Молекула антитела, обладающая специфичностью по отношению к kdr человека, и способы применения антитела

010970 Данное изобретение относится к молекуле антитела, обладающей специфичностью по отношению к антигенным детерминантам человеческого рецептора, содержащего киназный домен вставки (KDR). Молекула антитела связывает KDR с более высокой аффинностью, чем сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) человека, и препятствует взаимодействию между VEGF и KDR. Данное изобретение также относится к терапевтическим применениям молекулы антитела и к способам получения молекулы антитела. Данное изобретение относится к молекулам антитела. В молекуле антитела имеются две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь и каждая легкая цепь имеют на своем N-конце вариабельный домен. Каждый вариабельный домен состоит из четырех каркасных областей (FR), чередующихся с тремя областями, определяющими комплементарность (CDR). CDR определяют антигенсвязывающую специфичность антител и представляют собой относительно короткие пептидные последовательности,которые заключены между каркасными областями вариабельных доменов. Остатки вариабельных доменов условно пронумерованы согласно системе, разработанной Кабатом и др. Данная система изложена вServices, NIH, USA (в дальнейшем Kabat et al.). В данном описании используют указанную систему нумерации, за исключением случаев, когда это оговорено особо. Обозначение остатков по Кабату не всегда прямо соответствует линейной нумерации аминокислотных остатков. Реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или содержать дополнительные аминокислоты по сравнению с точной нумерацией Кабата, что соответствует укорочению или инсерции структурного компонента в каркас или CDR основной структуры вариабельного домена. Правильную нумерацию остатков по Кабату для данного антитела можно определить путем выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со стандартной пронумерованной последовательностью Кабата.CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены в пределах остатков 31-35 (CDRH1), остатков 50-65 (CDRH2) и остатков 95-102 (CDRH3) согласно нумерации Кабата.CDR вариабельного домена легкой цепи расположены в пределах остатков 24-34 (CDRL1), остатков 50-56 (CDRL2) и остатков 89-97 (CDRL3) согласно нумерации Кабата. Конструирование CDR-привитых антител описано в Европейской заявке на выдачу патентаEP-A-0239400, в которой заявлен способ, при котором CDR мышиного моноклонального антитела (мАт) прививают в каркасные области вариабельных доменов иммуноглобулина человека с помощью сайтспецифичного мутагенеза с использованием длинных олигонуклеотидов. Более раннюю работу по гуманизации мАт путем прививки CDR осуществляли на мАт,распознающих синтетические антигены, такие как NP. Однако Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536,1988) и Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988) описали примеры, в которых путем прививки CDR гуманизировали мышиное мАт, распознающее лизоцим, и крысиное мАт, распознающее антиген наRiechmann et al. обнаружили, что перенос только CDR (которые определены Кабатом (Kabat et al.(выше) и Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970 не достаточен для обеспечения удовлетворительной антигенсвязывающей активности в CDR-привитом продукте. Обнаружено, что необходимо изменить ряд каркасных остатков так, чтобы они соответствовали остаткам каркасной области донора. Предложенные критерии для выбора того, какие каркасные остатки необходимо изменить, описаны в международной патентной заявке WO 90/07861. Опубликован ряд обзоров, в которых обсуждаются CDR-привитые антитела, включая Vaughan et al.VEGF является гомодимерным гликопротеидом, состоящим из двух субъединиц с Мм 23 кДа,структурно сходным с PDGF. Он играет важную роль в развитии в васкулогенезе, образовании системы новых кровеносных сосудов и вовлечен в ангиогенез, образование новых сосудов из ранее существующих сосудов. Ангиогенез включает в себя пролиферацию, миграцию и инфильтрацию в ткани эндотелиальных клеток капилляров из ранее существующих кровеносных сосудов. Наряду с тем, что ангиогенез играет важную роль в нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, фолликулярный рост (включая образование желтого тела) и заживление ран, он имеет место при ряде патологических состояний, включая воспаление, псориаз, ревматоидный артрит и опухолевый рост и метастазы (Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science, 235: 442-447, 1987). Например, многие считают, что опухоли не способны расти сверх определенного размера, если они не обеспечиваются специально предназначенной подачей крови посредством ангиогенеза.VEGF отличается от других факторов, считающихся возможными регуляторами ангиогенеза invivo, тем, что он является специфичным для эндотелиальных клеток индуктором ангиогенеза. Существует пять различных мономерных изоформ VEGF, возникающих в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Изоформы включают две связанные с мембранами формы (VEGF206 и VEGF189) и три растворимые формы (VEGF165, VEGF121 и VEGF145). Во всех тканях, за исключением плаценты человека, VEGF165 является наиболее распространенной изоформой.-1 010970 Эффекты VEGF опосредованы его взаимодействиями с двумя высоко аффинными тирозинкиназными рецепторами, fms-подобным тирозинкиназным рецептором (FLT-1 или VEGFR-1, Shibuya M. et al.,Oncogene, 5, 519-524, 1990) и KDR (или VEGFR-2, Terman et al., Oncogene, 6, 1677-1683, 1991). Оба рецептора, KDR и FLT-1, являются рецепторами, пронизывающими мембраны, каждый из которых содержит семь доменов, подобных иммуноглобулину, во внеклеточной связывающей лиганд области, внутриклеточный тирозинкиназный домен и трансмембранный домен. Трансмембранный домен служит для того, чтобы заякорить рецептор в клеточной мембране клеток, в которых он экспрессируется. Имеется несколько сообщений о сверхэкспрессии как VEGF, так и его рецепторов в опухолях, как на уровне РНК, так и на уровне белка (Dvorak et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237, 97, 1999). Экспрессия VEGF усиливается в ответ на гипоксию, которая часто имеет место в опухолях, и повышенная концентрация лиганда индуцирует экспрессию его рецепторов. Примеры исследований, показывающих повышенную экспрессию KDR в опухолях человека, включают рак молочной железы (Brown et al., Hum. Pathol., 26, 86, 1995); рак прямой кишки (Takahashi et al., Cancer Res., 55, 3964, 1995); рак почек (Takahashi et al., BBRC 257, 855, 1999) и аденокарциному желудочно-кишечного тракта (Brown et al., Cancer Res., 53, 4727, 1993). В более поздних исследованиях с использованием антитела, специфично распознающего VEGF,связанный с KDR, наблюдали повышающую регуляцию VEGF/KDR-ангиогенного пути при немелкоклеточном раке легкого (Koukourakis et al., Cancer Res., 60, 3088, 2000). Несколько примеров экспериментальных данных свидетельствуют о причинной связи между активностью VEGF и ангиогенезом в опухоли in vivo. Kim et al. инъецировали нейтрализующее антиVEGF-mAt мышам nude, являющимся носителями опухолей, и показали подавление опухолевого роста(Nature 362, 841, 1993). Ретровирусная экспрессия доминантного негативного мышиного KDR (FLK-1) также ингибировала опухолевый рост у мышей (Millauer et al., Nature, 367, 576, 1993). Подобным образом антисмысловой VEGF (Cheng et al., PNAS, 93, 8502, 1996) анти-FLK-1-антитела (Witte et al., Cancer Metast. Rev., 17, 155, 1998) и экспрессия растворимого FLT-1 (Goldman et al., PNAS, 95, 8795, 1998) ингибировали опухолевый рост в моделях на мышах. Несколько примеров экспериментальных данных свидетельствуют о том, что биологические эффекты VEGF, имеющие отношение к ангиогенезу, преимущественно опосредованы рецептором KDR(для обзора см. Larrivee and Karsan, Int. J. Mol. Med., 5, 447, 2000). Показано, что опосредованная VEGF активация отдельно KDR (в линиях