Генетические варианты гена tcf7l2 как диагностические маркеры риска возникновения сахарного диабета ii типа

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ГЕНА TCF7L2 КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА II ТИПА С помощью ассоциативного анализа продемонстрировано, что полиморфизм гена TCF7L2 определяет восприимчивость к диабету II типа. Приведены способы диагностики восприимчивости к диабету, пониженной восприимчивости к диабету и защиты против диабета, а также способы лечения диабета II типа. 016397 Уровень техники изобретения Сахарный диабет - заболевание, связанное с нарушением метаболизма, при котором снижается утилизация углеводов и усиливается утилизация липидов и белков, возникает вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина. В более тяжелых случаях диабет характеризуется хронической гипергликемией, глюкозурией, потерей воды и электролитов, кетоацидозом и комой. Долговременные осложнения включают развитие нейропатии, ретинопатии, нефропатии, генерализованных дегенеративных изменений в крупных и малых кровеносных сосудах и повышенную чувствительность к инфекциям. Наиболее общей формой диабета является диабет II типа, независимый от инсулина диабет, который характеризуется гипергликемией, обусловленной нарушенной секреций инсулина и резистентностью к инсулину тканей-мишеней. В развитие заболевания вносят вклад генетические факторы и влияние окружающей среды. Например, в развитии заболевания важную роль играет тучность. Диабет II типа часто является мягкой формой постепенного начала сахарного диабета. Последствия диабета II типа для здоровья являются огромными. В 1995 г. в мире было 135 миллионов людей с диабетом. Подсчитано, что в 2025 г. около 300 миллионов людей будут больны диабетом(King H., et al., Diabetes care, 21(9): 1414-1431 (1998. Распространенность диабета II типа в популяции взрослых жителей Исландии составляет 2,5% (Vilbergsson, S., et al., Diabet. Med., 14(6): 491-498 (1997,что включает приблизительно 5000 людей в возрасте выше 34 лет, которые больны этим заболеванием. Высокая распространенность заболевания и увеличивающаяся популяция больных свидетельствуют о неудовлетворенной потребности в определении генетических факторов, участвующих в развитии диабета II типа, для более точного определения ассоциированных факторов риска. Нужны также терапевтические агенты для предотвращения развития диабета II типа. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение относится к способам диагностики повышенной восприимчивости к диабету II типа, а также к способам диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа или диагностики действия защиты против диабета II типа путем выявления определенных маркеров или гаплотипов,относящихся к гену TCF7L2 (фактор транскрипции 2, подобный 7 (специфический по отношению кHMG-боксу Т-клеток), предварительно названный как TCF4 ген (транскрипционный фактор 4 Т-клеток). Способы включают определение генетического маркера, ассоциированного с блоком LD (нарушение равновесия сцепления) экзона 4 гена TCF7L2. В первом аспекте изобретение относится к способу диагностики восприимчивости индивидуума к диабету II типа, включающему анализ образца нуклеиновой кислоты, полученного из индивидуума для определения признака или гаплотипа, ассоциированного с блоком LD экзона 4 гена TCF7L2, где присутствие признака или гаплотипа является индикатором восприимчивости к диабету II типа. В одном воплощении признак или гаплотип включает по меньшей мере один признак, выбранный из группы признаков, перечисленных в табл. 6. В другом воплощении признак или гаплотип является маркером. В одном предпочтительном воплощении маркер или гаплотип является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В одном воплощении повышенная восприимчивость характеризуется относительным риском по меньшей мере 1,2, включая относительный риск по меньшей мере 1,3 и относительный риск по меньшей мере 1,4. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей изDG10S478, rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326 и rs4506565, где присутствие не нуль-0 аллеля (т.е. -4, 4, 8, 12, 16, 20 или другого не-0 аллеля) в DG10S478, Т аллеля вrs12255372; А аллеля в rs7895340; С аллеля в rs11196205; С аллеля в rs7901695; Т аллеля в rs7903146; С аллеля в rs4506565 или Т аллеля в rs4506565 является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В предпочтительном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей изDG10S478 и rs7903146, и где присутствие не ноль-0 аллеля является маркером повышенной восприимчивости к диабету II типа. Еще в одном предпочтительном воплощении маркером является rs7903146, где присутствие Т аллеля в rs7903146 является индикатором восприимчивости к диабету II типа. В другом предпочтительном воплощении маркер или гаплотип является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. Пониженная восприимчивость в одном воплощении характеризует относительный риск менее чем 0,7. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей изDG10S478, rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326 и rs4506565, где присутствие 0 аллеля в DG10S478, G аллеля в SNP rs12255372, G аллеля в rs7895340; T аллеля в rs7901695; С аллеля в rs7903146; T аллеля в rs12243326 или А аллеля в rs4506565 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. В предпочтительном воплощении маркером является DG10S478, где присутствие 0 аллеля в DG10S478 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. В другом предпочтительном воплощении маркером является rs7903146, где присутствие С аллеля вrs7903146 является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к набору реактивов для анализа образца из индивидуума с целью определения восприимчивости к диабету II типа, где набор реактивов включает один или более реагентов для обнаружения одного или более маркеров, ассоциированных с LD экзона 4,блок TCF7L2. В одном воплощении один или более реагентов включает по меньшей мере одну прилегающую нуклеотидную последовательность, которая полностью комплементарна области, включающей-1 016397 по меньшей мере один маркер, ассоциированный с LD экзона 4, блок TCF7L2. В одном воплощении один маркер выбран из группы, состоящей из DG10S478, rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695,rs7903146, rs12243326 и rs4506565. В предпочтительном воплощении маркер является С аллелем вrs7903146. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа индивидуума для определения вероятности ответа на терапевтический агент TCF7L2, включающему определение маркера, ассоциированного с LD экзона 4, блок TCF7L2, где присутствие маркера является индикатором вероятности позитивного ответа на терапевтический агент TCF7L2. В одном воплощении маркер выбирается из группы, состоящей из DG10S478, rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326 иrs4506565. В другом воплощении маркер является маркером DG10S478 или маркером rs7903146, где присутствие не-0 аллеля в DG10S478 или Т аллеля в rs7903146 является индикатором вероятности позитивного ответа на терапевтический агент TCF7L2. Другой аспект изобретения относится к применению терапевтического агента TCF7L2 для производства медикамента для лечения диабета II типа. В одном воплощении терапевтический агент TCF7L2 является агентом, который изменяет активность сигнального пути Wnt или кадгеринового сигнального пути. В другом воплощении терапевтический агент TCF7L2 является агентом, выбранным из группы,указанной выше в таблице агентов. Краткое описание чертежей Вышеупомянутые и другие объекты, особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего более детального описания предпочтительных воплощений изобретения. Фигура описывает интересующую область TCF7L2 по отношению к нарушению равновесия сцепления (LD) SNP в проекте НарМар, версия 16. Участки гена в 215,9 т.п.о. семи LD блоков, которые указаны схематично черными стрелками (на основе данных NCBI RefSeq), показывают направление транскрипции; указаны экзоны с выделенным экзоном 4. DG10S478 расположен в 114,46 м.п.о. на хромосоме 10 (NCBI конструкция 34) в интроне 3 гена TCF7L2, с 74,9 т.п.о. блоком, который включает часть интрона 3, весь экзон 4 и часть интрона 4 (здесь называется "блок экзона 4 TCF7L2"). Маркеры SNP размещены равноудалено, а не в соответствии с их физическим расположением. На фигуре показаны два параметра LD: D' (верхняя левая часть фигуры) и r2 (нижняя правая часть). Осуществление изобретения Описание предпочтительных воплощений изобретения даны ниже. Локусы, ассоциированные с диабетом II типа. Диабет II типа характеризуется гипергликемией, которая может возникать благодаря таким механизмам, как пониженная секреция инсулина, резистентность к инсулину периферических тканей и повышенная продукция глюкозы печенью. Большинство пациентов с диабетом II типа страдают от серьезных осложнений хронической гипергликемии, включая нефропатию, нейропатию, ретинопатию и ускоренное развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Распространенность диабета II типа в мире в настоящее время составляет 6%, но предсказывается увеличение этого параметра в течение следующего десятилетия (1). Это увеличение распространенности диабета II типа является следствием увеличения возраста популяции и роста тучности. Имеются свидетельства о вкладе генетического компонента в риск возникновения диабета II типа,включая влияние различий между группами различных рас (2, 3), более высокий уровень согласованности между моногомозиготными, чем между дизиготными близнецами (4, 5), и относительный риск появления диабета II типа у братьев и сестер (s) в европейской популяции, составляющий приблизительно 3,5 (6). Таким образом, для поиска генов, ассоциированных с диабетом II типа, было применено два подхода. Для выявления ассоциации с заболеванием в пределах генов-кандидатов тестировали единичный нуклеотидный полиморфизм (SNP), и в основном он не дал или дал лишь умеренный риск диабета II типа, о котором наиболее широко сообщалось, что он характеризуется защитным Pro-12-Ala полиморфизмом в активированного пролифератором пероксисом рецептором гамма гена (PPARG2) (7), и риск полиморфизма в калиевом канале, регулируемом изнутри, подсемейство J, член 11 гена (KIR6,2) (8). Сканирование связей во множестве геномов семейств с общей формой диабета II типа выявило несколько локусов, и первично международный исследовательский консорциум сфокусировался на хромосомах 1, 12 и 20, наблюдаемых во многих популяциях (6). Гены этих локусов до этого не рассматривались. Однако у мексиканских американцев ген кальпаина 10 (CAPN10) был изолирован из локуса хромосомы 2q; это отражало единственный ген для общей формы диабета II, идентифицированный до настоящего времени благодаря позиционному клонированию (9). Редкая Менделева форма диабета II, а именно диабет зрелого возраста у молодых (MODY), дала при позиционном клонировании семь генов (6). Предварительно авторы изобретения сообщали о существенной связи диабета II типа с хромосомой 5q для исландской популяции для множества геномов (10); в том же исследовании также сообщали о предположительном доказательстве связи с 10q и 12q. Связь с 10q областью наблюдалась также для мексиканских американцев (11).-2 016397 Ассоциация диабета II типа с геном белка 2. подобного транскрипционному фактору 7 (TCF7L2). Настоящее изобретение относится к идентификации ассоциированного с диабетом II типа блока("LD блок экзона 4 TCF7L2) в пределах гена, кодирующего транскрипционный фактор 4 (TCF4 - официальный символ гена TCF7L2). Было обнаружено, что с диабетом II типа ассоциировано несколько маркеров в пределах LD экзона 4 блока TCF7L2, включая микросателлитные маркеры DG10S478 и SNP(Р=1,310-9; относительный риск=1,45; риск, отнесенный к популяции=22,7%), были впоследствии подтверждены на датской популяции больных диабетом II типа и на популяции белых, больных диабетом, в Соединенных Штатах Америки. DG10S478 находится в интроне 3 гена TCF7L2 в 10q25,2 и в пределах хорошо определенного LD блока размером 74,9 т.п.о., который включает часть интрона 3, весь экзон 4 и часть интрона 4. Продукт гена TCF7L2 представляет собой высокомобильную группу (HMG) включающего бокс транскрипционного фактора, который играет важную роль в Wnt сигнальном пути, известном также как сигнальный путь АРС 3/-катенин/TCF путь. TCF7L2 опосредует специфическую для клеток регуляцию экспрессии гена проглюкагона (ключевого игрока в гомеостазе глюкозы в крови) через участника Wnt сигнального каскада -катенина и киназу-3-бета гликогенсинтазы (12). Кроме того, сигнальный путь Wnt поддерживает преадипоциты в недифференцированном состоянии за счет ингибирования белка альфа (С/ЕВР-альфа), связывающегося с энхансером ССАААТ адипогенных факторов транскрипции и активированного пролифератором пероксисом рецептора гамма (PPAR-гамма) (13). Когда Wnt сигнальный путь в преадипоцитах предотвращается за счет суперэкспрессии доминантно-негативного TCF7L2,эти клетки дифференцируют в адипоциты (13). Кроме того, сообщалось, что сигнальный каскад Wnt/катенин направлен на PPAR-гамма активность путем физического взаимодействия с -катенином иTCF7L2 в клетках рака кишечника (14). Мультифункциональный белок -катенин важен также для обеспечения клеточной адгезии через его связывание с кадгеринами (15). В результате этого открытия в настоящее время доступны способы диагностики восприимчивости к диабету II типа, а также диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа и/или защиты против диабета II типа. В предпочтительных воплощениях изобретения диагностический анализ был применен для идентификации присутствия специфических аллелей, включая 0 аллель в маркере DG10S478(ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа, который является защитным против диабета II типа); не-0 аллеля (т.е. -4, 4, 8, 12, 16 или 20 или другой аллель) в маркере DG10S478 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); G аллель в SNP rs12255372 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабетаII типа): Т аллель в SNP rs12255372 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); G аллель в rs7895340 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); А аллель в SNP rs7895340 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); G аллель в SNP rs11196205 (ассоциированный с восприимчивостью к диабетуII типа); G аллель в rs7895340 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); С аллель в SNP rs1196205 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); Т аллель в rs7901695 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем, защищающим против диабета II типа); С аллель в SNP rs7901695 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); С аллель в SNPrs7903146 (ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа и являющийся аллелем,защищающим против диабета II типа); Т аллель в SNP rs7903146 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа); С аллель в SNP rs12243326 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа) и Т аллель в SNP rs4506565 (ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа). В дополнительных воплощениях изобретения для диагностики восприимчивости к диабету II типа или для идентификации аллеля, который защищает от диабета II типа, могут применяться другие маркеры или SNP, идентифицированные с применением способов, описанных здесь. Диагностические анализы, представленные ниже, могут применяться для идентификации присутствия или отсутствия этих специфических аллелей. Диагностические анализы. Нуклеиновые кислоты, зонды, праймеры и антитела, такие как описанные здесь, могут применяться в различных способах диагностики восприимчивости к диабету II типа, а также в наборах реактивов (например, полезных при диагностике восприимчивости к диабету II типа). Подобным образом, нуклеиновые кислоты, зонды, праймеры и антитела, описанные здесь, могут применяться в способах диагностики пониженной восприимчивости к диабету II типа, а также в способах диагностики защиты против диабетаII типа, а также в наборах реактивов. В одном аспекте набор реактивов включает праймеры, которые могут применяться для амплификации интересующих маркеров. В одном аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету типа II ставится путем детектирования полиморфизма нуклеиновой кислоты в TCF7L2, как описано здесь (например, аллелей в маркереDG10S478 или в SNP rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326, rs4506565). Полиморфизм может быть изменением в нуклеиновой кислоте TCF7L2, таким как вставка или деления единственного нуклеотида или более чем одного нуклеотида, приводящая к сдвигу рамки считывания;-3 016397 изменением по меньшей мере одного нуклеотида, приводящим к изменению кодируемой аминокислоты; изменением по меньшей мере одного нуклеотида, приводящим к генерации преждевременного стопкодона; делецией нескольких нуклеотидов, приводящей к делеции одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидами; вставкой одного или нескольких нуклеотидов, такой как неадекватная рекомбинация или конверсия гена, приводящая к прерыванию кодирующей последовательности гена; дупликацией всего или части гена; транспозицией всего или части гена или реаранжировкой всего или части гена. В единичном гене может быть представлено более чем одно такое изменение. Такие изменения последовательности вызывают различия в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой TCF7L2. Например, если различие представляет собой сдвиг рамки считывания, то сдвиг рамки приводит к изменению кодируемых аминокислот и/или может приводить к генерации преждевременного стоп-кодона, вызывая генерацию трункированного (укороченного) полипептида. Альтернативно, полиморфизм, ассоциированный с заболеванием или состоянием или восприимчивостью к заболеванию или состоянию,ассоциированный с нуклеиновой кислотой TCF7L2, может быть синонимичным изменением в одном или более нуклеотидах (т.е. изменением, которое не приводит к изменению в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой TCF7L2). Такой полиморфизм может изменять сайты сплайсинга, влиять на стабильность или транспорт мРНК или другим образом влиять на транскрипцию или трансляцию гена. Нуклеиновая кислота TCF7L2, которая имеет любое изменение или перестройки, описанные выше, называется здесь "измененная нуклеиновая кислота". В первом способе диагностики восприимчивости к диабету II типа могут применяться методы гибридизации, такие как саузерн анализ, нозерн анализ или гибридизации in situ (см. