Антитела к тенасцину-с человека и их применение

013537 Настоящее изобретение относится к специфичным к тенасцину-С связывающим элементам, в частности к антителам человека против тенасцина-С человека. Данные специфичные связывающие элементы имеют ряд терапевтических применений, например в диагностике и лечении рака. Тенасцин-С представляет собой крупный гексамерный гликопротеин внеклеточного матрикса, который регулирует адгезию клеток. Он участвует в таких процессах, как пролиферация и миграция клеток, и ассоциирован с изменениями в архитектуре тканей, которые происходят в процессе морфогенеза и эмбриогенеза, а также при образовании опухолей (онкогенезе) или ангиогенезе. Доменная структура тенасцина-С схематически изображена на фиг. 1. В результате альтернативного сплайсинга, который может приводить к включению (множественных) доменов - от домена А 1 до домена D - в центральную часть этого белка, может образовываться несколько изоформ тенасцина-С. [BorsiL. et al. Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla В. et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567]. Ранее предполагали, что домены A1-D или входят в молекулу тенасцина-С, или не включаются в нее "блоком" (т.е. все сразу) по механизму альтернативного сплайсинга, в результате чего образуются молекулы "большого тенасцина-С" и "малого тенасцина-С" [Borsi L. et al. J Biol Chem 1995; 270:6243-6245]. Имеются сообщения о значительно повышенной экспрессии "большой" изоформы тенасцина-С в ряде опухолей [Borsi 1992 выше]; в клинике подробно описаны два моноклональных антитела, специфичных к доменам А 1 иD соответственно [Riva P. et al. Int J Cancer 1992; 51:7-13, Riva P. et al. Cancer Res 1995; 55:5952s-5956s,Paganelli G. et al. Eur J Nucl Med 1994; 21:314-321, Reardon D.A. et al. J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397,Bigner D.D. et al. J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212]. Однако недавно стало очевидным, что имеет место более сложная регуляция механизма альтернативного сплайсинга, приводящая к повышенной гетерогенности молекул "больших" изоформ тенасцинаС. Например, сообщалось о том, что дополнительный домен С тенасцина-С демонстрирует более ограниченный по сравнению с другими подвергающимися альтернативному сплайсингу доменами тенасцина-С рисунок экспрессии [Carnemolla В. et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352], при котором иммуногистохимический анализ показывает, в основном, периваскулярное окрашивание. Домен С тенасцина-С не удается обнаружить в большинстве нормальных взрослых тканей, однако его экспрессия повышена в астроцитомах высокой степени злокачественности (high-grade) [Carnemolla В.et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352] и других типах опухолей. Дальнейшее подтверждение существования гетерогенности среди больших изоформ тенасцина-С дал анализ транскрипции, который подтвердил, что транскрипты большого тенасцина-С имеют гетерогенный состав [Katenkamp K. et al. J Pathol 2004; 203:771-779]. Дополнительный уровень сложности обусловлен присутствием или отсутствием посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования), которые могут изменить определенные эпитопы на поверхности отдельных доменов белка и сделать их недоступными для специфичного молекулярного распознавания специфичными моноклональными антителами in vitro или in vivo. Несмотря на то, что существующие in vitro методики позволяют быстро выделить антитела, специфичные практически к любому белку, что такие антитела не обязательно будут распознавать данный эпитоп в биологических образцах или в модели болезни на животном. Возможные причины отсутствия связывания in vivo включают посттрансляционные модификации эпитопа, маскирование эпитопа и недостаточные специфичность или стабильность антитела. Поэтому трудно оценивать пригодность моноклональных антител для практического применения, основываясь лишь на их способности реагировать с рекомбинантыми антигенами (или фрагментами антигенов) при обычных способах твердофазного анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), который обычно применяют для скрининга моноклональных антител. Следовательно, чтобы оценить пригодность для применения в диагностике и терапии, моноклональные антитела к отдельным доменам "больших" изоформ тенасцина-С необходимо анализировать отдельно. Авторы настоящего изобретения выделили фрагменты моноклонального антитела человека, специфичные к разным эпитопам, которые находятся в пределах области тенасцина-С, подвергающейся альтернативному сплайсингу. Эти антитела характеризуются способностью распознавать большие изоформы тенасцина-С в биологических образцах, а также высокоспецифичным связыванием при исследовании способом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), и при этом прекрасно различают друг от друга близкородственные антигены. Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает элемент, который связывает тенасцин-С человека, в частности большую изоформу тенасцина-С. Предпочтительные специфично связывающие элементы специфичны к опухолям и связывают опухоли предпочтительнее, чем нормальные ткани. Специфично связывающие элементы могут, например,связывать строму и/или нео- и периваскулярные структуры опухолевых тканей предпочтительнее, чем нормальные ткани. Специфично связывающий элемент может связывать "большую" изоформу тенасцина-С предпочтительнее, чем малую изоформу тенасцина-С. В некоторых способах реализации специфично связывающий элемент может связывать домен A1 тенасцина-С. Подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область-1 013537 тяжелой цепи (VH-домен), выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи 4A1-F16, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2, вариабельной области тяжелой цепи 3A1-D5,которая имеет последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7 и SEQ ID NO: 13; и/или вариабельную область легкой цепи антитела (VL-домен), которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи 4A1-F16/3A1-D5, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 50,и/или вариабельную область тяжелой цепи 4A1-F16, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2,или вариабельную область тяжелой цепи 3A1-D5, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 12. В других способах реализации специфично связывающий элемент может связывать домен С тенасцина-С. Подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи Е 10 (последовательность перечня SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 48), вариабельной области тяжелой цепи А 12 (SEQ ID NO: 25), вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11 (SEQ IDNO: 29 или SEQ ID NO: 45) и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQID NO: 26 и SEQ ID NO: 27; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 81, вариабельной области легкой цепи F4, которая имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 31 или SEQ IDNO: 83, вариабельной области легкой цепи G11, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 35 илиSEQ ID NO: 47, и вариабельной области легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 32 и SEQID NO: 33. Так, в одном из примеров специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи Е 10 (SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 48), вариабельную область тяжелой цепи А 12(SEQ ID NO: 25) и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 81, и вариабельной области легкой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23. Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи Е 10/А 12 (SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 81), и/или вариабельную область тяжелой цепи Е 10 (SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 48), или вариабельную область тяжелой цепи А 12 (SEQ ID NO: 25). В другом примере специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11 (SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 45) и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи F4 (SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 83), вариабельной области легкой цепи G11(SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 47) и вариабельной области легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23. Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи F4/G11, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 45, и/или вариабельную область легкой цепи F4, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 83, или вариабельную область легкой цепи G11, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 35 илиSEQ ID NO: 47. В другом способе реализации специфично связывающий элемент связывает домен D тенасцина-С. Предпочтительно специфично связывающий элемент связывает домен D тенасцина человека. Он может-2 013537 давать перекрестную реакцию с изоформой тенасцина мыши. Мы выделили молекулы антител, специфичных к домену D. Обозначение исходного клона - F4S. Мы также разработали вариант F4S с улучшенной афинностью (affinity matured), обозначенный D11. Кроме того, мы разработали вариант D11 с улучшенной аффинностью, обозначенный Р 12. Соответственно, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи F4S, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 58, вариабельной области тяжелой цепи D11, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 55, вариабельной области тяжелой цепи Р 12, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 52, и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63,SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66, и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи Р 12 и D11 с последовательностью SEQ ID NO: 53, вариабельной области легкой цепи F4S, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 60, и вариабельной области легкой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей перечня SEQ ID NO: 67, SEQID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 71. Обычно вариабельную область тяжелой цепи соединяют с вариабельной областью легкой цепи и получают антигенсвязывающий сайт антитела, хотя, как будет обсуждаться ниже, вариабельную область тяжелой цепи можно применять отдельно для связывания антигена. В одном предпочтительном способе реализации описанную в настоящей заявке вариабельную область тяжелой цепи (т.е. последовательностиSEQ ID NOS. 2, 12, 15, 25, 29, 45, 48, 52, 56 или 58) соединяют с соответствующей вариабельной областью легкой цепи (т.