клеток, экспрессирующих только один тип VEGFR) достаточна для того, чтобы вызвать пролиферацию и миграцию клеток(Waltenburger et al., J. Biol. Chem., 269, 26988, 1994). Наоборот, когда активирован только FLT-1, пролиферация клеток не наблюдается и наблюдения миграции клеток противоречивы. Эксперименты с использованием избирательных в отношении рецептора мутантов VEGF показали,что лигирование KDR активирует активируемую митогенами протеинкиназу (MAPK), вызывая пролиферацию, миграцию и проницаемость сосудов (Keyt et al., J. Biol. Chem., 271, 5638, 1996). В указанных анализах мутант, избирательный в отношении FLT-1, был неактивным. Анти-VEGF-мАт, блокирующее взаимодействие с KDR, но не с FLT-1, было способно ингибировать индуцируемую VEGF проницаемость сосудов, тогда как неблокирующее анти-VEGF-антитело не оказывало такого действия (Brekken et al., Cancer Res., 60, 5117, 2000). Описано получение мАт против мышиного рецептора VEGF, FLK-1, с помощью методики на основе гибрида (WO 94/11499). Показано, что указанные антитела ингибируют активацию рецептора FLK-1 в результате блокирования взаимодействия VEGF с рецептором. Указанное ингибирование активации рецептора было эффективным при ингибировании индуцированного VEGF ангиогенеза в некоторых моделях. Кроме того, показано, что указанное анти-FLK-1-антитело эффективно при лечении нескольких ксенотрансплантированных опухолей мышей. Однако не все антитела, которые связывают FLK-1, будут связывать KDR с достаточной для терапевтической эффективности аффинностью. Связывание VEGF-KDR также ингибирует апоптоз новообразованных кровеносных сосудов благодаря опосредованной KDR активации сигнального пути PI3-киназа-Akt-киназа (Akt-киназа является хорошо известной ниже расположенной киназой PI3-киназного пути, вовлеченного в выживаемость клеток,Gerber et al., J. Biol. Chem., 273, 30336, 1998). Модели на животных также показывают эффективность блокады данного антиапоптозного ответа посредством блокирования взаимодействия VEGF-KDR. В настоящее время считается, что KDR является наиболее важным рецептором в опосредовании эффектов VEGF, и его роль в стимулировании ангиогенеза и выживаемости новых сосудов, повидимому, общепризнанна. Таким образом, молекула антитела, способная связывать KDR и блокировать его активацию посредством VEGF, может быть терапевтически применимой при лечении патологий, в которые вовлеченVEGF и/или KDR, например, в случае воспаления, псориаза, ревматоидного артрита и роста опухоли. Также имеются убедительные аргументы, что это лучше всего осуществить посредством блокирования его взаимодействия с рецептором KDR. Существует необходимость в такой молекуле антитела, которую можно многократно использовать и можно просто и с высокой эффективностью получать. Также суще-2 010970 ствует необходимость в молекуле антитела, которая обладает высокой аффинностью по отношению кKDR и низкой иммуногенностью у человека. В первом аспекте данное изобретение относится к молекуле антитела, обладающей специфичностью по отношению к KDR, имеющей тяжелую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (который определен Kabat et al. (выше, имеющий последовательность, приведенную в виде H1 на фиг. 1(SEQ ID NO: 3) для CDRH3. Молекула антитела согласно первому аспекту данного изобретения содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из H1, H2 и H3 (с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 3), в случае вариабельного домена тяжелой цепи. Предпочтительно молекула антитела содержит по меньшей мере два или более, предпочтительно все три CDR в вариабельном домене тяжелой цепи. Во втором аспекте данного изобретения предложена молекула антитела, обладающая специфичностью по отношению к KDR человека, содержащая легкую цепь, в которой вариабельный домен содержит(SEQ ID NO: 6) для CDRL3. Молекула антитела согласно второму аспекту данного изобретения содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из L1, L2 и L3 (с SEQ ID NO: 4 по SEQ ID NO: 6), в случае вариабельного домена легкой цепи. Предпочтительно молекула антитела содержит по меньшей мере два или более, предпочтительно все три CDR в вариабельном домене легкой цепи. Молекулы антитела согласно первому и второму аспектам данного изобретения предпочтительно имеют комплементарную легкую цепь или комплементарную тяжелую цепь соответственно. Предпочтительно молекула антитела согласно первому и второму аспектам данного изобретения содержит тяжелую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (который определен Kabat et al.(выше, имеющий последовательность, представленную в виде H1 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1) для CDRH1,в виде H2 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 2) для CDRH2 или в виде H3 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 3) для CDRH3, и легкую цепь, в которой вариабельный домен содержит CDR (который определен Kabat et al. (выше,имеющий последовательность, приведенную в виде L1 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 4) для CDRL1, в виде L2 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 5) для CDRL2 или в виде L3 на фиг. 1 (SEQ ID NO: 6) для CDRL3. Вышеуказанные CDR, приведенные в SEQ ID NO: 1-6 (фиг. 1), получены из мышиного моноклонального антитела VR165. Данное изобретение также относится к мышиному моноклональному антителу VR165. Последовательности вариабельных доменов антитела VR165 показаны на фиг. 2(SEQ ID NO: 7 и 8). Константная область легкой цепи VR165 является каппа-типа, и константная область тяжелой цепи относится к IgG2a. Мышиное антитело ниже называется донорным антителом. Во втором альтернативно предпочтительном варианте антитело согласно либо первому, либо второму аспектам данного изобретения является молекулой химерного антитела мыши/человека, называемой в данном описании молекулой химерного антитела VR165. Молекула химерного антитела VR165 содержит вариабельные домены мышиного мАт VR165 (SEQ ID NO: 7 и 8) и константные домены человека. Предпочтительно молекула химерного антитела VR165 содержит домен C-каппа человека (Hieter et(Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) в тяжелой цепи. В третьем альтернативно предпочтительном варианте антитело согласно либо первому, либо второму аспектам данного изобретения является молекулой CDR-привитого антитела. Термин молекулаCDR-привитого антитела в используемом в данном описании смысле относится к молекуле антитела, в которой тяжелая и/или легкая цепь содержит один или несколько CDR из донорного антитела (например,мышиного мАт), привитых в каркас вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи акцепторного антитела (например, антитела человека). Предпочтительно такое CDR-привитое антитело имеет вариабельный домен, содержащий каркасные области акцепторного антитела человека, а также один или несколько вышеуказанных донорныхCDR. В том случае, когда прививают CDR, можно использовать любую подходящую каркасную последовательность вариабельной области акцептора, относящегося к классу/типу донорного антитела, из которого получены CDR, включая каркасные области мыши, примата и человека. Примерами каркасных областей человека, которые можно использовать в данном изобретении, являются KOL, NEWM, REI, EU,TUR, TEI, LAY и POM (Kabat et al. (выше. Например, KOL и NEWM можно использовать в случае тяжелой цепи, REI можно использовать в случае легкой цепи и EU, LAY и POM можно использовать как в случае тяжелой цепи, так и в случае легкой цепи. Предпочтительными каркасными областями в случае тяжелой цепи являются каркасные области группы 3 зародышевой линии человека, показанные на фиг. 3 (VH3-7 GL, SEQ ID NO: 9). Предпочтительными каркасными областями в случае легкой цепи являются каркасные области группы 1 последовательности зародышевой линии человека, показанные на фиг. 3 (А 30 GL, SEQ ID NO: 10).