Новый карбамилированный еро и способ его получения
Номер патента: 11586
Опубликовано: 28.04.2009
Авторы: Мунк Мортен, Фольдагер Ларс, Вальбьерн Йеспер, Кристенсен Серен, Туэсен Марианне Халберг, Педерсен Андерс Ельхольт
Формула / Реферат
1. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ESI-масс-спектрометрией, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина.
2. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.
3. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30% агрегированного белка.
4. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20% агрегированного белка.
5. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10% агрегированного белка.
6. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
7. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
8. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мac.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
9. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
10. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
11. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
12. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл.
13. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл.
14. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M.
15. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M.
16. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60шС.
17. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34шC.
18. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11.
19. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10.
20. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
21. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
22. Способ по п.1, где белок эритропоэтина взаимодействует с цианатом в присутствии буферного раствора.
23. Способ по п.22, где буферным раствором является борат.
24. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M.
25. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,1 приблизительно до 1M.
26. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно 0,5M.
27. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M, температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60шС, рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11, а время составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до тридцати суток.
28. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M, температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34шC, рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10, а время составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
29. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно 0,5M, температура составляет приблизительно 32шC, рН составляет приблизительно 9, а период времени составляет приблизительно 24 ч.
30. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 3% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ESI-масс-спектрометрией, включающий в себя очистку карбамилированного эритропоэтина с применением анионообменной, катионообменной, гидрофобной хроматографии, хроматографии с обращенными фазами, аффинной хроматографии или хроматографии с исключением по размеру.
31. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.
32. Способ по п.30, где по меньшей мере 90% аминовых остатков на лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина карбамилированы.
33. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 2,5% агрегированного белка.
34. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет приблизительно 0,5% или менее агрегированного белка.
35. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
36. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
37. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
38. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
39. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
40. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
41. Способ получения белка карбамилированного эритропоэтина с менее чем приблизительно 3% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ESI-масс-спектрометрией, при этом способ включает в себя:
(a) взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминовых остатков на лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина; и
(b) очистку белка карбамилированного эритропоэтина с применением анионообменной, катионообменной, гидрофобной хроматографии, хроматографии с обращенными фазами, аффинной хроматографии или размерно-эксклюзионной хроматографии.
42. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.
43. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 2,5% агрегированного белка.
44. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет приблизительно 0,5% или менее агрегированного белка.
45. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
46. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
47. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточню ш недостаточно карбамилированного белка.
48. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
49. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
50. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
51. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл.
52. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл.
53. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл.
54. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M.
55. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M.
56. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно 0,5M.
57. Способ по п.41, где температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60шС.
58. Способ по п.41, где температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34шC.
59. Способ по п.41, где температура составляет приблизительно 32шC.
60. Способ по п.41, где рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11.
61. Способ по п.41, где рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10.
62. Способ по п.41, где рН составляет приблизительно 9.
63. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
64. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
65. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно 24 ч.
66. Способ по п.41, где белок эритропоэтина взаимодействует с цианатом в присутствии буферного раствора.
67. Способ по п.66, где буферным раствором является борат.
68. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M.
69. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,1 приблизительно до 1M.
70. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно 0,5M.
71. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M, температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60шС, рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11, а время составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
72. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M, температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34шC, рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10, а время составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
73. Способ по п.34, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно 0,5M, температура составляет приблизительно 32шC, рН составляет приблизительно 9, а период времени составляет приблизительно 24 ч.
74. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимыми для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина, причем эритропоэтин взаимодействует с цианатом в присутствии бората калия.
75. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре от 30 до 34шC, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина.
76. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и N-концевой аминокислоте эритропоэтина, причем карбамилированный белок эритропоэтина очищается с применением анионообменной хроматографии при поддержании рН 8,5+0,2 как разделяющего, так и элюирующего буферов.
Текст
011586 Введение Настоящее изобретение относится к новому соединению, а также способу получения указанного соединения. Представляющее собой карбамилированный эритропоэтин (СЕРО) новое соединение карбамилировано по всем или большинству первичных аминов лизинов и по N-концевой аминокислоте молекулы, и, кроме того, данное соединение имеет низкий уровень карбамилирования первичных аминов других аминокислот в молекуле. Кроме того, данное новое соединение свободно от агрегированных белков и полимеров и приемлемо для применения в фармацевтических композициях для лечения заболеваний, например, центральной и периферической нервной системы и других тканей, экспрессирующих центральный рецептор EPO. Одним дополнительным неожиданным преимуществом данного способа получения является тот факт, что способ предоставляет продукт, содержащий меньшее количество агрегированного белка и меньшее количество полимеров, чем продукты, получаемые другими описанными для эритропоэтина известными способами карбамилирования. Предпосылки изобретения(2000) Blood Purif.; 18: 13-17 показали снижение биологической гематопоэтической активности карбамилированным EPO. Brines et al. 2003, патентная заявка США 20030072737 показали, что потеря гематопоэтической активности не препятствует тканевым защитным свойствам EPO. Карбамилирование белков широко известно как побочный эффект применения мочевины в очистке белков и как результат высокого уровня мочевины в сыворотке. Карбамилирование вызвано спонтанным разложением мочевины до цианата. Цианат отвечает за карбамилирование первичных аминов белка в Nконцевой области и подверженных карбамилированию лизинах белка (фиг. 1). Кроме того, другие возможные подверженные карбамилированию аминокислотные остатки представляют собой аргинин, цистеин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовую кислоту и гистидин, однако реакция зависит от рН и не протекает так быстро, как с N-концевым остатком и остатком лизина.Hrkk S. et al. (1992) Kidney International.; 41: 1175-1181, Plapp, В.V. et al. (1971) Jour. Biol. Chem.; 246(4): 939-945, Satake, R. et al. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 и Mun, K-C. and Golper, T.А. (2000) Blood Purif.; 18: 13-17 провели исследования для того, чтобы выяснить, способно ли карбамилирование белков улучшать или ухудшать биологическую активность белков. Они исследовали биологическое действие карбамилирования белков, используя KCNO в качестве источника цианата. В результате повышенного карбамилирования все они наблюдали снижение или изменение биологической активности. Оценка степени карбамилирования основана на двух аналитических способах: 1. Измерение снижения свободных аминогрупп с применением анализа с тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS) и 2. Аминокислотный анализ, определяющий преобразованные в остатки гомоцитруллина лизины.Hrkk S. et al. (1992) выполняли карбамилирование липопротеина низкой плотности максимум в течение 6 ч при 37C 2M KCNO, но не получали полностью карбамилированный белок, применяя анализ сPlapp, В. V. et al. (1971) изучали действие времени и получили почти полностью карбамилированную бычью панкреатическую дезоксирибонуклеазу А после 24-часовой обработки 1M KCNO при 37C.Mun, K-C. and Golper, T.А. (2000) изучали зависимость от времени с максимальным временем реакции 6 ч с применением 2M KCNO. Они также изучали действие повышения концентрации KCNO в течение 6 ч, все реакции проводили при 37C. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что карбамилирование EPO приводит к образованию полимеров и агрегатов, делая его, таким образом, биофармацевтически непригодным. Кроме того, авторы обнаружили, что образование таких полимеров и агрегатов зависит от условий процесса карбамилирования. Следовательно, необходима разработка процесса с оптимальными параметрами, рассматривая рН, время, концентрацию цианата, температуру, белковую концентрацию и наиболее важный параметр степень полимеризации белка. Настоящее изобретение включает в себя оптимальный процесс карбамилирования с образованием продукта с низкой степенью полимеризации и агрегации, и, кроме того, неожиданно авторы изобретения обнаружили, что получен полностью карбамилированный EPO, имея в виду N-концевую аминокислоту и все остатки лизина (последнее происходит в указанном диапазоне рН). Для удаления образовавшихся агрегатов и полимеров выполняли последующую стадию способа по изобретению. Полученный карбамилированный чистый EPO представляет собой новое соединение и в настоящей заявке заявлен как таковое, наряду с содержащими данное соединение фармацевтическими композициями. Ранее проиллюстрировано, что степень карбамилирования зависит от концентрации цианата и времени. Однако не описано, как проводить процесс изменяемого карбамилирования для производства биофармацевтического продукта. Присутствие агрегатов при недостаточно оптимальном получении связано с индукцией антител. И,следовательно, присутствие агрегатов приводит к неприемлемому для применения у людей биофармацевтическому продукту. Описанный в настоящем изобретении способ карбамилирования и очистки приводит к получению-1 011586 белка, характеризуемого как полностью карбамилированный с наименьшей из возможного степенью образования полимеров или агрегатов и с минимальной потерей конечного продукта, что делает его, таким образом, экономически целесообразной стадией. Кроме того, получение карбамилированного белка предоставляет биофармацевтически приемлемый продукт с исключительно минимальным риском развития иммунологической реакции к белку из-за агрегатов и полимеров. Кроме аминокислотного анализа, аналитические способы оценки полного карбамилирования представляют собой измерение свободных первичных аминогрупп с применением TNBS и, наконец, определение продукта и расщепленного MALDI-TOF продукта. Для получения фармацевтических композиций для лечения чувствительных к нейропротективному действию нативного эритропоэтина заболеваний можно применять новое соединение по изобретению,представляющее собой эритропоэтин, полностью карбамилированный по свободным аминогруппам наN-концевой аминокислоте и лизинах молекулы, и, кроме того, не агрегированный и не полимеризованный в объеме свыше 2,5%, и содержащий минимальное количество избыточно или недостаточно карбамилированного эритропоэтина. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к масштабируемому способу карбамилирования белка для получения биофармацевтических продуктов. Кроме того, изобретение относится к продукту, полученному указанным способом, к содержащим соединение фармацевтическим композициям и к применению данных композиций. Описанный в настоящей заявке способ карбамилирования и очистки приводит к получению белка,характеризуемого как полностью карбамилированный с наименьшей из возможного степенью образования полимеров или агрегатов и с минимальной потерей конечного продукта. Способ карбамилирования оптимизировали к получению карбамилированного белка с наименьшим количеством полимера или агрегатов, что делает его экономически целесообразным способом. Кроме того, конечный продукт содержит ограниченные количества изоформ избыточно и/или недостаточно карбамилированного эритропоэтина (менее или более 9 карбамилирований на молекулу). Недостаточно карбамилированный EPO содержит менее 9 карбамильных остатков, т.е. карбамилированы не все из 8 лизинов и N-концевая аминокислота. Недостаточно карбамилированный EPO может иметь, например,около 5 карбамильных остатков и, тем не менее, не обладать классической активностью эритропоэтина,делая его приемлемым для применения по настоящему изобретению. Избыточно карбамилированныйEPO имеет более 9 карбамильных остатков и карбамилирован по аминокислотам, отличным от восьми лизиновых остатков и N-концевой аминокислоты. СЕРО может иметь также и 15 карбамильных остатков и, тем не менее, обладать желаемым действием, т.е., отсутствием классической активности эритропоэтина. По меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно 95% изоформ СЕРО карбамилированы только по 8 лизиновым остаткам и N-концевому остатку. Кроме того, получение карбамилированного белка удаляет агрегированный и полимеризованный продукт до максимального уровня 3 или 2,5% и, таким образом, предоставляет биофармацевтически приемлемый продукт с исключительно минимальным риском развития иммунологической реакции к белку из-за агрегатов и полимеров. Кроме аминокислотного анализа аналитические способы оценки карбамилирования представляют собой измерение свободных первичных аминогрупп с TNBS и определение продукта и расщепленногоMALDI-TOF и ЖХ-МС/МС продукта. Подробное описание изобретения Способы получения Способ карбамилирования белков состоит из 6 стадий: 1. Концентрирование ультрафильтрацией 2. Модифицирование карбамилированием. 3. Обессоливание гель-фильтрацией 4. Очистка анионообменом. 5. Концентрирование и замена буфера ультра- и диафильтрацией. 6. Фильтрация через фильтр с размером пор 0,22 мкм По данному способу карбамилирования исходным веществом является эффективно очищенный человеческий EPO, но может являться любая форма EPO животного или человеческого типа, в качестве не ограничивающего примера EPO представляет собой синтетический, рекомбинантный человеческий EPO или биологически, или химически модифицированный человеческий EPO, как, например, асиало-ЕРО,мутанты человеческого EPO, т.е. молекула с включенными в аминокислотную последовательность заменами, фрагменты EPO, пептиды EPO, другие белки или смесь белков, если желательно карбамилирование нескольких белков. Первая стадия способа включает в себя подбор концентрации белка ультрафильтрацией, где концентрацию белка подбирают с целью поддержания низкого объема в ходе производства. По предпочтительному варианту осуществления концентрация белка составляет от 0,05-10 или 0,05-8 мг/мл. Более-2 011586 предпочтительным вариантом осуществления является 0,05-7 мг/мл, а наиболее предпочтительны 2-5 мг/мл. Агрегаты формируются в большей степени, если концентрация увеличена. Ультрафильтрацию выполняют посредством BioMax (Millipore) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. Можно применять другие фильтры. Кроме того, посредством добавления стабилизаторов можно подобрать растворимость белка. После завершения стадии концентрирования белковый раствор смешивают с К-борат тетрагидратом, К-цианатом с рН 7-11 или рН 7-10. По предпочтительному варианту осуществления рН равно 8-10, а наиболее предпочтительно 9,0. Диапазоны температур от 0-60 С или 0 -50 С или от до 40 С или от 0 до менее чем 37C, но предпочтительный вариант осуществления представляет собой температурный интервал 30-34C, предпочтительно 32C, в течение временного интервала 10 мин - 30 суток или 30 мин 30 суток или 1 ч - 30 суток или 1 ч - 20 суток или 1 ч - 10 суток или 1 ч - 5 суток или 1 ч -2 суток или 1-26 ч или 18-26 ч или предпочтительно 22-26 ч, наиболее предпочтительно 24 ч. Однако данные предпочтительные интервалы можно менять, если меняют другие параметры процесса, т.е. температуру, концентрацию цианата и концентрацию белка. При понижении температуры ниже предельной выход низок из-за медленного и неэффективного карбамилирования. При превышении температурных пределов выход низок из-за повышенной агрегации. Еще один критический параметр представляет собой время, так как карбамилирование не будет завершенным, если время укорочено или наблюдают формирование агрегатов, если время увеличено, следовательно, приводя к более низкому выходу. Следовательно, представляют процесс с согласованными параметрами, т.е., сниженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством увеличения концентрации цианата и/или времени реакции, если температура понижена. Кроме того, если снижено время реакции, пониженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством повышения температуры и/или концентрации цианата. Наконец, в способе со сниженной концентрацией цианата, пониженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством повышения времени реакции и/или температуры. Следовательно, в заключение необходимо отметить, что одно значимое изменение одного критического параметра (время, температура, концентрация цианата и белковая концентрация) предполагает изменение одного или нескольких из оставшихся критических параметров для того, чтобы получить полностью карбамилированную молекулу с низким образованием агрегатов и полимеров. Концентрация боратного буфера может составлять 0,05-2M, но в предпочтительном варианте осуществления 0,1-1M, а наиболее предпочтительно 0,5M из-за существенного гидролиза и полимеризации цианата при поглощении протонов и потери буферной емкости, что приводит к сдвигу рН раствора. Кроме того, концентрация цианата предпочтительно находится в интервале 0,05-10M, или 0,05-8M,или 0,05-6M, или 0,05-4M, или 0,05-2M, предпочтительным вариантом осуществления является 0,05-1M,а наиболее предпочтительно 0,5M. Для контроля сдвига рН, вызванного протонным поглощением используемой 0,5M концентрации цианата, необходима 0,5M концентрация боратного буфера. Можно использовать способ с применением других солей цианата и бората. Кроме того, можно применять другие реакционные буферные растворы помимо боратного, например карбонатный буфер или фосфатный буфер. Обессоливание реакционной смеси белка и цианата выполняют хроматографической гельфильтрацией. Применяют матрицу G-25 Fine (Amersham Biosciences). Время выдержки до нанесения образца на колонку контролируют, и оно не должно превышать 2 ч, поскольку это может вызвать дополнительное карбамилирование и образование полимера. Обессоливание и замену буфера белков можно выполнять диализом, диа-ультрафильтрацией или хроматографической гель-фильтрацией. Можно применять другие матрицы гель-фильтрации, такие как например, матрицы сшитых полисахаридов или сшитых смешанных полисахаридов, полиакриламид, полистирол или матрицы керамической природы. Кроме того, на этой стадии можно менять высоту колонки. Для получения продукта с менее 40% агрегатов и полимеров или менее 30%, или менее 25%, или менее 20%, или менее 15%, или менее 12,5%, или менее 10%, или менее 8%, или менее 7% можно стандартизировать стадию карбамилирования. Удаление агрегатов и полимеров выполняют посредством стадии очистки с применением анионного обмена. Отмечают, что можно отделить карбамилированный EPO от остатков исходного вещества и от агрегатов/полимеров. Разделяющий буфер А представляет собой: 0,3% Трис (25 мМ), 0,3% (50 мМ)NaCl, рН 8,50,2, и элюирующий буфер В: 0,3% Трис (25 мМ), 5,8% (1M) NaCl, рН 8,50,2. Градиент выполняют с 0-30% более 20 объемов колонки, приводя к желательному разделению. Стадия очистки может приводить к получению продукта с менее 3% агрегатов и полимеров или менее 2,5%, или менее 2%, или менее 1,5%, или менее 1%, или менее чем приблизительно 0,5%. Элюирование и сбор, и объединение пика карбамилированного EPO влияет на распределение неоднородности, т.е. изоформ, элюированного белка. Другими словами, количества избыточно и недостаточно карбамилированного СЕРО варьируют в зависимости от способа сбора и объединения. Точное объединение приводит к снижению содержания избыточно и/или недостаточно карбамилированного эритропоэтина. Увеличение интервала градиента обеспечит выделение более определенного продукта посред-3 011586 ством исключения других продуктов. Композиция карбамилированного EPO с менее чем приблизительно 40 мас.% определенных ESIмасс-спектрометрией избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ представляет собой один вариант осуществления изобретения. Более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 35 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 25 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 15 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-массспектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 5 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенныхESI-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 2 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Наиболее предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 1 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ESI-масс-спектрометрией. Кроме того, влияние суммарного содержания изоформ, сбор и объединение пика карбамилированного EPO оказывает влияние на распределение избыточно карбамилированного СЕРО. Предпочтительно, чтобы количество определенных ESI-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 35 мас.%. Еще более предпочтительно,чтобы количество определенных ESI-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 30 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ESI-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 25 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ESI-массспектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 20 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ESI-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 15 мас.%. Наиболее предпочтительно количество избыточно карбамилированного EPO должно составлять не более чем приблизительно 10%, приблизительно 5% или приблизительно 1 мас.% от суммарного СЕРО. Можно применять другие разделяющие и элюирующие буферы, а также другие анионообменные матрицы. В качестве не ограничивающего примера матрицы представляют собой сшитые полисахариды или сшитые смешанные полисахариды, полиакриламид, полистирол или матрицы керамической природы. Кроме того, для очистки можно равнозначно применять катионообменную, гидрофобную хроматографию, хроматографию с обращенными фазами, аффинную хроматографию и хроматографию с исключением по размеру. В следующей стадии для подбора концентрации и буфера диа/ультрафильтрацией применяют установку с проточной фильтрацией вдоль потока. Концентрацию карбамилированного EPO корректируют до 0,5 мг/мл и меняют буфер на буферный раствор с 20 мМ цитрата, 100 мМ NaCl. Концентрирование и замену буфера выполняют посредством BioMax (Millipore) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. Можно применять другие фильтры. Наконец, для исключения роста патогенной среды очищенное биофармацевтическое лекарственное вещество фильтруют через фильт с размером пор 0,22 мкм с применением Millipak (Millipore). Можно применять любой фильтр с размером пор 0,22 мкм. С применением способа полностью карбамилированного EPO получают с менее 3% или предпочтительно менее 2,5% агрегатов, измеренных ВЭЖХ с исключением по размеру. Полное карбамилирование 8 лизиновых остатков подтверждают с применением аминокислотного анализа, определяющего превращенные в гомоцитруллин лизины. Кроме того, после карбамилирования применяют анализ TNBS для определения первичных аминов, доказывая, таким образом, полное карбамилирование лизинов и Nконца. Кроме того, полное исследование с применением MALDI-TOF определяет изменение в исходной массе обработанного PNGase белка и белка с N-гликанами. Кроме того, MALDI-TOF анализ в области"отпечатка пальцев" пептидных масс/ЖХ-МС/МС анализ показывают, что все 8 лизинов и N-концевая аминокислота карбамилированы. Другие карбамилированные аминокислоты не определяют и не регистрируют модификации гликанов. Кроме того, в конечном продукте получают сниженное количество избыточно и недостаточно карбамилированных форм EPO. Данный продукт является новым и заявленным.