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds, John WileySons, включая все дополнения с 1999 года). Например,биологический образец ("тестируемый образец") из тестируемого субъекта ("тестируемый индивидуум") геномной ДНК, РНК или кДНК получают из индивидуума (для экзонных маркеров может применяться только РНК и кДНК), такого как индивидуум, подозреваемый в том, что он является восприимчивым к или предрасположенным к или несущим дефект диабета II типа. Индивидуум может быть взрослым, ребенком или плодом. Тестируемый образец может быть из любого источника, который включает геномную ДНК, таким как образец крови, образец амниотической жидкости, образец цереброспинальной жидкости или образец ткани из кожи, мышцы, буккальной слизистой или слизистой оболочки глаза, плацента, желудочно-кишечный тракт или другие органы. Тестируемый образец ДНК из фетальных клеток или ткани может быть получен подходящими способами, такими как амниоцентез или образцы ворсинок хориона. Затем образец ДНК, РНК или кДНК исследуется для определения того, имеется ли полиморфизм в нуклеиновой кислоте TCF7L2 и/или для определения, какой сплайсированный вариант(ы), кодируемыйTCF7L2, представлен в нем. Присутствие полиморфизма или сплайсированного варианта(ов) может быть показано гибридизацией гена геномной ДНК, РНК или кДНК с нуклеотидным зондом. "Нуклеотидный зонд", как это применяется здесь, может быть зонд ДНК или зонд РНК; нуклеотидный зонд может включать, к примеру, по меньшей мере один полиморфизм нуклеиновой кислоты TCF7L2 и/или включать нуклеиновую кислоту, кодирующую специфический сплайсированный вариант нуклеиновой кислотыTCF7L2. Зонд может быть любой молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше (например, ген или нуклеиновая кислота, фрагмент, вектор, включающий ген или нуклеиновую кислоту, зонд или праймер,и т.д). Для диагностики восприимчивости к диабету II типа образец для гибридизации может быть сформирован путем контакта нуклеиновой кислоты TCF7L2 по меньшей мере с одним нуклеотидным зондом. Предпочтительным зондом для детектирования мРНК или геномной ДНК является меченый нуклеотидный зонд, способный к гибридизации с последовательностями мРНК или геномной ДНК, описанными выше. Нуклеотидный зонд может быть, к примеру, молекулой нуклеиновой кислоты полной длины или ее частью, такой как олигонуклеотид, имеющий длину по меньшей мере в 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, и достаточный для специфической гибридизации в жестких условиях с подходящей мРНК или геномной ДНК. Зонды, подходящие для применения в диагностических анализах изобретения, описаны выше (см., к примеру, зонды и праймеры, обсуждавшиеся под названием "Нуклеиновые кислоты изобретения"). Образец для гибридизации поддерживается в условиях, которые достаточны для того, что позволить специфическую гибридизацию нуклеотидного зонда с нуклеиновой кислотой TCF7L2. "Специфическая гибридизация", как это применяется здесь, означает правильную гибридизацию (например, без несоответствий). Специфическая гибридизация может быть выполнена в очень жестких условиях или в умеренных условиях, например, как описано выше. В особенно предпочтительном аспекте условия гибридизации для специфической гибридизации являются очень жесткими. Специфическая гибридизация, если она присутствует, обнаруживается затем с применением стандартных способов. Если в тестируемом образце имеет место специфическая гибридизация между нуклеотидным зондом и нуклеиновой кислотой TCF7L2, то TCF7L2 имеет полиморфизм или является сплайсированным вариантом, который представлен в нуклеотидном зонде. Одновременно в этом способе может применяться более чем один нуклеотидный зонд. Специфическая гибридизация любого одного из нуклеотидных зондов является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2 или присут-4 016397 ствия определенного сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, и может быть диагностирована, как восприимчивость к диабету II типа или как пониженная восприимчивость к диабету II типа (или быть указанием на наличие защитного аллеля против диабета II типа). В нозерн анализе (см. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds, John WileySons, supra) применяются способы гибридизации, описанные выше, для идентификации присутствия полиморфизма или специфического сплайсированного варианта, ассоциированного с восприимчивостью к диабету II типа или ассоциированного с пониженной восприимчивостью к диабету II типа. Для нозерн анализа тестируемый образец ДНК получают из индивидуума подходящим способом. Специфическая гибридизация нуклеотидного зонда, как описано выше, с РНК из индивидуума является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2, присутствия специфического сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, и является, таким образом, диагностикой восприимчивости к диабету II типа или с пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или индикатором защитного аллеля против диабета II типа). Для репрезентативных примеров применения нуклеотидных зондов см., к примеру, патентыUS 5288611 и 4851330. Альтернативно, вместо нуклеотидного зонда в способах гибридизации, описанных выше, может применяться зонд из пептидонуклеиновой кислоты (PNA). PNA является имитатором ДНК, имеющим пептидоподобный неорганический скелет, такой как N-(2-аминоэтил)глициновые единицы с органическими основаниями (A, G, С, Т или U), прикрепленными к азоту глицина через метиленкарбонильный линкер (см., например, Nielsen, P.E. et al., Bioconjugate Chemistry 5, American Chemical Society, p.1(1994. Зонд PNA может быть сконструирован для специфической гибридизации с нуклеиновой кислотой TCF7L2. Гибридизация зонда PNA с нуклеиновой кислотой TCF7L2 может быть диагностикой восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатором защитного аллеля против диабета II типа). В другом способе изобретения может быть применен анализ изменения путем рестрикционного переваривания для обнаружения изменения в гене, если изменение (мутация) или полиморфизм в гене является результатом создания или элиминации рестрикционного сайта. Тестируемый образец, включающий геномную ДНК, получают из индивидуума. Для амплификации нуклеиновой кислоты TCF7L2 в тестируемом образце геномной ДНК из тестируемого индивидуума может быть применена полимеразная цепная реакция (ПЦР) (и, если необходимо, фланкирующие последовательности). RFLP анализ проводится, как описано (см. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds, John WileySons,supra). Профиль переваривания релевантного фрагмента ДНК указывает на присутствие или отсутствие изменения или полиморфизма нуклеиновой кислоты TCF7L2 и, таким образом, указывает на присутствие или отсутствие восприимчивости к диабету II типа или пониженную восприимчивость к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа). Для обнаружения специфического полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2 может быть также применен анализ последовательности. Тестируемый образец ДНК или РНК получают из тестируемого индивидуума. ПЦР или другие подходящие методы могут быть применены для амплификации гена или нуклеиновой кислоты и/или его фланкирующих последовательностей, если это желательно. Последовательность нуклеиновой кислоты TCF7L2 или фрагмента нуклеиновой кислоты, или фрагмента кДНК,или мРНК или фрагмента мРНК определяется с применением стандартных методов. Последовательность нуклеиновой кислоты TCF7L2 или фрагмента нуклеиновой кислоты, или фрагмента кДНК, или мРНК или фрагмента мРНК сравнивается с известной последовательностью нуклеиновой кислоты или гена,или кДНК, или мРНК, в зависимости от того, что является более подходящим. Присутствие полиморфизма в TCF7L2 показывает, что индивидуум обладает восприимчивостью к диабету II типа или пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа). Специфичные по отношению к аллелю олигонуклеотиды также могут применяться для выявления присутствия полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2 путем применения дот-блот гибридизации амплифицированных нуклеотидов со специфичными по отношению к аллелю олигонуклеотидными зондами (ASO) (см., например, Saiki, R. et al., Nature. 324:163-166 (1986. "Специфичные по отношению к аллелю олигонуклеотиды" (ASO) (называемые здесь также "специфичными по отношению к аллелю олигонуклеотидными зондами") представляют собой олигонуклеотиды с длиной приблизительно 10-15 пар оснований, предпочтительно приблизительно 15-30 пар оснований, которые специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой TCF7L2 и которые включают полиморфизм, ассоциированный с восприимчивостью к диабету II типа, или полиморфизм, ассоциированный с пониженной восприимчивостью к диабету II типа (или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа). С применением стандартных способов может быть получен ASO зонд, специфичный для определенного полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2 (см. Current Protocols in Molecular Biology, supra). Для идентификации полиморфизмов в гене, который ассоциирован с диабетом II типа, из индивидуума получают тестируемый образец ДНК. Для амплификации всей нуклеиновой кислоты TCF7L2 или ее фрагмента и ее фланкирующих последовательностей может быть применена ПЦР. ДНК, включающая амплифицированную-5 016397 нуклеиновую кислоту TCF7L2 или фрагмента гена или нуклеиновой кислоты, подвергается дотблоттингу с применением стандартных способов (см. Current Protocols in Molecular Biology, supra), и блот контактирует с олигонуклеотидным зондом. Затем детектируется наличие специфической гибридизации зонда с амплифицированной нуклеиновой кислотой TCF7L2. Гибридизация AOS с ДНК из индивидуума является индикатором полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2 и, таким образом, индикатором восприимчивости к диабету II типа или индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа(или указывает на наличие защитного аллеля против диабета II типа). Дополнительно изобретение обеспечивает AOS, которые гибридизуются с контрольным или различающимися аллелями гена или нуклеиновой кислоты, включающей единственный нуклеотидный полиморфизм, или к комплементарной ей молекуле. Эти нуклеотиды могут быть зондами или праймерами. Специфичный к аллелю праймер гибридизуется с участком на ДНК-мишени, перекрывающим полиморфизм, и только начинает амплификацию аллельной формы, к которой праймер демонстрирует совершенную комплементарность. См. Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448 (1989). Праймер применяется в соединении со вторым праймером, который гибридизуется в дистальном участке. Амплификация происходит с двух праймеров, приводя к получению детектируемого продукта, который указывает на присутствие определенной аллельной формы. Контроль обычно получают со второй парой праймеров, один из которых показывает единственное несоответствующее основание в полиморфном участке, а другой из них демонстрирует совершенную комплементарность с дистальным участком. Единственное несоответствующее основание предотвращает амплификацию, поэтому детектируемый продукт не образуется. Способ работает наилучшим образом, когда несоответствие включено в большинстве случаев в 3'-позицию олигонуклеотида, выровненного с полиморфизмом, поскольку эта позиция является наиболее дестабилизирующей для элонгации с праймера (см., например, WO 93/22456). С добавлением таких аналогов, как заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA), размер праймеров и зондов может быть редуцирован лишь до 8 оснований. LNA являются новым классом бициклических аналогов ДНК, в которых позиции 2' и 4' в фуранозном кольце соединены через О-метиленовую(окси-LNA) или аминометиленовую (амино-LNA) группировку. Общим для всех этих вариантов LNA является сродство к комплементарной нуклеиновой кислоте, которая общепризнанно является наиболее высоким из известных для аналогов ДНК. Например, было показано, что, в частности, все окси-LNA нонамеры имеют температуру плавления 64 ЕС и 74 ЕС, когда находятся в комплексе с комплементарной ДНК или РНК соответственно в отличие от 28 ЕС для ДНК и РНК соответствующих ДНК наномеров. Существенное увеличение температуры плавления получают также, когда LNA мономеры применяются в комбинации с мономерами стандартной ДНК или РНК. Для праймеров и зондов, в зависимости от того,где включены LNA мономеры (например, на 3'-конце, 5'-конце или посредине), температура плавления может быть значительно увеличена. В другом аспекте матрица олигонуклеотидной пробы, которая является комплементарной к последовательности сегментов нуклеиновой кислоты-мишени из индивидуума, может быть применена для идентификации полиморфизма в нуклеиновой кислоте TCF7L2. Например, в одном аспекте может применяться олигонуклеотидная матрица. Олигонуклеотидные матрицы обычно включают множество различных олигонуклеотидных зондов, которые сопряжены с поверхностью субстрата в различных известных местах. Эти олигонуклеотидные матрицы, известные также как "Genechips", были описаны, к примеру, в патенте US 5143854 и в патентных публикациях РСТ WO 90/15070 и 92/10092. Эти матрицы в основном могут быть получены с применением методов механического синтеза или направленного светом синтеза, который включает комбинацию фотолитографических методов и методов твердофазного синтеза олигонуклеотидов. См. Fodor et al., Science. 251:767-777 (1991), Pirrung et al., патент US 5143854(см. также заявку РСТ WO 90/15070 и Fodor et al., публикация РСТ WO 92/10092 и патент US 5424186,включенные сюда в их целостности путем ссылки). Методы синтеза этих матриц с применением методов механического синтеза описаны, к примеру, в патенте US 5384261,; включенном сюда в его целостности путем ссылки. В другом примере могут быть применены линейные матрицы. Как только олигонуклеотидная матрица приготовлена, интересующая нуклеиновая кислота гибридизуется с матрицей и сканируется на полиморфизм. Гибридизация и сканирование проводятся в основном способами, описанными здесь, а также в опубликованной публикации РСТ WO 92/10092 иWO 95/11995 и патенте US 5424186, которые включены сюда в их целостности путем ссылки. Кратко,последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, которая включает один или более предварительно идентифицированных полиморфных маркеров, амплифицируется с применением хорошо известных методов амплификации, например ПЦР. Обычно для этого применяются последовательности праймеров,которые комплементарны двум нитям последовательности-мишени, расположенным ниже и выше полиморфизма. Может применяться техника асимметричной ПЦР. Затем амплифицированная мишень, в основном включающая метку, гибридизуется с матрицей в подходящих условиях. После выполнения гибридизации и промывания матрицы матрица сканируется для определения позиции, с которой гибридизуется последовательность-мишень. Данные гибридизации, полученные из скана, представлены обычно в виде интенсивности флуоресценции как функции расположения матрицы.-6 016397 Хотя первично это было описано в терминах детекции единственного блока, например, для детектирования единичного полиморфизма, матрицы могут включать множество блоков детекции и, таким образом, способны анализировать множественные специфические полиморфизмы. В альтернативных аспектах в основном будет понятно, что блоки детекции могут быть сгруппированы в пределах единственной матрицы или множества раздельных матриц, так что различные оптимальные условия могут быть применены во время гибридизации мишени с матрицей. Например, часто может быть желательным обеспечить детекцию таких полиморфизмов, которые попадают в пределы отрезка геномной последовательности, обогащенного G-C, отдельно от тех, которые попадают в сегменты, обогащенные А-Т. Это позволяет провести раздельную оптимизацию условий для каждой ситуации. Дополнительное применение олигонуклеотидных матриц для детекции полиморфизма может быть обнаружено, к примеру, в патентах US 5858659 и 5837832, которые включены сюда в их целостности путем ссылки. Другие способы анализа нуклеиновой кислоты могут применяться для детекции полиморфизма в гене диабета II типа или вариантов, кодируемых геном диабета II типа. Репрезентативные способы включают, к примеру, прямое ручное секвенирование (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad; Sci.USA. 81:1991-1995 (1988); Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463-5467 (1977), Beavis et al.,патент US 5288644; автоматизированное флуоресцентное секвенирование; анализ полиморфизма одноцепочечной конформации (SSCP); зажатый электрофорез в геле в денатурирующих условиях (CDGE); градиентный электрофорез в геле в денатурирующих условиях (DGGE) (Sheffield, V.C. et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 86:232-236 (1989); анализ сдвига мобильности (Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:2766-2770 (1989); рекстрикционный анализ (Flavell et al., Cell. 15:25 (1978); Greever, et al., Proc. Natl.(CMC) (Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:4397-4401 (1985); анализ защиты от РНКаз(Myers, R.M. et al., Science. 230:1242 (1985; применение полипептидов, которые распознают несоответствие нуклеотидов, таких как mutS белок из Е.coli; специфическая по отношению к аллелю ПЦР. В одном аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатор защитного аллеля против диабета II типа) может быть сделан также путем экспрессионного анализа путем количественной ПЦР (кинетические температурные циклы). Этот метод с применением TaqMan анализа может определить присутствие изменения в экспрессии или состав полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2 или сплайсированными вариантами, кодируемыми нуклеиновой кислотой TCF7L2. Для идентификации полиморфизма могут применяться также TaqMan зонды, независимо от того, является пациент гомо- или гетерозигоным. Дополнительно экспрессия вариантов может быть оценена количественно как физически или функционально различных. В другом аспекте изобретения диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа (или индикатор защитного аллеля против диабета II типа) может быть сделан путем исследования экспрессии и/или состава полипептида TCF7L2 с применением различных способов, включая иммуноферментный анализ с использованием сорбента (ELISA), Вестерн-блоты, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Тестируемый образец из индивидуума оценивается на присутствие изменения в экспрессии и/или изменения в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, или на присутствие определенного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотойTCF7L2. Изменение в экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, может быть, например, изменением в количественной экспрессии полипептида (т.