е. с последовательностями SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 50 (для 4A1-F16 и 3A1D5), SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 81 (для A12 и Е 10), SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 47 для F4 и G11), SEQ ID NO: 54 для Р 12 и D11 или SEQ ID NO: 60 для F4S), чтобы сформировать антигенсвязывающий сайт антитела, который содержит обе области: вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи (например, сайт, содержащий обе вариабельные области - тяжелой и легкой цепей - антитела 4A1-F16, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи 3A1-D5, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Е 10, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи А 12, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи F4, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи G11, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Р 12, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи D11 или вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи F4S). В других способах реализации вариабельную область тяжелой цепи можно соединить с вариабельной областью легкой цепи, отличной от соответствующей (родственной) вариабельной области легкой цепи, предпочтительно с вариабельной областью легкой цепи от специфичного связывающего элемента, который связывает тот же домен тенасцина-С. Многообразие легких цепей хорошо известно в данной области. Можно взять один или более гипервариабельный участок из вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, описанных в настоящей заявке, и встроить их в подходящий каркас. Подробнее это будет обсуждаться ниже. Гипервариабельные участки (CDR) обычно определяют по Кэботу (Kabat). Предпочтительно вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи содержит CDR1, CDR2 и CDR3. Гипервариабельный участок CDR1 вариабельной области тяжелой цепи 4A1-F16 представлен последовательностью SEQ ID NO: 5. Гипервариабельный участок CDR1 вариабельной области тяжелой цепи 3A1-D5 представлен SEQ ID NO: 13. Гипервариабельные участкиCDR2 и CDR3 вариабельных областей тяжелых цепей 4A1-F16 и 3A1-D5 представлены SEQ ID NOS. 6 и 7 соответственно. Гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей легких цепей 4A1-F16 и 3A1-D5 представлены SEQ ID NOS. 8, 9 и 10 соответственно. Гипервариабельные участкиCDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи Е 10 представлены SEQ ID NOS. 18 и 19. Гипервариабельные участки CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи А 12 представлены SEQ ID NOS. 26 и 27. Гипервариабельный участок CDR3 вариабельной области тяжелой цепи Е 10 и А 12 представленSEQ ID NO: 23. Гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12 представлены SEQ ID NOS. 21, 22 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки CDR1,CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11 представлены SEQ ID NOS. 18, 19 и 20 соответственно. Гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи F4 представлены SEQ ID NOS. 32, 33 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки CDR1, CDR2 иCDR3 вариабельной области легкой цепи G11 представлены SEQ ID NOS. 32, 22 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи Р 12 представлены SEQ ID NOS. 61, 63 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи Р 12 представленыSEQ ID NOS. 67, 69 и 71 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи D11 представлены SEQ ID NOS. 62, 64 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариа-3 013537 бельной области легкой цепи D11 представлены последовательностями SEQ ID NOS. 67, 69 и 71 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи F4S представлен SEQ ID NOS. 62, 65 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи F4S представлены SEQ ID NOS. 68, 70 и 71 соответственно. В некоторых способах реализации специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи антитела, которая содержит один или более CDR3, который имеет последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6, и CDR1, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или более предпочтительно SEQ ID NO: 13. В других способах реализации специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую один или более CDR3, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 20, CDR2, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 27 или более предпочтительно SEQ ID NO: 19, и CDR1, который имеет последовательность аминокислот SEQID NO: 26 или более предпочтительно SEQ ID NO: 18. Специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи антитела,которая содержит один или более гипервариабельный участок CDR3, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 23, участок CDR2, который имеет последовательность аминокислот SEQ IDNO: 22 или SEQ ID NO: 33, и CDR1, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 21 илиSEQ ID NO: 32. Предпочтительно специфично связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела (scFv), описанного более подробно далее. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей можно соединить через пептидный линкер, например линкер, имеющий последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 37. Обычно линкер имеет последовательность аминокислот, содержащую один или более тандемных повторов какого-либо мотива. Обычно такой мотив представляет собой последовательность из пяти остатков, и предпочтительно по меньшей мере 4 из этих остатков представляют собой Gly или Ser. Если четыре из пяти остатков представляют собой Gly или Ser, оставшийся остаток может представлять собой Ala. Более предпочтительно, чтобы каждый из пяти остатков представлял собой Gly или Ser. Предпочтительными мотивами являются GGGGS, SSSSG,GSGSA и GGSGG (последовательности SEQ ID NOS. 76, 77, 78 и 79 соответственно). Предпочтительно такие мотивы в последовательности располагаются рядом, таким образом, чтобы между повторами не было промежуточных остатков. Последовательность линкера может содержать или состоять из одногопяти, предпочтительно трех или четырех повторов такого мотива. Например, линкер с тремя тандемными повторами может иметь одну из следующих последовательностей аминокислот: Варианты вариабельных областей тяжелых и легких цепей и гипервариабельных участков, последовательности которых представлены в настоящем описании и которые можно применять для специфично связывающих тенасцин-С элементов, можно получить способами модификации последовательностей или мутации и скрининга. Настоящее изобретение обеспечивает также и такие способы. Варианты последовательностей аминокислот любых вариабельных областей легких и тяжелых цепей, последовательности которых конкретно указаны в настоящей заявке, также можно применять в соответствии с настоящим изобретением, как указанно в настоящем описании. Конкретные варианты могут включать одно или более изменение в последовательности аминокислот (добавление, делецию, замену и/или вставку остатка аминокислоты), возможно, менее 20 изменений, менее 15 изменений, менее приблизительно 10 изменений или менее приблизительно 5 изменений, 4, 3, 2 или 1 изменение. Изменения можно сделать в одной или нескольких каркасной области и/или одном или более гипервариабельном участке. В частности, можно внести изменения в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, особенно в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи. Специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению может представлять собой элемент, который конкурирует за связывание антигена с каким-либо специфично связывающим элементом, каждый из которых также связывает "большую" изоформу тенасцина С, в частности ее домены А 1 или С, и включает (охватывает) специфично связывающий элемент, вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, либо гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, описанный в настоящей заявке, либо вариант любого из них. Конкуренцию между связывающими элементами можно легко оценить in vitro, например посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и/или мечения специфичной по отношению к одному из связывающих элементов-4 013537 молекулой-репортером, которую можно детектировать в присутствии другого немеченого элемента(ов),чтобы обеспечить идентификацию специфичных связывающих элементов, которые связывают один и тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы. Соответственно, еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает специфично связывающий элемент, который содержит антигенсвязывающий сайт антитела человека, который конкурирует за связывания тенасцина-С с одним или более из 4A1-F16, 3A1-D5, Е 10, А 12, F4, G11, Р 12, D11 иF4S. В данной области доступны различные способы получения антител против "большой" формы тенасцина-С, которые могут конкурировать с 4 А 1-F16, 3A1-D5, Е 10, А 12, F4, G11, Р 12, D11 или F4S. Такие антитела связывают "большую" изоформу тенасцина-С предпочтительнее, чем малую изоформу тенасцина-С. Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения одного или более специфичных связывающих элементов, способных связывать антиген, который включает приведение в контакт с указанным антигеном библиотеки специфичных связывающих элементов согласно настоящему изобретению и отбор одного или более специфичного связывающего элемента из этой библиотеки,способного связывать указанный антиген. Библиотеку можно разместить на поверхности частиц бактериофага (phage display), каждая из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, расположенную на ее поверхности и, факультативно, вариабельную область легкой цепи, если она также присутствует на поверхности. После отбора специфично связывающих элементов, способных связывать антиген и расположенных на поверхности частиц бактериофага, можно получить нуклеиновую кислоту из частиц бактериофага, на которых расположен указанный специфично связывающий элемент. Такую нуклеиновую кислоту можно затем применять для получения специфического связывающего элемента или вариабельной области тяжелой цепи антитела (факультативно, вариабельной области легкой цепи антитела) путем экспрессии нуклеиновой кислоты, которая имеет последовательность, аналогичную последовательности нуклеиновой кислоты, полученной из частицы бактериофага, несущей указанный отобранный специфично связывающий элемент. Вариабельная область тяжелой цепи антитела, которая имеет последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи указанного специфично связывающего элемента, можно получить в выделенном (изолированном) виде, так же как и специфично связывающий элемент, который содержит такую вариабельную область тяжелой цепи. Затем можно исследовать способность указанного элемента связывать тенасцин-С, а также конкурировать с 4A1-F16, 3A1-D5, Е 10, А 12, F4, G11, Р 12, D11 или F4S за связывание тенасцина-С. Специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению может связывать тенасцинС с аффинностью, равной афинности одного или более из 4A1-F16, 3A1-D5, Е 10, А 12, F4, G11, Р 12, D11 или F4S, или с большей или меньшей аффинностью. Аффинность связывания различных специфичных связывающих элементов можно сравнить в подходящих условиях. В дополнение к последовательностям антител, специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут содержать другие аминокислоты, например образующие пептид или полипептид, такой как домен складки, или придающие молекуле другую функциональную характеристику в дополнение к способности связывать антиген. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут нести детектируемую метку, например, агент, который облегчает выявление опухолей, такой как радионуклид или флюорофор, либо специфичные связывающие элементы можно конъюгировать с агентом, способным запускать какое-либо биологическое событие, таким как радионуклид, фотосенсибилизатор, лекарственное средство, цитокин, предшественник фактора свертывания (крови), токсин или фермент (например, через пептидильную связь или линкер), для применения в способе терапии. В других своих аспектах настоящее изобретение обеспечивает изолированную нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность, кодирующую специфично связывающий элемент, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи согласно настоящему изобретению, и способы приготовления специфического связывающего элемента, вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, которые включают экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в условиях, обеспечивающих получение указанного специфичного связывающего элемента, вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи, и его выделение. Описанные в настоящей заявке специфичные связывающие элементы можно применять в способах лечения или диагностики в организме человека или животного, таком как способ лечения (которое может включать профилактическое лечение) расстройства или заболевания, в частности пролиферативного заболевания, такого как рак, у пациента, который представляет собой человека, указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного количества специфично связывающего элемента. Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту, обычно изолиро-5 013537 ванную, кодирующую раскрытую в настоящем описании вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи. Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту, обычно выделенную,кодирующую раскрытую в настоящем описании последовательность гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи или гипервариабельного участка вариабельной области легкой цепи, в частности гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NOS. 5, 6, 7, 13, 18, 19, 20, 26 и 27 или гипервариабельного участка вариабельной области легкой цепи, выбранную из SEQ ID NOS. 8, 9, 10, 21, 22, 23, 32 и 33. В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, трансформированную нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению. Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения вариабельной области тяжелой цепи антитела, который включает осуществление экспрессии с кодирующей нуклеиновой кислотой. Данный способ может включать культивирование клетки-хозяин в условиях, подходящих для получения указанной вариабельной области тяжелой цепи антитела. Аналогичные способы получения вариабельных областей легкой цепи и специфичных связывающих элементов, содержащих вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, обеспечены в качестве дополнительных аспектов настоящего изобретения. Способ получения может включать этап выделения и/или очистки продукта. Способ получения может включать приготовление продукта в форме композиции, которая содержит по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый наполнитель. Ниже эти и другие аспекты настоящего изобретения описаны подробнее. Терминология Специфично связывающий элемент. Этот термин описывает одну молекулу (элемент, составляющую) из пары молекул, которые обладают специфичностью связывания по отношению друг к другу. Элементы специфично связывающейся пары могут быть природного происхождения либо быть полностью или частично синтезированы. Поверхность одного из элементов пары молекул обладает областью или полостью, которая специфично связывает определенную пространственную и полярную структуру другого элемента такой пары молекул, и, следовательно, комплементарна ей. Таким образом, элементы пары обладают свойством специфичного связывания (взаимодействия) друг с другом. Примерами типов специфично связывающих пар являются пары антиген/антитело, биотин/авидин, гормон-рецептор/гормон, рецептор/лиганд, фермент/субстрат. Данная заявка относится к реакциям типа антиген-антитело. Антитело. Этот термин описывает иммуноглобулин, природный либо полученный частично или полностью путем синтеза. Данный термин также относится к полипептиду или белку, имеющему связывающую область (домен), которая представляет собой связывающую область антитела или в значительной степени гомологична связывающей области антитела. Примерами антител являются классы (изотипы) иммуноглобулинов, а также их подклассы, фрагменты, которые содержат антигенсвязывающую область, такие как Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; и бивалентные антитела (diabodies). Можно использовать моноклональные и другие антитела и применить методики технологии рекомбинантных ДНК, чтобы получить другие антитела или химерные молекулы, которые сохраняют специфичность исходного антитела. Такие методики могут включать присоединение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность, CDR) антитела, к константным областям либо к константным областям и каркасным областям другого иммуноглобулина. См., например, ЕР-А-184187, GB 2188638A или ЕР-А-239400. Гибридому или другую клетку,продуцирующую антитело, можно подвергнуть генетической мутации или другим модификациям, которые могут привести или не привести к изменению специфичности продуцируемых антител. Следует иметь в виду, что поскольку антитела можно модифицировать несколькими способами,термин "антитело" охватывает любой специфично связывающий элемент или вещество, имеющие связывающую область (домен) требуемой специфичности. Следовательно, этот термин охватывает фрагменты,производные и функциональные эквиваленты антител, а также гомологи антител, включая любой полипептид, содержащий связывающую область иммуноглобулина, природную, либо полностью или частично синтетическую. Следовательно, в объем понятия включены и химерные молекулы, содержащие связывающую область иммуноглобулина, либо ее эквивалент, соединенные с другим полипептидом. Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в европейских патентах ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023. Было показано, что фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются: (i) фрагменты Fab, состоящие из следующих областей: вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH), константная область легкой цепи (CL) и константная область 1 тяжелой цепи (СН 1); (ii) Fd-фрагмент, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи и константной области 1 тяжелой цепи; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из-6 013537 областей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи одного антитела; (iv)dAb-фрагмент (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989, который состоит из вариабельной области тяжелой цепи; (v) изолированные гипервариабельные участки (CDR); (vi) F(ab')2-фрагменты-бивалентые фрагменты, содержащие два связанных Fab-фрагмента; (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны пептидным линкером, который обеспечивает объединение этих двух областей с образованием антигенсвязывающего сайта (Bird et al., Science,242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) биспецифичные димеры одноцепочечных Fv (PCT/US 92/09965) и (ix) бивалентные фрагменты антител ("diabodies"), мультивалентные или мультиспецифичные фрагменты, полученные путем соединения генов (WO 94/13804; P. Holliger etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993). Молекулы Fv, scFv или мультиспецифичных фрагментов можно стабилизировать посредством введения дисульфидных мостиков, соединяющих вариабельные области легких и тяжелых цепей (Y. Reiter et al. Nature Biotech 14, 1239-1245, 1996). Также можно получить миниантитела (Minibodies), содержащие scFv, объединенные с доменом СН 3 (S. Hu et al., CancerRes. 56, 3055-3061, 1996). Мультиспецифичные фрагменты антител представляют собой мультимеры полипептидов, где каждый полипептид содержат одну область, содержащую связывающий участок легкой цепи иммуноглобулина, и вторую область, содержащую связывающий участок тяжелой цепи иммуноглобулина, причем эти две области связаны (например, пептидным линкером), но не способны ассоциировать друг с другом с образованием антигенсвязывающего сайта: антигенсвязывающий сайт образуется при ассоциации первой области одного полипептида в составе мультимера со второй областью другого полипептида в составе этого мультимера (WO 94/13804). В случае применения биспецифичных антител они могут представлять собой обычные биспецифичные антитела, которые можно получить разнообразными способами (Holliger, P. and Winter G. CurrentOpinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993, например приготовить химическим способом или из гибридных гибридом, либо они могут представлять собой любой из упомянутых выше биспецифичных фрагментов антител. Можно сконструировать мультиспецифичные фрагменты антител и scFv без участка Fc, используя только вариабельные области, что может позволить снизить эффекты антиидоптипической реакции. Биспецифичные фрагменты (diabodies) в отличие от полных биспецифичных антител также могут быть особенно полезны, поскольку их можно легко сконструировать и экспрессировать в E.coli. Мультиспецифичные фрагменты антител (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с подходящей специфичностью связывания можно легко выбрать из библиотек при помощи фагового дисплея(WO 94/13804). Если одно плечо мультиспецифичного фрагмента антитела должно остаться неизменным, например со специфичностью, направленной против антигена X, то можно создать библиотеку, в которой варьируется другое плечо, и выбрать антитело подходящей специфичности. Полные биспецифичные антитела можно получить путем изменения пространственной укладки цепей антител (knobsinto-holes engineering J.В.В. Ridgeway et al., Protein Eng. 9, 616-621, 1996). Антигенсвязывающая область. Этот термин описывает часть антитела, которая содержит область, которая специфичным образом связывает часть антигена или целый антиген и является им комплементарной. Если антиген крупный,антитело может связывать только определенную часть этого антигена, которая называется эпитопом. Антигенсвязывающую область может образовывать одна или более вариабельных областей антитела(например, так называемый Fd-фрагмент антитела, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи). Предпочтительно антигенсвязывающая область содержит вариабельную область легкой цепи антитела(VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH). Специфично (специфичный). Этот термин можно применять к ситуации, в которой один элемент специфично связывающей пары не демонстрирует значительного связывания с молекулами, отличными от его специфично связыва(ющего/емого) партнера(ов). Например, антитело, специфичное к тенасцину-С, либо демонстрирует незначительное связывание, либо не демонстрирует связывания с другими компонентами внеклеточного матрикса, такими как фибронектин. Аналогично антитело, специфичное к "большой" изоформе тенасцина-С, может либо демонстрировать незначительное связывание, либо не демонстрировать связывания с малой изоформой тенасцина-С. Данный термин применим также в случае, если, например, антигенсвязывающая область специфична к конкретному эпитопу, который несет несколько антигенов. В таком случае специфично связывющий элемент, несущий антигенсвязывающую область, будет способен связывать различные антигены, несущие такой эпитоп. Содержать. Этот термин обычно используют в значении включать, другими словами допускать присутствие одного или более свойств или компонентов. Изолированный/выделенный. Этот термин относится к состоянию, в котором специфично связывающие элементы согласно настоящему изобретению или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие связывающие элементы, будут находиться в соответствии с настоящим изобретением. Элемент и нуклеиновая кислота будут свободны-7 013537 или практически свободны от материала, с которым они обычно связаны (ассоциированы), такого как другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми их обычно обнаруживают в их природном окружении, либо в окружении (среде), в котором их получают (например, в культуре клеток) в случае получения по технологии рекомбинантных ДНК, осуществляемой in vitro или in vivo. Элементы и нуклеиновые кислоты могут быть приготовлены с разбавителями или адъювантами, но для практических целей все равно оставаться изолированными (выделенными). Например, элементы обычно будут смешивать с желатином или другими носителями в случае применения для покрытия микротитрационных планшетов для применения в иммунологическом анализе, либо смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями для применения в диагностике или терапии. Специфичные связывающие элементы могут быть гликозилированы, либо естественным образом, либо системами гетерологичных эукариотических клеток (например, СНО или NSO (ЕСАСС 85110503), либо они могут быть негликозилированными (например, в случае их получения путем экспрессии в прокариотической клетке). Под "практически соответствующим указанному" понимают, что соответствующий гипервариабельный участок или вариабельная область тяжелой или легкой цепи согласно настоящему изобретению либо идентична, либо очень близка указанным участкам, последовательности которых приведены в настоящем описании. Под "очень близка" подразумевают, что в гипервариабельном участке и/или вариабельной области легкой или тяжелой цепи может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3, или 1, или 2, или 3, или 4 замен. Структура, которая будет нести гипервариабельный участок согласно настоящему изобретению,обычно будет состоять из последовательности тяжелой или легкой цепи антитела, либо ее значительной части, в которой гипервариабельный участок расположен в положении, соответствующем положению гипервариабельного участка во встречающихся в природе вариабельных областях тяжелой или легкой цепей (VH и VL) антител, кодируемых модифицируемыми генами иммуноглобулина. Структуры и расположение вариабельных областей можно определить, обратившись к Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4-e изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, 1987, или к более поздним версиям, доступным в сети Интернет (http://immuno.bme.nwu.edu. Предпочтительно последовательность аминокислот гипервариабельного участка, практически соответствующую указанной, несет в качестве гипервариабельного участка вариабельная область [иммуноглобулина] человека или ее значительную часть. Вариабельные области, задействованные в настоящем изобретении, можно получить из любой зародышевой линии или перестройкой вариабельной области человека, либо она может представлять собой синтетическую вариабельную область, в основе которой лежит консенсусная последовательность известной вариабельной области человека. Последовательность гипервариабельного участка согласно настоящему изобретению (например, CDR1, CDR2 или CDR3) можно встроить в набор вариабельных областей, в которых отсутствует гипервариабельный участок (например, соответствующий CDR1, CDR2 или CDR3), при помощи технологии рекомбинантных ДНК. Например, Marks et al. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) описывает способы получения наборов вариабельных областей антитела, в которых консенсусные праймеры, направленные к или расположенные рядом с 5'-концом вариабельной области, применяют вместе с консенсусными праймерами к третьей каркасной области генов вариабельной области тяжелой цепи человека, чтобы получить набор вариабельных областей VH без гипервариабельного участка CDR3. Marks et al. описывают также, как можно совместить этот набор с CDR3 конкретного антитела. При помощи аналогичных методик можно "перетасовать" (shuffle) полученные из гипервариабельных участков последовательности согласно настоящему изобретению с наборами вариабельных областей легкой или тяжелой цепи без гипервариабельных участков, и совместить перетасованные вариабельные области легкой или тяжелой цепи с родственной вариабельной областью тяжелой или легкой цепи для получения специфично связывающих элементов согласно настоящему изобретению. Этот набор можно затем ввести в подходящую систему-хозяин, например в систему фагового дисплея согласно WO 92/01047, для отбора подходящих специфично связывающих элементов. Набор может состоять из любого числа индивидуальных членов, начиная с 104 и выше, например из от 106 до 108 или 1010 членов. Аналогичные методики перетасовки или комбинаторные методики раскрывает Stemmer (Nature,1994, 370:389-391), который описывает такую методику применительно к гену -лактамазы, но отмечает,что этот подход можно применять для получения антител. Другая альтернатива - создать не существовавшие ранее вариабельные области легкой или тяжелой цепи, несущие последовательности согласно настоящему изобретению, полученные из гипервариабельных участков, путем случайного мутагенеза одного или более отобранных генов вариабельных областей легкой или тяжелой цепи, чтобы получить мутации во всей вариабельной области. Такая методика описана Gram et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:3576-3580), которые применяли ПЦР-мутагенез (errorprone PCR). Другой способ, который можно применять, - направленный мутагенез гипервариабельных участков генов вариабельной области тяжелой или легкой цепи. Такие методики раскрыты в Barbas et al. (1994,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) и Schier et al. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).-8 013537 Все описанные выше методики как таковые известны в данной области и сами по себе не являются частью настоящего изобретения. Опытный специалист сможет применить такие методики для получения специфично связывающих элементов согласно настоящему изобретению при помощи стандартной методологии данной области. Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ получения антигенсвязывающей области антитела, специфичной к тенасцину-С, которая представляет собой вариант указанной вариабельной области тяжелой цепи, который включает получение посредством добавления делеции, замены или вставки одной или более аминокислот в последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, соответствующей описанной в настоящей заявке, вариабельной области тяжелой цепи, факультативное совмещение полученной таким образом вариабельной области тяжелой цепи с одной или более вариабельными областями легкой цепи и исследование вариабельной области тяжелой цепи или комбинации или комбинаций вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи с целью выявления специфического связывающего элемента или антигенсвязывающей области антитела,специфичных к тенасцину-С. Указанная вариабельная область легкой цепи может иметь последовательность аминокислот, которая практически соответствует указанной в настоящей заявке. В некоторых способах реализации один или более гипервариабельных участков вариабельной области тяжелой цепи, например CDR1, CDR2 и/или CDR3, может содержать добавление, делецию, вставку или замену одной или более аминокислот. Можно применять аналогичный способ, включающий получение вариабельной области легкой цепи, которая представляет собой вариант последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи, описанной в настоящей заявке, посредством добавления, делеции, замены или вставки одной или более аминокислот в описанную в настоящей заявке последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи, совмещение полученной таким образом вариабельной области легкой цепи с одной или более вариабельными областями тяжелой цепи и исследование комбинации или комбинаций вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи с целью выявить специфично связывающий элемент или антигенсвязывающую область антитела, специфичные к тенасцину-С. Указанная вариабельная область тяжелой цепи может иметь последовательность аминокислот, которая практически соответствует указанной в настоящей заявке, или может предоставлять собой вариант последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, которая описана в настоящей заявке, полученный,как описано выше. В некоторых способах реализации один или более гипервариабельных участков вариабельной области легкой цепи может содержать добавление, делецию, вставку или замену одной или более аминокислот. Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ приготовления специфично связывающего элемента, специфичного к тенасцину-С, который включает:(a) обеспечение исходного набора нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, которые либо содержат гипервариабельный участок, который предстоит заменить, либо не имеют области, кодирующей гипервариабельный участок;(b) объединение такого набора с донорской нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность аминокислот, практически соответствующую указанной в настоящей заявке последовательности гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи, для введения указанной донорской нуклеиновой кислоты в гипервариабельный участок в наборе, с целью обеспечить конечный набор нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи;(c) экспрессию нуклеиновых кислот указанного конечного набора;(d) отбор специфического связывающего элемента, специфичного к антигену тенасцин-С; и(e) выделение указанного специфического связывающего элемента или кодирующей его нуклеиновой кислоты. Гипервариабельный участок может представлять собой CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи. Опять же можно применить аналогичный способ, в котором гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи объединяют с набором нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область легкой цепи, которые либо содержат гипервариабельный участок, который следует заменить,либо не содержат область, кодирующую гипервариабельный участок. Гипервариабельный участок может представлять собой CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи. Аналогично, можно привить один или более либо все три гипервариабельных участка в набор вариабельных областей тяжелой или легкой цепей, среди которых затем проводят скрининг на специфично связывающий элемент или специфично связывающие элементы, специфичные к тенасцину-С, в частности к "большим" изоформам тенасцина-С. Значительная часть вариабельной области иммуноглобулина будет содержать по меньшей мере три гипервариабельных участка вместе с промежуточными каркасными участками. Предпочтительно эта часть будет также содержать по меньшей мере приблизительно 50% первого и четвертого каркасных-9 013537 участков (любого из них или обоих), где эти 50% представляют собой С-концевые 50% первого каркасного участка и N-концевые 50% четвертого каркасного участка. Дополнительные остатки N-концевого или С-концевого конца значительной части вариабельной области могут представлять собой те остатки,которые обычно не ассоциированы с встречающимися в природе участками вариабельных областей. Например, результатом создания специфичных связывающих элементов согласно настоящему изобретению, полученных по технологиям рекомбинантных ДНК, может быть введение N- или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, введенными с целью облегчить клонирование или другие этапы манипуляций. Другие этапы манипуляций включают введение линкеров для соединения вариабельных областей согласно настоящему изобретению с другими последовательностями белков, включающими тяжелые цепи иммуноглобулина, другие вариабельные области (например, при получении мультиспецифичных фрагментов антител) или белковыми метками, описанное подробнее ниже. Хотя в предпочтительном аспекте настоящего изобретения предпочтительны специфичные связывающие элементы, содержащие пару вариабельных областей легкой и тяжелой цепи, связывающие области, содержащие либо вариабельную область легкой цепи, либо вариабельную область тяжелой цепи,представляют собой другие аспекты настоящего изобретения. Известно, что отдельные области иммуноглобулина, в частности вариабельные области тяжелой цепи, способны связывать антигены специфичным образом. Что касается любой из одноцепочечных специфичных связывающих областей, эти области можно использовать для проведения скрининга на комплементарные области, способные образовывать двухдоменный специфично связывающий элемент, способный связывать тенасцин-С. Этого можно достигнуть способами скрининга с использованием фагового дисплея, в которых применяют так называемый иерархический двойной комбинаторный подход, раскрытый в WO 92/01047, где индивидуальную колонию, содержащую клон либо с легкой, либо с тяжелой цепью (Н или L), применяют, чтобы заразить полную библиотеку клонов, кодирующих другую цепь (легкую или тяжелую, L или Н), и полученные в результате двухцепочечные связывающие элементы отбирают по методикам фагового дисплея, описанным в указанном источнике. Эта методика также раскрыта в Marks et al., там же. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать константные области антитела или их части. Например, вариабельную область легкой цепи можно по ее С-концу присоединить к константным областям легкой цепи, включая цепи С или С антител человека, предпочтительно цепи С. Аналогично, специфично связывающий элемент на основе вариабельной области тяжелой цепи можно присоединить по его С-концу к полной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, полученным из иммуноглобулина любого класса, например IgG, IgA, IgE иIgM, и из любого подкласса этих классов, в частности IgG1 и IgG4. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению можно снабжать детектируемой или функциональной меткой. Детектируемые метки могут включать радионуклиды, такие как йод-131, иттрий-90, индий-111 и технеций-99, которые можно присоединять к антителам согласно настоящему изобретению, применяя стандартные реагенты, известные в области визуализации антител. Специфично связывающий элемент,помеченный радиоактивным изотопом, можно применять для того, чтобы селективно направлять излучение на конкретную мишень, такую как опухоль. Это может быть полезно для визуализации опухолей или доставки цитотоксической дозы излучения, как описано ниже. Другие детектируемые метки могут включать ферментные метки, такие как пероксидаза хрена, химические элементы, такие как биотин, которые можно детектировать посредством связывания со специфическим когнатным детектируемым компонентом, например меченым авидином, флюорохромами, такими как флюоресцеин, родамин, фикоэритрин и техасский красный (Texas Red), а также флюорофорами ближнего инфракрасного диапазона, включая производные цианинового красителя, такие как Су 7 (Amersham Pharmacia) и Alexa750 (Molecular probes). В других способах реализации детектируемая метка может содержать производное микропузырьков, которое определяется при (Joseph S. et al. Pharm Res. 2004 Jun; 21(6):920-6), или магнитную частицу(Schellenberger E.A. et al. Bioconjug. Chem. 2004 Sep-Oct; 15(5): 1062-7). Функциональная метка может включать агент, который способен запускать какое-либо биологическое событие или обладает противораковым действием. Подходящие метки включают радионуклиды,фотосенсибилизаторы, полипептиды-токсины, токсичные синтетические молекулы и другие лекарственные средства, цитокины (например, IL2, IL12, TNF), хемокины, предшественники факторов свертывания(например, тканевой фактор), ферменты, липосомы и факторы иммунного ответа (см., например, D. Neri(2004) CHIMIA "Tumor Targeting" (нацеливание на опухоли), т. 58, стр. 723-726). Радионуклиды включают йод-131, иттриум-90, индий-111 и технеций-99. Они более подробно описаны выше. Токсин, представляющий собой полипептид или пептид, обладает цитотоксической или апоптотической активностью и может быть получен из источника, представляющего собой микроорганизм, растение, животное или человека. В некоторых способах реализации токсин-полипептид можно ввести непо- 10013537 средственно в константные области специфично связывающего элемента. Примеры токсинаполипептида включают экзотоксин Pseudomonas, -цепь рицина и ангиогенин. Синтетические токсические молекулы включают химические соединения, обладающие цитотоксической активностью, включая, например, агенты, образующие комплексы с ДНК, агенты или ингибиторы клеточного цикла. В некоторых способах реализации высвобождение токсической молекулы может происходить вблизи клетки-мишени благодаря расщеплению рН- или ферментчувствительного линкера (например, линкеров, содержащих иминовые связи). Примеры токсических синтетических молекул включают мейтанзин (maytansine), калдихимицин (calicheamicin), эпотилон (epothilone) и тубулизин (tubulysin), a также их производные. Факторы иммунного ответа могут включать специфичные связывающие элементы, которые связываются с иммунными клетками-эффекторами. Связывание специфического связывающего элемента может вызывать клеточный иммунный ответ против клетки-мишени. В предпочтительных способах реализации специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению конъюгируют с цитокином. Можно получить рекомбинантный белок, содержащий специфично связывающий элемент или полипептид, являющийся его компонентом (например, тяжелую цепь или легкую цепь состоящего из нескольких цепей фрагмента антитела, такого как Fab), и цитокин. Так,например, можно объединить вариабельную область легкой или тяжелой цепи специфичного связывающего элемента согласно настоящему изобретению с цитокином. Обычно специфично связывающий элемент и цитокин соединяют посредством пептидного линкера, например пептида, из приблизительно 5-25 остатков, например 10-20 остатков, предпочтительно 15 остатков. В настоящем описании приведены подходящие примеры пептидных линкеров. Предпочтительно цитокин представляет собой IL2, более предпочтительно - IL2 человека. Цитокин можно присоединять в направлении, обратном транскрипцииdownstream), от специфичного связывающего элемента или полипептида, являющегося его компонентом. Предпочтительный способ реализации представляет собой рекомбинантный белок, содержащий специфично связывающий элемент (в частности, молекулу антитела, например молекулу scFv) согласно настоящему изобретению и IL2. Последовательности аминокислот таких рекомбинантных белков и нуклеиновые кислоты, содержащие кодирующие их последовательности нуклеотидов, составляют часть настоящего изобретения. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут быть полезными в способах диагностики, таких как визуализация опухолей, или в лечении пациентов - животных или людей, например, при раковых заболеваниях. Соответственно, дальнейшие аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы лечения,включающие введение предусмотренного специфичного связывающего элемента, фармацевтической композиции, содержащей такой специфично связывающий элемент, и применение такого специфично связывающего элемента в производстве лекарственного средства для введения, например, в способе изготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающем разработку рецептуры специфичного связывающего элемента с фармацевтически приемлемым носителем. Специфично связывающий элемент для применения в способе лечения предпочтительно конъюгируют или связывают с функциональной меткой, которая обеспечивает противоопухолевый эффект. В предпочтительных способах реализации, как упоминалось выше, специфично связывающий элемент конъюгирован с цитокином, например IL2. Клинические показания, при которых можно применять описанный в настоящей заявке специфично связывающий элемент для обеспечения полезного терапевтического действия, включают пролиферативные заболевания, такие как предраковые и злокачественные новообразования и опухоли (например, гистоцитома, астроцитома, остеома), рак (например, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, колоректальный рак, карцинома молочной железы, карцинома яичников, рак простаты, рак яичка, рак печени, рак почки, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак мозга, саркома, остеосаркома, саркома Капоши, меланома), лейкемии и ангиогенные заболевания. Предраковые или злокачественные заболевания могут возникать в любых типах клеток, включая,без ограничения, легкое, толстую кишку, молочную железу, яичник, предстательную железу, печень,мозг и кожу. Пролиферативное заболевание, подходящее для описанного в настоящей заявке лечения, может характеризоваться присутствием клеток или тканей, в которых повышена или увеличена экспрессия крупных изоформ тенасцина-С, в частности "больших" изоформ, содержащих домены A1 или С. В соответствии с настоящим изобретением предусмотренные композиции можно вводить индивидуумам. Предпочтительно осуществляют введение "терапевтически эффективного количества", достаточного для того, чтобы продемонстрировать благоприятное для пациента действие. Такое благоприятное действие может представлять собой, по меньше мере, облегчение одного из симптомов. Фактически вводимое количество, доза и время введения будут зависеть от природы и тяжести состояния, которое лечат. Ответственность за предписания лечения, например решения относительно дози- 11013537 ровок и т.д., несут врачи общей практики (терапевты) и другие врачи. Подходящие дозы антитела хорошо известны в данной области; см. Ledermann J.A. et al. (1991) lnt J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. etal. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals (Антитело, иммуноконъюгаты и радиофармацевтические препараты) 4: 915-922. Точная доза будет зависеть от ряда факторов, включая следующие: предназначено ли антитело для диагностики или лечения, размер и положение участка, который предстоит лечить, конкретная природа антитела (например, целое антитело, фрагмент или мультиспецифическое антитело) и природа любой детектируемой метки или другой молекулы, присоединенной к антителу. Обычно доза антитела будет лежать в диапазоне от 0,5 мг до 100 г для систематического применения и от 10 мкг до 1 мг для местного применения. Обычно антитело будет представлять собой целое антитело предпочтительно класса IgG1 или IgG4. Доза дана для самостоятельного лечения (только антителом) взрослого пациента, ее можно пропорционально изменять для детей и младенцев, а также для других форматов антител пропорционально молекулярной массе. Применение можно повторять ежедневно, дважды в неделю, еженедельно или с месячными интервалами, согласно решению врача. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению обычно будут вводить в форме фармацевтической композиции, которая может содержать по меньшей мере один компонент в дополнение к специфично связывающему элементу. Соответственно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению и для применения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, в дополнение к активному компоненту,фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны снижать эффективность активного компонента. Точная природа носителя или другого материала будет зависеть от пути введения, который может представлять собой пероральное ведение или введение путем инъекции, например внутривенной. Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме таблетки, капсулы,порошка или в жидкой форме. Таблетка может содержать твердый носитель, такой как желатин, или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода,петролейные, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Такие композиции могут содержать физиологический раствор, раствор декстрозы или другого сахарида, либо гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Для внутривенных инъекций или инъекций в очаг поражения активный компонент будет иметь форму пригодного для парентерального введения раствора, который является апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Лица, обладающие соответствующим опытом в данной области, смогут приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические разбавители, такие как Sodium Chloride Injection (раствор хлорида натрия для инъекций), Ringer's Injection (раствор Рингера для инъекций), Lactated Ringer's Injection (лактатный раствор Рингера). При необходимости можно включить в композицию консерванты, стабилизаторы, буферы и/или другие добавки. Композицию можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения либо одновременно, либо последовательно, в зависимости от заболевания, которое следует лечить. Другие способы лечения могут включать введение обезболивающих лекарств, таких как нестероидные противовоспалительные лекарства (например, аспирин, парацетамол, ибупрофен или кетопрофен), или опиаты, такие как морфин, либо противорвотных средств. Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает способ обнаружения и/или визуализации опухолевых клеток, включающий введение описанного в настоящей заявке антитела индивидууму и детектирование связывания указанного антитела с опухолевыми клетками в организме указанного индивидуума. Предпочтительные антитела для применения в таких способах можно конъюгировать или связывать с детектируемой меткой, такой как радионуклид или флюорофор. Способ согласно настоящему изобретению может включать стимуляцию или допущение связывания обеспеченного настоящим изобретением специфично связывающего элемента с тенасцином-С. Как уже отмечалось, такое связывание может иметь место in vivo, например, после введения специфического связывающего элемента или нуклеиновой кислоты, кодирующей специфично связывающий элемент. Можно определять параметры (количественные характеристики) связывания специфично связывающего элемента с тенасцином-С. В некоторых способах реализации можно определять связывание специфично связывающего элемента с образцом, взятым у пациента. В других способах реализации можно определять связывание специфичного связывающего элемента с антигеном in vivo, например, в визуализации или детектировании опухолей в организме индивидуума. Можно осуществлять количественную оценку количества антигена, что может представлять диагностический интерес. Связывание антител можно определять любыми подходящими средствами. Например, антитело можно связать или конъюгировать с молекулой-репортером или детектируемой меткой и определять присутствие, количество или локализацию метки или репортера в образце.