-4 011586 Один вариант осуществления изобретения представляет собой композицию, полученную после стадии карбамилирования, но до анионообменной очистки, включающей в себя карбамилированный EPO с менее приблизительно 40 мас.% агрегатов и полимеров, или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 12,5%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 8%, или менее приблизительно 7% и количество цианата. Кроме того, один вариант осуществления изобретения представляет собой композиция, полученная после анионообменной очистки, включающая в себя карбамилированный EPO с менее приблизительно 3 мас.% агрегатов и полимеров, или менее приблизительно 2,5%, или менее приблизительно 2%, или менее приблизительно 1,5%, или менее приблизительно 1%, или менее приблизительно 0,5%. Кроме того, данная композиция содержит изоформы, состоящие из избыточно или недостаточно карбамилированногоEPO в количествах менее приблизительно 40 мас.% суммарного карбамилированного EPO, или более предпочтительно менее приблизительно 35%, или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Кроме того, количество избыточно карбамилированного EPO в композиции может составлять менее приблизительно 35 мас.% суммарного карбамилированного EPO, или более предпочтительно менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%,или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Фармацевтические композиции по изобретению Один аспект изобретения представляет собой применение соединений по изобретению для получения фармацевтических композиций для применения у людей или млекопитающих для лечения описанных ниже состояний. Один вариант осуществления изобретения представляет собой фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество карбамилированного EPO с менее приблизительно 3 мас.% агрегатов и полимеров, или более предпочтительно менее приблизительно 2,5%, или менее приблизительно 2%, или менее приблизительно 1,5%, или менее приблизительно 1%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,5%, и, кроме того, данная композиция включает в себя изоформы, состоящие из избыточно или недостаточно карбамилированного EPO в количествах менее приблизительно 40 мас.% суммарного карбамилированного EPO, или более предпочтительно менее приблизительно 35%,или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 3%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Кроме того, количество избыточно карбамилированного EPO в композиции может составлять менее приблизительно 35 мас.% суммарного карбамилированного EPO, или более предпочтительно менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 3%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. При осуществлении первого аспекта настоящего изобретения содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию, как описано выше, можно вводить млекопитающему любым способом, обеспечивающим необходимый уровень соединения по изобретению в сосудистой системе для обеспечения прохождения сквозь эндотелиально-клеточный барьер и благоприятного действия на восприимчивые клетки. Аналогичные эффекты желательны при использовании с целью перфузии ткани или органа. В случае, когда клетки или ткань не васкуляризированы и/или введение представляет собой промывание клеток или ткани композицией по изобретению, фармацевтическая композиция обеспечивает эффективное для лечения клеток количество соединения по изобретению. Эндотелиально-клеточные барьеры, сквозь которые может проходить соединение по изобретению, включают в себя запирающие зоны, перфорированные соединения, фенестрированные соединения и любые другие представленные у млекопитающего типы эндотелиальных барьеров. В качестве не ограничивающего примера предпочтительным барьером является эндотелиально-клеточное плотное соединение. Указанное выше соединение по изобретению, как правило, приемлемо для терапевтического или профилактического лечения человеческих заболеваний центральной нервной системы или периферической нервной системы, имеющих, главным образом, неврологические или психиатрические симптомы,глазных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, сердечно-легочных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почек, заболеваний мочевых путей и заболеваний репродуктивной системы, желудочно-кишечных заболеваний и эндокринных и метаболических нарушений. Конкретно, такие состояния и заболевания включают в себя гипоксические состояния, неблагоприятно воздействующие на возбудимые ткани, как, например, возбудимые ткани в ткани центральной нервной системы, ткани периферической нервной системы или сердечной ткани или ткани сетчатки, такие как, например, в головном-5 011586 мозге, сердце или сетчатке/глазу. Таким образом, соединение по изобретению можно применять для лечения или профилактики повреждения возбудимой ткани в результате гипоксических состояний в ряде условий и состояний. В качестве не ограничивающих примеров такие условия и состояния представлены здесь далее в таблице. В примере защиты от поддающихся лечению по настоящему изобретению патологий нервной ткани, подобные патологии включают в себя состояния, полученные в результате сниженной оксигенации нервных тканей. Любое состояние, снижающее доступ кислорода к нервной ткани, приводящее к стрессу, повреждению и, наконец, гибели нервной клетки, можно лечить способами по настоящему изобретению. Как правило, определяемые как гипоксия и/или ишемия, данные состояния возникают в результате или включают в себя в качестве не ограничивающих примеров инсульт, сосудистую окклюзию, пренатальное или постнатальное кислородное голодание, удушье, удушение, удушье, утопление с угрозой жизни, отравление угарным газом, вдыхание дыма, травму, включая хирургическую и радиотерапию,асфиксию, эпилепсию, гипогликемию, хроническое обструктивное заболевание легких, эмфизему, синдром расстройства дыхания у взрослых, гипотензивный шок, септический шок, анафилактический шок,инсулиновый шок, серповидный кризис, остановку сердца, нарушение ритма, кессонную болезнь и неврологические расстройства, вызванные проведением искусственного кровообращения. По одному из вариантов осуществления, например, конкретные фармацевтические композиции, содержащие композицию по изобретению, можно вводить для предотвращения травмы или повреждения ткани, возникающего в результате риска травмы или повреждения ткани во время хирургических процедур, таких как, например, резекция опухоли или лечение аневризмы. Другие патологии, вызванные или возникающие в результате гипогликемии, поддающиеся лечению описанными здесь способами, включают в себя передозировку инсулина, также называемую ятрогенной гиперинсулинемией, инсулиному,дефицит соматотропного гормона, гипокортицизм, передозировку лекарственным препаратом и определенные новообразования. Другие патологии, являющиеся результатом повреждения возбудимой нервной ткани, включают в себя судорожные расстройства, как, например, эпилепсия, конвульсии или хронические судорожные расстройства. Другие поддающиеся лечению состояния и заболевания в качестве не ограничивающих примеров включают в себя заболевания, как, например, инсульт (ишемический инсульт, субарахноидальное кровоизлияние, внутримозговое кровоизлияние), рассеянный склероз, гипотензия, остановка сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травма головного или спинного мозга,СПИД-деменция, возрастная потеря когнитивной функции, потеря памяти, амиотрофический боковой склероз, судорожные расстройства, алкоголизм, ишемия сетчатки, обусловленное глаукомой повреждение зрительного нерва и потеря нейронов. Конкретная композиция и способы по настоящему изобретению можно применять для лечения воспаления, обусловленного болезненными состояниями или различными травмами, как, например, физически или химически индуцированное воспаление. Такие травмы могут включать в себя ангиит, хронический бронхит, панкреатит, остеомиелит, ревматический артрит, гломерулонефрит, воспаление зрительного нерва, темпоральный артериит, энцефалит, менингит, поперечный миелит, дерматомиозит, полимиозит, некротический фасцилит, гепатит и некротический энтероколит. Данные демонстрируют, что активированные астроциты могут проявлять цитостатическую роль по отношению к нейронам, продуцируя нейротоксины. Оксид азота, активные формы кислорода и цитокины синтезируются глиальными клетками в ответ на церебральную ишемию (см. Becker, K. J. 2001. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke. Curr Opinion Neurol 14:349-353 иMattson, M. P., Culmsee, C, and Yu, Z. F. 2000. Apoptotic и Antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell TissueRes 301: 173-187.). Кроме того, исследования демонстрируют, что в моделях нейродегенерации активация глии и последующая продукция воспалительных цитокинов зависит от первичного нейронного повреждения (см. Viviani, В., Corsini, E., Galli, CL. , Padovani, A., Ciusani, E., and Marinovich, M. 2000. Dyingneural cells activate glia through the release of a protease product. Glia 32: 84-90 и Rabuffetti, M., Scioratti, C,Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A.A., and Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-1-like activity by AcTyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction и decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci 20: 4398-4404). Воспаление и активация глии присущи различным формам нейродегенеративных расстройств, включающих в себя церебральную ишемию, травму головного мозга и экспериментальный аллергический энцефаломиелит, расстройства,при которых эритропоэтин оказывает нейропротективное действие. Ингибирование продукции цитокинов эритропоэтином может, по меньшей мере, частично, опосредовать свое защитное действие. Однако в отличие от "классических" противовоспалительных цитокинов,таких как ИЛ-10 и ИЛ-13, ингибирующих непосредственно фактор некроза опухоли, эритропоэтин оказывается активным только при наличии гибели нейрона. Не желая быть ограниченными любой конкретной теорией, очевидно, что данную противовоспалительную активность можно гипотетически в качестве неограничивающих примеров объяснить несколькими теориями. Во-первых, так как эритропоэтин предотвращает апоптоз, были бы предотвращены вызванные апоптозом воспалительные события. Кроме того, эритропоэтин может предотвращать высвобо-6 011586 ждение молекулярных сигналов от гибнущих нейронов, стимулирующих клетки глии или способные действовать непосредственно на клетки глии, снижающие их взаимодействие с данными продуктами. Еще одна возможность состоит в том, что эритропоэтин выявляет более проксимальных участников воспалительного каскада (например, каспаза 1, реакционно-способный кислород или промежуточные соединения азота), запускающих апоптоз и воспаление. Кроме того, очевидно, что эритропоэтин обеспечивает противовоспалительную защиту без обратного действия, обычно связанного с другими противовоспалительными соединениями, как, например,дексаметазон. Опять не желая быть связанными любой конкретной теорией, однако, очевидно, что это может быть обусловлено действием эритропоэтина на нейротоксины с широким спектром действия, как,например, оксид азота (NO). Хотя в ответ на различные травмы активированные астроциты и микроглия продуцируют нейротоксические количества NO, NO служит для многих целей в организме, включающих в себя модулирование необходимых физиологических функций. Таким образом, хотя применение противовоспалительного средства может ослабить воспаление посредством супрессии NO или других нейротоксинов, если противовоспалительное средство обладает слишком долгим периодом полувыведения,оно также может перекрещиваться с задачами данных химических реагентов в восстановлении повреждения, вызванного приводящей к воспалению травмой. Предполагают, что соединение по настоящему изобретению способно ослаблять воспаление без перекреста с репаративными возможностями нейротоксинов, таких как NO. Конкретные композиции и способы по изобретению можно применять для лечения состояний и повреждений ткани сетчатки. Такие заболевания в качестве не ограничивающих примеров включают в себя ишемию сетчатки, дистрофию желтого пятна, отслоение сетчатки, пигментную дегенерацию сетчатки,артериосклеротическую ретинопатию, гипертензивную ретинопатию, закупорку артерии сетчатки, закупорку вены сетчатки, гипотензию и диабетическую ретинопатию. По еще одному из вариантов осуществления способы и принципы по изобретению можно применять для профилактики или лечения повреждений, вызванных лучевым поражением или индуцированного химиотерапией повреждения возбудимой ткани. В качестве не ограничивающего примера для защиты от повреждений, вызванных соединениями, такими как таксаны, цисплатин и