е. в количестве производимого полипептида); изменением в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, представляет собой изменение в качественной экспрессии полипептида (например, экспрессии измененногоTCF7L2 полипептида или другого спланированного варианта). В предпочтительном аспекте диагноз восприимчивости к диабету II типа или пониженной восприимчивости к диабету II типа может быть сделан путем детекции определенного сплайсированного варианта, кодируемого этой нуклеиновой кислотойTCF7L2, или определенного спектра сплайсированных вариантов. Могут быть представлены оба таких изменения (количественные и качественные). Термин "изменение" в экспрессии или составе полипептида, как он применяется здесь, относится к изменению в экспрессии или составе тестируемого образца по сравнению с экспрессией или составом полипептида нуклеиновой кислоты TCF7L2 в контрольном образце. Контрольный образец является образцом, который соответствует тестируемому образцу (например, происходит из того же типа клеток и из индивидуума, у которого не затронута восприимчивость к диабету II типа). Изменение в экспрессии или составе полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является индикатором восприимчивости к диабету II типа. Подобным образом присутствие одного или более сплайсированных вариантов в тестируемом образце или присутствие значительно различающихся количеств различных сплайсированных вариантов в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является индикатором чувствительности к диабету II типа. Могут применяться различные способы анализа экспрессии или состава полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, включая спектроскопию, колориметрию, электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и иммуноанализ (например, David et al., патентUS 4376110), такой как иммуноблоттинг (см. также Current Protocols in Molecular Biology, особенно главу 10). Например, в одном аспекте антитело способно связываться с полипептидом (например, как описано выше), предпочтительно может применяться антитело с детектируемой меткой. Антитела могут быть поликлональными или более предпочтительно, моноклональными. Может применяться интактное антитело или его фрагмент (например, Fab или F(ab')2). Термин "меченый" по отношению к зонду или антителу включает непосредственно меченый зонд или антитело, сопряженное (т.е. физически соединенное) с детектируемым веществом зонда, а также непрямо меченый зонд или антитело за счет его взаимодействия с другим реагентом, который помечен непосредственно. Примеры непрямого мечения включают детекцию первичного антитела с применением флуоресцентно меченого вторичного антитела и зонд ДНК,помеченный на конце биотином, так что это может быть обнаружено с флуоресцентно меченым стрептавидином. Вестерн-блот анализ с применением антитела, как описано выше, которое специфически связывается с полипептидом, кодируемым измененной нуклеиновой кислотой TCF7L2, или антитела, которое специфически связывается с полипептидом, кодируемым неизмененной нуклеиновой кислотой, или антитела, которое специфически связывается с определенным сплайсированным вариантом, кодируемым нуклеиновой кислотой, может применяться для идентификации присутствия в тестируемом образце определенного сплайсированного варианта или полипептида, кодируемого полиморфной или измененной нуклеиновой кислотой TCF7L2, или отсутствия в тестируемом образце определенного сплайсированного варианта или полипептида, кодируемого неполиморфной или неизмененной нуклеиновой кислотой. Присутствие полипептида, кодируемого полиморфной или измененной нуклеиновой кислотой, или отсутствие полипептида, кодируемого неполиморфной или неизмененной нуклеиновой кислотой, являются диагнозом на восприимчивость диабета II типа, как и присутствие (или отсутствие) определенных сплайсированных вариантов, кодируемых нуклеиновой кислотой TCF7L2. В одном аспекте этого способа уровень или количество полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, в тестируемом образце сравнивается с уровнем или количеством полипептида, кодируемого TCF7L2, в контрольном образце. Уровень или количество полипептида в тестируемом образце, которое является более высоким или низким, чем уровень или количество полипептида в контрольном образце, такие, что различие является статистически значимым, является индикатором изменения в экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, и диагностикой восприимчивости к диабету II типа. Альтернативно, состав полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, в тестируемом образце сравнивается с составом полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2, в контрольном образце (например, присутствие различных сплайсированных вариантов). Различие в составе полипептида в тестируемом образце по сравнению с составом полипептида в контрольном образце является диагностикой восприимчивости к диабету II типа. В другом аспекте может быть определен и уровень, и состав полипептида в тестируемом и в контрольном образцах. Различие в количестве или уровне полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом; различие состава в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом или оба различия в количестве или уровне и различие в составе являются индикатором восприимчивости к диабету II типа. Те же способы могут, наоборот, применяться для идентификации присутствия различия, когда сравниваются с контрольным (при заболевании) образцом. Отличие от контроля является индикатором пониженной восприимчивости к диабету II типа и/или индикатором присутствия защитного аллеля против диабета II типа. Оценка маркеров и гаплотипов. Популяции индивидуумов, демонстрирующих генетическое многообразие, не имеют идентичных геномов. Точнее, геном демонстрирует вариабельность последовательности между индивидуумами во многих участках генома; другими словами, в популяции имеется много полиморфных участков. В некоторых случаях делается ссылка на различные аллели в полиморфном участке без выбора аллеля сравнения. Альтернативно, контрольная последовательность может сравниваться с определенным полиморфным участком. Контрольный аллель иногда рассматривают как аллель "дикого типа", и он обычно выбирается либо как первый секвенированный аллель, либо как аллель из "не подверженного" болезни индивидуума (например, индивидуума, который не демонстрирует признаков заболевания или аномального фенотипа). Аллели, которые отличаются от контрольного, называют "вариантными" аллелями."Маркер", как описано здесь, относится к последовательности генома, характерной для определенного вариантного аллеля (т.е. полиморфного участка). Маркер может включать любой аллель любого вариантного типа, обнаруженного в геноме, включая SNP, микросателлиты, вставки, делеции, дупликации и транслокации. Номенклатура SNP, как сообщается здесь, относится к официальному ID SNP (rs) идентификационному ярлыку, назначенному каждому уникальному SNP Национальным Центром Биотехнологической Информации (NCBI)."Гаплотип", как это описано здесь, относится к сегменту цепи геномной ДНК, которая характеризуется специфической комбинацией генетических маркеров ("аллелей"), расположенных внутри сегмента. В определенном воплощении гаплотип может включать один или более аллелей, два или более аллелей,-8 016397 три или более аллелей, четыре или более аллелей или пять или более аллелей. Генетический маркер является определенными "аллелями" в "полиморфных участках", ассоциированными с LD блоком 4 экзонаTCF7L2. Как это применяется здесь, "LD блок экзона 4 TCF7L2" относится к LD блоку на Chr10q, в пределах которого наблюдается ассоциация вариантов с диабетом II типа. В соответствии с NCBI существует 34 позиции этого блока в пределах от 114413084 до 114488013 пар оснований. Термин "восприимчивость", как описывается здесь, включает как повышенную, так и пониженную восприимчивость. Таким образом, определенные маркеры и/или гаплотипы изобретения могут характеризовать повышенную восприимчивость к диабету II типа, что характеризуется относительным риском заболевания более чем единица. Более того, маркеры и/или гаплотипы, которые придают повышенную восприимчивость к диабетуII типа, рассматриваются как наличие "риска", поскольку они обеспечивают повышенный риск заболевания. Альтернативно, маркеры и/или гаплотипы изобретения, характеризующие пониженную восприимчивость к диабету II типа, характеризуются относительным риском менее чем единица. Позиция нуклеотида, в которой в популяции возможна более чем одна последовательность (либо в природной популяции, либо в синтетической популяции, например в библиотеке синтетических молекул), называется здесь "полиморфным участком". Там, где полиморфный участок имеет длину в один нуклеотид, участок называется SNP. Например, если в определенном участке хромосомы один член популяции имеет аденин, а другой член популяции имеет тимин в одной и той же позиции, то эта позиция является полиморфным участком, более точно SNP. Аллели для маркеров SNP, как это называется здесь,относятся к основаниям А, С, G или Т, поскольку они находятся в полиморфном участке в примененном анализе SNP. Специалист поймет, что путем определения или чтения противоположной нити в каждом случае может быть определен комплементарный аллель. Таким образом, для полиморфного участка,включающего полиморфизм A/G, примененный анализ может измерить либо процент, либо соотношение двух возможных оснований, т.е. А и G. Альтернативно, путем создания анализа, который определяет противоположную нить на матрице ДНК, может быть измерен процент или соотношение комплементарных оснований Т/С. Количественно (например, в терминах относительного риска) должны быть получены идентичные результаты из измерения любой нити ДНК (+нить или -нить). Участки полиморфизма могут позволить различать последовательности на основании замен, вставок или делеций. Например,полиморфные микросателлиты имеют множественные малые повторы оснований (такие как СА повторы) в определенном участке, в котором ряд дин повторов в основной популяции варьирует. Каждая версия последовательности в отношении участка полиморфизма называется здесь как "аллель" полиморфного участка. Таким образом, в предыдущем примере SNP позволяет присутствие обоих аденинового и тиминового аллелей. Обнаружено, что SNP и микросателлитные маркеры, локализованные в пределах LD блока экзона 4 TCF7L2, ассоциированные с диабетом II типа, описаны в табл. 2-7. Типично контрольная последовательность относится к определенной последовательности. Аллели,которые отличаются от контрольного, называются "вариантные" аллели. Например, контрольная геномная последовательность ДНК между позициями 114413084 и 114488013 NBCI Конструкция 34 (равная 74929 парам оснований или 74,9 т.п.о.), которая относится к локализации в пределах хромосомы 10, описана здесь как SEQ ID NO: 1. Вариантная последовательность, как это применяется здесь, относится к последовательности, которая отличается от SEQ ID NO:1, но во всем остальном, по существу, подобна. Генетические маркеры, которые составляют гаплотипы, ассоциированные с LD блоком экзона 4 TCF7L2,являются вариантными. Дополнительно варианты могут включать изменения, которые влияют на полипептид, например полипептид, кодируемый геном TCF7L2. Эти различия в последовательности, когда они сравниваются с контрольной нуклеотидной последовательностью, могут включать вставки или делеции единственного нуклеотида или более чем одного нуклеотида. Такие различия в последовательности могут приводить к сдвигу рамки считывания; изменение по меньшей мере одного нуклеотида может приводить к изменению кодируемой аминокислоты; изменение по меньшей мере одного нуклеотида может приводить к генерации преждевременного стоп-кодона; делеция нескольких нуклеотидов может приводить к делеции одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидами; вставка одного или нескольких нуклеотидов, такая как неравная рекомбинация или конверсия гена, может приводить к прерыванию кодирующей последовательности рамки считывания; дупликации всей или части последовательности; транспозиции или реаранжировке нуклеотидной последовательности, как это описано здесь детально. Такие изменения последовательности изменяют полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой. Например, если изменение в последовательности нуклеиновой кислоты вызывает сдвиг рамки, то сдвиг рамки может привести к изменению в кодируемых аминокислотах и/или может привести к генерации преждевременного стоп-кодона, вызывая получение укороченного полипептида. Альтернативно, полиморфизм, ассоциированный с диабетом II типа или с восприимчивостью к диабету II типа, может быть синонимичным изменением в одном или более нуклеотидах(т.е. изменением, которое не приводит к изменению в аминокислотной последовательности). Такой полиморфизм может, например, изменять участки сплайсинга, влиять на стабильность или транспорт мРНК или по-другому влиять на транскрипцию или трансляцию кодируемого полипептида. Он может изменять также ДНК, увеличивая возможность структурных изменений, таких как амплификация или делеция, имеющих место на соматическом уровне в опухолях. Полипептид, кодируемый контрольной нуклеотидной последовательностью, является "кон-9 016397 трольным" полипептидом с определенной контрольной аминокислотной последовательностью, и полипептиды, кодируемые вариантными аллелями, называются "вариантными" полипептидами с вариантными аминокислотными последовательностями. Полиморфные микросателлиты имеют множественные малые повторы оснований, которые имеют длину в 2-8 нуклеотидов (такие как СА повторы) в определенном участке, в котором ряд длин повторов варьирует в общей популяции. Вставка является общей формой полиморфизма, включающего малые вставки или делеции, которые типично имеют длину лишь несколько нуклеотидов. Гаплотипы, описанные здесь, представляют собой комбинацию различных генетических маркеров,например SNP и микросателлитов, имеющих определенные аллели в полиморфных участках. Гаплотипы могут включать комбинацию различных генетических маркеров, детектирование гаплотипов, таким образом, может быть выполнено способами, известными специалисту, для детектирования последовательностей в полиморфных участках. Например, могут применяться стандартные методы для генотипирования присутствия SNP и/или микросателлитных маркеров, такие как основанные на флуоресцентных методах (Chen, X. et al., Genome Res. 9(5):492-98 (1999, ПЦР, LCR, вложенная ПЦР и другие методы амплификации нуклеиновой кислоты. Эти маркеры и SNP могут быть идентифицированы в гаплотипах,придающих риск возникновения заболевания. Определенные способы идентификации важных маркеров и SNP включают LD и/или оценки LOD. В определенных способах, описанных здесь, индивидуум, который имеет риск возникновения диабета II типа, является индивидуумом, у которого идентифицированы маркеры риска или гаплотип риска. В одном аспекте маркер или гаплотип риска является тем, что придает значительно увеличенный риск(или восприимчивость) диабета II типа. В одном воплощении значимость, ассоциированная с маркером или гаплотипом, измеряется относительным риском. В дополнительном воплощении значимость определяется процентом. В одном воплощении значительно увеличенный риск измеряется как относительный риск по меньшей мере примерно 1,2, включая, но не ограничиваясь, 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8 и 1,9. В дополнительном воплощении относительный риск 1,2 является значимым. В дополнительном воплощении относительный риск по меньшей мере 1,5 является значимым. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска, являющееся равным по меньшей мере 1,7, является значительным. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска составляет по меньшей мере примерно 20%, включая,но не ограничиваясь этим, примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 98%. В дополнительном воплощении значимое увеличение риска составляет по меньшей мере примерно 50%. В других воплощениях изобретения маркер или гаплотип придает пониженный риск (пониженную восприимчивость) диабета II типа. В одном воплощении значимое уменьшение риска измеряется как относительный риск менее чем 0,9, включая, но не ограничиваясь, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5 и 0,4. В дополнительных воплощениях значимый относительный риск составляет менее чем 0,7. В другом воплощении снижение риска (или восприимчивости) составляет по меньшей мере примерно 20%, включая, но не ограничиваясь, примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 98%. В дополнительном воплощении значимое уменьшение риска составляет по меньшей мере примерно 30%. Таким образом, термин "восприимчивость к диабету II типа" указывает либо на повышенный риск либо на восприимчивость или пониженный риск или восприимчивость диабета II типа в количестве, которое является значимым, когда представлен определенный аллель, маркер, SNP или гаплотип; значимость измеряется, как указано выше. Термины "пониженный риск", "пониженная восприимчивость" и"защита против", как они применяются здесь, показывают, что относительный риск является пониженным соответственно, когда представлен определенный другой аллель, маркер, SNP и/или определенный гаплотип. Понятно, однако, что идентификация того, является ли пониженный или повышенный риск значимым в медицине, может также зависеть от множества факторов, включая специфическое заболевание, маркер или гаплотип и часто факторы окружающей среды. Маркер или гаплотип риска, включая часть, в гене TCF7L2 является таковым, где маркер или гаплотип наиболее часто представлены у индивидуумов с риском диабета II типа (подверженным) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума (контрольного) и где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором восприимчивости к диабету II типа. Примером простого теста на корреляцию будет строгий тест Фишера попарно в таблице. Данная группа хромосом попарно в таблице сконструирована из ряда хромосом, которые включают оба маркера или гаплотипа, один из маркеров или гаплотипов, но не другой, и ни один из маркеров или гаплотипов. В определенных аспектах изобретения маркер или гаплотип риска является маркером или гаплотипом риска в пределах или вблизи TCF7L2, что значимо коррелирует с диабетом II типа. В других аспектах маркер или гаплотип риска включает маркер или гаплотип риска в пределах или вблизи TCF7L2, что значимо коррелирует с восприимчивостью к диабету II типа. В определенном воплощении маркер или гаплотип ассоциирован с LD блоком экзона 4 TCF7L2, как это описано здесь. Могут применяться стандартные способы генотипирования присутствия SNP и/или маркера микросателлита, такие как методы, основанные на флуоресценции (Chen, et al., Genome Res. 9, 492 (1999,ПЦР, LCR, вложенная ПЦР и другие методы амплификации нуклеиновой кислоты. В предпочтительном аспекте способ включает оценку у индивидуума присутствия или частоты SNP и/или, включая часть,- 10016397 гена TCF7L2, где избыток или более высокая частота SNP и/или микросателлитов по сравнению со здоровыми контрольными индивидуумами является индикатором того, что индивидуум восприимчив к диабету II типа. Такие SNP и маркеры могут формировать гаплотипы, которые могут применяться как инструмент для скрининга. Эти маркеры и SNP могут быть идентифицированы как гаплотипы риска. Например, гаплотип риска может включать маркеры микросателлиты и/или SNP, такие как маркер DG10S478 и/или SNP rs12255372, rs7895340, rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326 и rs4506565. Присутствие гаплотипа риска является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа и, таким образом, индикатором индивидуума, который попадает в популяцию для лечения способами, описанными здесь. Идентификация вариантов восприимчивости. Частоты гаплотипов у пациентов и контрольных групп могут быть оценены с применением алгоритма максимизации ожидания (Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. D, 39:1-38 (1977. Может быть применено осуществление этого алгоритма, которое может контролировать отсутствующие генотипы и неопределенность с фазой. В нулевой гипотезе предполагается, что пациенты и контроли имеют идентичные частоты. С применением вероятностного подхода тестируется альтернативная гипотеза, где кандидату на гаплотип риска, который может включать маркеры, описанные здесь, позволено иметь более высокую частоту у пациентов, чем в контроле, в то время как соотношение частот других гаплотипов предполагается одинаковым в обеих группах. Вероятность максимизируется отдельно для обеих гипотез, и применяется соответствующий 1-df статистический коэффициент вероятности для оценки статистической значимости. Для поиска маркеров риска и защитных маркеров в пределах сцепленной области, к примеру, исследуется ассоциация всех возможных комбинаций генотипированных маркеров, в том случае, если эти маркеры простираются в настоящую область. Комбинированные группы пациентов и контрольные группы могут быть беспорядочно разделены на два набора, равные по размеру оригинальной группе пациентов и контрольных индивидуумов. Затем анализ маркера и гаплотипа повторяется, и определяются наиболее значимые зарегистрированные значения р. Эта рандомизированная схема затем может быть повторена, например, более 100 раз для конструирования эмпирического распределения значений р. В предпочтительном воплощении значение р 0,05 является индикатором значимой ассоциации маркера и/или гаплотипа. Далее следует подробное обсуждение анализа гаплотипа. Анализ гаплотипа. Один общепринятый подход к анализу гаплотипа вовлекает применение основанного на вероятности заключения, применимого к Nested Models (Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet. 35:131-38 (2003. Способ выполняется с помощью программы NEMO, которая учитывает многие полиморфные маркеры, SNP и микросателлиты. Метод и программное обеспечение специально созданы для изучения пары случайконтроль, где цель заключается в идентификации группы гаплотипов, которая придает различные риски заболевания. Это также инструмент для исследования LD структур. В NEMO максимальная вероятность оценивается, коэффициенты вероятности и значения р непосредственно рассчитываются с поддержкой ЕМ алгоритма для наблюдаемых данных, обрабатывая их как в случае проблемы отсутствия данных. Информация об измерениях. Даже хотя тесты коэффициента вероятности, основанные на вероятности, вычисленной непосредственно для наблюдаемых данных, которые фиксировали информацию о потери, обусловленную неопределенностью в фазе, и отсутствующих генотипах, позволяют надеяться на получение ценных значений р,было бы интересно узнать, как много информации было потеряно, вследствие того, что информация была неполной. Измерение информации для анализа гаплотипа описано у Nicolae and Kong (TechnicalReport 537, Department of Statistics, University of Chicago; Biometrics, 60(2):368-75 (2004 как натуральное распространение информационных пределов для анализа связи и выполняется с помощью NEMO. Статистический анализ. Для ассоциации единственного маркера с заболеванием может быть применен строгий тест Фишера для расчета двусторонних значений р для каждого индивидуального аллеля. Все значения р представлены не подведенными до множественных сравнений, пока это не указано специально. Представленные частоты (для микросателлитов, SNP и гаплотипов) являются частотами аллелей в противоположность несущим частотам. Для минимизации любого смещения, обусловленного связанностью пациентов, которые были набраны как семейства для анализа взаимосвязи, родственники первой и второй степени могли быть удалены из списка пациентов. Более того, тест для ассоциации можно повторить, чтобы ввести поправки на любую сохраняющуюся связанность среди пациентов путем процедуры распространения подведения расхождений, описанной у Rich, N.Teng, J. (Genome Res., 8:1273-1288 (1998, создания общего фонда ДНК (ibid) для кровных родственников так, чтобы он мог применяться для основных семейных взаимоотношений и для сравнения представляться как доведенными, так и не доведенными значениями р. Как ожидалось, различия в основном были незначительными. Для оценки значимости ассоциации с единственным маркером, скорректированной для множественного тестирования, авторы изобретения могли проводить тест рандомизации с применением данных того же генотипа. Группа пациентов и кон- 11016397 трольная группа могли быть рандомизированы, и анализ ассоциации сделан повторно много раз (например, до 500000 раз), и значение р представляет собой фракцию повторных анализов, которые дают значение р для того же маркерного аллеля, которое ниже или равно значению р, наблюдаемому с применением оригинальной группы пациентов или контрольной группы. Для обоих типов анализа (единичного маркера и гаплотипа) относительный риск (RR) и приписанный к популяции риск могут быть рассчитаны на основе предположения множественной модели (гаплотип относительно модели риска) (Terwilliger,J.D.Ott, J. Hum. Hered. 42:337-46 (1992) and Falk, C.T.Rubinstein, H., Ann. Hum. Genet. 51 (Pt. 3):227-33(1987, т.е. что риски двух аллелей/гаплотипов индивидуум несет, умножая. К примеру, если RR представляет собой риск А относительно а, то риск гомозиготной персоны АА будет RR раз от такового для гетерозиготы Аа и RR2 раз от риска гомозиготной персоны аа. Мультипликативная модель имеет замечательное свойство, которое упрощает анализ и расчеты - гаплотипы являются независимыми, т.е. находятся в равновесии Харди-Вайнберга в пределах подверженной заболеванию популяции, а также в пределах контрольной популяции. Вследствие этого каждый гаплотип, рассчитанный для подверженных заболеванию и контролей, имеет полиномное распределение, но с различными частотами гаплотипа при альтернативных гипотезах. В частности, для двух гаплотипов, hi и hj, риск(hi/hj)=(fi/pi)(fj/pj), где f и р означают соответственно частоты в подверженной заболеванию популяции и в контрольной популяции. В то время как имеется некоторая потеря силы, если истинная модель не является мультипликативной, потеря имеет тенденцию быть умеренной, исключая экстремальные случаи. Наиболее важным является то, что значения р всегда являются правомерными, поскольку они рассчитаны по отношению к нулевой гипотезе. Нарушение равновесия сцепления с применением NEMO.LD между парами маркеров можно рассчитать с применением стандартного определения D' и R2(Lewontin, R., Genetics. 49:49-67 (1964); Hill, W.G. Robertson, F. Theor. Appl. Genet. 22:226-231 (1968. С применением программы NEMO частоты комбинаций двух маркерных аллелей оцениваются с максимальной вероятностью, а отклонение от равновесия взаимосвязи оценивается с помощью теста коэффициента вероятности. Определения D' и R2 расширены с включением микросателлитов путем усреднения значений для всех возможных аллельных комбинаций двух маркеров, взвешенных посредством крайних вероятностей аллелей. Размещая все комбинации маркеров для выявления структуры LD в определенной области, помещали D' в верхний левый угол, а значение р - в нижний правый угол. В LD графике, если это желательно, маркеры могут быть размещены равноудаленно, а не в соответствии с их физической локализацией. Статистические способы анализа сцепления. В анализах оценки свидетельств сцепления может быть применен многоточечный, приписанный только к доле одного аллеля, метод. Результаты, такие как LOD баллы и непараметрическая оценка сцепления (NPL), могут быть получены с применением программы Allegro (Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000. Наш базовый анализ сцепления применяет бальную функцию Spairs (Wittemore, A.S., Halpen, J. Biometrics. 50:118-27 (1994); Kruglyak L., et al., Amer. J. Hum. Genet. 58:1347-63 (1996, экспоненциальную модель распределения аллеля (Kong, A. and Cox, N.J. Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997 и семейно взвешенную схему, которая на логарифмической шкале представляет собой половину расстояния между равным взвешиванием каждой подверженной заболеванию пары и равным взвешиванием каждой семейной пары. Информационный показатель, который применяется, является частью данных на выходе программы Allegro, и информационный показатель равен нулю, если маркер генотипов является полностью информативным, и равен единице, если генотипы определяют точное количество распределения аллеля среди подверженных заболеванию родственников нестрогим образом (Gretarsdottir et al., Am.J. Hum. Genet., 70:593-603 (2002. Значения Р были рассчитаны двумя различными путями, и здесь приводится менее значимый результат. Первое значение Р может быть рассчитано на основе теории больших выборок; распределение аппроксимирует стандартную нормальную переменную в нулевой гипотезе сцепления (Kong, A. and Cox, N.J. Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997. Второе значение Р может быть рассчитано путем сравнения наблюдаемой LOD-оценки с его полными данными распределения образца в нулевой гипотезе (например, Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000. Когда данные состоят из более чем нескольких семейств, эти два значения Р проявляют тенденцию быть очень похожими. Определение гаплотипов и "гаплотипного блока" локуса восприимчивости. В определенных воплощениях анализ маркера и гаплотипа вовлекает определение локусакандидата на восприимчивость на основе "блоков гаплотипа" (называемых также "LD блоками"). Сообщалось о том, что части генома человека могут быть разделены на серии дискретных гаплотипных блоков, включающих несколько общих гаплотипов; для этих блоков данные о нарушении сцепления обеспечивали мало доказательств, указывающих на рекомбинацию (см., например, Wall J.D. and Pritchard J.K.- 12016397 Существует два основных способа определения этих гаплотипных блоков: блоки могут быть определены как области ДНК, которые имеют ограниченное разнообразие гаплотипов (см., например,Daly M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2002); Patil, N. et al., Science. 294:1719-1723 (2001); Dawson, E.et al., Nature. 418:544-548 (2002); Zang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:7335-7339 (2002, или как области между переходными зонами, имеющие большую историческую рекомбинацию, идентифицированную с применением выявлений нарушения сцепления (см., например, Gabriel, S.B. et al., Science. 296:2225-2229 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003); Wang et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B. Curr. Biol. 13:1-8 (2003. Как это применяется здесь, термины "гаплотипный блок" или "LD блок" включают блоки, определенные с помощью любой из двух характеристик. Репрезентативные способы идентификации блоков гаплотипов приведены выше, например, в опубликованных патентных заявках US 20030099964, 200330170665, 20040023237 и 20040146870. Блоки гаплотипов могут легко применяться для ассоциации на карте между фенотипов и статусом гаплотипа. Основные гаплотипы могут быть идентифицированы в каждом блоке гаплотипов, а затем может быть идентифицирован набор "меченых" SNP или маркеров (самый малый набор SNP или маркеров, необходимых для различения гаплотипов). Эти меченые SNP или маркеры могут затем применяться в оценке образцов из группы индивидуумов для идентификации ассоциации между фенотипом и гаплотипом. Если желательно, одновременно могут быть оценены соседние блоки гаплотипов, поскольку может также существовать нарушение сцепления между блоками гаплотипов. Гаплотипы и диагностика. Как описано здесь, было обнаружено, что определенные маркеры и гаплотипы, включающие такие маркеры, полезны при определении восприимчивости к диабету II типа, т.е. обнаружено, что они полезны при диагностике восприимчивости к диабету II типа. У индивидуумов с диабетом II типа они обнаруживаются чаще, чем у индивидуумов без диабета II типа. Таким образом, эти маркеры и гаплотипы имеют предсказательное значение для обнаружения диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа у индивидуума. Блок гаплотипов (т.е. LD блок экзона 4 TCF7L2), включающий определенные меченые маркеры, может быть обнаружен более часто у индивидуумов с диабетом II типа, чем у индивидуумов без диабета II типа. Таким образом, эти несущие "риск" меченые маркеры в пределах блока гаплотипов также обладают предсказательной силой для выявления диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа у индивидуума. Несущие "риск" меченые маркеры в пределах гаплотипа или LD блоков могут также включать другие маркеры, которые проводят различие среди гаплотипов, поскольку они подобным образом имеют предсказательную силу для выявления диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа. Вследствие гаплотипной блоковой структуры человеческого генома может быть обнаружено, что большое число маркеров или других вариантов и/или гаплотипов, включающих такие маркеры или варианты, в ассоциации с блоком гаплотипов (LD блок) ассоциированы с определенной особенностью и/или фенотипом. Таким образом, возможно, что маркеры и/или гаплотипы, находящиеся в пределах LD блока экзона 4 TCF7L2, как это определено здесь, или в строгом LD (характеризуясь r2 более чем 0,2) с LD блоком экзона 4 TCF7L2, ассоциированы с диабетом II типа (т.е. они придают увеличенную или пониженную восприимчивость к диабету II типа). Это включает маркеры, которые описаны здесь (табл. 6), но может также включать другие маркеры, которые находятся в строгом LD (характеризуясь r2 более чем 0,2) с одним или более маркерами, перечисленными в табл. 6. Идентификация таких дополнительных вариантов может быть достигнута способами, хорошо известными специалисту, например путем секвенирования ДНК LD блока геномной области А у определенной группы индивидуумов, и настоящее изобретение также включает такие дополнительные варианты. Как это описано здесь, определенные маркеры в пределах LD блока экзона 4 TCF7L2 обнаруживаются с более низкой частотой у индивидуумов с диабетом II типа, и гаплотипы, включающие два или более таких маркеров, перечисленных в табл. 13, 20 и 21, также обнаруживаются с более низкой частотой у индивидуумов с диабетом II типа. Следовательно, эти маркеры и гаплотипы являются защитными для диабета II типа, т.