-3 010970 В CDR-привитом антителе согласно данному изобретению предпочтительно использовать в качестве акцепторного антитела антитело, имеющее цепи, которые являются гомологичными цепям донорного антитела. Тяжелую и легкую цепи акцептора не обязательно нужно получать из того же самого антитела и при желании они могут содержать составные цепи, имеющие каркасные области, полученные из различных цепей. Также в CDR-привитом антителе согласно данному изобретению каркасные области не должны иметь точно такую же последовательность, как области акцепторного антитела. Например, необычные остатки могут быть заменены часто более встречающимися остатками для данного класса или типа цепи акцептора. Альтернативно выбранные остатки в акцепторных каркасных областях могут быть заменены так, чтобы они соответствовали остатку, обнаруженному в таком же положении в донорном антителе. При таких изменениях следует придерживаться минимума, необходимого для получения аффинности донорного антитела. Протокол выбора остатков в каркасных областях акцепторного антитела, которые может быть нужно изменить, приведен в WO 91/09967. Предпочтительно в молекуле CDR-привитого антитела согласно данному изобретению в том случае, если акцепторная тяжелая цепь имеет каркасные области группы 3 зародышевой линии человека(показанные на фиг. 3) (SEQ ID NO: 9), акцепторные каркасные области тяжелой цепи содержат, кроме одного или нескольких донорных CDR, донорные остатки в положениях 77 и 93 (согласно Kabat et al.(выше. Предпочтительно в молекуле CDR-привитого антитела согласно данному изобретению в том случае, если акцепторная легкая цепь имеет каркасные области группы 1 человека (показанные на фиг. 3)(SEQ ID NO: 10), акцепторные каркасные области легкой цепи содержат донорные остатки в положениях 36, 44, 60, 66, 69, 70 и 71 (согласно Kabat et al. (выше. Донорные остатки являются остатками из донорного антитела, т.е. антитела, из которого исходно получены CDR. Молекула антитела согласно данному изобретению может содержать полную молекулу антитела,имеющую полноразмерные легкие и тяжелые цепи; ее фрагмент, такой как Fab, модифицированный Fab,ди-Fab, ди(модифицированный Fab), Fab', F(ab')2 или Fv-фрагмент; мономер или димер легкой цепи или тяжелой цепи; одноцепочечное антитело, например одноцепочечный Fv, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепи связаны пептидным линкером. Подобным образом, вариабельные области тяжелой и легкой цепи можно комбинировать с другими доменами антитела согласно обстоятельствам. Предпочтительно молекула антитела согласно данному изобретению представляет собойSEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, предпочтительно кодируются нуклеотидными последовательностями,приведенными в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно (фиг. 4 и 5). Альтернативно предпочтительно, чтобы молекула антитела согласно данному изобретению представляла собой модифицированный Fab-фрагмент, где модификацией является добавление к C-концу его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот, чтобы обеспечить присоединение эффекторной или репортерной молекулы. Предпочтительно дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или два остатка цистеина, с которыми может быть связана эффекторная или репортерная молекула. Такой модифицированный Fab-фрагмент предпочтительно содержит легкую цепь, имеющую последовательность, изображенную в виде SEQ ID NO: 11, и тяжелую цепь,имеющую последовательность, изображенную в виде SEQ ID NO: 12. Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, предпочтительно кодируются нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно. В следующем альтернативном варианте особенно предпочтительно, чтобы молекула антитела согласно данному изобретению представляла собой ди(модифицированный Fab)-фрагмент, где модификацией является добавление к C-концу каждой тяжелой цепи Fab одной или нескольких аминокислот, чтобы обеспечить связывание цепи с другой такой цепью и с эффекторной или репортерной молекулой. Предпочтительно дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область,содержащую один, два или три остатка цистеина, для связывания с другими Fab, эффекторными или репортерными молекулами. Предпочтительной эффекторной группой является молекула полимера, которая может быть связана с модифицированным Fab-или ди(модифицированный Fab)-фрагментом, чтобы увеличить время полужизни in vivo. В общем, молекула полимера может быть синтетическим полимером или полимером природного происхождения, например, необязательно замещенным, имеющим неразветвленную или разветвленную цепь полиалкиленовым, полиалкениленовым или полиоксиалкиленовым полимером или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например гомо- или гетерополисахаридом. Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать в указанных выше синтетических полимерах, включают одну или несколько гидроксильных, метильных или метоксигрупп. Кон-4 010970 кретные примеры синтетических полимеров включают необязательно замещенный, имеющий неразветвленную или разветвленную цепь поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) или их производные, особенно необязательно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или его производные. Конкретные полимеры природного происхождения включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные. Подразумевается что производные в используемом в данном описании смысле включают реакционноспособные производные, например, избирательные по отношению к тиолу реакционноспособные группы, такие как малеимиды и т.п. Реакционноспособная группа может быть связана с полимером непосредственно или через линкерный участок. Будет понятно, что остаток такой группы в некоторых случаях будет образовывать часть продукта в качестве связывающей группы между фрагментом антитела и полимером. Размер полимера при желании можно варьировать, но, как правило, он будет в пределах средней молекулярной массы от 500 до 50000 Да, предпочтительно от 5000 до 40000 Да и более предпочтительно от 25000 до 40000 Да. В частности, размер полимера может быть выбран на основе планируемого применения продукта. Особенно предпочтительные полимеры включают полиалкиленовый полимер, такой как поли(этиленгликоль), или особенно метоксиполи(этиленгликоль), или их производное и особенно с молекулярной массой в пределах примерно от 25000 до 40000 Да. Каждая молекула полимера, связанная с модифицированным фрагментом антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина, расположенного во фрагменте. Ковалентная связь, как правило, будет представлять собой дисульфидную связь или, в частности, связь сера-углерод. В тех случаях, когда это желательно, фрагмент антитела может иметь одну или несколько связанных с ним эффекторных или репортерных молекул. Эффекторные или репортерные молекулы могут быть связаны с фрагментом антитела посредством любой доступной боковой цепи аминокислоты или функциональной группы концевой аминокислоты, расположенной во фрагменте, например, посредством любойсвободной амино-, имино-, гидрокислотной или карбоксильной группы. Активированный полимер можно использовать в качестве исходного продукта при получении модифицированных полимером фрагментов антител, которые описаны выше. Активированным полимером может быть любой полимер, содержащий реакционноспособную по отношению к тиолу группу, такую как -галогенкарбоновую кислоту или сложный эфир, например йодацетамид, имид, например малеимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные вещества можно получить коммерчески (например,от Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) или можно получить из коммерчески доступных исходных веществ, используя обычные химические способы. Что касается связывания остатков поли(этиленгликоля) (ПЭГ), дана ссылка на Poly(ethyleneglycol)Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York,Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds),American Chemical Society, Washington DC и Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York. В том случае, когда требуется получить фрагмент антитела, связанный с эффекторной или репортерной молекулой, его можно получить стандартными химическими способами или способами на основе рекомбинантной ДНК, при которых фрагмент антитела связывают непосредственно или с помощью связывающего агента с эффекторной или репортерной молекулой либо до, либо после реакции с активированным полимером в зависимости от обстоятельств. Конкретные химические способы включают, например, способы, описанные в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 и WO 89/01476. Альтернативно, в том случае, когда эффекторной или репортерной молекулой является белок или полипептид, связывание можно осуществить с использованием способов на основе рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и EP-A-0392745. Предпочтительно модифицированный Fab-фрагмент или ди-Fab согласно данному изобретению пэгилирован (т.