другие химиотерапевтические средства, способные индуцировать периферическую нейропатию. Дополнительная польза способов по настоящему изобретению состоит в лечении нейротоксического отравления, как, например, отравление домоевой кислотой моллюска, нейролатиризм и болезнь Гуама, амиотрофический боковой склероз и болезнь Паркинсона. Как указано выше, настоящее изобретение также относится к способу усиления функции возбудимости ткани у млекопитающего посредством периферического введения соединения по изобретению, как описано выше. Различные заболевания и расстройства поддаются лечению с применением данного способа, и, кроме того, данный способ приемлем для усиления когнитивной функции при отсутствии какого-либо расстройства или заболевания. Такие применения настоящего изобретения описаны в дополнительной части далее и включают в себя улучшение познания и обучаемости у человека и не относящихся к человеку приматов. Расстройства и заболевания, поддающиеся лечению посредством способов по данному аспекту настоящего изобретения, направленные на центральную нервную систему в качестве не ограничивающих примеров, включают в себя расстройства настроения, тревожные расстройства, депрессию, аутизм, синдром дефицита внимания с гиперактивностью и когнитивную дисфункцию. При данных расстройствах характерно усиление нейронной функции. Другие расстройства, поддающиеся лечению в соответствии с замыслом настоящего изобретения, включают в себя, например, расстройство сна, апноэ во сне и связанные с путешествиями расстройства; субарахноидальные и аневризматические кровотечения, гипотензивный шок, ударное повреждение, септический шок, анафилактический шок и осложнения различных энцефалитов и менингитов, например связанные с заболеванием соединительной ткани энцефалиты, как,например, туберкулез кожи. Другие применения включают в себя профилактику или защиту от отравления нейротоксинами, как например, отравление домоевой кислотой моллюска, нейролатиризм и болезнь Гуама, амиотрофический боковой склероз, болезнь Паркинсона; послеоперативное лечение эмболии или ишемического повреждения; тотальное облучение головного мозга; серповидный кризис и эклампсия. Дополнительная группа поддающихся лечению способами по настоящему изобретению расстройств включает в себя митохондриальную дисфункцию наследственной или приобретенной природы,являющуюся причиной ряда неврологических заболеваний, являющихся типичным примером нейронального повреждения и гибели. Например, болезнь Ли (подострая некротическая энцефалопатия) характеризуется прогрессивной потерей зрения и энцефалопатией из-за резкого снижения нейронной функции и миопатии. В этих случаях, дефектный митохондриальный метаболизм не в состоянии восполнять достаточно высокие энергетические субстраты для поддержания метаболизма возбудимых клеток. Модулятор активности рецептора эритропоэтина оптимизирует недостаточную функцию в ряде митохондриальных заболеваний. Как указано выше, гипоксические состояния неблагоприятно действуют на возбудимые ткани. Возбудимые ткани включают в качестве не ограничивающих примеров в себя ткань цен-7 011586 тральной нервной системы, ткань периферической нервной системы и сердечную ткань. Кроме описанных выше состояний, способы по настоящему изобретению приемлемы для лечения отравления вдыханием, например, угарного газа и вдыхания дыма, тяжелой астмы, синдрома расстройства дыхания у взрослых, удушья и близкого к смерти от утопления состояния. Дополнительные состояния, создающие гипоксические условия или индуцирующие повреждение возбудимой ткани другими способами, включают в себя гипогликемию, которая может произойти при неадекватном дозировании инсулина или при инсулин-продуцирующих новообразованиях (инсулинома). Различные нейрофизиологические расстройства, как полагают, возникающие из-за повреждения возбудимой ткани, поддаются лечению посредством срочных процедур. Хронические расстройства, в которые вовлечено нейрональное повреждение и лечение которых обеспечивается по настоящему изобретению, включают в себя связанные с центральной нервной системой и/или периферической нервной системой расстройства, включающие в себя возрастную потерю когнитивной функции и старческое слабоумие, хронические судорожные расстройства, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию,потерю памяти, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вильсона, церебральный и прогрессивный надъядерный паралич, болезнь Гуама, деменцию с тельцами Леви, прионные заболевания, как, например, спонгиозная энцефалопатия, например, болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Гентингтона, миотоническую дистрофию, болезнь Шарко-Мари-Тута,атаксию Фридриха и другие атаксии, а также синдром Жилля де ла Туретта, судорожные расстройства,как, например, эпилепсия и хронические судорожные расстройства, инсульт, травму головного или спинного мозга, СПИД-деменцию, алкоголизм, аутизм, ишемию сетчатки, глаукому, расстройства автоматической функции, такие как гипертензия и расстройства сна, и нейропсихиатрические расстройства, в качестве не ограничивающих примеров включающие в себя шизофрению, шизоаффективное расстройство,синдром нарушения внимания с гиперактивностью, дистимическое расстройство, большое депрессивное расстройство, мания, обсессивно-компульсивное расстройство, связанные с применением психоактивных веществ расстройства, беспокойство, паническое расстройство, а также униполярные и биполярные аффективные расстройства. Дополнительные нейропсихиатрические и нейродегенеративные расстройства включают в себя, например, расстройства, указанные в American Psychiatric Association's Diagnostic иStatistical Manual of Mental Disorders (DSM), самая последняя версия IV, полностью включенная сюда в качестве ссылки. По еще одному из вариантов осуществления можно применять содержащие соединение по изобретению рекомбинантные химерные молекулы токсинов для терапевтического применения токсинов для лечения пролиферативного заболевания, как, например, злокачественная опухоль, или вирусного заболевания, как например, подострый склерозирующий панэнцефалит. В табл. 1 в качестве не ограничивающих перечислены дополнительные примеры в отношении различных состояний и заболеваний, поддающихся лечению указанными выше соединениями по изобретению. Как указано выше, данные заболевания, расстройства или состояния являются только иллюстрациями ряда преимуществ, обеспечиваемых соединением по изобретению. Соответственно, данное изобретение в целом обеспечивает терапевтическое или профилактическое лечение последствий механической травмы или человеческих заболеваний. Предпочтительно терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний ЦНС и/или периферической нервной системы. Представлено терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний с психиатрическим компонентом. Представленное терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний в качестве не ограничивающих примеров включает в себя заболевания с глазным, сердечно-сосудистым, сердечно-легочным, респираторным, почечным, мочевым, репродуктивным, желудочно-кишечным, эндокринным или метаболическим компонентом. В одном из вариантов осуществления такую содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию можно вводить системно для защиты или улучшения состояния клеток-мишеней,ткани или органа. Такое введение может представлять собой парентерально, посредством ингаляции,через слизистую оболочку, например перорально, назально, ректально, интравагинально, сублингвально,подслизистым введением или чрескожно. Предпочтительно парентеральное введение представляет собой, например, внутривенную или интраперитонеальную инъекцию, а также в качестве не ограничивающих примеров включает в себя внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение. Для других путей введения, которыми вводят фармацевтическую композицию, как, например, посредством перфузируемой жидкости, инъекции в орган, или другого местного введения, приводит к результату в соответствующих концентрациях соединения по изобретению, как описано выше. Предпочтительная концентрация составляет приблизительно 0,01 пМ - 30 нМ. Фармацевтические композиции по изобретению могут включать в себя терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает средства, одобренные Федеральным регулирующим органом или правительством штата или перечисленные в американской Фармакопее или другой общепризнанной иностранной фармакопее для применения у животных, а более конкретно, у людей. Термин "носитель" относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят лекарство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, как, например, солевые растворы в воде и маслах, включающие в себя масла из нефтепродуктов, животного,растительного или синтетического происхождения, как например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т.п. Предпочтительным носителем является физиологический раствор, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей, конкретно для инъекционных растворов также можно применять солевые растворы и водный раствор глюкозы, и растворы глицерина. Фармацевтически приемлемые наполнители включают в себя крахмал, глюкозу,лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина,тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Если жела- 15011586 тельно, композиция также может содержать небольшие количества увлажнителей или эмульгирующих веществ или рН буферных веществ. Данные композиции могут принимать форму растворов, суспензий,эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Композицию можно формулировать как суппозиторий с обычными связывающими веществами и носителями,как, например, триглицериды. Соединения по изобретению можно формулировать как нейтральные или солевые формы. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, образованные свободными аминогруппами, как, например, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот группы и т.д., и группы, образованные свободными карбоксильными группами, как, например,группы, полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д. Примеры приемлемых фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" у E.W. Martin. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, вместе с приемлемым количеством носителя для обеспечения формы для соответствующего введения пациенту. Формулировка должна удовлетворять способу введения. Приспособленные для перорального введения фармацевтические композиции можно принимать в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропа или суспензий (в водных или неводных жидкостях); в виде съедобных пленок или кремов; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния,сахаросодержащий натрий, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислота или их соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара. Предназначенное для перорального введения активное вещество можно покрывать или смешивать с веществом, задерживающим распад и/или абсорбцию активного вещества в желудочно-кишечном тракте(например, можно применять глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат). Таким образом, можно достичь продолжительного высвобождения активного вещества в течение многих часов, и, если необходимо, активное вещество можно защищать от деградации в желудке. Для облегчения высвобождения активного вещества в конкретном участке желудочно-кишечного тракта фармацевтические композиции для перорального введения можно формулировать с помощью определенного рН или ферментативных условий. Приспособленные для трансдермального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде дискретных частей, предназначенных для сохранения в непосредственном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного промежутка времени. Приспособленные для местного введения фармацевтические композиции можно вводить в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для местного применения на коже, рту, глазу или других внешних тканях предпочтительно применять местно мазь или крем. При формулировании в виде мази активный ингредиент можно применять с парафиновой или водорастворимой мазевой основой. В качестве альтернативы, активный ингредиент можно формулировать в крем с основой "масло-в-воде" или основой "вода-в-масле". Приспособленные к местному введению в глазу фармацевтические композиции включают в себя глазные капли. В данных композициях активный ингредиент можно растворять или суспендировать в приемлемом носителе, например в водном растворителе. Приспособленные к местному введению в ротовой полости фармацевтические композиции включают в себя таблетки, пастилки и жидкости для полоскания рта. Приспособленные для назального и легочного введения фармацевтические композиции могут содержать твердые носители, как, например, порошки (предпочтительно с размером частиц в диапазоне от 20 до 500 мкм). Порошки можно вводить сопровождающимся вдохом способом, т.