения последовательности или порядка аминокислот в возникающем полипептиде. В дополнение к содержащимся интронам геномные формы гена могут также содержать последовательности, локализованные как на 5'-, так и на 3'-конце последовательностей, которые присутствуют в транскрипте РНК. Эти последовательности обозначают как "фланкирующие" последовательности или области (эти фланкирующие последовательности локализованы к 5' или 3' от нетранслируемых последовательностей, присутствующих в транскрипте мРНК); 5'-фланкирующая область может содержать регуляторные последовательности, такие как промоторы и энхансеры, которые контролируют транскрипцию гена или влияют на нее; 3'-фланкирующая область может содержать последовательности, которые управляют терминацией транскрипции, посттранскрипционным расщеплением и полиаденилированием. Термин "рекомбинантный" при использовании по отношению к клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору обозначает то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы введением гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, изменением природной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаружены в природной (не рекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют природные гены, которые являются сверхэкспрессированными или иным образом аномально экспрессированными, например, экспрессированными в виде не встречающихся в природе фрагментов или вариантов сплайсинга. Термином "рекомбинантная нуклеиновая кислота" здесь обозначают нуклеиновую кислоту, первоначально полученную in vitro, как правило,посредством манипуляции с нуклеиновой кислотой, например, с использованием полимераз и эндонуклеаз, в форме, в норме не обнаруженной в природе. По этому способу достигают функционального свя- 12018260 зывания различных последовательностей. Таким образом, выделенную нуклеиновую кислоту, в линейной форме, или экспрессирующий вектор, полученный in vitro лигированием молекул ДНК, которые в норме не являются соединенными, оба считают рекомбинантными для целей по этому изобретению. Понятно, что после получения рекомбинантной нуклеиновой кислоты и введения в клетку или организмхозяина, она будет реплицироваться не рекомбинантным образом, т.е. с использованием in vivo клеточного аппарата клетки-хозяина, а не манипуляций in vitro; однако такие нуклеиновые кислоты, однажды полученные рекомбинантным образом, хотя они и реплицируются затем не рекомбинантным образом,все еще считают рекомбинантными для целей изобретения. Подобным образом, "рекомбинантный белок" представляет собой белок, полученный с использованием рекомбинантных способов, т.е. посредством экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как описано выше. Как применяют здесь, термин "гетерологичный ген" относится к гену, который присутствует не в своем естественном окружении. Например, гетерологичный ген включает в себя ген из одних видов, введенный в другие виды. Гетерологичный ген включает в себя также ген, естественный для организма, который является измененным каким-либо образом (например, подверженным мутации, добавленным во многих копиях, связанным с неприродными регуляторными последовательностями и т.д.). Гетерологичные гены отличаются от эндогенных генов тем, что последовательности гетерологичного гена, как правило, присоединены к последовательностям ДНК, которые не обнаружены связанными с последовательностями гена на хромосоме, или связаны с частями хромосомы, не обнаруженными в природе (например,гены, экспрессированные в локусах, где гены в норме не экспрессированы). Как применяют здесь, термин "вектор" используют по отношению к молекулам нуклеиновой кислоты, которые переносят фрагмент(ы) ДНК от одной клетки к другой. Термин "носитель" иногда используют взаимозаменяемо с "вектором". Векторы часто получают из плазмид, бактериофагов или вирусов растений или животных."Лигирование" относится к процессу формирования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Если не предусмотрено иначе, лигирование можно осуществлять с использованием известных буферов и условий с помощью 10 единиц Т 4 ДНК-лигазы ("лигазы") на 0,5 мкг приблизительно эквимолярных количеств фрагментов ДНК, подлежащих лигированию. Лигирование нуклеиновой кислоты может служить для связывания двух белков вместе в рамке считывания для получения одного белка, или слитого белка. Как применяют здесь, термин "экспрессия гена" относится к процессу перевода генетической информации, закодированной в гене, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, или мяРНК) посредством"транскрипции" гена (например, посредством ферментативного действия РНК-полимеразы), и, для кодирующих белок генов, в белок посредством "трансляции" мРНК. Экспрессию гена можно регулировать на многих стадиях процесса. "Повышающая регуляция" или "активация" относится к регуляции, которая увеличивает продукцию продуктов экспрессии гена (например, РНК или белка), в то время как "понижающая регуляция" или "репрессия" относится к регуляции, которая уменьшает продукцию. Молекулы(например, факторы транскрипции), которые вовлечены в повышающую регуляцию или понижающую регуляцию, часто называют "активаторами" и "репрессорами" соответственно. Термины "полипептид", "пептид", "белок" и "фрагмент белка" используют здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из остатков аминокислот. Термины применяют к полимерам аминокислот, в которых один или несколько остатков аминокислот представляют собой искусственный химический миметик соответствующей в природе аминокислоты, так же как к встречающимся в природе полимерам аминокислот и не встречающимся в природе полимерам аминокислот. Термин "аминокислота" относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам,так же как к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют сходным образом с встречающимися в природе аминокислотами. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, так же как аминокислоты, которые являются модифицированными позднее, например гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые обладают такой же основной химической структурой, как встречающиеся в природе аминокислоты, например альфа-углерод, который является связанным с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги могут обладать модифицированными R-группами (например, норлейцин) или модифицированными пептидными остовами, но сохранять такую же основную химическую структуру, как встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые обладают структурой, отличающейся от основной химической структуры аминокислоты, но которые функционируют сходным образом с встречающейся в природе аминокислотой."Консервативно модифицированные варианты" применяют к последовательностям как аминокислот, так и нуклеиновой кислоты. Термин "варианты аминокислот" относится к последовательностям аминокислот. По отношению к конкретным последовательностям нуклеиновой кислоты консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные последовательности аминокислот, или, когда нуклеиновая кислота не ко- 13018260 дирует аминокислотную последовательность по существу к идентичным или связанным (например,близким в природе) последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует большинство белков. Например, кодоныGCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодон определяет аланин, кодон можно заменять на другой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты представляют собой "молчащие варианты", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты здесь, которая кодирует полипептид, описывает также молчащие варианты нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области известно, что в конкретном контексте каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, молчащие варианты нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумеваются в описанной последовательности по отношению к продукту экспрессии, но не по отношению к действительной последовательности зонда. Что касается последовательностей аминокислот, специалисту в данной области известно, что отдельные замены, делеции или вставки в последовательность нуклеиновой кислоты, пептида,полипептида или белка, которые заменяют, добавляют или делетируют отдельную аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, являются "консервативно модифицированным вариантом", включая те, где изменения приводят к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по изобретению. Как правило, консервативные замены включают в себя: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (Т) и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984. Термин "меченный эпитопом", как применяют здесь, относится к химерному полипептиду, содержащему последовательность маркерного белка или домена раковой стволовой клетки, или ее часть, слитую с "эпитопом-меткой". Полипептид эпитопа-метки содержит достаточно остатков аминокислот для предоставления эпитопа для узнавания антителом, однако является достаточно коротким, так что он не мешает активности маркерного белка раковой стволовой клетки. Подходящие эпитопы-метки, как правило, обладают по меньшей мере шестью остатками аминокислот, обычно между приблизительно 8 и приблизительно 50 остатками аминокислот и иногда между приблизительно 10 и приблизительно 20 остатками. Общепринятые эпитопы-метки включают в себя метки Fc, НА, His и FLAG. Настоящее изобретение относится к композициям и способам для исследования, диагностики, характеристики и лечения рака. В частности, настоящее изобретение относится к антителам против маркеров стволовых клеток солидной опухоли и способам использования этих антител для ингибирования роста опухоли и лечения рака у пациентов-людей. В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению включают в себя антитела-антагонисты, которые специфически связывают маркерный белок раковой стволовой клетки и мешают, например, связыванию лиганда, димеризации рецептора, экспрессии маркерного белка раковой стволовой клетки и/или передаче сигнала маркерным белком раковой стволовой клетки. В конкретных вариантах осуществления описанные антитела включают в себя антитела-агонисты, которые специфически связывают маркерный белок раковой стволовой клетки и способствуют, например, связыванию лиганда, димеризации рецептора, и/или передаче сигнала маркерным белком раковой стволовой клетки. В конкретных вариантах осуществления описанные антитела не препятствуют или не способствуют биологической активности маркерного белка раковой стволовой клетки, однако ингибируют рост опухоли посредством, например, интернализации и/или распознавания иммунной системой антитела. В конкретных вариантах осуществления антитела специфически узнают более одного маркерного белка клеток солидной опухоли. Представлено выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом DLL4 человека,сформированным сочетанием N-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека(SEQ ID NO: 26), где антитело влияет на рост опухоли. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой химерное антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело человека. Кроме того, представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по настоящему описанию и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, представлен способ лечения рака, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела или фармацевтической композиции по настоящему описанию. В конкретных вариантах осуществления антитело конъюгируют с цитотоксической группой. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя введение по меньшей мере одного терапевтического средства, подходящего для осуществления комбинированной терапии. В конкретных вариантах осуществления опухолевые клетки выбраны из клеток опухоли молочной железы, опухоли ободочной и прямой кишки, опухоли легкого, опухоли предстательной железы, опухоли поджелудочной железы и опухоли головы и шеи. Подобно тканям, из которых они происходят, солидные опухоли состоят из гетерогенной популяции клеток. То, что большинство этих клеток не вызывают образование опухоли, позволяет предполагать, что развитие и поддержание солидных опухолей также основано на небольшой популяции стволовых клеток (т.е. вызывающих опухоль раковых клеток) со способностью пролиферировать и эффективно давать начало как дополнительным стволовым клеткам опухолей (самообновление), так и большинству более дифференцированных опухолевых клеток, которые не обладают потенциалом вызывать образование опухоли (т.е. не вызывающие образование опухоли раковые клетки). Концепцию раковых стволовых клеток впервые представили вскоре после открытия гематопоэтических стволовых клеток (HSC) и доказали экспериментально для острого миелогенного лейкоза (AML) (Park et al., 1971, J. Natl. Cancer. Inst. 46:411-22; Lapidot et al., 1994, Nature. 367:645-8; BonnetDick, 1997, Nat. Med. 3:730-7; Hope et al., 2004,Nat. Immunol. 5:738-43). Позднее выделили стволовые клетки из солидных опухолей на основании их экспрессии уникального набора рецепторов поверхности клеток и оценки их свойств самообновления и пролиферации в культуре и в моделях на животных с ксенотрансплантацией. Обнаружили линейную популяцию ESA+ CD44+ CD24-/низкий, более чем в 50 раз обогащенную по способности образовывать опухоли по сравнению с нефракционированными опухолевыми клетками (Al-Hajj et al., 2003, Proc. Natl.Acad. Sci. 100:3983-8). Возможность выделять вызывающие образование опухоли раковые стволовые клетки из множества не вызывающих образование опухоли опухолевых клеток привела к идентификации маркеров раковых стволовых клеток, генов с дифференциальной экспрессией в раковых стволовых клетках по сравнению с не вызывающими образование опухолей опухолевыми клетками или нормальным эпителием молочной железы с использованием анализа на микрочипах. По настоящему изобретению используют знание этих идентифицированных маркеров раковой стволовой клетки для диагностики и лечения рака. Маркеры раковой стволовой клетки по настоящему изобретению относятся к DLL4 человека, лиганду рецептора Notch. Путь передачи сигнала Notch является одним из нескольких критических регуляторов формирования эмбриональной картины, постэмбрионального поддержания тканей и биологии стволовых клеток. Более конкретно, передача сигнала Notch вовлечена в процесс латерального торможения между соседними клетками, определяющего их судьбу, и играет важную роль в определении пути развития клетки во время асимметричных делений клеток. Нерегулируемая передача сигналов Notch связана с множеством типов рака человека, где она может изменять направление развития опухолевых клеток для поддержания их в недифференцированном и пролиферативном состоянии (Brennan and Brown,2003, Breast Cancer. Res. 5:69). Таким образом, канцерогенез может протекать, захватывая механизмы гомеостаза, контролирующие нормальное развитие и репарацию тканей посредством популяций стволовых клеток (Beachy et al., 2004, Nature. 432:324). Рецептор Notch впервые идентифицировали у мутантов Drosophila. Гаплонедостаточность Notch уDrosophila приводит к вырезам на краю крыла, в то время как потеря функции приводит к эмбриональному летальному "нейрогенному" фенотипу, когда клетки эпидермиса переключают развитие на нервную ткань (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). Рецептор Notch представляет собой однопроходный трансмембранный рецептор, содержащий множество тандемных повторов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF) и богатых цистеином повторовNotch/LIN-12 внутри большого внеклеточного домена (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986,Mol. Cell Biol. 6:3094; обзор в Artavanis et al., 1999, Science 284:770). Идентифицировали четыре белкаNotch млекопитающих (Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4), и мутации в этих рецепторах неизменно приводят к аномалиям развития и патологиям человека, включая тяжелые типы рака, как подробно описано ниже (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; JoutelTournier-Lasserve, 1998, Semin. CellDev. Biol. 9:619-25). Рецептор Notch активируют однопроходные трансмембранные лиганды семейства Delta, Serrated,Lag-2 (DSL). Известные лиганды Notch у млекопитающих, Delta-подобный 1 (D111), Delta-подобный 3EGF-подобными повторами внутри внеклеточного домена. Внеклеточный домен рецептора Notch взаимодействует с внеклеточным доменом его лигандов, как правило, на соседних клетках, что приводит к двум протеолитическим расщеплениям Notch, внеклеточному расщеплению, опосредованному протеазойADAM, и расщеплению внутри трансмембранного домена, опосредованному гамма-секретазой. Это последнее расщепление образует внутриклеточный домен Notch (NICD). Затем NICD входит в ядро, где он активирует семейство факторов транскрипции CBF1, супрессор Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL) в качестве главных нижестоящих эффекторов для увеличения транскрипции ядерных основных факторов транскрипции спираль-петля-спираль из семейства Hairy и Enhancer of Split [E(spl)] (Artavanis et al., 1999,Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer. Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb.Deltex, идентифицированный у Drosophila, может также существовать у млекопитающих (Martinez et al.,2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33), и этот зависимый от Deltex путь может действовать для супрессии экспрессии генов-мишеней Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr.Biol. 11:375-85). Гематопоэтические стволовые клетки (HSC) являются наиболее изученными стволовыми клетками в организме, и передача сигнала Notch является вовлеченным как в их нормальное поддержание, так и в лейкемическую трансформацию (KopperHajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). HSC представляют собой редкую популяцию клеток, которые могут сохраняться в стомальной нише внутри взрослого костного мозга. Эти клетки характеризуются как уникальным профилем экспрессии генов, так и способностью постоянно давать начало более дифференцированным клеткам-предшественникам для реконструирования всей гематопоэтической системы. Конститутивная активация передачи сигналов Notchl в HSC и клетках-предшественниках приводит к образованию иммортализованных линий клеток, из которых образуются как лимфоидные, так и миелоидные клетки in vitro и в долговременных анализах реконструкции (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81), и присутствие Jagged 1 увеличивает приживление популяций клеток костного мозга человека, обогащенных по HSC (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Позднее показали передачу сигналов Notch в HSC in vivo и показали, что она вовлечена в ингибирование дифференцировки HSC. Более того, передача сигналов Notch, по-видимому, необходима для опосредованного Wnt самообновления HSC (Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314). Путь передачи сигналов Notch также играет центральную роль в поддержании нервных стволовых клеток и вовлечен как в их нормальное поддержание, так и в злокачественные опухоли мозга (KopperHajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Cancer. Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004,Cancer. Res. 64:7794-800). Нервные стволовые клетки дают начало всем нейрональным и глиальным клеткам в нервной системе млекопитающих в ходе развития, и совсем недавно их идентифицировали во взрослом мозге (Gage, 2000, Science. 287:1433-8). Для мышей, дефицитных по Notch1, генам-мишенямNotch HES1, 3 и 5 и регулятору передачи сигналов Notch пенесилину 1 (PS1), показали сниженное число эмбриональных нервных стволовых клеток. Более того, число взрослых нервных стволовых клеток снижено в мозге гетерозиготных по PS1 мышей (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al.,2002, Genes Dev. 16:846-58). Уменьшение количества нервных стволовых клеток, по-видимому, является результатом их преждевременной дифференцировки в нейроны (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:553950), что позволяет предполагать, что передача сигналов Notch регулирует дифференцировку и самообновление нервных стволовых клеток. Неправильная передача сигналов Notch вовлечена в ряд типов рака человека. Ген Notch1 у человека впервые идентифицировали в подгруппе Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов как транслоцированный локус, приводящий к активации пути Notch (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61). Конститутивная активация передачи сигналов Notchl в Т-клетках в моделях на мышах подобным образом вызывает Т-клеточные лимфомы, что позволяет предполагать ее роль в качестве причины (Robey et al., 1996, Cell. 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood. 98:3793-9; Bellavia et al., 2000,EMBO J. 19:3337-48). Недавно обнаружили, что точечные мутации, вставки и делеции в Notch1, приводящие к неправильной передаче сигналов Notch1, часто присутствуют при Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе/лимфоме как у детей, так и у взрослых (PearAster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:41633). Частая вставка вируса опухоли молочной железы мыши в локусы как Notch1, так и Notch4 в опухолях молочной железы и полученные в результате активированные фрагменты белка Notch в первую очередь вовлечены в передачу сигналов Notch при раке молочной железы (GallahanCallahan, 1987, J. Virol 61:66-74; BrennanBrown, 2003, Breast Cancer. Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Cancer. Biol. 14:341-7). Дальнейшие исследования трансгенных мышей подтвердили роль Notch в разветвлении протоков в ходе нормального развития молочной железы, и конститутивно активная форма Notch4 в эпителиальных клетках молочной железы ингибирует дифференцировку эпителия и приводит к образованию опухолей(Jhappan et al., 1992, GenesDev. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Cancer. Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995,Cell Growth Differ. 6:563-77; Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer. 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol 196:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Cancer. Biol. 14:341-7). В настоящее время доказательство ролиNotch при раке молочной железы человека ограничено экспрессией рецепторов Notch при карциномах молочной железы и ее корреляцией с исходом болезни (Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al.,2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86). Более того, сверхэкспрессию для пути Notch наблюдали при раке шейки матки (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8), почечно-клеточном раке (Rae et al., 2000, Int. J. Cancer. 88:726-32), плоскоклеточном раке головы и шеи (Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), раке эндометрия (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9), и нейробластомах (van Limpt et al., 2000, Med.Pediatr. Oncol. 