е. содержит ковалентно связанный с ним ПЭГ (поли(этиленгликоль или m-ПЭГ (метоксиполи(этиленгликоль согласно способам, заявленным в EP-A-0948544 и EP-A-1090037. Предпочтительно молекулой антитела согласно данному изобретению является пэгилированный модифицированный Fab-фрагмент, который показан на фиг. 6, или пэгилированный ди(модифицированный Fab)фрагмент. Как показано на фиг. 6, модифицированный Fab-фрагмент содержит малеимидную группу,ковалентно связанную с единственной тиольной группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина ковалентно связан с малеимидной группой. С каждой аминогруппой остатка лизина связан полимер метоксиполи(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу примерно 20000 Да. Таким образом, общая молекулярная масса целой эффекторной молекулы составляет примерно 40000 Да. Сходным образом каждый m-ПЭГ может быть связан с остатком лизина, ковалентно связанным с бис-малеимидным линкером,как описано вEP-A-1090037,образуя пэгилированный ди(модифицированный Fab) согласно изобретению. Предпочтительно в соединении, показанном на фиг. 6, тяжелая цепь части антитела имеет последовательность, изображенную в виде SEQ ID NO: 12, и легкая цепь имеет последовательность, приведен-5 010970 ную в SEQ ID NO: 11. Домены константных областей молекулы антитела согласно данному изобретению в том случае,когда они присутствуют, могут быть выбраны, принимая во внимание предполагаемую функцию молекулы антитела и, в частности, эффекторные функции, которые могут необходимы. Например, домены константной области могут быть доменами IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, можно использовать домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3, когда молекула антитела предназначена для терапевтических применений и требуются эффекторные функции антитела. Альтернативно можно использовать изотипы IgG2 и IgG4, когда молекула антитела предназначена для терапевтических применений и эффекторные функции антитела не требуются, например, просто для блокирования связывания KDR фактором VEGF. Также молекула антитела согласно данному изобретению может иметь связанную с ней эффекторную или репортерную молекулу. Например, она может иметь макроцикл для хелатирования атома тяжелого металла или токсин, такой как рицин, связанный с ней структурой, образующей ковалентный мостик. Альтернативно можно использовать методику на основе рекомбинантной ДНК, чтобы получить молекулу антитела, в которой Fc-фрагмент (CH2, CH3 и шарнирные домены), домены CH2 и CH3 или домен CH3 полной молекулы иммуноглобулина были заменены или имеют связанный с ними пептидной связью функциональный белок, не являющийся иммуноглобулином, такой как молекула фермента или токсина. Молекула антитела согласно данному изобретению предпочтительно имеет аффинность связывания 0,410-10 М. Предпочтительно молекула антитела согласно данному изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи gH3 (SEQ ID NO: 15) и вариабельный домен легкой цепи gL3 (SEQ ID NO: 16). Последовательности вариабельных доменов указанных легкой и тяжелой цепей показаны на фиг. 7. Данное изобретение также относится к вариантам молекулы антитела согласно данному изобретению, которые имеют повышенную аффинность по отношению к KDR. Такие варианты можно получить с помощью ряда протоколов для созревания аффинности, включая мутирование CDR (Yang et al., J. Mol.Biol., 254, 392-403, 1995), перестановку цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), использование мутаторных штаммов E.coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), перестановку ДНК (Pattenet al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88,1996) и ПЦР на основе материала половой ткани (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al.(выше) обсуждают указанные способы созревания аффинности. Данное изобретение также относится к последовательности ДНК, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь(и) молекулы антитела согласно данному изобретению, которая, например, описана на фигурах,приведенных в данном изобретении. Последовательность ДНК согласно данному изобретению может содержать синтетическую ДНК,например, полученную химической обработкой, кДНК, геномную ДНК или их комбинации. Данное изобретение также относится к клонирующему или экспрессирующему вектору, содержащему одну или несколько последовательностей ДНК согласно данному изобретению. Предпочтительно клонирующий или экспрессирующий вектор содержит две последовательности ДНК, соответственно,кодирующие легкую и тяжелую цепи молекулы антитела согласно данному изобретению. В предпочтительном варианте данное изобретение относится к экспрессирующему вектору E.coli,содержащему последовательность ДНК согласно данному изобретению. Предпочтительно экспрессирующим вектором является pTTOD(CDP791), который схематично показан на фиг. 8. Общие способы, посредством которых можно конструировать векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в данной области. В этом отношении приведена ссылка на Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, NewYork и руководство Maniatis, выпущенное Cold Spring Harbor Publishing. Последовательности ДНК, которые кодируют молекулу антитела согласно данному изобретению,можно получить способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, последовательности ДНК, кодирующие часть или все тяжелые и легкие цепи антитела, можно синтезировать при необходимости на основе определенных последовательностей ДНК или на основе соответствующих аминокислотных последовательностей. ДНК, кодирующая акцепторные каркасные последовательности, общедоступна специалистам в данной области и легко может быть синтезирована на основе их известных аминокислотных последовательностей. Для получения последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела, согласно данному изобретению можно использовать стандартные способы молекулярной биологии. Требуемые последовательности ДНК можно синтезировать полностью или частично, используя способы олигонуклеотидного синтеза. В зависимости от обстоятельств можно использовать способы сайт-специфичного мутагенеза или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Любую подходящую систему клетка-хозяин/вектор можно использовать для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела согласно данному изобретению. Можно использовать-6 010970 бактериальные, например, E.coli, и другие системы микроорганизмов, в частности, для экспрессии фрагментов антител, таких как фрагменты Fab, ди(модифицированный Fab) и F(ab')2, и особенно Fvфрагменты и фрагменты одноцепочечного антитела, например одноцепочечные Fv. Эукариотические системы экспрессии в клетках-хозяевах, например, млекопитающих, можно использовать для получения более крупных молекул антител, включая целые молекулы антител. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают клетки CHO, миеломы и гибридомы. Данное изобретение также относится к способу получения молекулы антитела согласно данному изобретению, включающему в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор согласно данному изобретению, в условиях, подходящих для осуществления экспрессии белка с ДНК, кодирующей молекулу антитела согласно данному изобретению, и выделение молекулы антитела. Предпочтительно способ получения молекулы антитела согласно данному изобретению включает в себя культивирование E.coli, содержащей экспрессирующий вектор E.coli, содержащий последовательность ДНК согласно данному изобретению, в условиях, подходящих для осуществления экспрессии белка с последовательности ДНК, и выделение молекулы антитела. Молекула антитела может секретироваться из клетки или может быть направлена к периплазме подходящими сигнальными последовательностями. Альтернативно молекулы антитела могут накапливаться в цитоплазме клетки. Предпочтительно молекула антитела направлена к периплазме. В зависимости от продуцируемой молекулы антитела и используемого способа желательно обеспечить возможность для рефолдинга молекул антител и принятия функциональной конформации. Способы, обеспечивающие рефолдинг молекул антител, хорошо известны специалистам в данной области. Молекула антитела может содержать только полипептид тяжелой или легкой цепи, и в этом случае необходимо использовать последовательность, кодирующую полипептид только легкой или только тяжелой цепи, чтобы трансфицировать клетки-хозяева. Для получения продуктов, содержащих как тяжелую, так и легкую цепи, линию клеток можно трансфицировать двумя векторами: первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. Альтернативно можно использовать один вектор, при этом вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи. Данное изобретение также относится к терапевтической или диагностической композиции, содержащей молекулу антитела согласно данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем. Данное изобретение также относится к способу получения терапевтической или диагностической композиции, содержащей смесь молекулы антитела согласно данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем. Молекула антитела может быть единственным активным ингредиентом в терапевтической или диагностической композиции или ей могут сопутствовать другие активные ингредиенты, включая другие ингредиенты, являющиеся антителами, например антитела против T-клеток, анти-IFN-антитела или анти-ЛПС-антитела, или ингредиенты, не являющиеся антителами, такие как ксантины. Фармацевтические композиции предпочтительно должны содержать терапевтически эффективное количество антитела согласно изобретению. Термин терапевтически эффективное количество в используемом в данном описании смысле относится к количеству терапевтического агента, необходимому для лечения, ослабления или предотвращения заболевания или состояния, являющегося мишенью, или чтобы проявить выявляемый терапевтический или профилактический эффект. Для любого антитела терапевтически эффективную дозу можно сначала оценить либо в анализах на культуре клеток, либо в моделях на животных, обычно на грызунах, кроликах, собаках, свиньях или приматах. Модель на животных также можно использовать для того, чтобы определить подходящие пределы концентраций и путь введения. Затем такую информацию можно использовать для того, чтобы определить применимые дозы и пути введения для человека. Точное эффективное количество для человека будет зависеть от тяжести состояния болезни, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы и пола субъекта, питания, времени и частоты введения,комбинации(й) лекарственных средств, реакционной чувствительности и толерантности/ответной реакции на терапию. Указанное количество можно определить общепринятым на практике экспериментированием, и оно зависит от мнения лечащего врача. В общем, эффективная доза будет составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,1 до 20 мг/кг, более предпочтительно примерно 15 мг/кг. Композиции можно вводить пациенту отдельно или можно вводить в комбинации с другими средствами, лекарственными препаратами или гормонами. Доза, в которой вводят молекулу антитела согласно данному изобретению, зависит от природы состояния, которое необходимо лечить, степени, в которой уровень нейтрализуемого VEGF возрос или ожидается, что он возрастет по сравнению с требуемым уровнем, и от того, используется ли молекула антитела профилактически или для того, чтобы лечить существующее состояние. Доза также будет выбираться в соответствии с возрастом и состоянием пациента. Таким образом, например, в том случае, когда продукт предназначен для лечения или профилактики хронического воспалительного состояния, такого как ревматоидный артрит, подходящие дозы моле-7 010970 кулы антитела согласно данному изобретению лежат в пределах от 0,5 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 1 до 20 мг/кг и наиболее предпочтительно составляют примерно 15 мг/кг. Частота дозы будет зависеть от времени полужизни молекулы антитела и продолжительности ее действия. Если молекула антитела имеет короткое время полужизни (например, от 2 до 10 ч), может быть необходимым назначение одной или нескольких доз в сутки. Альтернативно, если молекула антитела имеет продолжительное время полжизни (например, от 2 до 15 дней), необходимым может быть назначение дозы раз в сутки, раз в неделю или даже один раз каждые 1 или 2 месяца. Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель для введения антитела. Носитель сам по себе не должен индуцировать продукцию антител, вредных для человека, принимающего композицию, и не должен быть токсичным. Подходящие носители могут являться крупными, медленно метаболизируемыми макромолекулами, такими как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты,сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот,такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты. Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях дополнительно могут содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты или буферные вещества для получения определенного pH. Такие носители дают возможность готовить фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для приема пациентом вовнутрь. Предпочтительные формы для введения включают формы, подходящие для парентерального введения, например, путем инъекции или инфузии, например посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном наполнителе или он может содержать агенты для приготовления композиций, такие как суспендирующие агенты, консерванты, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно молекула антитела может быть в сухой форме для перерастворения перед использованием в подходящей стерильной жидкости. После приготовления композиции согласно изобретению можно непосредственно вводить субъекту. Субъектами, которых необходимо лечить, могут быть животные. Однако предпочтительно композиции адаптируют для введения человеку. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению можно вводить любым количеством способов, включая, но не ограничиваясь указанным, пероральный, внутривенный, внутримышечный,внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, внутрижелудочковый, трансдермальный, чрескожный (см., например, WO 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, энтеральный,местный, подъязычный, внутривагинальный или ректальный пути. Также можно использовать гипоспреи для введения фармацевтических композиций согласно изобретению. Обычно терапевтические композиции можно готовить в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий. Также можно готовить твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких наполнителях перед инъекцией. Прямая доставка композиций, как правило, будет осуществляться путем инъекции, подкожно,внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно или доставляться в интерстициальное пространство ткани. Композиции также можно вводить в место повреждения. Схема лечения может представлять собой схему введения однократной дозы или схему введения многократных доз. Будет понятно, что активным ингредиентом в композиции будет молекула антитела. Как таковой он будет чувствителен к деградации в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композицию необходимо вводить путем с использованием желудочно-кишечного тракта, то будет нужно, чтобы композиция содержала агенты, которые защищают антитело от деградации, но которые высвобождают антитело после того, как оно абсорбируется из желудочно-кишечного тракта. Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей имеется в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991). Также предусматривается, что антитело согласно данному изобретению будет вводиться с применением генной терапии. Чтобы это осуществить, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы антитела, под контролем соответствующих компонентов ДНК вводят пациенту с тем, чтобы цепи антитела экспрессировались с последовательностей ДНК и подвергались сборке in situ. Данное изобретение также относится к молекуле антитела согласно данному изобретению для применения при лечении заболевания, в которое вовлечен VEGF и/или KDR. Кроме того, данное изобретение относится к применению молекулы антитела согласно данному изобретению в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, в которое вовлечен-8 010970 Молекулу антитела согласно данному изобретению можно использовать в случае любой терапии,когда требуется снизить уровень биологически активного KDR, присутствующего в организме человека или животного. VEGF может быть циркулирующим в организме или присутствовать на нежелательно высоком уровне, располагаясь в конкретном месте организма. Например, VEGF (и, следовательно, KDR) оказались вовлечены в ряд патологических состояний,включая воспаление, псориаз, ревматоидный артрит и опухолевый рост и метастазы. Данное изобретение также относится к способу лечения человека или животных, страдающих заболеванием или подверженных риску развития заболевания, в которое вовлечен VEGF и/или KDR, при этом способ включает в себя введение субъекту эффективного количества молекулы антитела согласно данному изобретению. Молекулу антитела согласно данному изобретению также можно использовать в диагностике, например в диагностике и визуализации in vivo состояний болезни, в которые вовлечены повышенные уровни KDR. Далее данное изобретение описано с помощью иллюстрации, только на следующих примерах, в которых даны ссылки на сопровождающие фигуры. На фиг. 1 показаны последовательности CDR V-областей тяжелой и легкой цепи гена мышиного моноклонального антитела VR165 (SEQ ID NO: 1-6). На фиг. 2 показана последовательность белка доменов VH и VL мышиного моноклонального антитела VR165 (SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8). На фиг. 3 показаны белковые последовательности V-областей, выбранные в качестве акцепторных каркасов зародышевой линии человека. VH3-7 GL является геном VH зародышевой линии человека(SEQ ID NO: 10). В каждом случае последовательность зародышевой линии каркаса 4 представлена JH4 иJK1 зародышевой линии человека соответственно. На фиг. 4 показана аминокислотная и нуклеотидная последовательность легкой цепи Fab CDP791(SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13). На фиг. 5 показана аминокислотная и нуклеотидная последовательность тяжелой цепи Fab CDP791(SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14). На фиг. 6 показана структура модифицированного Fab-фрагмента, полученного из антитела VR165,ковалентно связанного посредством остатка цистеина с лизилмалеимидным линкером, где каждая аминогруппа остатка лизила имеет ковалентно связанный с ней остаток метоксиПЭГ, где n составляет примерно 420; На фиг. 7 показаны белковые последовательности оптимизированных генов CDR-привитых VH- иVL-доменов (SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16). На фиг. 8 показана оптимизированная плазмида pTTOD(CDP791), которая содержит вариант IGS-2 между прививаемыми участками gL3 и gH3. На фиг. 9 показана белковая последовательность сконструированных прививаемых участков VH иVL (gH1-3 и gL1-3, SEQ ID NO: 17-22). Прививаемый участок gH1 не содержит мышиных каркасных остатков. Прививаемый участок gH2 содержит мышиные остатки в положениях 77 и 93 (нумерация по Кабату). Как T, так и S являются обычными в последовательностях зародышевой линии человека в положении 77, поэтому включение T еще соответствует остатку человека. V в положении 93, вероятно,должен иметь важное значение на границе раздела VH/VL. Включение человеческих остатков в положении 60 и 62 представляет собой изменения в C-концевой части CDR-H2. Прививаемый участок gL2 содержит мышиные остатки в положениях 60, 66, 69, 70 и 71 (нумерация по Кабату). Прививаемый участокgL3 содержит дополнительные мышиные остатки в положениях 36 и 44. На фиг. 10 показана конструкция генов, кодирующих прививаемые участки gH1 и gL1(SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24). На фиг. 11 показаны олигонуклеотиды, используемые для сборки генов, кодирующих прививаемые участки gL1 и gH1 (SEQ ID NO: 25-40). На фиг. 12 показаны плазмиды pCR2.1(gH1) и pCR2.1(gL1), которые содержат прививаемые участки gH1 и gL1 соответственно. На фиг. 13 показаны олигонуклеотидные кассеты, используемые при конструировании прививаемых участков gH2, gH3, gL2 и gL3 (SEQ ID NO: 41-44). На фиг. 14 показаны пары олигонуклеотидов, используемых при конструировании прививаемых участков gH2, gH3, gL2 и gL3 (SEQ ID NO: 45-52). На фиг. 15 показаны плазмиды pGamma4 и pMR10.1, в которых субклонировали прививаемые участки VH и VL соответственно, чтобы обеспечить экспрессию в линиях клеток CHO. На фиг. 16 показана плазмида pTTOD E.coli, экспрессирующая Fab', содержащая в данном случае последовательность IGS-3. На фиг. 17 показана нуклеотидная последовательность трех тестированных областей IGS(SEQ ID NO: 53-55). На фиг. 18 показаны результаты сравнения действия IGS на ферментацию Fab'.(SEQ ID NO: 56). На фиг. 20 показаны результаты радиоиммуноанализа, в котором фрагменты антител тестировали в отношении блокирования связывания VEGF с KDR. На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность полной тяжелой цепи gH3-привитого полученного из VR165 моноклонального антитела (SEQ ID NO: 57). Примеры Получение и селекция моноклональных антител. Запускали собственную программу иммунизации, чтобы отобрать антитело к KDR человека, которое эффективно блокирует взаимодействие с его лигандом VEGF. Мышей иммунизировали множеством иммуногенов, включая клетки CHO, трансфицированные полноразмерным KDR человека, очищенные слитые белки KDR человека-Fc человека и ДНК, кодирующую указанные слитые белки. Из общего количества 19 слияний, полученных от животных, иммунизированных клеточными/белковыми иммуногенами, и 4 слияний, полученных от животных, иммунизированных ДНК, проводили скрининг примерно 23000 лунок в первичном формате ELISA в отношении связывания с 7-доменным KDR-Fc человека. Затем примерно 800 антител подвергали вторичному скринингу, радиоиммуноанализу, измеряющему блокирование связывания 125-I-VEGF с 7-доменным KDR-Fc человека. При третьем скрининге измеряли блокирование стимулированного VEGF высвобождения тканевого фактора из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). На основании указанного каскада скрининга отобрали антителоVR165 (данные не показаны). Клонирование гена VR165. РНК получали из клеток гибридомы, экспрессирующих VR165, и обратно транскрибировали в ДНК. Указанную ДНК затем использовали в качестве матрицы для серии реакций ПЦР, чтобы амплифицировать последовательности V-области. В качестве прямых праймеров использовали пулы вырожденных праймеров, сконструированных для отжига с консервативными сигнальными последовательностями тяжелой и легкой