е. они придают пониженный риск развития диабета II типа для индивидуумов, несущих эти маркеры и/или гаплотипы. Гаплотипы и маркеры, описанные здесь, являются в некоторых случаях комбинацией различных генетических маркеров, например SNP и микросателлитов. Таким образом, детектирование гаплотипов может быть проведено способами, известными специалисту и/или описанными здесь для выявления последовательностей в полиморфных участках. Более того, корреляция между определенными гаплотипами или набором маркеров и фенотипом заболевания может быть верифицирована с применением стандартных методов. Репрезентативный пример простого теста для корреляции будет строгий тест Фишера попарно в таблице. В специфических воплощениях маркер или гаплотип, ассоциированный с LD блоком экзона 4TCF7L2, является таким, в котором маркер или гаплотип наиболее часто представлен у индивидуума с риском для диабета II типа (подверженные заболеванию) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума (контроль), где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором диабета II типа или восприимчивости к диабету II типа. В других воплощениях меченые маркеры, несущие- 13016397 риск заболевания, в LD с одним или более маркерами, ассоциированными с LD блоком экзона 4 TCF7L2,являются мечеными маркерами, которые наиболее часто представлены у индивидуумов с риском диабетаII типа (подверженные заболеванию) по сравнению с частотой его присутствия у здорового индивидуума(контроль), где присутствие меченого маркера или гаплотипа является индикатором повышенной восприимчивости к диабету II типа. В дополнительном воплощении маркеры риска в LD с одним или более маркерами, ассоциированными с LD блоком экзона 4 TCF7L2, являются маркерами, которые наиболее часто представлены у индивидуума с риском диабета II типа по сравнению с частотой их присутствия у здорового индивидуума (контроль), где присутствие маркеров является индикатором восприимчивости к диабету II типа. В определенных способах, описанных здесь, индивидуум, который имеет риск развития диабета II типа, представляет собой индивидуума, у которого идентифицирован маркер риска. В одном воплощении сила ассоциации маркера или гаплотипа измеряется относительным риском (RR). RR является соотношением долей состояния у субъектов, которые несут одну копию маркера или гаплотипа, и долей состояния у субъектов, которые не имеют такой маркер или гаплотип. Это соотношение эквивалентно соотношению доли состояния среди субъектов, которые несут две копии маркера или гаплотипа к доле состояния у субъектов, которые несут одну копию маркера или гаплотипа. В одном воплощении маркер или гаплотип имеет RR по меньшей мере 1,2. В другом воплощении маркер или гаплотип имеет RR по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 2,5,по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4,0 или по меньшей мере 5,0. В других способах изобретения индивидуум, который имеет пониженный риск (или пониженную восприимчивость) диабета II типа, является индивидуумом, у которого идентифицирован защитный маркер или гаплотип. В таких случаях RR составляет менее чем 1,0. В одном воплощении маркер или гаплотип имеет RR менее чем 0,9. В других воплощениях маркер или гаплотип имеет RR менее чем 0,8, менее чем 0,7, менее чем 0,6, менее чем 0,5, менее чем 0,4. Полезность генетического тестирования. Знание о генетическом варианте, который несет риск развития диабета II, открывает возможность генетического тестирования для разграничения между индивидуумами с повышенным риском развития заболевания (т.е. несущих вариант риска) и теми, кто имеет пониженный риск развития заболевания (т.е. несет защитный вариант). Основным достоинством генетического тестирования для индивидуумов, принадлежащих к обеим упомянутым выше группам, являются возможности диагностики заболевания на ранней стадии и обеспечение информации для клиницистов о прогнозе/агрессивности заболевания, для того чтобы быть способными применить наиболее подходящее лечение. Например, применение генетического теста для диабета II типа может обеспечить возможность детекции заболевания на ранней стадии, которое может привести к использованию терапевтических мер на ранней стадии и, таким образом,может минимизировать неблагоприятные эффекты симптомов и серьезные последствия для здоровья,характерные для диабета II типа. Способы терапии. В другом воплощении изобретения могут быть применены способы лечения диабета II типа. Термин "лечение", как он применяется здесь, относится не только к облегчению симптомов, ассоциированных с диабетом II типа, но также к предотвращению или задержке начала диабета II типа; к снижению тяжести или частоты симптомов диабета II типа и/или к снижению также потребности в сопутствующей терапии другими лекарствами, которые облегчают симптомы, ассоциированные с диабетом II типа. В одном аспекте индивидуум, который лечится, является индивидуумом, который восприимчив (имеет повышенный риск), диабета II типа (например, индивидуум, у которого присутствуют аллели, иные, чем 0 аллель в маркере DG10S478, присутствует Т аллель в SNP rs12255372, присутствует А аллель в SNPSNP rs4506565. В дополнительном воплощении изобретения могут быть применены способы лечения других заболеваний или состояний, ассоциированных с TCF7L2. Терапевтический агент TCF7L2 может применяться как в способах лечения диабета II типа, так и в способах лечения других заболеваний или состояний, ассоциированных с TCF7L2. В способах лечения (профилактических и/или терапевтических) применяется терапевтический агент TCF7L2. "Терапевтический агент TCF7L2" представляет собой агент, который изменяет (например,усиливает или ингибирует) активность полипептида и/или экспрессию нуклеиновой кислоты TCF7L2,непосредственно или непрямым способом (например, путем изменения активности экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, взаимодействующий с TCF7L2, такой как белок в Wnt сигнальном пути или в кадгериновом сигнальном каскаде (например, -катенина. В определенных воплощениях терапевтический агент TCF7L2 изменяет активность и/или экспрессию нуклеиновой кислоты TCF7L2.- 14016397 Терапевтический агент TCF7L2 может изменять активность полипептида TCF7L2 или экспрессию нуклеиновой кислоты различными способами, такими как, к примеру, обеспечение дополнительного полипептида TCF7L2 или путем активации регуляции транскрипции или трансляции нуклеиновой кислотыTCF7L2; путем изменения посттрансляционного процессинга полипептида TCF7L2; путем изменения транскрипции сплайсированных вариантов TCF7L2 или путем вмешательства в активность полипептидаTCF7L2 (например, путем связывания с полипептидом TCF7L2) или путем связывания с другим полипептидом, который взаимодействует с TCF7L2, путем изменения (например, путем обратной регуляции) экспрессии, транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты TCF7L2 или путем изменения (например, агонистами или антагонистами) активности. Репрезентативные терапевтические агенты TCF7L2 включают следующее: нуклеиновые кислоты или фрагменты или производные этого, описанные здесь, определенные нуклеотиды, кодирующие полипептиды, описанные здесь, и векторы, включающие такие нуклеиновые кислоты (например, ген, кДНК и/или мРНК, кодирующие полипептид TCF7L2 или активный фрагмент, или производное этого; или олигонуклеотид, или дополнительный по отношению к нему, или фрагмент, или производное этого, и/или сплайсированные варианты, кодирующие нуклеиновую кислоту диабета II типа; или фрагменты, или производные этого); полипептиды, описанные здесь, и/или сплайсированные варианты, кодируемые нуклеиновой кислотой TCF7L2, или фрагменты, или производные этого; другие полипептиды (например,рецепторы TCF7L2); агенты, связывающие TCF7L2, или агенты, которые влияют (например, увеличивают или уменьшают) на активность, антитела, такие как антитело на неизмененный полипептид TCF7L2 или антитело против определенного сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотойTCF7L2, как описано выше; имитаторы пептида, слитые белки или пролекарства, рибозимы, другие малые молекулы и другие агенты, которые изменяют (например, усиливают или ингибируют) экспрессию нуклеиновой кислоты TCF7L2, или которые регулируют транскрипцию сплайсированных вариантовTCF7L2 (например, агенты, которые влияют на то, какой из сплайсированных вариантов экспрессируется), или которые влияют на количество каждого сплайсированного варианта, который экспрессируется. Дополнительные репрезентативные терапевтические агенты TCF7L2 включают соединения, которые влияют на сигнальный каскад инсулина и/или глюкагона, GLP-1 или GIP сигнальные пути. Если желательно, одновременно может применяться более чем один терапевтический агент TCF7L2. В предпочтительных воплощениях терапевтический агент TCF7L2 представляет собой агент, который мешает проявлению активности TCF7L2, такой, к примеру, как агент, который мешает связыванию или взаимодействию TCF7L2 с бета-катенином (см., например, Fasolini, et al., J. Biol. Chem. 278(23):21092-21096 (2003 или с другими белками. Другие терапевтические агенты TCF7L2 включают агенты, которые влияют на сигнальный путь Wnt, или агенты, которые влияют на кадгериновый сигнальный каскад. Репрезентативные агенты включают агенты, такие как те, что применяются в терапии рака, белки, такие как DKK белки; бета-катенинсвязывающий домен АРС или аксин; факторы, такие какIDAX, AXAM и ICAT; антисенс олигонуклеотиды или интерферирующая РНК (РНК-i), такие как с применением Vitravet, онколитические вирусные векторы и другие соединения (см., к примеру, Luu, et al.,Current Cancer Drug Target. 4:6530671 (2004; малые молекулы антагонистов, включающие, например,ZTM00990, PKF118-310, PKF118-584, PKF22-815, CGPO49090, NPDDG39.024 и NPDDG1.024, как описано у Lepourcelet et al. (см., к примеру, Lepourcelet et al., Cancer Call. 5:91-102 (2004; соединения, описанные в патенте US 6762185, соединения, описанные в заявках на патент US 200400053136,20040072831, 20040247593 или 20050059628. Другие репрезентативные терапевтические агенты TCF7L2 включают ингибиторы gsk3, включая, к примеру, таковые, описанные в патентах US 6057117, 6153618,6417185, 6465231, 6489344, 6512102, 6608063, 6716624, 6800632 и опубликованных заявках на патентыUS 200300088866, 20030077798, 20030130289, 20030207883, 1000092535 и 200500851. Все описанное в этих ссылках, патентах и заявках на патенты повторно цитируется в Спецификации и включено сюда в их целостности.- 15016397 Дополнительные репрезентативные терапевтические агенты TCF7L2 показаны в таблице агентов. Таблица агентовNSD = структура не раскрыта (в Iddb3).- 17016397 Терапевтический(е) агент(ы) TCF7L2 вводится в терапевтически эффективном количестве (т.е. в количестве, которое "достаточно" для лечения, как описано выше). Количество, которое будет терапевтически эффективным при лечении определенного индивидуального расстройства или состояния, будет зависеть от симптомов и тяжести заболевания и может быть определено стандартными клиническими методами. Кроме того, необязательно могут применяться анализы in vitro или in vivo, чтобы помочь идентифицировать оптимальные диапазоны дозировки. Точная доза, применяемая в формулировке, будет также зависеть от пути введения и серьезности заболевания или расстройства и должна быть выбрана в соответствии с решением практикующего врача и состоянием каждого пациента. Эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных на тест-системах in vitro или на животных моделях. В одном воплощении могут применяться нуклеиновая кислота, например нуклеиновая кислота, кодирующая TCF7L2 полипептид, или другая нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид TCF7L2 или сплайсированный вариант, производное или фрагмент этого, одна или в фармацевтической композиции, как описано выше. Например, ген TCF7L2, или нуклеиновая кислота, или кДНК, кодирующаяTCF7L2 полипептид, сама по себе или включенная в вектор, могут быть введены в клетки (in vitro или invivo), так что клетки производят нативный полипетид TCF7L2. Если необходимо, клетки, которые были трансформированы геном или кДНК или вектором, включающим ген, нуклеиновую кислоту или кДНК,могут быть введены (или введены повторно) индивидууму, подверженному заболеванию. Таким образом, клетки, у которых в природе отсутствует нативная экспрессия и активность TCF7L2 или которые имеют измененную экспрессию или активность TCF7L2 либо имеют экспрессию сплайсированного варианта TCF7L2, ассоциированного с заболеванием, могут быть сконструированы для экспрессии полипептида TCF7L2 или активного фрагмента полипептида TCF7L2 (или отличающегося варианта TCF7L2). В определенных воплощениях нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид TCF7L2, или активный фрагмент, или производное этого могут быть введены в экспрессионный вектор, такой как вирусный вектор, а вектор может быть введен в подходящие клетки животного. Могут быть применены другие переносящие ген системы, включая вирусные и невирусные системы транспорта. Альтернативно, могут применяться также невирусные способы транспорта генов, такие как совместная преципитация с фосфатом кальция, механические методы (например, микроинъекции); опосредованный слиянием с мембранами транспорт с помощью липосом; прямое поглощение ДНК. Альтернативно, в другом воплощении изобретения нуклеиновая кислота изобретения; нуклеиновая кислота, комплементарная нуклеиновой кислоте изобретения, или часть такой нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид, как описано ниже) могут быть применены в "антисенс"-терапии, в которой нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотид), которая специфически гибридизуется с мРНК и/или геномной ДНК гена диабета II типа вводится или производится in situ. Антисенс-нуклеиновая кислота,которая специфически гибридизуется с мРНК и/или геномной ДНК, ингибирует экспрессию полипепти-аTCF7L2, например, путем ингибирования трансляции или транскрипции. Связывание антисенс= нуклеиновой кислоты может осуществляться за счет комплементарности традиционных пар оснований или, к примеру, в случае связывания дуплекса ДНК может осуществляться через специфическое взаимодействие в большой борозде двойной спирали. Антисенс-конструкт настоящего изобретения может доставляться, например, как экспрессионная плазмида, как описано выше. Когда плазмида транскрибируется в клетке, она производит РНК, которая комплементарна части мРНК и/или ДНК, которая кодирует полипептид TCF7L2. Альтернативно, антисенс-конструкт может быть олигонуклеотидным зондом, который производится ex vivo и вводится в клетки; затем он ингибирует экспрессию путем гибридизации с мРНК и/или геномной ДНК полипептида. В одном воплощении олигонуклеотидный зонд модифицируется олигонуклеотидами, которые резистентны к эндогенным нуклеазам, например экзонуклеазам и/или эндонуклеазам, таким образом сохраняя их стабильными in vivo. Типичными молекулами нуклеиновой кислоты для применения в качестве антисенс-олигонуклеотидов являются фосфорамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см. также патенты US 5176996, 5264564 и 5256775). Дополнительно общепринятым подходом к конструированию олигомеров, полезных при антисенс-терапии, являются также описанные, например, уVan der Krol et al. (Biotechniques. 6:958-976 (1988 и у Stein et al. (Cancer Res. 48:2659-2668 (1988. По отношению к антисенс-ДНК предпочтительными являются олигодезоксирибонуклеотиды, происходящие из сайта инициации трансляции. Для осуществления антисенс-терапии конструируются олигонуклеотиды (мРНК, кДНК или ДНК),которые являются комплементарными к мРНК, кодируемой геном TCF7L2. Антисенс-олигонуклеотиды связываются с транскриптами мРНК TCF7L2 и предотвращают трансляцию. Абсолютная комплементарность, хотя и является предпочтительной, не требуется. Последовательность, "комплементарная" части РНК, как это называется здесь, показывает, что последовательность имеет достаточную комплементарность, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя стабильный дуплекс; в случае двутяжной антисенс-нуклеиновой кислоты единственная нить дуплекса ДНК может быть тестирована таким образом, или может быть проанализировано образование триплекса. Способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины молекулы антисенс-нуклеиновой кислоты, как- 18016397 подробно описано выше. В основном, чем длиннее гибридизуемая нуклеиновая кислота, тем больше оснований, являющихся некомплементарными с РНК, она может включать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс, в случае, если он существует). Специалист может выявить степень толерантности неспаривания путем применения стандартных процедур. Олигонуклеотиды, применяемые в антисенс-терапии, могут быть ДНК, РНК или химерными смесями или производными либо модифицированными версиями этого, одноцепочечными или двуцепочечными. Олигонуклеотиды могут быть модифицированы по основаниям, сахарам или фосфатному скелету,например, для увеличения стабильности молекулы, гибридизации и т.д. Олигонуклеотиды могут включать другие прикрепленные группы, такие как пептиды (например, для направления их к рецепторам клетки-хозяина in vivo) или агенты, облегчающие транспорт через клеточную мембрану (см., например,Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:648-652 (1987); Международная публикация РСТ: WO 88/09810) или через гематоэнцефалический барьер (см., например, Международную публикацию РСТ WO 89/10134), или запускаемые гибридизацией расщепляющие агенты (см., например, Krol et al., Biotechniques. 6:958-976 (1988, или встраиваемые в ДНК агенты. (См., например, Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988. Наконец, олигонуклеотиды могут быть конъюгированы с другими молекулами (например, пептидом, запускаемым гибридизацией кросссшивающим агентом, транспортирующим агентом, запускаемым гибридизацией расщепляющим агентом). Антисенс-молекулы доставляются к клеткам, которые экспрессируют TCF7L2 in vivo. Для доставки антисенс-ДНК или РНК в клетки может быть использован ряд способов, например антисенс-молекулы могут быть инъецированы непосредственно в участок ткани, или модифицированные антисенсмолекулы, сконструированные так, чтобы направляться в желаемые клетки (например, антисенсмолекулы связывают с петидами или антителами, которые специфически связываются с рецепторами или антигенами, экспрессируемыми на поверхности клетки-мишени), могут быть введены системно. Альтернативно, в предпочтительном воплощении применяется рекомбинантный ДНК-конструкт, в котором антисенс-олигонуклеотид помещен под контролем сильного промотора (например, pol III или pol II). Применение такого конструкта для транспорта к клеткам-мишеням у пациента приводит к транскрипции достаточных количеств одноцепочечной РНК, которая будет образовывать комплементарные пары оснований с эндогенным транскриптом TCF7L2 и таким образом предотвращать трансляцию мРНК TCF7L2. Например, in vivo может быть введен такой вектор, который аккумулируется клеткой и направляет транскрипцию антисенс-РНК. Такой вектор может оставаться эписомальным или интегрироваться в хромосомы до тех пор, пока он может быть транскрибирован для получения желаемой антисенс-РНК. Такие векторы могут быть сконструированы с применением технологий рекомбинантной ДНК, стандартных для отрасли и описанных выше. Например, плазмида, космида, YAC или вирусный вектор могут применяться для приготовления рекомбинантного конструкта ДНК, который может быть введен непосредственно в участок ткани. Альтернативно, могут применяться вирусные векторы, которые избирательно инфицируют желаемую ткань, в этом случае введение может быть выполнено другим путем (например,системно). Эндогенная экспрессия полипептида TCF7L2 может быть также снижена путем инактивации или"нокаута" гена, нуклеиновой кислоты или его промотора с применением направленных гомологичных рекомбинаций (например, см. Smithies et al., Nature. 