Антитела против бета-амилоидного пептида

ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Раскрыты антитела, которые связывают человеческий -амилоидный пептид; способы лечения указанными антителами заболеваний или расстройств, отличающихся повышенными уровнями амилоида или отложениями -амилоида; фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела; и способы получения антител. Бербидж Стивен Энтони, Эллис Джонатан Генри, Форд Сюзанна К.,Гермашевски Фолькер, Кумар Умеш,Филпотт Карен Луиз, Соден Питер Эрнест (GB) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) Примечание: библиография отражает состояние при переиздании(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) 015654 Область изобретения Изобретение относится к антителам, которые связываются с -амилоидным пептидом и, в частности, с человеческим -амилоидным пептидом. Настоящее изобретение также относится к способам лечения указанными антителами заболеваний или расстройств, отличающихся повышенными уровнями амилоида или отложениями -амилоида, особенно болезни Альцгеймера; к фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к способам изготовления. Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания. Предшествующий уровень техники Болезнь Альцгеймера (AD) является самой распространенной причиной возрастного когнитивного ухудшения, затрагивающей более 12 миллионов человек во всем мире (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5,Suppl 1055-1057). Ранние стадии данного заболевания характеризуются прогрессирующей потерей памяти с ассоциированным когнитивным ухудшением и расстройствами речи и поведения. На более поздних стадиях заболевания у пациентов развивается тотальная амнезия и значительно снижается двигательная функция. Смерть обычно наступает через 9 лет после установления диагноза и часто ассоциирована с другими состояниями, обычно с пневмонией (Davis K.L. and Samules S.C. (1998) в Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. and Coyle J.T. (McGraw-Hill, New-York pp. 267-316. Существующие способы терапии представляют собой симптоматические подходы, направленные на ослабление когнитивного ухудшения и уменьшение поведенческих симптомов, ассоциированных с этиологией прогрессирующего заболевания. На практике эти способы лечения обеспечивают только кратковременный положительный эффект в отношении когнитивных способностей при уровне когнитивного ухудшения, описываемого только для последних 1-2 лет. Потенциал модифицирующей заболевание терапии, которая замедляет или, возможно, останавливает прогрессирование заболевания, огромен. Такие подходы могут обеспечить радикальное и длительное улучшение качества жизни пациентов и, что важно, их профессиональной деятельности, а также снизить огромные расходы на медицинскую помощь при этом заболевании. Клиническая диагностика болезни Альцгеймера основана на комбинации физических и психических тестов, которые приводят к диагностике возможной или предположительной болезни Альцгеймера. При вскрытии трупа заболевание подтверждают с помощью очень характерных неврологических признаков в мозге, включающих отложение А в паренхиматозных бляшках и сосудах головного мозга, образование внутри нейронов нейрофибриллярных клубочков, уменьшение количества синапсов и уменьшение количества субпопуляций нейронов в конкретных участках мозга (Terry, RD (1991) J Neural TransSuppl 53: 141-145). Множество генетических, гистологических и функциональных признаков позволяет предположить,что -амилоидный пептид (A) является ключевым для прогрессирования болезни Альцгеймера (Selkoe,D.J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766). Известно, что А продуцируется посредством расщепления белка-предшественника бета-амилоида(также известного как АРР) ферментом аспартилпротеазой, известным как ВАСЕ 1 (также известным как-секретаза, Asp2 или Memapsin-2) (De Strooper, В. and Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). Помимо отложения в паренхиме и сосудах, постулируют, что растворимые олигомерные формы А вносят вклад в развитие AD, и они могут влиять на нервную функцию на ранней стадии посредством нарушения синаптической функции (Lambert et al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95: 6448-6453). Несмотря на то, что нерастворимые амилоидные бляшки обнаруживаются на ранних стадияхAD и MCI (умеренное когнитивное расстройство), уровни растворимых агрегатов А (известных как олигомеры или А-происходящие диффундирующие лиганды (ADDL у этих индивидуумов также увеличены, и уровни растворимого А лучше коррелируют с нейрофибриллярной дегенерацией и потерей синаптических маркеров, чем с амилоидными бляшками (Naslund et al. (2000) J Am Med Assoc 283: 15711577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1:8-19). Высоко амилоидогенный АР 42 и укороченные по аминоконцу формы Ах-42 являются преобладающими разновидностями А, которые обнаруживаются и в диффузных, и в сенильных бляшках (Iwatsubo, Т (1994) Neuron. 13: 45-53; Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270: 7013-7016). Относительные уровни А 42, по-видимому, являются ключевым регулятором агрегации А в амилоидные бляшки, и, действительно, как было показано, А 42 легче агрегирует in vitro, чем другие формы А (Jarret, JT (1993) Biochemistry 32: 4693-4697), и А 42 сам по себе вовлечен в патогенез AD в качестве инициирующей молекулы (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92: 289-292). Несмотря на то,что А 42 является минорным продуктом метаболизма АРР, небольшие изменения в его продукции ассоциированы со значительными эффектами на отложение А; поэтому постулировано, что уменьшение только А 42 может быть эффективным способом лечения AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris).92: 289-292). В подтверждение этого сообщили о том, что мутации в генах белка-предшественника амилоида(АРР) и пресенилина преимущественно увеличивают относительные уровни А 42 и, таким образом, сокращают период времени до начала болезни Альцгеймера (AD) (Selkoe D.J., Podlisny МБ. (2002) Annu.Rev. Genomics Hum. Gemet. 3: 67-99). Однако следует отметить, что скорость отложения также зависит-1 015654 от катаболизма и клиренса А. Животные модели амилоидного отложения были созданы посредством сверхэкспрессии мутантных человеческих трансгенов у мышей. Мыши, сверхэкспрессирующие только трансгены человеческого АРР,обычно демонстрируют развитие церебральных бляшкоподобных -амилоидных отложений с 12 месячного возраста (Games D. Et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99102, тогда как мыши, несущие трансгены и мутантного человеческого АРР, и пресенилина-1 (PS-1),обычно демонстрируют развитие церебральных бляшкоподобных -амилоидных отложений уже в 2 месячном возрасте (Kurt M.A. et al., (2001) Exp. Neurol. 171: 59-71; McGowan E. etal., (1999) Neurolbiol.Dis. 6: 231-244). Все более очевидным становится тот факт, что транспорт экзогенного А между центральной нервной системой (ЦНС) и плазмой играет роль в регуляции уровней амилоида в мозге (Shibata, et al (2000) JClin Invest 106: 1489-1499), причем А ЦСЖ (спинномозговая жидкость) быстро транспортируется из ЦСЖ в плазму. Поэтому активная вакцинация пептидами А или пассивное введение специфических антител к А быстро связывает периферический А, изменяя динамическое равновесие между плазмой,ЦСЖ и, в конечном итоге, ЦНС. В действительности в настоящее время существует множество исследований, демонстрирующих, что оба эти подхода могут снижать уровни А, уменьшать Аассоциированную патологию и обеспечивать полезный когнитивный эффект в различных трансгенных моделях амилоидоза. Также были проведены ограниченные исследования на высших видах. Карибских зеленых мартышек (в возрасте 10-16 лет) иммунизировали А-пептидом в течение 10 месяцев. Уровни А 40 в плазме увеличивались в 2-5 раз с пиком на 251-е сутки, тогда как уровни А 40 и А 42 в ЦСЖ значительно уменьшались к 100-м суткам и возвращались впоследствии к исходному уровню. Это снижение в ЦСЖ сопровождалось значительным снижением бляшечной нагрузки (Lemere, CA (2004) Am JPathology 165: 283-297). Похожее повышение уровней А в плазме также определяли после иммунизации зрелых (15-20 лет) макак-резусов (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18: 44-46). Первым средством иммунной терапии, нацеленной на амилоид мозга, была активная вакцинаElan/Wyeth's AN-1792. Эта терапия была прекращена после развития клинических признаков, согласующихся с менингоэнцефалитом. Анализы подгрупп позволили предположить, что лечение замедляло ухудшение когнитивных функций (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1: 84-85). Посмертный анализ пациентов также подтвердил устранение бляшек (Gilman S. et ai. (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562). Было показано, что пассивная терапия с использованием MAb (моноклональное антитело) бапинеузумаба (ААВ 001, Elan/Wyeth) значительно улучшает когнитивные показатели в фазе I небольшого исследования безопасности. Другие заболевания и расстройства, характеризующиеся повышенными уровнями -амилоида или отложениями -амилоида, включают умеренное когнитивное расстройство (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversation from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease:Oct 2006), наследственную церебральную геморрагию с -амилоидозом по голландскому типу, церебральную -амилоидную ангиопатию и различные типы дегенеративных деменций, таких как те, которые ассоциированы с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикобазальной дегенерацией и болезнью Альцгеймера с диффузными тельцами Леви (Mollenhauer В (2007) JNeural Transm e-published 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5: 655-60), и синдром Дауна (Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254: 22-7). Краткое изложение сущности изобретения В одном воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-12 (SEQ ID NO:15) с константой равновесия KD менее 100 пМ, но не связывается с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пептида, иммобилизованного на стрептавидиновом чипе. В другом воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-12 (SEQ ID NO:15) с константой равновесия KD менее 100 пМ и имеет константу равновесия KD для связывания с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), которая в 1000 раз больше, чем KD для пептида 1-12 (SEQ ID NO:15), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пептида, иммобилизованного на стрептавидиновом чипе. В другом воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-12 (SEQ ID NO:15) с константой равновесия KD менее 100 пМ и имеет константу равновесия KD для связывания с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), которая в 10000-2 015654 раз больше, чем KD для пептида 1-12 (SEQ ID NO:15), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пептида, иммобилизованного на стрептавидиновом чипе. В одном аспекте анализ методом поверхностного плазменного резонанса с использованием пептида, иммобилизованного на стрептавидиновом чипе, представляет собой анализ методом поверхностного плазмонного резонанса, описанный в Примере ниже. Согласно другому аспекту анализ методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пептида, иммобилизованного на стрептавидиновом чипе, представляет собой Способ A(i), описанный в рамках анализа SPR Biacore ниже. В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело,представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-40 с константой равновесия KD менее 10 нМ, но не связывается с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса, описанного в способе Б в примерах ниже. В другом альтернативном воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-40 с константой равновесия KD менее 10 нМ и имеет константу равновесия KD для связывания с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), которая в 1000 раз больше, чем KD для пептида 1-12 (SEQ ID NO:15), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса, описанного в способе Б в примерах ниже. В другом альтернативном воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом 1-40 с константой равновесия KD менее 10 нМ и имеет константу равновесия KD для связывания с -амилоидным пептидом 2-13 (SEQ ID NO:44), которая в 10000 раз больше, чем KD для пептида 1-12 (SEQ ID NO:15), где оба определения осуществляют методом поверхностного плазмонного резонанса, описанного в способе Б в примерах ниже. В одном воплощении настоящего изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и/или производное, которое связывается с -амилоидным пептидом и которое содержит следующие CDR (области, определяющие комплементарность):CDRH3: GTWFAY (SEQ ID NO:3) в вариабельной области человеческой тяжелой цепи, происходящей из семейства генов VH3, иCDRL3: SQTRHVPYT (SEQ ID NO:6) в вариабельной области человеческой легкой цепи, происходящей из аминокислотной последовательности, раскрытой в GenPept номер САА 51135 (SEQ ID NO:24). На всем описании термины "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" следуют системе нумерации Kabat, как изложено в Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987. Поэтому следующее определяет CDR согласно изобретению: Номенклатура семейства генов VH3 и генов родственных иммуноглобулинов описана у Matsuda etal (Journal of Experimental Medicine, 188: 2151-2162, 1998) и LefrancLefranc (The Immunoglobulin Factsbook. 2001. Academic Press: London). В конкретном воплощении вариабельная область человеческой тяжелой цепи происходит изV-гена, выбранного из следующей подгруппы членов семейства VH3: VH3-48, VH3-21, VH3-11,VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9 и VH3-43;V-гена, выбранного из следующей подгруппы членов семейства VH3: VH3-48, VH3-21 и VH3-11; гена VH3-48 или его аллеля. Последовательность в GenBank номер М 99675 представляет собой аллель гена VH3-48. М 99675 представляет собой нуклеотидную последовательность Genbank геномной части ДНК, включающую два экзона, составляющие ген VH3-48 (SEQ ID NO:22) человеческой тяжелой цепи, и кодирует аминокис-3 015654 лотную последовательность вариабельной области, представленную в SEQ ID NO:21. В конкретном аспекте каркасная область человеческой акцепторной тяжелой цепи происходит из М 99675. Для того чтобы сконструировать полную V-область, каркасную область 4 следует добавить к кодируемому в зародышевой линии V-гену М 99675. Подходящие последовательности каркасной области 4 включают последовательности, кодируемые человеческим минигеном JH4 (Kabat):YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) где первые четыре остатка, подпадающие под область CDR3, замещены экзогенной CDR из донорного антитела. Специалист понимает, что V-ген и J-ген зародышевой линии не содержат кодирующую последовательность для всей CDR3 тяжелой цепи. Однако в антителах по изобретению последовательность CDR3 предоставлена донорным иммуноглобулином. Соответственно, комбинация VH-гена, такого как VH3-48,минигена JH, такого как JH4, и группы CDR тяжелой цепи, таких как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQID NO:3 (скомбинированных таким образом, чтобы замаскировать зрелую, полностью перегруппированную вариабельную область тяжелой цепи), является достаточной для определения вариабельной области тяжелой цепи по изобретению, такой как представлено в SEQ ID NO:26, 28, 30. Вариабельная область, кодируемая в Genpept ID CAA51134, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24. Последовательность каркасной области вариабельной области легкой цепи, известная как GenPeptID CAA51134, представляет собой выведенную аминокислотную последовательность полностью перегруппированной вариабельной области легкой цепи и идентична другой аминокислотной последовательности с такими же каркасными областями в базе данных (идентификационный номер по Genpept S40356) и описана в Klein, R., et al., Eur. J. Immunol. 