Опухолеассоциированные пептиды, беспорядочно связывающиеся с молекулами класса ii человеческого лейкоцитарного антигена (hla)

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к 49 новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE) 013876 Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также к клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности рака печени и толстой кишки. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к 49 новым пептидным последовательностям,полученным из молекул HLA класса II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Уровень техники Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной,так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Cheever et al., Annals N.Y. Sci. Acad. Sci. 1993, 690:101-112). В частности, CD8-положительные Т-клетки (TCD8+), которые распознают молекулыI класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков,образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA). Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться в большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться только на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, комплексы из пептида и МНС класса II распознаются CD4-положительными хелперными Т-клетками.CD4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов и поэтому идентификация CD4-положительных Т-клеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Kobayashi, H., Omiya, R., Ruiz, M., Huarte, E., Sarobe, P., Lasarte, J.J., Herraiz, M.,Sangro, B., Prieto, J., Borras-Cuesta, F. and Celis, E. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper TCorrelation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(15):8862-7). На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (т.е. CD8-положительных Т-лимфоцитов),CD4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирования визуализирования опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (IFN-) (Qin, Z. and Blankenstein, T. 2000.receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). К тому же было показано, чтоCD4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами HLA класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (Ab) (Kennedy, R.C., Shearer, М.Н., Watts, A.M. and Bright R.K. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами HLA класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Так как конститутивная экспрессия молекулHLA класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Mach, В., Steimle, V.,Martinez-Soda E. and Reith, W. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev.Immunol. 14:301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Поэтому было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса антигенпрезентирующих клеток (АПК), например инкубация АПК с интересующим антигеном для его поглощения, процессинга и презентации (Chaux, P.,-1 013876Bruggen B.P. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778) или трансфекция клеток генами или мини-генами, кодирующими интересующий антиген, и слитых с инвариантной цепью, которая опосредует транслокацию антигена в лизосомный компартмент МНС класса II по процессингу и погрузке. Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 остатков в длину и содержат два зарезервированных остатка ("домен") в их последовательности,которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам(АПК), например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из всех классов белков, таких как энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например,также присутствовать только в опухолевых клетках, например, как продукты мутировавших генов или альтернативных открытых рамок считывания (ОРС) или белкового сплайсинга (Vigneron N., Stroobant V.,Chapiro J., Ooms A., Degiovanni G., Morel S., van der Bruggen P., Boon T., Van den Eynde B.J. An antigenicpeptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science. 2004 Apr. 23; 304 (5670):587-90). Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ ("раковый тестикул"), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани тестикул. Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, PSA (простата-специфический антиген) и PSMA (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями (кроссовер), такими как bcr/abl в лимфоме. Тем не менее многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Linehan W.M.,Walther M.M., Zbar В. The genetic basis of cancer of the kidney. J. Urol. 2003 Dec.; 170 (6 Pt 1):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р 53 (которые являются примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL и HER-2/neu,могут аккумулировать мутации, приводящие к активации экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al. Cancer Research. 1998. 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211). Cancer Research. 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994,187:198-211). Эти мутантные белки могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака. Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но также имел высокую концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессингу II класса. Есть возможность инкубировать антигенпрезентирующие клетки с интересующим антигеном для его поглощения и процессирования (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K.,Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A.M.L., Boon, T.van der, B.P. (1999), J. Exp. Med. 189, 767-778). Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательности-мишени,Такие белки слияния, экспрессированные в АПК, направляют антигены в отдел процессирования II класса (Marks, M.S., Roche, P.A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P.J.Bonifacino, J.S. (1995), J. CellBiol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J.M., de Pereda, J.M.Whitton, J.L. (2001), J. Virol. 75, 10421-10430). Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН 1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоцииро-2 013876 ванные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является поэтому выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, которые могут быть распознаны CD4-положительными ЦТЛ. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II. В соответствии с настоящим изобретением данная задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида, выбранного из группы пептидов, содержащих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из SEQ ID1-49 из приложенного списка последовательностей, причем пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II, при условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом. В настоящем изобретении изобретатели демонстрируют то, что возможно изолировать и охарактеризовать пептиды, связывающиеся с молекулами HLA класса II, напрямую из опухолей млекопитающих,предпочтительно из опухолей человека, предпочтительно солидных опухолей, например из почечноклеточных карцином и карцином толстой кишки. Инфильтрирующие моноциты экспрессировали молекулы МНС класса II в равной степени, как и опухолевые клетки, и, в дополнение, опухолевые клетки проявляли активацию нескольких цитокинов или хемокин-индуцированных генных продуктов, например интерферон-гамма-индуцированных генных продуктов. Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, образованные из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и способность связываться в достаточной мере с молекулами HLA II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа TH1. Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани, включая, например, опухолеассоциированные пептиды из матричной металлопротеиназы 7 (ММР 7; SEQ ID1) и связывающего инсулиноподобный фактор роста белка 3 (IGFBP3; SEQ ID25). В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают также неопровержимую очевидность того,что опухолеассоциированные пептиды в достаточной мере связывающиеся беспорядочно с молекуламиHLA II класса, в особенности с аллелями HLA II класса, которые генетически закодированы локусомHLA DR человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные человеческимиCD4-положительными Т-клетками. CD4-положительные Т-клетки были изолированы из периферийной крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток. Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые этим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака. В целях идентификации лигандов HLA II класса из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) для разработки основанной на пептидах иммунотерапии изобретатели попытались изолировать презентированные пептиды HLA-DR напрямую из вырезанных солидных опухолей, в особенности почечноклеточной карциномы (RCC), о которой сообщалось, что она способна экспрессировать молекулы II класса (Gastl, G., Ebert, Т., Finstad, C.L., Sheinfeld, J., Gomahr, A., Aulitzky, W. and Bander N.H. 1996.interferon gamma. J. Urol. 155:361-367). Даже если большинство опухолевых клеток были негативными по классу II, современный уровень развития масс-спектрометров должен был обеспечить чувствительность,требуемую для идентификации пептидов II класса из минимального числа опухолевых клеток или инфильтрирующих лейкоцитов, которые, возможно, кросс-презентируют опухолеассоциированные антигены, или из стромальных клеток по периметру растущей опухоли. Причинами для фокусировки внимания на RCC для демонстрации доказательства правильности концепции были следующие. Диагноз RCC ставится ежегодно примерно 150 тысячам человек в мире, с данным заболеванием связан высокий уровень смертности, результатом чего являются приблизительно 78 тысяч смертей в годCancer, 4:381-393). Если выявлены метастазы, то одногодичный коэффициент выживаемости сокращается примерно до 60% (Jemal, A., Tiwari, R.C., Murray, T., Ghafoor, A., Samuels, A., Ward, E., Feuer E.J. and-3 013876 медицины при этом показании. Так как RCC является, вероятно, иммуногенной опухолью (Oliver RTD,Mehta A., Barnett M.J. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma andEngl. J. Med. 1998; 338:1265), как было указано существованием опухолевых реагирующих и инфильтрирующих ЦТЛ (Finke, J.H., Rayman, P., Alexander, J., Edinger, M., Tubbs, R.R., Connelly, R., Pontes, E. andtumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 50:2363-2370), то для разработки основанных на пептидах противоопухолевых вакцинаций были инициированы клинические исследования (Wierecky J., Mueller M., Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1.Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr. 28). Однако в связи с недостатком хелперных Т-клеточных эпитопов из ТАА молекулярные вакцины обычно включают пептиды, функционирующие только как лигандыI класса. В ходе научной работы, ведущей к настоящему изобретению, изобретатели были в состоянии изолировать лиганды II класса из десяти проб RCC, трех колоректальных карцином (CCA) и одной переходно-клеточной карциномы (ТСС, уротелиальная карцинома). Только выбранные лиганды из ТАА, идентифицированные таким способом, обладают общей способностью 1) происходить из антигена с известной ассоциацией с опухолью; 2) связываться с наиболее распространенными аллелями HLA II класса DR, HLA DRB10101 и 3) иметь характеристики, обосабливающие их из большинства лигандов HLA II класса, в том, что они выполняют критерии, касающиеся их первичной аминокислотной последовательности, позволяющей им беспорядочно связываться с молекулами HLA-DR по крайней мере из двух различных аллелей. Как поясняется далее на примере с пептидом из ММР 7 (SEQ ID1), эти беспорядочно связывающиеся с HLA-DR опухолеассоциированные пептиды, как было обнаружено, распознаютсяCD4-положительными Т-клетками. Первый аспект изобретения обеспечивает пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID1-49 или их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность, а именно одна из последовательностей во всю длину, как представлена в списке ID локус-линкеров (входные номера указаны в приложенной далее табл. 1). Как здесь описывается в дальнейшем, все пептиды, формирующие основу настоящего изобретения,были выявлены как презентируемые клетками, несущими МНС класса II (RCC). Таким образом, эти конкретные пептиды, так же как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), будут по всей вероятности все вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в указанных пептидах (см. ниже). Специалист в данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу. Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID1-49 или одним из их вариантов. Термин "состоял преимущественно из" подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из SEQ ID1-49 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на N- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как "коровая последовательность" пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп. Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению включает 80 N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р 33, в дальнейшем "Ii"), как взятая из NCBI, инвентарный номер - GenBank"Вариантом" данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают то, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связывать подходящую молекулу МНС, такую как HLA-A, и таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные-4 013876 ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах этого изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, как описано впоследствии, некоторые позиции связывающихся с HLA-A пептидов являются типичными доменными остатками, образующими центральную последовательность,подходящую к соединительному элементу HLA-связывающей бороздки. Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, включение которой, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом,помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности, или их часть, или их вариант, как дано. В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы "коровой последовательностью", имеющей конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции "коровой последовательности" (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину от 1 до 10 аминокислот соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 100,предпочтительно между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но в основном они могут иметь молекулярный вес менее чем 100000, предпочтительно менее чем 50000, более предпочтительно менее чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Если пептид, который имеет более чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному HLA-связывающему региону, являлись такими, что, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками. Примеры для пептидов из МНС-лигандов, элементов, вариантов, а также отдельные примеры для N- и/или С-терминальных удлиняющих сегментов могут быть взяты, например, из банка данных SYFPEITHI (Rammensee H., Bachmann J., Emmerich N.P., Bachor O.A., Stevanovic S. SYFPEITHI:http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ и ссылок, включенных сюда. В качестве неограниченных примеров некоторые пептиды для HLA-DR в банке данных представлены как пептид KHKVYACEVTHQGLSS, полученный из цепи Ig kappa 188-203 (Kovats et al. Eur. J. Immunol. 1997 Apr; 27(4):1014-21); KVQWKVDNALOSGNS, полученный из цепи Ig kappa 145-159 (KovatsGAD65 556-575 (Endl et al. J. Clin. Invest. 15 May, 1997; 99(10):2405-15). В дополнение, пептиды могут также быть получены из мутировавших последовательностей антигенов, таких как в случаеHammer et al. Cell. 16 Jul., 1993; 74(1):197-203 and Hammer et al. J. Exp Med. 1 May, 1995; 181(5):1847-55) как примеры для HLA-DR4 выделены жирным шрифтом, предполагаемые центральные последовательности подчеркнуты. Все описанные выше пептиды охватываются термином "варианты" данной аминокислотной последовательности. В понятие "пептид" изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-CO-NH-), но и также молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретрообратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Meziere et al. (1997), J. Immunol. 159, 3230-3237,включенной в данное описание посредством ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, а не ориентацию боковых цепей. Meziere et al.(1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для МНС класса II и Т-хелперных клеточных ответов. Ретрообратные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, более устойчивы к протеолизу. Типично, что пептид по изобретению является таким, который, если он экспрессирован в антигенпрезентирующей клетке, может процессироваться, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС, а также может быть презентирован подходящей клеткой и может вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида фрагмент может также быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который включает данную аминокислотную последовательность, или ее сегмент, или ее вариант, и дальнейший сегмент, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший сегмент может включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого сегмента, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является "усеченным" белком человека или белком слияния белкового фрагмента и другого сегмента полипептида при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотную последовательность изобретения. В особенно предпочтительном воплощении пептид по изобретению включает аминокислотную последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, причем дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на вид опухоли, который аберрантно экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды "бусины на нити", которые могут также использоваться в качестве вакцин. Из последующего следует понимать, что в некоторых случаях применения пептиды по изобретению могут быть использованы непосредственно (т.е. их не получают при экспрессии полинуклеотида в клетке пациента или в данной пациенту клетке); в случае такого применения предпочтительно, чтобы пептид имел менее чем 100 или 50 остатков. Предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были способны связываться с HLA-DR. Особенно предпочтительно, если пептиды селективно связываются с HLA-DRB10101. В другом аспекте настоящего изобретения аналогично ситуации, поясненной выше для молекул МНС II класса, пептиды по изобретению могут быть применены для вызывания специфического Т-клеточного ответа МНС I класса. Предпочтительный специфический пептид МНС I класса настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 16, предпочтительно между 9 и 12 аминокислотами. Нужно понимать, что такие пептиды могут быть использованы (например, в вакцине) как более длинные пептиды, аналогично пептидам МНС II класса. Способы идентификации специфических "центральных последовательностей" МНС класса I, имеющих конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент для молекул HLA класса I, известны специалисту данной области и могут быть спрогнозированы,например, компьютерными программами PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) и SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de). Пептиды по изобретению особенно полезны для иммунотерапевтических методов по маркированию и уничтожению клеток, которые аберрантно экспрессируют полипептиды, формирующие основу для настоящих пептидов по изобретению. Так как эти специфические пептиды, состоящие из данных аминокислотных последовательностей, связываются с HLA-DR, предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были такими, которые связывают HLA-DR, и при такой связи HLA-DR-пептидный комплекс, презентированный на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки, был бы способен вызывать продуцирование ЦТЛ, которые распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению включает 80N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р 33, в дальнейшем "Ii"), как взятый из NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497 (см. ниже). В понятие "аберрантно экспрессированный" авторы включают то, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии или что ген является "молчащим" в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием "гиперэкспрессирован" авторы подразумевают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани. Пептиды (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu et al. (1981), J. Org. Chem. 46, 3433 и в прилагающихся ссылках. Временная защитаN-аминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Повторное расщепление этой высоко щелочелабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в N,N-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые-6 013876 эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Там, где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой цепи амидофункциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросслинкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные, за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного N,N-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя с сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при синтезе. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, Bruckdorfer T., Marder О., Albericio F. From production of peptides in milligramamounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb.; 5(1):2943 и приводимые здесь ссылки). Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии вCalbiochem-Novabiochem (Великобритания) Ltd., Nottingham NG7 2QJ, Великобритания. Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник, как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и(обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием градиентного разделения ацетонитрил/вода. Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (FAB), а также масс-спектрометрического анализа MALDI и ESI-Q-TOF. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид),кодирующую пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, это только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК. Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазы рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т 4 ДНК полимеразы или E.coli ДНК полимеразы I, ферментов, которые удаляют выдающиеся 3'-одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями и наполняют имеющие углубления 3'-концы их полимеразными активностями. Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в присутствии фрагмента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого как бактериофаг Т 4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.-7 013876 Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, США. Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто у Saiki et al. (1988), Science 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу для ферментативного амплифицирования ДНК примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования в векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов. Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом,ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в следующих патентах США: 4440859, выданном 3 апреля 1984 г. на имя Rutter et al.; 4530901, выданном 23 июля 1985 г. на имяMark et al.; 4678751, выданном 7 июля 1987 г. на имя Goeddel; 4704362, выданном 3 ноября 1987 г. на имя Itakura et al.; 4710463, выданном 1 декабря 1987 г. на имя Murray; 4757006, выданном 12 июля 1988 г. на имя Toole, Jr. et al.; 4766075, выданном 23 августа 1988 г. на имя Goeddel et al.; и 4810648, выданном 7 марта 1989 г. на имя Stalker, которые все включены в описание путем ссылки. ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция. Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину посредством стандартных способов. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клеткихозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам. Альтернативно, ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина. Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен. Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.coli и Bacillus subtilis),дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была RCC (почечноклеточная карцинома) или линией клеток Awells. Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК,которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично представлены в плазмидных векторах,содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются pUC18, pUC19, pBR322 и pBR329,имеющиеся в наличии в Biorad Laboratories, Richmond, CA, США, а также pTrc99A и pKK223-3, имеющиеся в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ, США. Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих pSVL имеется в наличии в Pharmacia,Piscataway, NJ, США. Этот вектор использует поздний промотор SV40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антигенвырабатывающих клетках, таких как клетки COS-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих являетсяpMSG, имеющийся также в наличии в Pharmacia. Этот вектор использует глюкокортикоидиндуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются-8 013876 92037, США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (YIps) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Ycps). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники. Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е.coli, таким как, например,Е.coli штамма DH5, имеющимся в наличии в Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, США, иRR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур American Type Culture Collection(ATCC) of Rockville, MD, США ( АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии. Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС какCCL61, NIH эмбриональные клетки швейцарской мыши NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС какCRL 1658, почечные клетки обезьяны COS-1, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650, и клетки 293,являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфицироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Cohen et al. (1972),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 и Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у Sherman et al. (1986), Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Beggs) (1978), Nature 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и DEAE-декстран или липосомальные композиции, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc.,Gaithersburg, MD 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных. Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными методами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК проверяться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у Southern (1975), J. Mol. Biol. 98, 503 или у Berent et al. (1985), Biotech. 3, 208. Альтернативно, наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител, как описывается ниже. В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, клетки, успешно трансформированные с вектором экспрессии, вырабатывают белки, проявляющие соответствующую антигенность. Образцы предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткамхозяевам настоящее изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (клонально-гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной среде. Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее,другие клетки-хозяева могут быть пригодны в некоторых методах лечения. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессирования пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для внутривенной (i.v) инъекции, подкожной (s.с) инъекции, внутрикожной (i.d) инъекции, внутрибрюшной (i.p) инъекции,внутримышечной (i.m) инъекции. Предпочтительными способами пептидной инъекции являются s.c, i.d.,i.p., i.m. и i.v. Предпочтительными способами инъекции ДНК являются i.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. Вводиться могут дозы от 1 до 500 мг пептида или ДНК. Дальнейший аспект изобретения относится к использованию опухолеассоциированного пептида в соответствии с изобретением, нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением в медицине.-9 013876 Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего указанный пептид, причем объем указанного пептида или объем указанного полинуклеотида или вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клеткимишени у указанного пациента. Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой. Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота формирует вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток,полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то она может быть полезна для трансфекции клеток, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть в основном чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом, таким как Detox, либо использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993), Ann. NY Acad.Sci. 690, 276-291). NY Acad. Sci. 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют CD4 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой CD4-положительными Т-клетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопами, которые стимулируют CD4 положительные Т-клетки. Стимулирующие CD4-положительные эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. Полинуклеотид может быть в основном чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "ген-пистолета". Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом,который стимулирует CD4-положительные Т-клетки. Пептид для использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-, или 12-мерным пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9- или 10-мерные пептиды, как описано в приложенной табл. 1, являются предпочтительными. Соответственно любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. "Обнаженная" ДНК может вводиться внутримышечно, или внутрикожно, или подкожно. Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшно, внутривенно или подкожно(см. также выше рассмотрение способа получения пептида). Предпочтительно, чтобы пептиды в качестве активных фармацевтических компонентов вводились в комбинации с адъювантом, таким как, например,ИЛ-2, ИЛ-12, GM-CSF, неполным адъювантом Фрейнда, полным адъювантом Фрейнда или липосомальными композициями. Наиболее предпочтительные адъюванты рассматриваются, например, уOpin. Biol. Ther. 2004 Feb; 4(2):181-98. Вакцинация приводит к ответам ЦТЛ, стимулированных профессиональными антигенпрезентирующими клетками; после примирования ЦТЛ может появиться преимущество по стимуляции экспрессии МНС в опухолевых клетках. Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например в антигенпрезентирующие клетки, либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента и введении ex vivo пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Zhou et al. (1995), Blood, 86, 3295-3301; Roth et al. (1996), Scand. J. Immunology, 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает поэтому эффективную вакцину против рака или раковых или опухолевых клеток, включающую эффективный объем пептида в соответствии с изобретением или включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Также предпочтительно, чтобы вакцина была вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Наиболее предпочтительной является вакцина, включающая (синтетический) пептид или пептиды (т.е. либо от- 10013876 дельный, либо в комбинации из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или даже большим числом пептидов, см. также ниже). Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть "обнаженной" (т.е., по существу, без других компонентов для введения) либо она может быть доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида дендритными клетками может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфицированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированные пептиды из трансфицированных клеток в ткани. Предпочтительно, если вакцина, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA,США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и собственно адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой, полученный из сапонина адъювант (Superfos, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Conry et al.therapeutics, Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, которые все включены в описание путем ссылки. Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного ответа, более предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу МНС II класса человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы HLA II класса на их поверхности. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, таким образом, способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vivo или in vitro, способ, включающий контактирование ЦТЛ invitro с нагруженными антигеном молекулами МНС класса II человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, причем антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Соответственно ЦТЛ являются CD4-положительными хелперными клетками, предпочтительно типа ТН 1. Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфицирована для экспрессии такой молекулы), или если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга или презентации антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ. Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на обозначенную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС класса II может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro. Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т 2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена. Нагружающая пептид дефектная клеточная линия Т 2 человека имеется в наличии в AmericanType Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговымCRL 1992; клеточная линия дрозофилы линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговымCRL 19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается у Karre и Ljunggren (1985), J. Exp. Med. 162,- 11013876 1745. Обычно обозначенная клетка-хозяин до трансфекции в основном не экспрессирует молекулы МНСI класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Т-клеточной костимуляции, такую как любая из В 7.1, В 7.2, ICAM-1 и LFA 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных GenBank и EMBL. В дальнейшем воплощении также могут быть использованы комбинации молекул HLA, такие как,например, молекулы МНС класса II, как описываются здесь в табл. А и В. Использование рекомбинантных полиэпитопных вакцин для доставки множественных эпитоповCD8+ ЦТЛ описывается у Thomson et al. (1996), J. Immunol. 157, 822-826 и в WO 96/03144, которые включены сюда путем ссылки. По отношению к настоящему изобретению может быть желательным включение в одну вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), причем пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения и другой CD8+ Т-клеточный стимулирующий эпитоп. Такая вакцина была бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний. Такие вакцины "бусины на нити" являются типичными ДНК-вакцинами. Синхронная инициация МНС класса IIзависимого иммунного ответа вместе с МНС класса I-зависимым иммунным ответом имеет преимущество, которое ведет к локальной TH1-подобной Т-клеточной реакции CD4-положительных Т-клеток, чем поддерживаются МНС класса I-зависимые CD8-положительные Т-клетки. Для генерации ЦТЛ in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах,описанных у Peoples et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 432-436 и Kawakami et al. (1992), J.Immunol. 148, 638643, при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Для приготовления ЦТЛ Plebanski et al. (1995), Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 использует аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Jochmus et al. (1997), J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 описывают получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Hill et al. (1995), J. Exp. Med. 181, 2221-2228 и Jerome et al. (1993), J. Immunol. 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ пользуются В-клетками. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. Walter S., Walter S., Herrgen L., Schoor O., Jung G., Wernet D., Buhring H.J., Rammensee H.G.,Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 15 Nov., 2003; 171(10):4974-8) описывают прайминг Т-клеток in vitro с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток, который является также подходящим путем генерации Т-клеток против выбранного пептида. При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот метод детально описывается в патенте WO 97/26328, включенном в описание путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т 2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, бактерии,дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, Porta et al. (1994), Virology 202, 449-955), который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов. Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов изобретения, применимы в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавали указанную клетку при взаимодействии с комплексом HLA/пептид (например, соединение). ЦТЛ применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид,включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ. ЦТЛ, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно, ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. "Здоровым индивидом" изобретатели обозначают, что индивид в общем имеет хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить. Активированные ЦТЛ экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР), который участвует в распознании клеток, которые экспрессируют аберрантный полипептид. Полезно, если кДНК, кодирующая ТКР,клонирована из активированных ЦТЛ и перенесена на дальнейшие ЦТЛ для экспрессии.- 12013876 Клетками-мишенями для CD4-положительных ЦТЛ in vivo в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС классаII). ТКР клонов ЦТЛ по изобретению, специфические для пептидов по изобретению, клонируются. Использование ТКР в клонах ЦТЛ определяется использованием (i) ТКР вариабельных регионспецифических моноклональных антител и (ii) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами, специфическими для семейств генов Va и Vp. Библиотека кДНК подготовлена из поли-(А)-мРНК, экстрагированной из клонов ЦТЛ. Использовались праймеры, специфические для С-терминального участка ТКР а и Р-цепей, а для N-терминального участка - идентифицированные сегменты Va и Р. Вся кДНК для ТКР а и цепи амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой, и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепи могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода, описанного у Chung et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9112658. В этой отдельной модели цепи за сегментом VaJ следует сегмент V DJ, затем сегмент Ср, затем трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи CD3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в ретровирусный вектор экспрессии (панель векторов может быть использована на основе их способности инфицировать взрослые человеческие CD8-положительные Т-лимфоциты и способствовать экспрессии генов: ретровирусная система векторов Kat является одной предпочтительной возможностью (см. Finer etal. (1994), Blood 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать очищенные CD8-положительные или CD4-положительные Т-лимфоциты, изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу, опубликованному у Roberts et al. (1994), Blood 84,2878-2889, включенному в описание путем ссылки). Антитела анти-CD3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных CD8+ Т-клеток, которая способствует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции определяется окрашиванием инфицированных CD8+ Т-клеток антителами, специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ in vitro трансдуцированных CD8-положительных Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном ЦТЛ, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных CD8 положительных Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения пациентов можно использовать от 108 до 1011 аутологичных, трансдуцированных ЦТЛ. Аналогично CD8-положительным могут быть генерированы трансдуцированные CD4-положительные Т-хелперные клетки, несущие соотносимые модели. Другие подходящие системы для введения генов в ЦТЛ описываются в работе Moritz et al. (1994),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91-4322, включенной в описание путем ссылки. Eshhar et al. (1993), Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 90,720-724 и Hwu et al. (1993), J. Exp. Med. 178, 361-366 описывают также трансфекцию ЦТЛ. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку,которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; ТКР, полученный из активированных ЦТЛ. В дополнение к ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генной инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным у Chung et al. (1994), Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 91, 12654-12658, включенным в описание путем ссылки и указанным выше. Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны выше в связи с экспрессией пептидов по изобретению. Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны экспрессировать ТКР в следующей за ЦТЛ трансфекции. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получения ЦТЛ от пациента; (2) введения в указанные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР, или функционально эквивалентную молекулу,как определено выше; и (3) введения клеток, полученных на стадии (2), пациенту. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая определена в первом, или втором, или третьем аспектах изобретения, метод,включающий стадии (1) извлечения антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, у обозначенного пациента; (2) контактирования указанных антигенпрезентирующих клеток с пептидом,как определено в первом, или втором, или третьем аспектах изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, ex vivo; и (3) введения обработанных таким образом антигенпрезентирующих клеток снова пациенту.- 13013876 Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Murphy et al. (1996), The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al. (1997), TheProstate, 32, 272-278. В дальнейшем воплощении антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, контактируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом приводя к презентации пептида и индукции иммунитета. Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например,аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к MUC1 (см. Gong et al. (1997), Gene Ther. 4,1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Wan et al. (1997), Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (Specht et al. (1997), J. Exp. Med. 186, 1213-1221 и Szabolcs et al. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Tuting et al. (1997), Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (Ashley et al. (1997), J. Exp. Med. 186, 1177-1182). Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковые клетки почек или толстой кишки. Особенно предпочтительно, если пациенты, которых лечат методами данного изобретения, имели гаплотип HLA-DR. Таким образом, в предпочтительном воплощении HLA-гаплотип пациента определяется до начала лечения. Гаплотипирование HLA может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники. Изобретение включает в особенности использование пептидов по изобретению (или кодирующих их полинуклеотидов) для активной вакцинации in vivo; для манипуляции аутологичными дендритными клетками in vitro при последующем введении манипулированных таким образом дендритных клеток invivo для активации ответов ЦТЛ; для активации аутологичных ЦТЛ in vitro с последующей адоптивной терапией (т.