- 12013537 Связывание антитела in vivo, например, в способе визуализации молекул можно определять путем радиоактивного детектирования (например, PET (позитронно-эмиссионная томография), SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография, визуализации способом флюоресценции в ближнем диапазоне инфракрасного излучения (например, диффузная оптическая томография, эндоскопия), ультразвук (например, с нацеленными производными микропузырьков) и магнитно-резонансная томография(с нацеленными магнитными частицами). В других способах реализации связывание антитела может происходить in vitro, например, при твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA), Вестерн-блоттинге, иммуноцитохимическом анализе, иммунопреципитации или аффинной хроматографии. Способ обнаружения и/или визуализации клеток опухоли может, таким образом, включать приведение описанного в настоящей заявке антитела в контакт с образцом, полученным у пациента, и определение связывания указанного антитела с клетками опухоли в указанном образце. Предпочтительные антитела для применения в таких in vitro способах можно конъюгировать или связывать с молекулой-репортером. Молекула-репортер может представлять собой радионуклид, флюорохром, люминисцирующий или лазерный краситель со спектрально обособленными характеристиками испускания или поглощения. Подходящие флюорохромы включают флюоросцеин, родамин, фикоэритрин и техасский красный (Texas Red). Подходящие хромогенные красители включают диаминобензидин. Для визуализации in vivo предпочтительны радионуклиды или флюорофоры. Другие репортеры включают макромолекулярные коллоидные частицы или конкретный материал,такой как латексные гранулы с красителем, магнитным или парамагнитным, а также биологически или химически активные агенты, которые могут прямо или опосредованно порождать детектируемые сигналы, которые можно наблюдать визуально, детектировать при помощи электронных средств либо регистрировать другими способами. Эти молекулы могут представлять собой ферменты, которые катализируют реакции, в которых развивается или меняется окраска, или вызывают изменение электрических свойств,например. Они могут представлять собой возбудимые молекулы, благодаря чему переход между различными энергетическими состояниями порождает поглощение или излучение с определенным спектром. Они могут включать химические элементы, применяемые совместно с биосенсорами. Можно применять следующие системы детектирования: биотин/авидин или биотин/стрептавидин и щелочная фосфатаза. Способ определения связывания не является признаком настоящего изобретения, и специалисты в данной области смогут выбрать подходящий способ, руководствуясь своими знаниями и предпочтениями. Настоящее изобретение охватывает также специфично связывающий элемент, который конкурирует за связывание тенасцина-С с любым другим связывающим элементом, который связывает тенасцин-С,и содержит вариабельную область, включая гипервариабельный участок с последовательностью аминокислот, практически совпадающей с указанной в настоящей заявке (например, описанный в настоящей заявке специфично связывающий элемент). Конкуренцию между связывающими элементами можно легко исследовать in vitro, например, посредством присоединения специфической молекулы-репортера к одному из связывающих элементов, которую можно детектировать в присутствии другого связывающего элемента (элементов) без меток, чтобы обеспечить идентификацию специфично связывающих элементов, которые связывают один и тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы. Конкуренцию можно определять при помощи стандартных методик, таких как твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA). При исследовании конкуренции можно применять фрагмент антигена, представляющий собой пептид, в частности пептид, содержащий представляющий интерес эпитоп. Можно применять пептид,имеющий последовательность эпитопа, а также одну или более аминокислот на любом из концов. Про такой пептид можно сказать, что он "состоит практически" из указанной последовательности. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут быть такими, что их связывание с антигеном ингибирует пептид, который имеет данную последовательность или содержит ее. В исследовании этого факта можно применять белок с любой последовательностью плюс одна или более аминокислот. Подходящие пептиды можно получить из последовательностей доменов D, С и/или А 1 тенасцина-С. Специфичные связывающие элементы, которые связывают конкретный белок, можно выделить, например, из библиотеки фагового дисплея путем "пэннинга" (отбор посредством взаимодействия с (пропускания над) иммобилизованным лигандом) с пептидом (пептидами). Настоящее изобретение также обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК. В предпочтительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая кодирует гипервариабельный участок вариабельной области легкой или тяжелой цепи, которые определены выше. Настоящее изобретение также обеспечивает конструкты в форме плазмид, векторов, кассет транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере один из описанных выше полинуклеотидов.- 13013537 Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантную клетку-хозяин, которая содержит один или более из указанных выше конструктов. Нуклеиновая кислота, кодирующая любой гипервариабельный участок, вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи или специфично связывающий элемент, сама по себе составляет один из аспектов настоящего изобретения, как и способ получения кодируемого продукта, который включает его экспрессию с кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессию можно легко осуществить посредством культивирования рекомбинантных клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, в подходящих условиях. После получения вариабельной области тяжелой или легкой цепи, либо специфично связывающего элемента, путем экспрессии, их можно выделить и/или очистить, применяя любую подходящую методику, а затем применять соответствующим образом. Специфичные связывающие элементы и/или вариабельные области тяжелой или легкой цепи, а также молекулы кодирующей нуклеиновой кислоты и векторы согласно настоящему изобретению можно обеспечивать в выделенном и/или очищенном виде, например, из (от) их естественного окружения, в практически чистой или гомогенной форме, либо, в случае нуклеиновой кислоты, свободными или практически свободными от нуклеиновых кислот или генов, отличающихся по происхождению от последовательности, кодирующей полипептид с необходимой функцией. Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Ссылка на описанную в настоящей заявке последовательность нуклеотидов охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью, а также молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой U (урацил) заменен на Т (тимин), если не указано другое. Системы для клонирования и экспрессии полипептида в разнообразных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают системы бактерий, клеток млекопитающих, дрожжей, а также бакуловирусы. Доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида линии клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек новорожденных хомячков (BHK), клетки меланомы мыши NSO и многие другие. Традиционно предпочтительным хозяином является Е. coli. Экспрессия антител и фрагментов антител в клетках прокариот, таких как Е. coli, хорошо разработана в данной области. Обзор можно найти, например, в Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Специалистам в данной области также доступна экспрессия в эукариотических клетках, как дополнительная возможность для получения специфично связывающего элемента; обзор можно найти, например,в Ref. M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. Можно выбрать или создать подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая последовательности промоторов, последовательности терминаторов, последовательности полиаденилирования, последовательности энхансеров, гены-маркеры и другие подходящие последовательности. В случае необходимости векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные векторы, например фаг или фагмиду. Более подробную информацию можно найти, например, в Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), 2-е изд.,Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные методики и протоколы манипуляций с нуклеиновой кислотой, например, в приготовлении конструктов нуклеиновой кислоты, мутагенезе, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, а также в анализе белков подробно описаны в 2-м изд. Current Protocols in Molecular Biology (Современные протоколы в молекулярной биологии), под ред.Ausubel et al., John WileySons, 1992. Описания Sambrook et al. и Ausubel et al. включены в настоящую заявку путем ссылки. Соответственно, дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает клетку-хозяин, содержащую описанную в настоящей заявке нуклеиновую кислоту. Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин. Введение может задействовать любую доступную методику. Для эукариотических клеток подходящие методики могут включать кальций-фосфатную трансфекцию, ДЭАЭ-декстран, электропорацию, трансфекцию при помощи липосом и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса осповакцины, или для клеток насекомых бакуловируса. Для клеток бактерий подходящие методики могут включать трансформацию с применением хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с применением бактериофага. За введением может следовать стимулирование или допущение экспрессии с нуклеиновой кислотой, например, посредством культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии данного гена. В одном способе реализации нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению встраивают в геном (например, в хромосому) клетки-хозяин. Встраивание можно стимулировать путем введения последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными методиками. Настоящее изобретение также обеспечивает способ, который включает применение описанного выше конструкта в системе экспрессии для экспрессии специфично связывающего элемента или полипептида, описанных выше. Другие способы включают конъюгирование или связывание описанного в настоящей заявке специ- 14013537 фично связывающего элемента с детектируемой меткой или противораковым агентом. Подходящие метки и агенты описаны выше. Метки и агенты можно конъюгировать со специфично связывающим элементом, применяя стандартные химические средства. Ниже некоторые аспекты и способы реализации настоящего изобретения будут проиллюстрированы посредством примеров со ссылками на следующие эксперименты. В свете настоящего описания для специалиста в данной области будут очевидны разнообразные дальнейшие аспекты и способы реализации настоящего изобретения. Все документы, упомянутые в данном описании, полностью включены в него путем ссылки. Настоящее изобретение охватывает все до единой комбинации и подкомбинации описанных выше признаков. Ниже некоторые аспекты и способы реализации настоящего изобретения будут проиллюстрированы посредством примеров со ссылками на описанные фигуры и таблицу. Фиг. 1 - схематическое изображение малой (А) и "большой" (В) изоформ тенасцина-С. Некоторые домены, подобные фибронектину III типа, подвергаются альтернативному сплайсингу, в результате которого они либо включаются (В), либо не включаются (А) в молекулу. Фиг. 2 - биораспределение антитела 4A1-F16-SIP у мышей nude с ксенотрансплантатом опухолиU87. (А) Цифры представляют средний