23 (12), 3248-3262 (1993). ДНК, кодирующая последовательность САА 51134, доступная как идентификационный номер Genbank X72467, представлена в виде SEQID NO:25. В конкретном аспекте изобретения каркасная область человеческой акцепторной тяжелой цепи происходит из М 99675 и минигена JH4, а каркасная область человеческой акцепторной легкой цепи происходит из САА 51135, возможно содержащих одну или более, например, от одной до четырех, более конкретно от одной до трех замен аминокислотных остатков на основе соответствующих остатков, обнаруженных в донорном VH-домене, имеющем последовательность SEQ ID NO:17, и в донорном VLдомене, имеющем последовательность SEQ ID NO:19, которые сохраняют всю или по существу всю аффинность связывания донорного антитела с -амилоидным пептидом. Фраза "по существу всю аффинность связывания" означает, что терапевтическое антитело имеет не более чем десятикратное снижение аффинности связывания по сравнению с донорным антителом. В более конкретном аспекте каркасная область человеческой акцепторной тяжелой цепи, происходящей из М 99675 и JH4, имеет от одной до четырех замен аминокислотных остатков, выбранных из положений 24, 48, 93 и/или 94 (нумерация по Kabat). В еще более конкретном аспекте изобретения каркасная область человеческой акцепторной тяжелой цепи, происходящей из М 99675 и JH4, содержит следующие остатки (или их консервативные замены): Согласно одному воплощению изобретения предложено терапевтическое антитело, содержащее цепь VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:26, 28 или 30, и VL-домен, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:32. В другом воплощении изобретения предложено терапевтическое антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:34, 36 или 38, и легкую цепь, имею-4 015654 щую последовательность, представленную в SEQ ID NO:40. В другом воплощении изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтическое антитело по изобретению. Согласно еще одному воплощению изобретения предложен способ лечения пациента-человека,страдающего заболеванием, ассоциированным с -амилоидным пептидом, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества терапевтического антитела по изобретению. Также предложено применение терапевтического антитела по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с -амилоидным пептидом. В другом воплощении изобретения предложен способ изготовления терапевтического антитела по изобретению, включающий экспрессию полинуклеотида, кодирующего антитело, в клетке-хозяине. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь терапевтического антитела, содержащую цепь VH, имеющую последовательность, представленную в SEQ IDNO:26, 28 или 30. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий легкую цепь терапевтического антитела, содержащую VL-домен, имеющий последовательность, представленную в SEQ IDNO:32. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь терапевтического антитела, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:34, 36 или 38. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий легкую цепь терапевтического антитела, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:40. В более конкретном воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь терапевтического антитела, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, 37,39 или 42. В другом более конкретном воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий легкую цепь терапевтического антитела, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:41 или 43. В конкретном воплощении у терапевтического антитела, которое представляет собой антитело или его фрагмент и/или производное, по существу отсутствуют функции а) активации комплемента по классическому пути и б) опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности. В другом воплощении изобретения предложено антитело или его фрагмент, содержащий VH-домен,имеющий последовательность SEQ ID NO:17, и VL-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:19. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, содержащий VH-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:17, в частности полинуклеотид SEQ ID NO:18. В другом воплощении изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела или ее фрагмент, содержащий VL-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:19, в частности полинуклеотид SEQ ID NO:20. Подробное описание сущности изобретения 1. Структуры антител. 1.1. Интактные антитела. Интактные антитела обычно представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелых и две легких цепи. За исключением IgM, интактные антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Обычно каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью с помощью одной ковалентной дисульфидной связи, в то время как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в различных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеют внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) и константную область на другом ее конце; константная область легкой цепи выровнена с первой константной областью тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи антител большинства позвоночных видов могут быть причислены к одному из двух типов, называемых Каппа и Лямбда, на основе аминокислотной последовательности константной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей человеческие антитела можно причислить к пяти различным классам: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA можно дополнительно подразделить на подклассы: lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4; и lgA1 и lgA2. Существуют видовые варианты у мыши и крысы, которые имеют по меньшей мере lgG2a, IgGb. Вариабельный домен антитела посредством определенных областей, демонстрирующих особую вариабельность и именуемых как определяющие комплементарность области (CDR), обеспечивает специфичность связывания антитела. Более консервативные участки вариабельной области называют каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов интакт-5 015654 ных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, соединенных тремя CDR. CDR в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от FR областей, и CDR другой цепи способствует формированию антигенсвязывающего участка антител. Константные области не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), фагоцитоз посредством связывания с Fc-рецептором, периода полувыведения/иммунный клиренс через неонатальный Fcрецептор (FcRn) и комплементзависимая цитотоксичность через C1q-компонент каскада комплемента. Константная область человеческого lgG2 не обладает способностью активировать комплемент по классическому пути или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Константная область человеческого lgG4 не обладает способностью активировать комплемент по классическому пути и опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность очень слабо. Антитела, по существу не обладающие этими эффекторными функциями, можно обозначить как "нелитические" антитела. 1.1.1. Человеческие антитела. Человеческие антитела могут быть получены с помощью ряда способов, известных специалисту в данной области. Человеческие антитела могут быть получены гибридомным способом с использованием клеточных линий человеческой миеломы или гетеромиеломы мышь-человек (см. Kozbor J. Immunol. 133,3001, (1984) и Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Альтернативные способы включают применение фаговых библиотек или трансгенных мышей, в которых используют репертуары человеческой V-области (см. Winter G, (1994), Annu. Rev.Immunol. 12, 433-455, Green LL (1999), J. Immunol. Methods 231, 11-23). В настоящее время доступны несколько штаммов трансгенных мышей, где их локусы мышиных иммуноглобулинов заменены генными сегментами человеческих иммуноглобулинов (см. Tomizuka K,(2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild D.M. (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851, Mendez MJ, 1997, NatureGenetics, 15, 146-156). При антигенной стимуляции такие мыши способны продуцировать репертуар человеческих антител, из которых можно выбрать интересующие антитела. Особо следует отметить систему Trimera (см. Eren R et al, (1998) Immunology 93: 154-161), в которой человеческие лимфоциты трансплантируют облученным мышам; систему селекции лимфоцитарных антител (SLAM, см. Babcook et al, PNAS (1996) 93: 7843-7848), в которой лимфоциты человека (или других видов) эффективно подвергают процедуре получения крупного пула антител in vitro, после чего следуют обратная фильтрация, серийное разведение и процедура селекции, и Xenomouse II (Abgenix Inc.). Альтернативный подход имеется в Morphotek Inc, использующей технологию Morphodoma. Для продукции человеческих антител (и их фрагментов) может быть использована технология фагового дисплея (см. McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) и Griffiths AD et al (1994) EMBO 13: 32453260). Согласно этому методу гены V-домена антитела клонируют в каркасной области в ген либо главного, либо минорного оболочечного белка нитевидного бактериофага, такого как М 13 или fd и представлены (обычно с помощью фага-помощника) в качестве функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Селекция на основе функциональных свойств антитела приводит к отбору гена, кодирующего антитело, демонстрирующего эти свойства. Метод фагового дисплея может быть использован для селекции антиген-специфических антител из библиотек, полученных из человеческих Вклеток, взятых от индивидуумов, страдающих вышеописанными заболеваниями или расстройствами,или, альтернативно, от иммунизированных доноров-людей (см. Marks; J. Mol.Bio. 222, 581-597, 1991). Когда желательно получить интактное человеческое антитело, содержащее Fc-домен, необходимо повторно клонировать фрагмент, полученный с помощью фагового дисплея, в экспрессирующие векторы млекопитающих, содержащие желаемые константные области и дающие стабильно экспрессирующие клеточные линии. Для улучшения аффинности связывания может быть использован метод созревания аффинности(Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992, в котором аффинность первичного человеческого антитела улучшают посредством последовательного замещения V-областей Н- и L-цепей природными вариантами и селекции на основе улучшенных аффинностей связывания. Варианты этого метода, такие как "эпитопный импринтинг", также доступны в настоящее время (см. WO 93/06213, см. также Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993. 1.2. Химерные и гуманизированные антитела. Применение интактных антител, не являющихся человеческими, в лечении заболеваний или расстройств у человека связано с хорошо обоснованными в настоящее время проблемами их потенциальной иммуногенности, особенно при повторном введении антитела, которые заключаются в том, что иммунная система пациента может распознавать нечеловеческое интактное антитело как чужеродное и развить нейтрализующий ответ. Помимо разработки полностью человеческих антител (см. выше) за последнее время были разработаны различные способы преодоления этих проблем, обычно включающие преобразование структуры нечеловеческих аминокислотных последовательностей в интактное терапевтическое антитело с сохранением относительной простоты получения нечеловеческих антител от иммунизированных животных, например мыши, крысы или кролика. Для достижения этого широко использовали два-6 015654 подхода. Первый представляет собой химерные антитела, обычно содержащие нечеловеческий (например, грызуна, такого как мышь) вариабельный домен, слитый с человеческой константной областью. Поскольку антигенсвязывающий участок антитела локализован в вариабельных областях, химерное антитело сохраняет свою аффинность связывания с антигеном, но приобретает эффекторные функции человеческой константной области и поэтому способно осуществлять такие эффекторные функции, которые описаны выше. Химерные антитела обычно получают с использованием методов рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующую антитела (например, кДНК), выделяют и секвенируют с использованием стандартных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими вариабельные области Н- и L-цепей антитела по изобретению, например ДНК из SEQ ID NO:18 и 20, описанных выше). Обычным источником такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК помещают в экспрессирующий вектор, который затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как Е. coli, клетки COS, клетки СНО, клетки PerC6 или клетки миеломы, которые в других обстоятельствах не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для получения синтеза антитела. ДНК можно модифицировать посредством замены кодирующей последовательности человеческих Н- иL-цепей на соответствующие нечеловеческие (например, мышиные) Н- и L-константные области (см.,например, Morrison; PNAS 81, 6851 (1984. Таким образом, в другом воплощении изобретения предложено химерное антитело, содержащее VH-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:17, и VLдомен, имеющий последовательность SEQ ID NO:19, слитые с человеческой константной областью (которая может иметь изотип IgG, например lgG1). Второй подход включает получение гуманизированных антител, при котором нечеловеческую структуру антитела уменьшают посредством гуманизации вариабельных областей. Популярность приобрели два способа гуманизации. Первый представляет собой гуманизацию посредством переноса CDR.CDR образуют петли на N-конце антитела, где они образуют поверхность, размещенную в каркасе, образованном каркасными областями. Антигенсвязывающая специфичность антитела в основном определяется топографией и химическими характеристиками его CDR-поверхности. Эти свойства, в свою очередь, определены конформацией индивидуальных CDR, относительным расположением CDR и характером и расположением боковых цепей остатков, содержащих CDR. Значительное снижение иммуногенности может быть достигнуто переносом только CDR нечеловеческих (например, мышиных) антител ("донорное" антитело) на подходящую человеческую каркасную область ("акцепторная каркасная область") и константные области (см. Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 и Verhoeyen M et al (1988) Science 239,1534-1536). Однако перенос CDR сам по себе может не привести к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто находят, что некоторые остатки каркасной области донорного антитела необходимо сохранить (иногда их называют "обратными мутациями") в гуманизированной молекуле, если необходимо получить значительную аффинность связывания с антигеном (см. Queen С et al (1989) PNAS 86, 10029-10033, Со, М et al (1991) Nature 351, 501-502). В этом случае для получения человеческой каркасной области (FR) из базы данных можно выбрать человеческие V-области, демонстрирующие наибольшую гомологию последовательности (обычно 60% или более) с нечеловеческим донорным антителом. Выбор человеческих FR может быть осуществлен либо из консенсусных, либо из индивидуальных человеческих антител. При необходимости, для сохранения конформаций CDR ключевые остатки из донорного антитела заменяют в человеческой акцепторной каркасной области. Для облегчения идентификации таких структурно важных остатков может быть использовано компьютерное моделирование антитела (см. WO 99/48523). Альтернативно, гуманизации можно достичь с помощью процесса "маскировки". Статистический анализ уникальных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей человеческого и мышиного иммуноглобулинов показал, что определенные паттерны экспонированных остатков в человеческих и мышиных антителах различаются, и наиболее характерные поверхностные положения имеют выраженное предпочтение к небольшой группе различных остатков (см. Padlan E.A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28,489-498 и Pedersen J.T. et al (1994) J. Mol. Biol, 235; 959-973). Поэтому можно уменьшить иммуногенность нечеловеческого Fv путем замены экспонированных остатков в его каркасных областях, которые отличаются от остатков, обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. Поскольку белковая антигенность может коррелировать с поверхностной доступностью, замена поверхностных остатков может быть достаточной для придания "невидимости" мышиной вариабельной области для человеческой иммунной системы (см. также Mark G.E. et al (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: Thepharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, рр.105-134). Этот способ гуманизации известен как "маскировка", поскольку изменена только поверхность антитела, а поддерживающие остатки остаются незатронутыми. Другие альтернативные подходы включают подходы, изложенные в WO 04/006955, и способ Humaneering (Kalobios), при котором используют бактериальные системы экспрессии и получают антитела, близкие по последовательности к человеческой зародышевой линии (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California). Специалистам в данной области будет очевидно, что термин "происходящий из" предназначен для определения не только источника в смысле физического происхождения вещества, но и для определения вещества, структурно идентичного этому веществу, но которое не происходит из упомянутого источни-7 015654 ка. Таким образом, "остатки, обнаруживаемые в донорном антителе" не обязательно должны быть выделены из донорного антитела. В данной области общепризнанным является тот факт, что некоторые аминокислотные замены рассматриваются как "консервативные". Аминокислоты делят на группы на основании общих свойств боковой цепи и замен в пределах групп, которые сохраняют всю или по существу всю аффинность связывания терапевтического антитела по изобретению, и относятся к консервативным заменам, см. следующую табл. 1. Таблица 1 1.3. Биспецифические антитела. Биспецифическое антитело представляет собой производное антитела, обладающее специфичностями связывания к по меньшей мере двум различным эпитопам, и оно также составляет часть изобретения. Способы получения таких антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на коэкспрессии двух иммуноглобулиновых пар Н-цепь/Lцепь, где две Н-цепи обладают различными специфичностями связывания (см. Millstein et al, Nature 305: 537-539 (1983), WO 93/08829 и Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659). Вследствие случайной сортировки Н- и L-цепей получают потенциальную смесь из десяти различных структур антитела, из которых только одна обладает желаемой специфичностью связывания. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов с желаемыми специфичностями связывания с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, СН 2- и СН 3-области. Предпочтительно иметь по меньшей мере в одном из слияний СН 1-область, содержащую участок, необходимый для связывания с легкой цепью. ДНК, кодирующую эти слияния и, при желании, L-цепь, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и затем котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Однако можно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей в один экспрессирующий вектор. Согласно одному предпочтительному подходу биспецифическое антитело состоит из Нцепи с первой специфичностью связывания в одном плече и пары H-L-цепей, обеспечивающей вторую специфичность связывания в другом плече (см. WO 94/04690, см. также Suresh et al, Methods in Enzymology 121, 210, 1986). Доставке терапевтических белков в мозг препятствует наличие гематоэнцефалического барьера(ВВВ). В тех случаях, когда желательно доставить антитело по изобретению или фрагмент антитела по изобретению через ВВВ, предложены различные стратегии усиления такой доставки, где это необходимо. Для того чтобы получить требуемые питательные вещества и факторы из крови, ВВВ обладает несколькими специфическими рецепторами, которые транспортируют соединения из циркулирующей крови в мозг. В исследованиях показано, что различные соединения, такие как инсулин (см. Duffy KR et al(1989) Brain Res. 420: 32-38), трансферрин (см. Fishman JB et al (1987) J.Neurosci 18: 299-304) и инсулиноподобные факторы роста 1 и 2 (см. Pardridge WM (1986) Endocrine Rev. 7: 314-330 и Duffy KR et al(1989) Metabolism 37: 136-140), пересекают ВВВ посредством рецептор-опосредованного трансцитоза. Таким образом, рецепторы этих молекул обеспечивают потенциальный способ доступа терапевтических антител по изобретению в мозг при использовании так называемых "направленных" антител (см.Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36: 299-321). Например, было показано, что антитело к рецептору трансферрина динамично транспортируется в паренхиму мозга (см. Friden PM et al (1991)PNAS 88: 4771-4775 и Friden PM et al (1993) Science 259: 373-377). Таким образом, один возможный подход состоит в получении биспецифического антитела или биспецифического фрагмента, таких как описано выше, где первая специфичность направлена на транспортный рецептор, расположенный, например,на ВВВ, а вторая специфичность направлена на транспортный рецептор трансферрина. 1.4. Фрагменты антител. В некоторых воплощениях изобретения предложено терапевтическое антитело, представляющее собой антигенсвязывающий фрагмент. Такие фрагменты могут представлять собой функциональные антигенсвязывающие фрагменты интактных и/или гуманизированных, и/или химерных антител, такие какFab-, Fd-, Fab'-, F(ab')2-, Fv-, ScFv-фрагменты антител, описанных выше. Фрагменты, не имеющие константной области, не обладают способностью активировать комплемент по классическому пути или опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность. Традиционно такие фрагменты получают-8 015654 путем протеолитического расщепления интактных антител с помощью расщепления, например, папаином (см., например, WO 94/29348), но можно получить их непосредственно из рекомбинантно трансформированных клеток-хозяев. Для получения ScFv см. Bird et al; (1988) Science, 242, 423-426. Кроме того,фрагменты антител могут быть получены с использованием различных инженерных методик, как описано ниже.Fv-фрагменты, по-видимому, обладают более низкой энергией взаимодействия их двух цепей, чемFab-фрагменты. Для стабилизации ассоциации VH- и VL-доменов их соединяли пептидами (Bird et al,(1988) Science, 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85: 5879-5883), дисульфидными мостиками (Glockshuber(1997), Protein Sci., 6: 781-788). ScFv-фрагменты могут быть получены с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области (см. Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2: 97-105 и Huston et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10: 195-217). ScFv можно продуцировать в бактериальных клетках, таких как E.coli, но более типично его продуцируют в эукариотических клетках. Одним из недостатков ScFv является моновалентность продукта, которая препятствует повышенной авидности вследствие поливалентного связывания, а другим - его короткий период полувыведения. Попытки преодолеть эту проблему включают бивалент (ScFv')2, полученный из ScFv, содержащего дополнительный С-концевой цистеин, с помощью химического связывания (Adams et al (1993) Can.Res. 53: 4026-4034 иBiophys 26:187-204). Альтернативно, можно инициировать формирование мультимеров из ScFv путем укорочения пептидного линкера до 3-12 остатков для образования "диател" (см. Holliger et al PNAS(1993), 90: 6444-6448). Более того, укорочение линкера может привести к образованию тримеров ScFv(1999) FEBS Lett, 453: 164-168). Конструирования бивалентных молекул ScFv также можно достичь генетическим слиянием с димеризующими мотивами белков для образования "миниантител" (см. Pack et alScFv-Sc-Fv ScFv)2) также могут быть получены с помощью соединения двух единиц ScFv третьим пептидным линкером (см. Kurucz et al (1995) J.Immunol. 154, 4576-4582). Биспецифические диатела могут быть получены с помощью нековалентной ассоциации продуктов слияния двух отдельных цепей, содержащих VH-домен из одного антитела, соединенный с помощью короткого линкера с VL-доменом из другого антитела (см. Kipriyanov et al (1998), Int. J. Can. 77, 763-772). Стабильность таких биспецифических диател можно усилить путем введения дисульфидных мостиков или мутаций "knob-in-hole", как описано выше, или путем образования одноцепочечных диател (ScDb), в которых два гибридных ScFv-фрагмента соединены с помощью пептидного линкера (см. Kontermann et al (1999) J.Immunol. Methods 226: 179188). Тетравалентные биспецифические молекулы доступны, например, благодаря слиянию ScFvфрагмента с СН 3-доменом молекулы IgG или с Fab-фрагментом через шарнирную область (см. Coloma etal (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163). Альтернативно, тетравалентные биспецифические молекулы были получены путем слияния биспецифических одноцепочечных диател (см. Alt et al, (1999) FEBS Lett 454: 90-94). Меньшие тетравалентные биспецифические молекулы также могут быть образованы путем димеризации либо тандемов ScFv-ScFv с линкером, содержащим мотив спираль-петля-спираль (DiBiminiantibodies, см. Muller et al (1998) FEBS Lett 432: 45-49), либо одноцепочечной молекулы, содержащей четыре вариабельных домена антитела (VH и VL) в ориентации, предотвращающей внутримолекулярное спаривание (тандемное диатело, см. Kipriyanov et al, (1999), J.Mol.Biol. 293: 41-56). БиспецифическиеF(ab')2-фрагменты могут быть созданы путем химического сочетания Fab'-фрагментов или путем гетеродимеризации посредством лейциновых "молний" (см. Shalaby et al, (1992) J.Exp.Med. 175: 217-225 и Kostelny et al (1992), J.lmmunol. 148: 1547-1553). Также доступны выделенные VH- и VL-домены (см. US 6248516; US 6291158; US 6172197). 1.5. Гетероконъюгатные антитела. Гетероконъюгатные антитела представляют собой производные, которые также являются воплощением настоящего изобретения. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител, образованных с использованием любых подходящих способов сшивания (см. US 4676980). 1.6. Другие модификации. Считают, что взаимодействие между Fc-областью антитела и различными Fc-рецепторами (FcR) опосредует эффекторные функции антитела, которые включают антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), связывание комплемента, фагоцитоз и период полувыведения антителаиммунный клиренс. Могут быть осуществлены различные модификации Fc-области антител по изобретению в зависимости от желаемого эффекторного свойства. В частности, человеческие константные области, по существу не обладающие функциями а) активации комплемента по классическому пути и б) опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности, включают константную область lgG4, константную область lgG2 и константную область lgG1, содержащие конкретные мутации, как, например, мутации по положениям 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и/или 322, раскрытые в ЕР 0307434 (WO 8807089), ЕР 0629240 (WO 9317105) и WO 2004/014953. Отдельно было описано, что мутации по остаткам 235 или 237-9 015654 в пределах СН 2-домена константной области тяжелой цепи (нумерация по Kabat; система EU Index) уменьшают связывание с FcRI, FcRII и FcRIII и, следовательно, уменьшают антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) (Duncan et al, Nature (1988), 332: 563-564; Lund et al, J.lmmunol. (1991),147: 2657-2662; Chappel e al, PNAS (1991), 88: 9036-9040; Burton and Woof, Adv.lmmunol. (1992), 51: 1-84;Morgan et al, Immunology 1995, 86: 319-324; Hezareh et al, J.Virol. (2001), 75 (24): 12161-12168). Кроме того, в некоторых сообщениях также было описано вовлечение некоторых из этих остатков в стимуляцию или опосредование комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Morgan et al, (1995); Xu et al,Cell.lmmunol. (2000), 200: 16-26; Hezareh et al, J.Virol. (2001), 75 (24): 12161-12168). Поэтому оба остатка 235 и 237 подвергли мутации с заменой на остатки аланина (Brett et al., Immunology (1997), 91: 346-353;Bartholomew et al. Immunology (1995), 85: 41-48; и WO 9958679) для снижения и комплемент-опосредованных, и FcR-опосредованных эффектов. Антитела, содержащие эти константные области, можно обозначить как "нелитические" антитела. Для увеличения периода полувыведения из сыворотки крови можно включить в состав антитела эпитоп, связывающий рецептор реутилизации (salvage receptor) (см. US 5739277). В настоящее время известны пять человеческих рецепторов Fc: FcRI, FcRIIa, FcRIIb, FcRIIIa и неонатальный FcRn. Shields et al 2001) J.Biol.Chem., 276, 6591-6604) продемонстрировали, что обычный набор остатков lgG1 участвует в связывании со всеми FcR, в то время как FcRII и FcRIII используют другие участки связывания вне этого обычного набора. Одна группа остатков lgG1 уменьшала связывание со всеми FcR при замене на аланин: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 и Pro-239. Все эти остатки локализованы в СН 2-домене IgG и сгруппированы около шарнирной области, соединяющей СН 1 и СН 2. Хотя FcRI использует для связывания только обычный набор остатков lgG1, FcRII и FcRIII взаимодействуют с другими остатками в дополнение к обычному набору. Изменение некоторых остатков уменьшало связывание только с FcRII (например, Arg-292) или с FcRIII (например, Glu-293). Некоторые варианты продемонстрировали улучшенное связывание с FcRII или с FcRIII, но не влияли на связывание с другим рецептором (например, замена Ser-267Ala улучшала связывание с FcRII, но не влияла на связывание с FcRIII). Другие варианты продемонстрировали улучшенное связывание с FcRII илиFcRIII с уменьшением связывания с другим рецептором (например, замена Ser-298Ala улучшала связывание с FcRIII и уменьшала связывание с FcRII). Для FcRIIIa лучшие варианты связывания lgG1 объединили замены на аланин по Ser-298, Glu-333 и Lys-334. Считают, что неонатальный FcRn-рецептор вовлечен в защиту молекул IgG от разрушения и, таким образом, увеличивает период полувыведения из сыворотки крови и трансцитоз через ткани (см. Junghans R.P. (1997) Immunol.Res. 16: 29-57 и Ghetie et al(2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766). Человеческие lgG1 остатки, для которых показано прямое взаимодействие с человеческим FcRn, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gin311, Asn434 и His435. Терапевтическое антитело по изобретению может включать любую из вышеперечисленных модификаций константной области. В конкретном воплощении терапевтическое антитело по существу не обладает функциями а) активации комплемента по классическому пути и б) опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности. В еще более конкретном воплощении