е. манипулированные таким образом ЦТЛ вводятся пациенту) и для активации ЦТЛ здоровых доноров (МНС-совместимых или несовместимых) in vitro с последующей адоптивной терапией. В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину либо отдельно, либо в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования опухолей. Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila'sQS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и собственно адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой, полученный из сапонина адъювант(Superfos, Дания). Также могут быть полезны другие адъюванты, такие как олигонуклеотиды CpG, стабилизированная РНК, имиквимод (имеется в продаже под названием Aldara, изготавливаемый 3 МPharma, США), неполный адъювант Фрейнда (имеется в продаже как Montanide ISA-51, изготавливаемыйSeppic S.A., Париж, Франция), липосомальные композиции или ГМ-КСФ. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. С использованием пептидов может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции ЦТЛ, такие ЦТЛ, которые специфически направлены против пептида или индуцированы при терапии. Кроме того, увеличение числа предшественников Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые имеют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого получен пептид. В табл. 1 приведены пептиды, которые были идентифицированы, а также названия белков, из которых получен пептид, и соответствующая позиция пептида в соответствующем белке. Кроме того, даются соответствующие инвентарные номера, которые относятся к генному банку "Национального центра биотехнологической информации" (National Centre for Biotechnology Information) Национального института здоровья (National Institute of Health), см. http: www.ncbi.nlm.nih.gov.- 14013876 В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии в опухолевом заболевании или нарушении. В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются, например, в MethodsEnzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Согласно дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит один или более указанных пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом,предпочтительно водном, носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000,American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний. Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих любую из последовательностей SEQ ID1-49, вводится пациенту, страдающему опухолевым заболеванием, которое ассоциировано с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ. В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины либо в непосредственной комбинации, либо в рамках той же лечебной схемы. Кроме того, могут быть использованы комбинации с другими пептидами, например с пептидами, специфическими для МНС II класса. Специалист в данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке,например, поколения Т-клеток in vitro в равной степени, как их эффективности и общего присутствия,пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе выработки IFN- (см. также примеры ниже), ИЛ-12 или перфорина. Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше. Подходящая вакцина будет содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных пептидов, предпочтительно 4, 5, 6 или 7 различных пептидов и наиболее предпочтительно 6 различных пептидов. Наконец, вакцина может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени как и от статуса заболевания, ранних схем лечения,иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. Было показано, что 80 N-терминальных аминокислот Ii достаточно для направления белков в каскад реакций по процессингу II класса (Sanderson, S., Frauwirth, K.Shastri, N. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 92, 7217-7221, Wang, R.F., Wang, X., Atwood, A.C, Topalian, S.L.Rosenberg, S.A. (1999), Science 284, 1351-1354). Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. Здесь изобретатели сообщают об общеприменимом методе и пептидах, которые были получены из дифференциального пептидного анализа на МС для идентификации естественно процессированных и презентированных лигандов МНС II класса опухолеассоциированных антигенов. Этот подход впервые объединяет стадию трансфекции АПК с вектором, кодирующим для белка слияния между цепью Ii и интересующим антигеном, элюирование связанных с HLA пептидов и МС-идентификацию образованных из антигена пептидов, презентируемых трансфицированными по сравнению с нетрансфицированными клетками. Более того, изобретатели могли подтвердить действенность этого метода, показав, что Т-клетки, индуцированные против идентифицированного пептида, специфически распознают трансфектанты, гиперэкспрессирующие родственный антиген. Хотя идентифицированные пептиды все еще должны быть протестированы на их иммуногенность in vivo, наш подход ведет к точной характеристике естественно процессированных лигандов МНС II класса. Таким образом, изобретатели избегают тестирования как синтетических перекрывающих пептидов опухолеассоциированных антигенов, так и широкого спектра пептидов, выбранных эпитоппрогнозированием, которое по сравнению с эпитоп-прогнозированием класса I менее точно. В отличие от лабораторных Т-клеточных анализов, которые могут вести к идентификации криптических Т-клеточных эпитопов, не способных индуцировать Т-клеточную активацию in vivo (Anderton, S.M.,- 15013876Viner, N.J., Matharu, P., Lowrey, P.A.Wraith, D.С (2002), Nat. Immunol. 3, 175-181), работа может быть сфокусирована на нескольких пептидах, которые, как было обнаружено, презентируются. Более того,используя этот метод, не нужно получать рекомбинантные антигены или иметь в наличии антигенэкспрессирующие опухолевые клеточные линии, чтобы доказать, что пептиды являются естественно процессированными. Изобретатели использовали N-конец Ii для направления опухолеассоциированных антигенов в компартмент по процессингу II класса EBV-трансформированных В-клеток. С целью достижения этого изобретатели сконструировали многосторонний вектор, с помощью которого можно экспрессировать любой антиген, такой как белок слияния с Ii, который помогает авторам определять уровень экспрессии белка в трансфицированных клетках с помощью метода иммунного блотинга (Western-blot). Уже было показано,что N-конца Ii достаточно для нацеливания белков в компартмент по процессингу II класса. Но до сих пор это было показано лишь на модели с использованием овальбумина (Sanderson, S., Frauwirth, K.Shastri, N. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7217-7221) с целью идентификации неизвестного антигена с использованием кодирующих белок слияния библиотек кДНК (Wang, R.F., Wang, X.,Atwood, А.С., Topalian, S.L.Rosenberg, S.A. (1999), Science 284, 1351-1354) или для подтверждения специфичности известных клонов Т-клеток (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K.,Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A.M., Boon, T.van der Bruggen, B.P. (1999), J. Exp. Med. 189, 767778). Насколько это известно изобретателям, этот метод никогда не использовался ранее для идентификации естественно презентируемых связанных с МНС II класса пептидов известных опухолеассоциированных антигенов. Дифференциальный анализ лигандов класса II трансфицированных и нетрансфицированных клеток на MALDI-MS и последующая характеристика дифференциально экспрессированных пептидов на ESI-MS приводит к эффективному методу по идентификации лигандов II класса интересующего антигена. Трансфекция клеток с белками слияния кератин-18 подтвердила, что метод изобретателей общеприменим для интересующих антигенов, и вновь изобретатели были способны описать презентируемый HLA-DR пептид из модели трансген, кератин-18. Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. До сих пор были разработаны различные стратегии для идентификации пептидов II класса из опухолеассоциированного антигена, начиная с инкубации АПК с интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (Chaux, P., Vantomme,V., Stroobant, V.,Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A.M., Boon, T., and van der Bruggen, B.P. 1999.Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778) до всевозможных стратегий трансфекции с белками слияния (Dengjel, J., Decker, P.,Schoor О., Altenberend, F., Weinschenk, T., Rammensee, H.G., and Stevanovic, S. 2004. Identification of amass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Для всех этих методов требуется большая затрата времени и часто остается неизвестным, действительно ли происходит презентация идентифицированных лигандов HLA in vivo человеческими тканями. Изобретатели смогли впервые показать, что возможна изоляция лигандов HLA II класса напрямую из вырезанных солидных опухолей, идентифицируя, таким образом, пептиды, которые презентируются опухолями и окружающей тканью in vivo, которые, следовательно, могут быть распознаны Т-клетками,несущими соответствующий Т-клеточный рецептор, и которые одновременно экспрессируют костимулирующий лиганд CD4 на их клеточной поверхности. Среди белков, функционирующих как источники для процессируемых эндогенно лигандов HLA II класса, было идентифицировано несколько белков "домашнего хозяйства" и связанных с иммунной системой белков. Однако пептиды из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) также могли быть обнаружены, что ведет к эффективному методу по идентификации in vivo-релевантных лигандов II класса ТАА. Изобретатели идентифицировали три лиганда, обнаруживающих одну центральную последовательность из IGFBP3, и один лиганд из ММР 7. Изобретатели обнаружили эти белки гиперэкспрессированными в почечно-клеточных карциномах, к тому же они были описаны как опухолеассоциированныеin the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279). Эти пептиды связывались беспорядочно с молекулами HLA II класса и были способны активироватьCD4-положительные Т-клетки различных здоровых доноров. Таким образом, подход изобретателей будет полезен при идентификации новых пептидов-кандидатов II класса из ТАА для использования в клинических протоколах по вакцинации.- 16013876 Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с настоящим изобретением, или нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, или вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, причем объем указанного пептида, или объем указанной нуклеиновой кислоты, или объем указанного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента. Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, как определено в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему стадии (1) получения цитотоксических Т-лимфоцитов от пациента; (2) введения в указанные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Тклеточный рецептор или функционально эквивалентную молекулу, как определено в соответствии с настоящим изобретением; и (3) введения клеток, полученных на стадии (2), пациенту. Предпочтительно, чтобы клетки-мишени являлись раковыми клетками. Более предпочтительно,чтобы указанный рак являлся лейкемией или лимфомой, которая экспрессирует полипептид, который включает аминокислотную последовательность, которая дана в соответствии с настоящим изобретением. В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы HLAII класса на их поверхности. Этот факт был описан лишь раз у Brasanac et al. (Brasanac D.,Markovic-Lipkovski J., Hadzi-Djokic J., Muller G.A., Muller C.A. Immunohistochemical analysis of HLA classhistopathological data. Neoplasma. 