Антагонистические антитела против пептида, связанного с геном кальцитонина, и способы их применения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ПЕПТИДА, СВЯЗАННОГО С ГЕНОМ КАЛЬЦИТОНИНА, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В данном изобретении раскрыты способы профилактики или лечения расстройств,ассоциированных с пептидом, связанным с геном кальцитонина (CGRP), таких как вазомоторные симптомы, включая головную боль (например, мигрень, кластерную головную боль и головную боль напряжения) и приливы крови, путем введения антагонистического антитела против CGRP. Также описано антагонистическое антитело G1 и антитела, являющиеся производными от G1,против CGRP. 015526 В данной заявке испрашивается приоритет заявки на патент США 60/736623, поданной 14 ноября 2005 г., включенной в данное описание путем ссылки. Область изобретения Настоящее изобретение относится к применению антагонистических антител против CGRP для профилактики, снижения интенсивности или лечения вазомоторных симптомов, таких как головные боли, связанные с CGRP (например, мигрень), и приливы крови. Предшествующий уровень техникиCGRP (пептид, связанный с геном кальцитонина) представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который относится к семейству пептидов, включающих кальцитонин, адреномедуллин и амилин. У людей существуют две формы CGRP (-CGRP и -CGRP), обладающих подобной активностью. Они отличаются по трем аминокислотам и демонстрируют различное распределение. По меньшей мере два подтипа рецепторов CGRP также могут являться причиной разных активностей. CGRP представляет собой нейромедиатор в центральной нервной системе, и показано, что он является сильным сосудорасширяющим агентом в периферических тканях, где нейроны, содержащие CGRP, тесно ассоциированы с кровеносными сосудами. Опосредованное CGRP расширение кровеносных сосудов также ассоциировано с нейрогенным воспалением как часть каскада событий, приводящих в результате к транссудации плазмы и расширению кровеносных сосудов микроциркуляторного русла, и присутствует при мигрени. Отмечали, что CGRP возможно связан с вазомоторными симптомами (Wyon et al. Scand. J. Urol.Nephrol. 35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000. Вазомоторные симптомы (VMS), такие как приливы крови и ночная потливость, представляют собой наиболее обычные симптомы, ассоциированные с менопаузой, возникающие у 60-80% всех женщин после естественной или вызванной хирургическим вмешательством менопаузы. Приливы крови вероятно представляют собой адаптивную реакцию центральной нервной системы (ЦНС) на снижение уровня половых стероидных гормонов(Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001. К настоящему времени наиболее эффективные способы лечения приливов крови представляют собой гормональные способы лечения, включающие эстрогены и/или некоторые прогестины. Гормональные способы лечения могут быть эффективны для уменьшения интенсивности приливов крови, но не подходят для всех женщин. Считают, что наблюдаемые психологические и эмоциональные симптомы, такие как нервозность, утомляемость, возбудимость, бессонница,депрессия, потеря памяти, головная боль, тревога, нервозность или неспособность концентрироваться,вызваны лишением сна из-за прилива крови и ночной потливости (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rdSCI: 3-7 (1992. Мужчины также испытывают приливы крови вследствие снижения концентрации стероидных гормонов (андрогенов). Это возникает в случаях возрастного снижения уровня андрогенов (Katovich, et al.,Proceedings of the Society for Experimental BiologyMedicine, 1990, 193(2): 129-35), а также в экстремальных случаях гормональной депривации, ассоциированной со способами лечения рака предстательной железы (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Одна треть этих пациентов испытывает устойчивые и частые, достаточно тяжелые симптомы, вызывающие значительный дискомфорт и неудобство.CGRP представляет собой сильный сосудорасширяющий агент, который вовлечен в патологию других вазомоторных симптомов, таких как все формы сосудистой головной боли, включая мигрени (с аурой или без нее) и кластерную головную боль. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004. Сывороточные уровни CGRP в наружной яремной вене повышаются у пациентов во время мигрени. Goadsby et al.,Ann. Neural. 28:183-7, 1990. Внутривенное введение человеческого -CGRP вызывало головную боль и мигрень у пациентов, страдающих мигренью без ауры, свидетельствуя о том, что CGRP является причиной мигрени. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002. Возможное вовлечение CGRP в мигрень составляет основу для разработки и тестирования ряда соединений, ингибирующих высвобождение CGRP (например, суматриптан), оказывающих антагонистическое действие в отношении рецептора CGRP (например, дипептидное производное BIBN4096BS(Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37, или взаимодействующих с одним или более чем одним из белков,ассоциированных с рецептором, таких как мембранный белок, модифицирующий рецепторную активность (RAMP), или белок-компонент рецептора (RCP), оба из которых влияют на связывание CGRP с его рецепторами. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Подтипы -2 адренорецепторов и аденозиновых A1 рецепторов также контролируют (ингибируют) высвобождение CGRP и тригеминальную активацию (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Агонист аденозинового А 1 рецептораGR79236 (метрафадил), который, как было продемонстрировано, ингибирует нейрогенное расширение кровеносных сосудов и тригеминальную ноцицепцию у людей, могут также обладать противомигренозной активностью (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292,2003). Эту теорию опровергает наблюдение того, что лечение соединениями, которые исключительно ингибируют нейрогенное воспаление (например, антагонисты тахикининового NK1 рецептора) или триге-1 015526 минальную активацию (например, агонисты рецептора 5HT1D), как продемонстрировано, относительно неэффективно в качестве способов лечения мигрени, приводя некоторых исследователей к вопросу о том, является ли ингибирование высвобождения CGRP первичным механизмом действия эффективных способов противомигренозного лечения. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004. Мигрень представляет собой распространенное сложное неврологическое состояние, характеризующееся тяжелыми эпизодическими приступами головной боли и ассоциированными симптомами, которые могут включать тошноту, рвоту, чувствительность к свету, звукам или движению. У некоторых пациентов головной боли предшествует аура или сопровождает ее. Головная боль может быть тяжелой и также может быть односторонней у некоторых пациентов. Приступы мигрени нарушают ежедневный образ жизни. В США и Западной Европе общая доля лиц, страдающих мигренью, составляет 11% от общей численности населения (6% мужчин; 15-18% женщин). Кроме того, средняя частота приступов у индивида составляет 1,5/месяц. Хотя существует множество способов лечения для уменьшения интенсивности или уменьшения симптомов, профилактическое лечение рекомендуется для пациентов, у которых в месяц случается более 3-4 приступов мигрени.Goadsby et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. Различные фармакологические способы вмешательства, которые используют для лечения мигрени,и различия в реакции среди пациентов представляют собой доказательство многообразной природы данного расстройства. Таким образом, такие относительно неизбирательные лекарства, как алкалоиды спорыньи (например, эрготамин, дигидроэрготамин, метисергид), которые проявляют серотонинергическую,а также адренергическую, норадренергическую и дофаминергическую активность, использовали в течение более восьми лет для лечения мигрени. Другие способы лечения включают опиаты (например, оксикодон) и Р-адренергические антагонисты (например, пропранолол). Некоторые пациенты, обычно пациенты, имеющие более слабые симптомы, способны контролировать свои симптомы с использованием лекарственных средств, отпускаемых без рецепта, таких как один или более чем один нестероидный противовоспалительный агент (NSAID), такой как комбинация аспирина, ацетаминофена и кофеина (например, Excedrin Migrain). Относительно недавно некоторых пациентов, страдающих мигренью, лечили топираматом, представляющим собой противосудорожное средство, блокирующее потенциалозависимые натриевые каналы и некоторые глутаматные рецепторы (АМРА-каинат), усиливающее активность рецептора А-типа аминомасляной кислоты (GABA-A) и блокирующее карбоангидразу. Относительно недавний успех применения агонистов серотониновых рецепторов 5HT-1B/1D и/или 5 НТ-1 а, таких как суматриптан, у некоторых пациентов привел исследователей к предположению о серотонинергической этиологии этого расстройства. К сожалению, хотя у некоторых пациентов обнаруживалась хорошая реакция на лечение, другие оставались относительно резистентными к его действиям. Выдвинуто предположение о том, что дисфункция ионного канала в аминергических ядрах ствола мозга лежит в основе этого расстройства, однако точная патофизиология мигрени пока хорошо не изучена. Продемонстрировано, что одна из форм мигрени, представляющая собой семейную гемиплегическую мигрень, ассоциирована с миссенс-мутациями в 1-субъединице потенциалозависимого кальциевого канала P/Q-типа, и весьма вероятно, что другие мутации ионного канала также могут быть обнаружены в других группах пациентов. Хотя расширение кровеносных сосудов ассоциировано с болевыми симптомами мигрени и усиливает их, такими как нейрососудистые явления, в настоящее время считают, что они представляют собой скорее результат, а не причину состояния. В целом дисфункцию путей ствола мозга,модулирующую сенсорный вход, рассматривают как общий признак мигрени. Goadsby, P.J. et al., NewEngl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. В данной заявке на изобретение сделана ссылка на различные публикации (включая патенты и заявки на патенты). Описания этих публикаций включены здесь путем ссылки. Краткое изложение сущности изобретения Раскрытое здесь изобретение относится к антагонистическим антителам против CGRP и способам применения антагонистических антител против CGRP для лечения или профилактики вазомоторных симптомов, таких как головные боли, такие как мигрень с аурой или без нее, гемиплегическая мигрень,кластерные головные боли, мигренозная невралгия, хронические головные боли, головные боли напряжения и головные боли, возникающие в результате других медицинских состояний (таких как инфекция или повышенное черепное давление в результате опухоли). Другие вазомоторные симптомы включают приливы крови. В одном из аспектов в настоящем изобретении предложен способ лечения или профилактики по меньшей мере одного вазомоторного симптома у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP. В одном из аспектов в настоящем изобретении предложен способ лечения или профилактики головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP. В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, сни-2 015526 жения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP. В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля,снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли) у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения головной боли. Такие дополнительные агенты включают 5 НТ (5-гидрокситриптамин)1-подобные агонисты (и агонисты, действующие в других сайтах 5-НТ 1) и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID). Примеры агонистов 5-НТ 1, которые могут быть использованы в комбинации с антителом противCGRP, включают класс соединений, известных как триптаны, такие как суматриптан, золмитриптан, наратриптан, ризатриптан, элетриптан, алмотриптан и фроватриптан. Также известно, что алкалоиды спорыньи и родственные соединения обладают агонистической активностью в отношении 5-НТ и используются для лечения головной боли, такой как мигрень. К таким соединениям относятся эрготамина тартрат, эргоновина малеат и эрголоида мезилаты (например, дигидроэргокорнин, дигидроэргокристин, дигидроэргокриптин и дигидроэрготамина мезилат (DHE 45. Примеры NSAID, которые могут быть использованы в комбинации с антителом против CGRP,включают напроксен, флурбипрофен, кетопрофен, оксапрозин, этодолак, индометацин, кеторолак, набуметон, мефенамовая кислота и пироксикан. Дополнительные NSAID включают ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ-2). Члены этой группы включают целекоксиб; рофекоксиб; мелоксикам; JTE-522; L745,337; NS398 и их фармацевтически приемлемые соли. В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела противCGRP. В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля,снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела противCGRP в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения приливов крови. Такие дополнительные агенты включают гормональное лечение, включая эстрогены и/или прогестины, но не ограничены ими. В одном из воплощений антагонистическое антитело против CGRP, используемое в любом из вышеописанных способов, представляет собой любое из описанных здесь антител. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP распознает человеческийCGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывается с человеческим-CGRP и -CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывается с человеческим и крысиным CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывается с С-концевым фрагментом, имеющим аминокислоты 25-37 CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывается с С-концевым эпитопом в пределах аминокислот 25-37 CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP является гуманизированным. В некоторых воплощениях антитело является человеческим. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP представляет собой антитело G1 (как здесь описано). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP содержит один или более чем один гипервариабельный участок (CDR) (например, один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть CDR) антитела G1 или вариантов G1, представленных в табл. 6. В других воплощениях антагонистическое антитело против CGRP содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную на фиг. 5 (SEQ ID NO: 1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную на фиг. 5 (SEQ ID NO: 2). В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, такую как константную область, являющуюся иммунологически инертной (включая частично иммунологически инертную), например, не запускающую лизис, опосредованный системой комплемента, не стимулирующую антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), не активирующую микроглию или у которой одна или более чем одна из этих активностей снижена. В некоторых воплощениях константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; международной заявкеPCT/GB 99/01441 и/или заявке на патент Великобритании 9809951.8. В других воплощениях антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG2, включающую следующие мутации: А 330 Р 331 на S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательностьIgG2 дикого типа). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь человеческого IgG1 с любой из следующих-3 015526 мутаций: 1) А 327 А 330 Р 331 на G327S330S331; 2) E233L234L235G236 на P233V234A235 с делецией G236; 3) E233L234L235 на P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327 А 330 Р 331 на P233V234A235G327S330S331 с делецией G236; 5) E233L234L235 А 327 А 330 Р 331 на P233V234A235G327S330S331 и 6) N297 на А 297 или любую другую аминокислоту, за исключением N. В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь человеческого IgG4 с любой из следующих мутаций: E233F234L235G236 на P233V234A235 с делецией G236; E233F234L235 на P233V234A235 и S228L235 на Р 228 Е 235. В других воплощениях константная область агликозилирована для N-связанного гликозилирования. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для N-связанного гликозилирования путем мутации остатка, по которому происходит присоединение олигосахарида (такого как Asn297) и/или фланкирующих остатков, которые представляют собой часть последовательности, распознающейN-гликозилирование, в константной области. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для N-связанного гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована дляN-связанного гликозилирования ферментативно или путем экспрессии в клетках-хозяевах, дефектных по гликозилированию. Аффинность связывания (KD) антагонистического антитела против CGRP в отношении CGRP (такого как человеческий -CGRP, измеренная посредством поверхностно-плазмонного резонанса, при подходящей температуре, такой как 25 или 37 С) может составлять от приблизительно 0,02 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500,приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительно 50, приблизительно 20, приблизительно 15,приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 250, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ. Антагонистическое антитело против CGRP может быть введено до, во время и/или после возникновения головной боли. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP вводят перед приступом головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли). Введение антагонистического антитела против CGRP может быть осуществлено любым из способов, известных в данной области, включая пероральный, внутривенный, подкожный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрисердечный, интраспинальный, внутригрудной, внутрибрюшинный, интравентрикулярный, подъязычный,трансдермальный способ, и/или путем ингаляции. Введение может быть системным, например внутривенным, или местным. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP может быть введено в комбинации с другим агентом, таким как другой агент для лечения головной боли. В еще одном аспекте в изобретении предложено применение антагонистического антитела противCGRP для изготовления лекарственного средства для применения в любом из описанных здесь способов,например, для лечения или профилактики головной боли. В еще одном аспекте в изобретении предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения головной боли (например, мигрени и кластерной головной боли), содержащая эффективное количество антагонистического антитела против CGRP в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. В еще одном аспекте в изобретении предложен набор для применения в любом из описанных здесь способов. В некоторых воплощениях набор содержит контейнер, композицию, содержащую вышеописанное антагонистическое антитело против CGRP, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и инструкции по применению композиции в любом из описанных здесь способов. В настоящем изобретении также предложены антагонистические антитела против CGRP и полипептиды, имеющие происхождение из антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6. Соответственно, в одном из аспектов изобретение представляет собой антитело G1 (взаимозаменяемым образом называемое "G1"), которое продуцируется экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6866 и РТА-6867 в Американской коллекции типовых культур АТСС. Например, одно из воплощений представляет собой антитело, включающее тяжелую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором,имеющим номер РТА-6867 в АТСС. Еще один аспект представляет собой антитело, включающее легкую цепь, продуцируемую экспрессирующим вектором, имеющим номер РТА-6866 в АТСС. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи G1 показаны на фиг. 5. Фрагменты гипервариабельного участка (CDR) антитела G1 (включающей CDR Чотиа и Кабата) также показаны на фиг. 5. Понятно, что ссылка на любую часть или целую область G1 охватывает последовательности, продуцируемые экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6866 и РТА-6867 в АТСС, и/или последовательности, представленные на фиг. 5. В изобретении также предложены варианты-4 015526 антитела G1 с аминокислотными последовательностями, представленными в табл. 6. В одном из аспектов изобретение представляет собой антитело, включающее домен VH, который по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен по аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: l. В еще одном аспекте изобретение представляет собой антитело, включающее домен VL, который по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен по аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2. В еще одном аспекте изобретение представляет собой антитело, включающее фрагмент или область антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6. В одном из воплощений фрагмент представляет собой легкую цепь антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи, представленную на фиг. 5. В еще одном воплощении фрагмент содержит один или более чем один CDR легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела G1. В еще одном аспекте в изобретении предложены полипептиды (которые могут представлять собой или не представлять собой антитело), включающие VH CDR3, как представлено в SEQ ID NO: 5, или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 5 по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным заменам. В конкретном воплощении такие аминокислотные замены представляют собой консервативные замены. В еще одном аспекте в изобретении предложены полипептиды (которые могут представлять собой или не представлять собой антитело), включающие VL CDR3, как представлено в SEQ ID NO: 8, или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 8 по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным заменам. В конкретном воплощении такие аминокислотные замены представляют собой консервативные замены. В еще одном аспекте изобретения предложены полипептиды (которые могут представлять собой антитело или могут не представлять собой антитело), включающие любой один или более чем один из следующих: а) один или более чем один CDR антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; б) CDR H3 тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; в) CDR L3 легкой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; г) три CDR легкой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; д) три CDR тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; е) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов,представленных в табл. 6. В изобретении также предложены полипептиды (которые могут представлять собой антитело или могут не представлять собой антитело), включающие любой один или более чем один из следующих: а) один или более чем один (один, два, три, четыре, пять или шесть) CDR, имеющих происхождение из антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; б) CDR, имеющий происхождение из CDR H3 тяжелой цепи антитела G1; и/или в) CDR, имеющий происхождение из CDR L3 легкой цепи антитела G1. В некоторых воплощениях CDR представляет собой CDR, представленный на фиг. 5. В некоторых воплощениях один или более чем один CDR, имеющий происхождение из антителаG1 или его вариантов, представленных в табл. 6, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88%, по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичен по меньшей мере одному, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести CDR G1 или его вариантов. В некоторых воплощениях CDR представляет собой CDR Кабата. В других воплощениях CDR представляет собой CDR Чотиа. В других воплощениях CDR представляет собой комбинацию CDR Кабата и Чотиа (также называемую "комбинированный CDR" или "расширенный CDR"). Другими словами,для любого из данных воплощений, содержащих более чем один CDR, CDR может представлять собой любой из CDR Кабата, Чотиа и/или комбинированный. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность KASKXaaVXaaTYVS, где Хаа в положении 5 представляет собой R, W, G, L или N; и где Хаа в положении 7 представляет собой Т, А, D, G, R, S, W или V. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность KASKXaaVXaaTYVS представляет собой CDR1 легкой цепи антитела. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последова-5 015526 тельность XaaXaaSNRYXaa, где Хаа в положении 1 представляет собой G или А; где Хаа в положении 2 представляет собой А или Н; и где Хаа в положении 7 представляет собой L, Т, I или S. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность XaaXaaSNRYXaa представляет собой CDR2 легкой цепи антитела. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, где Хаа в положении 5 представляет собой Е, R, K, Q или N; где Хаа в положении 8 представляет собой A, G, N, E, H, S, L, R, С, F, Y, V, D или Р; где Хаа в положении 9 представляет собой S, G, T, Y, С, Е, L, A, P, I, N, R, V, D или М; где Хаа в положении 12 представляет собой Н или F; где Хаа в положении 15 представляет собой Е или D. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG представляет собойCDR2 тяжелой цепи антитела. В некоторых воплощениях полипептид (такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где аминокислотный остаток в положении 99 SEQ ID NO: 1 представляет собойL или замещен на A, N, S, Т, V или R; и где аминокислотный остаток в положении 100 в SEQ ID NO: 1 представляет собой А или замещен на L, R, S, V, Y, С, G, Т, K или Р. В некоторых воплощениях антитело по изобретению представляет собой человеческое антитело. В других воплощениях антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых воплощениях антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антитело (или полипептид) является выделенным. В некоторых воплощениях антитело (или полипептид) является, по существу, чистым. Константная область тяжелой цепи антител может иметь любой из типов константной области, такой как IgG, IgM, IgD, IgA и IgE; и любой изотип, такиой как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, описанную здесь. В еще одном аспекте в изобретении предложен полинуклеотид (который может быть выделен),включающий полинуклеотид, кодирующий фрагмент или область антитела G1, или его варианты, представленные в табл. 6. В одном из воплощений фрагмент представляет собой легкую цепь антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент содержит одну или более чем одну вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела G1. В еще одном воплощении фрагмент содержит один или более чем один (т.е. один, два, три,четыре, пять или шесть) гипервариабельный участок (CDR) легкой цепи и/или тяжелой цепи антителаG1. В еще одном аспекте изобретение представляет собой полинуклеотид (который может быть выделен), включающий полинуклеотид, кодирующий антитело G1 или его варианты, представленные в табл. 6. В некоторых воплощениях полинуклеотид включает любой или оба полинуклеотида, представленные в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В еще одном аспекте в изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие любое из описанных здесь антител (включая фрагменты антител) или полипептидов. В еще одном аспекте в изобретении предложены векторы (включая экспрессирующие и клонирующие векторы) и клетки-хозяева, включающие любые из раскрытых здесь полинуклеотидов. В некоторых воплощениях вектор представляет собой pDb.CGRP.hFcGI, имеющийРТА-6867 АТСС. В других воплощениях вектор представляет собой pEb.CGRP.hKGI, имеющийРТА-6866 АТСС. В еще одном аспекте изобретение представляет собой клетку-хозяина, включающую полинуклеотид, кодирующий любое из описанных здесь антител. В еще одном аспекте изобретение представляет собой комплекс CGRP, связанного с любыми описанными здесь антителами или полипептидами. В некоторых воплощениях антитело представляет собой антитело G1 или его варианты, представленные в табл. 6. В еще одном аспекте изобретение представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество любого из описанных здесь полипептидов (включая антитела, такие как антитело, включающее один или более чем один CDR антитела G1) или полинуклеотидов и фармацевтически приемлемый эксципиент. В еще одном аспекте изобретение представляет собой способ получения антитела G1, включающий культивирование клетки-хозяина или ее потомства в условиях, которые обеспечивают продуцирование антитела G1, где клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, кодирующий антитело G1; и в некоторых воплощениях очистку антитела G1. В некоторых воплощениях экспрессирующий вектор включает одну или обе полинуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В еще одном аспекте в изобретении предложены способы получения любого из описанных здесь антител или полипептидов путем экспрессии одного или более чем одного полинуклеотида, кодирующего антитело (которые могут быть экспрессированы раздельно в виде одной легкой или тяжелой цепи, или легкая и тяжелая цепь, обе, экспрессируются с одного вектора) или полипептид в подходящей клетке, как правило, с последующим извлечением и/или выделением интересующего антитела или полипептида. Антагонистическое антитело против CGRP и полипептиды, а также полинуклеотиды, кодирующие-6 015526 антитела и полипептиды по настоящему изобретению, могут быть использованы для лечения, профилактики, уменьшения интенсивности, контроля или снижения частоты заболеваний, ассоциированных с аномальной функцией CGRP, таких как головная боль (например, мигрень, кластерная головная боль,хроническая головная боль и головная боль напряжения) и другие состояния, которые можно лечить или предупреждать посредством антагонистической активности в отношении CGRP. В еще одном аспекте в изобретении предложены наборы и композиции, содержащие любую одну или более чем одну из описанных здесь композиций. Эти наборы, как правило, находящиеся в подходящей упаковке и снабженные подходящими инструкциями, полезны для любых из описанных здесь способов. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлена таблица, демонстрирующая аффинности связывания 12 мышиных антител в отношении различных аланинзамещенных фрагментов человеческих -CGRP. Аффинности связывания измеряли при 25 С с использованием Biacore при помощи потока Fab через CGRP на чипе. Значения в рамке представляют потерю аффинности аланиновых мутантов по отношению к родительскому фрагменту 25-37 (курсив) за исключением K35A, который получен из родительского 19-37. а означает аффинности в отношении фрагментов 19-37 и 25-37 и представляет собой среднее значениестандартное отклонение для двух независимых измерений на различных сенсорных чипах. b означает данные взаимодействия, отклоняющиеся от модели простого бимолекулярного взаимодействия из-за бифазного аномального режима, так что их аффинности определяли с использованием модели конформационного изменения. Шкала полутонов: белый (1,0) означает родительскую аффинность; светло-серый (менее чем 0,5) означает более высокую аффинность по сравнению с родительской; темно-серый (более 2) означает более низкую аффинность по сравнению с родительской и черный означает отсутствие связывания. На фиг. 2 А и 2 В показан эффект введения CGRP 8-37 (400 нмоль/кг), антитело 4901 (25 мг/кг) и антитело 7D11 (25 мг/кг) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. CGRP 8-37 вводили внутривенно (в.в.) за 3-5 мин до стимуляции электрическим импульсом. Антитела вводили внутрибрюшинно (в.б.) за 72 ч до стимуляции электрическим импульсом. Каждая точка на графиках представляет собой площадь под кривой (AUC) для крысы, которую лечили в указанных условиях. Каждая линия на графиках представляет собой среднююAUC для крыс, которых лечили в указанных условиях. AUC (площадь под кривой) равна потоквремя. "поток" представляет собой изменение единиц потока после стимуляции электрическим импульсом; и "время" представляет собой период времени для уровня потока клеток крови для возвращения к уровню до стимуляции электрическим импульсом. На фиг. 3 показан эффект введения различных доз антитела 4901 (25, 5, 2,5 или 1 мг/кг) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитела вводили внутривенно (в.в.) за 24 ч до стимуляции электрическим импульсом. Каждая точка на графике представляет собой AUC для одной крысы, которую лечили в указанных условиях. Линия на графике представляет собой среднюю AUC для крыс, которых лечили в указанных условиях. На фиг. 4 А и 4 В показан эффект введения антитела 4901 (1 или 10 мг/кг, в.в.), антитела 7 Е 9 (10 мг/кг, в.в.) и антитела 8 В 6 (10 мг/кг, в.в.) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитела вводили внутривенно (в.в.) с последующей стимуляцией электрическим импульсом через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела. Ось Y представляет процент AUC по сравнению с уровнем AUC без введения антитела (время 0). Ось X представляет период времени (минуты) между введением антител и стимуляцией электрическим импульсом.означает Р 0,05 иозначает Р 0,01 по сравнению со временем 0. Данные анализировали с использованием одностороннего ANOVA и теста множественных сравнений Даннета. На фиг. 5 представлена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи(SEQ ID NO: 1) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 2) антитела G1. CDR Кабата выделены жирным шрифтом, a CDR Чотиа подчеркнуты. Аминокислотные остатки вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи пронумерованы последовательно. На фиг. 6 представлено картирование эпитопа антитела G1 посредством пептидной конкуренции с использованием Biacore. N-Биотинилированный человеческий -CGRP прикрепляли к сенсорному чипуSA. G1 Fab (50 нМ) в отсутствие конкурентного пептида или после предварительной инкубации в течение 1 ч с 10 мкМ конкурентного пептида пропускали через чип. Измеряли связывание G1 Fab с человеческим -CGRP на чипе. Ось Y представляет процент связывания, блокируемого вследствие присутствия конкурирующего пептида, по сравнению со связыванием в отсутствие конкурирующего пептида. На фиг. 7 показан эффект введения антитела G1 (1 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), 0,01% Tween 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с. Антитело G1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) с последующей стимуляцией нерва электрическим импульсом через 30, 60, 90 и 120 мин после введения антитела. Ось Y представляет процент AUC по сравнению с уровнем AUC без введения антитела или разбавителя (определенного как 100%) (время 0). Ось X пред-7 015526 ставляет период времени (минуты) между введением антитела и стимуляцией электрическим импульсом.