317:230-234 (1985); ThomasCapecchi, Cell. 51:503512 (1987); Thompson et al., Cell. 5:313-321 (1989. Например, могут быть применены измененный нефункциональный ген или нуклеиновая кислота (или полностью неродственная последовательность ДНК), фланкированная ДНК, гомологичная эндогенному гену или нуклеиновой кислоте (кодирующими или регуляторными областями нуклеиновой кислоты) с или без маркера для селекции и/или негативного маркера для селекции, для трансфицирования клеток, которые экспрессируют ген или нуклеиновую кислоту in vivo. Встраивание ДНК-конструкта путем направленной гомологичной рекомбинации приводит к инактивации гена или нуклеиновой кислоты. Рекомбинантные ДНК-конструкты могут быть введены непосредственно или направлены к нужному участку in vivo с применением подходящих векторов, как описано выше. Альтернативно, экспрессия неизмененных генов или нуклеиновых кислот может быть увеличена с применением подобного способа: для встраивания ДНК-конструкта, включающего неизмененный функциональный ген или нуклеиновую кислоту в месте измененного TCF7L2 в клетке, может быть применена направленная гомологичная рекомбинация, как это описано выше. В другом воплощении направленная гомологичная рекомбинация может применяться для встраивания ДНК-конструкта,включающего нуклеиновую кислоту, которая кодирует вариантный полипептид диабета II типа, который отличается от представленного в клетке. Альтернативно, экспрессия эндогенной нуклеиновой кислоты TCF7L2 может быть снижена путем направления дезоксирибонуклеотидных последовательностей, комплементарных к регуляторной области нуклеиновой кислоты TCF7L2 (т.е. к промотору или энхансерам TCF7L2), для формирования тройных спиральных структур, которые предотвращают транскрипцию нуклеиновой кислоты TCF7L2 в клеткахмишенях организма (см. в основном Helene, С., Anticancer Drug Des., 6(6):569-84 (1991); Helene, С., et al.,Arm. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992) и Maher, L.J. Bioassay. 14(12):807-15 (1992. Подобным образом- 19016397 антисенс-конструкты, описанные здесь, за счет антагонизма с нормальной биологической активностью одного из белков TCF7L2 могут применяться в манипуляциях с тканью, например в дифференциации ткани, как in vivo, так и ex vivo в культурах ткани. Дополнительно антисенс-методы (например, микроинъекция антисенс-молекул или трансфекция плазмидами, транскрипты которых являются антисенс-молекулами по отношению к мРНК гена диабетаII типа или к последовательности гена) могут применяться для исследования роли TCF7L2 или взаимодействия TCF7L2 и связывающих его агентов в процессе развития, а также в нормальном функционировании TCF7L2 в клетке, или взаимодействия TCF7L2 и связывающих его агентов с тканью взрослых. Такие методы могут применяться на культуре клеток, но могут также применяться в создании трансгенных животных. Еще в одном воплощении изобретения в обработке гена диабета II типа могут также применяться другие TCF7L2 терапевтические агенты, как те, что описаны здесь. Терапевтические агенты могут доставляться в композиции, как описано выше, или сами по себе. Они могут вводиться системно или могут быть направлены в определенную ткань. Терапевтические агенты могут быть получены различными способами, включая химический синтез; рекомбинантную продукцию; продукцию in vivo (например, в трансгенных животных, таких как в патенте US 4873316Meade et al.), и могут быть изолированы с применением стандартных способов, таких как описанные выше. Могут также применяться комбинации любых из описанных выше способов (например, введение неизмененных полипептидов в сочетании с антисенс-терапией, направляющей измененную мРНКTCF7L2; введение первого сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2 в сочетании с антисенс-терапией, направленной доставкой второго сплайсированного варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой TCF7L2). Способы оценки вероятности ответа на терапевтические агенты TCF7L2. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам оценки вероятности ответа индивидуума на терапевтический агент TCF7L2. В способах оцениваются маркеры или гаплотипы, относящиеся к TCF7L2 гену, как это описано выше в отношении к оценке индивидуума на восприимчивость к диабетуII типа. Присутствие аллеля, маркера, SNP или гаплотипа, ассоциированного с восприимчивостью (повышенным риском) к диабету II типа (например, аллеля, иного, чем 0 аллель в маркере DG10S478, Т аллель в SNP rs12255372, А аллель в SNP rs7895340, С аллель в SNP rs11196205, С аллель в SNP rs7901695,Т аллель в SNP rs7903146, С аллель в SNP rs12243326 и Т аллель в SNP rs4506565; маркера, ассоциированного с LD блоком экзона 4 TCF7L2, такого как гаплотип риска, ассоциированный с LD блоком экзона 4 TCF7L2), является индикатором вероятности положительного ответа на терапевтический агентTCF7L2. "Вероятность положительного ответа" показывает, что индивидуум наиболее вероятно имеет положительный ответ на терапевтический агент TCF7L2, чем индивидуум, не имеющий такого аллеля,маркера, SNP или гаплотипа, ассоциированных с восприимчивостью (повышенным риском) к диабету II типа, как описано здесь. "Положительный ответ" на терапевтический агент TCF7L2 является физиологическим ответом, который служит признаком лечения диабета II типа. Как описано выше, "лечение" относится не только к облегчению симптомов, ассоциированных с диабетом II типа, но также к предотвращению или задержке начала диабета II типа; уменьшение тяжести или частоты симптомов диабета II типа и/или также снижение потребности в сопутствующей терапии другими лекарствами, которые облегчают симптомы, ассоциированные с диабетом II типа. Фармацевтические композиции. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим агенты,которые изменяют активность TCF7L2, или которые другим способом влияют на Wnt сигнальный каскад илина кадгериновый сигнальный путь, или которые могут применяться как TCF7L2 терапевтические агенты. Фармацевтические композиции могут быть составлены с физиологически приемлемым носителем или эксципиентом для приготовления фармацевтической композиции. Носитель и композиция могут быть стерильными. Композиции должны соответствовать способу введения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, воду,солевые растворы (например, NaCl), буферно-солевые растворы, спирты, глицерин, этанол, гуммиарабик,растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, дестроза, стеарат магния, тальк, кремниевая кислота, вязкий парафин, парфюмерное масло,сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.д., а также комбинации этого. Если желательно, то фармацевтические препараты могут быть смешаны со вспомогательными агентами, например смазочными агентами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, красителями, вкусовыми и/или ароматическими веществами и подобным, которые не реагируют вредным образом с активными агентами.- 20016397 Если желательно, композиции могут также включать минорные количества увлажняющих или эмульсифицирующих агентов или агентов, забуферивающих рН. Композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, формулировкой с пролонгированным освобождением или порошком. Композиция может быть составлена как суппозиторий с традиционными связывающими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральные композиции могут включать стандартные носители, такие как фармацевтической чистоты маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливинилпирролидоны, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д. Способы введения этих композиций включают, но не ограничиваются этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриглазной, внутривенный, подкожный, локальный, пероральный или интраназальный. Другие подходящие способы введения могут включать также генную терапию (как описано ниже), перезаряжаемые или биодеградируемые устройства, устройства, обеспечивающие ускорение частиц ("генный пистолет"), и медленно освобождающие вещество полимерные устройства. Фармацевтическая композиция этого изобретения может быть также введена как часть комбинационной терапии с другими агентами. Композиции могут быть составлены в соответствии с обычными процедурами, как фармацевтические композиции, адаптированные для введения людям. Например, композиции для внутривенного введения типично являются растворами в стериальных изотонических буферах на водной основе. Где это необходимо, композиция может также включать солюбилизирующий агент и локальный анестетик для снижения боли в месте инъекции. В основном ингредиенты поставляются либо отдельно, либо в смешанном виде в единичной форме дозировки, например, как сухой лиофилизированный порошок или свободный водный концентрат в герметически запечатанном контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного агента. Там, где композиция вводится путем инфузии, она может быть суспендирована в инфузионной бутылочке, включающей стерильную воду фармацевтической чистоты, солевой раствор или смесь дектроза/вода. Там, где композиция вводится путем инъекции, может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения. Для локального введения могут применяться нераспыляемые формы, от вязких до полутвердых или твердых форм, включающих носитель, совместимый с локальным применением и имеющим динамическую вязкость, предпочтительно большую, чем вода. Подходящие композиции включают, но не ограничиваются этим, растворы, эмульсии, кремы, мази, порошки, клизмы, примочки, золи, линименты, бальзамы, аэрозоли и т.д., которые по желанию стерилизуются или смешиваются со вспомогательными агентами, например консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, буферами или солями для воздействия на осмотическое давлении и т.д. Агент может быть включен в косметическую композицию. Для локального введения подходящими являются также распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, предпочтительно в комбинации с твердым или жидким инертным носителем упаковывается в запрессованную бутылочку или смешивается с прессуемым летучим веществом, обычно газообразной сжатой в баллончике жидкостью, например со сжатым воздухом. Агенты, описанные здесь, могут быть сформулированы как нейтральные солевые формы. Фармацевтически приемлемые соли включают те, которые образуются со свободными аминогруппами, такие как происходящие из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и тех, что образуются со свободными карбоксильными группами, такие как происходящие из гидроксидов натрия, калия,аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д. Агенты вводятся в терапевтически эффективном количестве. Количество агентов, которое будет терапевтически эффективным, частично зависит от природы расстройства и/или степени симптомов и может быть определено стандартными химическими способами. Кроме того, необязательно могут быть сделаны анализы in vitro и in vivo с тем, чтобы помочь идентифицировать оптимальные интервалы дозировок. Точная доза для применения в композиции будет также зависеть от способа введения и серьезности симптомов и должна быть определена в соответствии с решением практикующего врача и обстоятельствами болезни каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы изкривых доза-ответ, полученных на тест-системах in vitro или на животных моделях. Изобретение обеспечивает также фармацевтическую упаковку или набор, включающие один (или более) контейнер, заполненный одним (или более) ингредиентом фармацевтических композиций изобретения. Необязательно в наборе с таким контейнером(и) может быть уведомление в форме предписанных государственным агентством правил, регулирующих производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, это уведомление отражает разрешение, данное агентством на применение или продажу для введения людям. Упаковка или набор могут быть снабжены информацией относительно способа введения, последовательности введения лекарств (например, отдельно, последовательно или одновременно) или подобной информацией. Упаковка или набор могут также включать средства напоминания пациенту о принятии лекарства. Упаковка или набор могут быть стандартной дозировкой комбинационной терапии или они могут содержать множество стандартных дозировок. В частности,агенты могут быть разделены, смешаны вместе в любой комбинации, представлены в одном пузырьке- 21016397 или таблетке. Агенты, смонтированные в блистерной упаковке, или другие средства дозирования являются предпочтительными. Для целей этого изобретения стандартная дозировка означает дозировку, которая зависит от индивидуальной фармакодинамики каждого агента и вводится в одобренных FDA дозировках в виде стандартных временных режимов. Скрининг-анализы и идентифицированные таким образом агенты. Изобретение обеспечивает также способы идентификации агентов (например, слитых белков, полипептидов, имитаторов пептидов, пролекарств, рецепторов, связывающих агентов, антител, малых молекул или других лекарственных средств, или рибозимов), которые изменяют (например, увеличивают или уменьшают) активность TCF7L2, которые другим образом взаимодействуют с TCF7L2 или с другим членом Wnt сигнального каскада или кадгеринового сигнального каскада (например, бета-катенин). К примеру, в определенных воплощениях такие агенты могут быть агентами, которые связываются с TCF7L2,которые производят стимулирующее или ингибирующее воздействие, например на активность TCF7L2; или которые изменяют (например, усиливают или ингибируют) способность TCF7L2 взаимодействовать с другими членами Wnt сигнального пути или с членами кадгеринового сигнального пути, или которые изменяют посттрансляционный процессинг TCF7L2. В других воплощениях такие агенты могут быть агентами, которые изменяют активность или функцию Wnt сигнального каскада или кадгеринового сигнального пути. В одном воплощении изобретение обеспечивает анализы для скрининга кандидатов или тестовых агентов, которые связываются с или модулируют активность белка TCF7L2 (или биологически активных частей этой молекулы), а также агенты, идентифицируемые этим анализом. Тестируемые агенты могут быть получены с применением любого из многочисленных подходов методами комбинаторной библиотеки, известными специалисту, включая биологические библиотеки; библиотеки, пространственно расположенные параллельно твердой фазе или жидкой фазе; способы создания синтетических библиотек,требующие деконволюции; метод библиотек "одна бусина-одно соединение") и методы синтетической библиотеки с применением селекции путем аффинной хроматографии. Подход с применением биологической библиотеки ограничен полипептидными библиотеками, в то время как другие четыре подхода применимы к полипептидам, непептидным олигомерам или библиотекам малых молекул (Lam, K.S.,Anticancer Drug Des. 12:145 (1997. В одном воплощении для идентификации агентов, которые изменяют активность TCF7L2, клетка,клеточный лизат или раствор, включающий или экспрессирующий TCF7L2, или фрагмент, или производное этого, может контактировать с тестируемым агентом; альтернативно, белок может контактировать непосредственно с тестируемым агентом. Оценивается уровень (количество) активности TCF7L2(например, измеряется уровень (количество) активности TCF7L2 либо непосредственно, либо непрямым способом) и сравнивается с уровнем активности в контроле (т.е. с уровнем активности белка TCF7L2 или активного фрагмента, или производного этого в отсутствие тестируемого агента). Если уровень активности в присутствии агента отличается на количество, которое является статистически значимым, от уровня активности в отсутствие агента, то агент является агентом, который изменяет активность TCF7L2. Увеличение в уровне активности относительно контроля указывает, что агент является агентом, который усиливает (является агонистом) активность. Подобным образом уменьшение уровня активности относительно контроля указывает, что агент является агентом, который ингибирует (является антагонистом) активности. В другом воплощении уровень активности TCF7L2 или производного, или фрагмента этого в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем, который был установлен предварительно. Уровень активности в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня по количеству, которое является статистически значимым, указывает, что агент изменяет активностьTCF7L2. Настоящее изобретение относится также к любому способу анализа по идентификации агентов, которые изменяют экспрессию гена TCF7L2 (например, антисенс-нуклеиновые кислоты, слитые белки,полипептиды, имитаторы пептидов, рецепторы, связывающие агенты, антитела, малые молекулы или другие лекарственные средства, или рибозимы), которые изменяют (например, увеличивают или уменьшают) экспрессию (например, транскрипцию или трансляцию) гена или которые другим образом взаимодействуют с TCF7L2, а также агентов, идентифицируемых анализом. Например, раствор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую TCF7L2, может контактировать с тестируемым агентом. Раствор может включать, к примеру, нуклеиновую кислоту или клеточный лизат, включающий нуклеиновую кислоту; альтернативно, раствор может быть иным раствором, который включает элементы, необходимые для транскрипции/трансляции нуклеиновой кислоты. По желанию могут быть также применены клетки,которые не суспендируются в растворе. Оценивается уровень и/или характер экспрессии TCF7L2 (например, уровень и/или характер экспрессированных мРНК или белка, такой как уровень и/или характер различных сплайсированных вариантов) и сравнивается с уровнем и/или характером экспрессии в контроле (т.е. уровнем и/или характером экспрессии TCF7L2 в отсутствие тестируемого агента). Если уровень и/или характер в присутствии агента отличается по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, от уровня и/или характера в отсутствие агента, то агент является агентом,который изменяет экспрессию гена диабета II типа. Усиление экспрессии показывает, что агент является- 22016397 агонистом активности TCF7L2. Подобным образом ингибирование экспрессии показывает, что агент является антагонистом активности TCF7L2. В другом воплощении уровень и/или характер полипептида(ов) TCF7L2 (т.