1999; 46(3): 173-8), где криостатные срезы 37 почечно-клеточных карцином (RCC) - 25 светло-клеточный тип, 10 гранулярный и 2 хромофобный - были исследованы непрямым иммунопероксидазным методом с применением моноклональных антител (MoAb) к антигенамHLA-DR, -DP и -DQ для анализа антигенов HLA класса II и анти-CD14, -CD3, -CD4 и -CD8 MoAb для опухоль-инфильтрующих мононуклеарных клеток (TIM). Число положительных клеток оценивалось полуколичественным методом, а результаты иммуногистохимического исследования были соотнесены с клиническими (возраст и пол пациента, размер опухоли и классификация по TNM) и гистопатологическими (цитология, гистология, степень) характеристиками RCC. Все RCC экспрессировали HLA-DR,92% -DQ- и 73% -DP-антигены с уровнем экспрессии в соотношении -DR-DQ-DP, однако не было установлено никакой значимой связи с какими-либо проанализированными гистопатологическими или клиническими параметрами. Моноциты были более многочисленны, чем Т-лимфоциты, а Т-клетки CD4+,чем CD8+, причем опухоли с преобладанием Т-лимфоцитов и приблизительно равным числом CD4+ иCD8+ Т-клеток имеют наибольший средний диаметр. Неадекватная активация Т-лимфоцитов опухолевыми клетками (несмотря на способность презентации антигена) могла быть причиной для ассоциации параметров, которая свидетельствует о более агрессивном поведении опухоли с аберрантной экспрессией антигена HLA II класса на RCC. Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь,могут быть использованы не только в соответствующей комбинации, как было показано, но а также и в отдельной модели без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. Далее изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры,примеры и список последовательностей. Примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не предназначены для ограничения изобретения. Последовательности SEQ ID1-49 демонстрируют пептидные последовательности Т-клеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые презентируются МНС класса II в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности SEQ ID50-SEQ ID79 демонстрируют пептидные последовательности из табл. 3. Фиг. 1 показывает экспрессию молекул HLA II класса в RCC трех пациентов. Тогда как в опухоли пациента RCC132 HLA-положительные клетки были предпочтительно локализованы в пределах (А, В),образцы экспрессии HLA II класса опухолей пациента RCC190 и RCC211, обнаруживающие более папиллярную структуру, были распространены более равномерно (C, E, G). ВизуализацияCD68-положительных макрофагов (B, D, F) в серийных тканевых срезах иллюстрирует близкую пространственную связь опухоль-инфильтрующих мононуклеарных иммунных клеток и экспрессирующихHLA II опухолевых клеток. Инкубация с мышиным IgG вместо специфических антител сообразно показала отрицательные результаты окрашивания (Н). Заглавной Т отмечена опухоль.- 17013876 На фиг. 2 представлен анализ CD4-положительных Т-клеток, специфических для IGFBP3169-181,MMP7247-262 и CCND1198-212, на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS). Представлены также репрезентативные дот-блоты внутриклеточного окрашивания IFN- против CD4-FITC. На фиг. 3 представлена схематическая иллюстрация антигенспецифических вырабатывающих IFNCD4-положительных Т-клеток, обнаруженных у каждого донора и для каждого пептида. Показано процентное выражение вырабатывающих IFN- CD4-положительных Т-клеток для каждого донора и пептида, использованного для стимуляции. Клетки культивировались в 96-луночных планшетах - 7 лунок на донора и пептид. В прямоугольниках стоят значения, рассматриваемые как положительные: процентное выражение вырабатывающих IFN- CD4-положительных Т-клеток более чем в 2 раза выше по сравнению с отрицательным контролем без пептида. Процентное выражение вырабатывающих IFNCD4-положительных Т-клеток, обнаруженных после стимуляции с нерелевантным пептидом, соотносится со значениями после стимуляции без пептида, за исключением Донора 1 после 3-й стимуляцииIGFBP3169-181. Однако этот эффект после 4-й стимуляции более не наблюдался. На фиг. 4 представлена экспрессия молекул HLA II класса в ССА 165 (умеренно дифференцированная аденокарцинома толстой кишки). На Lamina propria участков с нормальной кишечной слизистой оболочкой (секция с и левая часть секции а, отмечены звездочкой) характерно наблюдалось несколько положительных макрофагов HLA II класса, но эпителиальные клетки были стабильно отрицательны для экспрессии HLA II класса. В эпителиальных клетках различных участков опухоли, тем не менее, была замечена ясно выраженная экспрессия HLA II, как показано с правой стороны секции а и в секциях b и d. На фиг. 5 а и 5b представлена идентификация пептидной последовательности пептидов, элюированных из молекул HLA класса II, изолированных из первичной опухолевой ткани человека при массспектроскопии. Фиг. 5 а: фрагменты, полученные при фрагментации естественно процессированных и презентированных лиганд HLA II класса из ММР 7, соответствующие пептидной последовательности SEQ ID1(SQDDIKGIQKLYGKRS). Аннотированные фрагменты представлены в табл. 5. Фиг. 5b: фрагменты, полученные при фрагментации синтетического пептида, имеющего пептидную последовательность SEQ ID1. Фрагментации как синтетических, так и естественно процессируемых пептидов показывают эквивалентные фрагментационные образцы и позволяют вывести и подтвердить первичную аминокислотную последовательность не охарактеризованной прежде пептидной последовательности (SEQ ID1) этого лиганда HLA II класса человеческого ММР 7. Таблица 1 Пептидные последовательности, расположенные в соответствии с фрагментом HLA-DRB10101. Пептиды с показателями выше 19 рассматривались как связки DRB10101RCC производилась в соответствии со стандартными гистопатологическими и иммуногистологическими исследованиями (Fleming, S. and O'Donnell, М. 2000. Surgical pathology of renal epithelial neoplasms: recentadvances and current status. Histopathology, 36:195-202). Для иммуногистологического обнаружения молекул МНС класса II или молекул CD68 соответственно 5 мкм залитых парафином тканевых срезов обрабатывались предварительно 10 мМ буфера цитрата, рН 6, затем производилась инкубация либо с мышиным анти-HLA-DR mAb с альфа-цепью (клон(2 мкг/мл, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, США) и визуализировались при помощи Ventana iViewDAB detection kit (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, Франция). С тканевыми срезами было произведено контрастное окрашивание гематоксилином и, наконец, они были залиты средством Entellan. Элюирование и молекулярный анализ HLA-DR-связывающих пептидов. Замороженные пробы обрабатывались, как было описано ранее (Weinschenk, Т., Gouttefangeas, С.,Schirle, M., Obermayr, F., Walter, S., Schoor, О., Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K.H., Wernet, D.,Stevanovic S. and Rammensee H.G. 2002. Integrated functional genomics approach for the design ofpatient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827), а пептиды изолировались в соответствии со стандартными протоколами (Dengjel, J., Rammensee H.G. and Stevanovic, S. 2005. Glycan side chains onhuman В cell line. J. Immunol. 125:293-299). Естественные пептидные смеси были проанализированы обратнофазной ВЭЖХ Ultimate HPLC(Dionex, Amsterdam, Netherlands), соединенной с Q-TOF I масс-спектрометром (Waters, Eschborn,Germany) или обратнофазной системой ВЭЖХ CapLC HPLC, соединенной с Q-TOF Ultima API(Waters), как описывалось ранее (Lemmel, С., Weik, S., Eberle, U., Dengjel, J., Kratt, T., Becker, H.D.,Rammensee H.G. and Stevanovic S. 2004. Differential quantitative analysis of MHC ligands by massspectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22:450-454). Фрагментационные спектры анализировались вручную и автоматически. Анализ экспрессии генов с помощью высокоплотных олигонуклеотидных микрочипов. Изоляция РНК из опухолевых и аутологичных проб нормальной почки, а также анализ экспрессии генов с помощью олигонуклеотидных микрочипов Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix,Santa Clara, CA, США) были произведены, как описывалось ранее (Krger, Т., Schoor, О., Lemmel, С.,Kraemer, В., Reichle, С., Dengjel, J., Weinschenk, Т., Mller, M., Hennenlotter, J., Stenzl, A.,Rammensee, H.G. and Stevanovic, S. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: noveltumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Данные анализировались программой GCOS (Affymetrix). Для попарного сравнения опухолевых и аутологичных нормальных почек использовался соответствующий обычный анализ в качестве исходного. Для RCC149 и RCC211 не имелось данных анализа аутологичной нормальной почки. Поэтому суммарная здоровая почечная РНК человека была куплена (Clontech, Heidelberg, Германия) и использовалась в качестве исходных данных для этих опухолей.- 19013876 Созревание дендритных клеток (DCs).DCs были получены из крови здоровых доноров. Вкратце, МПК были изолированы с использованием стандартного градиентного центрифугирования (Lymphocyte Separation Medium, РАА LaboratoriesGmbH, Pasching, Austria) и высеивались с плотностью 710 клеток/мл в среду X-Vivo 15. После 2 ч при 37 С неадгезивные клетки были удалены, а адгезивные моноциты культивировались 6 дней в среде Х-Vivo со 100 нг/мл ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и 40 нг/мл ИЛ-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Германия). На 7-й день незрелые DCs были активированы 10 нг/мл TNF- (RD Systems, Wiesbaden, Германия) и 20 мкг/мл poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия) на 3 дня. Получение антигенспецифических CD4-положительных Т-клеток. 106 МПК на лунку были простимулированы 2105 аутологичными DCs (5 мкг/мл) с введенным импульсным методом пептидом. Клетки культивировались в 96-луночных планшетах (7 лунок на донора и пептид) в Т-клеточной среде: дополнительно RPMI 1640 в присутствии 10 нг/мл ИЛ-12 (Promocell, Heidelberg, Германия). После 3-4 дней коинкубации при 37 С добавлялась свежая среда с 80 U/мл ИЛ-2(Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, США) и 5 нг/мл ИЛ-7 (Promocell). Рестимуляции производились аутологичными МНК плюс пептид каждые 6-8 дней. Внутриклеточное окрашивание IFN-. После 3-4 циклов стимуляции МПК размораживались, промывались дважды в среде X-Vivo 15, ресуспендировались при 107 клеток/мл в Т-клеточной среде и культивировались в течение ночи. На следующий день МПК с введенным импульсным способом пептидом 5 мкг/мл инкубировались с эффекторными клетками в соотношении 1:1 в течение 6 ч. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Германия) добавлялся для заключительных 4 ч инкубации. Клетки анализировались с использованием комплекта Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) иCD4-FITC- (Immunotools), IFNPE- и антител CD8-PerCP клон SK1 (Becton Dickinson). Для отрицательного контроля были объединены клетки из семи лунок и инкубировались или с нерелевантным пептидом, или без пептида соответственно. Стимуляция ФМА/иономицин использовалась для положительного контроля. Клетки анализировались на трехцветном сортере с активацией флуоресценции FACSCalibur(Becton Dickinson). Экспрессия HLA II класса при RCC. При нормальных условиях и отсутствии воспаления молекулы HLA класса II должны экспрессироваться только клетками кроветворной системы и тимусным эпителием (Mach, В., Steimle, V.,Martinez-Soria E. and Reith W. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu.Rev.Immunol. 14:301-331). Ситуация меняется во время воспаления. Экспрессия HLA II класса может индуцироваться в большинстве видов клеток и тканей IFN- (Leib und Gut-Landmann, S.,Waldburger, J.M., Krawczyk, M., Otten, L.A., Suter, T., Fontana, A., Acha-Orbea, H. and Reith W. 2004.Mini-review: Speciicity and expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes. Eur. J. Immunol. 34:1513-1525). Так как возникновение RCC часто сопровождается воспалительными явлениямиlymphocytes compared to peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer. Br. J. Cancer 83:637-641),то, как сообщается, молекулы II класса действительно экспрессируются вблизи опухолей или самими опухолями. Иммуногистохимическое окрашивание молекул HLA II класса. Изобретатели анализировали экспрессию HLA II класса десяти проб RCC, включая гистологическую светло-клеточную и папиллярную почечную карциному, иммуногистохимическим окрашиванием и выявили, что все обследованные пробы обнаруживают положительные опухолевые клетки II класса. Как показано на примере фиг. 1 А, названная экспрессия HLA II класса часто обнаруживалась на границе опухоли. На этих участках изобретателями наблюдалась близкая пространственная взаимосвязь HLA положительных опухолевых клеток с инфильтрующими опухоль иммунными клетками, как это иллюстрирует визуализация CD68-положительных макрофагов в серийных тканевых срезах (фиг. 1 В). В RCC,обнаруживающих более папиллярную структуру, экспрессия молекул HLA II класса была распространена более равномерно по опухоли (фиг. 1 С, Е, G). Сравнение образцов HLA II класса и CD68 иммуногистохимического окрашивания в серийных тканевых срезах отчетливо демонстрирует, что, помимо макрофагов, опухолевые клетки также экспрессируют HLA II класса (фиг. 1C, D и E, F). Было показано, чтоIFNпродуцирующие CD4-положительные клетки TH1 в равной степени, как и естественные киллерные клетки (NK), инфильтрируют RCC (Cozar, J.M., Canton, J., Tallada, M., Concha, A., Cabrera, Т., Garrido, F.lymphocytes in human renal carcinomas. Cancer Immunol. Immunother). Так как положительные опухолевые клетки II класса были обнаружены преимущественно во внешних частях вырезанных опухолей, можно- 20013876 спекулировать, что лейкоциты, привлеченные опухолью, вырабатывают IFN-, который воздействует на соседние злокачественные клетки. Аномальная экспрессия молекул HLA II класса в неопластической ткани не ограничивается RCC, она может также быть обнаружена в ТСС (переходно-клеточная карцинома) и ССА (светло-клеточная аденокарцинома). На фиг. 4 представлено иммуногистохимическое окрашивание проб ткани аденокарциномы толстой кишки человека. Анализ экспрессии IFN- и транскриптов генов, индуцированных IFN-. Изобретатели исследовали также экспрессию HLA II класса с помощью сравнительного анализа генной экспрессии с использованием олигонуклеотидных микрочипов. Благодаря этой технике изобретатели были в состоянии оценить общую экспрессию HLA II класса в вырезанных опухолях независимо от типа экспрессирующих клеток. Изобретатели проанализировали дифференциальную экспрессию в четырех опухолях: RCC149, RCC180, RCC190 и RCC211 в сравнении с нормальной исходной почкой. Во всех четырех опухолях были обнаружены гиперэкспрессированные гены, кодирующие молекулы HLA II класса (табл. 2). Одной из возможных причин этого может быть индуцированная IFN- экспрессия, и по этой причине изобретатели искали другие гены, о которых известно, что они могут активироваться интерферонами (Kolchanov, N.A., Ignatieva, E.V., Ananko, E.A., Podkolodnaya, I.L. Stepanenko, T.I.Merkulova, M.A. Pozdnyakov, N.L. Podkolodny, A.N. Naumochkin О.A. and Romashchenko, A.G. 2002. Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): its status in 2002. Nucleic Acids Res. 30:312-317). Интересно то, что значительное число таких генов было обнаружено в гиперэкспрессированном состоянии в одной или более опухолевых пробах. В табл. 2 представлены интерферон-индуцируемые гены, которые были активированы достоверно во всех четырех пробах в соответствии с более ранними открытиями изобретателей (Weinschenk, Т., Gouttefangeas, С., Schirle, M., Obermayr, F., Walter, S., Schoor, О.,Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K.H., Wernet, D., Stevanovic, S. and Rammensee, H.G. 2002. Integratedfunctional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:58185827). Среди них находятся LMP2, LMP7 и MECL1 - белки, которые заменены на конститутивные субъединицы крупного протеолитического голоэнзима, находящегося в цитозоли, протеасоме, для формирования иммунопротеасомы. Замена нормально экспрессированных протеолитических субъединиц протеасомы на IFNиндуцируемые субъединицы представляет собой важнейший процесс в богатом интерфероном окружении. К тому же была произведена непосредственная оценка IFN- с помощью количественного анализа в реальном времени (RT) PCR (TaqMan). Опухоли, представленные в табл. 2, показывали в 5 и до 60 раз большую гиперэкспрессию IFN- мРНК в сравнении с аутологичными нормальными пробами РНК того же донора (данные не приводятся). Таким образом, результаты, полученные изобретателями, указывают на то, что IFN- может играть важную роль в RCC и быть причиной избыточной экспрессии II класса. Экспрессию в опухолевых пробах сравнивали с аутологичными нормальными почками (RCC180,RCC190) или объединенными здоровыми почками (RCC149, RCC211). Все гены показывали "повышение" в алгоритме "change-call" программы GCOS для всех четырех опухолей и были описаны как интерферон-индуцируемые. Лиганды HLA-DR, изолированные из раковой ткани. В соответствии с общедоступными данными пептиды, связанные молекулами HLA II класса, экспрессированные в тканях солидных опухолей, до сих пор не были изолированы и идентифицированы другими. Изобретатели проанализировали десять различных опухолей RCC (почечно-клеточная карцинома), три ССА (светло-клеточная аденокарцинома) и одну ТСС (переходно-клеточная карцинома) и были в состоянии изолировать лиганды HLA-DR из всех проб, общее количество достигает 453 пептидов(данные не приводятся). Пептидные последовательности были определены с помощью объединения хроматографической сепарации и тандемного масс-спектрометрического анализа (LC-MS/MS), как описывалось ранее (Weinschenk, Т., Gouttefangeas, С., Schirle, M., Obermayr, F., Walter, S., Schoor, O.,Kurek, R., Loeser, W., Bichler, K.H., Wernet, D., Stevanovic, S. and Rammensee, H.G. 2002. Integratedapproach. Eur. J. Immunol. 2000; 30(8):2216-25). Пример нового секвенирования пептидов на LC-MS/MS показан на фиг. 5 а и 5b. Установленные первичные аминокислотные последовательности фрагментов слияния, показанных на фиг. 5 а и 5b, включены в табл. 5. Опухолевые пробы отличались по их HLAгенотипам, весу и по общему числу идентифицированных лигандов HLA. В табл. 3 представлен репрезентативный список пептидов и соответствующих белков-источников, идентифицированных из одной отдельной пробы опухоли, RCC190. Пептиды были изолированы из молекул клеток HLA II класса, как- 22013876 было описано ранее (Dengjel, J., Decker, P., Schoor, О., Altenberend, F., Weinschenk, Т., Rammensee, H.G.combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Таблица 3 Список примеров лигандов HLA-DR, изолированных из RCC190. Представлены центральные последовательности лигандов HLA-DR,изолированных из RCC190 (HLA-DRB11, DRB115, DRB3, DRB5). Взаимосвязи между весом опухоли и числом идентифицированных лигандов HLA не было. Пептидные белки-источники можно было разделить на две группы. С одной стороны, были обнаружены лиганды, которые должны презентироваться лейкоцитами, такие как пептиды из дополняющих компонентов, например С 3, С 4 А, С 4 связывающего белка альфа и других белков, сопряженных со специфическими функциями клеток иммунной системы, например CD 14 и Fc-фрагмент IgG связывающего белка. С другой стороны, изобретатели были в состоянии раскрыть природу и характеристики неизвестных прежде пептидов, презентируемых опухолевыми клетками из гиперэкспрессированного ТАА (опухолеассоциированного антигена), например из виментина, матричной металлопротеиназы 7, эукариотического трансляционного фактора элонгации 1 альфа 1 и никотинамид N-метилтрансферазы. Это наблюдение соответствует иммуногистохимическим данным (фиг. 1 и 4) и демонстрирует, что положительные опухолевые клетки HLA II класса и инфильтрующие лейкоциты были представлены в проанализированных образцах и что элюированные пептиды происходят из антигенов, которые были обнаружены в гиперэкспрессированном состоянии в этих различных видах клеток. С целью идентификации пептидов из ТАА изобретатели сравнили белки-источники для отдельных лигандов с гиперэкспрессированными генами, обнаруженными при анализе опухолей микрочипамиtumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Изобретатели идентифицировали пептид из связывающего инсулиноподобный фактор роста белка 3, IGFBP3166-181 в RCC190. К тому же в ТСС 108 были обнаружены два варианта этого пептида: IGFBP3169-181 и IGFBP3169-184, содержащие тот же самый фрагмент центральной последовательности, который является необходимым и достаточным для осуществления связи с HLA-DRB10101 (для сравнения см. табл. 1). Из той же самой опухоли было возможно изолировать пептид из матричной металлопротеиназы 7, ММР 7247-262 (табл. 1). На уровне мРНК ММР 7 был гиперэкспрессирован в 13 и IGFBP3 в 22 из 23 проанализированных RCC (данные не приводятся). В целом из 453 пептидных последовательностей, идентифицированных первоначально (не приводятся), лежащие в основе антигены для 49 пептидов (SEQ ID1-49) были идентифицированы как опухолеассоциированные как при экспериментах изобретателей (данные не включены в этот документ), так и у других (Miyamoto, S., Yano, K., Sugimoto, S., Ishii, G., Hasebe, T., Endoh, Y.,Kodama, K., M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growthmultistage colorectal tumorigenesis and progression. World J. Gastroenterol. 