цепи, тогда как в качестве обратных праймеров служили праймеры, кодирующие область соединения каркасной область 4/C-область. Таким образом, амплифицировали гены V-области как тяжелой, так и легкой цепи, и затем клонировали и секвенировали. Последовательности ДНК транслировали, получая аминокислотную последовательность V-области VR165, которую подтверждали на основе белковой последовательности, определенную с помощью N-концевого секвенирования. Затем мышиные гены V-области субклонировали в экспрессирующих векторах pMR10.1 и pGamma-4. Указанные векторы являются отдельными векторами для экспрессии легкой и тяжелой цепи, соответственно, содержащими геномную ДНК, кодирующую гены константных областей легкой цепи каппа и тяжелой цепи гамма-4 человека. Совместная трансфекция в клетки CHO создавала химерное антитело VR165. Конструирование CDR-привитых последовательностей.VR165 подвергали CDR-прививке в каркасные области человека, чтобы уменьшить возможную иммуногенность и облегчить экспрессию в E.coli. Акцепторные каркасы зародышевой линии человека выбирали из подгруппы VHIII и VLI. Акцепторный каркас тяжелой цепи представляет собой последовательность VH3-7 зародышевой линии человека, при этом каркас 4 происходит из данной части последовательности зародышевой линии JH-области человека, JH4. Акцепторный каркас легкой цепи представляет собой последовательность А 30 зародышевой линии человека, при этом каркас 4 происходит из данной части последовательности зародышевой линии JK-области человека, JK1. Выравнивание показывает,что имеется 15 различий в каркасе между донорной и акцепторной тяжелыми цепями. В каждом из указанных положений проводили анализ возможности того, что данный остаток вносит вклад в связывание антигена; мышиный донорный остаток сохраняли при условии, что он считался важным. Выравнивание легких цепей показывает, что существует 24 различия в каркасе между донорной и акцепторной последовательностями. Снова анализировали возможность того, что мышинный остаток вносит вклад в связывание антигена. Таким образом, конструировали три прививаемых участка VH и три прививаемых участка VL (фиг. 9, SEQ ID NO: 17-22). В каждом случае прививаемый участок 1 представляет собой прививаемый участок без мышиных каркасных остатков. Прививаемые участки 2 и 3 содержат мышиные каркасные остатки в показанных положениях. Прививаемый участок gH3 также содержит дополнительные человеческие остатки на C-конце CDR-H2. Данная часть CDR не находится на антигенсвязывающей поверхности. Конструировали гены для кодирования привитых последовательностей, используя кодоны,часто используемые в генах E.coli, и избегая редкие кодоны E.coli (Wada et al., Nucl. AcidsRes., 19, 1981-86, 1991). В последовательность ДНК с интервалами вводили сайты рестрикции, чтобы облегчить дальнейшие генетические манипуляции. На фиг. 10 показана конструкция генов gH1 и gL1(SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24). Олигонуклеотиды, используемые для конструирования генов, показаны на фиг. 11 (SEQ ID NO: 25-40). Конструирование генов привитых последовательностей. Способ ПЦР-сборки использовали для конструирования генов CDR-привитых V-областей gH1 иgL1. Готовили объемы реакции 100 мкл, содержащие 10 мМ трис-HCl pH 8,3, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl,0,001% желатин, 0,25 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 1 пмоль каждого из внутрен- 10010970 них праймеров (F2, F3, F4, R2, R3, R4), 10 пмоль каждого из внешних праймеров (F1, R1) и 1 единицу полимеразы Taq (AmpliTaq, Applied BioSystems, номер в каталоге N808-0171). Параметры цикла ПЦР составляли 94 С в течение 1 мин, 55 С в течение 1 мин и 72 С в течение 1 мин, 30 циклов. Затем продукты реакции разгоняли в 1,5% агарозном геле, вырезали и извлекали, используя центрифужные колонкиQIAGEN (набор для экстракции гелей QIAquick, номер в каталоге 28706). ДНК элюировали в объеме 30 мкл. Затем аликвоты (1 мкл) ДНК gH1 и gL1 клонировали в клонирующем векторе pCR2.1 ТОРО InVitrogen ТОРО ТА (номер в каталоге K4500-01) согласно инструкциям производителя. Указанный неэкспрессирующий вектор служил в качестве промежуточного продукта клонирования, чтобы облегчить секвенирование большого количества клонов. Секвенирование ДНК с использованием специфичных для вектора праймеров использовали для того, чтобы идентифицировать правильные клоны, содержащиеgH1 и gL1, создавая плазмиды pCR2.1(gH1) и pCR2.1(gL1) (см. фиг. 12). Способ замены олигонуклеотидных кассет использовали для создания гуманизированных прививаемых участков gH2 и gL2. На фиг. 13 показана конструкция олигонуклеотидных кассет (SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 43). Чтобы сконструировать каждый вариант вектор (pCR2.1(gH1) или pCR2.1(gL1 разрезали указанными ферментами рестрикции (фиг. 13, сайты рестрикции подчеркнуты), большой векторный фрагмент очищали из агарозного геля и использовали в лигировании с олигонуклеотидной кассетой. На фиг. 14 показаны последовательности олигонуклеотидов, используемых в кассетах (SEQ ID NO: 45-46 иSEQ ID NO: 49-50). Пары отжигали вместе, смешивая в концентрации 0,5 пмоль/мкл в объеме 200 мкл,содержащем 12,5 мМ трис-HCl pH 7,5, 2,5 мМ MgCl2, 25 мМ NaCl, 0,25 мМ дитиоэритритол, и нагревая до 95 С в течение 3 мин на водяной бане (объем 500 мл), затем давали возможность медленно остыть до комнатной температуры. Затем отожженную олигонуклеотидную кассету разбавляли в десять раз в воде перед лигированием в соответствующим образом разрезанный вектор. Секвенирование ДНК использовали для подтверждения правильной последовательности, создавая плазмиды pCR2.1(gH2) и pCR2.1(gL2). Варианты gH3 и gL3 конструировали сходным образом из gH2 и gL2. Кассеты и олигонуклеотиды показаны на фиг. 13 и 14 (SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:47-48 и SEQ ID NO: 51-52). Конструирование gL3 требовало модифицированной методики из-за наличия сайтов PvuI в остове вектораpCR2.1. Расщепление pCR2.1(gL2) с помощью AatII и SfuI создавало молекулу вектора, в которую лигировали подвергнутую отжигу PvuI-AatII-кассету плюс 225 пар оснований SfuI-PvuI-фрагмента, также полученного из pCR2.1(gL2). Секвенирование ДНК использовали для подтверждения правильной последовательности, создавая плазмиды pCR2.1(gH3) и pCR2.1(gL3). Каждый из 3 прививаемых участков тяжелой цепи затем субклонировали в экспрессирующем векторе pGamma-4 в виде HindIII-ApaI-фрагментов. Каждый из 3 прививаемых участков легкой цепи субклонировали в экспрессирующем векторе pMR10.1 в виде SfuI-BsiWI-фрагментов. На фиг. 15 показаны карты указанных экспрессирующих векторов. Антитела экспрессировали временно посредством котрансфекции в клетки CHO. Все комбинации привитой цепи и химерной цепи экспрессировали и сравнивали с антителом с двумя химерными цепями. Связывание оценивали в анализе ELISA связывания KDR, в радиоиммуноанализе ингибирования связывания меченого VEGF с KDR и в анализе BIAcore связывания KDR. Все привитые формы демонстрировали хорошую эффективность в ELISA и радиоиммуноанализе, проявляя активность, сходную с химерной формой. На основе анализа BIAcore прививаемый участок gL3gH3 отобрали в качестве оптимального (данные не показаны) и в дальнейшем называли g165. Конструирование плазмиды pTTOD. Плазмиду рТТО-1 конструировали следующим образом.SalI и EcoRI, продукт расщепления разгоняли в 1% агарозном геле и очищали крупный фрагмент ДНК(4520 п.