означает Р 0,05 иозначает Р 0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием двухстороннего ANOVA и апостериорного теста Бонферрони. На фиг. 8 А показан эффект введения антитела G1 (1, 3 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (PBS,0,01% Tween 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с через 24 ч после введения дозы. Антитело G1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 24 ч до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Y представляет общую площадь под кривой (изменение потока клеток крови, умноженное на изменение времени от стимуляции до возвращения потока до базового уровня, AUC). Ось X представляет различные дозы антителаG1.означает Р 0,05 иозначает Р 0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннего ANOVA и теста множественного сравнения Данна. На фиг. 8 В показан эффект введения антитела G1 (0,3, 1, 3 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя (PBS,0,01% Tween 20) на кровоток в коже, измеренный в виде потока клеток крови после стимуляции электрическим импульсом в течение 30 с через 7 суток после введения дозы. Антитело G1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 7 суток до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Y представляет общую AUC. Ось X представляет различные дозы антитела G1.означает Р 0,01 иозначает Р 0,001 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннегоANOVA и теста множественного сравнения Данна. На фиг. 8 С представлен анализ подгонки кривой с данными из фиг. 8 А и 8 В. Антитело G1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 24 ч или 7 суток до стимуляции нерва электрическим импульсом. Ось Y представляет общую AUC. Ось X представляет различные дозы антитела G1 в мг/кг в логарифмической шкале для определения средней эффективной концентрации ЕС 50. На фиг. 9 показан эффект антитела mu7E9 (10 мг/кг), BIBN4096BS или разбавителя (PBS, 0,01%Tween 20) на изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Антитело mu7E9, BIBN4096BS или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) в момент времени 0 мин после оценки базового ответа на электрическую стимуляцию. Ось Y представляет изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Диаметр в свободном состоянии соответствует 0%. Ось X представляет время (минуты) стимуляции электрическим импульсом.означает Р 0,05 иозначает Р 0,01 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием одностороннего ANOVA и теста множественного сравнения Даннета. На фиг. 10 показан эффект различных доз антитела G1 (1, 3 или 10 мг/кг, в.в.) или разбавителя(PBS, 0,01% Tween 20) на изменение диаметра средней менингеальной артерии после стимуляции электрическим полем. Антитело G1 или разбавитель вводили внутривенно (в.в.) за 7 суток до стимуляции электрическим полем. Ось Y представляет изменение диаметра средней менингеальной артерии. Диаметр в спокойном состоянии соответствует 0%. Ось X представляет стимулирующее напряжение.означает Р 0,05,означает Р 0,01 иозначает Р 0,001 по сравнению с разбавителем. Данные анализировали с использованием двухстороннего ANOVA и апостериорного теста Бонферрони. На фиг. 11 А показан эффект антитела mu4901 (10 мг/кг) или разбавителя (PBS, 0,01% Tween 20),введенного внутривенно (в.в.) за 24 ч, на уменьшение внутренней температуры, вызванное подкожной инъекцией налоксона (1 мг/кг) у крыс, страдающих зависимостью от морфина. Ось Y представляет разницу температур, исходя из базового значения. Ось X представляет время, измеренное с момента инъекции налоксона. На фиг. 11 В показан эффект антитела mu4901 (10 мг/кг) или разбавителя (PBS, 0,01% Tween 20),введенного внутривенно (в.в.) за 24 ч, на увеличение поверхностной температуры хвоста, вызванное подкожной инъекцией налоксона (1 мг/кг) у крыс, страдающих зависимостью от морфина. Ось Y представляет разницу температур, исходя из базового значения. Ось X представляет время, измеренное с момента инъекции налоксона. Подробное описание изобретения В раскрытом здесь изобретении предложены способы лечения и/или профилактики вазомоторных симптомов, таких как головная боль (например, мигрень, кластерная головная боль, хроническая головная боль и головная боль напряжения) или прилив крови, у индивида путем введения указанному индивиду терапевтически эффективного количества антагонистического антитела против CGRP. В раскрытом здесь изобретении также предложены антагонистические антитела против CGRP и полипептиды, имеющие происхождение из G1, или его варианты, представленные в табл. 6. В изобретении также предложены способы получения и применения этих антител и полипептидов. Общие способы. При практическом применении настоящего изобретения, если не указано иначе, используют общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные технологии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники. Такие способы полностью описаны в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotid Synthesis (MJ."Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и так далее, по меньшей мере через один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Использованный здесь термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, а также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одну цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие фрагмент антитела (такие как доменные антитела), и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, включающую сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), и антитело не обязательно должно принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно могут быть разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы , , ,исоответственно. Хорошо известны структуры и трехмерные конфигурации субъединиц различных классов иммуноглобулинов. Использованный здесь термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, включающие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут быть представлены в минорных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам поликлонального антитела, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение "моноклональное" указывает на природу антитела, получаемого, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должен рассматриваться как требующий, чтобы антитела были получены каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler andMilstein, 1975, Nature, 256:495, или могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, такими как описано в патенте США 4816567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, создаваемых с использованием способов, описанных, например, в McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. Используемые здесь "гуманизированные" антитела относятся к формам антител, не являющихся человеческими (например, мышиным), представляющим собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка (CDR) реципиента замещены остатками CDR видов, не являющихся человеческими (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающие желаемой специфичностью, аффинностью и биологической активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированное антитело может включать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в последовательностях донорного CDR или каркасной области, а включены для дополнительного улучшения и оптимизации функции антитела. Как правило, гуманизированное антитело включает, по существу, все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все области FR представляют собой области консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также включает, по меньшей мере, фрагмент константной области или домен (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Антитела могут иметь Fc-области, модифи-9 015526 цированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют один или более чем один CDR (один, два, три, четыре, пять, шесть), которые изменены относительно исходного антитела, которые также названы как один или более чем один CDR, "имеющий происхождение из" одного или более чем одного CDR исходного антитела. Используемое здесь "человеческое антитело" означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или полученного с использованием любого из способов получения человеческих антител, известных в данной области техники или раскрытых здесь. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Один из таких примеров представляет собой антитело, включающее полипептиды легкой цепи мышиного антитела и полипептиды тяжелой цепи человеческого антитела. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области техники. В одном из воплощений человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, экспрессирующей человеческие антитела (Vaughanand Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локуса человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, в которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени(такие В-лимфоциты могут быть выделены у индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner etal., 1991, J. Immunol, 147 (l):86-95 и патент США 5750373. Использованный здесь термин "пептид, связанный с геном кальцитонина" и "CGRP" относится к любой форме пептида, связанного с геном кальцитонина, и его вариантам, которые сохраняют по меньшей мере часть активности CGRP. Например, CGRP может представлять собой -CGRP или -CGRP. Использованный здесь CGRP включает все виды нативной последовательности CGRP млекопитающих,например человека, собаки, кошки, лошади и быка. Использованный здесь термин "антагонистическое антитело против CGRP" (взаимозаменяемым образом называемое "антитело против CGRP") относится к антителу, способному связываться с CGRP и ингибировать биологическую активность CGRP и/или последующий(ие) сигнальный(ые) путь(и), опосредованный(ые) CGRP. Антагонистическое антитело против CGRP охватывает антитела, которые блокируют, оказывают антагонистическое действие, подавляют или уменьшают (в том числе существенно) биологическую активность CGRP, включая последующие сигнальные пути, опосредованные CGRP, такие как связывание рецептора и/или индуцирование клеточного ответа на CGRP. Для задач настоящего изобретения понятно, что термин "антагонистическое антитело против CGRP" охватывает все ранее идентифицированные термины, наименования и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам CGRP, биологическая активность CGRP (включая его способность опосредовать любые виды головной боли, но не ограниченные ею) или проявления биологической активности, по существу, сводятся к нулю, уменьшаются или нейтрализуются в любой значимой степени. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывает CGRP и предотвращает связываниеCGRP с рецептором CGRP. В других воплощениях антитело против CGRP связывает CGRP и предотвращает активацию рецептора CGRP. Здесь приведены примеры антагонистических антител противCGRP. Используемые здесь термины "G1" и "антитело G1" используют взаимозаменяемым образом для ссылки на антитело, продуцируемое экспрессирующими векторами, имеющими номера РТА-6867 АТСС и РТА-6866 АТСС. Аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи представлена на фиг. 5. Фрагменты CDR антитела G1 (включая CDR Чотиа и Кабата) схематически показаны на фиг. 5. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, представлены в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Характеристика G1 описана в примерах. Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" используют здесь взаимозаменяемым образом для ссылки на полимеры аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, может включать модифицированные аминокислоты и может быть прерван фрагментами, не являющимися аминокислотами. Эти термины также охватывают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или путем вмешательства; например, образование дисульфидной связи,гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгирование с метящим компонентом. Также в определение включены,например, полипептиды, содержащие один или более чем один аналог аминокислоты (включающий, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Следует понимать, что поскольку полипептиды по изобретению основаны на антителе, данные полипептиды могут существовать в виде единичных цепей или ассоциированных цепей.- 10015526 Используемые здесь взаимозаменяемым образом "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги или любой субстрат, который может быть включен в полимер посредством ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует модификация нуклеотидной структуры, она может быть произведена перед или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, таким образом как конъюгирование с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замещение одного или более чем одного из встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), содержащие боковые группировки, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды,поли-L-лизин и т.д.), со вставками (например, акридин, псорален и т.д.), содержащие хелатообразователи(например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), содержащие алкилаторы, с модифицированными связями (например, -аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть замещена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами, или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5'- и 3'-концевая группа ОН может быть фосфорилирована или замещена аминами или органическими кэпирующими группировками из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть преобразованы до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые в общем известны в данной области техники, включая,например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара,фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и неосновные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или более чем одна фосфодиэфирная связь может быть замещена альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают воплощения, в которых фосфат замещен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), "(O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR, СО или СН 2 ("формацеталь"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), возможно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил, но не ограничены ими. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем упомянутым здесь полинуклеотидам,включая РНК и ДНК."Вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации. Вариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей состоят из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные участки. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством FR и вместе с CDR другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител. Существуют по меньшей мере два способа определения CDR: (1) подход, основанный на вариабельности последовательности между видами (т.е.Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD; и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антигенантитело (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948. Использованный здесь CDR может относиться к CDR, определенному любым из подходов или комбинацией обоих подходов."Константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации. Эпитоп, который "предпочтительно связывается" или "специфически связывается" (используют здесь взаимозаменяемым образом) с антителом или полипептидом, представляет собой термин, хорошо понятный в данной области техники, и способы определения такого специфического или предпочтительного связывания хорошо известны в данной области техники. Считают, что молекула демонстрирует"специфическое связывание" или "предпочтительное связывание", если она взаимодействует или ассоциирует чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом по сравнению с альтернативными клетками или веществами. Антитело "специфически связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью по сравнению с его связыванием с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом CGRP, представляет собой антитело, которое связывается с этим эпитопом с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью по сравнению с его связыванием с- 11015526 другими эпитопами CGRP или эпитопами, отличающимися от эпитопов CGRP. При прочтении этого описания также должно быть понятно, что, например, антитело (или группировка или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может специфически или неспецифически или предпочтительно связываться со второй мишенью. Само по себе "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" не обязательно требует (хотя может включать) исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает предпочтительное связывание. Использованный здесь "по существу чистый" относится к веществу, которое по меньшей мере на 50% является чистым (то есть не содержит примесей), более предпочтительно по меньшей мере на 90% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 95% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% является чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99% является чистым."