11:3285-3289). Отдельный анализ иммуностимулирующего потенциала пептидов, связывающихся с распространенными аллелямиHLA-DR, обнаруживает существование антигенспецифических CD4-положительных Т-клеток кIGFBP3169-181 и ММР 7247-262. Беспорядочное связывание отдельной последовательности SEQ ID1 с различными аллелямиHLA-DR может быть обнаружено несколькими независимыми методами: лиганды определенных молекул MHC/HLA несут химически соотносимые аминокислоты в определенных позициях их первичной последовательности, которая позволяет дефиницию пептидного фрагмента для каждого аллеляby sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature. 1991; 351(6324):290-6). SYFPEITHI использует матрицы фрагментов, полученные из очищенных фрагментов, основываясь исключительно на анализе естественных лигандов с помощью метода деградации Эдмана и тандемной масс-спектрометрии. Эти матрицы позволяют прогнозирование пептидов из заданной белковой последовательности, презентированной на молекулах МНС класса I или II (Rotzschke, О., Falk, K., Stevanovic, S., Jung, G., Walden, P.,Rammensee, H.G. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur J. Immunol. 1991; 21(11):2891-4). Применяя принципы прогнозирования, сделанные по алгоритму SYFPEITHI (Rammensee, H.G.,Bachmann, J. and Stevanovic, S. 1997. МНС Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Германия; Rammensee, H., Bachmann, J., Emmerich, N.P., Bachor, O.A., Stevanovic, S. SYFPEITHI: database forMHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-9), к упомянутой ранее пептидной последовательности (SEQ ID1), был составлен рейтинг по связыванию последовательности SEQ ID1 с несколькими распространенными аллелями HLA-DR (см. табл. 7). Алгоритм успешно применялся для прогнозирования эпитопов I и II класса из различных антигенов, например из человеческого ТАА TRP2derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int J. Cancer. 2004; 112(4):661-8). Пороговое значение показателей 18 или выше для значительного связывания было определено на основе анализа показателей связывания для опубликованных ранее беспорядочно связывающихся пептидных лигандовHLA-DR. Беспорядочное связывание определяется как связывание пептида с хорошей связывающей силой, на что указывает показатель 18 или выше в тесте SYFPEITHI, с двумя или более различными распространенными аллелями HLA-DR. Наиболее распространенные аллели HLA DR приводятся в табл. 7. Локусы HLA-A и HLA-DR имеют неравномерное распределение (linkage disequilibrium), что ведет к комбинациям HLA-A2 и специфических HLA-DR, которым отдается предпочтение по сравнению с другими. Генотипы HLA-DR исходных опухолей были проанализированы и получили подтверждение какHLA-DRB111 и DRB115 в обоих случаях. Предпочтительные доменные аминокислотные остатки для наиболее распространенных аллелей HLA II класса (DRB10101, DRB10301, DRB10401, DRB10701,DRB11101 и DRB11501) представлены в табл. 4. Например, аллель DRB10301 HLA II класса предпочтительно связывает пептиды в их связывающей бороздке, которые обладают специфическими аминокислотными остатками в позициях 1, 4, 6, и 9 от N- до С-терминального конца центральной последовательности любого данного пептида. DRB10301 показывает особенно хорошее связывание, если центральная последовательность пептида имеет остаток глютамата (D) на позиции 4, так же как и L, I, F, М или V на позиции 1, так же как K, R, E, Q или N на позиции 6, так же как и Y, L или F на позиции 9. Таблица 4 Пептидные фрагменты распространенных аллелей HLA-DR. Доменные аминокислоты обозначены буквенным кодом на соответствующих связывающих карманах.- 26013876 Результаты анализа in silico, основанного на компьютерном алгоритме для прогнозирования взаимодействия между молекулами HLA и пептидными последовательностями, представленном на сайтеwww.syfpeithi.de, указывают на то, что пептид ММР 7247-262 SEQ ID1 беспорядочно связывается с несколькими аллелями HLA-DR. В соответствии с результатами прогнозирования пептид с последовательностью SEQ ID1 получает высокий показатель связывания для взаимодействия с DRB11101,DRB11501, DRB10401, DRB10301 и DRB10101 (табл. 7). Аллели HLA-DR, проанализированные в этом тесте на взаимосвязь аминокислотной последовательности пептида и силы связывания, покрывают по крайней мере 69,6% HLA-А 2-положительного населения европеоидной расы (Mori, М., Beatty, P.G.,Graves, M., Boucher, K.M., Milford, E.L. HLA gene and haplotype frequencies in the North Americanpopulation: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997; 64(7): 1017-27). Так как в настоящий момент не доступны данные по частотности HLA-DR15, этот аллель не рассматривался для расчета результатов конечного покрытия HLA-А 2-положительного европеоидного населения. Таким образом, велика вероятность того, что покрытие населения SEQ ID1 даже выше чем 69,6%, что указывает на то, что пептид обладает превосходной перспективой для того, чтобы служить кандидатом для разработки фармацевтических препаратов для большинства раковых пациентов. Тем не менее, применение алгоритмов прогнозирования ведет только тогда к убедительным результатам, когда результаты анализов in silico комбинируются с экспериментальным подтверждением беспорядочного связывания, как было показано ранее в других работах, где не удалось продемонстрировать иммунные ответы, вызываемые пептидными последовательностями, которые по прогнозам должны были иметь хорошую связующую силу (Bohm, C.M., Hanski, M.L., Stefanovic, S., Rammensee, H.G., Stein, H.,Taylor-Papadimitriou, J., Riecken, E.O., Hanski, С. Identification of HLA-A2-restricted epitopes of thetumor-associated antigen MUC2 recognized by human cytotoxic T-cells. Int J. Cancer. 1998; 75(5):688-93). Прогнозирование артефактов, как в рассмотренном выше случае, в принципе, не может быть исключено,так как используемые для прогнозирования алгоритмы не учитывают того, что пептидная последовательность не обязательно генерирована в условиях in vivo (внутри живых клеток). Экспериментальное подтверждение может быть получено при сборе данных in vitro из биологического теста, например, при демонстрации присутствия или недостатка иммуногенности пептида. Следовательно, экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания SEQ ID1 было получено сбором таких данных in vitro. Для проверки пептидов на их иммуностимулирующую способность с помощью экспериментов in vitro по Т-клеточному праймингу использовались наиболее короткие варианты ("коровая последовательность") пептидов IGFBP3, IGFBP3169-181 и пептидов ММР 7, ММР 7247-262. Для генерации антигенспецифических CD4-положительных Т-клеток и для проверки пептидов на беспорядочное связывание МПК 4 здоровых доноров с разными аллелями HLA-DR (фиг. 2), один сDRB11101, были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом. К тому же пептид CCND1198-212, известный Т-клеточный эпитопtargeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), использовался в качестве положительного контроля. Для системы обработки данных для генерирования антигенспецифическихCD4-положительных Т-клеток уровни IFN- были оценены проточной цитометрией. Т-клетки были проанализированы после третьей и четвертой еженедельной стимуляции внутриклеточным окрашиваниемIFN- плюс окрашивание CD4-FITC и CD8-PerCP для определения процентного выраженияIFNпродуцирующих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. Во всех экспериментах стимуляции с нерелевантным пептидом и без пептида производились в качестве отрицательного контроля. IFNответ рассматривался как положительный, если процентное отношение IFNпродуцирующихCD4-положительных Т-клеток было более чем в 2 раза выше в сравнении с отрицательным контролем(Horton, H., Russell, N., Moore, E., Frank, I., Baydo, R., Havenar-Daughton, С., Lee, D., Deers, M.,Hudgens, M., Weinhold, K. and Mc Elrath, M.J. 2004. Correlation between interferon-gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696). Изобретателям удалось генерировать в трех из четырех доноров специфическиеCD4-положительные Т-клетки для обоих пептидов (фиг. 2). Ни одна стимуляция не привела к Т-клеточным ответам у донора 4. У донора 1 было обнаружено от 0,05 до 0,1% (фиг. 3)IFNпродуцирующих CD4-положительных Т-клеток при всех семи попытках стимуляции после третьей стимуляции пептидом IGFBP3169-181. Число этих Т-клеток может быть увеличено в большинстве случаев при дополнительном цикле стимуляции до 0,09-0,13%. IFNпродуцирующие CD4-положительные Т-клетки, специфические для пептида IGFBP3169-181, наблюдались также у доноров 2 и донора 3 с максимальной частотностью в 0,05 и 0,07% IFNпродуцирующих CD4+ Т-клеток. Доноры 1, 2 и 3 также имели CD4+ Т-клетки, реагирующие на пептид ММР 7247-262. Наиболее высокие частотности IFNпродуцирующих CD4+ Т-клеток, специфических для пептида ММР 7, были обнаружены у доноров 1 и 2 соответственно. Доноры 1, 2 и 3 имели IFNответы на пептид CCND1198-212,который уже описывался как рестриктированный по МНС II класса Т-клеточный эпитоп (Dengjel, J.,- 27013876targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Таким образом, пептиды из IGFBP3, ММР 7 и CCND1 беспорядочно связываются с HLA II класса и в состоянии вызывать CD4-положительные Т-клеточные ответы у трех из четырех здоровых доноров,имеющих разные аллели HLA DR. Если аллели HLA двух опухолевых пациентов, от которых были получены пептиды IGFBP3 и ММР 7, сравниваются с аллелями четырех здоровых доноров, то становится очевидным, что пептиды презентируются HLA-DRB101, HLA-DRB104 и HLA-DRB111. Все три ранее названных аллотипа HLA DR имеют аминокислотный остаток глицина на позиции 86 и остаток аспарагиновой кислоты на позиции 57 их -цепей соответственно (см. www.anthonynolan.com/HIG). Поэтому они имеют очень похожие характеристики связывания для их связывающих карманов P1 и Р 9a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:36443651), все остается в силе. Донор 4 имеет HLA-DRB10318 и HLA-DRB11401, аллели с пептидными фрагментами, которые отличаются первичной аминокислотной последовательностью их бета-цепей от тех, что были описаны выше. Это может объяснить, почему было невозможно вызвать Т-клеточные ответы против двух пептидов, используя клетки этого донора. Интересно, что IFNпродуцирующие CD8-положительные киллерные Т-клетки были обнаружены у двух доноров после стимуляций с тремя пептидами, в особенности у донора 3, но и также в меньшей мере у донора 1 (данные не приводятся). Таблица 5 Таблица 6 Частота встречаемости гаплотипа Северно-американского европеоидного населенияSYFPEITHI для наиболее распространенных аллелей HLA-DRB1 среди европеоидного населения. Частота встречаемости соответствующих серологических гаплотипов HLA-А 2-положительных европеоидов дана в скобках. Пептиды рассматриваются как связывающиеся достаточно хорошо с молекулами HLA II класса, если показатель равен или выше 18. Таблица 7 Показатели связывания SEQ ID1 с распространенными аллелями HLA-DR