Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды

010909 В заявке на данный патент заявляются права на привилегию предварительной заявки 60/471739,поданной 20 мая 2003, описание которой включено в это изобретение путем ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу получения усовершенствованных цитотоксических конъюгатов, содержащих мэйтансиноиды и связывающиеся с клетками агенты. Эти конъюгаты имеют терапевтическое применение, поскольку они доставляются в специфическую популяцию клеток нацеленным образом. Настоящее изобретение также относится к способу получения мэйтансиноидов, имеющих тиоловую функциональную группу, которые могут быть использованы при получении цитотоксических конъюгатов. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым мэйтансиноидам и к новым промежуточным соединениям в синтезе новых мэйтансиноидов. Уровень техники Появилось множество сообщений о попытках специфического таргетинга, опухолевых клеток при помощи конъюгатов моноклональное антитело-лекарственный препарат (Sela и др. в книге Immunoconjugates, с. 189-216 (С. Vogel, ред. 1987); Ghose и др., в Targeted Drugs, с. 1-22 (Е. Goldberg, ред. 1983);Mediated Delivery Systems, с. 25-53 (J. Rodwell, ред. 1988); Bumol и др., в Antibody Mediated Delivery Systems, с. 55-79 (J. Rodwell, ред. 1988. Цитотоксические лекарственные препараты, такие как метотрексат,даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С и хлорамбуцил, были конъюгированы с разнообразными мышиными моноклональными антителами. В некоторых случаях молекулы лекарственного препарата были присоединены к молекулам антитела через промежуточную молекулу носителя, такую как сывороточный альбумин (Garnett и др., Cancer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa и др., Cancer Immumol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo и др., Cancer Res. 47:1076-1080 (1980,декстран (Hurwitz и др., Appl Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi и др., Biochem. Pharmacol. 34:289-291(1988 или полиглутаминовая кислота (Tsukada и др., J. Natl Cane. Inst. 73:721-729 (1984); Kato и др., J.Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada и др., Br. J. Cancer 52:111-116 (1985. Для получения таких иммуноконъюгатов было использовано обширное множество линкерных технологий, причем были исследованы расщепляющиеся, а также нерасщепляющиеся линкеры. Однако в большинстве случаев полный цитотоксический потенциал лекарственных препаратов можно было использовать, только если молекулы лекарственного препарата могли высвобождаться из конъюгатов в немодифицированном виде в сайте-мишени. Один из расщепляющихся линкеров, который был использован для получения конъюгатов антитело-лекарственный препарат, представляет собой кислотно-лабильный линкер на основе цис-аконитовой кислоты, что использует преимущество кислотного окружения в различных внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы, встречающиеся в ходе рецепторно опосредованного эндоцитоза, и лизосомы. Shen и Ryser разработали этот способ для получения конъюгатов даунорубицина с макромолекулярными носителями (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981. Yang и Reisfeld использовали ту же самую методику, чтобы получить конъюгат даунорубицина с антителом против меланомы (J. NatlCane. Inst, 80:1154-1159 (1988. Кроме того, недавно Dillman и др. применили кислотно-лабильный линкер аналогичным образом, для получения конъюгатов даунорубицина с антителом против Т клеток (Cancer Res. 48:6097-6102 (1988.Trouet и др. использовали альтернативный подход, включающий присоединение даунорубицина к антителу через пептидную ножку (Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629 (1982. Это было выполнено, исходя из предположения, что из такого конъюгата может высвобождаться свободный лекарственный препарат под действием лизосомальных пептидаз. Однако при испытаниях цитотоксичности in vitro было установлено, что для конъюгатов антителолекарственный препарат редко достигается та же самая цитотоксическая эффективность, как для свободных неконъюгированных лекарственных препаратов. Это позволяет предположить, что механизмы, с помощью которых молекулы лекарственного препарата высвобождаются из антител, являются весьма неэффективными. В области иммунотоксинов было продемонстрировано, что конъюгаты, образовавшиеся за счет дисульфидных мостиков между моноклональными антителами и каталитически активными белковыми токсинами, обладают более высокой цитотоксичностью, чем конъюгаты, содержащие другие линкеры. См. статью Lambert и др., J. Biol Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert и др., в книге Иммунотоксины 175-209 (ред. A. Frankel, 1988); Ghetie и др., Cancer Res. 48:2610-2617 (1988). Это объясняется высокой внутриклеточной концентрацией глутатиона, который дает вклад в эффективное расщепление дисульфидной связи между молекулой антитела и токсином. Несмотря на это, имеется только несколько примеров, в которых сообщается о применении дисульфидных мостиков для получения конъюгатов между лекарственными препаратами и макромолекулами. Shen и др. описали превращение метотрексата в меркаптоэтиламидное производное, с последующим конъюгированием с поли-D-лизином через дисульфидную связь (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985. Кроме того, в некоторых публикациях описано получение конъюгатов содержащего трисульфид токсичного лекарственного препарата калихеамицина с антителами (Hamann и др., 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993), Hamann и др., Bioconjugate Chem.,-1 010909 13,40-46 (2002), Hamann и др., Bioconjugate Chem., 73,47-58 (2002. Одной причиной отсутствия конъюгатов связанных дисульфидной связью антител с лекарственными препаратами является недоступность цитотоксических лекарственных препаратов, несущих функциональную группу, содержащую атом серы, которую можно легко использовать для связывания лекарственного препарата с антителом с помощью дисульфидного мостика. Более того, затруднено химическое модифицирование существующих лекарственных препаратов без ухудшения их цитотоксического потенциала. Мэйтансиноиды представляют собой лекарственные препараты с высокой цитотоксичностью. Впервые мэйтансин был выделен Kupchan и др. из восточно-африканского кустарника Maytenus serrata, и было продемонстрировано, что он обладает в 100-1000 раз большей цитотоксичностью, чем традиционные противораковые хемиотерапевтические агенты, подобные метотрексату, даунорубицину и винкристину (U.S. Pat.3896111). В последующем было установлено, что некоторые микробы также продуцируют мэйтансиноиды, такие как мэйтансинол и С-3 сложные эфиры мэйтансинола (U.S. Pat.4151042). Синтетические С-3 сложные эфиры мэйтансинола и аналогов мэйтансинола также были описаны (Kupchan и др., J. Med. Chan. 21:31-37 (1978); Higashide и др., Nature 270:721-722 (1977); Kawai и др., Chem.Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984. Примеры аналогов мэйтансинола, из которых были приготовлены С-3 сложные эфиры, включают мэйтансинол с модификациями в ароматическом кольце (например, дехлоро) или в положении С-9, С-14 (например, гидроксилированная метильная группа), С-15, С-18, С-20 и С-4,5,С-3 сложные эфиры мэйтансинола естественного происхождения и синтетические можно подразделить на две группы:(a) С-3 сложные эфиры с простой карбоновой кислотой (U.S. Pat.4248870; 4265814; 4308268; 4308269; 4309428; 4317821; 4322348; и 4331598), и(b) С-3 сложные эфиры с производными N-метил-L-аланина (U.S. Pat.4137230; 4260608; 5208020; и Chem. Pharm. Bull. 12:3441 (1984. Было обнаружено, что сложные эфиры группы (b) обладают значительно более высокой цитотоксичностью, чем сложные эфиры группы (а). Мэйтансин представляет собой митотический ингибитор. Известно, что обработка L1210 клеток мэйтансином in vivo приводит к 67% клеток, накапливающихся в митозе (митотическое деление клеток). Сообщалось, что необработанные контрольные клетки демонстрируют митотический индекс в диапазоне между 3,2 и 5,8% (Sieber и др., 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976. Эксперименты с яйцами морского ежа и икрой моллюсков предполагают, что мэйтансин ингибирует митоз, препятствуя образованию микротрубочек за счет ингибирования полимеризации белка микротрубочек тубулина (Remillard и др., Science 189:1002-1005 (1975. Обнаружено, что in vitro суспензии клеток мышиного лейкоза Р 388, L1210, и LY5178 ингибируются мэйтансином при дозах от 10-3 до 10-1 мкг/мл, причем наиболее чувствительной была линия Р 388. Кроме того, было продемонстрировано, что мэйтансин представляет собой активный ингибитор роста in vitro клеток человеческой носоглоточной карциномы, и описано, что линия СЕМ острого лимфобластного лейкоза человека ингибируется при столь низкой концентрации как 10-7 мкг/мл (Wolpert-DeFillippes и др., Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975. Было продемонстрировано, что мэйтансин также является активным in vivo. Показано, что опухолевый рост в системе Р 388 лимфоцитарного лейкоза ингибируется более чем в 50-100-кратном диапазоне доз, что позволяет предположить высокий терапевтический индекс; кроме того, значительная ингибирующая активность может быть продемонстрирована в системе мышиного лейкоза L1210, в системе человеческой легочной карциномы Льюиса и в системе человеческой меланокарциномы В-16 (Kupchan,Fed. Proc. 33:2288-2295 (1974. Мэйтансиноиды, используемые в конъюгатах со связывающимися с клетками агентами, описаны в патентах U.S.5208020 и 5416064 и в статьях Chari и др., Cancer Res., 52: 127-131 (1992) и Liu и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 8618-8623 (1996). В этих конъюгатах связывающийся с клетками агент присоединяется с помощью дисульфидных связей к мэйтансиноиду DM1 [N2'-деацетилN2'-(3-меркапто-1-оксопропил)мэйтансин, 1, CAS Number: 139504-50-0, фиг. 1] В указанных выше патентах мэйтансиноидные лекарственные препараты, содержащие ацилированные боковые цепи N-метил-L-аланина, имеют формулы 2a, 2b В формуле 2a l представляет собой целое число от 1 до 10. Таким образом, в мэйтансиноидах формулы 2a имеется атом серы, присоединенный к незамещенной метиленовой группе (-CH2-S-). Полагают,что сульфгидрильная группа в таком мэйтансиноидном соединении или дисульфидная группа в связанном через дисульфидную связь конъюгате связывающегося с клетками агента с таким мэйтансиноидом является "незатрудненной, поскольку отсутствуют объемистые заместители при -углеродном атоме,смежном с сульфгидрильной или дисульфидной группой, которые вызывают стерические затруднения. В формуле 2b, m означает 0, 1, 2 или 3. Следовательно, мэйтансиноиды формулы 2b также имеют атом серы, присоединенный к незамещенной метиленовой группе, за исключением случаев, когда m=0, иR2=CH3 или CH2CH3. Если m=0, тогда в мэйтансиноиде имеется один заместитель при атоме углерода,несущем тиоловую функциональную группу или дисульфидную функциональную группу после конъюгирования со связывающимся с клетками агентом с помощью дисульфидной связи. Однако было обнаружено, что, поскольку в этом случае атом серы находится в -положении относительно карбонильной группы, эти мэйтансиноиды и конъюгаты таких мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами через дисульфидную связь являются нестабильными из-за их склонности к процессу элиминирования. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что присоединение мэйтансиноидов,несущих стерически затрудненную тиоловую группу (имеющую один или два заместителя при -атоме углерода, несущем тиоловую функциональную группу), к связывающимся с клетками агентам дает конъюгаты, которые обладают чрезвычайно улучшенной противоопухолевой активностью in vivo, по сравнению с конъюгатами, полученными с ранее описанными мэйтансиноидами, в которых отсутствует заместитель при -атоме углерода, несущем дисульфидную связь. Другим неожиданным открытием является то, что достигается улучшенная биологическая активность, когда стерическое затруднение является оптимальным на мэйтансиноидной стороне дисульфидной связи в конъюгатах. Кроме того, ацильная группа в боковой цепи ацилированной аминокислоты мэйтансиноида, несущей сульфгидрильную группу, должна обладать линейной цепочкой длиной по меньшей мере три атома углерода между карбонильной группой амида и атомом серы. Эти наблюдения показали, что связанные дисульфидной связью конъюгаты связывающегося с клетками агента и мэйтансиноида могут иметь такую конфигурацию, что замещения при двух -атомах углерода, несущих дисульфидную связь, могут привести к различным степеням стерического затруднения на каждой стороне дисульфидной связи. Соответственно, в настоящем изобретении описан синтез новых, стерически затрудненных тиол- и дисульфидсодержащих мэйтансиноидов, в которых имеется один или два алкильных заместителя при углеродном атоме, несущем атом серы. Кроме того, ацильная группа в боковой цепи ацилированной аминокислоты обладает линейной цепочкой длиной по меньшей мере три атома углерода между карбонильной группой амида и атомом серы. Кроме того, описано получение и биологическая оценка конъюгатов этих новых мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами. В одном воплощении изобретения описаны новые тиол- и дисульфидсодержащие мэйтансиноиды,имеющие моно- или диалкильное замещение при атоме углерода, несущем атом серы. Во втором воплощении настоящего изобретения описаны способы синтеза этих новых мэйтансиноидов. В третьем воплощении описаны способы присоединения этих новых мэйтансиноидов к связывающимся с клетками агентам. Эти конъюгаты используются в качестве терапевтических агентов, которые доставляются специфично к клеткам-мишеням и являются цитотоксическими. Эти конъюгаты обладают чрезвычайно улучшенной терапевтической эффективностью в моделях опухолей животных по сравнению с ранее описанными агентами.-3 010909 Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает Мэйтансиноид, имеющий в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20 десметил, боковую цепочку ацилированной аминокислоты с ацильной группой, несущей затрудненную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой CH3,C2H5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может представлять собой H, и в которой ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы; Соединение, представленное формулой 4'(CR7R8)l(CR9=CR10)pCCqAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ, в которой каждый заместитель R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может представлять собой H;A, B, D означают циклоалкил или циклоалкенил, имеющий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый заместитель R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5,линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый символ l, m, n, o, p, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5, при условии что по меньшей мере два из l, m, n, o, p, q, r, s и t не равны нулю одновременно;Z означает H, SR или -COR, в котором R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Соединение, представленное формулой 4', в которой R1 означает метил, R2 представляет собой H иZ означает H. Соединение, представленное формулой 4', в которой R1 и R2 представляют собой метил и Z означает H. Соединение, представленное формулой 4', в которой R1 означает метил, R2 представляет собой H иZ означает -SCH3. Соединение, представленное формулой 4', в которой R1 и R2 представляют собой метил и Z означает -SCH3. Соединение, представленное формулой (I-L), (I-D) или (I-D, L)-4 010909 каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил, или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может представлять собой H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z представляет собой H, SR или -COR, где R представляет собой линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; иMay означает мэйтансиноид, который имеет боковую цепочку при С-3, С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20-десметил; Описанное выше соединение, в котором R1 представляет собой метил, R2 означает H, каждый из R5,R6, R7 и R8 означает H, каждый l и m равен 1, n означает 0 и Z представляет собой H; Описанное выше соединение, в котором R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7, R8 означает H, l и m равны 1, n означает 0 и Z означает H; Описанное выше соединение, в котором R1 представляет собой метил, R2 означает H, каждый R5,R6, R7 и R8 означает H, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z означает -SCH3; Описанное выше соединение, в котором R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7, R8 означает H, l и m равны 1, n равно 0 и Z означает -SCH3; Соединение, представленное формулой 4 в которой Y представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, где каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может представлять собой H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может быть равно 0; иZ означает H, SR или -COR, где R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; Соединение формулы 4, в которой R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H; каждый l и m равен 1; n равно 0; Z означает H; Соединение формулы 4, в которой R1 и R2 означают метил; каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, l и m равны 1; n равно 0; Z означает H; Соединение формулы 4, в которой R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z представляет собой -SCH3; Соединение формулы 4, в которой R1 и R2 означают метил, каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, l и m равны 1, n равно 0 и Z означает -SCH3; Конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащий по меньшей мере-5 010909 один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представляет собой любое из вышеописанных соединений; Любой из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором связывающийся с клетками агент содержит по меньшей мере один связывающий сайт антитела,предпочтительно MY9, гуманизированного или с перелицованной поверхностью MY-9, гуманизированного или с перелицованной поверхностью анти-В 4, или гуманизированного или с перелицованной поверхностью С 242. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество любого из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, их фармацевтически приемлемых солей или сольватов, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель; Способ этерификации мэйтансиноида в положениях С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил, аминокислотой с ацилированной боковой цепочкой, где ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную функциональную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода,фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может представлять собой H, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку протяженностью по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы, причем указанный способ включает взаимодействие мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил, с ацилированной аминокислотой, где ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную группу. Способ этерификации мэйтансиноида с целью получения сложного эфира мэйтансиноида, представленного формулой (IV-L), (IV-D) или (IV-D, L) в которой Y2 представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, где каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может представлять собой H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный циклический алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, n может быть равно 0;Z2 представляет собой группу SR или COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; иMay представляет собой мэйтансиноид; причем указанный способ включает в себя взаимодействие указанного мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с соединением формулы (III-L), (III-D) или в которой Y2 представляет собой (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, где каждый R1 и R2 независимо означает CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный ра-6 010909 дикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0; иZ2 представляет собой группу SR или COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; Вышеупомянутый способ, в котором R1 представляет собой метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H; каждый l и m равен 1; n означает 0; Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III) представлено формулой (III-L); Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-L) представляет собой соединение 15a (S,S), 15b (S,R) или смесь 15a (S,S) и 15b (S,R); Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-D) представляет собой соединение 15 (R,S), 15 (R,R) или смесь 15 (R,S) и 15 (R,R); Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-D, L) представляет собой рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, для того, чтобы образовались соединения структуры 15; Вышеупомянутый способ, в котором смесь 15a (S,S) и 15b (S,R) получают с помощью способа, который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы образовалось соединение 13;(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-L-аланином с образованием указанной смеси соединений 15a (S,S) и 15b (S,R); Вышеупомянутый способ, в котором соединение 15a (S,S) получают способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 20 с N-метил-L-аланином с образованием указанного соединения 15a (S,S). Вышеупомянутый способ, в котором соединение 15b (S,R) получают способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 25 с N-метил-L-аланином с образованием указанного соединения 15b (S,R). Описанный выше способ, в котором смесь соединений 15 (R,S) и 15 (R,R) получают с помощью способа, включающего в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(2) превращение соединения 13 в его N-гидроксисукцинимидный эфир 14,(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-D-аланином с образованием указанной смеси соединений 15 (R,S) и 15 (R,R). Вышеупомянутый способ, в котором рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, давая соединения структуры 15, получают с помощью способа, включающего в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы получить соединение 13;(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим N-метилаланином с образованием рацемического N-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, с образованием соединений структуры 15,Вышеупомянутый способ, в котором R1 и R2 представляют собой метил; каждый R5, R6, R7 и R8 означает H; каждый l и m равен 1; n означает 0; Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-L) представляет собой соединение-7 010909 10(S), содержащее N-метил-L-аланин; Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-D) представляет собой соединение 10(R), содержащее N-метил-D-аланин; Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III-D, L) представляет собой соединение 10(S,R), содержащее рацемический N-метилаланин; Вышеупомянутый способ, в котором соединение 10, содержащее N-метил-L-аланин, N-метил-Dаланин или рацемический N-метилаланин, получено способом, который включает в себя:N-метилаланином с образованием указанного соединения 10, содержащего N-метил-L-аланин, N-метилD-аланин или рацемический N-метилаланин; Способ получения мэйтансиноида с помощью любого из вышеупомянутых способов, с разделением диастереоизомеров, если они присутствуют, и очисткой мэйтансиноида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на силикагеле с циано-связями; Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим реакционноспособную дитиогруппу или сульфгидрильную группу. Вышеупомянутый способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором реакционноспособная дитиогруппа представляет собой дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу; Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из упомянутых выше способов, и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную или галоидацетильную группу; Способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноида формулы 42'(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый A, B и D независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m, n, о, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, о, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно; иZ2 представляет собой группу SR или -COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый A, B и D независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m, n, o, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, o, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно; иZ2 является группой SR или -COR, в которой R представляет собой линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42', в котором соединение формулы (I) представлено формулой (I-L). Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42', в которой R1 представляет собой метил и R2 является H. Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42 в которой Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 представляет собой группу SR или COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в которой Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 представляет собой группу SR или COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 4 а, в котором соединение формулы (III) представлено формулой (III-L); Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4 а,в котором указанным соединением формулы (III-L) является соединение 15a (S,S), 15b (S,R) или смесь 15a (S,S) и 15b (S,R); Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4 а,в котором указанным соединением формулы (III-D) является соединение 15 (R,S), 15 (R,R) или смесь 15(R,S) и 15 (R,R); Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4 а,в котором указанным соединением формулы (III-D, L) является рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, с образованием соединений структуры 15; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4 а,в котором смесь 15a (S,S) и 15b (S,R) получают способом, который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-L-аланином с образованием указанной смеси соединений 15a (S,S) и 15b (S,R); Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола, в котором указанное соединение 15a (S,S) получают способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 20 с N-метил-L-аланином с получением соединения 15a (S,S). Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола, в котором указанное соединение 15b (S,R) получают способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 25 с N-метил-L-аланином с получением соединения 15b (S,R); Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноидов формулы 4 а, в котором смесь соединений 15 (R,S) и 15 (R,R) может быть получена способом, который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-D-аланином с получением указанной смеси соединений 15 (R,S) и 15 (R,R). Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноидов формулы 4 а, в котором рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, получают способом, который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы получить соединение 13;(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим N-метилаланином, чтобы получить рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, с образованием соединений структуры 15,Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b,в которой R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7, R8 означает H; l и m равны 1, n равно 0; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b,в котором указанное соединение формулы (III-L) представляет собой соединение 10, содержащее Nметил-L-аланин; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b,в котором указанное соединение формулы (III-D) представляет собой соединение 10, содержащее Nметил-D-аланин;- 11010909 Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b,в котором указанное соединение формулы (III-D, L) представляет собой соединение 10, содержащее рацемический N-метилаланин; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b,в котором соединение 10, содержащее N-метил-L-аланин, N-метил-D-аланин или рацемический Nметилаланин, получают способом, который включает в себя:N-метилаланином с образованием соединения 10, содержащего N-метил-L-аланин, N-метил-D-аланин или рацемический N-метилаланин; Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола соединением 10 с последующим разделением диастереоизомеров, если они присутствуют, и очисткой мэйтансиноида методом ВЭЖХ на силикагеле с циано-связями, который дополнительно включает восстановление дисульфидной связи с получением мэйтансиноидов формулы 4b; Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4b, и взаимодействие мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя сульфгидрильную группу или реакционноспособную дитиогруппу, предпочтительно дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу; Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов этерификации мэйтансинола, чтобы получить мэйтансиноиды формулы 4b, и взаимодействие мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную или галоидацетильную группу. Способы терапии с использованием вышеупомянутых конъюгатов. Соединения формулы (III) в которой Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может быть равно 0; иZ2 представляет собой группу SR или -COR, в которой R означает линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Соединения 10(S), 10(R) или рацемическое соединение 10; Способ получения соединения 10, содержащего N-метил-L-аланин, N-метил-D-аланин или рацемический N-метилаланин, который включает в себя:N-метилаланином, чтобы получить указанное соединение 10, содержащее N-метил-L-аланин, N-метил-D- 12010909 аланин или рацемический N-метилаланин. Смесь соединений 15a (S,S) и 15b (S,R); Способ получения смеси соединений 15a (S,S) и 15b (S,R), включающий в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-L-аланином с получением указанной смеси соединений 15a (S,S) и 15b (S,R); Смесь соединений 15 (R,S) и 15 (R,R). Способ получения смеси соединений 15 (R,S) и 15 (R,R), который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-D-аланином, чтобы получить указанную смесь соединений 15 (R,S) и 15 (R,R). Рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15; Способ получения рацемического N-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой,имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, который включает в себя:(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим N-метилаланином с образованием рацемического N-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, для того, чтобы получить соединение структуры 15; Соединение 15a (S,S); Соединение 15b (S,R); Способ получения соединения 15a (S,S), который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 20 с N-метил-L-аланином с получением указанного соединения 15a(S,S); Способ получения соединения 15b (S,R), который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 25 с N-метил-L-аланином с получением указанного соединения 15b(S,R). Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество любого из вышеупомянутых мэйтансиноидных соединений, их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель; Вышеупомянутая фармацевтическая композиция, содержащая мэйтансиноидное соединение и дополнительно содержащая антитело. Способ индукции гибели смерти клеток в выбранных популяциях клеток, который включает в себя контактирование клеток-мишеней или тканей, содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством любого из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами, их солей или сольватов. Краткое описание фигур На фиг. 1 продемонстрированы структуры ранее описанных мэйтансиноидов. На фиг. 2 продемонстрированы структуры некоторых мэйтансиноидов настоящего изобретения. На фиг. 3a-d показаны схемы синтеза репрезентативных мэйтансиноидов настоящего изобретения. На фиг. 4a,b представлена эффективность in vitro новых мэйтансиноидов настоящего изобретения. На фиг. 4c,d графически сопоставлена in vitro эффективность новых мэйтансиноидов настоящего изобретения с описанными ранее мэйтансиноидами. На фиг. 5a-d показаны схемы получения конъюгатов связывающихся с клетками агентов с мэйтансиноидами настоящего изобретения. На фиг. 6 графически продемонстрирована эффективность in vitro конъюгатов связывающихся с клетками агентов-мэйтансиноидов настоящего изобретения. На фиг. 7 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность in vivo huC242- 13010909 мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами huC42 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов опухоли ободочной кишки человека HT-29. На фиг. 8 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность in vivo huC242 мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами huC242 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов опухоли ободочной кишки человека COLO 205. На фиг. 9 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность in vivo MY9-6 мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами MY9-6 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов промиелоцитарного миелоидного лейкоза HL60. На фиг. 10 показан результат оценки цитотоксичности in vitro конъюгата huMy9-6-DM4 на клеткахмишенях HL-60 и на клетках Namalwa, не являющихся мишенями. На фиг. 11 показана оценка эффективности конъюгата huMy9-6-DM4 in vivo против ксенотрансплантированных опухолей человека HL-60 на мышах SCID и ее сопоставление с эффективностью конъюгата huMy9-6 с ранее описанным мэйтансиноидом (huMy9-6-DM1). На фиг. 12 показан результат оценки цитотоксичности конъюгата huB4-DM4 in vitro на клеткахмишенях Ramos и на клетках Colo 205, не являющихся мишенями. На фиг. 13a показана оценка эффективности конъюгата huB4-DM4 in vivo против ксенотрансплантированных опухолей человека Ramos на мышах SCID, и на фиг. 13b показаны изменения массы тела животных в течение периода испытаний. Осуществление изобретения В этом изобретении раскрыты новые, стерически затрудненные тиол- и дисульфидсодержащие мэйтансиноиды, в которых -атом углерода, несущий атом серы, имеет один или два алкильных заместителя. Кроме того, в изобретении раскрыт способ синтеза этих новых мэйтансиноидов. Дополнительно описаны новые соединения, которые применяются в качестве промежуточных соединений в синтезе новых мэйтансиноидов. Кроме того, в этом изобретении описано получение конъюгатов этих новых мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами. Из уровня техники выявлено, что в высшей степени трудно модифицировать существующие лекарственные препараты без снижения их цитотоксического потенциала. В описанном изобретении эта проблема решена путем раскрытия способа синтеза новых мэйтансиноидных молекул, содержащих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу. Раскрытые новые мэйтансиноиды сохраняют, а в некоторых случаях даже усиливают, цитотоксическую эффективность ранее описанных мэйтансиноидов. Конъюгаты мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами в полной мере обеспечивают,чтобы цитотоксическое действие мэйтансиноидов было использовано направленным образом только против нежелательных клеток, тем самым устраняя побочные эффекты, вызванные повреждением здоровых клеток, не являющихся мишенями. Таким образом, изобретение предоставляет полезные агенты и новые способы их получения для элиминирования пораженных болезнью или аномальных клеток, которые следует уничтожить или лизировать, таких как опухолевые клетки (в частности, клетки солидной опухоли), клетки, инфицированные вирусом, клетки, инфицированные микроорганизмами, клетки, инфицированные паразитами, аутоиммунные клетки (клетки, которые продуцируют аутоантитела), активированные клетки (которые вовлечены в отторжение трансплантата или в реакцию трансплантат против хозяина), или любые другие типы пораженных болезнью или аномальных клеток, при этом побочные эффекты проявляются в минимальной степени. Таким образом, в этом изобретении раскрыт способ получения улучшенных цитотоксических конъюгатов, содержащих новые мэйтансиноиды и связывающиеся с клетками агенты с чрезвычайно улучшенной биологической активностью по сравнению с ранее описанными мэйтансиноидами и связывающимися с клетками агентами. В изобретении, кроме того, раскрыт способ синтеза мэйтансиноидных производных, в которых имеется стерически затрудненная тиоловая или дисульфидная функциональная группа, которая обеспечивает химическое присоединение к связывающемуся с клетками агенту, и в то же время проявляющих высокую цитотоксичность или в связанном виде, или в освобожденном виде, или в обоих состояниях. Цитотоксический конъюгат согласно настоящему изобретению содержит один или несколько мэйтансиноидов, связанных со связывающимся с клетками агентом. Для того чтобы связать мэйтансиноид со связывающимся с клетками агентом, сначала этот мэйтансиноид необходимо модифицировать. Мэйтансиноиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении с целью получения мэйтансиноидов, которые способны быть присоединенными к связывающемуся с клетками агенту, хорошо известны из уровня техники и они могут быть выделены из природных источников согласно известным способам или приготовлены синтетически в соответствии с известными способами. Примеры подходящих мэйтансиноидов включают мэйтансинол и аналоги мэйтансинола. Примеры подходящих аналогов мэйтансинола включают те, в которых имеется модифицированное ароматическое кольцо, и те, в которых имеются модификации в других положениях. Конкретные примеры подходящих аналогов мэйтансинола, имеющих модифицированное ароматическое кольцо, включают:(2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/-С-19-дехлоро (U.S. Pat.4361650 и 4307016) (получен путем деметилирования с использованием Streptomyces или Actinomyces или путем дехлорирования с использованием LAH);(3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлоро (U.S. Pat.4294757) (получен путем ацилирования с использованием ацилхлоридов). Конкретные примеры подходящих аналогов мэйтансинола, имеющих модификации в других положениях, включают:(1) C-9-SH (U.S. Pat.4424219) (получен путем взаимодействия мэйтансинола с H2S или P2S5);(4) С-15-гидрокси/ацилокси (U.S. Pat.4364866) (получен путем превращения мэйтансинола под действием Streptomyces);(6) C-18-N-деметил (U.S. Pat.4362663 и 4322348) (получен путем деметилирования мэйтансинола под действием Streptomyces);(7) 4,5-деокси (U.S. Pat.4371533) (получен путем восстановления мэйтансинола трихлоридом титана/литий-алюминийгидридом (LAH. Для обеспечения связывания мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом этот мэйтансиноид включает в себя связывающую функциональную группу. Эта связывающая группа содержит химическую связь, которая обеспечивает высвобождение полностью активных мэйтансиноидов в конкретном месте. Подходящие химические связи хорошо известны из уровня техники и включают дисульфидные связи, кислотно-лабильные связи, фотолабильные связи, связи, лабильные к пептидазе, и связи, лабильные к эстеразе. Предпочтительными являются дисульфидные связи. В описании патента США 5208020, включенного в это изобретение путем отсылки, раскрыто получение мэйтансиноидов, несущих такие связи. Согласно настоящему изобретению связывающая функциональная группа содержит стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную группу. Особенно предпочтительными мэйтансиноидами, включающими в себя связывающую группу, которая содержит реакционноспособную химическую группу, являются С-3 сложные эфиры мэйтансинола и его аналогов, причем связывающая группа содержит стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную связь. Многие положения в мэйтансиноидах могут служить в качестве места для химического присоединения связывающей группы. Например, можно ожидать, что С-3 положение, содержащее гидроксильную группу, С-14 положение, модифицированное гидроксиметилом, С-15 положение, модифицированное гидроксигруппой, и С-20 положение, содержащее гидроксигруппу, все будут эффективными. Однако С-3 положение является предпочтительным и особенно предпочтительным является С-3 положение мэйтансинола. Кроме того, хотя синтез сложных эфиров мэйтансинола, имеющих связывающую группу, описан ниже на примере дисульфидной связи, содержащей связывающие группы в С-3 