о.). Синтезировали два олигонуклеотида, которые при отжиге вместе кодируют область полилинкера OmpA. Указанная последовательность имеет липкие концы, которые совместимы с Sail- и EcoRIконцами, созданными в результате рестрикции pTTQ9. При клонировании указанной олигонуклеотидной кассеты в векторе pTTQ9 сайт SalI не восстанавливается, а сайт EcoRI сохраняется. Кассета кодирует первые 13 аминокислот сигнальной последовательности наружного мембранного белка E.coli Omp-A,которым предшествует сайт связывания рибосомы Шайне-Далгарно гена OmpA. Кроме того, присутствуют сайты рестрикции ферментов XbaI, MunI, StyI и SplI. Сайты MunI и StyI находятся в кодирующей области сигнальной последовательности OmpA и предназначены в качестве 5'-клонирующих сайтов для инсерции генов. Два олигонуклеотида, которые составляют данную кассету, отжигали вместе, смешивая при концентрации 5 пмоль/мкл и нагревая на водяной бане до 95 С в течение 3 мин, затем медленно охлаждая до комнатной температуры. Затем подвергнутую отжигу последовательность лигировали в разрезанный SalI/EcoRI вектор pTTQ9. Полученный в результате плазмидный промежуточный продукт, названный pTQOmp, проверяли с помощью секвенирования ДНК.(b) Получение фрагментов и лигирование. Плазмиду рТТО-1 конструировали лигированием одного фрагмента ДНК из плазмиды pACYC184 с двумя фрагментами, полученными из pTQOmp. Плазмиду pACYC184 получали из New England Biolabs. Аликвоту (2 мкг) полностью расщепляли ферментом рестрикции StyI, затем обрабатывали нуклеазойMung Bean; указанная обработка создавала тупые концы посредством сокращения выступающих 5'оснований. После фенольной экстракции и осаждения этанолом ДНК подвергали рестрикции ферментомPvuII, создавая фрагменты длиной 2348, 1081, 412 и 403 п.о. Фрагмент длиной 234 8 п.о. очищали после электрофореза в агарозном геле. Указанный фрагмент кодирует маркер резистентности к тетрациклину и начало репликации р 15 А. Затем фрагмент обрабатывали щелочной фосфатазой кишечника теленка, чтобы удалить 5'-концевые фосфаты, таким образом, предотвращая самолигирование указанной молекулы. Аликвоту (2 мкг) плазмиды pTQOmp расщепляли ферментами SspI и EcoRI и фрагмент длиной 2350 п.о. очищали от нежелательных фрагментов длиной 2040 п.о. и 170 п.о. после электрофореза в агарозном геле; полученный фрагмент кодирует область терминатора транскрипции и ген lacIq. Другую аликвоту (2 мкг) pTQOmp расщепляли EcoRI и XmnI, создавая фрагменты длиной 2289, 1670, 350 и 250 п.о. Фрагмент длиной 350 п.о., кодирующий tac-промотор, сигнальную последовательность OmpA и сайт множественного клонирования, очищали из геля. Затем три фрагмента лигировали, используя примерно эквимолярные количества каждого фрагмента, создавая плазмиду рТТО-1. Все области связывания при клонировании подтверждали секвенированием ДНК.(c) Получение плазмиды pTTOD. Плазмиду pTTOD получали из рТТО-1 удалением сайтов рестрикции остова для PvuII (3 сайта),EcoRV (2 сайта) и ApaI (1 сайт). Указанные изменения осуществляли для того, чтобы упростить методику кодирования Fab'. При осуществлении указанных изменений кодирующую белок последовательность гена laclq и гена тетрациклиновой резистентности не изменяли, хотя на уровне ДНК осуществляли молчащие изменения. Использовали методику ПЦР, при которой конструировали и использовали праймеры, несущие молчащие изменения, которые удаляли указанные сайты рестрикции, чтобы амплифицировать участки исходной плазмиды (pTTO-1). Затем использовали фланкирующие сайты рестрикции(неизменные), чтобы заменить последовательности в исходной плазмиде указанными модифицированными последовательностями. Посредством указанного многостадийного способа создавали плазмидуpTTOD. Перенос существующих в векторе pTTO генов Fab' в pTTOD осуществляли с использованием уникальных сайтов PstI и EcoRI, которые фланкируют гены, создавая pTTOD(Fab'). Инсерция генов V-области g165 в Fab'-экспрессирующую плазмиду pTTOD E.coli. Исходной точкой для инсерции последовательностей g165 были 3 вектора для экспрессии нерелевантного Fab', pTTOD(Fab' IGS-1), pTTOD(Fab' IGS-2) и pTTOD(Fab' IGS-3) (например, см. фиг. 16). Векторы отличаются только в так называемой IGS или межгенной последовательности, которая отделяет ген легкой цепи от гена тяжелой цепи. Указанные IGS-области показаны на фиг. 17 (SEQ ID NO: 53-55). Клонирование последовательностей д 165 в указанных векторах осуществляли в ходе 2-стадийного способа. Сначала легкую цепь рестрицировали из pCR2.1(gL3) в виде EcoRV-BsiWI-фрагмента (395 п.о.) и встраивали в большой фрагмент вектора из EcoRV-BsiWI-расщепления pTTOD(Fab' IGS-1), pTTOD(Fab'IGS-2) и pTTOD(Fab' IGS-3). В результате создавали промежуточные продукты клонированияpTTOD(g165L IGS-1), pTTOD(g165L IGS-2) и pTTOD(g165L IGS-3). Затем указанные промежуточные продукты клонирования разрезали PvuII и ApaI, большой векторный фрагмент очищали и встраивалиPvuII-ApaI-фрагмент длиной 435 п.о. из pCR2.1(gH3). В результате создавали 3 Fab'-экспрессирующие плазмиды pTTOD(g165 IGS-1), pTTOD(g165 IGS-2) и pTTOD(g165 IGS-3). Указанными плазмидами трансформировали штамм-хозяин W3110 и экспрессию Fab' указанными 3 плазмидами сравнивали во встряхиваемых флаконах и в ферментере. На фиг. 18 показаны результаты сравнения экспрессии в ферментере, ясно свидетельствующие о более высокой эффективности вариантаIGS-2. Плазмиду pTTOD(g165 IGS-2) переименовали в pTTOD(CDP791). Плазмидная карта данной конструкции показана на фиг. 8. На фиг. 19 показана полная ДНК и белковая последовательность кодирующей области Fab' в данном векторе плюс некоторая часть 5'- и 3'-фланкирующий последовательности(SEQ ID NO: 56). Пэгилирование CDR-привитого основанного на VR165 модифицированного Fab. Очищенный модифицированный Fab сайт-специфичным образом конъюгировали с разветвленной молекулой m-ПЭГ. Это осуществляли путем активации единственного остатка цистеина в укороченной шарнирной области модифицированного Fab с последующим взаимодействием с (m-ПЭГ)лизилмалеимидом, как описано ранее (A.P. Chapman et al., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). Пэгилированная молекула показана на фиг. 6. Альтернативно реакция активированного Fab с (m-ПЭГ)лизилбис-малеимидом, которая описана в EP-A-1090037, давала пэгилированный ди(модифицированный Fab),в дальнейшем называемый DFM. Активности BIAcore голых и пэгилированных фрагментов.- 12010970 пропускали различные фрагменты CDR-привитого антитела g165 и исходного мышиного антителаVR165, обеспечивая возможность для определения аффинности. В приведенной ниже таблице суммированы полученные результаты. В случае данной формы анализа имеет место преимущество дивалентности, которое показано на основе более низкой скорости распада (Kd) дивалентного типа. Аффинность привитого DFM очень сходна с мышиным IgG, при этом в случае DFM-ПЭГ наблюдается незначительное снижение аффинности. KD молекулы g165 DFM-ПЭГ в данном анализе составляет примерно 410-11 М. Таблица 1 Активности BIAcore голых и пэгилированных фрагментов Радиоиммуноанализ. Способность фрагментов блокировать связывание VEGF с KDR измеряли в радиоиммуноанализе. Поликлональное анти-Fc-антитело использовали для того, чтобы иммобилизовать 7-Ig-доменный KDR,слитый с Fc человека, в планшете для микротитрования, добавляли антитело или фрагмент, затем 125-I-меченый VEGF-165. Результаты этого анализа показаны на фиг. 20. И снова в данной постановке анализа имеет место преимущество дивалентности, которое показано на основе более высокой блокирующей эффективности DFM по сравнению с Fab'. В случае конструкции DFM-PEG наблюдается незначительное снижение активности по сравнению с голым DFM, как показано в исследовании BIAcore. Анализы на основе клеток. Молекула g164 DFM-ПЭГ также проявляла активность в основанных на клетках анализах. Ее способность блокировать VEGF-стимуляцию KDR показана посредством ингибирования высвобождения тканевого фактора эндотелиальными клетками пупочной вены человека (см. Clauss et al., J. Biol. Chem.,271, 17629-17634, 1996). Активность также показана посредством ингибирования опосредованной VEGF мобилизации Са 2+ в эндотелиальных клетках микрососудов человека (см. Cunningham et al., Am. J.Physiol., 276, C176-181, 1999). Следует понимать, что описанные выше примеры являются только иллюстративными и не ограничивают объем данного изобретения, который определен следующей формулой изобретения.