е. посредством быстрого вдыхания носом из поднесенного близко к носу контейнера с порошком. В качестве альтернативы,приспособленные для назального введения композиции могут содержать жидкие носители, например спреи для носа или капли для носа. В качестве альтернативы, ингаляцию непосредственно в легкие можно выполнять посредством глубокой ингаляции или установки загубника в ротоглотку. Данные композиции могут содержать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения ингаляцией можно поставлять в специально приспособленных устройствах, в качестве не ограничивающих примеров включающих в себя аэрозоли под давлением, распылители или порошковдуватели, которые можно конструировать для введения определенных заранее дозировок активного ингредиента. По предпочтительному варианту осуществления, фармацевтические композиции по изобретению вводят прямо в носовую полость или легкие через носовую полость или ротоглотку. Приспособленные для ректального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде суппозиториев или клизм. Приспособленные для вагинального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозольных препаратов. Приспособленные для парентерального введения фармацевтические композиции включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферные растворы, бактериостатические вещества и растворы с кровью предполагаемого- 16011586 реципиента, превращающие композиции, главным образом, в изотонические. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают в себя, например, воду, спирты, полиолы,глицерин и растительные масла. Приспособленные для парентерального введения фармацевтические композиции можно выпускать в однократной дозировке или содержащих многократные дозировки контейнерах, например герметично закрытых ампулах и флаконах, и можно хранить в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением, например, стерильного физиологического раствора для инъекций. Предназначенные для немедленного приема инъекционные растворы и суспензии можно получать из порошков, гранул и таблеток. По одному из вариантов осуществления содержащий инъекционный раствор соединения по изобретению автоинжектор можно использовать для неотложного применения в машинах скорой помощи, пунктах медицинской помощи и в условиях боевых действий, а также для самостоятельного введения в домашних условиях, особенно в случаях возможной травматической ампутации,как, например, неосторожное обращение с газонокосилкой. Вероятность выживания после реплантации клеток и тканей в отрезанной ноге или пальце ноги можно увеличить введением соединения по изобретению в несколько участков в отрезанную часть, как только осуществление этого станет возможным,даже до прибытия медицинского персонала на участок, или доставки пострадавшего индивидуума с отрезанным пальцем ноги в отделение неотложной хирургии. По предпочтительному варианту осуществления композицию формулируют в соответствии с общепринятыми способами, например, приспособленную для внутривенного введения людям фармацевтическую композицию. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буферном растворе. Если необходимо, композиция также может включать в себя растворитель и местный анестетик для снятия боли в участке инъекции, как например,лидокаин. Как правило, ингредиенты комплектуют отдельно или смешивают вместе в стандартную лекарственную форму, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, как например, ампула или пакет-саше с указанием количества активного вещества. При инфузионном введении композицию можно дозировать с помощью содержащего фармацевтически стерильную воду или физиологический раствор инфузионного сосуда. При введении композиции посредством инъекции ампулу со стерильным физиологическим раствором можно приготовить таким образом, чтобы можно было смешать ингредиенты непосредственно перед введением. Как правило, суппозитории содержат активное вещество в диапазоне от 0,5 до 10 мас.%; пероральные препараты предпочтительно содержат от 10 до 95% активного вещества. Перфузируемую композицию можно готовить для применения в сосудах для пересаженных органов, для перфузии in situ или для введения в сосудистую систему донорского органа перед забором органа. Такие фармацевтические композиции могут содержать не приемлемые для острого или хронического,местного или системного введения индивидууму концентрации соединения по изобретению, но удовлетворяющие функциям, определенным здесь в трупе, сосуде для органа, перфузате для органа, или перфузии in situ до удаления или снижения содержавшихся там концентраций соединения по изобретению до выделения или возвращения обработанного органа или ткани в системную циркуляцию. Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению контейнеров. Такой контейнер(ы) необязательно сопровождаются уведомлением в форме, установленной государственными органами, контролирующими производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, в таком уведомлении отражено одобрение организации производства, применения или продажи для введения людям. По еще одному из вариантов осуществления, например, соединение по изобретению можно выпускать в системе с контролируемым высвобождением. Например, полипептид можно вводить с применением внутривенной инфузии, имплантируемой осмотической помпы, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. По одному из вариантов осуществления можно применятьпомпу (см.Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). По еще одному из вариантов осуществления соединение можно выпускать в везикуле, конкретно липосоме (см. Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease и Cancer, Lopez-Berestein и Fidler (eds.), Liss, New York,pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; патент США 4704355; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.). По еще одному из вариантов осуществления можно применять полимерные материалы (см.(1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61, 1953; также см. Levy et al., 1985,Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105). По еще одному из вариантов осуществления систему с контролируемым высвобождением можно помещать близко от терапевтической мишени, т.е. целевых клеток, ткани или органа, требуя, таким образом, только части системной дозы (см., например, Goodson, pp. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждают в- 17011586 обзоре у Langer (1990, Science 249: 1527-1533). По еще одному из вариантов осуществления соединение по изобретению в виде соответствующей формулировки можно вводить посредством назального, перорального, ректального, вагинального или сублингвального введения. В конкретном варианте осуществления может быть желательно введение композиций по изобретению местно в нуждающуюся в лечении область; этого можно достичь, в качестве не ограничивающего примера, локальной инфузией во время хирургической операции, местной аппликацией, например в сочетании с обработкой раны после хирургической операции, инъекцией, посредством катетера, при помощи суппозитория или при помощи имплантата, указанный имплантат представляет собой пористый,непористый или гелеобразный материал, включающий в себя мембраны, как, например, силиконовые мембраны или нити. Выбор предпочтительной эффективной дозы квалифицированный специалист производит на основании рассмотрения нескольких факторов, известных любому специалисту в данной области. Такие факторы включают в себя конкретную форму соединения по изобретению и его фармакокинетические параметры, как, например, биодоступность, метаболизм, период полувыведения и т.д., устанавливаемые во время стандартных процедур разработки, обычно используемых при получении разрешения контролирующего органа для фармацевтического соединения. Дополнительные факторы в обсуждении дозы включают в себя подвергаемое лечению состояние или заболевание, или достижение пользы у нормального индивидуума, массу тела пациента, путь введения, если введение является острым или хроническим, сопутствующие назначения лекарственных средств и другие факторы, хорошо известные для достижения эффекта от введенных фармацевтических веществ. Таким образом, точную дозу следует определять согласно заключению практикующего врача и обстоятельств каждого пациента, например, в зависимости от состояния и иммунного статуса отдельного пациента и в соответствии со стандартными клиническими способами. По еще одному аспекту настоящего изобретения перфузат или перфузионный раствор предоставляют для перфузии и хранения органов для трансплантации, перфузионный раствор, включающий в себя количество соединения по изобретению, эффективен для защиты чувствительных клеток и ассоциированных клеток, тканей или органов. Трансплантация в качестве не ограничивающего примера включает в себя ксенотрансплантацию, где орган (включая клетки, ткань или другую часть тела) забирают от одного донора и пересаживают в отличающегося реципиента; и аутотрансплантацию, при которой орган забирают из одной части тела и помещают в другую, включая хирургические процедуры на столе, при которых орган можно удалить, и во время его положения ex vivo резецировать, восстановить или обработать иначе, как, например, удаление опухоли, а затем возвратить в исходное положение. По одному из вариантов осуществления перфузионный раствор представляет собой раствор the University of Wisconsin(UW) solution (патент США 4798824), содержащий от приблизительно 1 до приблизительно 25 Ед/мл эритропоэтина, 5% гидроксиэтилкрахмала (с молекулярным весом от приблизительно 200000 до приблизительно 300000 и в значительной степени свободный от этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона) ; 25 мМ KН 2 РО 4; 3 мМ глутатиона; 5 мМ аденозина; 10 мМ глюкозы; 10 мМ буферного раствора HEPES; 5 мМ глюконата магния; 1,5 мМ CaCl2; 105 мМ глюконата натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона; 12 мг фенолового красного; с рН 7,4-7,5 и осмолярностью приблизительно 320 мОсм/л. Раствор применяют для поддержания трупных почек и поджелудочных желез до трансплантации. С применением раствора консервирование можно продолжать свыше 30-часового ограничения, рекомендованного для консервирования трупных почек. Данный конкретный перфузат является всего лишь иллюстративным ряда подобных растворов, которые можно приспособить для настоящего применения включением эффективного количества соединения по изобретению. По дополнительному варианту осуществления перфузионный раствор содержит от приблизительно 0,01 пг/мл до приблизительно 400 нг/мл соединения по изобретению, или приблизительно от 40 приблизительно до 300 нг/мл соединения по изобретению. Тогда как предпочтительным реципиентом соединения по изобретению во всех целях здесь является человек, применяемые здесь способы одинаковы для всех млекопитающих, конкретно одомашненных животных, домашнего скота, домашних животных и животных зоопарка. Однако изобретение не ограничено таким образом, и преимущества можно применять к любому млекопитающему. Терапевтические и профилактические применения соединений по изобретению Как отмечено далее в примере 1, присутствие рецепторов эритропоэтина в эндотелии капилляров головного мозга человека указывает, что мишени соединений по изобретению присутствуют в головном мозге человека, и что исследования на животных данных соединений по изобретению непосредственно переносятся на лечение или профилактику людей. По еще одному аспекту изобретения способы и композиции для улучшения жизнеспособности клеток, тканей или органов, не отделенных от сосудистой системы эндотелиально-клеточным барьером,обеспечивают экспонированием клеток, ткани или органов непосредственно с фармацевтической композицией, содержащей соединение по изобретению, или введением, или взаимодействием соединения по изобретению - взаимодействием фармацевтической композиции с сосудистой системой ткани или орга- 18011586 на. Усиленная активность восприимчивых клеток в обработанной ткани или органе содействует оказанным положительным эффектам. Как описано выше, изобретение отчасти основано на открытии, что молекулы эритропоэтина можно транспортировать от люминальной поверхности к поверхности базальной мембраны эндотелиальных клеток капилляров органов с эндотелиально-клеточными плотными контактами, включающими в себя,например, головной мозг, сетчатку и яички. Таким образом, чувствительные клетки поперек барьера являются восприимчивыми мишенями для лечебных воздействий соединения по изобретению, а другие типы клеток или тканей, или органов, содержащих и зависящих полностью или частично от восприимчивых клеток, представляют собой здесь мишени для способов по изобретению. Не желая связываться с любой конкретной теорией, после трансцитоза соединения по изобретению, соединение по изобретению может взаимодействовать с рецептором эритропоэтина на чувствительной клетке, например нервной,ретинальной, мышечной, сердечной, легочной, печеночной, почечной, клетке тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичек, яичников, поджелудочной железы, костной, клетке кожи или эндодермальной клетке, а связывание рецептора может инициировать сигнальную передачу по каскаду, приводя к активации программы генной экспрессии в чувствительной клетке или ткани, приводя к защите клетки или ткани, или органа от повреждения, как, например, токсинами, химиотерапевтическими веществами, лучевой терапией, гипоксией и т.