положении, специалист в этой области техники может понять, что связывающие группы с другими химическими связями, которые описаны выше, также могут быть использованы в настоящем изобретении, как и другие мэйтансиноиды и другие связывающие положения, которые описаны выше. Структуры различных мэйтансиноидов настоящего изобретения представлены на фиг. 2. Синтез мэйтансиноидов, имеющих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу, может быть описан со ссылкой на фиг. 3. Во многих приведенных ниже иллюстративных способах используются тиолсодержащие мэйтансиноиды:DM3 (4 а) и DM4 (4b) представлены следующими структурными формулами: Цитотоксичность in vitro новых стерически затрудненных тиол- и дисульфидсодержащих мэйтансиноидов изобретения может быть оценена по их способности подавлять пролиферацию различных нежелательных клеточных линий in vitro (фиг. 4). Например, клеточные линии, такие как линия карциномы молочной железы человека SK-Br-3, или клеточная линия плоскоклеточного рака человека KB, могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих новых мэйтансиноидов. Клетки, подлежащие оценке, могут быть обработаны соединениями в течение 72 ч, и измеряют долю выживших клеток в прямом анализе известными способами. Затем, из результатов анализа могут быть рассчитаны величины ингибирующих концентраций (IC50). Получение мэйтансиноидов, имеющих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу Новыми мэйтансиноидами изобретения являются соединения, имеющие в положении С-3, С-14 гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил боковую цепочку ацилированной аминокислоты с ацильной группой, содержащей затрудненную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать H, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы. Предпочтительно мэйтансиноидные соединения представлены формулой 4'(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенныйй фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H;A, B, D представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода,простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или- 16010909 алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m, n, o, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, o, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно;Z представляет собой H, SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. В предпочтительных вариантах воплощения соединения, представленного формулой 4', R1 означает метил, R2 представляет собой H и Z означает H; R1 и R2 представляют собой метил и Z означает H; R1 означает метил, R2 означает H и Z представляет собой группу -SCH3; или R1 и R2 означают метил и Z представляет собой -SCH3. Более предпочтительно мэйтансиноиды представляют собой соединения, представленные формулами (I-L), (I-D) или (I-D, L) в которых Y представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z представляет собой H, SR или -COR, в которых R означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; иMay представляет собой мэйтансиноид, в котором имеется боковая цепочка в положении С-3, С-14 гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил. Более предпочтительным является С-3 сложный эфир, который представляет собой соединение представленное формулой 4 в которой заместители определены выше. Особенно предпочтительными являются любые из вышеупомянутых соединений, в которых R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z представляет собой H; соединения, в которых R1 и R2 означают метил, каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, l и m равны 1, n равно 0 и Z означает H; соединения, в которых R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z означаетm равны 1, n равно 0 и Z означает -SCH3. Кроме того, предпочтительным является L-аланиловый стереоизомер, поскольку он является наиболее полезньм для конъюгатов изобретения. Предпочтительные воплощения соединений формулы 4 включают DM3 и DM4, т.е. мэйтансиноид формулы 4, в которой Z означает H, R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, l и m равны 1 и n равно 0 (DM3, соединение 4 а); мэйтансиноид формулы 4, в которой Z означает H, оба R1 и R2 представляют собой метил, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, l и m равны 1 и n равно 0 (DM4, соединение 4b); мэйтансиноид формулы 4, в которой R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1, n равно 0 и Z означает-SCH3; и мэйтансиноид формулы 4, в которой R1 и R2 означают метил, каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, l и m равны 1, n равно 0 и Z означает группу -SCH3. Примеры линейных алкилов или алкенилов, имеющих от 1 до 10 атомов углерода, включают (но не ограничиваются указанными) метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, пропенил, бутенил и гексенил. Примеры разветвленных алкилов или алкенилов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, включают(но не ограничиваются указанными) изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, 1 этилпропил, изобутенил и изопентенил. Примеры циклических алкилов или алкенилов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, включают (но не ограничиваются указанными) циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклопентенил,и циклогексенил. Простые арилы включают арилы, имеющие от 6 до 10 атомов углерода, и замещенные арилы включают арилы, имеющие от 6 до 10 атомов углерода, несущие по меньшей мере один алкильный заместитель, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкоксизаместитель, такой как метокси, этокси, или галоидный заместитель, или нитрозаместитель. Примеры простого арила, который содержит от 6 до 10 атомов углерода, включают фенил и нафтил. Примеры замещенного арила включают нитрофенил, динитрофенил. Гетероциклические ароматические радикалы включают группы, в которых имеется 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из N, O или S. Гетероциклоалкильные радикалы включают циклические соединения, которые включают в себя 310-членные кольцевые системы, содержащие один или два гетероатома, выбранных из N, O или S. Примеры гетероциклических ароматических радикалов включают пиридил, нитро-пиридил, пирролил, оксазолил, тиенил, тиазолил и фурил. Примеры гетероалкильных радикалов включают дигидрофурил, тетрагидрофурил, тетрагидропирролил, пиперидинил, пиперазинил и морфолино. Новые мэйтансиноиды, имеющие стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу, могут быть получены с помощью следующих вновь разработанных способов. Синтез мэйтансиноидов На фиг. 3a показаны стадии синтеза мэйтансиноида DM4 (4b). Изобутиленсульфид (5) реагирует с анионом ацетонитрила, образуя меркапто-соединение 6. Гидролиз 6 под действием основания дает 4 меркапто-4-метилпентановую кислоту (7). Превращение 7 в дисульфид 8 достигается путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты (MeSSO2Me). Превращение 8 в Nгидроксисукцинимидный эфир 9, с последующим взаимодействием с N-метил-L-аланином, обеспечивает карбоновую кислоту 10, которую очищают хроматографией на колонке с силикагелем. При взаимодействии 10 с мэйтансинолом (11) в присутствии N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и хлористого цинка получают смесь N-ацил-N-метил-L-аланилового мэйтансиноида L-DM4SMe (4e) и N-ацил-N-метил-Dаланилмэйтансиноида D-DM4SMe (4f). Эту смесь диастереоизомеров разделяют с помощью ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. Целевой изомер, содержащий L-аминокислоту 4 е, собирают и восстанавливают дитиотреитолом, чтобы получить тиолсодержащий L-аминоацилмэйтансиноид DM4 (4b), который снова очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. На фиг. 3b показаны стадии синтеза мэйтансиноида DM3 (4 а). Превращают 4-меркаптопентановую кислоту (12) в метилдисульфид путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты,чтобы получить 13. Превращение 13 в N-гидроксисукцинимидный эфир 14, с последующим взаимодействием с N-метил-L-аланином, обеспечивает карбоновую кислоту 15, которую очищают хроматографией на колонке с силикагелем. При взаимодействии 15 с мэйтансинолом (R) в присутствии N,N'дициклогексилкарбодиимида (DCC) и хлористого цинка получают смесь N-ацил-N-метил-Lаланилмэйтансиноида L-DM3SSMe, (4 с) и N-ацил-N-метил-D-аланилмэйтансиноида D-DM3SSMe (4d). Эту смесь диастереоизомеров разделяют методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. Целевой изомер, содержащий L-аминокислоту, собирают и восстанавливают дитиотреитолом, получая мэйтансиноид DM3 (4 а), содержащий меркапто-L-аминокислоту, который снова очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. На фиг. 3c и 3d показан синтез DM3, имеющего или (S)-4-метилдитио-1-оксопентильную функциональную группу, или (R)-4-метилдитио-1-оксопентильную группу. Превращение (R)-1,3-бутандиола (16) в соответствующий дитозилат 17, с последующим взаимодействием с цианидом натрия и этилксантатом(15 а). При взаимодействии с мэйтансинолом, как описано выше для соединения 15, образуются два диастереоизомера L-DM3SMe 4g и 4h. Аналогично, (S)-1,3-бутандиол (21) превращают в (R)-4 метилдитиопентановую кислоту 24 и затем в соединение 15b. При взаимодействии с мэйтансинолом, как описано выше, получают два диастереоизомера DM3SMe, 4k и 4l. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил аминокислотой с ацилированной боковой цепочкой, в которой ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать H, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с ацилированной аминокислотой, в которой ацильная группа несет защищенную сульфгидрильную группу. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение представляет способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноида формулы 42'(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый A, B и D независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m, n, o, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, o, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно; иZ2 представляет собой SR или -COR, в которых R означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3-10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый A, B и D независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m, n, o, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, o, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно; иZ2 представляет собой SR или -COR, в которых R означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Предпочтительно соединение формулы (I) представлено формулой (I-L) и, также предпочтительно,R1 означает метил и R2 означает H. В более предпочтительном воплощении настоящее изобретение обеспечивает способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42 в которой Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный или разветвленный или алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10- 20010909 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо означает H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил,имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал,причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3 в которых Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R5, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0; иZ2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Диастереоизомеры могут быть разделены методом ВЭЖХ на силикагеле с циано-связями. В более предпочтительном воплощении настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансиноида с целью получения сложного эфира мэйтансиноида, представленного формулами в которых Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10- 21010909 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; иMay представляет собой мэйтансиноид; причем указанный способ включает в себя взаимодействие указанного мэйтансиноида в положении С-3,С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с соединением формулы (III-L), (III-D) или (IIID, L) в которых Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0; иZ2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. В еще более предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42 в которой Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 представляет собой независимо CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,- 22010909 имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола в положении С-3 с соединением формулы (III-L), (III-D) или (III-D, L) в которых Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0;Z2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Предпочтительно соединение, представленное формулой (I), является L-стереоизомером. В указанных выше способах предпочтительно, чтобы R1 означал метил, R2 означал H, каждый R5,R6, R7 и R8 представлял собой H, каждый l и m был равен 1 и n означал 0; или чтобы R1 и R2 означали метил, каждый R5, R6, R7 и R8 означал H, l и m были равны 1 и n означал 0. При получении DM3 соединение формулы (III-L) представляет собой 15a (S,S), 15b (S,R) или смесь 15a (S,S) и 15b (S,R); соединение формулы (III-D) представляет собой N-метил-D-аланин, ацилированный рацемической ацильной группой или ацильной группой, имеющей или R-, или S-хиральность, чтобы образовались соединения 15; и соединение формулы (III-D, L) представляет собой рацемический Nметилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Rили S-хиральность, чтобы образовались соединения структуры 15,Смесь 15a (S,S) и 15b (S,R) может быть получена способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-L-аланином, чтобы получить указанную смесь соединений 15a (S,S) и 15b (S,R). Аналогично, смесь соединений 15 (R,S) и 15 (R,R) может быть получена способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 14 с N-метил-D-аланином с образованием указанной смеси соединений 15 (R,S) и 15 (R,R). Рацемический N-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, может быть получен способом, который включает в себя:- 23010909 рацемического N-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет R- или S-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15; Соединение 15a (S,S) может быть получено в процессе, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 20 с N-метил-L-аланином с образованием указанного соединения 15a (S,S). Соединение 15b (S,R) может быть получено способом, который включает в себя:(3) взаимодействие соединения 25 с N-метил-L-аланином с образованием указанного соединения 15b (S,R). При получении DM4, соединение формулы (III-L) представляет собой соединение 10, содержащееN-метил-L-аланин; соединение формулы (III-D) представляет собой соединение 10, содержащее Nметил-D-аланин, и соединение формулы (III-D, L) представляет собой соединение 10, содержащее рацемический N-метилаланин. Соединение 10, содержащее N-метил-L-аланин, N-метил-D-аланин или рацемический Nметилаланин, получают способом, который включает в себя:N-метилаланином, чтобы получить соединение 10, содержащее N-метил-L-аланин, N-метил-D-аланин или рацемический N-метилаланин. Согласно настоящему изобретению соединения формулы (III) также являются новыми в которых Y2 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0; иZ2 означает SR или -COR, в которых R представляет собой линейный алкил, разветвленный алкил или циклический алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал. Соединения формулы (III) могут быть легко получены соединения специалистом в этой области техники с помощью способов, аналогичных описанным выше для получения соединений 10 и 15,Цитотоксичность мэйтансиноидов in vitro Цитотоксичность in vitro мэйтансиноидов настоящего изобретения продемонстрирована на фиг. 4. Новые мэйтансиноиды (4 с, 4 е), несущие затрудненную дисульфидную связь, высокоэффективны в отношении испытанных клеточных линий. Так, 4 с уничтожает клетки А-375 и клетки SK-Br-3 при значенияхIC50, равных 1,510-11 М и 7,010-12 М соответственно. Аналогично, мэйтансиноид 4 е также высокоэффективен со значением IC50, равным 3,210-11 М и 9,010-12 М в отношении клеток А-375 и SK-Br-3 соответственно. Сопоставление эффективности in vitro затрудненного тиолсодержащего мэйтансиноида 4 а настоящего изобретения с эффективностью ранее описанного мэйтансиноида 1 (фиг. 4 с, d) показывает,что новые мэйтансиноиды обладают в 20-50 раз большей эффективностью, чем описанные ранее.- 24010909 Получение связывающихся с клетками агентов Эффективность соединений изобретения в качестве терапевтических агентов зависит от надлежащего выбора подходящего связывающегося с клетками агента. Связывающиеся с клетками агенты могут быть любого известного в настоящее время типа или соединениями, которые станут известными, и включают пептиды и непептиды. Обычно они могут представлять собой антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы, транспортирующие питательные вещества (такие, как трансферрин), или любые другие связывающиеся с клетками молекулы или соединения. Более конкретные примеры связывающихся с клетками агентов, которые могут быть использованы,включают поликлональные антитела; моноклональные антитела; фрагменты антител, такие как Fab, Fab', и F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983);Spring и др., J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff и др., Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960; интерфероны (например, альфа-, бета-, гамма-); лимфокины, такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; гормоны, такие как инсулин, TRH (гормон, высвобождающий тиреотропин), MSH (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены; факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как эпидермальный фактор роста (EGF),трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарный - макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984; трансферрин (O'Keefe и др.,J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985; и витамины, такие как фолат. Методики на основе моноклональных антител обеспечивают получение в высшей степени специфических связывающихся с клетками агентов в виде специфических моноклональных антител. Из уровня техники особенно хорошо известны методики создания моноклональных антител, полученных путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любых других млекопитающих представляющим интерес антигеном, таким как неповрежденные клетки-мишени, антигены, выделенные из клетки-мишени, цельный вирус, ослабленный цельный вирус, и вирусные белки, такие как белки оболочки вируса. Кроме того,могут быть использованы сенсибилизированные человеческие клетки. Другой способ создания моноклональных антител заключается в применении фаговых библиотек scFv (одноцепочечная вариабельная область), конкретно человеческих scFv (см., например, Griffiths и др., патенты США 5885793 и 5969108;McCafferty и др., WO 92/01047; Liming и др., WO 99/06587). Кроме того, также могут быть использованы антитела с замененной поверхностью, раскрытые в патенте США 5639641, как и гуманизированные антитела. Подбор подходящего связывающегося с клетками агента представляет собой предмет выбора, и зависит от конкретной популяции клеток, которая будет выбрана в качестве мишени, однако обычно предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, если подходящие являются доступными. Например, моноклональное антитело MY9 представляет собой мышиное антитело IgG1, которое специфически связывается с антигеном CD33 J.D. Griffin и др. Leukemia Res., 8, 521 (1984), и может быть использовано, если клетки-мишени экспрессируют CD33, как при заболевании острым миелогенным лейкозом (AML). Аналогично, моноклональное антитело антиВ 4 представляет собой мышиное антитело IgG1, которое связывается с антигеном CD19 на В клетках Nadler и др., J. Immunol. 