Способ повышения экспрессии опухолевого антигена с применением тималфазина

006599 По данной заявке испрашивается приоритет по ранее поданной заявке 60/391969 от 28 июня 2002 г. Область техники Настоящее изобретение относится к области диагностики и терапии рака, а также к использованию тималфазина (тимозина -1) в диагностике и лечении рака. Уровень техники Разработка вакцин от рака, методов иммунной визуализации и доставки лекарственных средств базируется на идентификации специфических молекулярных мишеней (например, опухолевых антигенов),которые расположены на мембране опухолевой клетки и, по существу, представлены молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 (ГКГ-1). Идентификация антигена по-прежнему является центральной проблемой в иммунотерапии опухолей, в частности, в разработке вакцины от рака. Несмотря на то, что идентифицировано большое количество опухолеспецифических антигенов, низкий уровень экспрессии данных антигенов и/или их непостоянное представление молекулами ГКГ-1 затрудняют развитие иммунотерапии и методов иммунодиагностики, достаточно специфичных и чувствительных для того, чтобы обнаружить присутствие раковых клеток и уничтожить их. Повышенная чувствительность для выявления опухолевых антигенов позволяет диагностировать заболевание и проводить лечение на ранних стадиях при наличии меньшего количества опухолевых клеток, а также проводить более интенсивную терапию при метастазировании. Ранее было показано, что опухолеспецифический антиген (ОСА) экспрессируется как в опухолях человека, так и в экспериментальных опухолях и имеет консервативную последовательность. В связи с этим ОСА является хорошей мишенью для иммунодиагностических и иммунотерапевтических методов,однако, уровень экспрессии ОСА, как и большинства молекулярных мишеней опухолей, ниже уровня,необходимого для подобных целей. Тимозин -1, или тималфазин, является пептидом, состоящим из 28 аминокислотных остатков, который в норме обнаруживается в циркулирующей крови. Тималфазин стимулирует рост и дифференциацию тимоцитов, образование ИЛ-2, Т-клеточных ИЛ-2-рецепторов, ИТФ и ИТФ. Baxevanis, 1990; Bepler, 1994; Serrate, 1987; Stzein, 1989. Также было показано, что тимозин -1 повышает экспрессию ГКГ класса I. Giuliani, 2000. Тималфазин исследовали в качестве терапевтического средства для лечения различных заболеваний, в том числе хронических гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД), подавленного ответа на вакцинацию и рака. Andreone, 1996; Garaci, 1998, 2000;Gravenstein, 1986; Mutchnick, 1999; Sherman, 1998. Краткое описание изобретения Было обнаружено, что тималфазин способен усиливать экспрессию ОСА на клетках колоректального рака как in vitro, так и in vivo. Такая повышенная экспрессия ОСА позволяет усовершенствовать разнообразные диагностические и терапевтические методы за счет повышенной направленности на раковые клетки, например методы радиоиммунохирургии или иммуносцинтиграфические методы. Возможность повышения экспрессии опухолевого антигена при нетоксичном лечении, например, тималфазином, могло бы быть весьма полезным как для терапевтических, так и для диагностических целей, поскольку позволило бы осуществлять более раннее выявление и лечение раковых заболеваний, а также проводить более интенсивное и полное лечение поздних стадий рака, особенно метастатических раков. Краткое описание фигур Фиг. 1 - ОСА экспрессируется на мембране клеток колоректального рака линии DHD-K12; фиг. 2 - экспрессия ОСА на поверхности клеток колоректального рака линии WiDr увеличивается в результате обработки тималфазином; фиг. 3 - экспрессия ОСА на опухолевых клетках асцитов увеличивается в результате обработки животных тималфазином. Подробное описание Экспрессию ОСА антигена можно увеличивать путем обработки тималфазином. Повышенная экспрессия могла бы привести к более эффективным CTL ответам в результате индукции специфической популяции CD8. Кроме того, такая повышенная экспрессия могла бы способствовать лучшему обнаружению клеток и нацеливанию на них при проведении иммуноориентированной радиотерапии или иммуно-сцинтиграфических методов. Более того, наличие экспериментальной опухоли, для которой свойственно экспрессировать человеческий антиген, могло бы иметь широкое применение в разработке предклинических моделей. Усиление экспрессии опухолевого антигена методами настоящего изобретения повышает чувствительность как диагностических, так и иммунотерапевтических методов, что, в свою очередь, делает возможным более раннее обнаружение и лечение раковых заболеваний, а также проведение более интенсивного и полного лечения поздних стадий рака, включая метастатические раковые заболевания. Определение дозы пептида тималфазина, необходимое для повышения экспрессии ОСА, можно установить экспериментальным путем с помощью обычных методов титрования. Повышение регуляции ОСА может быть достигнуто in vivo при введении тималфазина в дозе от 2 мкг/кг до 6 мг/кг массы тела,-1 006599 предпочтительно от 20 до 200 мкг/кг. Установлено, что тималфазин безопасен при введении в таких высоких дозах, как 16 мг/дозу/сутки для людей и 6 мг/кг/сутки для крыс. Тималфазин можно вводить одним из известных способов, например путем инъекций или вливаний внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или непосредственно в окружающую опухоль область. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пептид тималфазин представлен в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекций, физиологический раствор или другой подобный растворитель. Период полувыведения из плазмы введенного подкожно тималфазина составляет всего около 2 ч. Rost и др., 1998. Однако конъюгация полимера с пептидом тималфазином существенно увеличивает период его полувыведения из плазмы. Rasi и др. (неопубликованные результаты). При использовании в контексте конъюгированного тималфазина, указанные выше дозировки отражают только представленный в композиции пептид тималфазин без учета веса конъюгированного с ним полимера. Выделение, характеристика и использование тималфазин-пептидов описывается, например, в патентах US 4079127, US 4353821, US 4148788 и US 4116951. В настоящем изобретении могут быть использованы такие тималфазин-пептиды, как природный тималфазин, синтетический тималфазин и рекомбинантный тималфазин, имеющие аминокислотную последовательность природного тималфазина,аминокислотные последовательности в значительной степени близкие природному тималфазину, или форму укороченной последовательности; также в настоящем изобретении могут использоваться биологически активные аналоги, в состав которых входят модифицированные последовательности (замещения,делеции, элонгации, замены и др.), обладающие биологической активностью, в значительной степени близкой активности тималфазина, например тималфазин-пептид, чья аминокислотная последовательность имеет достаточную гомологию аминокислотной последовательности тималфазина, что позволяет ему функционировать, по существу, тем же способом, что и тималфазин, и с той же активностью. Пример 1 (in vitro). Клеточные линии колоректального рака WiDr (человека), lA-XsSBR (крысы) и DHD-K12 (крысы) обрабатывают тималфазином в концентрации 5-100 мкг/мл в течение 6-48 ч. Экспрессию антигена ОСА определяют посредством проточной цитометрии (ПЦ) и локализацию антигена - посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), используя ОСА-антисыворотку, полученную против белкового эпитопа ОСА (CSH-275), состоящего из 9 аминокислот. ОСА естественным образом экспрессируется во всех трех клеточных линиях колоректального рака,как в цитоплазме, колеблясь в пределах 30-55% клеток (при использовании ПЦ и КЛСМ после повышения проницаемости), так и на клеточной мембране, колеблясь в пределах 10-20% клеток (методом ПЦ). Фиг. 1. Тималфазин может увеличивать экспрессию данного антигена во всех исследованных клеточных линиях. Фиг. 2. Уровень повышения экспрессии и локализация на мембране в сравнении с цитоплазмой варьирует в зависимости от дозировки и времени обработки и может достигать уровней экспрессии 90% клеток. Пример 2 (in vivo). Крысам линии BD-IX вводят внутрибрюшинно изогенные клетки DHD-K12 и обрабатывают тималфазином внутрибрюшинно или подкожно. Экспрессию и локализацию ОСА определяют, как описано выше, на опухолевых клетках, полученных как от асцитов, так и от опухолевых образований. Опухолевые клетки животных, обработанных тималфазином, показывают увеличение экспрессии ОСА подобное таковому, наблюдаемому in vitro. Фиг. 3. БиблиографияSztein M. and Serrate S. "Characterization of the immunoregulatory properties of thymosin alpha 1 on interleukin-2 production and interleukin-2 receptor expression in normal human lymphocytes", Int. J. Immunopharmacol. 11, 1989, cc. 789-800. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ повышения экспрессии опухолевого антигена, включающий обработку опухолевых клеток тималфазином в количестве, достаточном для повышения экспрессии опухолевого антигена по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток. 2. Способ по п.1, в котором введение проводят больному in vivo. 3. Способ по п.2, в котором тималфазин вводят в дозе от 2 мкг/кг веса тела до 6 мг/кг массы тела. 4. Способ по п.3, в котором тималфазин вводят в дозе от 20 до 200 мкг/кг массы тела. 5. Способ по п.1, в котором указанным опухолевым антигеном является ОСА. 6. Способ повышения чувствительности иммунодиагностического или иммунотерапевтического способа, включающий предварительную обработку опухолевых клеток-мишеней посредством введения в клетки тималфазина в количестве, достаточном для повышения экспрессии опухолевого антигена по сравнению с таковой у необработанных опухолевых клеток, с последующим использованием иммунодиагностического или иммунотерапевтического метода. 7. Способ по п.6, в котором введение проводят больному in vivo. 8. Способ по п.7, в котором тималфазин вводят в дозе от 2 мкг/кг массы тела до 6 мг/кг массы тела. 9. Способ по п.8, в котором тималфазин вводят в дозе от 20 до 200 мкг/кг веса тела. 10. Способ по п.1, в котором введение проводят в клетки in vitro. 11. Способ по п.6, в котором введение проводят в клетки in vitro.