настоящего изобретения предложены терапевтические антитела по изобретению, имеющие любую одну (или более) из вышеописанных замен остатков для модификации периода полувыведения антитела/иммунного клиренса и/или эффекторных функций, таких как ADCC, и/или комплемент-зависимой цитотоксичности, и/или лизиса системой комплемента. Согласно другому аспекту настоящего изобретения терапевтическое антитело содержит константную область изотипа lgG1 с заменами на аланин (или другими заменами, нарушающими последовательность) по положениям 235 (например, L235A) и 237 (например, G237A) (нумерация согласно схеме EU,приведенной у Kabat). Другие производные по изобретению включают гликозилированные варианты антител по изобретению. Известно, что гликозилирование антител по консервативным положениям их константных областей оказывает выраженный эффект на функцию антитела, особенно на эффекторные функции, такие как описанные выше (см., например, Boyd et al (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318). Предусмотрены варианты гликозилирования терапевтических антител по настоящему изобретению, в которых добавлены, заменены, удалены или модифицированы одна или более углеводородных группировок. Введение мотива аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин создает потенциальный участок для ферментативного присоединения углеводородных группировок и, следовательно, может быть использовано для управления гликозилированием антитела. В Raju et al 2001) Biochemistry 40, 8868-8876) степень концевого сиалирования иммуноадгезина TNFR-IgG увеличивали в процессе регалактозилирования и/или ресиалирования с использованием бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа-2,3-сиалилтрансферазы. Считают,что увеличение концевого сиалирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела, наряду с большинством гликопротеинов, в природе обычно продуцируются в виде смеси гликоформ. Эта смесь особенно очевидна, когда антитела продуцируются в эукариотических клетках, особенно клетках млекопитающих. Для изготовления определенных гликоформ было разработано множество способов(см. Zhang et al Science (2004), 303, 371; Sears et al, Science (2001), 291, 2344; Wacker et al (2002) Science,- 10015654 298, 1790; Davis et al (2002) Chem.Rev., 102, 579; Hang et al (2001) Acc.Chem.Res. 34, 727). Таким образом,изобретение относится ко множеству терапевтических антител (которые могут представлять собой изотип IgG, например lgG1), как описано в данной заявке, содержащих определенное число (например, 7 или менее, например, 5 или менее, например две или одну) гликоформ(ы) указанных антител. Производные согласно изобретению также включают терапевтические антитела по изобретению,соединенные с небелковым полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Конъюгация белков с ПЭГ является общепризнанным способом увеличения периода полувыведения белков, а также снижения антигенности и иммуногенности белков. Использование ПЭГилирования с различными молекулярными массами и видами (линейные или разветвленные) исследовали на интактных антителах, а также на Fab'-фрагментах (см. Koumenis I.L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198: 83-95). Конкретное воплощение содержит антигенсвязывающий фрагмент по изобретению без эффекторных функций а) активации комплемента по классическому пути и б) опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности; (такой как Fab-фрагмент или ScFv) содиненный с ПЭГ. 2. Способы получения. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в трансгенных организмах, таких как козлы (см. Pollock et al (1999), J.Immunol. Methods 231: 147-157), куры (см. Morrow KJJ (2000)Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204; Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4: 601-606; Baez J et al, Biopharm (2000) 13: 50-54; Stoger E et al (2000) Plant Mol.Biol. 42: 583-590). Антитела также могут быть получены посредством химического синтеза. Однако типично антитела по изобретению получают с использованием метода рекомбинантных клеточных культур, хорошо известного специалистам в данной области. Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и вставляют в реплицирующийся вектор, такой как плазмида,для культивирования или экспрессии в клетке-хозяине. Одной подходящей экспрессирующей системой является глутаматсинтетазная система (такая как продаваемая фирмой Lonza Biologies), особенно та, где клетка-хозяин представляет собой СНО или NS0 (см. ниже). Полинуклеотид, кодирующий антитело,можно легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых методов (например, олигонуклеотидные зонды). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиды, вирусы, фаги,транспозоны, мини-хромосомы, из которых плазмиды являются типичным воплощением. Обычно такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепи,для облегчения экспрессии. Полинуклеотид, кодирующий легкую и тяжелую цепи, можно вставить в отдельные векторы и ввести (например, посредством трансформации, трансфекции, электропорации или трансдукции) в одну и ту же клетку-хозяина одновременно или последовательно или, при желании, и тяжелую цепь, и легкую цепь можно вставить в один и тот же вектор перед таким введением. Специалисту в данной области сразу станет понятно, что вследствие избыточности генетического кода также доступны полинуклеотиды, альтернативные раскрытым в данной заявке, которые будут кодировать полипептиды по изобретению. 2.1. Сигнальные последовательности. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в виде слитого белка с гетерологичной сигнальной последовательностью, имеющей конкретный сайт расщепления на N-конце зрелого белка. Сигнальная последовательность должна распознаваться и процессироваться клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев сигнальная последовательность может представлять собой лидерную последовательность щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Для дрожжевой секреции сигнальная последовательность может представлять собой лидерную последовательность дрожжевой инвертазы, лидерную последовательность а-фактора или лидерные последовательности кислой фосфатазы (см., например, WO90/13646). Для клеточных систем млекопитающих доступны вирусные секреторные лидерные последовательности, такие как сигнальная последовательность gD вируса простого герпеса и сигнальные последовательности нативных иммуноглобулинов (таких как тяжелая цепь человеческого Ig). Типично сигнальную последовательность лигируют в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим антитело по изобретению. 2.2. Точка начала репликации. Точки начала репликации хорошо известны в данной области, причем pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, 2 плазмида для большинства дрожжевых и различных вирусных точек начала репликации, таких как SV40, полиома, аденовирус, VSV или BPV для большинства клеток млекопитающих. Обычно компонент точки начала репликации SV40 не является необходимым для интегрированных экспрессирующих векторов млекопитающих. Однако точка начала репликации SV40 может быть включена, поскольку она содержит ранний промотор. 2.3. Селективный маркер. Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или (б) комплементируют ауксотрофные дефициты или поставляют питательные вещества, не доступные в ком- 11015654 плексных средах, или (в) дают комбинацию и того, и другого. Схема селекции может вовлекать остановку роста клеток-хозяев, которые не содержат вектор или векторы. Клетки, которые были успешно трансформированы генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают благодаря, например, лекарственной устойчивости, придаваемой совместно доставленным селективным маркером. Одним примером является система DHFR-селекции, где трансформанты получают в DHFRотрицательных штаммах-хозяевах (см., например, Page and Sydenham (1991) Biotechnology 9: 64-68). В этой системе ген DHFR (дигидрофолатредуктаза)доставляют совместно с полинуклеотидными последовательностями антитела по изобретению, и затем DHFR-положительные клетки подвергают селекции путем удаления нуклеозидов. При необходимости, для селекции трансформантов с амплификацией генаDHFR также используют ингибитор DHFR метотрексат. Благодаря функциональному связыванию генаDHFR с последовательностями, кодирующими антитело по изобретению или его функциональные производные, амплификация гена DHFR приводит к сопутствующей амплификации желаемых интересующих последовательностей антитела. Клетки СНО являются особенно подходящей клеточной линией для этой DHFR/метотрексат селекции, и способы амплификации и селекции клеток-хозяев с использованиемsystems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung, 48(8): 870-80, 1998 Aug). Еще одним примером является глутаматсинтетазная экспрессирующая система (Bebbington et al Biotechnology 1992 vol 10, p 169). Подходящим селективным геном для использования у дрожжей является trp1 ген (см. Stinchcomb etal Nature 282, 38, 1979). 2.4. Промоторы. Подходящие промоторы для экспрессии антител по изобретению функционально связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антитело. Промоторы для прокариотических хозяев включают промотор phoA, системы промоторов бета-лактамазы и лактозы, промоторы щелочной фосфатазы, триптофана и гибридные промоторы, такие как Тас. Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, например енолазу,глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, пируватдекарбоксилазу, фосфофруктокиназу, глюкозу-6-фосфатизомеразу, 3-фосфоглицератмутазу и глюкокиназу. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают алкогольдегидрогеназу 2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, металлотионеин и ферменты,ответственные за метаболизм азота или утилизацию мальтозы/галактозы. Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающих включают промоторы РНК-полимеразы II, включая вирусные промоторы, такие как промотор вируса полиомы, вируса оспы птиц и аденовирусов (например, аденовируса 2),вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса (в частности, промотор непосредственно раннего гена), ретровируса, вируса гепатита В, актина, вируса саркомы Рауса (RSV) и ранние или поздние промоторы вакуолизирующего обезьянего вируса 40 и невирусные промоторы, такие как EF-1 альфа (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18 (17): 5322). Выбор промотора можно осуществлять на основании соответствующей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. 2.5. Энхансерный элемент. В соответствующих случаях, например, для экспрессии в клетках высших эукариот можно включать дополнительные энхансерные элементы вместо или наряду с теми, что обнаруживают расположенными в промоторах, описанных выше. Подходящие энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы из глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионеина и инсулина. Альтернативно, может быть использован энхансерный элемент из вируса эукариотической клетки, такой как энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, бакуловирусный энхансер или локус мышиного lgG2a (см. WO 04/009823). Несмотря на то, что такие энхансеры типично расположены на векторе в сайте выше промотора, они также могут быть расположены где-либо еще, например, в пределах нетранслируемой области или ниже полиаденилирующего сигнала. Выбор и расположение энхансера может зависеть от соответствующей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. 2.6. Полиаденилирование/терминация. В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функционально связаны с полинуклеотидом, кодирующим антитело по изобретению. Такие сигналы типично располагают на 3'-конце открытой рамки считывания. В системах млекопитающих неограничивающие примеры сигналов включают сигналы, происходящие из генов гормонов роста, фактора элонгации 1 альфа и вирусных (например,SV40) генов или ретровирусных длинных концевых повторов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают сигналы, происходящие из генов фосфоглицераткиназы (PGK) и алкогольдегидрогеназы 1 (ADH). В прокариотической системе сигналы полиаденилирования обычно не требуются, и вместо этого обычно используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/терминации можно осуществлять на основании соответствующей совместимости с клеткойхозяином, используемой для экспрессии. 2.7. Другие способы/элементы для усиленного выхода.- 12015654 В дополнение к вышесказанному другие признаки, которые могут быть использованы для усиления выхода, включают элементы ремоделирования хроматина, модификацию интронов и специфических кодонов клетки-хозяина. Использование кодонов антитела по данному изобретению можно модифицировать для обеспечения характерного для данного организма статистического отклонения от равномерности в использовании кодонов (codon bias) клетки-хозяина для того, чтобы увеличить выход транскрипта и/или продукта (например, Hoekema A et al, Mol.Cell Biol. (1987), 7 (8): 2914-24). Выбор кодонов может быть осуществлен на основании соответствующей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. 2.8. Клетки-хозяева. Подходящими клетками-хозяевами для клонирующих или экспрессирующих векторов, кодирующих антитела по изобретению, являются клетки прокариот, дрожжей и высших эукариот. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерии, например энтеробактерии, такие как Escherichia, например E.coli (например АТСС 31446; 31537; 27325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также бациллы,такие как B.subtilis и B.licheniformis (см. DD 266710), Pseudomonas, такие как P.aeruginosa, и Streptomyces. Из дрожжевых клеток-хозяев рассматривают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces(EP183070, см. также Peng et al, J.Biotechnol. 108 (2004), 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244234),Penicillin, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A.nidulans и A.niger. Несмотря на то, что прокариотические и дрожжевые клетки-хозяева конкретно рассмотрены в данном изобретении, типичными клетками-хозяевами по настоящему изобретению, однако, являются клетки позвоночных. Подходящие клетки-хозяева позвоночных включают клетки млекопитающих, такие какCOS-1 (АТСС NO: CRL 1650), COS-7 (АТСС CRL 1651), линия клеток эмбриональной почки человека 293, PerC6 (Crucell), клетки почки сирийского хомячка (ВНК) (АТСС CRL 1632), ВНК 570 (АТСС CRL 10314), 293 (АТСС CRL 1573), клетки яичника китайского хомячка СНО (например, СНО-К 1, АТСС NO:vol 12 pp. 555-566), конкретнее клеточные линии СНО, адаптированные для суспензионной культуры,клетки Сертоли мыши, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зеленой мартышки (АТССCRL-1587), клетки HELA, клетки почки собаки (АТСС CCL 34), клетки легких человека (АТСС CCL 75),Hep G2 и клетки миеломы или лимфомы, например NS0 (см. US5807715), Sp2/0, Y0. Таким образом, согласно одному воплощению изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела, описанного в данной заявке. Типично такие клетки-хозяева содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий указанную тяжелую цепь. Такие клетки-хозяева также можно дополнительно конструировать или адаптировать для модификации количества, функции и/или выхода антитела по этому изобретению. Неограничивающие примеры включают экспрессию конкретных модифицирующих (например, гликозилирующих) ферментов и шаперонов для фолдинга белков. 2.9. Способы культивирования клеток. Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антитела по изобретению, можно культивировать любым способом, известным специалистам в данной области. Клеткихозяева можно культивировать в центрифужных пробирках, встряхиваемых колбах, роллерных бутылках, волновых реакторах (например, System 1000 от wavebiotech.com) или системе полых волокон, но для крупномасштабного производства предпочтительно, чтобы использовали реакторы с мешалкой или контейнерные реакторы (например, Wave Biotech, Somerset, New Jersey, США), в частности, для суспензионных культур. Типично реакторы с мешалкой адаптируют для аэрации с использованием, например,опрыскивателей, перегородок или лопастных мешалок с малым усилием сдвига. Для барботажных колонок и реакторов с подачей воздуха может быть использована прямая аэрация пузырьками воздуха или кислорода. В тех случаях, когда клетки-хозява культивируют в бессывороточных культуральных средах,их можно дополнить защитным агентом для клеток, таким как Pluronic F-68, для предупреждения повреждения клеток в процессе аэрации. В зависимости от характеристик клеток-хозяев могут быть использованы либо микроносители в качестве ростовых субстратов для зависимых от заякоривания клеточных линий, либо клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (что является типичным). При культивировании клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев позвоночных, можно использовать различные рабочие режимы, такие как поточное культивирование, культивирование с подпиткой и цикличное поточное культивирование (см. Drapeau et ai (1994) Cytotechnology, 15: 103-109), расширенное поточное культивирование или перфузионную культуру. Хотя рекомбинантно трансформированные хозяйские клетки млекопитающих можно культивировать в средах, содержащих сыворотку, таких как среды, содержащие эмбриональную телячью сыворотку (FCS), предпочтительно, чтобы такие клетки-хозяева культивировали в бессывороточных средах, таких как среды, раскрытые в Keen et al (1995) Cytotechnology, 17: 153-163, или коммерчески доступных средах, таких как ProCHO-CDM или UltraCHO (CambrexNJ, США), дополненных, при необходимости, источником энергии, таким как глюкоза, и синтетически- 13015654 ми факторами роста, такими как рекомбинантный инсулин. Бессывороточное культивирование клетокхозяев может потребовать того, чтобы эти клетки были адаптированы к росту в бессывороточных условиях. Одним подходом к адаптации является культивирование таких клеток-хозяев в средах, содержащих сыворотку, и многократная замена 80% культуральной среды на среду без сыворотки для того, чтобы клетки-хозяева научились адаптироваться к бессывороточным условиям (см., например, Scharfenberg Ket al (1995) в Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp. 619623, Kluwer Academic publishers). Антитела по изобретению, секретируемые в среды, могут быть выделены и очищены из сред с использованием различных методик для обеспечения степени очистки, подходящей для предполагаемого применения. Например, применение терапевтических антител по изобретению для лечения пациентовлюдей типично требует по меньшей мере 95% чистоты, как определено с помощью восстанавливающего ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), более типично 98% или 99% чистоты при сравнении с культуральными средами, содержащими терапевтические антитела. В первом случае клеточный дебрис из культуральных сред обычно удаляют с использованием центрифугирования, за которым следует стадия осветления супернатанта с использованием, например, микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубокой фильтрации. Альтернативно, антитело может быть получено с помощью микрофильтрации, ультрафильтрации или глубокой фильтрации без предшествующего центрифугирования. Имеются различные другие методы, такие как диализ и гель-электрофорез, и хроматографические методы, такие как гидроксиапатит (НА), аффинная хроматография (возможно включающая систему аффинных меток, таких как полигистидин) и/или гидрофобная хроматография (HIC, см. US 5429746). В одном воплощении антитела по изобретению после ряда стадий осветления могут захватываться с использованием аффинной хроматографии с протеином А или G, после которой следует дополнительные хроматографические стадии, такие как ионообменная и/или НА-хроматография, анионо- или катионообменная хроматография, гель-хроматография и осаждение сульфатом аммония. Типично также используют различные стадии удаления вирусов (например, нанофильтрация с использованием, например, фильтра DV-20). После этих различных стадий получают очищенный (типично моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 10 мг/мл или более, например 100 мг/мл или более, антитела по изобретению, и, следовательно, формируют воплощение изобретения. Концентрация 100 мг/мл или более может быть получена с помощью ультрацентрифугирования. Соответственно такие препараты по существу не содержат агрегированных форм антител по изобретению. Бактериальные системы особенно подходят для экспрессии фрагментов антител. Такие фрагменты расположены внутриклеточно или в пределах периплазмы. Нерастворимые периплазматические белки можно подвергнуть экстракции и рефолдингу для образования активных белков согласно способам, известным специалистам в данной области (см. Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 и Cupit PM et al(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277). 3. Фармацевтические композиции. Очищенные препараты антител по изобретению (особенно моноклональные препараты), как описано выше, можно включать в состав фармацевтических композиций для применения в лечении заболеваний и расстройств человека, таких как те, что указаны выше. Типично такие композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый (то есть инертный) носитель, известный и предусмотренный приемлемой фармацевтической практикой (см., например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed,(1980), Mack Publishing Co). Примеры таких носителей включают стерилизованные носители, такие как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, забуференный подходящими буферами, такими как тригидрат ацетата натрия, до фармацевтически приемлемого рН, такого как рН в диапазоне от 5 до 8. Фармацевтические композиции для инъекции (например, внутривенной, интраперитонеальной, внутрикожной, подкожной, внутримышечной и в воротную вену) или продолжительной инфузии соответственно не содержат видимых твердых частиц и могут содержать от 1 мг до 10 г терапевтического антитела, типично от 5 мг до 1 г, более конкретно от 5 мг до 25 мг или 50 мг антитела. Способы приготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области. В одном воплощении фармацевтические композиции содержат от 1 мг до 10 г терапевтических антител по изобретению в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями по применению. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть лиофилизированы (высушены сублимацией) для разбавления перед введением согласно способам, хорошо известным или очевидным специалистам в данной области. В тех случаях, когда воплощения изобретения содержат антитела по изобретению с изотипом lgG1, к фармацевтической композиции может быть добавлен хелатор из ионов металла, включающий медь, такой как цитрат (например, цитрат натрия), или EDTA, или гистидин, для уменьшения степени металл-опосредованной деградации антител этого изотипа, см. ЕР 0612251. Фармацевтические композиции также могут содержать солюбилизатор, такой как основание аргинин, детергент/антиагрегант, такой как полисорбат 80, и инертный газ, такой как азот, для замены кислорода в свободном пространстве над продуктом в сосуде. Эффективные дозы и терапевтические схемы введения антитела по изобретению обычно определяют эмпирически, и они зависят от таких факторов, как возраст, масса тела и состояние здоровья пациен- 14015654 та, а также заболевание или расстройство, которое лечат. Такие факторы находятся в пределах компетенции лечащего врача. Указания по выбору подходящих доз можно найти, например, в Smith et al (1977)Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York, но обычно они составляют от 1 мг до 10 г. В одном воплощении режим введения доз для лечения пациента-человека составляет от 1 мг до 1 г терапевтического антитела по изобретению, вводимого подкожно один раз в неделю или каждые две недели, или с помощью внутривенной инфузии каждые 1 или 2 месяца. Такая доза соответствует 0,014-140 мг/кг, например 0,014-14 мг/кг. Композиции по настоящему изобретению также можно применять профилактически. 4. Клинические применения. Следует учесть, что заболевания, характеризующиеся повышенными уровнями -амилоида или отложениями -амилоида, включают болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное расстройство, синдром Дауна, наследственную церебральную геморрагию с -амилоидозом по голландскому типу, церебральную -амилоидную ангиопатию и различные виды дегенеративных деменций, таких как те, которые ассоциированы с болезнью Паркинсона, прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикобазальной дегенерацией и болезнью Альцгеймера с диффузными тельцами Леви. Более предпочтительно заболевание, характеризующееся повышенными уровнями -амилоида или отложениями -амилоида, представляет собой болезнь Альцгеймера. Хотя настоящее изобретение было описано, главным образом, в отношении лечения заболеваний или расстройств человека, настоящее изобретение также может найти применение в лечении похожих заболеваний или расстройств у млекопитающих, не являющихся человеком. Примеры Методы. Получение мышиного моноклонального антитела 2 Е 7. Мышиное моноклональное антитело 2 Е 7 получали стандартной иммунизацией мышей. Мышей иммунизировали растворимым или агрегированным -амилоидом 1-40 и 1-42, приготовленным в виде препарата в адъюванте Фрейнда. После конечной бустер-инъекции без адъюванта спленоциты сливали с клетками миеломы. Слитые клетки культивировали в 96-луночных планшетах, из которых гибридомные супернатанты подвергали скринингу в отношении потенциальных выходов. Выбранное антитело 2 Е 7,которое было получено в результате иммунизации растворимым -амилоидом 1-40, представляло собой изотип мышиного IgG2a и обладало связывающей активностью в отношении бета-амилоида в анализе выхода, описанном ниже, и аффинностью 36,1 пМ к бета-амилоиду 1-40 при измерении с помощью Способа А(1) Biacore (табл. 10). Картирование эпитопов антитела 2 Е 7. Для тонкого картирования связывания антитела 2 Е 7 с -амилоидным пептидом использовали набор пептидов (А). Набор пептидов (А) состоял из набора из 31 12-мерного перекрывающегося пептида, охватывающего полную последовательность -амилоидного пептида 1-42. Каждый последующий пептид инициировали в последующей аминокислоте в пределах -амилоидного пептида, смещая таким образом последовательность, охваченную между последовательными пептидами, на одну аминокислоту. Все пептиды в наборе (А) содержали С-концевой линкер из 3 аминокислот (глицин-серин-глицин) и концевой биотинилированный остаток лизина. Кроме того, все пептиды, за исключением пептида А 1DAEFRHDSGYEVGSGK-биотин (SEQ ID NO:15), были ацетилированы по N-концу. Второй набор пептидов (набор (Б состоял из последовательных делеций одной С-концевой аминокислоты в пептиде, содержащем аминокислоты 1-10 из последовательности -амилоида. Все пептиды в наборе (Б) содержали С-концевой линкер из 3 аминокислот (глицин-серин-глицин) и концевой биотинилированный остаток лизина, но с дополнительными остатками глицина и серина для замены делетированных аминокислот - 16015654 амилоида (табл. 2). Таким образом, все пептиды в наборе (Б) имеют одинаковую длину. Таблица 2. Последовательности биотинилированных пептидов (набор (Б, содержащих укороченные N-концевые фрагменты -амилоида.DAE-GSGGSGGSGGSGK-биогин (SEQ ID NO:14) Мониторинг связывания антитела 2 Е 7 с пептидами -амилоидного происхождения с использованием оптических биосенсоров. 96-луночные планшеты SRU BIND, покрытые стрептавидином (SRU Biosystems), промывалиPBS, содержащим 1% ДМСО, для удаления глицерина и консерванта. Объем 50 мкл на лунку оставляли для достижения равновесия при комнатной температуре для обеспечения постоянного исходного уровня,Биотинилированные пептиды разбавляли до приблизительно 0,3 мкг/мл в PBS, содержащем 1% ДМСО, и добавляли по 50 мкл каждого в лунки, и инкубировали в течение приблизительно 1 ч. Дублированные лунки получали с использованием различных секторов планшета и в каждом секторе использовали по меньшей мере одну контрольную лунку без пептида для получения данных относительно исходного уровня. После иммобилизации пептида планшет промывали PBS, содержащим 1% ДМСО, оставляя по 50 мкл свежего буфера в лунке для обеспечения нового исходного уровня на планшет-ридере. Никакого распада пептида не наблюдалось на поверхности. Затем буфер заменяли на 40 мкл/лунку буфера, содержащего тестируемое антитело в концентрации 20-64 нМ, и оставляли на 2 ч. Обнаружили, что антитело 2 Е 7 связывается только с пептидом, охватывающим 1-12 аминокислот -амилоидного пептида в наборе пептидов (А) (пептид A1, SEQ ID NO:15). Этот результат позволяет предположить, что аспарагиновая кислота в положении 1 является критической для связывания с этим пептидом. Для того чтобы дополнительно охарактеризовать участок связывания антитела 2 Е 7, использовали набор пептидов (Б). При использовании биосенсорной методологии SRU BIND антитело 2 Е 7 продемонстрировало незначительное связывание с пептидами, охватывающими 1-3 и 1-4 аминокислоты амилоидного пептида (SEQ ID NO:14 и 13). Связывание с пептидом, охватывающим 1-7 аминокислоты-амилоидного пептида (из набора пептидов (А. Наблюдали связывание с пептидами, охватывающими 1-5 и 1-6 аминокислот из -амилоидного пептида (SEQ ID NO:12 или 11), но оно было слабее (как измерено по стабильности после дополнительной стадии промывки), чем связывание с пептидом, охватывающим 1-7 аминокислот из -амилоидного пептида (SEQ ID NO:10). Таким образом, было показано, что только остатки 1-7 из -амилоидного пептида необходимы для полного связывания, как измерено с использованием этой методологии. Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса. В дополнение к экспериментам, описанным выше, для мониторинга связывания антитела 2 Е 7 с выбранными пептидами, происходящими из последовательности -амилоида, использовали оптический биосенсор Biacore 3000. Связывание измеряли путем нанесения (инжекции) тестируемых антител в концентрации вплоть до 64 нМ на 5 минут на пептиды, иммобилизованные на поверхности отдельных чипов со стрептавидином (130-230 RU (единицы резонанса. Использовали подвижный буфер (HBS-EP),содержащий 0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р 20, при 25 С и скорости потока 20 мкл/мин. Все опыты проводили с двойным контролем относительно пустой стрептавидиновой поверхности и пустых инжекции. Анализы осуществляли с использованием программного обеспечения Biaevaluation версия 4.1 для Biacore анализа. Результаты для выбранных пептидов в наборе (А) дополнительно подтвердили данные, полученные с использованием SRU BIND,указывающие, что 2 Е 7 связывалось только с пептидом, охватывающим 1-12 аминокислот (SEQ IDNO:15) из -амилоидного пептида, с кажущейся константной равновесия KD приблизительно 50 пМ. В тех же условиях 2 Е 7 не связывалось с пептидом, охватывающим 2-13 аминокислот из -амилоидного пептида. Пептид А 2-13: AEFRHDSGYEVHGSGK-биотин (SEQ ID NO:44). Используемые способ и условия позволили определить молекулы с высокой, а также с более низкой аффинностью в одной и той же экспериментальной установке; в противоположность 2 Е 7, было показано,что другое антитело, распознающее N-концевой эпитоп -амилоидного пептида, связывается с 2-13 пептидом (SEQ ID No:44) с кажущейся KD 7 нМ. 2 Е 7 не связывалось с выборкой пептидов в наборе (А) из средних участков 3-амилоидного пептида. В отдельных экспериментах -амилоидный пептид 1-40 им- 17015654 мобилизовали через его N-концевой остаток аспарагиновой кислоты, который биотинилировали. Этот пептид иммобилизовали на чипе Biacore, покрытом стрептавидином, как описано ранее. Антитело 2 Е 7,нанесенное в концентрации 66 нМ на 1 минуту, не могло связываться с этим пептидом. Поэтому делают вывод о том, что ранее описанный N-концевой участок связывания был замаскирован с помощью линкера и способа иммобилизации, таким образом дополнительно подтверждая критическое значение N-конца как участка, содержащего основной участок связывания. Связывание с экспрессирующимся в клетках белком-предшественником амилоида (АРР).