е. различных сплайсированных вариантов) в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем и/или характером, который был установлен предварительно. Уровень и/или характер в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня и/или характера по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, указывает, что агент изменяет экспрессии TCF7L2. В другом воплощении изобретения агенты, которые изменяют экспрессию TCF7L2 или которые другим образом взаимодействуют с TCF7L2 или с другими членами Wnt сигнального пути или кадгеринового сигнального пути, могут быть идентифицированы с применением клетки, клеточного лизата или раствора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую область промотора гена TCF7L2 или нуклеиновй кислоты, операбельно связанной с репортерным геном. После контакта с тестируемым агентом определяется уровень экспрессии репортерного гена (например, уровень экспрессируемых мРНК или белка) и сравнивается с уровнем экспрессии в контроле (т.е. уровнем экспрессии репортерного гена в отсутствие тестируемого агента). Если уровень в присутствии агента отличается по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, от уровня в отсутствие агента, то агент является агентом, который изменяет экспрессию TCF7L2, как показано по его способности изменять экспрессию гена, который операбельно связан с промотором гена TCF7L2. Усиление экспрессии репортера показывает, что агент является агонистом TCF7L2 активности. Подобным образом ингибирование экспрессии репортера показывает, что агент является антагонистом активности TCF7L2. В другом воплощении уровень экспрессии репортера в присутствии тестируемого агента сравнивается с контрольным уровнем,который установлен предварительно. Уровень в присутствии агента, который отличается от контрольного уровня по количеству или по способу, которые являются статистически значимыми, показывает, что агент изменяет экспрессию. Агенты, которые изменяют количество различных сплайсированных вариантов, кодируемыхTCF7L2 (например, агент, который усиливает активность первого сплайсированного варианта и который ингибирует активность второго сплайсированного варианта), а также агенты, которые являются агонистами активности первого сплайсированного варианта и антагонистами второго сплайсированного варианта, могут быть легко идентифицированы с применением способов, описанных выше. В другом воплощении изобретения для оценки вклада тестируемого агента в активность полипептида в отношении связывающего TCF7L2 агента могут быть применены анализы. Например, клетка, которая экспрессирует соединение, взаимодействующее с полипептидом TCF7L2 (называемое здесь "агент,связывающий TCF7L2", который может быть полипептидом или другой молекулой, взаимодействующей прямо или непрямо с полипептидом TCF7L2, такой как член сигнального пути Wnt или член кадгеринового сигнального каскада), контактирует с TCF7L2 в присутствии тестируемого агента, и определяется способность тестируемого агента изменять взаимодействие между TCF7L2 и агентом, связывающимTCF7L2. Альтернативно, может быть использован клеточный лизат или раствор, включающий агент,связывающий TCF7L2. Агент, который связывается с TCF7L2 или TCF7L2 связывающий агент, изменяет взаимодействие, мешая ему, или усиливает способность TCF7L2 связываться или ассоциировать либо другим образом взаимодействовать с агентом, связывающим TCF7L2. Определение способности тестируемого агента связываться с TCF7L2 или агент, связывающий TCF7L2, может быть выполнено, к примеру, путем сопряжения тестируемого агента с радиоизотопом или ферментативной такой меткой, что связывание тестируемого агента с полипептидом может быть прямо или непрямо определено путем детекции меченого 125I, 35S, 14 С или 3 Н, а радиоизотоп определяется путем прямого счета радиоэмиссии или путем сцинтилляционного счета. Альтернативно, тестируемые агенты могут быть помечены ферментом,например пероксидазой из хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и ферментативная метка детектируется путем определения превращения подходящего субстрата в продукт. В рамках этого изобретения находится определение способности тестируемого агента взаимодействовать с полипептидом без мечения любых взаимодействующих компонентов. К примеру, для детектирования взаимодействия тестируемого агента с TCF7L2 или TCF7L2 связывающего агента без мечения тестируемого агента, TCF7L2 или TCF7L2 связывающего агента может применяться микрофизиометр. VcConnell, H.M. et al., Science. 257:1906-1912 (1992). Как это применяется здесь, "микрофизиометр" (например, Cytosensor) представляет собой аналитический инструмент, который измеряет скорость, с которой клетка закисляет свое окружение с применением чувствительного к свету потенциометрического сенсора (LAPS). Изменение в скорости закисления может применяться в качестве индикатора взаимодействия между лигандом и полипептидом. Таким образом, эти рецепторы могут быть полезны для скрининга соединений, которые являются агонистами или антагонистами, для их применения в лечении или исследовании чувствительности к диабету II типа. Могут быть созданы лекарства для регуляции активации TCF7L2, которые, в свою очередь,могут применяться для регуляции сигнальных путей и транскрипционных, происходящих ниже гена.- 23016397 В другом воплощении изобретения может быть применен анализ для идентификации полипептидов, которые взаимодействуют с TCF7L2. Например, для идентификации полипептидов, взаимодействующих с TCF7L2, может быть применена дрожжевая двухгибридная система (Fields, S. and Song, О.,Nature. 340:245-246 (1989. В такой дрожжевой двухгибридной системе конструируются векторы, основанные на гибкости транскрипционного фактора, который имеет два функциональных домена (ДНКсвязывающий домен и домен активации транскрипции). Если два домена разделены, но слиты в два различных белка, которые взаимодействуют друг с другом, может быть достигнута активация транскрипции и транскрипция специфического маркера (например, для идентификации присутствия взаимодействия и активации транскрипции могут применяться маркеры питательной среды, такие как His и Ade, или окрашенные маркеры, такие как lacZ). Например, в способе изобретения применяется первый вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую ДНК-связывающий домен, а также TCF7L2, сплайсированный вариант, или фрагмент, или производное этого, и применяется второй вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую домен активации транскрипции, а также нуклеиновую кислоту,кодирующую полипептид, который потенциально может взаимодействовать с TCF7L2 или сплайсированным вариантом, фрагментом или производным этого. Инкубация дрожжей, включающих первый вектор со вторым вектором в подходящих условиях (например, в условиях спаривания, таких как применяются в системе Matchmaker от Clontech (Palo Alto, California, USA), позволяет идентифицировать колонии, которые экспрессируют интересующий маркер. Эти колонии могут быть исследованы для идентификации полипептида(ов), которые взаимодействуют с TCF7L2 или его фрагментом или производным. Такие полипептиды могут применяться как агенты, которые изменяют активность экспрессии TCF7L2,как описано в отношении способов лечения. В более чем одном воплощении приведенного выше способа анализа настоящего изобретения может быть желательным иммобилизовать на твердой подложке либо TCF7L2 ген, либо белок TCF7L2,либо агент, который связывает TCF7L2 (например, другой член Wnt сигнального каскада или член кадгеринового сигнального пути) или другие компоненты анализа, для того чтобы облегчить разделение формы в виде комплекса от невзаимодействующих белков, а также для приспособления к автоматизации анализа. Связывание тестируемого агента с белком или взаимодействие белка со связывающим агентом в присутствии или в отсутствие тестируемого агента может быть выполнено в любом сосуде, подходящем для включения реактантов. Примеры таких сосудов включают пластины для микротитрования, пробирки или микроцентрифужные пробирки. В одном воплощении может быть обеспечен слитый белок (например, белок, слитый с глутатион-S-трансферазой), к которому добавлен домен, который позволяетTCF7L2, белку TCF7L2 или агенту, связывающему TCF7L2, быть связанным с матриксом или другой твердой подложкой. В другом воплощении модуляторы экспрессии молекул нуклеиновой кислоты изобретения идентифицируются способом, в котором клетка, клеточный лизат или раствор, включающий TCF7L2, контактирует с тестируемым агентом, и определяется экспрессия подходящей мРНК или полипептида (например,сплайсированного варианта(ов в клетке, лизате или растворе. Уровень экспрессии подходящей мРНК или полипептида(ов) сравнивается с уровнем экспрессии мРНК или полипептида(ов) в отсутствие тестируемого агента. Тестируемый агент может быть идентифицирован как модулятор экспрессии на основе этого сравнения. Например, когда экспрессия мРНК или полипептида больше (статистически значимо больше) в присутствии тестируемого агента, чем в его отсутствие, тестируемый агент идентифицируется как стимулятор или энхансер экспрессии мРНК или полипептида. Альтернативно, когда экспрессия мРНК или полипептида меньше (статистически значимо меньше) в присутствии тестируемого агента,чем в его отсутствие, тестируемый агент идентифицируется как ингибитор экспрессии мРНК или полипептида. Уровень экспрессии мРНК или полипептида в клетках может быть определен способами, описанными здесь для детектирования мРНК или полипептида. Дополнительно, изобретение относится к новым агентам, идентифицированным с помощью описанного выше скринирующего анализа. Соответственно в рамках настоящего изобретения далее применяется агент, идентифицированный, как описано здесь, в способах лечения, описанных здесь. Например,агент, идентифицированный, как описано здесь, может быть применен для изменения активности белка,кодируемого геном TCF7L2, или для изменения экспрессии TCF7L2 путем контактирования белка или нуклеиновой кислоты (или контактирования с клеткой, включающей полипептид или нуклеиновую кислоту) с агентом, идентифицированным, как описано здесь. Нуклеиновые кислоты изобретения. Нуклеиновые кислоты TCF7L2, их части и варианты. Настоящее изобретение относится также к молекулам изолированных нуклеиновых кислот, включающих человеческий TCF7L2. Молекулы нуклеиновой кислоты TCF7L2 настоящего изобретения могут быть РНК, например мРНК, или ДНК, такой как кДНК и геномная ДНК. Молекулы ДНК могут быть двутяжные или однотяжные, одноцепочечная РНК или ДНК может быть кодирующей или смысловой нитью либо некодирующей или антисмысловой нитью. Молекула нуклеиновой кислоты может включать всю или часть кодирующей последовательности гена и может дополнительно включать дополнительные некодирующие последовательности, такие как интроны и 3' и 5' некодирующие последовательности (вклю- 24016397 чая, к примеру, регуляторные последовательности). Дополнительно, молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут быть слиты с маркерной последовательностью, например последовательностью, которая кодирует полипептид, способствующий изоляции или очистке белка. Такие последовательности включают, но не ограничиваются, те, которые кодируют белок, слитый с глутатион-S-трансферазой (GST), и те, которые кодируют маркерный полипептид гемагглютинин А (НА) из вируса гриппа."Изолированная" молекула нуклеиновой кислоты, как это применяется здесь, является такой, которая отделена от нуклеиновых кислот, которые в норме фланкируют ген или нуклеотидную последовательность (как в геномных последовательностях) и/или были полностью или частично очищены от других транскрибируемых последовательностей (например, как в библиотеке РНК). К примеру, изолированная нуклеиновая кислота изобретения может, по существу, быть изолированной по отношению к комплексу клеточной среды, в которой она присутствует, или культуральной среды, когда она производится с помощью рекомбинантных методов, или химических предшественников, или других химических веществ, когда они синтезируются химическим путем. В некоторых случаях изолированный материал будет формировать часть композиции (например, грубый экстракт, включающий другие вещества) буферной системы или смешанных реагентов. В других обстоятельствах материал может быть очищен, по существу, до гомогенности, например, как определяется методом ЭФ в ПААГ колоночной хроматографии,такой как ВЭЖХ. Предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 50, 80 или 90% (на молярной основе) всех представленных видов макромолекул. По отношению к геномной ДНК термин "изолированная" также может относиться к молекулам нуклеиновых кислот, которые выделены из хромосомы, с которой геномная ДНК ассоциирована в природе. Например,молекула изолированной нуклеиновой кислоты может включать менее чем примерно 5 т.п.о., но не ограничиваться 4 т.п.о., 3 т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. или 0,1 т.п.о. нуклеотидов, которые фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой молекула нуклеиновой кислоты происходит. Молекула нуклеиновой кислоты может быть слита с другими кодирующими или регуляторными последовательностями и все еще рассматриваться как изолированная. Таким образом, рекомбинантная ДНК, содержащаяся в векторе, также включена в определение "изолированная", как это применяется здесь. Также молекулы изолированной нуклеиновой кислоты включают рекомбинантные молекулы ДНК в гетерологичных клетках-хозяевах, а также частично или по существу очищенные молекулы ДНК в растворе. Молекулы "изолированной" нуклеиновой кислоты включают также транскрипты РНК молекул ДНК настоящего изобретения in vivo и in vitro. Молекула изолированной нуклеиновой кислоты может включать молекулу нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты, которая синтезирована химическим или рекомбинантным способом. Следовательно, рекомбинантная ДНК, содержащаяся в векторе, включена в определение "изолированная", как оно применяется здесь. Также молекулы нуклеиновой кислоты включают рекомбинантные молекулы ДНК в гетерологичных организмах, а также частично или по существу очищенные молекулы ДНК а растворе. РНК транскрипты молекул ДНК настоящего изобретения in vivo и in vitro также включены в "изолированные" последовательности нуклеиновой кислоты. Такие изолированные молекулы нуклеиновой кислоты полезны при получении колируемого полипептида как зондов для выделения гомологичных последовательностей (например, из других видов млекопитающих) для картирования гена (например, путем гибридизации in situ с хромосомами) или для детектирования экспрессии гена в ткани (например, ткани человека), такого как анализ с помощью нозерн-блота или саузерн-блота. Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, которые не обнаружены в природе, но которые кодируют полипептид TCF7L2 или другие сплайсированные варианты полипептида TCF7L2 или полиморфных вариантов этого. Таким образом, к примеру, изобретение относится к молекулам ДНК, включающим последовательность, которая отличается от существующей в природе нуклеотидной последовательности, но которая благодаря вырожденности генетического кода кодирует полипептид TCF7L2 настоящего изобретения. Изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие части (фрагменты) или варианты полипептидов, такие как аналоги или производные полипептид TCF7L2. Такие варианты могут существовать в природе, например, в случае аллельных вариаций или SNP или неприродных, таких как те, что индуцированы воздействием различных мутагенов и мутагенных процессов. Обозначенные варианты включают, но не ограничиваются этим, вставки, делеции или замены одного или более нуклеотидов, которые могут приводить к консервативным или неконсервативным заменам аминокислот, включая вставки и делеции. Предпочтительно изменение нуклеотида(и/или полученной аминокислоты) является не проявляющимся или консервативным; это означает, что они не изменяют характеристик или активности полипептида TCF7L2. В одном аспекте последовательности нуклеиновой кислоты являются фрагментами, которые включают один или более полиморфных микросателлитных маркеров. В другом аспекте нуклеотидные последовательности являются фрагментами, которые включают один или более SNP в гене TCF7L2.- 25016397 Другие изменения молекул нуклеиновых кислот изобретения могут включать, например, мечение,метилирование, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные соединения (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы), заряженные соединения (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты), прикрепленные компоненты (например, полипептиды), интеркаляторы(например, акридин, псорален), хелаторы, алкиляторы и модифицированные соединения (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты). Включены также синтетические молекулы, которые имитируют молекулы нуклеиновой кислоты в способности связываться с указанной последовательностью через водородные связи и другие химические интеркаляторы. Такие молекулы включают, к примеру, те, в которых в скелете молекулы пептидные связи заменены на фосфатные связи. Изобретение относится также к молекулам нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации, таких как селективная гибридизация, с нуклеотидной последовательностью,описанной здесь (например, молекулами нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с последовательностью, кодирующей полипептиды, описанные здесь, и необязательно имеет активность полипептида). В одном аспекте изобретение включает варианты, описанные здесь, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации (например, при селективной гибридизации) с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или ее полиморфный вариант. В другом аспекте вариант, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации, имеет активность полипептида TCF7L2. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть обнаружены и/или изолированы путем специфической гибридизации (например, в жестких условиях гибридизации)."Специфическая гибридизация", как это применяется здесь, относится к способности первой нуклеиновой кислоты гибридизоваться со второй нуклеиновой кислотой таким способом, что первая нуклеиновая кислота не гибридизуется с любой нуклеиновой кислотой, иной, чем вторая нуклеиновая кислота (например, когда первая нуклеиновая кислота имеет более высокое подобие со второй нуклеиновой кислотой, чем с любой другой нуклеиновой кислотой в образце, где выполняется гибридизация)."