Клетка-хозяин" включает индивидуальную клетку или культуру клеток, которая может представлять собой или представляет собой реципиент для вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и это потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) по изобретению. Термин "Fc-область" используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. "Fc-область" может представлять собой Fc-область нативной последовательности или Fc-область варианта. Хотя связи Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяют как продолжающуюся от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. Нумерация остатков в Fc-области представляет собой нумерацию как в европейском индексе (EU) в соответствии с Kabat. Kabat et al., Sequences ofProteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.,1991. Fc-область имммуноглобулина, как правило, включает два константных домена: СН 2 и СН 3. Использованный здесь "Fc-рецептор" и "FcR" описывает рецептор, который связывается с Fcобластью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, который связывается с антителом IgG (-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcRI, FcRII и FcRIII, включая аллельные варианты и формы, возникающие в результате альтернативного сплайсинга этих рецепторов. РецепторыFcRII включают FcRIIA (активирующий рецептор) и FcRIIB (ингибирующий рецептор), имеющие сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются в основном по их цитоплазматическим доменам. Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al.,1994, Immunomethods, 4:25-34; и de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. FcR также включает неонатальный рецептор FcRn, который ответственен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer et al.,1976, J. Immunol., 117:587; и Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249)."Комплементзависимая цитотоксичность" и "CDC" относятся к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом), находящейся в комплексе с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть осуществлен анализ CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)."Функциональная Fc-область" обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией Fc-области нативной последовательности. Примеры "эффекторных функций" включают связывание Clq; комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и так далее. Для таких эффекторных функций,как правило, требуется, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и она может быть оценена с использованием различных анализов, известных в данной области техники для оценки таких эффекторных функций антитела."Fc-область нативной последовательности" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, обнаруживаемой в природе. "Вариант Fcобласти" включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области модификацией по меньшей мере одной аминокислоты, но в то же время сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc-области нативной последовательности. Предпочтительно вариант Fc-области имеет замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с Fcобластью нативной последовательности или с Fc-областью родительского полипептида, например приблизительно от одной до десяти замен аминокислот и предпочтительно приблизительно от одной до пяти замен аминокислот в Fc-области нативной последовательности или в Fc-области родительского полипептида. Вариант Fc-области здесь предпочтительно обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности с Fc-областью нативной последовательности и/или с Fc-областью роди- 12015526 тельского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с Fc-областью нативной последовательности и/или с Fc-областью родительского полипептида. Используемая здесь "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относится к клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, клетки натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис этой клеткимишени. Активность ADCC интересующей молекулы может быть оценена с использованием анализаADCC in vitro, такого как описано в патенте США 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и клеткиNK. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы может быть оцененаin vivo, например, в животной модели, такой как раскрыто в Dynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656. Использованный здесь термин "лечение" представляет собой подход для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. Для задач данного изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают один или более чем один из следующих: улучшение состояния при любом виде головной боли, включая уменьшение тяжести, уменьшение интенсивности боли и другие ассоциированные симптомы, уменьшающие частоту рецидивов, улучшение качества жизни лиц,страдающих головной болью, и уменьшение дозы других лекарственных препаратов, требующихся для лечения головной боли, но не ограничены ими. Для мигрени другие ассоциированные симптомы включают тошноту, рвоту и чувствительность к свету, звуку и/или движению, но не ограничены ими. Для кластерной головной боли другие ассоциированные симптомы включают припухлость под глазами или вокруг глаз, чрезмерное слезовыделение, красные глаза, ринорею или заложенность носа и покраснение лица, но не ограничены ими."Снижение частоты" головной боли означает любое из уменьшения частоты (которая может включать уменьшение потребности и/или количества (например, воздействия) других лекарств и/или способов лечения, как правило, применяемых при данном состоянии, включающих, например, эрготамин, дигидроэрготамин или триптаны при мигрени), длительности и/или частоты (включающих, например, задержку или увеличение времени следующей эпизодической атаки у индивида). Как понятно специалисту в данной области техники, индивиды могут отличаться с точки зрения их ответа на лечение, и, например,термин "способ снижения частоты головной боли у индивида" сам по себе отражает введение антагонистического антитела против CGRP, основываясь на рациональном ожидании того, что такое введение вероятно может вызывать такое снижение частоты у такого конкретного индивида."Уменьшения интенсивности" головной боли или одного или более чем одного симптома головной боли означает уменьшение или улучшение одного или более чем одного симптома головной боли по сравнению с отсутствием введения антагонистического антитела против CGRP. "Уменьшение интенсивности" также включает укорочение или уменьшение длительности симптома. Использованный здесь термин "контроль головной боли" относится к поддержанию или уменьшению тяжести или длительности одного или более чем одного симптома головной боли или частоты приступов головной боли у индивида (по сравнению с уровнем перед лечением). Например, длительность или тяжесть головной боли или частота приступов уменьшается, по меньшей мере, приблизительно на любое из следующих: 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 70% у индивида по сравнению с уровнем до лечения. Использованный здесь термин "замедление" развития головной боли означает задержку, воспрепятствование, сдерживание, торможение, стабилизацию и/или отсрочку развития заболевания. Это замедление может иметь варьирующую длительность по времени, зависит от истории заболевания и/или индивидуума, которого лечат. Как очевидно специалистам в данной области техники, достаточное или значительное замедление, может, в сущности, охватывать профилактику, так что у индивидуума не развивается головная боль (например, мигрень). Способ, который "замедляет" развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в данный период времени и/или снижает степень симптомов в данный период времени по сравнению с тем, когда этот способ не применяют. Такие сравнения, как правило, основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого количества субъектов."Развитие" или "прогрессирование" головной боли означает исходные проявления и/или прогрессирование расстройства. Развитие головной боли может быть обнаружимо и оценено с использованием стандартных клинических способов, таких как хорошо известные в области техники. Тем не менее, развитие также относится к прогрессированию, которое может быть необнаружимым. Для задачи данного изобретения развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. "Развитие" включает возникновение, рецидив и начало. Использованный здесь термин "начало" или "возникновение" головной боли включает исходное возникновение и/или рецидив. Использованный здесь термин "эффективная доза" или "эффективное количество" лекарства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для того, что- 13015526 бы привести к благоприятным или желаемым результатам. Для профилактического применения благоприятные или желаемые результаты включают результаты, такие как устраняющие или снижающие риск, уменьшающие тяжесть или задерживающие начало заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся при развитии заболевания. Для терапевтического применения благоприятные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение интенсивности боли, длительности или частоты приступов головной боли и уменьшение одного или более чем одного симптома, возникающего в результате головной боли (биохимического, гистологического и/или поведенческого), включая ее осложнения и промежуточные патологические фенотипы, представленные при развитии заболевания, увеличение качества жизни индивидов, страдающих этим заболеванием, снижение дозы других лекарственных средств, требующихся для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или замедление прогрессирования заболевания пациентов. Эффективная доза может быть введена в виде одного или более чем одного введения. Для задач изобретения эффективная доза лекарства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического прямого или опосредованного лечения. Как следует из клинического контекста, эффективная доза лекарства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнута или не достигнута в сочетании с другим лекарством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективная доза" может быть рассмотрена в контексте введения одного или более чем одного терапевтического агента, и один агент может быть рассмотрен как вводимый в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более чем одним другим агентом может быть достигнут желаемый результат."Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают сельскохозяйственных животных, спортивных животных, питомцев,приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс, но не ограничены ими. Использованный здесь "вектор" означает конструкцию, которая способна доставлять и предпочтительно экспрессировать один или более чем один интересующий ген или последовательность в клеткехозяине. Примеры векторов включают вирусные векторы, голые ДНК или РНК экспрессирующие векторы, плазмиду, космиду или фаговые векторы, ДНК или РНК экспрессирующие векторы, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, ДНК или РНК экспрессирующие векторы, инкапсулированные в липосомах, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты, но не ограничены ими. Используемая здесь "последовательность, контролирующая экспрессию" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность, контролирующая экспрессию, может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцибельный промотор, или энхансер. Последовательность, контролирующая экспрессию, функционально связана с транскрибируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. Используемый здесь "фармацевтически приемлемый носитель" или "фармацевтически приемлемый эксципиент" включает любое вещество, которое при объединении с активным ингредиентом дает этому ингредиенту возможность сохранять биологическую активность и не является реактивным в отношении иммунной системы субъекта. Примеры включают любой из стандартных фармацевтических носителей,таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы увлажнителей, но не ограничены ими. Предпочтительные разбавители для введения в аэрозоле или парентерального введения представляют собой забуференный фосфатом физиологический раствор или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными общепринятыми способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000). Предполагают, что используемый здесь термин "kon" относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном. Предполагают, что используемый здесь термин "koff" относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген. Предполагают, что используемый здесь термин "KD" относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитело-антиген. Предполагают, что использованный здесь термин "вазомоторный симптом" относится к состояниям, связанным с расширением кровеносных сосудов, и включает головную боль (такую как мигрень и другие), прилив крови (или приступообразное ощущение жара), приливы, бессонницу, расстройства сна,расстройства настроения, раздражимость, чрезмерную потливость, ночную потливость, дневную потливость, утомление и т.п, вызванное в том числе терморегуляторной дисфункцией, но не ограничен ими. Использованные здесь термины "прилив", "прилив крови" и "приступообразное ощущение жара" представляют собой известные в области техники термины, относящиеся к эпизодическому расстройству температуры тела, обычно состоящему из внезапного прилива крови к коже, обычно сопровождаемому потоотделением у субъекта.- 14015526 А. Способы профилактики или лечения вазомоторных симптомов. В одном из аспектов в изобретении предложен способ лечения или профилактики по меньшей мере одного вазомоторного симптома, такого как головная боль (например, мигрень) или приливы крови, у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP или полипептидов, имеющих происхождение из данного антитела. В еще одном аспекте в изобретении предложен способ уменьшения интенсивности, контроля, снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования по меньшей мере одного вазомоторного симптома, такого как головная боль (например, мигрень) или приливы крови, у индивида, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP. В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля,снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования головной боли (например, мигрени) у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела против CGRP в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения головной боли. Такие дополнительные агенты включают агонисты 5-НТ и NSAID, но не ограничены ими. Например, одновременно может быть введено антитело и по меньшей мере один дополнительный агент, т.е. они могут быть введены в достаточно близкие моменты времени для того, чтобы дать возможность перекрывания их индивидуальных терапевтических эффектов. Например, количество агониста 5-НТ илиNSAID, вводимого в комбинации с антителом против CGRP, должно быть достаточным для снижения частоты рецидивов головной боли у пациентов или обеспечения более длительной эффективности по сравнению с введением любого из этих агентов в отсутствие другого. Этот способ может быть использован для лечения головных болей, относящихся к любому из широкого разнообразия классов, включая мигрень с аурой или без нее, гемиплегическую мигрень, кластерные головные боли, мигренозную невралгию, хронические головные боли, головные боли напряжения и головные боли, возникающие в результате других медицинских состояний (таких как инфекция или повышенное черепное давление из-за опухоли); хроническую пароксизмальную гемикранию; смешанную головную боль, не ассоциированную со структурным нарушением; головную боль, ассоциированную с несосудистым внутричерепным расстройством; головную боль, ассоциированную с введением вещества или синдромом его отмены; головную боль, ассоциированную с нецефалической инфекцией; головную боль, ассоциированную с метаболическим расстройством; головную боль, ассоциированную с заболеванием черепа, шеи, глаз, ушей, носа, носовых пазух, зубов, ротовой полости или другой лицевой или черепной структуры; черепные невралгии; и боль нервного ствола и деафферентационная боль. Специалист в данной области техники способен определить подходящие дозы конкретных агентов,применяемых в комбинации с антителом против CGRP. Например, суматриптан может быть введен в дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 300 мг. При непарентеральном введении типичная доза суматриптана составляет от приблизительно 25 до приблизительно 100 мг, причем приблизительно 50 мг, как правило, является предпочтительной, и при парентеральном введении предпочтительная доза составляет приблизительно 6 мг. Тем не менее, эти дозы могут варьировать в соответствии со способами,стандартными в данной области техники, таким образом, что они оптимизированы для конкретного пациента или для конкретной комбинированной терапии. Дополнительно, например, целекоксиб может быть введен в количестве от 50 до 500 мг. В еще одном аспекте в изобретении предложены способы уменьшения интенсивности, контроля,снижения частоты или сдерживания развития или прогрессирования приливов крови у индивида, включающие введение указанному индивиду эффективного количества антагонистического антитела противCGRP в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным агентом, полезным для лечения приливов крови. Такие дополнительные агенты включают гормональные способы лечения, включающие эстрогены и/или некоторые прогестины, но не ограничены ими. В отношении всех описанных здесь способов ссылка на антагонистические антитела против CGRP также включает композиции, содержащие один или более чем один из этих агентов. Эти композиции дополнительно могут содержать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, которые хорошо известны в данной области техники. Настоящее изобретение может быть использовано самостоятельно или в комбинации с другими обычными способами лечения. Антагонистическое антитело против CGRP может быть введено индивиду любым подходящим путем. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что описанные здесь примеры не предназначены ограничивать объем изобретения, а иллюстрируют доступные способы. Соответственно,в некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP вводят индивиду в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение периода времени, путем внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриспинномозгового, подкожного, интраартикулярного, подъязычного, внутрисуставного введения, путем инсуффляции, внутриоболочечного, перорального введения, путем ингаляции или местным путем. Введение может быть системным, например внутривенное введение, или локальным. Для введения полезны- 15015526 имеющиеся в продаже распылители жидких препаратов, включая струйные распылители и ультразвуковые распылители. Жидкие препараты можно распылять непосредственно, и лиофилизированный порошок можно распылять после разведения. Альтернативно, антагонистическое антитело против CGRP можно распылять в виде аэрозоля с использованием фторуглеродного препарата и ингалятора с отмеренными дозами, или ингалировать в виде лиофилизированного и измельченного порошка. В одном из воплощений антагонистическое антитело против CGRP вводят способами сайтспецифической или целевой локальной доставки. Примеры способов сайт-специфической или целевой локальной доставки включают различные имплантируемые депо-источники антагонистического антитела против CGRP или катетеры для локальной доставки, такие как катетеры для инфузии, постоянный катетер или игольчатый катетер, синтетические имплантаты, адвентициальные аппликаторы, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямую инъекцию или непосредственное применение. См., например, публикацию заявки РСТ WO 00/53211 и патент США 5981568. Для введения могут быть использованы различные препараты антагонистического антитела противCGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP может быть введено в чистом виде. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP и фармацевтически приемлемый эксципиент могут находиться в различных лекарственных формах. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области техники и представляют собой относительно инертные вещества, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, эксципиент может обеспечивать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие эксципиенты включают стабилизаторы, увлажнители и эмульгаторы, соли для изменения осмолярности,инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проницаемости кожи, но не ограничены ими. Эксципиенты, а также препараты для парентеральной и непарентеральной доставки лекарства приведены в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000). В некоторых воплощениях такие агенты готовят для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинной, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т.п.). Соответственно, эти агенты можно объединять с фармацевтически приемлемыми разбавителями, такими как физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретная схема введения доз, т.е. доза, время введения и повторность, будет зависеть от конкретного индивида и истории болезни данного индивида. Антитело против CGRP может быть введено с использованием любого подходящего способа,включая инъекцию (например, внутрибрюшинную, внутривенную, подкожную, внутримышечную и т.п.). Антитела против CGRP также могут быть введены путем ингаляции, как здесь описано. Как правило, для введения антител против CGRP исходная предполагаемая доза может составлять приблизительно 2 мг/кг. Для задачи настоящего изобретения типичная суточная доза может находиться в диапазоне от 3 до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. Например, может быть использована доза приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг и приблизительно 25 мг/кг. Для повторных введений в течение нескольких суток или более длительного введения, в зависимости от состояния, лечение поддерживают до достижения желаемого подавления симптомов или до достижения достаточных терапевтических уровней, например для уменьшения боли. Пример схемы введения доз включает введение исходной дозы, составляющей приблизительно 2 мг/кг, с последующей еженедельной поддерживающей дозой приблизительно 1 мг/кг антитела против CGRP, или с последующей поддерживающей дозой приблизительно 1 мг/кг через неделю. Тем не менее, могут быть полезны другие схемы введения доз в зависимости от картины фармакокинетического разложения, которую практикующий врач желает достичь. Например, в некоторых воплощениях рассматривают дозу от одного до четырех раз в неделю. Ход такого способа лечения легко контролировать обычными методами и анализами. Схема введения дозы(включающая применяемый(е) антагонист(ы) CGRP) может варьировать в течение времени. Для задачи настоящего изобретения подходящая доза антагонистического антитела против CGRP зависит от используемого антагонистического антитела против CGRP (или его композиции), типа и тяжести головной боли (например, мигрени), которую лечат, вводят ли агент для профилактических или терапевтических задач, предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на агент и решения лечащего врача. Обычно клинический врач вводит антагонистическое антитело против CGRP до достижения дозы, которая позволит достичь желаемый результат. Доза и/или частота может варьировать в процессе лечения. В определение дозы, как правило, вносят вклад эмпирические факторы, такие как период полувыведения. Например, для увеличения периода полувыведения антитела и для предотвращения атаки антител иммунной системой хозяина могут быть использованы антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела. Частота введения может быть определена и подобрана во время курса лечения и, как правило, но необязательно, основана на лечении, и/или подавлении, и/или уменьшении интенсивности, и/или сдерживания головной боли (например, мигрени). Альтернативно, могут быть подходящими препараты антагонистических антител против CGRP с длительным непрерывным высвобождением. В данной области техники- 16015526 известны различные препараты и устройства для достижения длительного высвобождения. В одном из воплощений дозы антагонистического антитела против CGRP могут быть определены эмпирически для индивидуумов, которым осуществляют одно или более чем одно введение антагонистического антитела против CGRP. Индивидуумам вводят увеличивающиеся дозы антитела противCGRP. Для оценки эффективности антагонистического антитела против CGRP можно руководствоваться индикатором заболевания. Введение антагонистического антитела против CGRP в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть непрерывным или периодическим в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, от того, является ли задача введения терапевтической или профилактической, и других факторов, известных практикующим врачам. Введение антагонистического антитела против CGRP может быть, по существу, непрерывным в течение заданного периода времени или может быть в виде серий разделенных по времени доз, например перед, во время или после развития головной боли(например, мигрени); перед; во время; перед и после; во время и после; перед и во время или перед, во время и после развития головной боли. Введение может быть перед, во время и/или после любого события, вероятно приводящего к головной боли. В некоторых воплощениях может присутствовать более чем одно антагонистическое антитело против CGRP. Может присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более различных антагонистических антител противCGRP. Как правило, такие антагонистические антитела против CGRP могут иметь совместимые виды активности, которые не влияют отрицательно друг на друга. Антагонистическое антитело против CGRP также может быть использовано совместно с другими антагонистами CGRP или антагонистами рецептора CGRP. Например, может быть использован один или более чем один из следующих антагонистовCGRP: антисмысловая молекула, направленная на CGRP (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую CGRP), соединение-ингибитор CGRP, структурный аналог CGRP, доминантно-негативная мутация рецептора CGRP, связывающего CGRP, и антитело против рецептора CGRP. Антагонистическое антитело против CGRP также может быть использовано в сочетании с другими агентами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности агентов. Терапевтические препараты антагонистического антитела против CGRP, используемые в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000, в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфатный, цитратный буфер и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутил- или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин,аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, PLURONICS или полиэтиленгликоль (PEG). Липосомы, содержащие антагонистическое антитело против CGRP, готовят способами, известными в данной области техники, такими, как описано в Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985);Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); и патентах США 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем нахождения в системе кровообращения раскрыты в патенте США 5013556. Особенно полезные липосомы могут быть приготовлены способом обращенно-фазового выпаривания липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-производное фосфатидилэтаноламина (PEG-РЕ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенными размерами пор для получения липосом с желаемым диаметром. Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например,способами коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из поли-(метилметацилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000). Могут быть приготовлены препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных- 17015526 полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в виде оформленных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели(например, поли-(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт, полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, нераспадаемый этиленвинилацетат, распадаемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот, и лейпролида ацетата), изобутирата ацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксибутировая кислота. Препараты, предназначенные для применения для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществить, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Терапевтические композиции антагонистического антитела против CGRP, как правило, помещают в контейнер,имеющий стерильное отверстие для доступа, например контейнер для внутривенного раствора или пузырек, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции. Композиции по настоящему изобретению могут находиться в стандартных лекарственных формах,таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории для перорального, парентерального или ректального введения или введения путем ингаляции или инсуффляции. Для приготовления твердых композиций, таких как таблетки, действующее начало смешивают с фармацевтическим носителем, например общепринятыми ингредиентами для таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или смолы, и другими фармацевтическими разбавителями, например водой, с получением твердой композиции предварительного препарата, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению или ее нетоксичную фармацевтически приемлемую соль. Ссылка на такие композиции предварительных препаратов, как на гомогенные, означает, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции таким образом, что композиция может быть легко разделена на равные эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Такую твердую композицию предварительного препарата затем делят на лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до примерно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты или приготовлены каким-либо иным способом с получением лекарственной формы, обеспечивающей преимущество длительного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент дозы и внешний компонент дозы,причем последний компонент представлен в форме оболочки поверх первого компонента. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для обеспечения устойчивости к разложению в желудке и позволяет внутреннему компоненту пройти интактным в двенадцатиперстную кишку, или для задержки его высвобождения. Для таких энтеросолюбильных слоев или оболочек может быть использовано множество материалов, включая множество полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы. Подходящие поверхностно-активные агенты включают, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Tween 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например,Span 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным агентом обычно содержат от 0,05 до 5% поверхностно-активного агента и могут содержать от 0,1 до 2,5%. Понятно, что при необходимости могут быть добавлены другие ингредиенты, например маннит или другие фармацевтически приемлемые разбавители. Подходящие эмульсии могут быть приготовлены с использованием имеющихся в продаже жировых эмульсий, таких как Intralipid, Liposyn, Infonutrol, Lipofundin и LipiphysanTM. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, или, альтернативно, он может быть растворен в масле (например, соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле) и эмульсии, образованной при смешивании с фосфолипидом (например, яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Понятно, что могут быть добавлены другие ингредиенты, например глицерин или глюкоза, для регулировки тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии, как правило, содержат до 20% масла, например от 5 до 20%. Жировая эмульсия может содержать капли жира от 0,1 до 1,0 мкм, в частности от 0,1 до 0,5 мкм, и иметь рН в диапазоне от 5,5 до 8,0. Эмульсионные композиции могут представлять собой композиции, приготовленные путем смешивания антагонистического антитела против CGRP с Intralipid или его компонентами (соевым маслом,яичными фосфолипидами, глицерином и водой). Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как описано выше. В некоторых воплощениях композиции вводят пероральным или назальным респираторным путем для получения локального или системного эффекта. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с использованием газов. Распыляемые раство- 18015526 ры можно вдыхать непосредственно из распылителя, или распылитель может быть прикреплен к маске,палатке или дыхательному аппарату пульсирующего положительного давления. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка могут быть введены предпочтительно перорально или назально из устройств, которые доставляют лекарственную форму подходящим образом. Диагностика или оценка головной боли хорошо известна в данной области техники. Оценка может быть осуществлена на основе субъективных измерений, таких как характеристика симптомов пациентом. Например, мигрень можно диагностировать на основе следующих критериев: 1) эпизодические приступы головной боли, длящиеся от 4 до 72 ч; 2) по двум из следующих симптомов: односторонняя боль, пульсирующая боль, аггравация при движении и боль умеренной или сильной интенсивности; и 3) одному из следующих симптомов: тошнота или рвота, и фотофобия или фонофобия. Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002. Эффективность лечения может быть оценена с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Например, может оценивать купирование боли. Соответственно, в некоторых воплощениях купирование боли субъективно обнаруживают после 1,2 или нескольких часов после введения антитела против CGRP. В некоторых воплощениях частоту приступов головной боли субъективно обнаруживают после введения антитела против CGRP. Б. Антагонистические антитела против CGRP. В способах по изобретению применяют антагонистическое антитело против CGRP, которое относится к любой молекуле антитела, блокирующей, подавляющей или уменьшающей (в том числе существенно) биологическую активность CGRP, включая последующие сигнальные пути, опосредованныеCGRP, такие как связывание рецептора и/или индуцирование клеточного ответа на CGRP. Антагонистическое антитело против CGRP должно демонстрировать любую одну или более чем одну из следующих характеристик: (а) связывание с CGRP; (б) блокирование связывания CGRP с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора CGRP (включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности CGRP или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией CGRP; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренса CGRP и (ж) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения CGRP. Антагонистические антитела против CGRP известны в данной области техники. См., например, Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US),продуктC7113 (клон 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993. Для задач изобретения антитело взаимодействует с CGRP таким образом, чтобы ингибироватьCGRP и/или последующие пути, опосредованные сигнальной функцией CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP распознает человеческий CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывается с человеческим -CGRP и -CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывает человеческий и крысиный CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP связывает С-концевой фрагмент,имеющий аминокислоты 25-37 CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело противCGRP связывает С-концевой эпитоп по аминокислотам 25-37 CGRP. Антитела, полезные по настоящему изобретению, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антитела (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгированные антитела, одноцепочечные (ScFv) их мутанты,слитые белки, включающие фрагмент антитела (например, доменное антитело), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, имеющий требуемую специфичность, включающий варианты гликозилирования антител, варианты антител по аминокислотной последовательности и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или имеющими любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP представляет собой моноклональное антитело. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP является гуманизированным. В некоторых воплощениях антитело является человеческим. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP представляет собой антитело G1 (как здесь описано). В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP содержит один или более чем один CDR(например, один, два, три, четыре, пять или в некоторых воплощениях все шесть CDR) антитела G1 или варианты G1, представленные в табл. 6. В других воплощениях антагонистическое антитело противCGRP содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленной на фиг. 5 (SEQ ID NO: 1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленной на фиг. 5 (SEQ ID NO: 2). В некоторых воплощениях антитело содержит модифицированную константную область, такую как описанная здесь константная область, которая является иммунологически инертной. В некоторых воплощениях константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТPCT/GB 99/01441; и/или завке на патент Великобритании 9809951.8. В других воплощениях антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG2, включающую сле- 19015526 дующие мутации: А 330 Р 331 на S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательностьIgG2 дикого типа) Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. В некоторых воплощениях антитело содержит константную область IgG4, включающую следующие мутации: E233F234L235 на P233V234A235. В других воплощениях константная область агликозилирована для N-гликозилирования. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для N-гликозилирования путем мутации остатка присоединения олигосахарида (такого как Asn297) и/или фланкирующих остатков, которые представляют собой часть последовательности, распознающей N-гликозилирование, в константной области. В некоторых воплощениях константная область агликозилирована для N-гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована для N-гликозилирования ферментативно или путем экспрессии в клетке-хозяине,дефицитном по гликозилированию. Аффинность связывания (KD) антагонистического антитела против CGRP в отношении CGRP (такого как человеческий -CGRP) может составлять от приблизительно 0,02 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания представляет собой любую из приблизительно 200,приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500,приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительного 40, приблизительно 20, приблизительно 15,приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем любое значение из приблизительно 250, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ. Один из путей определения аффинности связывания антитела с CGRP заключается в измерении аффинности связывания монофункциональных фрагментов Fab антитела. Для получения монофункциональных фрагментов Fab антитело (например IgG) можно расщеплять папаином или рекомбинантно экспрессировать. Аффинность Fab фрагмента антитела против CGRP может быть определена посредством поверхностного плазмонного резонанса (система поверхностного плазмонного резонанса (SPR)Biacore3000, Biacore, INC, Piscataway NJ), оборудованного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным стрептавидином (SA) с использованием буфера для анализа HBS-EP (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р 20). Биотинилированный человеческий CGRP (или любой другой CGRP) можно развести в буфере HBS-EP до концентрации менее чем 0,5 мкг/мл и ввести в каналы отдельного чипа, используя различные периоды времени контакта, с достижением двух диапазонов плотности антигена, либо 50-200 единиц реакции (RU) для подробных кинетических исследований, либо 800-1000 RU для скрининговых анализов. Исследования регенерации продемонстрировали, что 25 мМ NaOH в 25% об./об. этаноле эффективно удаляет связанный Fab, в то же время сохраняя активность CGRP на чипе в течение более 200 инъекций. Типично, серийные разведения(охватывающие концентрации 0,1-10 х относительно оцененной KD) очищенных образцов Fab вводят в течение 1 мин со скоростью 100 мкл/мин и дают возможность для диссоциации в течение до 2 ч. Концентрацию белков Fab определяют путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и/или электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с использованием известной концентрации Fab (определенной в соответствии с аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Кинетические скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) определяют одновременно путем подгонки данных в целом к модели связывания Лэнгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, Н. Fagerstam, L. Petersson, В. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) с использованием программы BIAevaluation. Величины равновесной константы диссоциации (KD) рассчитывают как koff/kon. Этот протокол подходит для использования при определении аффинности связывания антитела с любым CGRP, включая человеческийCGRP, CGRP другого млекопитающего (такой как мышиный CGRP, крысиный CGRP, CGRP примата), а также различные формы CGRP (такие как формаи ). Аффинность связывания антитела, как правило,измеряют при 25 С, но также ее можно измерять при 37 С. Антагонистические антитела против CGRP могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Путь и схему иммунизации животного-хозяина, как правило, выбирают в соответствии с установленными и общепризнанными способами стимуляции и продукции антитела, как здесь дополнительно описано. Общие способы продукции человеческих и мышиных антител хорошо известны в данной области техники и описаны здесь. Понятно, что любой субъект-млекопитающее, включая людей или их клетки, продуцирующие антитело, может быть подвергнуто манипуляции для того, чтобы служить в качестве основы для продукции гибридомных клеточных линий млекопитающего, включая человека. Типично, животное-хозяин инокулируют внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутрикожно количеством иммуногена, в том числе, как описано здесь. Гибридомы могут быть получены из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общего способа гибридизации соматических клеток Kohler, В. and Milstein, С. (1975) Nature 256:495-497 или модифицированного Buck, D.W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). При гибридизации могут быть использованы имеющиеся линии миеломы, включая X63-Ag8.653 и линии из Salk Institute,Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, но не ограниченные ими. Как правило, способ включает- 20015526 слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием вещества, способствующего слиянию клеток, такого как полиэтиленгликоль, или электрическими средствами, хорошо известными специалисту в данной области техники. После слияния клетки отделяют от среды для слияния и выращивают в селективной среде для роста, такой как гипоксантин-аминоптерин-тимидиновая (HAT) среда для удаления негибридизированных родительских клеток. Любые описанные здесь среды, дополненные сывороткой или без нее, могут быть использованы для культивирования гибридом, секретирующих моноклональные антитела. В качестве еще одной альтернативы способа слияния клеток для продукции моноклональных антител против CGRP по настоящему изобретению могут быть использованы EBV иммортализованные В-клетки. При желании гибридомы размножают и субклонируют и супернатанты исследуют в отношении активности против иммуногена общепринятыми способами иммуноанализа (например, радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ или флуоресцентный иммуноанализ). Гибридомы, которые могут быть использованы в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки-предшественники родительских гибридом, которые продуцируют моноклональное антитела, специфичные в отношении CGRP, или их фрагмент. Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, могут быть выращены in vitro или in vivo с использованием известных способов. При желании моноклональные антитела могут быть выделены из культуральных сред или жидкостей организма общепринятыми способами очистки иммуноглобулина,такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация. Если присутствует нежелательная активность, она может быть удалена, например, путем пропускания препарата над адсорбентами, приготовленными из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюции или высвобождения желаемых антител с этого иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим CGRP или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень,конъюгированную с белком, который является иммуногенным для иммунизированных видов, например гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например малеимидобензоил-сульфосукцинимидного эфира (конъюгация через цистеиновые остатки), Nгидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, SOCl2 или R1N=C=NR, где R и R1 представляют собой различные алкильные группы, может дать популяцию антитела (например, моноклонального антитела). При желании интересующее антагонистическое антитело против CGRP (моноклональное или поликлональное) может быть секвенировано, и полинуклеотидная последовательность затем может быть клонирована в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может поддерживаться в векторе в клетке-хозяине, и клетка-хозяин затем может быть выращена и заморожена для последующего применения. Альтернативно, полинуклеотидная последовательность может быть использована для генетической манипуляции для "гуманизации" антитела или для улучшения аффинности или других характеристических антител. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы иметь большее сходство с константными областями человеческого антитела для того, чтобы избежать иммунного ответа, когда антитело применяют в клинических испытаниях и способах лечения людей. Может быть желательно генетически манипулировать с последовательностью антитела для достижения большей аффинности в отношении CGRP и большей эффективности в ингибировании CGRP. Специалисту в данной области техники понятно, что в антагонистическом антителе против CGRP могут быть осуществлены изменения одного или более чем одного полинуклеотида с сохранением его способности связывания с CGRP. Существуют четыре общие стадии гуманизации моноклонального антитела. Эти стадии представляют собой: (1) определение нуклеотида и предполагаемой аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепи исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. определение того, какую каркасную область антитела использовать в способе гуманизации,(3) действительные способы/методы гуманизации, и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762; 5585089 и 6180370. Описано множество молекул "гуманизированного" антитела, включающих антигенсвязывающий сайт, имеющий происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим, включая химерные антитела, имеющие V-области или модифицированные V-области антител грызунов и их ассоциированные гипервариабельные участки (CDR), слитые с константными доменами человеческого антитела. См.,например, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224(1989), Shaw et al. J. Immunol. 138:4534-4538 (1987) и Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987). В других ссылках описаны CDR грызунов, перенесенные в поддерживающую каркасную область (FR) человеческого антитела перед слиянием с подходящим константным доменом человеческого антитела. См.,например, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) иJones et al. Nature 321:522-525 (1986). В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно покрытыми каркасными областями антител грызунов. См., например, публикацию европейской заявки на патент 0519596. Эти "гуманизированные" молекулы сконструированы для минимиза- 21015526 ции нежелательного иммунологического ответа в отношении молекул антител грызунов против человеческого антитела, которые ограничивают длительность и эффективность терапевтических применений этих группировок в отношении реципиентов-людей. Например, константная область антитела может быть сконструирована таким образом, чтобы быть иммунологически инертной (например, она не запускает лизис комплемента). См., например, публикацию РСТPCT/GB 99/01441; заявку на патент Великобритании 9809951.8. Другие способы гуманизации антител, которые могут также быть использованы, раскрыты в Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) и в патентах США 6180377; 6054297; 5997867; 5866692; 6210671 и 6350861 и в публикации РСТWO 01/27160. В еще одной альтернативе полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием имеющихся в продаже мышей, которые сконструированы для экспрессии специфических белков человеческих иммуноглобулинов. Трансгенные животные, которые сконструированы для продукции более желательного (например, полностью человеческие антитела) или более устойчивого иммунного ответа,также могут быть использованы для конструирования гуманизированных или человеческих антител. Примеры такого способа представляют собой Xenomouse из Abgenix, Inc. (Fremont, СА) и HuMAbMouse и ТС Mouse из Medarex, Inc. (Princeton, NJ). Альтернативно, антитела могут быть получены рекомбинантным путем и экспрессированы с использованием любого способа, известного в данной области техники. В еще одной альтернативе антитела могут быть получены рекомбинантным путем с использованием технологии фагового дисплея. См.,например, патенты США 5565332; 5580717; 5733743 и 6265150 и Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Альтернативно, технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553(1990 может быть использована для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из наборов генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина неиммунизированных доноров. В соответствии с этим способом гены V-домена антитела клонированы внутри рамки в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как М 13 или fd, и представлены как функциональные фрагменты антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку эта нитевидная частица содержит одноцепочеченую копию ДНК фагового генома, отбор, основанный на функциональных свойствах антител,также приводит в результате к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей может быть проведен во множестве форматов; обзор см., например, в Johnson, Kevin S. and Chisweli, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Несколько источников сегментов V-генов могут быть использованы для фагового дисплея. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) выделил разнообразный ряд антител против оксазолона из небольшой, полученной путем случайной комбинации библиотеки V-генов, происходящей из селезенок иммунизированных мышей. Может быть сконструирован набор V-генов неиммунизированных доноров-людей, и антитела на разнообразный ряд антигенов (включая аутоантиген) могут быть выделены, по существу, в соответствии со способами, описанными в Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597(1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антитела аккумулируют мутации с высокой степенью (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений приводят к более высокой аффинности, и В-клетки, представляющие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно реплицируются и дифференцируются при последующей антигенной стимуляции. Этот естественный процесс может быть имитирован путем использования способа, известного как "перетасовка цепей" (Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992. В этом способе аффинность "первичных" человеческих антител, полученных при помощи фагового дисплея, может быть улучшена путем последовательного замещения генов V-областей тяжелой и легкой цепи наборами встречающихся в природе вариантов (наборы) генов V-домена, полученных от неиммунизированных доноров. Этот способ дает возможность для продукции антител и фрагментов антител, имеющих аффинности в диапазоне пМ-нМ. Стратегия получения очень крупных фаговых наборов антител (также известных как "мать всех библиотек" (the mother-of-all libraries описана в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Перетасовка генов также может быть использована для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет аффинности и специфичности, подобные исходному антителу грызуна. В соответствии с этим способом, который также называют как "эпитопный импринтинг", ген V-домена тяжелой или легкой цепи антител грызуна, полученных способом фагового дисплея, заменяют набором человеческих генов V-домена, с получением химер грызун-человек. Отбор антигена приводит в результате к выделению вариабельных областей человеческого антитела, способных востанавливать функциональный антигенсвязывающий сайт, т.е. эпитоп направляет выбором партнера("делает отпечаток"). При повторении способа для замены оставшегося V-домена грызуна получают человеческое антитело (см. заявку РСТWO 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов путем переноса CDR в этом способе предложены полностью человеческие антитела, у которых отсутствуют остатки каркасной области или CDR грызунов. Понятно, что хотя вышеприведенное обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсуждаемые принципы применимы для получения антител для применения, например, у собак, кошек,приматов, лошадей и коров. Кроме того, понятно, что один или более чем один описанный здесь аспект- 22015526 гуманизации антитела можно объединить, например перенос CDR, мутацию каркасной области и мутацию CDR. Антитела могут быть получены рекомбинантным путем сначала путем выделения антител и клеток,продуцирующих антитело, у животных-хозяев, получения последовательности гена и с использованием последовательности гена рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках яичников китайского хомячка (СНО. Другой способ, который может быть использован, заключается в экспрессии последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке были раскрыты. См., например, Peeters et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg N. and D. Huszar Int.Rev.Immunol 13:65 (1995); и Pollock, et al., J.Immunol. Methods 231:147(1999). Способы получения производных антител, например гуманизированных антител, одноцепочечных и т.д., известны в данной области техники. Иммуноанализы и способы сортировки путем проточной цитометрии, такие как клеточная сортировка с флуоресцентной активацией (FACS), также могут быть использованы для выделения антител,специфичных в отношении CGRP. Антитела могут быть связаны со множеством различных носителей. Носители могут быть активными и/или инертными. Примеры хорошо известных носителей включают полипропилен, полистирол,полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Носитель может быть растворимым или нерастворимым в зависимости от задач изобретения. Специалисту в данной области техники известны другие подходящие носители для связывания антител, или он способен оценить такие носители с использованием стандарных экспериментов. В некоторых воплощениях носитель содержит группировку, которая нацелена на миокард. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием обычных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы (такие как экспрессирующие векторы, раскрытые в публикации заявки РСТWO 87/04462), которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli,клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не продуцируют иначе белок иммуноглобулин, с достижением синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию заявки РСТWO 87/04462. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замещения кодирующей последовательности на константные домены человеческой тяжелой и легкой цепи вместо гомологичных мышиных последовательностей,Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), или путем ковалентного присоединения к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получают "химерные" или "гибридные" антитела, которые здесь обладают специфичностью связывания моноклинального антитела против CGRP. Антагонистические антитела против CGRP и полипептиды, имеющие происхождение из антител,могут быть идентифицированы или охарактеризованы с использованием способов, изестных в данной области техники, посредством чего обнаруживают и/или измеряют сокращение, уменьшение интенсивности или нейтрализацию биологической активности CGRP. Например, антагонистическое антитело против CGRP также может быть идентифицировано путем инкубации агента-кандидата с CGRP и обнаружения любой одной или более чем одной из следующих характеристик: (а) связывание с CGRP; (б) блокирование связывания CGRP с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора CGRP (включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности CGRP или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией CGRP; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренсаCGRP и (ж) ингибирование (уменьшение) синтеза, продукции или высвобождения CGRP. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против CGRP или полипептид идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с CGRP и обнаружения связывания и/или сопутствующего уменьшения или нейтрализации биологической активности CGRP. Анализ связывания может быть осуществлен с очищенным(и) полипептидом(ами) CGRP или с клетками, экспрессирующими в природе, или трансфицированными для экспрессии полипептида(ов) CGRP. В одном из воплощений анализ связывания представляет собой конкурентный анализ связывания, в котором оценивают способность антитела-кандидата конкурировать с известным антагонистом против CGRP за связывание с CGRP. Анализ может быть проведен в различных форматах, включая формат ELISA. В других воплощениях антагонистическое антитело против CGRP идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с CGRP и обнаружения связывания и сопутствующего ингибирования активации рецептора CGRP, экспрессируемого на поверхности клетки. После исходной идентификации активность антагонистического антитела-кандидата против CGRP может быть дополнительно подтверждена и оптимизирована при помощи биоанализов, известных для тестирования целевых биологических активностей. Альтернативно, биоанализы могут быть использованы для непосредственного скрининга кандидатов. Например, CGRP стимулирует ряд измеряемых изменений в реагирующих клетках. Эти изменения включают стимуляцию с AMP в клетке (например, клеткиSK-N-MC), но не ограничены ими. Антагонистическая активность также может быть измерена с использованием животных моделей, таких как измерение расширения кровеносных сосудов кожи, вызванного стимуляцией подкожного нерва крысы. Escort et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993. Животные модели головных болей (таких как мигрень) дополнительно могут быть использованы для тестирования эффективности антагонистических антител или полипептидов. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl. 3, 2000. Некоторые из способов идентификации и характеристики антагонистического антитела противCGRP или полипептида подробно описаны в примерах. Антагонистические антитела против CGRP могут быть охарактеризованы с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Например, один из способов заключается в идентификации эпитопа, по которому осуществляется связывание, или "эпитопное картирование". Существует множество известных в данной области техники способов для картирования и характеризации расположения эпитопов на белках, включающих распознавание кристаллической структуры комплекса антителоантиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии генных фрагментов и анализы, основанные на синтетических пептидах, описанные, например, в Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. В дополнительном примере картирование эпитопа может быть использовано для определения последовательности, с которой связывается антагонистическое антитело против CGRP. Картирование эпитопа имеется в продаже от различных источников, например Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 РН Lelystad, The Netherlands). Эпитоп может представлять собой линейный эпитоп, т.е. содержащийся в единичной цепи аминокислот,или конформационный эпитоп, образованный трехмерным взаимодействием аминокислот, которые не обязательно могут располагаться в одной цепи. Могут быть выделены или синтезированы (например,рекомбинантным путем) пептиды, имеющие различную длину (например, длину по меньшей мере в 4-6 аминокислот), и использованы для анализов связывания с антагонистическим антителом против CGRP. В еще одном примере эпитоп, с которым связывается антагонистическое антитело против CGRP, может быть определен в систематическом скрининге с использованием перекрывающихся пептидов, имеющих происхождение из последовательности CGRP, и определении связывания с антагонистическим антителом против CGRP. В соответствии с анализами экспрессии генного фрагмента открытую рамку считывания, кодирующую CGRP, фрагментируют либо случайным образом, либо посредством специфических генетических конструкций и определяют реактивность экспрессированных фрагментов CGRP с тестируемым антителом. Генные фрагменты, например, могут быть получены путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) и затем транскрибированы и транслированы в белок in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот. Связывание антител с фрагментами CGRP, меченными радиоактивными изотопами,затем определяют путем иммунопреципитации и гель-электрофореза. Некоторые эпитопы также могут быть идентифицированы с использованием крупных библиотек случайных пептидных последовательностей, представленных на поверхности фаговых частиц (фаговых библиотек). Альтернативно, определенная библиотека перекрывающихся пептидных фрагментов может быть тестирована в отношении связывания с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты с обменом доменами и сканирующий аланином мутагенез могут быть осуществлены для идентификации остатков, требуемых, достаточных и/или необходимых для связывания с эпитопом. Например, эксперименты с обменом доменами могут быть осуществлены с использованием мутантного CGRP, в котором различные фрагменты полипептида CGRP замещены (обмен) последовательностями близкородственного, но антигенно отличающегося белка (такого как еще один член семейства белков нейротрофина). Путем оценки связывания антитела с мутантным CGRP можно оценить важность конкретного фрагмента CGRP для связывания антитела. В еще одном способе, который может быть использован для характеристики антагонистического антитела против CGRP, конкурентные анализы применяют с другими антителами, которые, как известно,связываются с тем же самым антигеном, т.е. различными фрагментами на CGRP, определяют связывается ли антагонистическое антитело против CGRP с тем же самым эпитопом, как другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области техники. Экспрессирующий вектор может быть использован для прямой экспрессии антагонистического антитела против CGRP. Специалисту в данной области техники известно введение экспрессирующих векторов для достижения экспрессии экзогенного белка in vivo. См., например, патенты США 6436908; 6413942 и 6376471. Введение экспрессирующих векторов включает местное или системное введение,включая инъекцию, пероральное введение, пушку для частиц или введение через катетер, и местное введение. В еще одном воплощении экспрессирующий вектор вводят непосредственно в симпатический ствол или ганглии или в коронарную артерию, предсердие, желудочек или перикард. Также можно использовать нацеленную доставку терапевтических композиций, содержащих экспрессирующий вектор или субгеномные полинуклеотиды. Опосредованные рецептором способы доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem.(1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклео- 24015526 тид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для местного введения в протоколе генной терапии. Также в протоколе генной терапии могут быть использованы диапазоны концентрации ДНК, составляющие от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 500 мкг и от приблизительно 20 г до приблизительно 100 мкг ДНК. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды могут быть доставлены с использованием разбавителей для генной доставки. Разбавитель для генной доставки может иметь вирусное или невирусное происхождение (см. в общем Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; и Kaplitt,Nature Genetics (1994) 6:148). Экспрессия таких кодирующих последовательностей может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающего или гетерологичных промоторов. Экспресия кодирующей последовательности может быть конститутивной или контролируемой. Вирусные векторы для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в данной области техники. Примеры вирусных носителей включают рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации заявок РСТWO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; патенты США 5219740 и 4777127; патент GB2200651 и европейский патент 0345242), векторы, основанные на альфавирусах (например, векторы на основе вируса синдбис, вирусе лихорадки леса Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирусе РоссРивер (АТСС VR-373; АТСС VR-1246) и вирусе венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532, и векторы на основе аденоассоциированного вируса(AAV) (см., например, публикации заявок РСТWO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655), но не ограничены ими. Также может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. Также могут быть использованы невирусные носители для доставки и способы, включающие поликатионную конденсированную ДНК, связанную или несвязанную с убитым аденовирусом (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); связанную с лигандом ДНК (см., например, Wu, J. Biol. Chem.