-Амилоид состоит из пептидов, образующихся путем протеолитического расщепления трансмембранного белка-предшественника I типа, называемого белком-предшественником амилоида (АРР). Поскольку АРР имеет большой внеклеточный домен, связывание с этим белком может потенциально инициировать реакцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Для характеристики связывания антитела с полноразмерным АРР на клеточной поверхности использовали анализ на основе FMAT ABI8200. Трансфекция клеток НЕК 293 Т с ДНК АРР дикого типа. Клетки НЕК 293 Т поддерживают в среде DMEM F12, содержащей 10% (об./об.) FCS и 1Glutamax. Перед трансфекцией клетки сеют в колбах для тканевых культур объемом 75 см 2 и выращивают до 6080% конфлюэнтности (18-24 часа). Для трансфекции 9 мкг ДНК (либо ДНК АРР дикого типа (в вектореPCDNA3.1 (Invitrogen, либо только контролирующий вектор) смешивают с 0,3 мл среды Opti-MEM. Смешивают 30 мкл трансфицирующего агента Lipofectamine с 0,3 мл среды Opti-MEM и объединяют эти две смеси. Объединенные смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут перед добавлением дополнительных 4,8 мл среды Opti-MEM. Конечную смесь добавляют к клеткам (после промывки средой Opti-MEM) на 5 ч, затем добавляют 6 мл 10% (об./об.) сыворотки новорожденных телят в DMEM. Через 48 ч после трансфекции супернатант удаляют и монослой промывают в версене,затем в каждый флакон добавляют 3 мл хелатирующего агента Versene, инкубируют в течение 5 мин при 37 С и открепившиеся клетки осаждают центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. Полученный клеточный осадок осторожно ресуспендируют в 1 мл аналитического буфера (2% обработанной нагреванием сыворотки, 0,5% БСА, 0,1% NaN3 в PBS рН 7,4, профильтрованного через фильтр 0,2 мкм) для получения суспензии одиночных клеток. Анализ на основе FMAT ABI8200. Тестируемые антитела (мышиные IgG 2E7, LN27 (Zymed) к внеклеточному домену АРР в качестве положительного контроля и антитело G210, которое распознает форму х-40 -амилоидного пептида в качестве отрицательного контроля) разбавляли до 10 мкл/мл стерильным профильтрованным аналитическим буфером (2% обработанной нагреванием сыворотки, 0,5% БСА, 0,1% NaN3 в PBS, рН 7,2) в полипропиленовом планшете и затем осуществляли на планшете шесть дополнительных последовательных разведений 1:1. В качестве контроля использовали только аналитический буфер. 50 мкл суспензии клеток НЕК 293 Т, трансфицированных ДНК АРР дикого типа (эксперимент 1: 10000 клеток; Эксперимент 2: 20000 клеток), добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета, в которые добавляли по 5 мкл растворов каждого антитела для дублирования лунок. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку исходного антитела F-MAT blue против мышиного IgG (антитело мечено с использованием набора монофункциональных реагентов-красителей F-MAT blue из ABI 4328408), разведенного 1:500 (эксперимент 1) и 1:1000 (Эксперимент 2) в аналитическом буфере, и планшет встряхивали кратковременно и оставляли на 1 ч. Затем планшет считывали с использованием флуоресцентной макроконфокальной системы детекции клеток ABI 8200 (Applied Biosystems). Полученные данные по импульсам затем интерпретировали с использованием программного обеспечения с динамическими электронными таблицами Excel. Кратко, импульсы от ложнотрансфицированных клеток вычитали из импульсов от клеток, трансфицированных полноразмерным АРР, с получением специфического сигнала для каждого антитела. Выбирали две концентрации антител(1,25 и 0,63 мкг/мл), которые находились на линейном участке кривой, и полученные исходные скорректированные импульсы для этих концентраций выражали в виде процента от связывания антитела LN27 и усредняли для концентраций двух антител. Полученные данные описаны в табл. 3 (% от связыванияLN27SE). Таким образом, в пределах данной аналитической системы связывание антитела 2 Е 7 с АРР клеточной поверхности не отличается от связывания отрицательного контрольного антитела G210. Таблица 3 Связывание с пептидом, происходящим из белка-предшественника амилоида. Описанные ранее исследования по картированию эпитопов продемонстрировали, что антитело 2 Е 7- 18015654 связывается с N-концом -амилоидного пептида, с остатком аспарагиновой кислоты в положении 1, которая является необходимой для связывания. Это дает возможность предположить, что антитело распознает "нео"-эпитоп, образующийся при расщеплении АРР по -секретазному сайту. Это наблюдение дает возможность предположить, что антитело 2 Е 7 может не распознавать прилегающую пептидную последовательность АРР. Для проверки этой гипотезы синтезировали пептид АРР (пептид АРР 1, SEQ IDNO:16), который включал остатки 1-7 из -амилоидного пептида и пять прилегающих аминокислот, происходящих из АРР. Таким образом, пептид АРР 1 содержал смежные аминокислоты, начиная с Nконцевого положения 5 в сайте расщепления ВАСЕ-1 до С-концевого положения 7 в сайте расщепления ВАСЕ-1, и был ацетилирован по N-концу. Способность антитела 2 Е 7 связываться с пептидом АРР 1, происходящим из АРР, и с -амилоидным пептидом 1-12 (А 1-пептид) сравнивали с помощью методикиBiacore (как описано ранее для картирования эпитопов). Антитело 2 Е 7 продемонстрировало высокую аффинность связывания с -амилоидным пептидом А 1, который содержит основной эпитоп 1-7. Однако не наблюдали связывания с пептидом АРР 1, который также содержит основную последовательность 1-7,происходящую из -амилоида. Пептид А 1: DAEFRHDSGYEVGSGK-биотин SEQ ID No: 15.APP1: AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-биотин SEQ ID No: 16. Для того чтобы продемонстрировать, что в таких форматах 2 Е 7 не обладает аффинностью связывания к полноразмерному белку АРР, использовали комбинацию клеточного связывания на основеFMAT и картирования пептидов на основе Biacore. Принимая во внимание, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 1 -амилоидного пептида необходим для связывания, делают вывод о том, что 2 Е 7 распознает только "Heo-N-конец -амилоида и, следовательно, не должен связываться с АРР, экспрессирующимся на клеточной поверхности. Биологическая активность in vivo Модель оттока I125-амилоида. Во многих опубликованных исследованиях показано, что антитела против -амилоида могут образовывать комплексы с -амилоидным пептидом в кровотоке. Утверждают, что эта секвестрация периферического -амилоида дает возможность дополнительного оттока амилоида из ЦНС в кровоток (DeMattos RB, PNAS (2001), 98(15); 8850-8855). Для скрининга антител по их способности образовывать комплекс с -амилоидным пептидом, происходящим из мозга, в кровотоке, разработали фармакокинетическую модель острой фазы. У самцов мышей C57/BL6J индуцировали анестезию (4% изофлуран) и поддерживали (1,5% изофлуран) в 100% кислорода. Затем животных помещали в стереотаксическую рамку. После срединного разреза вдоль стреловидного шва просверлили отверстие в черепе и ввели направляющий катетер в латеральный церебральный желудочек (координаты: переднезадняя (АР) -0,5 мм, латеральная (L) +0,7 мм,вентральная (V) -2,5 мм). Просверлили два дополнительных отверстия в черепе, в которые поместили кортикальные винты. Катетер закрепляли на месте с помощью цианакрилатного геля, а на разрез накладывали швы вокруг насадки из цианакрилатного геля. После операции мышам вводили 0,3 мл физиологического раствора подкожно и помещали их в теплую окружающую среду для восстановления после анестезии. При восстановлении рефлекса выпрямления мышей размещали раздельно, и они получали стандартный 5-суточный послеоперационный уход. Все манипуляции были запрещены еще на 5 суток или до восстановления предоперационной массы тела. После восстановления проверяли местоположение катетера с помощью питьевого ответа на ангиотензин II. Каждой мыши интрацеребровентрикулярно(ICV) вводили (5 мкл) 100 нг ангиотензина II (AII) (разведенного в 0,9% физиологическом растворе). После введения AII потребление воды наблюдали в течение 15 мин. Мыши с положительным дипсогенным ответом на AII (длительная полидипсия) были включены в исследования, которые были начаты не ранее 5 суток после инъекции AII. В сутки проведения исследования мышей помещали на 5-10 мин в теплую окружающую среду для индукции вазодилатации, необходимой для облегчения инъекции в хвостовую вену. В хвостовую вену инъецировали тестируемое антитело (600 мкг) или носитель PBS (объем дозы не более 10 мл на кг массы тела), и после инъекции мышей возвращали в их индивидуальные клетки. Ровно через один час после инъекции в хвостовую вену мышам медленно (2 мкл в минуту) ICV инъецировали 2 нг (1 мкКи) I125 амилоида 1-40 (Amersham Biosciences, UK) в дозовом объеме 5 мкл. Ровно через четыре часа после ICVдозы забирали 50 мкл крови из артериального ствола и измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике. Мыши, которым инъецировали в хвостовую вену антитело 2 Е 7 (n=6 на группу обработки), продемонстрировали статистически значимое повышение радиоактивного сигнала (число импульсов в минуту- СРМ) в 50 мкл крови из артериального ствола по сравнению с сигналом СРМ, определенным у мышей,которым инъецировали носитель - (СРМ - носитель: 1339,7496,2; против антитела 2 Е 7: 4387,9980,3;- 19015654 В двух дополнительных исследованиях с антителом 2 Е 7, проведенных согласно идентичному протоколу, наблюдали похожие повышения оттока амилоида в кровь по сравнению с контролем, где инъецировали носитель (СРМ крови: носитель 352 +/- 113 против антитела 2 Е 7 2397 +/- 353 и носитель 1281+/- 312 против антитела 2 Е 7 5291 +/- 885; ANOVA с вторичным LSD анализом р 0,001 против носителя). Модели снижения трансгенного -амилоида в ЦНС. 1. -Амилоидная нагрузка после 4-недельного введения доз 2-месячным мышам TASTPM. Самцов и самок трансгенных мышей TASTPM (двойные мутанты APPswePS1.M146V, HoweettDR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136) в возрасте между 61 и 65 сутками в момент начала исследования размещали раздельно. Равное количество мышей включали в каждую группу обработки (n=12 на группу) и рандомизировали по полу и возрасту. Группы обработки включали в себя следующее: А: МОРС 21 (антитело с неизвестной специфичностью, Holton et al (1987) J.Immunol 139(9) 3041-3049, отрицательный контроль); Б: 2 Е 7 (тестируемое антитело). Все антитела растворяли в PBS и вводили дозами внутрибрюшинным путем. Независимо от массы животного вводили 300 мкг антитела. Дозы вводили животным два раза в неделю в течение четырех недель. Через одни сутки после последней дозы животных подвергали эвтаназии сверхдозой фенобарбитала натрия. Мозги иссекали и разделяли продольно на две части. Образцы мозга после продольного разделения на две части собирали в предварительно взвешенные пробирки eppendorf объемом 2 мл и быстро замораживали. Затем образцы оттаивали, снова взвешивали и добавляли 1 мл 5 М гуанидин HCl, содержащего таблетки полного ингибитора протеаз(Boehringer Mannheim), перед гомогенизацией и инкубацией образцов при 4 С в течение более 90 мин с постоянным перемешиванием. Образцы затем разбавляли в соотношении 1 к 10 в аналитическом буфере (50 мМ трис-HCl, рН 7,4,150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20 + 1% БСА), встряхивали и подвергали центрифугированию при 20000 g в течение 20 минут при 4 С. Супернатант удаляли и добавляли в виде трех повторных образцов в аналитический планшет. Уровни А 40 и А 42 измеряли с использованием электрохемилюминесцентного иммуноанализа с чувствительной поверхностью (BioVeris), в котором используют антитела, специфические к С-концу амилоида (к А 40 или А 42), меченные специфической меткой Oritag для облегчения детекции (BioVeris), используемые для захвата либо А 40, либо А 42 вместе с биотинилированным антителом, специфическим к N-концу А. Комплексы антитело-А иммобилизовали с помощью покрытых стрептавидином гранул, которые связывают биотинилированные антитела (Dynabeads, Dynal), и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием и анализировали в фотодетекторе BioVeris M8. Стандартные кривые строили с использованием человеческих пептидов АР 40 и А 42 в аналитическом буфере, содержащем требуемую концентрацию гуанидина HCl. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для статистического анализа Excel Robosage, и уровни А выражали в пмоль/г ткани. Согласно этой парадигме лечение антителом 2 Е 7 снижало нагрузку А 42 в ЦНС на 37% (р 0,001) и нагрузку А 40 в ЦНС на 23% (р 0,001). В последующих исследованиях в аналогичных экспериментальных условиях антитело 2 Е 7 снижало нагрузку А 42 в ЦНС на 38% (исследование 1, только самцы), на 22% (исследование 2, незначимо) и на 39% (исследование 3, самцы, р=0,001) и 13% (исследование 3, самки, незначимо) при сравнении с животными, которых лечили PBS. В этих исследованиях антитело 2 Е 7 также снижало уровень А 40 в ЦНС на 18% (исследование 3, самцы, р=0,017) и обеспечивало незначимое снижение уровня А 40 в ЦНС на 25% (исследование 1, только самцы), 1% (исследование 2) и незначимое повышение на 3% (исследование 3, самки) при сравнении с животными, которых лечили PBS. 2. -Амилоидная нагрузка после 4-месячного введения доз 4-месячным мышам TASTPM. Кратко, 4-месячным трансгенным мышам TASTPM вводили 300 мкг антитела один или два раза в неделю внутрибрюшинным (в/б) путем. Через 4 месяца после введения дозы измеряли уровни амилоида ЦНС с помощью ELISA и измеряли бляшечную нагрузку с помощью иммуногистохимии. Между 4-месячным и 8-месячным возрастом -амилоидная нагрузка в ЦНС экспоненциально увеличивалась и поэтому быстро развивалась бляшечная патология (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130136). Возраст мышей к началу исследования составлял от 120 до 128 суток, и мышей размещали раздельно. Похожие количества мышей включали в каждую группу обработки (n=20 или 21 на группу) и рандомизировали по полу и возрасту. Группы обработки включали в себя следующее: A: PBS (носитель), вводимый два раза в неделю; Б: антитело 2 Е 7, вводимое один раз в неделю; В: антитело 2 Е 7, вводимое два раза в неделю; Г: PBS, вводимый один раз в неделю. Дозу 300 микрограмм (объем 79 мкл) антитела 2 Е 7 вводили внутрибрюшинным путем. Животные, которых лечили носителем, получали такой же объемPBS. Животным вводили дозу в течение восемнадцати недель. Мыши TASTPM предрасположены к спонтанным судорожным припадкам, и, в результате, некоторое число животных погибло в ходе исследования. Конечные количества были следующими: А: 4 самки, 9 самцов; Б: 5 самок, 8 самцов; В: 4 сам- 20015654 ки, 9 самцов; Г: 2 самки, 9 самцов. Через двое или четверо суток после конечной дозы (равные количества на группу) животных подвергали эвтаназии сверхдозой фенобарбитала натрия. Брали образец кончика хвоста от каждой мыши для подтверждения генотипа. Мозги иссекали и разделяли продольно на две части. Правое полушарие фиксировали путем погружения в 4%-ный параформальдегид и обрабатывали для гистологического исследования. Левое полушарие собирали в предварительно взвешенные пробиркиeppendorf объемом 2 мл, замораживали на сухом льду и хранили при -80 С для последующего анализа содержания амилоида. Перед анализом образцы оттаивали, снова взвешивали и добавляли 1 мл 5 М гуанидин HCl, содержащего таблетки полного ингибитора протеаз (Boehringer Mannheim), перед гомогенизацией и инкубацией образцов при 4 С в течение более 90 минут с постоянным перемешиванием. Образцы затем разбавляли в соотношении 1 к 10 в аналитическом буфере (50 мМ трис-HCl, рН 7,4,150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20 + 1% БСА), встряхивали и центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 4 С. Супернатант дополнительно разбавляли 1:1000 и добавляли в виде трех повторных образцов в анализируемый планшет. Уровни A40 и A42 измеряли так же, как для исследования с 4-недельным введением доз. Использовали дисперсионный анализ с лечением, полом и режимом введения доз, включенными в модель в качестве фиксированных факторов. Все взаимодействия между тремя факторами также были включены. Не наблюдали значимых отличий между двумя режимами введения доз (один или два раза в неделю). При таком плане эксперимента, во-первых, можно было оценить, есть ли какие-либо существенные различия между режимами введения доз и, во-вторых, если не наблюдали таких существенных различий, данные по двум режимам введения доз можно было объединить, повысив, таким образом, эффективность эксперимента путем удваивания количества мышей в анализе. Согласно этой парадигме, лечение антителом 2 Е 7 снижало нагрузку А 42 в ЦНС на 22%(р=0,0152). Уровни А 40 в ЦНС также были снижены на 12,1%, но этот числовой показатель не достигал статистической значимости (р=0,118). Для определения области ткани мозга, демонстрирующей бляшечную патологию, осуществляли комплексный иммуногистохимический анализ этих образцов. Были взяты гистологические срезы из коры на уровне хвостатого ядра и из коры на уровне гиппокампа. Смежные гистологические срезы обрабатывали специфическим антителом либо к А 40, либо к А 42, либо альтернативно амилоидным красителем конго красным. Используя программное обеспечение для анализа изображения, область гистологического среза, окрашенную на бляшки, выражали в виде процента от общей области гистологического среза. После фиксации погруженные в PFA полушария мозга разрезали в плоскости венечного шва на толстые срезы матрикса мозга размером 62 мм. Эти срезы толщиной 2 мм будут указаны как срезы A-F,где А - наиболее ростральный, a F - наиболее каудальный. Срезы А, В и С, и D, Е и F помещали в отдельные заливочные кассеты, пронумерованные для каждого животного. Кассеты выдерживали в PFA до тех пор, пока они не будут готовы для обработки и заливки. Заливку производили на гистопроцессоре Citadel 1000 (Shandon). Для всех тканей использовали следующие режимы обработки: 70% IMS - 1 ч,100% IMS - 31 ч,100% этанол - 2 ч,100% изобутиловый спирт - 12 ч; 11,5 ч,Histoclear - 21,5 ч,Парафиновый воск - 22 ч. При завершении цикла обработки пропитанные воском тканевые срезы переносили в заполненные расплавленным парафиновым воском формы и заливали с использованием системы заливки парафиномHistocentre (Shandon). Ткани заливали так, чтобы срезы А, В и С оказались в одной форме, a D, Е и F во второй форме. Такую обработку осуществляли для всех наборов срезов, то есть из каждого разделенного на две части мозга получали два восковых блока, по три среза в каждом. Срезы помещали в формы таким образом, чтобы каудальная поверхность каждого кусочка стала будущей поверхностью для резания. Следили за тем, чтобы каждый срез был тщательно прижат в форме для того, чтобы микротомирование каждого происходило параллельно. Затем перфорированную заливочную кассету осторожно помещали на каждую форму, которую затем заливали расплавленным воском. Затем залитые блоки охлаждали на охлаждаемой плите до тех пор, пока это не позволяло извлечь их из форм. Блоки хранили при комнатной температуре до тех пор, пока они не потребуются для микротомирования. Блоки разрезали на случайные и 5-микронные срезы, размещенные на предварительно меченных покрытых желатином предметных стеклах (стекла Superfrost, Erie Scientific Company). На каждом предметном стекле размещали по два среза. Когда это возможно, готовили последовательные срезы, и предметные стекла нумеровали последовательно от 1 до 25. Из каждого блока брали пятьдесят срезов (25 предметных стекол). Предметные стекла сушили на горячей плите и затем хранили при комнатной температуре до тех пор, пока не понадобятся. Иммуногистохимическое исследование проводили на наборах из 30 предметных стекол. На каждом- 21015654 предметном стекле верхний срез метили антителом против А 40 (G30, поликлональное кроличье антитело, распознающее -амилоид х-40), нижний срез метили антителом против А 642 (20G10, моноклональное антитело, распознающее -амилоид х-42). Минимально метили по 5 срезов на антитело из каждого блока. Мечение проводили следующим образом. После удаления парафина с помощью Histoclear и набора спиртов с повышающейся концентрацией срезы погружали в 85% муравьиную кислоту на 8 мин и затем блокировали в 0,3% перекиси водорода в течение 30 мин для блокирования эндогенных пероксидаз. Оба антитела, и G30, и 20G10, использовали в течение ночи в разведениях 1:1000; срезы оставляли при 4 С. Обработку срезов осуществляли с использованием соответствующих биотинилированных вторичных антител против кроличьих и мышиных антител. Проявление цвета осуществляли с использованием набора для окрашивания с диаминобензидина тетрагидрохлоридом (DAB, Vector Labs). Перед дегидратацией, очисткой и нанесением покровного стекла срезы подвергали короткому контрастирующему окрашиванию гематоксилином Майера. Срезы оставляли сушиться по меньшей мере на 48 ч перед микроскопией. Изображения получали с помощью микроскопа Leica DMRB, оснащенного цифровой камерой. Изображения анализировали с использованием программного обеспечения Qwin (Leica) и результаты представляли в виде % площади среза, меченной А-антителом. Использовали вариационный анализ с лечением, полом и режимом введения доз, включенными в данную модель в качестве фиксированных факторов. Все взаимодействия между тремя факторами также были включены. Не наблюдали значимых отличий между двумя режимами введения доз (один или два раза в неделю). При таком плане эксперимента, во-первых, можно было оценить наличие каких-либо значимых различий между режимами введения доз и, во-вторых, если не наблюдали таких значимых различий, данные по двум режимам введения доз можно было объединить, повысив, таким образом,мощность эксперимента с помощью удваивания количества мышей в анализе. Согласно этой парадигме лечение антителом 2 Е 7 снижало бляшечную патологию, измеренную с использованием антитела, распознающего А 42. Бляшечная патология уменьшалась на 27,1% (р=0,0026) в коре головного мозга на уровне гиппокампа и на 43% (р 0,0001) в коре головного мозга на уровне хвостатого ядра. Бляшечная патология также уменьшалась при оценке с использованием антитела, распознающего А 40. Бляшечная патология уменьшалась на 16,6% (р=0,0421) в коре головного мозга на уровне гиппокампа и на 17,3% (р=0,0342) в коре на уровне хвостатого ядра. Ни у одной мыши в этом исследовании, которую обрабатывали носителем или антителом 2 Е 7, не наблюдали признаков микрогеморрагии (как определяли с помощью окраски Перла Прусским синим). Этот способ визуализирует трехвалентное железо (железо является необходимой составляющей переносящего кислород гемоглобина, который обнаруживают в эритроцитах) с получением нерастворимого соединения голубого цвета. Все уровни мозга всех животных были чистыми. Когнитивные модели. После введения дозы в течение 4 месяцев 4-месячным мышам TASTPM, как описано выше, этих мышей исследовали в двух моделях когнитивных способностей: тест на распознавание объекта и тест на адаптацию к страху. Тест на распознавание объекта. Тест на распознавание объекта использует природное свойство животных исследовать новые объекты и основан на способности животных вспоминать ранее исследованный объект (знакомый объект). Сообщили, что восьмимесячные мыши TASTPM демонстрируют нарушение способности различать новые и знакомые объекты (Howlett et al., 2004), что указывает на нарушение когнитивных функций у этих животных. Однако в этом исследовании 8-месячные мыши TASTPM, которых обрабатывали носителем,не продемонстрировали наличия когнитивного нарушения, то есть они были способны различать новые и знакомые объекты. Таким образом, не было окна для исследования каких-либо потенциальных терапевтических эффектов, полученных от обработки антителом 2 Е 7. Тест на адаптацию к страху. Модель адаптации к страху была разработана для исследования способности животного сравнивать предшествующий болевой раздражитель с контекстуальным или ориентировочным сигналом и вспоминать это при предъявлении того же контекста или звукового сигнала после Xh-задержки. В этом исследовании 8-месячные мыши TASTPM, которых обрабатывали носителем (один или два раза в неделю), продемонстрировали нарушение контекстуальной дифференциации, указывающее на наличие когнитивного нарушения у этих животных. Лечение антителом 2 Е 7 не влияло на это нарушение при введении один или два раза в неделю. Введение дозы в течение 4 месяцев 6-месячным мышам TASTPM. Это исследование включает в себя введение антитела 2 Е 7 (300 мкг в/б два раза в неделю) 4 месячным мышам TASTPM, начиная с 3-месячного возраста. Контрольные животные получали lgG2a вPBS. Как описано выше, мозги иссекали и разделяли продольно на две части. Правое полушарие фиксировали путем погружения в 4% параформальдегид и обрабатывали для гистологического исследования.- 22015654 Левое полушарие собирали в предварительно взвешенные пробирки eppendorf объемом 2 мл, замораживали на сухом льде и хранили при -80 С для последующего анализа содержания амилоида. Предварительный анализ одного среза каждого из случайно выбранных образцов мозга (n=6 - носитель, n=7 - группа обработки антителом 2 Е 7) с помощью IHC (иммуногистохимия) осуществляли с использованием того же основного протокола, как приведено выше. Статистический анализ (t-критерий Стьюдента) показал, что в таламусе наблюдалось значительное снижение А 42-бляшечной нагрузки(71,9%, р=0,007) и в системе таламус+кора+гиппокамп (54,1%, р=0,022) у мышей, которых обрабатывали антителом 2 Е 7, но не показал значимого изменения по А 40. Для биохимической оценки А 40 и А 42 мозга образцы обрабатывали и оценивали, как описано выше (коэффициент разбавления 1:10000). Уровень А 42 был значимо снижен (р=0,01, на 29,9%) у мышей, которых обрабатывали антителом 2 Е 7 (n=12 - контроль, n=16 - обработка). Концентрации А 40 также были снижены (22,6%), но это снижение не достигло статистической значимости (р=0,052). Клонирование вариабельных областей гибридомы Последовательности вариабельных областей. Из клеток гибридомы 2 Е 7 извлекли тотальную РНК и затем получали последовательности кДНК вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Прямой праймер для ОТ-ПЦР представлял собой смесь вырожденных праймеров, специфичных к лидерной последовательности гена мышиного иммуноглобулина, а обратный праймер был специфичен к константным областям антитела; в этом случае: мышиный изотип lgG2a для тяжелой цепи и мышиная галла-область - для легкой цепи. Праймеры были сконструированы согласно стратегии, описанной Jones и Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). ОТ-ПЦР проводили в двух повторностях для последовательностей обеих V-областей для облегчения последующей верификации корректных последовательностей V-областей. Продукты V-областей, полученные с помощью ОТ-ПЦР, клонировали(Invitrogen ТА Cloning Kit) и получали данные по последовательностям. Аминокислотная последовательность VH антитела 2 Е 7 (SEQ ID NO: 17) В аминокислотных последовательностях подчеркнуты области, определяющие комплементарность(CDR). Клонирование и экспрессия химерного антитела 2 Е 7. Для того чтобы экспрессировать рекомбинантный продукт-антитело, который может быть использован для подтверждения корректного клонирования функциональных мышиных V-областей, создавали химерное антитело 2 Е 7 (2 Е 7 с), состоящее из родительских мышиных V-областей, перенесенных на человеческий lgG1 (мутантный Fc (L235A, G237A для тяжелой цепи или на человеческие С-каппа-области для легкой цепи. ДНК, кодирующую V-области тяжелой и легкой цепи мышиного антитела 2 Е 7, и эндогенные мышиные сигнальные последовательности клонировали в рамке в экспрессирующие векторы млекопитающих RLD-bshe (для тяжелой цепи) и RLN-bshe (для легкой цепи), уже содержащие человече- 23015654 ские константные области (мутантный Fc lgG1 (L235A, G237A) или человеческую С-каппа-область соответственно). Элементы экспрессирующего вектора RLD-bshe для экспрессии тяжелой цепи:(положение элементов и общий размер вектора, приведенные выше, даны только с иллюстративными целями и будут зависеть от размера вставки цепи антитела) Элементы экспрессирующего вектора RLN-bshe для экспрессии легкой цепи:(положение элементов и общий размер вектора, приведенные выше, даны только с иллюстративными целями и будут зависеть от размера вставки цепи антитела). Идентифицировали клоны с корректно клонированными последовательностями VH и VL и готовили плазмиды для экспрессии в суспензионной культуре клеток СНО. Экспрессированное антитело 2 Е 7 с очищали из супернатанта культуры клеток с помощью хроматографии с протеином А в системе FPLC, а затем исследовали связывание с А с помощью ELISA и SPR с использованием технологии Biacore. Результаты показали, что были клонированы и экспрессированы корректные V-области мышиного антитела 2 Е 7, что дало функциональное антитело с характеристиками, похожими на родительское мышиное антитело 2 Е 7. Гуманизация легкой цепи. Человеческую акцепторную последовательность с Genpept ID CAA51135 (SEQ ID NO:24) и номером доступа Genbank X72467, имеющую 77%-ную идентичность на аминокислотном уровне (включаяCDR), выбрали в качестве акцепторной каркасной области. Конструкция L1 представляет собой перенос мышиных CDR из VL-домена антитела 2 Е 7 в акцепторную каркасную область. Гуманизация тяжелой цепи. Человеческую последовательность с номером доступа Genbank M99675 (SEQ ID NO:21), аллель гена VH3-48 с 74%-ной идентичностью на аминокислотном уровне (включая CDR 1 и 2) с вариабельной областью тяжелой цепи мышиного антитела 2 Е 7 выбрали в качестве человеческой акцепторной каркасной области тяжелой цепи вместе с человеческим минигеном JH4. На основе последовательности М 99675 и JH4 были сконструированы три гуманизированных вариабельных варианта тяжелой цепи. Н 1 представляет собой перенос мышиных CDR с использованием определения по Kabat с двумя дополнительными обратными мутациями в каркасе по положениям 93 и 94. Н 2 и Н 3 оба были получены из Н 1, но включали одну дополнительную мутацию в каркасной области, разную