Жесткие условия" гибридизации - это термин, применяемый специалистами, который относится к условиям инкубации и промывания, например, такие условия, как температура и концентрация буфера, которые позволяют осуществить гибридизацию определенной нуклеиновой кислоты с второй нуклеиновой кислотой: первая нуклеиновая кислота может быть полностью (т.е. на 100%) комплементарна второй или первая и вторая могут делить некоторую степень комплементарности, которая меньше, чем полная (например, 70, 75, 80, 85, 90, 95%). Например, могут быть применены определенные жесткие условия, которые позволяют безукоризненно разделить комплементарные нуклеиновые кислоты от таковых с меньшей комплементарностью. "Условия высокой жесткости", "условия средней жесткости" и "условия низкой жесткости", так же как и способы гибридизации нуклеиновых кислот, объяснены на страницах 2.10.12.10.16 и страницах 6.3.1-6.3.6 в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F., "Current Protocols in(1991. Процент гомологии или идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может быть определен путем выравнивания последовательностей для оптимальных целей сравнения(например, для оптимального выравнивания в первую последовательность могут быть введены пропуски). Затем нуклеотиды и аминокислоты в соответствующих позициях сравниваются, и процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных позиций,общих для двух последовательностей (т.е. % идентичности =идентичных позиций/общее количество позиций 100). Когда позиция в одной последовательности занимается тем же нуклеотидом или аминокислотным остатком, что и в соответствующей позиции другой последовательности, то молекулы являются гомологичными в этой позиции. Как это применяется здесь, "гомология" нуклеиновой кислоты или аминокислоты представляет собой эквивалент "идентичности" нуклеиновой кислоты или аминокислоты. В определенных аспектах длина последовательности, которая выровнена для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, например по меньшей мере 40%, в определенных аспектах по меньшей мере 60%, и в других аспектах по меньшей мере 70, 80, 90 или 95% от длины последовательности сравнения. Действительное сравнение двух последовательностей может быть выполнено хорошо известными способами, например с применением математических алгоритмов. Предпочтительный нелимитирующий пример такого математического алгоритма описан у Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873-5877(1993). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0), которые описаны уAltschul et al., Nucleic Acid Res. 25:389-3402 (1997). При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут применяться параметры дефолта соответствующих программ (например, NBLAST). В одном аспекте параметры для сравнения последовательностей могут быть установлены с баллами = 100, длиной слова = 12 или могут варьировать (например, W=5 или W=20). Другим предпочтительным нелимитирующим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Мейерса и Миллера (Myers and Miller,CABIOS 4(1):11-17 (1988. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для выравнивания последовательностей GCG (Accelrys, Cambridge, UK). Когда- 26016397 для сравнения последовательностей применяется программа ALIGN, могут быть применены параметры РАМ 120 взвешенной таблицы остатков, штраф за длину делеции 12, штраф за делению 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны специалисту и включают ADVANCE иPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-8 (1988). В другом аспекте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением пакета программ GCG с использованием либо матрикса BLOSUM,либо матрикса РАМ 250 и весом делеции 12, 10, 8, 6 или 4 и весом длины 2, 3 или 4. Еще в одном аспекте процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с применением программы GAP в пакете программ GCG с применением веса делеции 50 и веса длины 3. Настоящее изобретение обеспечивает также молекулы изолированных нуклеиновых кислот, которые включают фрагмент или часть, которая гибридизуется в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью TCF7L2 или комплементом такой последовательности, а также обеспечивает молекулы, которые включают фрагмент или часть, которая гибридизуется в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или полиморфный вариант этого. Фрагменты нуклеиновой кислоты изобретения имеют длину по меньшей мере примерно 15, предпочтительно по меньшей мере примерно 18, 20, 23 или 25 нуклеотидов и могут быть длиной 30,40, 50 100, 200 или более нуклеотидов. Более длинные фрагменты, например длиной 30 или более нуклеотидов, которые кодируют антигенные полипептиды, описанные здесь, являются особенно полезными,например, для генерации антител, как описано ниже. Зонды и праймеры. В родственном аспекте фрагменты нуклеиновой кислоты изобретения применяются как зонды и праймеры в анализах, таких как те, что описаны здесь. "Зонды" или "праймеры" - это нуклеотиды, которые гибридизуются специфическим по отношению к основаниям способом с комплементарной нитью молекул нуклеиновых кислот. Такие зонды и праймеры включают полипептид нуклеиновых кислот, как описано у Nielsen et al., Science. 254:1497-1500 (1991). Зонды и праймеры включают область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется по меньшей мере примерно с 15, например приблизительно 20-25 и в определенных аспектах примерно с 40,50 или 75 последовательными нуклеотидами молекулы нуклеиновой кислоты, включающей смежную нуклеотидную последовательность TCF7L2, или полиморфных вариантов этого. В других аспектах зонд или праймер включает 100 или несколько нуклеотидов, в определенных аспектах от 6 до 50 нуклеотидов,например от 12 до 30 нуклеотидов. В других аспектах зонд или праймер по меньшей мере на 70% идентичен смежной нуклеотидной последовательности или комплементарной нити смежной нуклеотидной последовательности, например по меньшей мере на 80% идентичен, в определенном аспекте по меньшей мере на 90% идентичен и в других аспектах по меньшей мере на 95% идентичен или даже способен селективно гибридизоваться с прилегающей нуклеотидной последовательностью или с нитью, комплементарной прилегающей нуклеотидной последовательности. Часто зонд или праймер дополнительно включает метку, например радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Молекулы нуклеиновой кислоты изобретения, такие как те, что описаны выше, могут быть идентифицированы и изолированы с применением стандартных методов молекулярной биологии, и при этом обеспечивается информация о последовательности. Например, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть амплифицированы и изолированы путем ПЦР с применением синтетических олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе последовательности TCF7L2 или последовательности, комплементарной ей, или созданных на основе нуклеотидных оснований последовательности, кодирующей одну или более аминокислотных последовательностей, обеспеченной при этом. См. в основном PCR Technology:(eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford и патент US 4683202). Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть амплифицированы с применением в качестве матрицы кДНК, мРНК или геномной ДНК, клонированы в подходящий вектор и охарактеризованы путем анализа последовательности ДНК. Другие подходящие способы амплификации включают лигазную цепную реакцию (LCR) (см. Wuand Wallace, Genomics. 4:560 (1989), Landegren et al., Science. 241:1077 (1988, амплификацию транскрипции (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1173 (1989 и самоподдерживаемую репликацию последовательности (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:1874 (1990 и амплификацию последовательности на основе нуклеиновой кислоты (NASBA). Последние два способа амплификации вовлекают изотермальную реакцию на основе изотермальной транскрипции, которая производит как одноцепочечную РНК (ssPHK), так и двухцепочечную РНК (ds-РНК) в качестве продуктов амплификации в соотношении примерно 30 или 100 к 1 соответственно.- 27016397 Амплифицированная ДНК может быть помечена, например, радиоактивными изотопами и применена как зонд для скрининга библиотеки кДНК, происходящей из клеток человека, мРНК в zap express,ZIPLOX или другом подходящем векторе. Соответствующие клоны могут быть изолированы, с последующим удалением in vivo может быть получена ДНК, и клонированная вставка может быть секвенирована в одной или обеих ориентациях способом, известным специалисту, для идентификации правильной рамки считывания полипептида подходящего молекулярного веса. Например, прямой анализ нуклеотидной последовательности молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может быть выполнен с применением хорошо известных способов, которые являются коммерчески доступными. См., например,Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York. 1989); Zyskind et al.,Recombinant DNA Laboratory Manual (Acad Press, 1988). Дополнительно, для анализа нуклеиновых кислот и полипептидов полезны также флуоресцентные методы (Chen et al., Genome Res, 9, 492 (1999. С применением этих или похожих методов могут быть изолированы, секвенированы и дополнительно охарактеризованы полипептид и ДНК, кодирующая полипептид. Антисенс-молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут быть придуманы с применением нуклеотидной последовательности TCF7L2 и/или комплементарной ей или ее части, сконструированы с применением химического синтеза и реакций ферментативного лигирования с применением процедур,известных в данной области. Например, антисенс-молекула нуклеиновой кислоты (например, антисенснуклеотид) может быть синтезирована химическим путем с применением природных нуклеотидов или различных модифицированных нуклеотидов, задуманных для увеличения биологической стабильности молекул или для увеличения физической стабильности дуплекса, сформированного между антисенс и смысловой нуклеиновыми кислотами, например могут быть применены фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды. Альтернативно, антисенс-молекула нуклеиновой кислоты может быть получена биологически с применением экспрессионного вектора, в котором молекула нуклеиновой кислоты была субклонирована в антисенс-ориентации (т.е. РНК, транскрибированная с встроенной молекулой нуклеиновой кислоты, будет в антисенс-ориентации по отношению к интересующей нуклеиновой кислоте-мишени). Последовательности нуклеиновых кислот могут также применяться для сравнения с последовательностями эндогенной ДНК у пациентов для идентификации одного или более расстройств, описанных выше, и как зонды, например, для гибридизации и открытие последовательностей родственных ДНК или для вычитания известных последовательностей из образца. Последовательности нуклеиновых кислот могут дополнительно применяться для извлечения праймеров при генетическом фингерпринтинге, для выработки антиполипептидных антител с применением технологии иммунизации ДНК и как антиген для выработки анти-ДНК антител или вызывания иммунного ответа. Части или фрагменты нуклеотидных последовательностей, идентифицированные здесь (и соответствующие полные последовательности гена) могут применяться многими путями, например как полинуклеотидный реагент. К примеру, эти последовательности могут использоваться для (i) картирования соответствующих им генов в хромосоме, и таким образом, для выявления локализации областей гена, ассоциированных с генетическим заболеванием; (ii) идентификации индивидуума исходя из мельчайшего образца (типирование ткани) и (iii) помощи при судебной идентификации биологического образца. Дополнительно, нуклеотидные последовательности могут применяться для идентификации и экспрессии рекомбинантных полипептидов для анализа, характеристики или терапевтического применения или как маркеры для тканей, в которых экспрессируются соответствующие полипептиды либо конститутивно во время дифференциации ткани, либо при заболевании. Последовательности нуклеиновых кислот могут дополнительно применяться как реагенты в скрининге и/или диагностических анализах, описанных здесь, и могут также включаться как компоненты в наборы (например, наборы реактивов) для применения в скрининге и/или в диагностических анализах,описанных здесь. Наборы (например, наборы реактивов), полезные в способах диагностики, включают компоненты,полезные в любых методах, описанных здесь, включая, к примеру, зонды или праймеры для гибридизации, как описано здесь (например, меченые зонды или праймеры), реагенты для детекции меченых молекул, рестрикционные ферменты (например, для RFLP анализа), аллель-специфичные олигонуклеотиды,антитела, которые связываются с измененным или с неизмененным (нативным) полипептидом TCF7L2,средства для амплификации нуклеиновых кислот, включая нуклеиновую кислоту TCF7L2, или для частиTCF7L2 или средства для анализа последовательности нуклеиновой кислоты или для анализа аминокислотной последовательности полипептида TCF7L2, как описано здесь, и т.д. В одном аспекте, набор реагентов для диагностики восприимчивости к диабету II типа может включать праймеры для амплификации области нуклеиновой кислоты TCF7L2, включающей маркер DG10S478, SNP rs12255372, rs7895340,rs11196205, rs7901695, rs7903146, rs12243326 и/или rs4506565, или гаплотип риска, который более часто представлен у индивидуумов, имеющих диабет II типа, или которые восприимчивы к диабету II типа. Праймеры могут быть сконструированы с применением частей нуклеиновых кислот, фланкирующихSNP, которые являются индикаторами диабета II типа.- 28016397 Векторы и клетки-хозяева. Другой аспект настоящего изобретения относится к конструктам нуклеиновой кислоты, включающим молекулы нуклеиновой кислоты, описанные здесь, и комплементарные им молекулы (или часть этого). Конструкты включают вектор (например, экспрессионный вектор, в который встроена последовательность изобретения в смысловой или антисенс-ориентации). Как применяется здесь, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту,с которой она была связана. Один тип векторов является "плазмидой", термин, который относится к циклической двутяжной петле ДНК, с которой может быть лигирован дополнительный сегмент ДНК. Другим типом векторов является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы с вирусным геномом. Определенные векторы способны к автономной репликации в клеткаххозяевах, в которые они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при интродукции в клетку-хозяин и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Экспрессионные векторы способны к направленной экспрессии генов, с которыми они операбельно связаны. В основном экспрессионные векторы, полезные в рекомбинантных технологиях ДНК, часто являются плазмидами. Однако изобретение намерено включить такие другие формы экспрессионных векторов, как вирусные векторы(например, дефективные по репликации ретровирусы, аденовирусы и вирусы, ассоциированные с аденовирусами), которые имеют эквивалентные функции. В определенных аспектах векторы рекомбинантной экспрессии изобретения включают молекулу нуклеиновой кислоты изобретения в форме, подходящей для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Это означает, что векторы рекомбинантной экспрессии включают один или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток хозяина для применения при экспрессии,которые операбельно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии "операбельно связанный" или "оперативно связанный" предназначается для обозначения того, что интересующая нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) способом, который позволяет обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности (например, система транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине,когда вектор интродуцирован в клетку-хозяин). Термин "регуляторная последовательность" предназначен для включения промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов экспрессии (например,сигналов полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, к примеру, у Goeddel,"Gene Expression Technology", Methods in Enzymology. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалист оценит, что конструирование экспрессионных векторов может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая должна быть трансформирована, и уровня экспрессии желаемого полипептида. Экспрессионные векторы изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для производства таким образом полипептидов, включая слитые полипептиды, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, как описано здесь. Векторы рекомбинантной экспрессии изобретения могут быть сконструированы для экспрессии полипептида изобретения в клетках прокариот и эукариот, например в бактериальных клетках, таких как клетки Е.coli, клетках насекомых (с применением бакуловирусного вектора экспрессии), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно уGoeddel, supra. Альтернативно, векторы рекомбинантной экспрессии могут быть транскрибированы и транслированы in vitro, например, с применением регуляторных последовательностей промотора Т 7 и Т 7 полимеразы. Другой аспект изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был интродуцирован вектор рекомбинантной экспрессии. Термины "клетка-хозяин" и "рекомбинантная клетка-хозяин" применяются здесь как взаимозаменяемые. Понятно, что такие термины относятся не только к определенным клеткам субъектам, но также к потомкам или потенциальным потомкам такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут иметь место определенные модификации, обусловленные либо мутациями, либо воздействием окружающей среды, такие потомки фактически могут не быть идентичны родительской клетке, но они еще включены в рамки термина, как он применяется здесь. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, молекула нуклеиновой кислоты изобретения может быть экспрессирована в бактериальных клетках (например, Е.coli), клетках насекомых, клетках дрожжей или млекопитающих (таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетках COS). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам. Вектор ДНК может быть интродуцирован в прокариотическую или эукариотическую клетку с применением традиционных методов трансформации или трансфекции. Как это применяется здесь, термины"трансформация" и "трансфекция" предназначены для отсылки ко многим известным специалистам ме- 29