процент от введенной путем инъекции дозы на грамм ткани в группе из трех мышей, через 3 (выше) и 6 (ниже) ч после инъекции. "Усы" обозначают стандартное отклонение. Фиг. 3 - биораспределение антитела 4A1-F16-SIP в безтимусных мышах (nude), несущих ксенотрансплантат опухоли U87. (А) Цифры представляют средний процент от введенной путем инъекции дозы на грамм ткани в группе из трех мышей, через 24 (выше) и 48 (ниже) ч после инъекции. "Усы" обозначают стандартное отклонение. Фиг. 4 - альтернативное представление данных о биораспределении, показанных на фиг. 2 и 3. Фиг. 5 - биораспределение SIP(P12). Мышам с подкожным ксенотрансплантатом опухоли - глиобластомы человека U87, вводили путем инъекции 3,5 мкг SIP(P12). Каждая временная точка представлена четырьмя животными. Пример 1. Ген, кодирующий домен А 1 тенасцина-С человека клонировали посредством ПЦР в реальном времени с мРНК, выделенной из нормальных фибробластов кожи (NHDF), которые культивировали при рН 7,5 в отсутствие сыворотки с использованием олигонуклеотидов TnC-AI BamHI ba(cgggatcctccactgaacaagcccctgag) и TnC-AI BgIII для (ggagatctttcccctgtggaggcctcagc) [16]. Затем этот ген клонировали в бактериальный вектор экспрессии pQE12 (Qiagen) и экспрессировали в E.coli TG-1. Очистку проводили посредством His-метки на Ni-нитрилацетат-сефарозе (смола, нагруженная никелем(Qiagen. Перед селекцией очищенный домен А 1 биотинилировали, сульфо-NHS-SS-биотином (Pierce). Биопэннинг (Biopanning) проводили, как описано в (Viti F., et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505). Вкратце, биотинилированный белок (конечная концентрация 10-7 М) инкубировали с 600 мкл предварительного блокированного фага библиотеки ЕТН-2 в течение 30 мин. Затем связанные фаги фиксировали путем добавления 5,3107 покрытых стрептавидином магнитных гранул (Dynal). После тщательной промывки отобранный фаг элюировали путем восстановления дисульфидной связи в биотиновом линкере. Выделенный фаг амплифицировали в TG-1 и концентрировали из надосадочной жидкости путем осаждения полиэтиленгликолем. После трех раундов пэннинга проводили скрининг 144 выделенных клонов путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), выполняемого, как описано в Viti F., et al. MethodsEnzymol 2000; 326:480-505. Покрытые стрептавидином планшеты для ИФА (StreptaWell High Bind, Roche) инкубировали с биотинилированным антигеном, добавляли надосадочную жидкость колоний индуцированной моноклональной E.coli TG-1, экспрессирующей фрагменты антитела scFv, и детектировали связанное антитело моноклональным антителом М 2 и конъюгатом антимышиного иммуноглобулина G с пероксидазой хрена(IgG - HRP). Клоны антитела с самыми высокими уровнями сигнала исследовали посредством анализа взаимодействия в реальном времени на приборе BIAcore 3000. Три самых лучших клона очищали на колонке, загруженной сефарозой с белком А и исследовали способами иммуногистохимии на криосрезах различных опухолей. Один из клонов, который продемонстрировал селективный характер окрашивания в иммуногистохимическом исследовании, scFv (3A1-D5), выбрали для созревания аффинности. Библиотеку созревания аффинности конструировали в фагмидном векторе, pDN322 (Pini A. et al. J Biol Chem 1998; 273:2176921776) путем введения случайных мутаций в позициях 31-33 в пределах гипервариабельного участка 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH CDR1), используя олигонуклеотиды ПЦР LMB3 long ba (caggaaacagctatgaccatgattac, праймирующие в направлении, обратном транскрипции от 5'-конца гена антитела) и DP4 7CDRImut for (agcctggcggacccagctcgcmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc). 3'-Конец гена антитела амплифицировали,используя праймеры(gagctgggtccgccaggctcc) и fdseq long for (gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg). Два фрагмента объединяли путем- 15013537 ПЦР с использованием праймеров LMB3 long ba и fdseq long for. Проводили биопэннинг библиотеки созревания аффинности с биотинилированным антигеном. После двух раундов пэннинга (как описано выше, но используя 10-8M биотинилированного антигена), проводили скрининг всех 382 клонов антитела путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). 69 клонов, которые в анализе ELISA были положительными, исследовали далее посредством твердофазного ИФА с М 2 (M2-ELISA, Scheuermann J. et al. J Immunol Methods 2003; 276:129-134), чтобы определить значения koff отдельных клонов антител. Вкратце, надосадочную жидкость, содержащую антителаscFv, наносили на поверхность, покрытую моноклональным антителом anti-Flag M2 (SIGMA). После добавления биотинилированного антигена и инкубирования до достижения равновесия добавляли избыток небиотинилированного антигена в качестве конкурента. После конкурирования в течение 0, 30, 60, 90 и 120 мин соответственно детектировали оставшуюся часть биотинилированного антигена, используя конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена. Для ранжирования различных положительных по результатам ИФА клонов на основе профиля диссоциации применяли BIAcore. Для очистки на колонке с покрытой антигеном сефарозой отобрали пять лучших клонов. Очищенные антитела подвергали гель-хроматографии, и полученные в результате фракции мономерныых фрагментов антител scFv применяли для определения констант аффинности и параметров кинетики на приборе BIAcore 3000. Антитело с лучшей константой диссоциации (KD), 4A1-F16, клонировали в формат бивалентного миниантитела, присоединяя способами генной инженерии последовательность scFv(4A1-F16) перед 5 концом гена, кодирующего домен СН 4 иммуноглобулина Е человека, в результате чего получали маленький иммунный белок (SIP) (Borsi L. et al. Jnt. J. Cancer 2002, 102:75-85), названный 4A1-F16-SIP. Домен СН 4 стимулирует гомодимеризацию, увеличивая функциональную аффинность антитела благодаря более высокой авидности. Проводили иммуногистохимический анализ с фрагментом антитела scFv(3A1-D5) против домена А 1 тенасцина-С на тканях рака головы и шеи. Первичное антитело детектировали посредством пептидной FLAG-метки, присоединенной к С-концу антитела scFv, используя моноклональное анти-FLAG антитело М 2 (SIGMA), после чего применяли систему АРААР (комплекс щелочная фосфатазаантищелочная фосфатаза, DAKO). Обнаружили, что scFv(3A1-D5) и scFv(4A1-F16) сильно окрашивали строму опухоли и неоваскулярные структуры на криосрезах различных типов рака головы и шеи, в то время как с нормальной слизью рта, полученной от здорового донора, они не реагировали. Способность 4A1-F16-SIP нацеливаться на опухоль оценивали следующим образом. Стимулировали образование опухолей у мышей Balb/C nu/nu путем подкожной инъекции 3106 клеток глиобластомы человека U87 (американская коллекция стандартных культур АТСС) на мышь. Через 20-25 дней после инъекции, когда размер опухоли достигал 300-1500 мм 3, путем инъекции водили антитело с радиоактивной меткой. Приготовление антитела включало последующую очистку аффинно-очищенного антитела 4A1-F16SIP путем гель-хроматографии на колонке с superdex 75. Собирали фракцию, представляющую гомодимерную форму (75 КДа), а затем метили ее йодом-125 (Amersham), используя "йодоген" (iodogen, Pierce). Мышам с опухолями вводили приблизительно 5 мкг антитела в хвостовую вену. Через 3, 6, 24 и 48 ч соответственно умерщвляли трех мышей, вырезали органы и определяли накопление I-125 в гаммасчетчике. Пример 2. Ген, кодирующий домен С тенасцина-С человека, клонировали в вектор pQE12 (Qiagen) [Carnemolla В. et al. Am J Pathol 1999; 154:1345-1352, Balza E. et al. FEBS Lett 1993; 332:39-43] и экспрессировали вE.coli TG-1. Очистку проводили посредством His-метки на Ni-нитрилацетат-сефарозе (смола, нагруженная никелем (Qiagen. Перед селекцией очищенный домен С биотинилировали сульфо-NHS-SS-биотином (Pierce). Биопэннинг проводили, как описано в (Viti F., et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505), но применяя модифицированную процедуру пэннинга на покрытых стрептавидином и авидином планшетах. Вкратце, биотинилированный белок (конечная концентрация 10-7 М) инкубировали с 600 мкл предварительного блокированного фага библиотеки ЕТН-2 в течение 30 мин. Затем связанные фаги фиксировали на пластиковых микротитрационных планшетах, покрытых авидином (1 и 3 раунды пэннинга) или стрептавидина (2 раунд пэннинга). После тщательной промывки отобранный фаг элюировали путем восстановления дисульфидной связи в биотиновом линкере. Выделенный фаг амплифицировали в TG-1 и концентрировали из надосадочной жидкости путем осаждения полиэтиленгликолем. После трех раундов пэннинга проводили скрининг нескольких дюжин выделенных клонов путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), выполняемого, как описано в [Viti F., et al. Methods Enzymol 2000; 326:480-505]. Покрытые стрептавидином планшеты для твердофазного иммуноферментного анализа (StreptaWellHigh Bind, Roche) инкубировали с биотинилированным антителом, добавляли надосадочную жидкость колоний индуцированной моноклональной E.coli TG-1, экспрессирующей фрагменты антитела scFv и детектировали связанное антитело при помощи антитела против пептидной метки и затем конъюгатом- 16013537 иммуноглобулина G мыши с пероксидазой хрена (IgG - HRP). Клоны антитела с самыми высокими уровнями сигнала исследовали путем анализа взаимодействия в реальном времени на приборе BIAcore 3000. Три самых лучших клона очищали на колонке, загруженной сефарозой с белком А, и исследовали способами иммуногистохимии на криосрезах различных опухолей. Один из клонов, который продемонстрировал селективный характер окрашивания в иммуногистохимическом исследовании, scFv (A12), отобрали для созревания аффинности. Библиотеку созревания аффинности конструировали в фагмидном векторе pHEN1 [Hoogenboom H.R. et al. Nucleic Acids Res 1991; 19:4133-4137], путем введения случайных мутаций в позициях 31-33 гипервариабельного участка 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH CDR1) и в позициях 52, 52 а, 53 и 56 гипервариабельного участка 2 вариабельной области тяжелой цепи (VH CDR2), используя олигонуклеотиды ПЦР LMB3 long ba(gcccttcacggagtctgcgtagtatgtmnnaccaccmnnmnnmnnaatagctgagacccactcc), DP47CDR2 ba (acatactacgcagactccgtgaagggc) и fdseq long для (gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg). Проводили биопэннинг библиотеки созревания аффинности с биотинилированным антигеном. После двух раундов пэннинга (как описано выше), проводили скрининг всех 382 клонов антитела путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Клоны, которые в анализе ELISA были положительными, исследовали далее на приборе BIAcore, чтобы ранжировать положительные согласно ИФА клоны на основании профиля диссоциации. Из исследованных клонов наиболее обнадеживающие свойства продемонстрировал scFv(E10). Проводили иммуногистохимический анализ с фрагментом антитела scFv (А 12) против домена С тенасцина-С на разнообразных тканях глиобластомы человека. Первичное антитело детектировали посредством пептидной myc-метки, которую присоединяли к С-концу антитела scFv, используя моноклональное антитело против метки myc Е 10, после чего применяли систему АРААР (комплекс щелочная фосфатаза-антищелочная фосфатаза, DAKO). Обнаружили, что эти антитела специфическим образом реагируют с переваскулярными структурами, что демонстрирует иммуногистохимическое исследование на криосрезах глиобластомы. Пример 3. Используя протокол, аналогичный описанному в примере 2, выделили другие scFv против домена С тенасцина-С, которые обозначили F4 и G11 соответственно. Вариабельные области легкой цепи F4 и G11 различаются двумя аминокислотами, а вариабельные области тяжелой цепи совпадают. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединяли пептидным линкером, имеющим последовательность аминокислот, показанную в SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39, которую кодирует SEQ ID NO: 36 или SEQ IDNO: 38 соответственно. Пример 4. Ген, кодирующий домен D тенасцина-С человека (TnC-D), клонировали путем ПЦР в реальном времени с тотальной РНК, выделенной из линии меланомы человека SKMel-28 с использованием олигонуклеотидов для ПЦР TnC-D BamHI ba (cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - SEQ ID NO: 72) и TnC-D BgIII для(cgggatccgttacagaagccgaaccggaa - SEQ ID NO: 73) [16]. Амплифицированный фрагмент субклонировали в бактериальный вектор экспрессии pQE12, который встраивал His-метку на С-конце белка. Ген, кодирующий изоформу ТпС-А 1 мыши, выделяли путем ПЦР из клона метки экспрессируемой последовательности (EST), полученного из ткани инфильтрующей карциномы протока, с использованием праймеров mmTnC-AI EcoBa (agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc - SEQ ID NO: 74) и mmTnC-AI BglFo (tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc - SEQ ID NO: 75), и клонировали в вектор pQE12 (Qiagen). Библиотеку ЕТН-2 [26] подвергали процедуре пэннинга с 100 нМ биотинилированного TnC-D человека, и связанный фаг фиксировали на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. После трех раундов пэннинга надосадочные жидкости, полученные от 188 отдельных клонов, подвергали скринингу путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на биотинилированном TnC-D человека и на биотинилированном TnC-D мыши. Большинство клонов, которые распознавали изоформу TnC-D человека, реагировали также с изоформой TnC-D мыши. Надосадочные жидкости положительных по результатам твердофазного ИФА клонов исследовали во втором твердофазном иммуноферментном анализе и подвергали скринингу на приборе BIAcore. Шесть лучших клонов тщательно исследовали и определили, что лучшим клоном является scFv(F4).scFv(F4) в твердофазном иммуноферментном анализе распознавал исключительно белки, которые содержат домен D, и не реагировал с белками, которые близки к домену D по структуре. Однако в иммуногистохимическом анализе он лишь слабо реагировал со структурами опухолей, порождая сигналы,которые было трудно отличить от фона. Причиной этого предположительно является низкая аффинностьScFv(F4) применяли в качестве матрицы для созревания аффинности путем мутагенеза гипервариа- 17013537 бельных участков [26]. Для рандомизации выбрали остатки в положениях 30, 31, 32 гипервариабельного участка 1 вариабельной области легкой цепи и в положениях 50, 52 и 53 гипервариабельного участка 2 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация согласно Kabat; [30]). Библиотеку клонировали в фагмидный вектор pHEN, который присоединяет метку myc к С-концу вариабельной области легкой цепи[31]. Первый раунд пэннинга с фагом библиотеки созревания аффинности проводили с биотинилированным TnC-D человека, второй раунд - с биотинилированным TnC-D мыши. 750 клонов подвергли скринингу в твердофазном иммуноферментном анализе на биотинилированном TnC-D человека, из них приблизительно 5% были положительными. После дальнейшего исследования антител на приборе BIAcore и способом твердофазного иммуноферментного анализа scFv(D11) идентифицировали как лучший клон. Измерения аффинности с мономерными фракциями на приборе BIAcore показали, что аффинностьscFv(D11) в два-четыре раза выше, чем аффинность родительского клона scFv(F4). scFv(D11) связывал изоформу тенасцина мыши с несколько более высокой аффинностью, чем изоформу тенасцина человека.scFv(D11) дал хорошие результаты в иммуногистохимическом анализе на различных опухолевых тканях. scFv(D11) окрашивал плоскоклеточную карциному рта человека, карциному мочевого пузыря человека и меланому А 375 человека, выращенные в мышах nude, а также тератокарциному F9 мыши,выращенную в мышах SvEv 129. Это антитело хорошо реагировало со стромой опухолей человека, таких как рак головы и шеи и карцинома мочевого пузыря, а также с различными моделями опухолей мышей и человека. Затем мы рандомизировали остатки в CDR1 и CDR1 вариабельной области тяжелой цепиscFv(D11). Для рандомизации мы выбрали остатки 31, 32, 33 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи и 52, 52 а, 53 и 56 в CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация по Kabat; [32]). Провели два раунда селекции способом фагового дисплея, используя 10-8 М TnC-D человека в качестве антигена. Чтобы повысить точность отбора, перед добавлением антигена в первом раунде смешивали 10 нМ очищенного растворимого scFv(D11) с фагом, а во втором раунде пэннинга к предварительно инкубированной смеси антиген-фаг добавляли 1000-кратный избыток небиотинилированного антигена. Скрининг способом твердофазного иммуноферментного анализа после двух раундов показал, что 25% из 384 клонов положительны по отношению к биотинилированному TnC-D человека. После дальнейшего исследования scFv(P12) идентифицировали как лучший клон. Его аффинность к TnC-D человека увеличилась с коэффициентом 4,8 по сравнению с scFv(D11).(P12) in vivo оценивали в экспериментах по биораспределению с мышами nude, несущими ксеноктрансплантат глиобластомы человека U87. Антитела SIP, меченые 125I, вводили путем внутривенной инъекции и через 3, 6, 24 и 48 ч животных забивали, вырезали органы, взвешивали их и измеряли радиоактивность. Из большинства органов SIP(P12) выводился в пределах 24 ч после инъекции, а через 24 и 48 ч наблюдали специфическое накопление в опухолях с отношением опухоль/кровь, достигающим 15 (фиг. 5 и таблица). Биораспределение меченого радиацией P12-SIP в мышах nude с опухолью Результаты выражены в процентах от дозы введенного путем инъекции антитела на грамм опухолиSEQ ID NO: 1. Последовательность нуклеотидов вариабельной области тяжелой цепи 4A1-F16SEQ ID NO: 2. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 4A1-F16SEQ ID NO: 3. Последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи 4A1-F16 и 3A1D5SEQ ID NO: 4. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи 4A1-F16 и 3A1D5 VLSEQ ID NO: 5. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи 4A1F16SEQ ID NO: 6. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепи 4A1F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 7. Последовательность аминокислот CDR3 вариабельной области тяжелой цепи 4A1F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 8. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области легкой цепи 4A1-F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 9. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области легкой цепи 4A1-F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 10. Последовательность аминокислот CDR3 вариабельной области легкой цепи 4A1F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 11. Последовательность нуклеотидов вариабельной области тяжелой цепи 3 А 1-D5SEQ ID NO: 12. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 3A1-D5SEQ ID NO: 13. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи 3A1-D5SEQ ID NO: 14. Последовательность нуклеотидов вариабельной области тяжелой цепи Е 10SEQ ID NO: 15. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи Е 10SEQ ID NO: 16. Последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 17. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 18. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи F10,F4 и G11SEQ ID NO: 19. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепи Е 10,F4 и G11SEQ ID NO: 20. Последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи Е 10, А 12, F4 и G11SEQ ID NO: 21. Последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 22. Последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи E10, A12 и G11SEQ ID NO: 23. Последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 24. Последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи А 12SEQ ID NO: 25. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи А 12SEQ ID NO: 26. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи А 12SEQ ID NO: 27. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепи А 12SEQ ID NO: 28. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11SEQ ID NO: 29. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11SEQ ID NO: 30. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи F4SEQ ID NO: 31. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи F4SEQ ID NO: 32. Последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи F4 и G11SEQ ID NO: 33. Последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи F4SEQ ID NO: 34. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи G11SEQ ID NO: 35. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи G11SEQ ID NO: 36. Последовательность нуклеиновой кислоты пептидного линкераSEQ ID NO: 37. Последовательность аминокислот пептидного линкераSEQ ID NO: 38. Последовательность нуклеиновой кислоты пептидного линкераSEQ ID NO: 39. Последовательность аминокислот пептидного линкераSEQ ID NO: 40. Последовательность нуклеиновой кислоты пептидного линкераSEQ ID NO: 41. Последовательность аминокислот пептидного линкераSEQ ID NO: 42. Последовательность аминокислот пептидного линкераSEQ ID NO: 43. Последовательность аминокислот пептидного линкераSEQ ID NO: 44. Новая последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи F4 и G11SEQ ID NO: 45. Новая последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи F4 иSEQ ID NO: 46. Новая последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи G11SEQ ID NO: 47. Новая последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи G11SEQ ID NO: 48. Новая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Е 10SEQ ID NO: 49. Новая последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи 4A1-F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 50. Новая последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи 4A1F16 и 3A1-D5SEQ ID NO: 51. Новая последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи P12SEQ ID NO: 52. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи Р 12SEQ ID NO: 53. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи Р 12 иSEQ ID NO: 54. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи Р 12 и D11SEQ ID NO: 55. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепиSEQ ID NO: 56. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи D11 VHSEQ ID NO: 57. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи F4SSEQ ID NO: 58. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи F4SSEQ ID NO: 59. Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи F4SSEQ ID NO: 60. Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи F4SSEQ ID NO: 61. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи Р 12SEQ ID NO: 62. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области тяжелой цепи D11 иSEQ ID NO: 63. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепиSEQ ID NO: 64. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепи D11SEQ ID NO: 65. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области тяжелой цепи F4SSEQ ID NO: 66. Последовательность аминокислот CDR3 вариабельной области тяжелой цепи Р 12,D11 и F4SSEQ ID NO: 67. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области легкой цепи Р 12 иSEQ ID NO: 68. Последовательность аминокислот CDR1 вариабельной области легкой цепи F4SSEQ ID NO: 69. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области легкой цепи Р 12 иSEQ ID NO: 70. Последовательность аминокислот CDR2 вариабельной области легкой цепи F4SSEQ ID NO: 71. Последовательность аминокислот CDR3 вариабельной области легкой цепи Р 12,D11 и F4SSEQ ID NO: 72. Олигонуклеотидный праймер для ПЦР TnC-D BamHI baSEQ ID NO: 73. Олигонуклеотидный праймер для ПЦР TnC-D BgIII foxSEQ ID NO: 74. Олигонуклеотидный праймер для ПЦР mmTnC-AI EcoBaSEQ ID NO: 75. Олигонуклеотидный праймер для ПЦР mmTnC-AI BglFoSEQ ID NO: 80. Новая последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 81. Новая последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи Е 10 и А 12SEQ ID NO: 82. Новая последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области F4 VLSEQ ID NO: 83. Последовательность аминокислот новой вариабельной области легкой цепи F4