для каждой конструкции (положения 24 и 48 соответственно, см. табл. 4). Таблица 4- 24015654 Конструирование ДНК гуманизированной тяжелой и легкой цепи. Гуманизированные V-области синтезировали de novo посредством создания перекрывающихся олигомеров и ПЦР-амплификации. Включали сайты рестрикции для клонирования в экспрессирующие векторы млекопитающих RLD-bshe и RLN-bshe и сигнальные последовательности, происходящие из выбранных человеческих акцепторных каркасных областей. ДНК, кодирующие гуманизированные Vобласти (Н 1 (SEQ ID NO:27), Н 2 (SEQ ID NO:29), Н 3 (SEQ ID NO:31), L1 (SEQ ID NO:33, вместе с сигнальными последовательностями и сайтами рестрикции затем клонировали в рамке в экспрессирующие векторы млекопитающих: Н 1, Н 2 и Н 3 в RLD-bshe для получения ДНК, кодирующей три полноразмерных Fc-мутантных тяжелых цепи человеческого lgG1, каждая из которых содержит мутации L235A и(SEQ ID NO:39); L1 клонировали в рамке в RLN-bshe, содержащий ДНК, кодирующую человеческую каппа-константную область, для получения ДНК, кодирующей полноразмерную человеческую каллалегкую цепь (SEQ ID NO:41). Типичные примеры экспрессии комбинаций гуманизированных тяжелых и легких цепей антитела Клетки CHOK1 временно трансфицировали в небольшом масштабе всеми комбинациями конструкций ДНК гуманизированных тяжелых и легких цепей: L1+H1, L1+H2, L1+H3 (SEQ ID NO: 35+41, 37+41,39+41) в 6-луночных планшетах. Клетки CHOK1, пассированные в DMEM F12 с 5% фетальной бычьей сыворотки с крайне низкой концентрацией IgG и 2 мМ глутамина, выращивали до конфлюэнтности в 6 луночных планшетах. Конфлюэнтные клетки трансфицировали всего 7,5 мкг ДНК: 30 мкг липида Transfast (Promega) в среде Optimem Glutamax (Invitrogen). Трансфицированные клетки инкубировали при 37 С с 5% СО 2. Через 72 часа собирали супернатанты и анализировали в отношении концентрации антитела, а затем тестировали на связывание с человеческим А с помощью ELISA. Гуманизированная L1 в сочетании со всеми тремя гуманизированными тяжелыми цепями экспрессировали полное антитело, которое связывается с человеческим А. Гуманизированные антитела также экспрессировали при временной трансфекции клеток CHOK1 в больших масштабах с использованием липосомальной доставки ДНК (например, TransFast (Promega и экспрессии в культуральных сосудах. Для оптимизации уровней экспрессии при временной трансфекции использовали соотношение ДНК экспрессирующих векторов тяжелой и легкой цепей 1:6. Материал, полученный при временной трансфекции, очищали с использованием колонок ProSepA или колонок дляFPLC с ProSepA HiTrap. Оценка связывания гуманизированных вариантов H1L1, H2L1 и H3L1 антитела 2 Е 7 с -амилоидом в ELISA. Гуманизированные варианты H1L1, H2L1 и H3L1 антитела 2 Е 7 оценивали на связывание с человеческим А-пептидом (1-40), биотинилированным по С-концу. Для сравнения использовали химерное антитело 2 Е 7. В табл. 5-7 представлены результаты для различных партий очищенного материала, полученного при временной трансфекции в больших масштабах. Таблица 5 Эти результаты показали очень похожие профили связывания с А для каждого из гуманизирован- 25015654 ных вариантов, происхоящих из антитела 2 Е 7. Сравнение значений ЕС 50 с 2 Е 7 показало небольшую потерю активности связывания с А в результате процесса гуманизации. Сравнение гуманизированных вариантов антитела 2 Е 7 с помощью конкурентного ELISA анализа. Химерные антитела 2 Е 7 с и гуманизированные антитела H1L1, H2L1 и H3L1 оценивали на их способность ингибировать связывание человеческого А-пептида с родительским мышиным мАТ (моноклональным антителом) 2 Е 7 в конкурентном ELISA анализе. Проводили два вида конкурентного ELISA анализа для того, чтобы сравнить активность связывания с A трех гуманизированных вариантов по сравнению с химерным антителом 2 Е 7. 1) Иммобилизованный -амилоид; биотинилированный человеческий А-пептид (1-40) иммобилизовали через стрептавидин на планшетах для ELISA. Добавляли мышиное антитело 2 Е 7 в постоянной концентрации вместе с сериями разведений гуманизированных вариантов антител, происходящих из антитела 2 Е 7. Связанные мышиные мАТ 2 Е 7 затем определяли с помощью конъюгата против мышиногоIgG. В табл. 8 представлены результаты двух анализов. Таблица 8 2) -Амилоид в растворе; постоянную концентрацию 6-амилоида предварительно инкубировали с сериями разведений гуманизированных вариантов антитела 2 Е 7 - смесь, содержащую находящийся в комлексе и свободный -амилоид, добавляли на короткий период времени в лунки, содержащие иммобилизованное мышиное мАТ 2 Е 7. Затем определяли количество свободного -амилоида, который был еще доступен для связывания иммобилизованного родительского мАТ 2 Е 7. В табл. 9 представлены результаты двух анализов. Таблица 9 Все гуманизированные варианты антитела ингибировали связывание мышиного мАТ 2 Е 7 с амилоидом с очень похожим профилем. Значения IC50, полученные для вариантов H2L1 и H3L1, были постоянно близки к значению для химерного антитела 2 Е 7 (когда его использовали), которое обладало наибольшей ингибирующей активностью в обоих анализах. Однако вариант H1L1 продемонстрировал несколько пониженную ингибирующую активность в обоих анализах, что указывает на возможно несколько меньшую аффинность к -амилоиду. Анализ SPR Biacore 2E7, 2 Е 7 с, H1L1, H2L1, H3L1. Кинетические параметры связывания рекомбинантного мышиного мАТ 2 Е 7, химерного антитела 2 Е 7 с и гуманизированных вариантов H1L1, H2L1 и H3L1 с человеческим бета-амилоидным пептидом (140) и (1-42) оценивали с использованием анализа Biacore на Biacore 3000. Использовали два различных формата анализа. Способ А.(1) Кратко, менее 20 резонансных единиц (RU) бета-амилоидного пептида (1-40) (биотинилированного по С-концу) иммобилизовали на стрептавидиновом биосенсорном чипе (как использовано для табл. 10 А). Антитела растворяли в буфере HBS-EP и пропускали над стрептавидин/бета-амилоидной поверхностью в концентрациях, варьирующих в диапазоне 0,001 нМ - 8 нМ (для табл. 10 А). Проводили два отдельных опыта; каждый опыт проводили на новой стрептавидин/бета-амилоидной поверхности. Опыты 1 и 2 были, по существу, одинаковыми, хотя имелись некоторые различия в используемых параметрах. Опыт 1 проводили с использованием поверхности чипа, на которой было иммобилизовано 16 RU бетаамилоида, и использовали концентрации антител в диапазоне 0,001 нМ - 8 нМ, использовали время ассоциации 4 минуты и время диссоциации 20 мин при скорости потока 50 мкл в минуту. Для опыта 2 было иммобилизовано менее 10 RU бета-амилоида, и использовали концентрации антител в диапазоне 0,003125 - 8 нМ. Скорость потока и время ассоциации были такими же, как в опыте 1, однако время дис- 26015654 социации было уменьшено до 15 мин.(2) Бета-амилоид (1-40) и (1-42) связывали посредством аминов с различными поверхностями биосенсорного чипа СМ 5 на уровне менее 20 резонансных единиц (как использовано для табл. 10 Б). Антитела разбавляли в буфере HBS-EP и пропускали над поверхностью биосенсор/бета-амилоид в концентрациях, варьирующих в диапазоне 1 - 64 нМ (как использовано для табл. 10 Б). Способ Б. Во втором случае использовали обращенный анализ, в котором сначала иммобилизовали антитела на уровне 1000-2500 резонансных единиц на поверхности с поликлональным антителом против мышиного IgG (для рекомбинантного мышиного мАТ 2 Е 7) или на поверхности с протеином А (для гуманизированного варианта H2L1) биосенсорного чипа СМ 5. Свежеприготовленный бета-амилоид (1-40) или (1-42) разбавляли в буфере HBS-EP и пропускали над поверхностью с иммобилизованным антителом в концентрациях, варьирующих в диапазоне 4-500 нМ (табл. 10 В и 10 Г). В обоих способах регенерацию осуществляли, пропуская 100 мМ Н 3 РО 4, а для данных табл. 10 А затем также проускали 50 мМ NaCl. Было показано, что поверхность стабильна и регенерация не влияет на нее. Все опыты выполняли с двойным контролем против контрольных инъекций буфера. Анализ осуществляли с использованием программного обеспечения BIAevaluation, версия 4.1, для анализа Biacore. Результаты Способ А(1) использовали для ранжирования антител по данным кинетики связывания с бетаамилоидом. Полученные данные представлены в табл. 10 А. Они демонстрируют, что родительское мАТ 2 Е 7 имеет KD 36,1 пМ для бета-амилоида, иммобилизованного на стрептавидине. Химерное антитело мыши и человека продемонстрировало несколько сниженную KD 45,8 пМ, а гуманизированные конструкции - диапазон от 54 (H2L1) до 93,6 пМ (H1L1). В заключение необходимо отметить, что эти данные демонстрируют, что процедура гуманизации была очень успешной и потеря аффинности очень незначительная. Дополнительные обратные мутации, введенные в Н 2 и Н 3, оказали небольшой, но полезный эффект, несмотря на то, что различия между конструкциями Н 2 и Н 3 находятся в пределах среднеквадратичных отклонений (SD) для этих экспериментов. Таблица 10 А Способ А(2) использовали для подтверждения того, что два дополнительных аминокислотных остатка на С-конце бета-амилоида (1-42) по сравнению с бета-амилоидом (1-40) незначительно меняют связывающие свойства антител 2 Е 7 и H2L1. Полученные данные представлены в табл. 10 Б и подтвержили это. Способ Б использовали для нейтрализации авидных эффектов, возможно наблюдаемых в первом формате анализа. Авидные эффекты, обусловленные одновременным связыванием обоих Fab-доменов одной молекулы антитела с двумя соседними бета-амилоидными молекулами на поверхности биосенсора(или в мультимерных формах бета-амилоида), могут увеличивать кажущуюся аффинность связывания. Измерения аффинности, полученные с использованием Способа Б, представлены в табл. 10 В. Таблица 10 В Доказательство того, что этот анализ обеспечивал истинные аффинности связывания 1:1, получали,когда Fab-фрагменты H2L1, полученные расщеплением папаином, связывали с иммобилизованным на стрептавидине бета-амилоидом (1-40) посредством способа, аналогичного способу А(1), с предполагаемой KD 2,4 нМ. Способ Б также использовали для подтверждения того, что два дополнительных аминокислотных остатка на С-конце бета-амилоида (1-42) по сравнению с бета-амилоидом (1-40) незначительно меняют связывающие свойства клона с идентичной последовательностью с мышиным мАТ 2 Е 7, названным 2F11. Полученные данные представлены в табл. 10 Г. Таблица 10 Г В исследовании, аналогичном картированию эпитопов антитела 2 Е 7 с использованием анализа методом поверхностного плазмонного резонанса, описанном выше, антитело H2L1 вело себя аналогично антителу 2 Е 7 при связывании с пептидом, охватывающим аминокислоты 1-12 (A1, SEQ ID NO:15) амилоидного пептида, но не с пептидом, охватывающим аминокислоты 2-13 -амилоидного пептида(А 2-13, SEQ ID NO:44). Активность H2L1 в модели оттока I125-амилоида. Для функционального сравнения гуманизированного антитела H2L1 с родительским мышиным моноклональным антителом 2 Е 7, оба антитела тестировали в одни и те же сутки в модели оттока I125 амилоида, описанной выше. Оба антитела H2L1 и 2 Е 7 значительно повышали число импульсов в минуту (СРМ) в крови по сравнению с контролем-носителем. СРМ радиоактивности в крови были следующими: носитель -1940166; 2 Е 7 - 100651386; H2L1 - 109131535. Использовали статистическую обработку ANOVA с вторичным LSD-тестом, носитель - n=7, 2E7 - n=6, H2L1 - n=6 (р 0,001 для каждого тестируемого соединения против носителя). Эти данные обеспечивают дополнительное доказательство того, что гуманизированное антителоH2L1 сохранило функциональные свойства, показанные для молекулы мышиного антитела 2 Е 7. Исследование фармакокинетики антител H2L1 и 2 Е 7. Исследовали конечный период полувыведения антитела у мышей. Тестируемое антитело вводили посредством внутривенной инфузии в течение 1 ч 4 мышам для получения целевой дозы 400 мкг на мышь. Проводили забор серии образцов крови от каждой мыши в течение 5 суток после введения дозы(одна мышь из группы антитела 2 Е 7 не завершила исследование и одна мышь из группы антитела H2L1 была исключена из последующего анализа, поскольку обнаружили, что дозу ввели не в/в). Уровни антител измеряли с использованием ELISA с иммобилизованным -амилоидом. Анализ данных показал, что гуманизированное антитело H2L1 обладает конечным периодом полувыведения у мышей, равным приблизительно 82 ч (табл. 11), что сравнимо с периодом для родительско- 28015654 го мышиного моноклонального антитела 2 Е 7 (приблизительно 75 ч). Таблица 11 Действие антитела H2L1 на периферическую амилоидную нагрузку у взрослых обезьян. Исследование проводили на взрослых яванских макаках (в возрасте приблизительно 15 лет) для изучения причинно-следственной связи в отношении образования и клиренса комплекса амилоид/Н 2L1 и последующих эффектов на уровни амилоида в ЦСЖ и ЦНС. Еженедельные образцы люмбальной ЦСЖ(которые брали при седации кетамином) и крови собирали в течение 3 недель до введения 1-й дозы антитела H2L1. Сразу же после забора образцов на 3-й неделе, а затем каждые две недели в течение 12 недель, животные получали плацебо (n=10), 0,1 мг/кг (n=5), 1 мг/кг (n=5) или 10 мг/кг (n=10) антителаH2L1. Образцы крови для анализа антитела H2L1 и А 42 в плазме забирали еженедельно. Образцы ЦСЖ для количественной оценки A40/42 забирали каждые 2 недели. После окончания периода введения дозы животных подвергали эвтаназии с целью количественного определения бета-амилоида в мозге с помощью биохимических анализов, описанных выше, и исследования микрогеморрагии. В группе с наименьшей дозой (0,1 мг/кг) животных подвергали эвтаназии по очереди для оценки потенциальной зависимости эффекта на уровни в мозге от времени, как следствия окончания введения дозы и, следовательно,насыщения пула амилоида в плазме. Исследование было санкционировано комитетом по биоэтике (Institutional Animal Care and UseCommittee (IACUC MACCINE Pte Ltd, или "Maccine", до начала экспериментальной фазы. Номер протокола IACUC 08-2006. Представители GSK (GlaxoSmithKlein) посетили Maccine и обсудили процесс рассмотрения этических аспектов и нашли его подходящим. Образцы плазмы подвергали последовательному разбавлению от 1:10 до 1:50000 и добавляли в планшеты для ELISA, покрытые A40. Получали стандартные кривые в диапазоне 0-10 мкг/мл антителаH2L1 в растворителе. После инкубации в течение ночи при 4 С антитело H2L1 визуализировали с использованием пероксидазы хрена против человеческого IgG (Amersham - разбавленная 1:2000 в растворителе) и системы детекции тетраметилбензидином. После однократного и повторного болюсного внутривенного введения уровни H2L1 в плазме продемонстрировали увеличение дозозависимым образом. Не было обнаружено признаков нелинейности в фармакокинетике, что указывало на то, что для большей части интервала между введениями дозы были достигнуты избыточные молярные концентрации антитела H2L1 в плазме по сравнению с уровнями свободного амилоида. В исходной плазме измеряли уровень общего А 42, используя коммерчески доступный набор дляELISA с A 1-42 (Innogenetics), в соответствии с инструкциями изготовителя и со стандартными кривыми в диапазоне 500-7 пг/мл, полученными в разбавителе из набора. Перед анализом в повторностях согласно инструкциям к набору, образцы и стандарты инкубировали в течение ночи при 4 С. Следует отметить, что вследствие интерференции детекции антитела, поставляемого с анализом А 42, этот набор не может быть использован для измерения уровней свободного А 42, а только для измерения предполагаемого "общего" А 42. Наблюдали повышение А 42 в зависимости от дозы и концентрации (с уровнями