(1989) 264:16985); клетки-носители для доставки в эукариотическую клетку (см., например, патент США 5814482; публикации заявок РСТWO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763 и WO 97/42338) и нейтрализацию ядерного заряда или слияние с клеточными мембранами, но не ограничены ими. Также могут быть использованы депротеинизированные ДНК. Примеры способов введения депротеинизированной ДНК описаны в публикации заявки РСТWO 90/11092 и патенте США 5580859. Липосомы,которые могут действовать в качестве носителей для доставки, описаны в патенте США 5422120; публикациях заявок РСТWO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445 и ЕР 0524968. Дополнительные подходы описаны в Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 и в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581. В. Антитело G1 и родственные антитела, полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева. Данное изобретение охватывает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитело G1 и его варианты, представленные в табл. 6, или полипептид, имеющий происхождение из антитела G1 и его вариантов, представленных в табл. 6; и полинуклеотиды, включающие последовательности, кодирующие G1 и его варианты или полипептид. Использованные здесь композиции содержат одно или более чем одно антитело или полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), связывающийся с CGRP, и/или один или более чем один полинуклеотид,включающий последовательности, кодирующие одно или более чем одно антитело или полипептид, связывающийся с CGRP. Эти композиции дополнительно могут содержать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, которые хорошо известны в данной области техники. Антагонистические антитела против CGRP и полипептиды по изобретению характеризуются любой(одной или более чем одной) из следующих характеристик: (а) связывание с CGRP; (б) блокирование связывания CGRP с его рецептором(ами); (в) блокирование или уменьшение активации рецептора CGRP(включая активацию сАМР); (г) ингибирование биологической активности CGRP или последующих путей, опосредованных сигнальной функцией CGRP; (д) профилактика, уменьшение интенсивности или лечение любого вида головной боли (например, мигрени); (е) увеличение клиренса CGRP и (ж) ингибирование (уменьшение) синтеза, продукции или высвобождения CGRP. Соответственно, в изобретении предложено любое из следующих, или композиции (включая фармацевтические композиции), содержащие любое из следующих: (а) антитело G1 или его варианты, представленные в табл. 6; (б) фрагмент или область антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6;(в) легкую цепь антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (г) тяжелую цепь антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (д) одну или более чем одну вариабельную область(и) легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (е) один или более чем один CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть CDR) антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (ж) CDR H3 тяжелой цепи антитела G1; (з) CDR L3 легкой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (и) три CDR легкой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; (к) три CDR тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл.- 25015526 6; (л) три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6; и (м) антитело, включающее любое одно из (б)-(л). В изобретении также предложены полипептиды, включающие любое одно или более чем одно из приведенных выше. Фрагменты CDR антитела G1 (включая CDR Чотиа и Кабата) схематически изображены на фиг. 5. Определение областей CDR находится в пределах знаний специалиста в данной области техники. Понятно, что в некоторых воплощениях CDR может представлять собой комбинацию CDR Кабата и ЧотиаCDR представляют собой CDR Кабата. В других воплощениях CDR представляют собой CDR Чотиа. Другими словами, в воплощениях с более чем одним CDR, CDR могут представлять собой любые изCDR Кабата, Чотиа, комбинированных CDR или их комбинаций. В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), который содержит по меньшей мере один CDR, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть CDR,по существу, идентичные по меньшей мере одному CDR, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем,по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или всем шести GDR G1 или его вариантов, представленных в табл. 6. Другие воплощения включают антитела, которые имеют по меньшей мере два, три,четыре, пять или шесть CDR, по существу, идентичные по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести CDR G1 или имеющие происхождение из G1. В некоторых воплощениях по меньшей мере один,два, три, четыре, пять или шесть CDR по меньшей мере приблизительно на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 96,97, 98 или 99% идентичны по меньшей мере одному, двум, трем, четырем, пяти или шести CDR G1 или его вариантов, представленных в табл. 6. Понятно, что для задач изобретения специфичность связывания и/или общая активность, как правило, сохраняются, хотя степень активности может варьировать по сравнению с G1 или его вариантами, представленными в табл. 6 (может быть больше или меньше). В изобретении также предложен полипептид (который может представлять собой или не представлять собой антитело), который содержит аминокислотную последовательность G1 или его вариантов,представленных в табл. 6, имеющий любое из следующего: по меньшей мере 5 смежных аминокислот, по меньшей мере 8 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот последовательности G1 или его вариантов, представленных в табл. 6,где по меньшей мере 3 из аминокислот происходят из вариабельной области G1 (фиг. 5) или его вариантов, представленных в табл. 6. В одном из воплощений вариабельная область происходит из легкой цепиG1. В еще одном воплощении вариабельная область происходит из тяжелой цепи G1. Пример полипептида имеет смежные аминокислоты (длины описаны выше) из вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей G1. В еще одном воплощении 5 (или более) смежных аминокислот происходят из гипервариабельного участка (CDR) G1, представленного на фиг. 5. В некоторых воплощениях смежные аминокислоты происходят из вариабельной области G1. Аффинность связывания (KD) антагонистического антитела против CGRP и полипептида в отношении CGRP (такого как человеческий -CGRP) может составлять от приблизительно 0,06 до приблизительно 200 нМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет любое значение из приблизительно 200, 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500, приблизительно 100, приблизительно 60, приблизительно 50, приблизительно 20, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 5 или приблизительно 2 пМ. В некоторых воплощениях аффинность связывания составляет менее чем любое значение из приблизительно 250, приблизительно 200,приблизительно 100, приблизительно 50, приблизительно 10, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500,приблизительно 100 или приблизительно 50 пМ. В изобретении также предложены способы получения любого из этих антител или полипептидов. Антитела по изобретению могут быть получены способами, известными в данной области техники. Полипептиды могут быть получены путем протеолитического или иного расщепления антител рекомбинантными способами (т.е. единичные или слитые полипептиды), как описано выше, или путем химического синтеза. Полипептиды антител, в особенности более короткие полипептиды длиной приблизительно до 50 аминокислот, для удобства получают химическим синтезом. Способы химического синтеза известны в данной области техники и имеются в продаже. Например, антитело может быть получено при помощи автоматического полипептидного синтезатора с использованием твердофазного способа. См. также патенты США 5807715; 4816567 и 6331415. В еще одном альтернативном воплощении антитела могут быть получены рекомбинантным путем с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. В одном из воплощений полинуклеотид включает последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела G1, представленного в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В еще одном воплощении полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9 и SEQID NO: 10, клонируют в одном или более чем одном векторе для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может сохраняться в векторе в клетке-хозяине, и эту- 26015526 клетку-хозяин затем можно размножать и замораживать для будущего применения. Здесь дополнительно описаны векторы (включающие экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева. Данное изобретение также охватывает одноцепочечные фрагменты вариабельной области (scFv) антител по изобретению, таких как G1. Одноцепочечные фрагменты вариабельной области получают путем связывания вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием короткого связывающего пептида. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Пример связывающего пептида представляет собой (GGGGS)3, который образует мостик длиной приблизительно 3,5 нм между карбоксильным концом одной вариабельной области и аминоконцом другой вариабельной области. Разработаны и применяют линкеры других последовательностей. Bird et al. (1988). В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для дополнительных функций, таких как присоединение лекарств или присоединение к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантным, либо синтетическим путем. Для синтетического получения scFv можно применять автоматический синтезатор. Для рекомбинантной продукции scFv подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующийscFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяин, являющуюся либо эукариотической, такой как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотической, такой как Е. coli. Полинуклеотиды, кодирующие интересующую scFv, могут быть получены при помощи стандартных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Получающаяся в результате scFv может быть выделена с использованием стандартных способов очистки белков, известных в данной области техники. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для обеспечения возможности объединения двух доменов на одной и той же цепи, тем самым вынуждая домены объединяться с комплементарными доменами другой цепи и образуя два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2:1121-1123). Например, биспецифические антитела, моноклональные антитела, обладающие специфичностями связывания в отношении по меньшей мере двух различных антигенов, могут быть получены с использованием раскрытых здесь антител. Способы получения биспецифических антител известны в данной области техники (см., например, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основано на коэкспрессии пар тяжелая цепь-легкая цепь двух иммуноглобулинов, где две тяжелые цепи имеют разную специфичность (Millstein and Cuello, 1983,Nature 305, 537-539). В соответствии с одним из подходов получения биспецифических антител вариабельные домены антитела, имеющие желаемые специфичности связывания (антигенсвязывающие центры антитела), подвергают слиянию с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим по меньшей мере часть шарнирной области СН 2 и СН 3. Предпочтительно, чтобы константная область первой тяжелой цепи (СН 1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствовала по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулинов и, если желательно, легких цепей иммуноглобулинов, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает значительную гибкость в выборе взаимных соотношений трех полипептидных фрагментов в воплощениях, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные выходы. Тем не менее, можно встраивать кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит в результате к высоким выходам, или когда эти соотношения не имеют конкретной значимости. В одном из подходов биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания, с одной стороны, и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания), с другой стороны. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только в одной половине биспецифичной молекулы облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновой цепи. Этот подход описан в заявке РСТWO 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г. Гетероконъюгатные антитела, включающие два ковалентно связанных антитела, также находятся в объеме данного изобретения. Такие антитела используют для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения инфекции вируса иммунодефицита(ВИЧ) (публикация РСТWO 91/00360 и WO 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых удобных способов перекрестного сшивания. Подходящие сшивающие агенты и способы перекрестного сшивания хорошо известны в данной области техники и описаны в патенте США 4676980. Химерные или гибридные антитела также могут быть получены in vitro с использованием извест- 27015526 ных химических способов синтеза белка, включая те, в которые вовлечены сшивающие агенты. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолят и метил-4-меркаптобутиримидат. Гуманизированное антитело, включающее один или более чем один CDR антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6, или один или более чем один CDR, имеющий происхождение из антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6, может быть получено с использованием любых способов, известных в данной области техники. Например, четыре общие стадии могут быть использованы для гуманизации моноклонального антитела. Данное изобретение охватывает модификации антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6, включающие функционально эквивалентные антитела, которые не влияют значительно на их свойства, и варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью и/или аффинностью. Например, аминокислотная последовательность антитела G1 или его вариантов, представленных в табл. 6, может быть мутирована с получением антитела, обладающего желаемой аффинностью связывания с CGRP. Модификация полипептидов представляет собой стандартную практику в данной области техники, и нет необходимости подробно описывать ее здесь. Модификация полипептидов проиллюстрирована в примерах. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды, имеющие консервативные замены аминокислотных остатков, одну или более чем одну делецию или добавление аминокислот, которые не приводят к существенным неблагоприятным изменениям функциональной активности, или применение химических аналогов. Вставки в аминокислотную последовательность включают слияния с амино- и/или карбоксильным концом, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков,а также вставки одного или множества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры вставок по концу включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с эпитопным концом. Другие варианты вставки в молекулу антитела включают слияние с N- или С-концом антитела фермента или полипептида, которое увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки крови. Варианты с заменой включают удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка из молекулы антитела и встраивание вместо него различных остатков. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения FR. Консервативные замены представлены в табл. 1 под заголовком "консервативные замены". Если такие замены приводят в результате к изменению биологической активности, то могут быть осуществлены более значительные изменения, обозначенные в табл. 1 как "примеры замен", или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты могут быть отобраны и подвергнуты скринингу. Таблица 1 Замены аминокислот Значительные модификации биологических свойств антитела осуществляют путем выбора замен,которые значительно отличаются по их эффекту в отношении поддержания (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте мишени или (в) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки разделяют на группы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro и(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe, His. Неконсервативные замены осуществляют путем замены представителя одного из этих классов на представители другого класса. Любой цистеиновый остаток, не вовлеченный в поддержание правильной конформации антитела,также может быть заменен, как правило, на серин, с улучшением стабильности молекулы к окислению и предотвращением аномального перекрестного связывания. Наоборот, цистеиновая(ые) связь(и) может(гут) быть введена(ы) в антитело для улучшения его стабильности, в частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент. Модификации аминокислот могут варьировать от замены или модификации одной или более чем одной аминокислоты до полного реконструирования области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменять аффинность и/или специфичность связывания. В некоторых воплощениях в домене CDR осуществляют замены не более чем 1-5 консервативных аминокислот. В других воплощениях в домене CDR осуществляют замены не более чем 1-3 консервативных аминокислот. В других воплощениях домен CDR представляет собой CDR H3 и/или CDRL3. Модификации также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды, обладающие другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилированы в консервативных положениях в их константных областях (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard,1990, Biochem. 29:4175-4180) и внутримолекулярное взаимодействие между фрагментами гликопротеина, что может оказать влияние на конформацию и презентируемую трехмерную поверхность гликопротеина (Hefferis and Lund, выше; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Олигосахариды также могут служить для нацеливания данного гликопротеина на некоторые молекулы, основываясь на специфических распознающих структурах. Также сообщали о том, что гликозилирование антител оказывает влияние на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, сообщали о том,что клетки яичника китайского хомячка (СНО) с регулируемой тетрациклином экспрессией (1,4)-Nацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), катализируемым гликозилтрансферазой образованием разрезанного пополам GIcNAc, обладают улучшенной активностью ADCC (Umana et al, 1999, MatureBiotech. 17:176-180). Гликозилирование антител, как правило, является либо N-связанным, либо О-связанным. NГликозилирование относится к присоединению углеводной группировки к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Хцистеин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводной группировки к бо- 29