д. Таким образом, способы защиты содержащей чувствительные клетки ткани от повреждения или гипоксического стресса, и усиление функции такой ткани описаны в подробном описании здесь далее. Как указано выше,способы по изобретению одинаково применимы к людям, а также к другим животным. По одному из способов одного варианта осуществления изобретения, млекопитающего больного для лечения злокачественной опухоли подвергают системной химиотерапии, включающей в себя лучевую терапию, обычно обладающей побочными эффектами, как, например, поражение нервов, легких,сердца, яичников или яичек. Введение содержащей соединение по изобретению фармацевтической композиции, как описано выше, выполняют перед или во время химиотерапии и/или лучевой терапии для защиты различных тканей и органов от повреждения химиотерапевтическим веществом, например для защиты яичек. Лечение можно продолжать до тех пор, пока циркулирующие концентрации химиотерапевтического вещества снизятся ниже уровня потенциальной опасности в организме млекопитающего. По одному из способов еще одного варианта осуществления изобретения, различные органы, запланированные для забора от жертвы автомобильной аварии для трансплантации нескольким реципиентам, несколько из которых необходимо транспортировать на продолжительные расстояния и период времени. Перед забором органа жертве вводят содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию, как здесь описано. Для транспортировки забранные органы перфузируют содержащей соединение по изобретению перфузионной жидкостью, как здесь описано, и хранят в содержащей соединение по изобретению емкости. Определенные органы непрерывно перфузируют пульсирующей перфузией дважды, используя перфузат по настоящему изобретению, содержащий соединение по изобретению. При транспортировке и при имплантации и реперфузии органов in situ происходит минимальное повреждение функции органа. По еще одному из вариантов осуществления изобретения, хирургическое вмешательство для восстановления сердечного клапана требует временной остановки сердца и артериальной окклюзии. Перед хирургической операцией пациенту вводят 4 мкг соединения по изобретению на кг массы тела. Такая обработка предотвращает гипоксическое ишемическое клеточное повреждение, конкретно после реперфузии. По еще одному из вариантов осуществления изобретения, соединение по изобретению можно применять при любом хирургическом вмешательстве, как, например, операция в условиях искусственного кровообращения. По одному из вариантов осуществления, для защиты головного мозга, сердца и других органов введение содержащей соединение по изобретению фармацевтической композиции, как описано выше, выполняют перед, во время и/или после процедуры искусственного кровообращения. В указанных выше примерах, в которых соединение по изобретению применяют для аппликаций exvivo, или для обработки чувствительных клеток, как например нервной ткани, ткани сетчатки, сердца,легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников,капиллярного эндотелия, яичек, яичников или клеток, или ткани эндометрия, изобретение относится к фармацевтической композиции в стандартной лекарственной форме, приспособленной для защиты или активации чувствительных клеток, тканей или органов, отдаленных от сосудистой системы, содержащей в стандартной дозировке эффективное нетоксичное количество соединения по изобретению и фармацевтически приемлемого носителя в диапазоне от приблизительно 0,01 пг до 5 мг, 1 пг до 5 мг, 500 пг до 5 мг, 1 нг до 5 мг, 500 нг до 5 мг, 1 мкг до 5 мг, 500 мкг до 5 мг, или 1 мг до 5 мг. По предпочтительному варианту осуществления, количество соединения по изобретению находится в диапазоне от приблизительно 1 нг до 5 мг. По дополнительному аспекту изобретения обнаружили, что введение EPO восстанавливает когнитивную функцию у подверженных травме головного мозга животных. Можно предположить, что соединения по изобретению обладают такими же защитными эффектами для клеток, как EPO. После 5- 19011586 суточной или 30-суточной выдержки EPO все еще способен к восстановлению функционирования по сравнению с ложно-обработанными животными, показывая способность EPO восстанавливать или воспроизводить активность головного мозга. Таким образом, изобретение также относится к применению соединения по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения травмы головного мозга и других когнитивных дисфункций, включая в себя лечение значительно позже повреждения(например, трех суток, пяти суток, недели, месяца или дольше). Изобретение также относится к способу лечения когнитивной дисфункции после повреждения посредством введения эффективного количества соединения по изобретению. Для данного аспекта изобретения можно применять любое соединение по изобретению, как здесь описано. Кроме того, данный восстановительный аспект изобретения относится здесь к применению любого из соединений по изобретению для получения фармацевтической композиции для восстановления клеточной, тканевой или органной дисфункции, где лечение начинают после и значительно позже ответственного за дисфункцию исходного повреждения. Кроме того, лечение с применением соединения по изобретению может перекрывать развитие заболевания или состояния во время острой фазы, а также хронической фазы. В примере, где соединение обладает эритропоэтической активностью, соединение можно вводить системно в дозировке на введение между приблизительно 1 мкг и приблизительно 100 мкг/кг массы тела,предпочтительно приблизительно 5-50 мкг/кг массы тела, наиболее предпочтительно 10-30 мкг/кг массы тела. Данная эффективная доза должна быть достаточной для достижения сывороточных концентраций соединения более чем приблизительно 10000, 15000 или 20000 мЕд/мл сыворотки после введения соединения. Таких сывороточных концентраций можно достичь в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения. Такие дозировки можно повторять по мере необходимости. Например, введение можно повторять ежедневно, так длительно, насколько это клинически необходимо, или после соответствующего интервала, например каждые от 1 до 12 недель, но предпочтительно каждые от 1 до 3 недель. Эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель можно фасовать в сосуд с однократной дозой или другой контейнер. Однако, соединение по изобретению не является эритропоэтическим, т.е. оно способно проявлять описанную здесь активность без увеличения концентрации гемоглобина или гематокрита. Такое неэритропоэтическое соединение особенно предпочтительно в примерах, где способы по настоящему изобретению направлены на хроническое применение. По еще одному из вариантов осуществления, соединение по изобретению дают в дозе, большей, чем соответствующая необходимая для максимальной стимуляции эритропоэза доза (мас./мас.) природного эритропоэтина. Как указано выше, соединение по изобретению не обладает эритропоэтической активностью, и следовательно указанные выше дозировки выражают в единицах, только приблизительно соответствующих количествам природного эритропоэтина; здесь выше представлены молярные эквиваленты для дозировок, применимые к любому соединению по изобретению. Примеры Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на следующие далее не ограничивающие примеры, представленные в качестве иллюстрации изобретения. Следующие далее примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществлений изобретения. Однако их не следует интерпретировать в качестве ограничивающих полноту изобретения. Пример 1. Получение карбамилированного эритропоэтина Исходное вещество способа в данном примере представляет собой очищенный рекомбинантный человеческий EPO. Первую белковую концентрацию корректируют ультрафильтрацией с целью сохранения небольшого объема реакции. Белковую концентрацию доводят до 3 мг/мл. Ультрафильтрацию выполняют посредством BioMax(Millipore) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. После завершения стадии концентрирования раствор EPO смешивают с 0,5M K-борат тетрагидратом, 0,5M K-цианатом при рН 9,0, раствор инкубируют при 32C в течение 24 ч. Обессоливание реакционной смеси EPO и цианата выполняют гель-фильтрацией. Белок обессоливают с буферным раствором 25 мМ Трис, 50 мМ NaCl рН 8,5. Применяют смолу G-25 Fine (AmershamBiosciences). Выполняют загрузку образца приблизительно 20% объема колонки, применяя поток 90 см/ч на колонку высотой приблизительно 15 см. Обессоленный карбамилированный EPO собирают дополнительной обработкой. На данном этапе содержание полимер/агрегат составляет 7,3%. Следующая стадия представляет собой удаление агрегатов и полимеров, выполняя стадию очистки с применением анионного обмена. Для очистки применят смолу SOURCE 30Q (Amersham Biosciences).Ha колонку используют приблизительно 4,5 мг/мл карбамилированного EPO. Разделяющий буфер А представляет собой: 25 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 8,5, и элюирующий буфер В: 25 мМ Трис, 1 M NaCl,рН 8,5. Градиент выполняют с 0-30% более 20 объемов колонки, собирают и объединяют основной пик карбамилированного EPO.- 20011586 Объединенную фракцию после стадии очистки корректируют до концентрации 0,5 мг/мл, и меняют буфер на буферный раствор с 20 мМ цитрата, 100 мМ NaCl с применением диа/ультрафильтрации с проточной фильтрацией вдоль потока. Концентрирование и замену буфера выполняют на 0,1 м 2 BioMax(Millipore) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. Наконец, очищенное биофармацевтическое лекарственное вещество фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм с применением Millipak (Millipore) для исключения пророста. Полученный в результате обработки карбамилированный EPO обладает свойствами, определяющими его как приемлемый в качестве биофармацевтического. Определенное SEC-HPLC содержание полимер/агрегат составляет 0,5%. Определенные аминокислотным анализом карбамилированные лизины составляют 100%. Концентрация составляет 0,5 мг/мл. Для определения изменения в исходной массе обработанного PNGase белка и белка с N-гликанами выполняют исследование с применением MALDI-TOF. Кроме того, выполняют MALDI-TOF анализ "отпечатка пальцев" пептидных масс/ЖХ-МС/МС, как указано далее: 1. СЕРО и EPO очищают на колонке POROS R1 (POROS R1 reverse phase column material, PerSeptiveBiosystems (1-1259-06. До применения колоночный материал хранят в 50% HiPerSolv для HPLC VWR 152525R. Колонку R1 уравновешивают и промывают 5% муравьиной кислотой (33015, Riedl de Han). Образцы элюируют из колонки качественным матричным раствором Agilent MALDI HCCA (G2037A). Исходную массу определяют посредством анализа на приборе Bruker Reflex IV MALDI-TOF. 2. В течение ночи 0,3 пмоль СЕРО и/или EPO подвергают обработке 1 единицей PNGase F и PNGaseF/O-гликозидазы. Общую массу определяют с применением MALDI-TOF. 3. СЕРО и EPO (1,5 пмоль) восстанавливают в растворе 50 мкл 10 мМ DTT, 50 мМ NH4CO3 с последующим алкилированием в 50 мкл 55 мМ иодацетамида, 50 мМ NH4CO3. Перед расщеплением трипсином образцы очищают на колонке POROS R1. Фракцию расщепленного образца очищают на колонкеPOROS R2 перед анализом MALDI-TOF (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05. Колонку R2 уравновешивают и промывают 0,1% трифторуксусной кислотой (99+% spectrometric grade, Aldrich 302031-100ml). Образцы элюируют из колонки качественным матричным раствором Agilent MALDIHCCA (G2037A). Полученную посредством трипсинового расщепления группу пептидов обрабатываютPNGase F и очищают на колонках POROS R2, и исследуют посредством MALDI-TOF. 4. СЕРО и EPO восстанавливают в растворе DTT и алкилируют иодацетамидом. Перед расщеплением Glu-C образцы очищают на колонке POROS R1. Перед анализом MALDI-TOF фракцию расщепленного образца очищают на колонках POROS R2. Полученную посредством Glu-C расщепления группу пептидов обрабатывают PNGase F и очищают на колонках POROS R2. 5. Для исключения возможности присутствия частично карбамилированного СЕРО, исходный EPO и СЕРО расщепляют Lys-C. Образцы анализируют с применением MALDI-TOF. Заключение состоит в том, что 8 лизинов и N-концевая аминокислота являются карбамилированными. Другие карбамилированные аминокислоты не определены, и не обнаружено никаких модификаций гликанов. Ссылки: Обычная идентификация белков посредством MS:proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry. MoI Cell Proteomics. 