131, 244-250(1983), и может быть использовано, если клетки-мишени представляют собой В-клетки или пораженные болезнью клетки, которые экспрессируют этот антиген, как в случае неходжкинской лимфомы или хронического лимфобластного лейкоза. Аналогично, моноклональное антитело С 242, которое связывается с антигеном CanAg, (патент США 5552293), может быть использовано для лечения опухолей, экспрессирующих CanAg, таких как колоректальный, панкреатический рак и рак желудка. Кроме того, GM-CSF, который связывается с миелоидными клетками, может быть использован в качестве связывающегося с клетками агента для пораженных болезнью клеток при остром миелогенном лейкозе. Лимфокин IL-2, который связывается с активированными Т-клетками, может быть использован для предупреждения отторжения пересаженного трансплантата, для терапии и предупреждения реакции трансплантата против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. MSH, который связывается с меланоцитами, может быть использован для лечения меланомы. Фолиевая кислота может быть использована для нацеливания на фолатный рецептор, экспрессируемый на опухолях яичников и других опухолях. Эпидермальный фактор роста может быть использован для нацеливания на сквамозные опухоли,такие как рак легких, головы и шеи. Соматостатин может быть использован для нацеливания на нейробластомы и другие типы опухолей. Раки молочной железы и яичек могут быть успешно сделаны мишенями при помощи эстрогена (или аналогов эстрогена) или андрогена (или аналогов андрогена), соответственно, в качестве связывающихся- 25010909 с клетками агентов. Получение цитотоксических конъюгатов Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащий по меньшей мере один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором связывающийся с клетками агент присоединен к мэйтансиноиду с использованием тиоловой или дисульфидной функциональной группы, которая находится в ацильной группе аминокислоты с ацилированной боковой цепочкой, созданной в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С 15-гидрокси или С-20-десметил мэйтансиноида, и в которой ацильная группа аминокислоты с ацилированной боковой цепочкой имеет соответствующую тиоловую или дисульфидную группу, расположенную при атоме углерода, который имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать H, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной групп и атомом серы. Предпочтительный конъюгат связывающегося с клетками агента содержит по меньшей мере один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представлен формулой 41'(CR7R8)l(CR9=CR10)p(CC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(CC)sBt(CR3R4)nCR1R2S-, в которой каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может представлять собой H; каждый A, B и D независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 и R12 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и каждый l, m, n, o, р, q, r, s и t независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из l, m, n, o, р, q, r, s и t не равны нулю одновременно. Предпочтительно R1 означает метил и R2 означает H, или R1 и R2 представляют собой метил. Еще более предпочтительный конъюгат связывающегося с клетками агента содержит по меньшей мере один мэйтансиноид, присоединенный к связывающемуся с клетками агенту, в котором мэйтансиноид представлен формулой (II-L), (II-D) или (II-D, L) в которой Y1 представляет собой группу (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-, в которой- 26010909 каждый R1 и R2 независимо представляет собой CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, R2 может означать H; каждый R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой H, CH3, C2H5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; каждый l, m и n независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n может означать 0; иMay представляет собой мэйтансинол, который несет боковую цепочку в положении С-3, С-14 гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил. Еще более предпочтительным является конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представлен формулой 41 в которой заместители такие же, как определено выше для формулы (II). Особенно предпочтительными являются любые из вышеупомянутых соединений, в которых R1 означает метил, R2 означает H, каждый R5, R6, R7 и R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1 и n равно 0; и те, в которых R1 и R2 означают метил, каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, l и m равны 1 иn равно 0. Кроме того, предпочтительным является L-аминоацильный стереоизомер. Репрезентативные цитотоксические конъюгаты изобретения представляют собой антитело/мэйтансиноид, фрагмент антитела/мэйтансиноид, эпидермальный фактор роста (EGF)/мэйтансиноид,меланоцитстимулирующий гормон(TSH)/мэйтансиноид, соматостатин/мэйтансиноид, фолат/мэйтансиноид, эстроген/мэйтансиноид, аналог эстрогена/мэйтансиноид, андроген/мэйтансиноид, и аналог андрогена/мэйтансиноид. Тиолсодержащий мэйтансиноид вводят в реакцию с соответственно модифицированным связывающимся с клетками агентом, чтобы получить цитотоксические конъюгаты. Эти конъюгаты могут быть очищены с помощью гель-фильтрации, ионообменной хроматографии или методом ВЭЖХ. Схемы получения конъюгатов из мэйтансиноидов, содержащих сульфгидрильные группы, приведены на фиг. 5. Более конкретно (фиг. 5 а, b), раствор антитела в водном буфере может быть инкубирован с молярным избытком модифицирующего антитело агента, такого как N-сукцинимидил-3-(2 пиридилдитио)пропионат (SPDP, 3 а) для того, чтобы ввести дитиопиридильные группы (фиг. 5 а), или сN-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (SPDB, 3b) для того, чтобы ввести дитиопиридильные группы (фиг. 5b). Затем модифицированное антитело взаимодействует с тиолсодержащими мэйтансиноидами (такими как 4 а или 4b) для того, чтобы получить связанный дисульфидом конъюгат антителомэйтансиноид. Затем этот конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен методом гельфильтрации. Альтернативно, антитело может быть инкубировано с молярным избытком амодифицирующего антитело агента, такого как 2-иминотиолан, чтобы ввести сульфгидрильные группы. Затем модифицированное антитело взаимодействует с подходящими дисульфидсодержащими мэйтансиноидами, чтобы получить связанный дисульфидной связью конъюгат антитело-мэйтансиноид. Затем этот конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен путем гель-фильтрации. Число молекул мэйтансиноида (обозначено как w на фиг. 5 а-d), связанных с одной молекулой антитела, можно определить спектрофотометрически, измеряя отношение поглощения при 252 и 280 нм. Этим способом можно связать в среднем 1-10 молекул мэйтансиноида с молекулой антитела. Предпочтительно среднее число молекул мэйтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, составляет 2-5 и наиболее предпочтительно равно 3-4,5. Альтернативно, раствор антитела в водном буфере может быть инкубирован с молярным избытком- 27010909 модифицирующего антитело агента, такого как N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат (SMCC, 26) для того, чтобы ввести малеимидные группы (фиг. 5 с), или с N-сукцинимидил 4-(иодацетил)аминобензоатом (SIAB, 27), чтобы ввести иодацетильные группы (фиг. 5d). Затем модифицированное антитело вводят в реакцию с тиолсодержащими мэйтансиноидами (такими, как 4 а или 4b),чтобы получить связанный тиоэфирной связью конъюгат антитела с мэйтансиноидом. Затем конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен методом гель-фильтрации. Число молекул мэйтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, может быть определено с помощью спектрофотометрического анализа, как описано выше. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя приготовление очищенного мэйтансиноида одним из способов, описанных выше, и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом. Предпочтительно реакционноспособная дитиогруппа представляет собой дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу. Особенно предпочтительно реакционноспособная дитиогруппа содержит нитропиридилдитио- или динитропиридилдитиогруппу. В другом способе очищенный мэйтансиноид вводят в реакцию со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную группу или галоидацетильную группу. Конъюгаты связывающихся с клетками агентов с мэйтансиноидными лекарственными препаратами изобретения могут быть оценены по их способности подавлять пролиферацию различных нежелательных клеточных линий in vitro (фиг. 6). Например, клеточные линии, такие как линия человеческой карциномы ободочной кишки COLO 205, клеточная линия человеческой меланомы А-375, клеточная линия человеческого миелоидного лейкоза HL60, могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих конъюгатов. Подлежащие оценке клетки могут контактировать с соединениями в течение 24 ч, и измеряют долю выживших клеток в прямом анализе известными способами. Затем из результатов анализа могут быть рассчитаны величины ингибирующих концентраций (IC50). Эффективность in vitro и специфичность по отношению к мишени конъюгатов антител с мэйтансиноидами настоящего изобретения продемонстрирована на фиг. 6, 10 и 12. Так, на фиг. 6 показано, чтоhuC242-DM3, а также huC242-DM4 обладают высокой эффективностью при уничтожении антигенположительных клеток COLO 205, при значениях IC50 1,310-11 М и 1,110-11 М соответственно. Напротив, антиген-отрицательные клетки А-375 приблизительно в 500 раз менее чувствительны, демонстрируя, что мэйтансиноидные конъюгаты настоящего изобретения обладают высокой эффективностью и специфичностью. Аналогично, фиг. 10 и 12 демонстрируют высокую эффективность и специфичность по отношению к мишени конъюгатов мэйтансиноидов настоящего изобретения с антителами MY9-6 и антиВ 4 соответственно. Противоопухолевую эффективность in vivo конъюгатов антител с затрудненными тиолсодержащими мэйтансиноидами настоящего изобретения сравнивали с эффективностью ранее описанных мэйтансиноидных конъюгатов на нескольких различных моделях человеческих опухолей на мышах. В первой модели (фиг. 7) мышей SCID, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты опухоли человеческой ободочной кишки HT-29, обрабатывали или конъюгатом антитела (huC242-DM1) с ранее описанным мэйтансиноидом DM1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (huC242-DM3, huC242DM4). Обработка конъюгатом huC242-DM1 приводит к задержке роста опухоли на 18 суток. Напротив,новые агенты обладают значительно большей эффективностью: время задержки роста опухоли составляет 28 суток для huC242-DM3 и 36 суток для huC242-DM4. Во