35:554-8), что указывает на потенциальную роль Notch в развитии ряда неоплазий. Инте- 16018260 ресно, что передача сигналов Notch может играть роль в поддержании в недифференцированном состоянии Аре-мутантных неопластических клеток ободочной кишки (van EsClevers, 2005, Trends Mol. Med. 11:496-502). Путь Notch вовлечен также во многие аспекты развития сосудов, включая пролиферацию, миграцию, дифференцировку гладких мышц, ангиогенез и артериально-венозную дифференцировку (Iso et al.,2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:543). Например, гомозиготные нулевые мутации в Notch-1/4 иJagged-1, так же как гетерозиготная потеря D114, приводит к тяжелым, хотя и различным, дефектам в развитии артерий и васкуляризации желточного мешка. Более того, для D111-дефицитных и Notch-2 гипоморфных эмбрионов мыши показали геморрагию, которая, по-видимому, является результатом слабого развития сосудистых структур (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al., 1999, Hum. Mel. Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature. 386:717-21;McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). У человека мутации в JAGGED1 связаны с синдромом Алажиля,нарушением развития, включающим в себя дефекты сосудов, а мутации в Notch3 являются ответственными за наследуемую сосудистую деменцию (CADASIL), при которой гомеостаз в сосуде является дефектным (Joutel et al., 1996, Nature. 383:707-10). Идентификация DLL4, как экспрессированного в раковых стволовых клетках по сравнению с нормальным эпителием молочной железы, позволяет предполагать нацеливание пути Notch на уничтожение не только большинства не вызывающих образование опухоли раковых клеток, но также вызывающих образование опухоли клеток, ответственных за образование и повторное появление солидных опухолей. Более того, из-за значительной роли ангиогенеза в образовании и поддержании опухоли, нацеливание на путь Notch посредством антитела против DLL4 также может эффективно ингибировать ангиогенез, лишая злокачественную опухоль питательных веществ и внося вклад в ее уничтожение. Таким образом, настоящее изобретение относится к маркеру раковой стволовой клетки, экспрессию которого можно анализировать для диагностики или мониторирования заболевания, связанного с раком. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркера раковой стволовой клетки определяют по экспрессии полинуклеотида, например, такого как мРНК, кодирующего маркер раковой стволовой клетки. Полинуклеотид можно детектировать и оценивать количественно посредством любого числа способов, хорошо известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления мРНК,кодирующую маркер раковой стволовой клетки, детектируют гибридизацией in situ срезов ткани, например, из биоптата пациента. В некоторых вариантах осуществления РНК выделяют из ткани и проводят детекцию, например, посредством Нозерн-блоттинга, количественной RT-ПЦР или микрочипов. Например, можно выделять тотальную РНК из образца ткани, и праймеры, которые специфически гибридизуются с маркером раковой стволовой клетки и амплифицируют его, можно использовать для детекции экспрессии маркерного полинуклеотида раковой стволовой клетки с использованием RT-ПЦР. В конкретных вариантах осуществления экспрессию маркера раковой стволовой клетки можно определять посредством детекции соответствующего полипептида. Полипептид можно детектировать и оценивать количественно посредством любого числа способов, хорошо известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления маркерный полипептид раковой стволовой клетки детектируют с использованием аналитических биохимических способов, например, таких как электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) или тонкослойная хроматография (TLC). Выделенный полипептид можно также секвенировать общепринятыми способами. В некоторых вариантах осуществления белковый маркер раковой стволовой клетки детектируют с помощью антител, индуцированных против белка, с использованием, например, иммунофлуоресценции или иммуногистохимии, на срезах тканей. Альтернативно, с антителами против маркера раковой стволовой клетки можно детектировать экспрессию с использованием, например, ELISA, FACS, Вестернблоттинга, иммунопреципитации или белковых микрочипов. Например, можно выделить из биоптата пациента раковые стволовые клетки и детектировать экспрессию маркерного белка раковой стволовой клетки с помощью флуоресцентно меченых антител с использованием FACS. По другому способу клетки, экспрессирующие маркер раковой стволовой клетки, можно детектировать in vivo с использованием меченых антител в обычной системе видеодокументации. Например, антитела, меченные парамагнитными изотопами, можно использовать для магнитно-резонансной томографии (MRI). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения диагностический анализ включает в себя определение того, экспрессируется или нет маркер раковой стволовой клетки в опухолевых клетках, с использованием, например, иммуногистохимии, гибридизации in situ или RT-ПЦР. В других вариантах осуществления диагностический анализ включает в себя определение уровней экспрессии маркера раковой стволовой клетки с использованием, например, количественного RT-ПЦР. В некоторых вариантах осуществления диагностический анализ дополнительно включает в себя определение уровней экспрессии маркера раковой стволовой клетки по сравнению с контрольной тканью, например, такой как нормальный эпителий. Детекцию экспрессии маркера раковой стволовой клетки можно затем использовать для предоставления прогноза и выбора терапии. Прогноз может быть основан на любом известном риске, на который указывает экспрессия маркера раковой стволовой клетки. Более того, детекцию маркера раковой стволо- 17018260 вой клетки можно использовать для выбора подходящей терапии, включая, например, лечение с помощью антител против детектированного маркерного белка раковой стволовой клетки. В конкретных вариантах осуществления антитело специфически связывается с внеклеточным доменом маркерного белка раковой стволовой клетки, такого как лиганд рецептора Notch, DLL4. В контексте настоящего изобретения подходящее антитело является средством, которое может оказывать один или несколько из следующих эффектов, например: мешать экспрессии маркера раковой стволовой клетки; мешать активации пути передачи сигнала раковой стволовой клетки, например, посредством стерического ингибирования взаимодействий между маркером раковой стволовой клетки и его лигандом, рецептором или корецепторами; активировать пути передачи сигнала раковой стволовой клетки, например, посредством действия в качестве лиганда или способствования связыванию эндогенного лиганда; или связываться с маркером раковой стволовой клетки и ингибировать пролиферацию опухолевой клетки. В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки действуют вне клетки для модуляции функции белкового маркера раковой стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления внеклеточное связывание антитела против маркера раковой стволовой клетки может ингибировать передачу сигнала белковым маркером раковой стволовой клетки, например, посредством ингибирования активации, присущей маркеру раковой стволовой клетки (например, киназной активности), и/или посредством стерического ингибирования взаимодействия, например, маркера раковой стволовой клетки с его лигандом, с его рецептором, с корецептором или с внеклеточным матриксом. В некоторых вариантах осуществления внеклеточное связывание антитела против маркера раковой стволовой клетки может осуществлять понижающую регуляцию экспрессии маркера раковой стволовой клетки на поверхности клетки, например, посредством интернализации белкового маркера раковой стволовой клетки или уменьшения переноса маркера раковой стволовой клетки на поверхность клетки. В некоторых вариантах осуществления внеклеточное связывание антитела против маркера раковой стволовой клетки может стимулировать передачу сигнала белковым маркером раковой стволовой клетки, например,посредством действия в качестве лиганда-приманки или увеличения связывания лиганда. В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки связываются с белковым маркером раковой стволовой клетки и оказывают один или несколько из следующих эффектов: ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, запускают клеточную смерть опухолевых клеток, стимулируют дифференцировку опухолевых клеток в тип клеток с меньшей способностью вызывать образование опухолей или предупреждают метастазирование опухолевых клеток. В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки запускают клеточную смерть посредством конъюгированного токсина, химиотерапевтического средства, радиоактивного изотопа или другого такого средства. Например, антитело против маркера раковой стволовой клетки конъюгируют с токсином, который активируется в опухолевых клетках, экспрессирующих маркер раковой стволовой клетки, посредством интернализации белка. В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки опосредуют клеточную смерть клетки, экспрессирующей белковый маркер раковой стволовой клетки, через антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). ADCC вовлекает лизис клеток посредством эффекторных клеток, которые узнают Fc-фрагмент антитела. Многие лимфоциты, моноциты, тканевые макрофаги, гранулоциты и эозинофилы, например, обладают Fc рецепторами и могут опосредовать цитолиз (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497). В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки запускают клеточную смерть клетки, экспрессирующей белковый маркер раковой стволовой клетки посредством активации комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). CDC вовлекает связывание комплемента сыворотки с Fc-фрагментом антитела и последующую активацию каскада белков комплемента, что приводит к разрушению мембраны клеток и возможной клеточной смерти. Известно, чтобиологическую активность антител в большой степени определяют константные домены или область Fc молекулы антитела (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, WilliamsWilkins, p. 218 (1984. Антитела различных классов и подклассов отличаются в этом отношении, так же как антитела одного и того же подкласса, но из различных видов. Из антител человека IgM является классом антител, наиболее эффективно связывающим комплемент, затем следуют IgG1, IgG3 и IgG2, тогда как IgG4, по-видимому, является совершенно неспособным активировать каскад комплемента (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). В соответствии с настоящим изобретением получены антитела этих классов, обладающие желаемой биологической активностью. Способность любого конкретного антитела против раковой стволовой клетки опосредовать лизис клетки-мишени посредством активации комплемента и/или ADCC можно анализировать. Интересующие клетки выращивают и метят in vitro; антитело добавляют к культуре клеток в сочетании либо с комплементом сыворотки, либо с иммунными клетками, которые можно активировать посредством комплексов антигена с антителом. Цитолиз клеток-мишеней детектируют, например, по высвобождению метки из лизированных клеток. Фактически скрининг антител можно проводить с использованием собственной сыворотки пациента в качестве источника комплемента и/или иммунных