4(2), 107-19. Дополнительные исследования позволили определить степень и гомогенность карбамилированияEPO, специфичность карбамилирования и идентичность сайтов карбамилирования,и присутствие потенциальных неспецифичных модификаций в результате побочных реакций карбамилирования и процесса очистки. Образцы анализировали посредством анализа общей массы образцов дегликозилированных белков и пептидного картирования с применением эндопротеаз LysC и трипсина для расщепления, и анализLC/MS для определения пептидов. Пример 2. Анализ общей массы Анализ выполняют с тремя образцами EPO, карбамилированными с применением способа по примеру 1. Все три образца очищают после реакции карбамилирования с применением анионного обмена,как описано в примере 1. Один из образцов СЕРО (обозначенный CEPO-CMC) получают посредствомCMC Biotech, масштаб производства из 1 г (концентрация: 0,82 мг/мл; буферный раствор: 20 мМ цитратNa, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1M NaCl, рН 6,9-7,3). Оставшиеся два образца, обозначенные CEPO-1 и СЕРО-2, получают из лабораторного масштаба производства 70 мг (концентрация: 1,1 мг/мл; буферный раствор: 25 мМ Трис, 0,2 M NaCl, рН 8,3-8,7). Данные образцы СЕРО сравнивают с не модифицированным или исходным EPO (концентрация: 0,82 мг/мл; буферный раствор: 2 мМ цитрат Na, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1 NaCl, рН 6,9-7,3) и ложным СЕРО (полученный посредством способа карбамилиорвания без добавления цианата K EPO) (концентрация: 0,38 мг/мл; буферный раствор: 20 мМ цитрат Na, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1M NaCl, рН 6,9-7,3).ESI-масс-спектрометрия До проведения анализа общей массы образцы подвергают ферментативному дегликозилированию. Каждый образец инкубируют в течение ночи с 50 мкг N-гликозидазы F (Prozyme from Glyko) , рекомбинантной нейраминидазы A. ureafaciens и О-гликозидазы при белковой концентрации 0,5 мг/мл. Полноту реакции дегликозилирования проверяют посредством способа SDS-PAGE при введении 3 мкг каждого образца в 12% Трис-глициновые гели. Оставшееся вещество из каждого образца используют для анализа по массе. Добавлением соответствующего объема матричного раствора гуанидина гидрохлорида дегликозилированные образцы вносят к гуанидину гидрохлориду с концентрацией 4-5M, а затем обессоливают в содержащем 2% муравьиную кислоту и 40% ацетнитрил буферном растворе. Гуанидин гидрохлорид добавляют для того, чтобы обеспечить полное восстановление дегликозилированного EPO и СЕРО для масс-спектрометрического анализа. Определение массы выполняют с применением Waters ESI-Q-Tofили Waters ESI-LCT-масс-спектрометра, обеспечивающего ESI-наноспрей источник ионизации. Оценку данных проводят автоматической деконволюцией и ручным определением конкретных представляющих интерес пиков посредством программного обеспечения Mass Lynx 4.0. Количественное определение относительных отношений карбамилированных разными способами образцов СЕРО выполняют вычислением относительных отношений на основании регистрируемых в области масса/заряд интенсивностей сигналов. Дегликозилирование приводит к образованию полностью удаляемых N-связанных сахаров. Однако высвобождение О-связанных Сахаров является не полным, особенно для образцов СЕРО. Как предполагалось, в результате карбамилирования образцы СЕРО показали различные спектры масс по сравнению с EPO и образцами ложного СЕРО. Как показано в табл. 2, деконволюция спектров дала в результате массы для основных пиков для различных образцов, как ожидалось теоретически. Во всех образцах СЕРО обнаружили только в значительной степени карбамилированные молекулы СЕРО, с основной изоформой, представляющей собой полностью карбамилированную изоформу с полным карбамилированием 8 лизинов и N-концевой аминокислоты, т.е. 9 карбамильными остатками. Образцы СЕРО демонстрируют гетерогенность в содержании дополнительных изоформ, соответствующих 8, 10 и 11 карбамильным остаткам, присоединенных к СЕРО. Содержащие 8 карбамильных остатков образцы обозначены как недостаточно карбамилированные, с отсутствием по меньшей мере одного карбамильного остатка. Образцы с 10 и 11 карбамильными остатками обозначены как избыточно карбамилированные,где избыточные присоединенные карбамильные остатки могут связываться в неспецифичных условиях с отличными от лизина аминокислотами. В спектрах всех образцов определяют несколько минорных сигналов, но, как полагают, ни один не представляет собой неспецифично модифицированный образец. В образцах EPO и СЕРО обнаружили несколько минорных сигналов, и, как полагают, примеси уже присутствовали в исходном EPO.- 22011586 Таблица 2. Полученные при анализе по общей массе деконволюционные массы дегликозилированных образцов СЕРО и EPO В табл. 3 показаны относительные соотношения различных изоформ. Диапазоны недостаточно карбамилированного СЕРО приблизительно от 1,5 до 5,5% общего СЕРО в зависимости от образца, а диапазоны избыточно карбамилированного СЕРО приблизительно от 11 до 22% в зависимости от образца.CEPO-1 и СЕРО-2 имеют одинаковое распределение изоформ, тогда как СЕРО-CMC имеет меньше недостаточно карбамилированных образцов по сравнению с двумя другими образцами. Различные масштабы производства дают выход продуктов с различным распределением, но как показано в табл. 3 для лабораторного масштаба производства, производство с подобным результатом можно повторять. Как обсуждали ранее, в любом выполненном масштабе производства распределение можно приспособить посредством корректировки объединения из анионообменной колонки. Цифры в табл. 3 представляют собой минимальное соотношение недостаточно и избыточно карбамилированного СЕРО. Причиной этого является степень карбамилирования (от 8-кратной до 11 кратной), возможно, не точно определенная степень недостаточно, полностью и избыточно карбамилированного СЕРО. Например, молекула СЕРО, содержащая 8 карбамильных остатков, определенных анализом по массе, может иметь только 7 карбамильных групп, специфично связанных с лизинами, а оставшийся карбамильный остаток может представлять собой неспецифично связанный с другой аминокислотой. Данную ситуацию можно рассматривать только как недостаточно карбамилированный СЕРО, даже если существуют неспецифически связанные карбамильные группы. Наоборот, содержащая 10 карбамильных остатков молекула СЕРО, возможно, имеет только 8 специфично связанных остатков и два связанных неспецифично. В данной ситуации изоформу СЕРО рассматривают только избыточно карбамилированную, даже если все лизины не карбамилированы.- 23011586 Таблица 3. Степень и гетерогенность карбамилирования: относительные соотношения различно карбамилированных образцов СЕРОn=1 Пример 3. LysC пептидное картирование С применением эндопротеаз LysC и трипсина для расщепления выполняют исследование пептидной карты образцов EPO и СЕРО. Исследования всех пептидных карт проводили с дегликозилированными пептидами. Ферментативное дегликозилирование пептидов выполняют одновременно с эндопротеазным расщеплением. Образцы EPO и СЕРО (приблизительно 150 мкг каждого) денатурируют и восстанавливают посредством инкубации с гуанидином гидрохлоридом и DTT. Свободные сульфгидрильные группы алкилируют иодуксусной кислотой. Алкилированные образцы обессоливают и выполняют замену буфера на соответствующий буфер с применением колонок для гель-фильтрации одноразового использования. Эндопротеазу, N-гликозидазу и нейраминидазу, одновременно добавляют к образцам алкилированных EPO и СЕРО. Образцы в течение ночи инкубируют при 37C. После инкубации приблизительно 5 мкг каждой смеси используют для анализа RP-HPLC/MS с применением Jupiter, C18 RP-колонок из Phenomenix, соединенных с ESI-LCT из Waters. B масс-спектрометре регистрируют УФ-сигнал при 220 нм и общее количество ионов (TIC). Для идентификации и количественного анализа полученных пептидов оценивают TIC. Так как LysC не способен к расщеплению карбамилированных лизинов, предполагалось,что если карбамилированы все лизины, указывая на специфичность карбамилирования, при расщепленииLysC фрагменты не образуются. В случае неполного карбамилирования должны образоваться конкретные фрагменты СЕРО. В табл. 4 перечислены теоретически образующиеся при расщеплении LysC фрагменты EPO, полностью и избыточно карбамилированных СЕРО и недостаточно карбамилированного СЕРО. Таблица 4. LysC пептидное картирование: списки теоретически образующихся при расщепленииLysC пептидных фрагментов EPO, полностью или избыточно карбамилированного СЕРО и недостаточно карбамилированных СЕРО и EPO Недостаточно карбамилированный СЕРО (8 карбамилирование) Как ожидали, полученный для расщепленных LysC образцов EPO и СЕРО LysC пептидный профиль полностью отличается. Расщепление LysC исходного EPO и ложного СЕРО привело к образованию ожидаемого пептидного профиля. В обоих образцах можно определить все пептиды от K1 до K9. В EPO и ложном СЕРО пептиды K5 и K1 являются частично расщепленными в неспецифических условиях. Не определяют никаких значимых дополнительных пиков и не определяют пики, отсутствующие в LysC карте ложного СЕРО по сравнению с исходным EPO. Исходя из этих данных, можно заключить, что при карбамилировании и процессе очистки не возникает значимых неспецифических ковалентных модификаций белка EPO. Пептидные карты образцов СЕРО имеют различные пептидные профили с исходным EPO. Присутствует один основной пик и несколько незначительных пиков. Как показано в табл. 5, полученные из пиков массы хорошо коррелируют с массами, ожидаемыми для не расщепленного СЕРО, или для фрагментов при расщеплении LysC недостаточно карбамилированного СЕРО. Основной пик (А) включает в себя исходный, дегликозилированный, полностью карбамилированный СЕРО (9 карбамилов) и избыточно карбамилированный СЕРО (10 карбамилов) (табл. 5). Четыре незначительных пика (B-E) включают в себя недостаточно карбамилированный СЕРО (8 карбамилов), с различными пиками, включающими в себя недостаточно карбамилированный СЕРО, не карбамилированный по конкретным лизинам. Пики В и С содержат недостаточно карбамилированный СЕРО, в котором отсутствует специфическое карбамилирование по Lys45, тогда как пики D и E содержат недостаточно карбамилированный СЕРО, в котором отсутствует специфическое карбамилирование по Lys97 (табл. 5). Таблица 5. LysC пептидное картирование: распределение экспериментально полученных масс с теоретически полученными фрагментами СЕРО из недостаточно карбамилированного СЕРО В относительных соотношениях пиков для различных образцов СЕРО существует несколько различий. Образцы СЕРО 1 и 2 имеют более рельефные пики D и E, чем у CEPO-CMC, показывая, что они содержат больше образцов недостаточно карбамилированного СЕРО. Из-за технических ограничений трудно количественно оценить минорные пики, так как они связаны с основным пиком. Однако с применением областей пиков по УФ-детекции в качестве грубого определения относительных отношений различных образцов можно определить, что недостаточно карбамилированный СЕРО может составлять менее 10% изоформ СЕРО в образцах и, что CEPO-1 и СЕРО-2 имеют двойное количество недостаточно карбамилированных изоформ по сравнению с CEPO-CMC. В целом, данные LysC пептидного картирования хорошо согласуются с описанным в примере 2 анализом по общей массе. CEPO-CMC содержит меньше недостаточно карбамилированных изоформ СЕРО, тогда как CEPO-1 и СЕРО-2 содержат больше избыточно карбамилированных изоформ СЕРО. Данное пептидное картирование также показывает, что лизин 45 и лизин 97 могут представлять собой области неполного карбамилирования. Пример 4. Пептидное картирование посредством трипсина Расщепление образца с применением трипсина описано в примере 3. Расщепление EPO и ложного СЕРО трипсином приводит к образованию ожидаемого пептидного профиля. Как ожидали, при расщеплении трипсином в обоих образцах можно определить большинство пептидов (от T1 до Т 21), за исключением некоторых небольших ди- и трипептидов (как например Т 21). Смотри табл. 6. Как и в случае с расщеплением LysC, не выявляют значимых дополнительных пиков и не выявляют пиков, отсутствующих у ложного СЕРО по сравнению с исходным EPO. Исходя из этих данных, заключают, что при карбамилировании и процессе очистки не образуется неспецифических ковалентных модификаций белка EPO. Пептидные профили образцов СЕРО отличаются от не модифицированного EPO. Обычно трипсин расщепляет по лизину и аргинину, таким образом, можно предположить, что в случае полностью карбамилированного EPO может произойти фрагментирование только посредством расщепления аргининов. Таким образом, после получения пептидного профиля с использованием трипсина можно определить области специфического карбамилирования и неспецифически карбамилированные пептиды. Ожидаемые при расщеплении трипсином молекул СЕРО пептиды допускают расщепление по аргининам (R) только, как указано в табл. 6. Таблица 6. Список ожидаемых для EPO и СЕРО расщепленных трипсином пептидов EPO СЕРО (предполагаемое расщепление только по Arg (R) в результате полного карбамилирования) Все ожидаемые для расщепления трипсином пептиды определяли в виде основных пиков во всех образцах СЕРО, за исключением C-концевого пептида R13. Данный пептид также не обнаружили в исходном EPO или ложном СЕРО. Полученные при специфическом расщеплении только по аргининам пики от R1 до R12 рассматривают как подавляющее большинство определенных в образцах СЕРО пептидов. Кроме того, все содержащие лизин пептиды определяют почти исключительно в полностью карбамилированной форме. Эти данные показывают высокую степень специфичного карбамилирования по лизинам и N-концевой аминокислоте. Кроме основного пептида во всех образцах СЕРО также определяют шесть минорных пептидов. Анализом по массе определяют три из минорных пептидов как результат расщепления трипсином избыточно карбамилированного СЕРО, а оставшиеся три образуются в результате расщепления недостаточно карбамилированного СЕРО. В табл. 7 перечислены все пептиды, определенные в картах с расщеплением трипсином трех проанализированных образцов СЕРО. Высоко распространенные пептиды от R1 до R12, образованные из полностью и специфически карбамилированного EPO, указаны обычным шрифтом, правильно карбамилированный EPO дополнительно обозначен жирным шрифтом. Наиболее вероятно образованные расщеплением недостаточно карбамилированного СЕРО пептиды обозначены курсивом, а образованные расщеплением избыточно карбамилированного СЕРО пептиды обозначены подчеркнутым шрифтом.