клеток. Антитело, которое способно активировать комплемент или опосредовать ADCC в тесте in vitro, можно затем использовать терапевтически для этого конкретного пациента. В конкретных вариантах осуществления антитела против маркера раковой стволовой клетки могут запускать клеточную смерть, ингибируя ангиогенез. Ангиогенез представляет собой процесс, посредством которого новые кровеносные сосуды формируются из предсуществующих сосудов, и является фундаментальным процессом, необходимым для нормального роста, например, во время эмбрионального развития, заживления ран и в ответ на овуляцию. Для роста солидных опухолей более 1-2 мм 2 также необходим ангиогенез для снабжения питательными веществами и кислородом, без которых опухолевые клетки погибают. В конкретных вариантах осуществления антитело против маркера раковой стволовой клетки нацелено на клетки сосудов, которые экспрессируют маркер раковой стволовой клетки, включая,например, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, или компоненты внеклеточного матрикса,необходимые для сборки сосуда. В конкретных вариантах осуществления антитело против маркера раковой стволовой клетки ингибирует передачу сигнала фактором роста, необходимую для привлечения,объединения, поддержания или выживания клеток сосуда. Антитела против маркера раковой стволовой клетки находят применение в диагностических и терапевтических способах, описанных здесь. В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению используют для детекции экспрессии белкового маркера раковой стволовой клетки в биологических образцах, например, таких как биоптат ткани пациента, плевральный выпот или образец крови. Можно получать срезы биоптатов ткани и детектировать белок с использованием, например, иммунофлуоресценции или иммуногистохимии. Кроме того, можно выделять отдельные клетки из образца и детектировать экспрессию белка в фиксированных или живых клетках посредством анализа FACS. В конкретных вариантах осуществления антитела можно использовать на белковых чипах для детекции экспрессии маркера раковой стволовой клетки, например, на опухолевых клетках, в лизатах клеток или в других образцах белка. В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению используют для ингибирования роста опухолевых клеток посредством приведения антител в контакт с опухолевыми клетками в анализах на основе клеток in vitro, в моделях на животных in vivo и т.д. В конкретных вариантах осуществления антитела используют для лечения рака у пациента посредством введения терапевтически эффективного количества антитела против маркера раковой стволовой клетки. Антитела по изобретению можно получать любыми общепринятыми способами, известными в данной области. Например, поликлональные антитела можно получать иммунизацией животного (например,кролика, крысы, мыши, осла и т.д.) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций соответствующего антигена (очищенного фрагмента пептида, полноразмерного рекомбинантного белка, слитого белка и т.д.), необязательно конъюгированного с гемоцианином морского блюдечка(KLH), сывороточным альбумином и т.д., разведенного в стерильном солевом растворе и объединенного с адъювантом (например, полным или неполным адъювантом Фрейнда) для получения стабильной эмульсии. Затем поликлональное антитело выделяют из крови, асцитов и т.п. иммунизированного таким образом животного. Собранная кровь свертывается, и сыворотку декантируют, осветляют центрифугированием и анализируют по титру антитела. Поликлональные антитела можно выделять из сыворотки или асцитов согласно общепринятым в данной области способам, включая аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез, диализ и т.д. Моноклональные антитела можно получать с использованием способов гибридомы, таких как описанные в Kohler and Milstein (1975), Nature. 256:495. С использованием способа гибридомы мышь, хомяка или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют, как описано выше, чтобы вызвать продукцию лимфоцитами антител, специфически связывающихся с иммунизирующим антигеном. Лимфоциты можно также иммунизировать in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей линией клеток миеломы с использованием, например, полиэтиленгликоля для получения клеток гибридомы, которые затем можно отбирать от неслитых лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, направленные специфически против выбранного антигена, как определено иммунопреципитацией, иммуноблоттингом или анализом связывания in vitro (например, радиоиммунный анализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, можно затем размножать либо в культуре in vitro с использованием общепринятых способов (Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press, 1986), либо in vivo в виде асцитных опухолей в животном. Моноклональные антитела можно затем очищать из культуральной среды или асцитной жидкости, как описано для поликлональных антител выше. Альтернативно, моноклональные антитела можно также получать с использованием способов рекомбинантной ДНК, как описано в патенте США 4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-клеток или клеток гибридомы, например, посредством RT-ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфически амплифицирующих гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, и их последовательность определяют с использованием общепринятых способов. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, клонируют затем в подходящие экспрессирующие векторы, при трансфекции которых в клетки-хозяева, такие как клетки Е.coli,- 19018260 клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, в других случаях не продуцирующие иммуноглобулиновый белок, клетки-хозяева образуют моноклональные антитела. Рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты из желаемых видов можно также выделять из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих CDR из желаемого вида, как описано в(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628 и Marks et al., 1991,J. Mol. Biol., 222:581-597). Полинуклеотид(ы), кодирующие моноклональное антитело, можно далее модифицировать рядом различных способов с использованием способа рекомбинантной ДНК для получения альтернативных антител. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой и тяжелой цепей, например,из моноклонального антитела мыши, можно заменять на 1) эти области, например, из антитела человека для получения химерного антитела или 2) на не относящийся к иммуноглобулинам полипептид для получения слитого антитела. В некоторых вариантах осуществления константные области укорачивают или удаляют для получения желаемого фрагмента антитела из моноклонального антитела. Сайтспецифический или высокоразрешающий мутагенез вариабельной области можно использовать для оптимизации специфичности, аффинности и т.д. моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело против маркера раковой стволовой клетки представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, содержащие минимальные последовательности из не относящихся к человеку (например, мышиных) антител внутри вариабельных областей. Такие антитела используют терапевтически для уменьшения антигенности и ответов НАМА (антитело человека против антитела мыши) при введении человеку. На практике, гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека с минимумом вплоть до отсутствия не относящихся к человеку последовательностей. Антитело человека представляет собой антитело, продуцированное человеком, или антитело,обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей антителу, продуцируемому человеком. Гуманизированные антитела можно получать с использованием различных способов, известных в данной области. Антитело можно гуманизировать заменой CDR из антитела человека на CDR из не относящегося к человеку антитела (например, мыши, крысы, кролика, хомяка и т.д.), обладающей желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью, следуя способам (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525;Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Гуманизированное антитело можно далее модифицировать посредством замены дополнительного остатка или в вариабельной человеческой каркасной области, и/или внутри замененных не относящихся к человеку остатков для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или емкости антитела. Выбор вариабельных доменов тяжелых и/или легких цепей человека для применения для использования для получения гуманизированных антител может являться важным для уменьшения антигенности. Согласно способу "наилучшего соответствия" проводят скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызунов против полной библиотеки известных последовательностей аминокислот вариабельных доменов человека. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления человеческую аминокислотную последовательность, наиболее гомологичную последовательности антитела грызуна, из которой взяты CDR, используют в качестве человеческой каркасной области (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196:901). По другому способу используют конкретную FR, выведенную из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей, и ее можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., 1992, PNAS, 89; 4285; Presta et al., 1993, J.Immunol., 151:2623). В конкретных вариантах осуществления используют сочетание способов для отбора вариабельной FR человека для использования для получения гуманизированных антител. Кроме того, понятно, что антитела (например, грызунов), подлежащие гуманизации, должны сохранять высокую аффинность к антигену, так же как другие благоприятные биологические свойства. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно получать способом анализа исходной последовательности антитела грызуна, подлежащего гуманизации, и различных последовательностей - кандидатов для гуманизации. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются доступными и известными специалистам в данной области. Компьютерные программы можно использовать для иллюстрации и вывода на экран возможных трехмерных конформационных структур выбранных последовательностей антител-кандидатов. Исследование таких моделей позволяет анализ возможной роли остатков в функционировании антитела, подлежащего гуманизации, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген. Таким образом, можно выбирать и сочетать остатки FR из исходного антитела и реципиентного гуманизированного антитела, так чтобы достигать желательных характеристик антитела. Как правило, остатки в CDR области узнавания антигена (или гипервариабельной области) сохраняют из исходного антитела (например, антитела грызуна с желательными свойствами связывания антигена) в гуманизированном антителе для связывания антигена. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный остаток внутри вариабельной FR сохраняют из исходного антитела в гуманизированном антителе. В конкретных вариантах осуществления вплоть до шести дополнительных остатков в вариабельной FR сохраняют из исходного антитела в гуманизированном антителе. Аминокислоты из вариабельных областей зрелых тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов обозначают Hx и Lx соответственно, где х представляет собой номер, обозначающий положение аминокислоты согласно схеме из Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health иHuman Services, 1987, 1991. Kabat перечисляет многие последовательности аминокислот для антител для каждой подгруппы и перечисляет наиболее часто встречающуюся аминокислоту для каждого положения остатка в каждой подгруппе для получения консенсусной последовательности. Kabat использует способ для присвоения номера остатка каждой аминокислоте в перечисленной последовательности, и этот способ для присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области. Схему Kabat можно расширять на другие антитела, не включенные в его перечень, посредством выравнивания рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей по Kabat по соотнесению с консервативными аминокислотами. С использованием системы нумерации Kabat легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях в различных антителах. Например, аминокислота в положении L50 антитела человека занимает положение, эквивалентное положению аминокислоты L50 антитела мыши. Более того,любые две последовательности антитела можно однозначно выравнивать, например, для определения процента идентичности, с использованием системы нумерации Kabat, так что каждая аминокислота в последовательности одного антитела является выровненной с аминокислотой в другой последовательности, обладающей тем же самым номером по Kabat. После выравнивания, если область рассматриваемого антитела (например, полную зрелую вариабельную область тяжелой или легкой цепи) сравнивают с такой же областью контрольного антитела, процент идентичности последовательности между областями рассматриваемого и контрольного антитела представляет собой число положений, занятых такой же аминокислотой в области как рассматриваемого, так и контрольного антитела, деленное на общее число выровненных положений двух областей, где пропуски не считают, умноженное на 100 для перевода в проценты. В примере 1 описано получение примерных гуманизированных антител против DLL4, специфически связывающих DLL4 человека, маркер раковой стволовой клетки из настоящего описания (21 М 18H9L2, депозит в ATCCPTA-8427 и 21 М 18 H7L2, номер депозита в ATCC PTA-8425, депонированы 10 мая 2007 г.; (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, VA 201102209 USA. В конкретных вариантах осуществления гуманизированные антитела содержат не относящуюся к человеку область узнавания антигена, полученную из моноклонального антитела мыши 21 М 18. В частности, в конкретных вариантах осуществления одну или несколько CDR тяжелой цепи из исходного антитела грызуна, CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, которые различаются в положении 52 а по Kabat) и CDR3 (SEQ ID NO: 5), сохраняют в гуманизированном антителе 21 М 18. В конкретных вариантах осуществления одну или несколько из CDR легкой цепи исходного антитела грызуна, CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) и CDR3 (SEQ ID NO: 11), сохраняют в гуманизированном антителе 21 М 18. В конкретных вариантах осуществления гуманизированные антитела дополнительно содержат по меньшей мере одну замену FR внутри вариабельной области либо тяжелой, либо легкой цепи человека. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, специфически связывающему эпитоп DLL4 человека, сформированный сочетаниемN-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека (SEQ ID NO: 26), где антитело влияет на рост опухоли. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой интактное антитело IgG. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой интактное антитело IgG2. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой фрагмент антитела. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой фрагмент Fab. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую не относящуюся к человеку область узнавания антигена и человеческую вариабельную каркасную область. В конкретных вариантах осуществления не относящаяся к человеку область узнавания антигена содержит определяющие комплементарность области (CDR), происходящие от грызунов. В конкретных вариантах осуществления не относящаяся к человеку область узнавания антигена содержит CDR из антитела мыши. В конкретных вариантах осуществления CDR грызунов получены из моноклонального антитела 21 М 18, где 21 М 18 содержит вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную SEQ ID NO: 6. В конкретных вариантах осуществления, где гуманизированное антитело имеет область VH, содержащую аминокислотную последовательность (a) CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4) и CDR3(SEQ ID NO: 5) или (b) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. В конкретных вариантах осуществления вариабельная каркасная область тяжелой цепи человека содержит экспрессированные последовательности человека. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области человека является замененным. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области тяжелой цепи человека присутствует в положении, выбранном из группы, состоящей из 16, 20, 27, 28, 38 и 48, на основании системы нумерации Kabat. В конкретных вариантах осуществления положения 16, 20,27, 28, 38 и 48 заменены на основании системы нумерации Kabat. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области человека заменен на остаток, занимающий соответствующее положение в антителе, содержащем не относящуюся к человеку область узнавания антигена. В конкретных вариантах осуществления вариабельная каркасная область тяжелой цепи человека содержит IGH(V) 1-18. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области человека является замененным. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области тяжелой цепи человека присутствует в положении, выбранном из группы, состоящей из 20H, 28H, 38H, 48H и 69H на основании системы нумерации Kabat. В конкретных вариантах осуществления положения 20H, 28H, 38H, 48H и 69H заменены на основании системы нумерации Kabat. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области человека заменен на остаток, занимающий соответствующее положение в антителе, содержащем не относящуюся к человеку область узнавания антигена. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую не относящуюся к человеку область узнавания антигена и человеческую вариабельную каркасную область. В конкретных вариантах осуществления не относящаяся к человеку область узнавания антигена содержит CDR, происходящие от грызунов. В конкретных вариантах осуществления не относящаяся к человеку область узнавания антигена содержит CDR из антитела мыши. В конкретных вариантах осуществления CDR получены из моноклонального антитела 21 М 18, где 21 М 18 содержит область VL, обозначенную SEQ ID NO: 12. В конкретных вариантах осуществления область VL содержит аминокислотную последовательность (a) CDR1(SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) и CDR3 (SEQ ID NO: 11) или (b) SEQ ID NO: 12. В конкретных вариантах осуществления вариабельная каркасная область легкой цепи человека содержит IGK(V) 4-1. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области легкой цепи человека является замененным. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток в вариабельной каркасной области человека присутствует в положении, выбранном из группы, состоящей из 22L и 36L на основании системы нумерации Kabat. В конкретных вариантах осуществления положения 22L и 36L заменены на основании системы нумерацииKabat. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток из вариабельной каркасной области человека заменен на остаток, занимающий соответствующее положение в антителе, содержащем не относящуюся к человеку область узнавания антигена. В конкретных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, конкурирующее с антителом 21 М 18 за специфическое связывание с DLL4 человека, где антитело 21 М 18 содержит (а) тяжелую цепь с вариабельной областью, обозначенной SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и (b) легкую цепь с вариабельной областью, обозначеннойSEQ ID NO: 12. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопом DLL4 человека, сформированным сочетанием N-концевой области DLL4 человека(SEQ ID NO: 27) и домена DSL человека (SEQ ID NO: 26), где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, обладающую, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности сSEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопомDSL человека (SEQ ID NO: 26), где антитело содержит область VH, содержащую не относящуюся к человеку область узнавания антигена, кодирующую CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4) и CDR3 (SEQ ID NO: 5), и человеческую вариабельную каркасную область, кодирующую IGH(V) 1-18. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопом DLL4 человека, сформированным сочетанием N-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека (SEQ ID NO: 26), где молекула полинуклеотида выбрана из группы, состоящей из (а) молекулы полинуклеотида, кодирующей аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и (b) молекулы полинуклеотида, которая гибридизуется с молекулой, комплементарной молекуле полинуклеотида согласно (а) в строгих условиях гибридизации. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопом DLL4 человека, сформированным сочетанием N-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека (SEQ ID NO: 26), где молекула полинуклеотида выбрана из группы, состоящей из(a) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15 и (b) молекулы полинуклеотида, которая гибридизуется с молекулой, комплементарной молекуле полинуклеотида согласно (а) в строгих условиях гибридизации. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопомDSL человека (SEQ ID NO: 26), где антитело содержит область VL, содержащую не относящуюся к человеку область узнавания антигена, кодирующую CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) и CDR3(SEQ ID NO: 11), и человеческую вариабельную каркасную область, содержащую IGK(V) 4-1. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопом DLL4 человека, сформированным сочетанием N-концевой области DLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека (SEQ ID NO: 26), где молекула полинуклеотида выбрана из группы, состоящей из: (а) молекулы полинуклеотида, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 и (b) молекулы полинуклеотида, которая гибридизуется с молекулой, комплементарной молекуле полинуклеотида согласно(а) в строгих условиях гибридизации. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, кодирующей гуманизированное антитело, специфически связывающееся с эпитопом DLL4 человека, сформированным сочетанием N-концевой областиDLL4 человека (SEQ ID NO: 27) и DSL человека (SEQ ID NO: 26), где молекула полинуклеотида выбрана из группы, состоящей из (a) SEQ ID NO: 16 и (b) молекулы полинуклеотида, которая гибридизуется с молекулой, комплементарной молекуле полинуклеотида согласно (а) в строгих условиях гибридизации. В конкретных вариантах осуществления представлен экспрессирующий вектор, содержащий выделенную молекулу полинуклеотида по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления представлена клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор, содержащий выделенную молекулу полинуклеотида по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у пациента, включающему в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела по настоящему описанию. В конкретных вариантах осуществления рак включает в себя рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак головы и шеи. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему контейнер и содержащуюся там композицию, где композиция содержит гуманизированное антитело по настоящему описанию и дополнительно содержит вкладыш в упаковку, указывающий, что композицию можно использовать для лечения рака. Кроме того, полностью человеческие антитела можно получить напрямую с использованием различных способов, известных в данной области. Можно получить иммортализованные В-лимфоциты человека, иммунизированные in vitro или выделенные из иммунизированного индивидуума, продуцирующие антитело, направленное против антигена-мишени (см., например, Cole et al., Monoclonal Antibodiesand Cancer. Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; и патент США 5750373). Антитело человека можно также отбирать из фаговой библиотеки, где фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314; Sheets et al.,1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al.,1991, J. Mol. Biol, 222:581). Антитела человека можно также получать в трансгенных мышах, содержащих локусы иммуноглобулинов человека, которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Этот способ описан в патентах США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016. Это изобретение относится также к биспецифическим антителам, специфически узнающим маркер раковой стволовой клетки. Биспецифические антитела представляют собой антитела, способные специфически узнавать и связывать по меньшей мере два различных эпитопа. Различные эпитопы могут находиться либо внутри одной и той же молекулы (например, одного и того же маркерного полипептида раковой стволовой клетки), либо на различных молекулах, так что, например, антитела могут специфически узнавать и связывать маркер раковой стволовой клетки, так же как, например, 1) эффекторную молекулу на лейкоците, такую как Т-клеточный рецептор (например, CD3) или Fc рецептор (например, CD64,CD32 или CD16), или 2) цитотоксическое средство, как подробно описано ниже. Биспецифические антитела могут представлять собой интактные антитела или фрагменты антител. Примерные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами по меньшей мере один из которых происходит из полипептида по изобретению. Альтернативно, антиантигенное плечо молекулы иммуноглобулина можно объединять с плечом, которое связывается с запускающей молекулой на лейкоците, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например CD2, CD3,CD28 или В 7), или Fc рецепторы для IgG, так чтобы сфокусировать клеточные механизмы защиты на клетке, экспрессирующей конкретный антиген. Биспецифические антитела можно также использовать,чтобы направлять цитотоксические средства к клеткам, которые экспрессируют конкретный антиген. Эти антитела обладают антигенсвязывающим плечом и плечом, связывающим цитотоксическое средство или хелатор радиоактивного изотопа, такой как EOTUBE, DPTA, DOTA или ТЕТА. Способы получения биспецифических антител являются общепринятыми в данной области (Millstein et al., 1983, Nature. 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120;Traunecker et al, 1991, EMSOJ. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al.,1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368 и патент США 5731168). Подразумевают также антитела более чем с двумя валентностями. Например, можно получать триспецифические антитела (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991. В конкретных вариантах осуществления представлен фрагмент антитела, например, для увеличения проникновения в опухоль. Известны различные способы для получения фрагментов антител: традиционно эти фрагменты получают посредством протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985,Science, 229:81). В конкретных вариантах осуществления фрагменты антител получают рекомбинантным образом. Фрагменты антител Fab, Fv и scFv все можно экспрессировать в Е.coli и секретировать из нее или других клеток-хозяев, таким образом, обеспечивая получение больших количеств этих фрагментов. Такие фрагменты антител можно также выделять из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Фрагмент антитела может также представлять собой линейные антитела, как описано, например, в патенте США 5641870, и может являться моноспецифическим или биспецифическим. Другие способы для получения фрагментов антител будут очевидными практикующему специалисту в данной области. В соответствии с настоящим изобретением способы можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфических для полипептида по изобретению (см. патент США 4946778). Кроме того, способы можно адаптировать для конструирования экспрессирующих библиотек Fab (Huse, et al.,Science, 246:1275-1281 (1989, чтобы позволять быструю и эффективную идентификацию моноклональных фрагментов Fab с желаемой специфичностью для лиганда рецептора Notch DLL4 или его производных, фрагментов или гомологов. Фрагменты антител, содержащие идиотипы к полипептиду по изобретению, можно получать способами из данной области, включая в качестве неограничивающих примеров(а) фрагмент F(ab')2, полученный расщеплением пепсином молекулы антитела; (b) фрагмент Fab, полученный восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2; (с) фрагмент Fab, полученный обработкой молекулы антитела папаином и восстанавливающим средством, и (d) фрагменты Fv. Может дополнительно являться желательным, особенно в случае фрагментов антител, модифицировать антитело, чтобы увеличить время его полужизни в сыворотке. Этого можно достигать, например,включением эпитопа связывания рецептора спасения во фрагмент антитела посредством мутации соответствующей области фрагмента антитела или посредством включения эпитопа в пептидную метку, которую затем сливают с фрагментом антитела либо на конце, либо в середине (например, посредством синтеза ДНК или пептида). Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела составлены из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела предложены, например, для нацеливания иммунных клеток на нежелательные клетки (патент США 4676980). Предусматривают, что антитела можно получать in vitro с использованием известных способов химии синтеза белка, включая способы, включающие в себя средства для перекрестного сшивания. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или посредством формирования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат. Для целей настоящего изобретения следует принимать во внимание, что модифицированные антитела могут содержать любой тип вариабельной области, который обеспечивает связь антитела с полипептидами DLL4 человека. В этом отношении вариабельная область может содержаться в любом типе или являться полученной из любого типа млекопитающего, которого можно индуцировать для подъема гуморального ответа и получения иммуноглобулинов против желаемого ассоциированного с опухолью антигена. В силу этого вариабельная область модифицированных антител может происходить, например,из человека, мыши, не относящегося к человеку примата (например, яванских макак, макак и т.д.) или волчьих. В некоторых вариантах осуществления как вариабельные, так и константные области модифицированных иммуноглобулинов являются человеческими. В других вариантах осуществления вариабельные области подходящих антител (как правило, полученных из не относящегося к человеку источника) можно конструировать или специфически приспосабливать для улучшения свойств связывания или уменьшения иммуногенности молекулы. В этом отношении вариабельные области, применимые по настоящему изобретению, можно гуманизировать или другим образом изменять посредством включения импортируемых последовательностей аминокислот. Вариабельные домены как в тяжелых, так и в легких цепях изменяют, по меньшей мере, частичной заменой одной или нескольких CDR и, если необходимо, частичной заменой каркасной области и изменением последовательности. Хотя CDR можно получать из антитела того же класса или даже подкласса,как и антитело, из которого получены каркасные области, предусматривают, что CDR будут получены из антитела другого класса и предпочтительно из антитела из другого вида. Может не являться необходимым, заменять все CDR на полные CDR из донорной вариабельной области для переноса антигенсвязывающей способности одного вариабельного домена к другому. Скорее, может являться необходимым,только перенести те остатки, которые необходимы для поддержания активности участка связывания антигена. Принимая во внимание объяснения, приведенные в патентах США 5585089, 5693761 и 5693762, это будет полностью в пределах компетенции специалистов в данной области, либо посредством выполнения общепринятых экспериментов, либо посредством тестирования методом проб и ошибок для получения функционального антитела с уменьшенной иммуногенностью. Несмотря на изменения в вариабельной области, специалисты в данной области будут принимать во внимание, что модифицированные антитела по этому изобретению будут включать в себя антитела, или их иммунореактивные фрагменты, в которых по меньшей мере часть из одного или нескольких доменов константной области делетированы или другим образом изменены для обеспечения желательных биохимических характеристик, таких как улучшенная локализация опухоли или уменьшенное время полужизни в сыворотке по сравнению с антителом приблизительно такой же иммуногенности, содержащем нативную или неизмененную константную область. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицированного антитела будет содержать человеческую константную область. Модификации константной области, совместимые с этим изобретением, включают в себя добавления, делеции или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких доменов. То есть модифицированные антитела, описанные здесь, могут содержать изменения или модификации одного или нескольких из трех константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) и/или константного домена легкой цепи(CL). В некоторых вариантах осуществления изобретения предусматривают модифицированные константные области, где один или несколько доменов являются частично или полностью делетированными. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитела будут содержать конструкции или варианты с делетированными доменами, где удален целый домен CH2 (конструкции CH2). В некоторых вариантах осуществления удаленный домен константной области будут заменять на короткий аминокислотный спейсер (например, 10 остатков), обеспечивающий некоторую часть гибкости молекулы, как правило, обеспечиваемой отсутствующей константной областью. В данной области известно, что, помимо своей конфигурации, константная область опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание компонента комплемента С 1 с антителами активирует систему комплемента. Активация комплемента является важной для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может также являться вовлеченной в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, антитела связываются с клетками через область Fc, с помощью участка рецептора Fc в области Fc антитела, связывающегося с рецептором Fc (FcR) на клетке. Существует ряд рецепторов Fc, которые являются специфическими для различных классов антитела, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфарецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с рецепторами Fc на поверхностях клеток запускает ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителом частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антитело-зависимой опосредуемой клетками цитотоксичностью илиADCC), высвобождение медиаторов воспаления, передача через плаценту и контроль продукции иммуноглобулина. Хотя различные рецепторы Fc и участки рецепторов изучены до определенной степени,существует еще много неизвестного об их локализации, структуре и функционировании. Без ограничения объема настоящего изобретения считают, что антитела, содержащие константные области, модифицированные, как описано в настоящем описании, обеспечивают измененные эффекторные функции, которые, в свою очередь, влияют на биологический профиль введенного антитела. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других способов) домена константной области может уменьшать связывание рецептора Fc с циркулирующим модифицированным антителом, таким образом, улучшая локализацию опухоли. В других случаях может присутствовать то, что модификации константной области в соответствии с этим изобретением уменьшают связывание комплемента и, таким образом, уменьшают время полужизни в сыворотке и неспецифическое связывание конъюгированного цитотоксина. Другие модификации константной области можно использовать для удаления дисульфидых связей или олигосахаридных групп, что позволяет улучшенную локализацию благодаря увеличенной антигенной специфичности или гибкости антитела. Подобным образом, модификации константной области согласно этому изобретению можно легко осуществить с использованием хорошо известных биохимических способов или способов молекулярной инженерии полностью в пределах компетенции специалиста в данной области. Следует отметить, что модифицированные антитела можно конструировать для слияния доменаCH3 непосредственно с шарнирной областью соответствующего модифицированного антитела. В других конструкциях может являться желательным предоставить пептидный спейсер между шарнирной областью и модифицированными доменами CH2 и/или CH3. Например, можно экспрессировать совместимые конструкции, где домен CH2 делетирован и оставшийся домен CH3 (модифицированный или немодифицированный) присоединен к шарнирной области с помощью спейсера из 5-20 аминокислот. Такой спейсер можно добавлять, например, чтобы гарантировать, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными или что шарнирная область остается гибкой. Однако следует отметить, что в некоторых случаях можно доказать, что аминокислотные спейсеры являются иммуногенными и вызывают нежелательный иммунный ответ против конструкции. Соответственно любой спейсер, добавляемый к конструкции, должен являться относительно неиммуногенным или даже совсем исключенным, если можно сохранить желательные биохимические качества модифицированного антитела. Следует понимать, что помимо делеции целых доменов константной области, антитела по настоящему изобретению можно получать посредством частичной делеции или замены нескольких или даже отдельной аминокислот. Например, мутация отдельной аминокислоты в выбранных областях доменаCH2 может являться достаточной, чтобы в основном уменьшить связывание Fc и, таким образом, улучшить локализацию опухоли. Подобным образом, может являться желательным просто делетировать ту часть одного или нескольких доменов константной области, которая контролирует эффекторную функцию (например, связывание комплемента CLQ), подлежащую модуляции. Такие частичные делеции константных областей могут улучшать выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке),в то же время оставляя нетронутыми другие желательные функции, связанные с рассматриваемым доменом константной области. Более того, как упомянуто выше, константные области описанных антител можно модифицировать посредством мутации или замены одной или нескольких аминокислот, что улучшает параметры полученной конструкции. В этом отношении может являться возможным нарушить активность, обеспечиваемую консервативным участком связывания (например, связывание Fc), в то же время по существу сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. Конкретные варианты осуществления могут содержать добавление одной или нескольких аминокислот к константной области для усиления желательных характеристик, таких как эффекторная функция, или обеспечения большего присоединения цитотоксина или углевода. В таких вариантах осуществления может являться желательным, вставлять или повторять специфические последовательности, полученные из выбранных доменов константной области. Кроме того, настоящее изобретение относится к вариантам и эквивалентам, которые являются, по существу, гомологичными химерным, гуманизированным и человеческим антителам или фрагментам этих антител, указанным здесь. Они могут содержать, например, мутации - консервативные замены, т.е. замену одной или нескольких аминокислот на сходные аминокислоты. Например, консервативная замена относится к замене одной аминокислоты на другую внутри одного и того же общего класса, например,одной кислой аминокислоты на другую кислую аминокислоту, одной основной аминокислоты на другую основную аминокислоту или одной нейтральной аминокислоты на другую нейтральную аминокислоту. Что подразумевают под консервативной аминокислотной заменой, хорошо известно в данной области. Изобретение относится также к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством. Цитотоксические средства включают в себя химиотерапевтические средства,ингибирующие рост средства, токсины (например, ферментативно активный токсин, происходящий из бактерий, грибов, растений или животных, или его фрагменты), радиоактивные изотопы (т.е. радиоконъюгат) и т.д. Химиотерапевтические средства, применимые для получения таких иммуноконъюгатов, включают в себя, например, метотрексат, адриамицин, доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие средства. Ферментативно активные токсины и их фрагменты,которые можно использовать, включают в себя цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина, цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина,альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S),ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин,рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. В некоторых вариантах осуществления антитела можно конъюгировать с радиоактивными изотопами, такими как 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu,67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re и 188Re, с использованием любого из ряда хорошо известных хелаторов или прямого мечения. В других вариантах осуществления описанные композиции могут содержать антитела,присоединенные к лекарственным средствам, пролекарствам или лимфокинам, таким как интерферон. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием множества бифункциональных средств для сшивания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат(SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6- 26018260 диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзиноиды, трихотецен и CC1065, и производных этих токсинов, обладающих активностью токсина, также можно использовать. В некоторых вариантах осуществления можно получать комплексы модифицированных антител с другими иммунологически активными лигандами (например, антителами или их фрагментами), где полученная молекула связывается как с неопластической клеткой, так и с эффекторной клеткой,такой как Т-клетка. Независимо от того, каким образом получены применимые параметры, антитела по настоящему изобретению можно использовать в любой из ряда конъюгированных (т.е. иммуноконъюгат) или неконъюгированных форм. Альтернативно антитела по этому изобретению можно использовать в неконъюгированной или "голой" форме, чтобы использовать естественные механизмы защиты субъекта, включая комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимую клеточную токсичность(ADCC) для уничтожения злокачественных клеток. Выбор, какое из конъюгированного или неконъюгированного модифицированного антитела использовать, будет зависеть от типа и стадии рака, использования вспомогательного лечения (например, химиотерапии или внешнего облучения) и состояния пациента. Следует понимать, что специалист в данной области может легко сделать такой выбор с учетом объяснений здесь. Антитела по настоящему изобретению можно анализировать по иммуноспецифическому связыванию посредством любого способа, известного в данной области. Иммуноанализы, которые можно использовать, включают в себя в качестве неограничивающих примеров, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких способов, как анализ BIAcore, анализ FACS, иммунофлуоресценция, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, радиоиммунные анализы, ELISA, "сэндвич"иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции преципитации с диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы связывания комплемента,иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с белком А. Такие анализы являются общепринятыми и хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel etal., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John WileySons, Inc., New York, приведенный здесь в качестве ссылки в полном объеме). В некоторых вариантах осуществления иммуноспецифичность антитела против маркера раковой стволовой клетки определяют с использованием ELISA. Анализ ELISA включает в себя получение антигена, покрытие лунок 96-луночного микропланшета для титрования антигеном, добавление антитела против маркера раковой стволовой клетки, конъюгированного с поддающимся детекции соединением,таким как субстрат фермента (например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы), в лунки, инкубацию в течение периода времени и детекцию присутствия антигена. В некоторых вариантах осуществления антитело против маркера раковой стволовой клетки не является конъюгированным с поддающимся детекции соединением, но вместо этого в лунку добавляют вторичное конъюгированное антитело, которое узнает антитело против маркера раковой стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления вместо покрытия лунки антигеном лунки можно покрывать антителом против маркера раковой стволовой клетки, и вторичное антитело, конъюгированное с поддающимся детекции соединением, можно добавлять после добавления антигена в покрытую лунку. Специалист в данной области будет осведомлен как о параметрах, которые можно модифицировать для увеличения детектированного сигнала, так и о других вариантах ELISA, известных в данной области (см., например, Ausubel et al., eds, 1994, CurrentProtocols in Molecular Biology, vol. 1, John WileySons, Inc., New York at 11.2.1). Аффинность связывания антитела с антигеном-маркером раковой стволовой клетки и скорость диссоциации при взаимодействии антитело-антиген можно определять посредством конкурентных анализов связывания. Одним примером конкурентного анализа связывания является радиоиммунный анализ,включающий в себя инкубацию меченого антигена (например, 3 Н или 125I), или его фрагмента или варианта, с интересующим антителом в присутствии увеличивающихся количеств немеченого антигена с последующей детекцией антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность антитела против маркера раковой стволовой клетки и скорости диссоциации при связывании можно определить из данных посредством анализа графика Скэтчарда. В некоторых вариантах осуществления анализ кинетики BIAcore используют для определения скоростей связывания и диссоциации антител против маркера раковой стволовой клетки. Анализ кинетики BIAcore включает в себя анализ связывания и диссоциации антител по чипам с иммобилизованными антигенами - маркерами раковой стволовой клетки на их поверхности. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к выделенным полинуклеотидам,которые кодируют полипептид, содержащий антитело или его фрагмент, против DLL4 человека. Таким образом, термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид" относится к полинуклеотиду, включающему только кодирующие последовательности для полипептида, так же как к полинуклеотиду, включающему дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Полинуклеотиды по изобретению могут присутствовать в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает в себя кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК и может являться двухцепочечной или одноцепочечной и, если является одноцепочечной, может представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь. Кроме того, настоящее изобретение относится к вариантам описанных здесь выше полинуклеотидов, кодирующих, например, фрагменты, аналоги и производные. Вариант полинуклеотида может представлять собой встречающийся в природе аллельный вариант полинуклеотида или не встречающийся в природе вариант полинуклеотида. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид может обладать кодирующей последовательностью, представляющей собой встречающийся в природе аллельный вариант кодирующей последовательности описанных полипептидов. Как известно в данной области, аллельный вариант представляет собой альтернативную форму последовательности полинуклеотида, обладающую, например, заменой, делецией или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, которые,по существу, не изменяют функцию кодируемого полипептида. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды содержат кодирующую последовательность для зрелого полипептида, слитого в той же самой рамке считывания с полинуклеотидом, помогающим, например, экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина (например, лидерная последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для контроля транспорта полипептида из клетки). Полипептид, обладающий лидерной последовательностью, представляет собой пребелок и может обладать лидерной последовательностью, отщепляемой клеткой-хозяином для формирования зрелой формы полипептида. Полинуклеотиды могут также кодировать пробелок, который представляет собой зрелый белок плюс дополнительные 5'-остатки аминокислот. Зрелый белок, обладающий пропоследовательностью, представляет собой пробелок и является неактивной формой белка. После отщепления пропоследовательности остается активный зрелый белок. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды содержат кодирующую последовательность для зрелого полипептида, слитую в одной и той же рамке считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет, например, очистку кодируемого полипептида. Например, маркерная последовательность может представлять собой гексагистидиновую метку, предоставляемую вектором pQE-9,для обеспечения очистки зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае бактериального хозяина,или маркерная последовательность может представлять собой метку гемагглютинин (НА), полученную из белка гемагглютинина гриппа, при использовании хозяина-млекопитающего (например, клеткиCOS-7). В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, обладающим нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной, по меньшей мере на 85% идентичной, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичной полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий антитело или его фрагмент, против DLL4 человека. Под полинуклеотидом, обладающим нуклеотидной последовательностью по меньшей мере, например, на 95% "идентичной" контрольной нуклеотидной последовательности, подразумевают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида является идентичной контрольной последовательности, за исключением того, что последовательность полинуклеотида может содержать вплоть до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Иными словами,для получения полинуклеотида, обладающего нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной контрольной нуклеотидной последовательности, вплоть до 5% нуклеотидов в контрольной последовательности можно делетировать или заменять другим нуклеотидом, или число нуклеотидов вплоть до 5% всех нуклеотидов в контрольной последовательности можно вставлять в контрольную последовательность. Эти мутации контрольной последовательности могут присутствовать в Nили С-концевых положениях контрольной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, являются распределенными либо по отдельности среди нуклеотидов в контрольной последовательности, либо в одной или нескольких непрерывных группах внутри контрольной последовательности. На практике, является ли любая конкретная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентичной, по меньшей мере на 85% идентичной, по меньшей мере на 90% идентичной и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной контрольной последовательности, можно определить общепринятым способом с использованием известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix,Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). В Bestfit используют алгоритм локальной гомологии из Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics. 2:482 489 (1981), для нахождения наилучшего участка гомологии между двумя последовательностями. КогдаBestfit или любую другую программу выравнивания последовательности используют для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной контрольной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают так, что процент идентичности рассчитывают относительно полной длины контрольной нуклеотидной последовательности и что позволяют пропуски вплоть до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности. Варианты полинуклеотида могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях или и в тех, и в других. В некоторых вариантах осуществления варианты полинуклеотида содержат изменения, которые приводят к молчащим заменам, добавлениям или делециям, но не изменяют свойства или активности кодируемого полипептида. В некоторых вариантах осуществления варианты нуклеотида получены посредством молчащих мутаций из-за вырожденности генетического кода. Варианты полинуклеотида можно получать по множеству причин, например, для оптимизации экспрессии кодонов для конкретного хозяина (изменения кодонов в мРНК человека на кодоны, предпочтительные для бактериального хозяина, такого как Е.coli). Полипептиды по настоящему изобретению могут представлять собой рекомбинантные полипептиды, природные полипептиды или синтетические полипептиды, включая антитело или его фрагмент, против DLL4 человека. В данной области известно, что некоторые последовательности аминокислот по изобретению можно изменять без значительного эффекта на структуру или функции белка. Таким образом,изобретение, кроме того, относится к вариантам полипептидов, которые обладают значительной активностью или которые содержат области антитела или его фрагмента против белка DLL4 человека. Такие мутанты включают в себя делеции, вставки, инверсии, повторы и замены типа. Полипептиды и аналоги можно дополнительно модифицировать, чтобы они содержали дополнительные химические группы, в норме не составляющие часть белка. Эти дериватизированные группы могут улучшать растворимость, биологическое время полужизни или всасывание белка. Группы могут также уменьшать или исключать любые желательные побочные эффекты белков и т.п. Обзор этих групп можно найти в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(2000). Выделенные полипептиды, описанные здесь, можно получать любым подходящим способом, известным в данной области. Такие способы лежат в диапазоне от способов прямого синтеза белка до конструирования последовательности ДНК, кодирующей последовательности полипептида, и экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформируемом хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК конструируют с использованием рекомбинантного способа посредством выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей интересующий белок дикого типа. Необязательно последовательность можно подвергать мутагенезу посредством сайт-специфического мутагенеза для получения ее функциональных аналогов. См., например Zoeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 81:5662-5066 (1984) и патент США 4588585. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК, кодирующую интересующий полипептид, будут конструировать посредством химического синтеза с использованием синтезатора олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды можно конструировать на основании аминокислотной последовательности желаемого полипептида и выбирать те кодоны, которые являются предпочтительными в клетке-хозяине, в которой будут продуцировать интересующий рекомбинантный полипептид. Общепринятые способы можно применять для синтеза выделенной последовательности полинуклеотида, кодирующей интересующий выделенный полипептид. Например, полную аминокислотную последовательность можно использовать для конструирования обратно транслированного гена. Кроме того,можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида, можно синтезировать и затем лигировать. Индивидуальные олигонуклеотиды, как правило, содержат 5'- или 3'-выступающие концы для комплементарной сборки. После сборки (посредством синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) последовательности полинуклеотида, кодирующего конкретный выделенный интересующий полипептид, будут вставлять в экспрессирующий вектор и функционально связывать с контролирующей экспрессию последовательностью, подходящей для экспрессии белка в желаемом хозяине. Правильную сборку можно подтверждать нуклеотидным секвенированием, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области, чтобы получить высокие уровни экспрессии трансфицированного гена в хозяине, ген необходимо функционально связывать с последовательностями для транскрипционного и трансляционного контроля экспрессии, которые являются функциональными в выбранном экспрессирующем хозяине. Рекомбинантные экспрессирующие векторы используют для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей слитые с маркером раковой стволовой клетки полипептиды. Рекомбинантные экспрессирующие векторы представляют собой способные к репликации конструкции ДНК, обладающие синтетическими или полученными из кДНК фрагментами ДНК, кодирующими слитый с маркером раковой стволовой клетки полипептид или биоэквивалентный аналог, функционально связанный с подходящими регуляторными элементами для транскрипции или трансляции, полученными из генов млекопитающих, микроорганизмов, вирусов или насекомых. Транскрипционная единица, как правило, содержит совокупность(1) генетического элемента или элементов, обладающих регуляторной ролью в экспрессии генов, например, транскрипционные промоторы или энхансеры, (2) структурной или кодирующей последовательности, транскрибируемой в мРНК и транслируемой в белок, и (3) подходящих последовательностей инициации и терминации транскрипции и трансляции, как подробно описано ниже. Такие регуляторные