- 27011586 Таблица 7. Пептидная карта при расщеплении трипсином: список пептидов, определенных в пептидной карте СЕРО с расщеплением трипсином- интенсивность по отношению к общему количеству импульсов в TIC 1- обнаружен посредством ручного определения; сигнал подтвержден как специфический Со ссылкой на табл. 7, минорные пики T9 и T10, содержащие соответственно R6a1 и R6b1 пептиды, наиболее вероятно получены при расщеплении молекул недостаточно карбамилированного СЕРО, не карбамилированного по Lys97. Пептид R4b1+1 карб. образуется, если не карбамилирована аминокислота Lys45. Пептид R6a1 (пик Т 9) более выражен в образцах CEPO-1 и CEPO-2, по сравнению с CEPOCMC, показывая, что образующая его молекула может иметь двойное количество недостаточно карбамилированного СЕРО. Пептиды R6b1 и R4b1 + 1 карб. представлены в равных количествах во всех образцах СЕРО. Выполнить вычисление относительного содержания недостаточно карбамилирванного СЕРО из этих данных представляет трудности из-за технических ограничений. Однако, собрав все наблюдения вместе, приблизительно определили, что количество недостаточно карбамилированных образцов составляет приблизительно 10%, так как это заключили из анализа по общей массе и LysC пептидного картирования. Три других минорных пептида, элюированных с остальными пептидами, интерпретировали по массе как содержащие один избыточный карбамильный остаток, т.е. избыточно карбамилированный СЕРО. Пептиды R102 карб. и R71 карб. определяют в незначительных количествах, причем обнаружили, чтоR123 карб. имеет значимую интенсивность сигнала. CEPO-CMC имеет в два раза большее содержание избыточно карбамилированных образцов СЕРО по сравнению с CEPO-1 и СЕРО-2. Это согласуется с результатами анализа по общей массе. Из этих данных также следует заключить, что аминокислотная- 28011586 последовательность 151-62 EPO представляет собой область для неспецифического карбамилирования. Кроме того, по тем же причинам, что и для количественной оценки неполного карбамилирования,количественная оценка избыточно карбамилированных образцов представляет трудности. Однако, предположив, что одинаковая эффективность ионизации пептидов, отличающаяся только по степени карбамилирования, по относительному количеству ионов производных R12 вычислили, что приблизительно 37% СЕРО представляют собой избыточно карбамилированные образцы. Это представляет собой меньшее количество избыточно карбамилированных изоформ, вычисленных анализом по общей массе. В целом, из анализа по общей массе и данных пептидного картирования EPO и СЕРО можно заключить следующее. Образцы СЕРО, являющиеся в достаточно высокой степени карбамилированными, исходя из анализа по общей массе. Приблизительно 95-98% всех молекул полностью карбамилированы и содержат по меньшей мере 9 карбамильных остатков (см. табл. 3). Картирование с применением LysC и трипсина подтверждает высокую степень карбамилирования по специфическим сайтам, и что наиболее вероятно более 95% молекул СЕРО являются полностью карбамилированными по 8 лизинам и N-концевой аминокислоте. Данные также показывают четыре обнаруженных изоформы СЕРО. В проанализированных образцах СЕРО определяют образцы с 8, 9, 10 и 11 карбамильными остатками, изоформа с 9 карбамильными остатками представляет собой доминирующие образцы. Предполагают, что содержащая 8 карбамильных остатков вместо 9 небольшая часть молекул СЕРО является неполностью карбамилированной. ДляCEPO-1 и СЕРО-2 данные изоформы составляют приблизительно 5% от общего, а для CEPO-CMC данная изоформа образуется приблизительно у 1,5% из общего количества молекул СЕРО. Более значительная часть молекул СЕРО является избыточно карбамилированной, т.е. содержит 10 или 11 карбамильных остатков. Интервалы избыточно карбамилированного СЕРО составляют приблизительно от 11% для CEPO-1 и СЕРО-2 до приблизительно 22% в CEPO-CMC. Данные пептидного картирования показывают высокую степень специфичности карбамилирования по 8 лизинам и N-концу. Кроме того, в целом пептидное картирование подтверждает результаты анализа по общей массе. По меньшей мере приблизительно 90-95% молекул СЕРО являются специфически модифицированными карбамильными остатками по всем лизинам и N-концу. Однако эти данные также показывают неполное и избыточное карбамилирование образцов СЕРО. Из-за некоторых технических ограничений тяжело определить точное соотношение недостаточно карбамилированных образцов, но приблизительно определили, что оно составляет приблизительно до 10%, что согласуется с обнаруженным по анализу общей массы количеством. Кроме того, на молекуле EPO определили два различных положения Lys45 и Lys97, как положения, где наиболее вероятно происходит отсутствие карбамилирования. В обеих сериях пептидного картирования также обнаружили избыточно карбамилированные образцы. Более того, из-за технических ограничений тяжело количественно оценить точное количество избыточно карбамилированных образцов. Исходя из полученных данных, можно спекулировать, что при пептидном картировании определяют слишком малые количества избыточно карбамилированных образцов. Пептидным картированием определяют только от одной трети до одной второй количества избыточно карбамилированных образцов по сравнению с анализом по общей массе. Разумное объяснение для данного противоречия состоит в том, что идентифицируют вообще не все из избыточно карбамилированных пептидов или в неправильном количестве. На карте LysC в значительных количествах определяют нерасщепленные содержащие 10 карбамильных остатков образцы СЕРО, а в картировании с применением трипсина определяют три пептида с содержанием одного избыточного карбамильного остатка. Два из этих фрагментов определяют только в следовых количествах. Третий пептид, пептид СЕРО из 152-162 аминокислот, граничит с С-концом и является причиной одной третьей части избыточного карбамилирования, и может представлять собой сайт для неспецифического карбамилирования в EPO. Посредством любого выполненного анализа не определили значительных количеств других неспецифических (не связанных карбамилом) модификаций в образцах СЕРО или в образцах ложного СЕРО. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ESI-масс-спектрометрией, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени,необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и Nконцевой аминокислоте эритропоэтина. 2. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин. 3. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно- 29011586 30% агрегированного белка. 4. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20% агрегированного белка. 5. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10% агрегированного белка. 6. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка. 7. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка. 8. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мac.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка. 9. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка. 10. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка. 11. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка. 12. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл. 13. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл. 14. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M. 15. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M. 16. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60 С. 17. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34C. 18. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11. 19. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10. 20. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток. 21. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток. 22. Способ по п.1, где белок эритропоэтина взаимодействует с цианатом в присутствии буферного раствора. 23. Способ по п.22, где буферным раствором является борат. 24. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M. 25. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,1 приблизительно до 1M. 26. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно 0,5M. 27. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10M, температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60 С, рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11, а время составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до тридцати суток. 28. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2M, температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34C, рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10, а время составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток. 29. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно 0,5M, температура составляет приблизительно 32C, рН составляет приблизительно 9, а период времени составляет приблизительно 24 ч. 30. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 3% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ESI-масс-спектрометрией, включающий в себя очистку карбамилированного эритропоэтина с применением анионообменной, катионообменной, гидрофобной хроматографии,хроматографии с обращенными фазами, аффинной хроматографии или хроматографии с исключением по размеру. 31. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий
МПК / Метки
МПК: A61K 38/18, C07K 14/505
Метки: еро, получения, карбамилированный, новый, способ
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11586-novyjj-karbamilirovannyjj-ero-i-sposob-ego-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Новый карбамилированный еро и способ его получения</a>
Новый способ получения изоиндолина
Номер патента: 3515
Опубликовано: 26.06.2003
Авторы: Фуже Клод, Совие Жан-Клод, Лекове Жан-Пьер
МПК: C07D 209/44
Метки: изоиндолина, новый, получения, способ
Формула / Реферат:
1. Способ синтеза изоиндолина, отличающийся тем, что раствор фталонитрила в тетрагидрофуране, в смеси тетрагидрофуран/вода или в диметоксиэтане подвергают воздействию водорода под давлением 100-180 бар при температуре 30-100шC в присутствии 5%-ной Pt/C. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворителем служит тетрагидрофуран. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворителем служит смесь тетрагидрофуран/вода, в которой содержание воды не...
Новый способ получения рофлумиласта
Номер патента: 9985
Опубликовано: 28.04.2008
Авторы: Палош Вальтер, Мюллер Бернд, Коль Бернхард
МПК: C07D 213/75
Метки: способ, рофлумиласта, новый, получения
Формула / Реферат:
1. Способ получения рофлумиласта путем реакции аниона 4-амино-3,5-дихлорпиридина формулы (1) в которой А+ обозначает катион, предпочтительно катион щелочного металла и особо предпочтительно катион калия, с активированным производным 3-циклопропилметокси-4-дифтометоксибензойной кислотой формулы (2) где LG обозначает уходящую группу, предпочтительно атом хлора, атом брома или группу формулы OC(O)-C1-С4алкил, особо предпочтительно атом хлора,...
Новый способ получения каберголина
Номер патента: 10689
Опубликовано: 30.10.2008
Авторы: Деметер Адам, Галамбош Янош, Балинт Шандорне, Игначне Сендрей Дьёрдьи, Цибуля Ласло, Кашшай Ференцне, Шебок Ференц
МПК: C07D 457/06
Метки: кабэрголина, новый, способ, получения
Формула / Реферат:
1. Способ получения каберголина (I) включающий следующие стадии: (а) взаимодействие соединения формулы (XIII) где R1 представляет собой С1-4алкильную группу, в присутствии катализатора (i) с соединением формулы (XIV) где R2 представляет собой необязательно замещенную линейную или разветвленную C1-6алкильную группу и X представляет атом брома или хлора, или (ii) с соединением формулы (XV) где R2 представляет собой группу, имеющую значения,...
Новый способ получения алендроновой кислоты
Номер патента: 3861
Опубликовано: 30.10.2003
Авторы: Лифшиц Ревитал, Лидор-Хадас Рами
МПК: C07F 9/38
Метки: кислоты, получения, алендроновой, способ, новый
Формула / Реферат:
1. Способ получения алендроновой кислоты, включающий стадии а) взаимодействия соединения формулы I с H3PO3 где R - имидогруппа и R1 выбирают из группы, которая состоит из атома хлора, брома, йода или фтора, гидрокси-, амино-, -OR2 или -OC(O)R2-группы, где R2 - C1-C12алкил-, C1-C12циклоалкил- или C1-C12арилгруппа, б) взаимодействия продукта стадии (а) с агентом, снимающим защитную группу, и в) выделения алендроновой кислоты. 2. Способ по п.1,...
Новый стабильный кристалл производного тиазолидиндиона и способ его получения
Номер патента: 4244
Опубликовано: 26.02.2004
Авторы: Охнота Михиро, Орита Казуо
МПК: A61K 31/426, A61P 3/10, C07D 277/34...
Метки: получения, новый, стабильный, тиазолидиндиона, производного, способ, кристалл
Формула / Реферат:
1. Новые кристаллы 5-[(2,4-диоксотиазолидин-5-ил)метил]-2-метокси-N-{[4-(трифторметил)фенил]метил}бензамида, характеризующиеся при порошковой дифракции рентгеновских лучей наличием дифракционных максимумов при значениях дифракционных углов (2Q) при по меньшей мере 9,7, 15,0 и 22,5ш. 2. Способ приготовления новых кристаллов по п.1 путем перекристаллизации из приемлемого растворителя. 3. Способ приготовления новых кристаллов по п.2, в котором...
Предыдущий патент: Смеси антраниламидных средств борьбы с беспозвоночными вредителями
Следующий патент: Смесь полимера пропилена, способ получения смеси и ее применение
Случайный патент: Способы получения соединений на основе имидазола