второй модели (фиг. 8) мышей, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты опухоли человеческой ободочной кишки COLO 205, обрабатывали или конъюгатом антитела (huC242-DM1) с ранее описанным мэйтансиноидом DM1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (huC242DM3, huC242-DM4). Обработка конъюгатом huC242-DM1 не приводит к регрессии опухоли и дает задержку роста опухоли на 20 суток. Напротив, новые агенты обладают значительно большей эффективностью. Полная регрессия опухоли в течение 45 суток наблюдается в группе, обработанной huC242-DM3. Конъюгат huC242-DM4 является даже более эффективным, и приводит к излечению всех обработанных мышей. В третьей модели (фиг. 9) мышей, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты человеческого миелоидного лейкоза HL60, обрабатывали или конъюгатом антитела (MY-9-6-DM1) с ранее описанным мэйтансиноидом DM1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (MY9-6-DM3, MY96-DM4). Обработка конъюгатом MY9-6-DM1 не приводит к регрессии опухоли, и дает задержку роста опухоли на 5 суток. Напротив, новые агенты обладают значительно большей эффективностью, приводят к регрессии опухоли. Конъюгат MY9-6-DM3, а также MY-9-6-DM4 обеспечивают время задержки роста опухоли больше чем на 20 суток. В четвертой модели (фиг. 11) конъюгат мэйтансиноида настоящего изобретения (huMY9-6-DM4) непосредственно сравнивали с конъюгатом ранее описанного мэйтансиноида (huMY9-6-DM1) в подкожной модели ксенотрансплантата, полученной с клетками HL-60. При эквивалентной дозе обработка конъюгатом настоящего изобретения MY9-6-DM4 приводит к полной регрессии опухоли в течение 85- 28010909 суток. Напротив, конъюгат ранее описанного мэйтансиноида обладает гораздо меньшей активностью, и дает задержку роста опухоли приблизительно только на 48 суток. В пятой модели (фиг. 13 а) конъюгат мэйтансиноида настоящего изобретения с антителом huB4 демонстрирует высокую противоопухолевую активность, которая зависит от дозы, на модели подкожной опухоли Ramos. Полная регрессия опухоли и излечение наблюдаются при дозах, которые не являются токсичными (фиг. 13 а,b). Результаты приведенных выше пяти экспериментов по эффективности демонстрируют, что стерически затрудненные тиолсодержащие мэйтансиноиды настоящего изобретения дают конъюгаты со связывающимися с клетками агентами, обладающие чрезвычайно улучшенной противоопухолевой активностью по сравнению с ранее описанными конъюгатами мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами. Композиции и способы их применения Настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество любого конъюгата мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами настоящего изобретения, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Настоящее изобретение также предоставляет способы лечения, которые включают в себя введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества любого из описанных выше конъюгатов. Аналогично, настоящее изобретение предоставляет способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, который включает в себя контактирование клеток-мишеней или тканей-мишеней,содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством цитотоксического агента, содержащего любой конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом настоящего изобретения, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Клетки-мишени представляют собой клетки, с которыми может связываться связывающийся с клетками агент. По желанию, наряду с конъюгатом могут быть введены другие активные агенты, такие как другие противоопухолевые агенты. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и наполнители хорошо известны и могут быть определены специалистами в этой области техники, как предписывается клинической ситуацией. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают:(1) физиологический раствор Dulbecco's с фосфатным буфером, pH около 7,4, содержащий (или не содержащий) приблизительно от 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина,(2) 0,9%-й физиологический раствор (0,9% вес./об. NaCl),(3) 5% (вес./об.) декстрозу; и кроме того, может содержать антиоксидант, такой как триптамин, и стабилизирующий агент, такой как Tween 20. Способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток может быть осуществлен in vitro,in vivo или ex vivo. Примеры использования in vitro включают обработки аутологического костного мозга до его трансплантации тому же самому пациенту, для того чтобы уничтожить пораженные болезнью или злокачественные клетки; обработки костного мозга до его трансплантации, для того чтобы уничтожить компетентные Т-клетки и предупредить реакцию трансплантата против хозяина (GVHD); обработки клеточных культур для того, чтобы уничтожить все клетки, за исключением желаемых вариантов, которые не экспрессируют целевой антиген; или чтобы уничтожить варианты, которые экспрессируют нежелательный антиген. Условия неклинического применения in vitro могут быть легко определены специалистом в этой области техники. Примерами клинического применения ex vivo могут быть удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга до аутологической трансплантации при лечении рака или при лечении аутоиммунного заболевания, или для удаления Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологического или аллогенного костного мозга или ткани до трансплантации для того, чтобы предупредить GVHD. Обработка может быть проведена следующим образом. Костный мозг заимствуют у пациента или у других индивидов и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, в которую добавляют цитотоксический агент изобретения, в диапазоне концентраций приблизительно от 10 мкМ до 1 пМ, приблизительно в течение от 30 мин до 48 ч, приблизительно при 37 С. Точные условия концентрации и времени инкубации, т.е. доза, легко определяются специалистом в этой области техники. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту внутривенно, в соответствии с известными способами. В тех случаях, когда пациент получает другие типы лечения, такие как курс аблационной химиотерапии или облучение всего организма, между временем заимствования и повторной инфузии обработанных клеток, эти обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование. Для клинического применения in vivo цитотоксический агент изобретения может вводиться в виде раствора или лиофилизированного порошка, который тестируют на стерильность и на уровень эндоток- 29010909 сина. Примеры подходящих протоколов введения конъюгата следуют ниже. Конъюгаты вводятся еженедельно в течение 4 недель в виде внутривенного болюса каждую неделю. Дозы болюсов задаются в 501000 мл нормального физиологического раствора, в который может быть добавлено от 5 до 10 мл человеческого сывороточного альбумина. Внутривенные дозировки могут составлять от 10 мкг до 2000 мг на введение (диапазон от 100 нг до 20 мг/кг в сутки). Спустя четыре недели после обработки, лечение пациента может продолжаться на еженедельной основе. Конкретные клинические протоколы, с учетом способа введения, наполнителей, разбавителей, дозировок, кратности и др., могут быть определены специалистом в этой области техники, как предписывается клинической ситуацией. Примеры медицинских состояний, которые могут подвергаться лечению в соответствии со способами in vivo или ex vivo индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, включают злокачественность любого типа, в том числе, например, рак легких, молочной железы, ободочной кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, яичников и лимфатических органов; аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит, и рассеянный склероз; отторжение трансплантата, такое как отторжение почечного трансплантата, отторжение печеночного трансплантата,отторжение легочного трансплантата, отторжение сердечного трансплантата, и отторжение трансплантата костного мозга; реакция трансплантата против хозяина; вирусные инфекции, такие как цитамегавирусная (CMV) инфекция, ВИЧ инфекция, СПИД, и др.; и паразитные инфекции, такие как жиардиаз,амебная дизентерия, бильгарциоз, и другие, как может быть определено средним специалистом в этой области техники. Примеры Теперь изобретение будет проиллюстрировано со ссылкой на не ограничивающие примеры. Если не указано другое, всепроценты, соотношения, части, и др. даны по массе. Ниже описаны примеры для соединений, в которых R1 представляет собой H или CH3, R2 означает CH3, каждый R5, R6, R7, R8 представляет собой H, каждый l и m равен 1 и n равно нулю. Аналогичный синтез может быть осуществлен для других соединений изобретения, в которых каждый R1 и R2 независимо представляют собой H, CH3,C2H5, или более высокомолекулярный алкил, алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или фенил,замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и где каждый l, m и n означает целое число от 1 до 5, и кроме того, n также может означать 0. Все реагенты были закуплены на фирме Aldrich Chemical Co., New Jersey, или из других коммерческих источников. Мэйтансинол (11) приготовлен, как описано ранее (патент США 6333410). Спектры ядерного магнитного резонанса (1H-ЯМР) регистрировали на приборе Braker 400 МГц и масс-спектры регистрировали на приборе Bruker Daltonics Esquire 3000 с использованием электрораспылительной ионизации. Пример 1. Синтез мэйтансиноида 4b. 4-Меркапто-4-метилпентановая кислота (7). Колбу емкостью 500 мл снабжают магнитной мешалкой и капельной воронкой на 150 мл. Эту систему помещают в атмосферу аргона. Через полую иглу добавляют 150 мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ) и 75 мл 2,5 молярного раствора н-бутиллития(BuLi) в гексане (18,7 ммоль), и раствор охлаждают при -78 С в бане сухой лед/ацетон. Ацетонитрил(7,3 г, 9,4 мл, 18 ммоль) по каплям добавляют из шприца приблизительно в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин, в течение которых образуется белый осадок литий-ацетонитрила. Изобутиленсульфид (15 г, 17 ммоль) растворяют в 100 мл безводного ТГФ и добавляют по каплям в течение приблизительно 30 мин из капельной воронки. Удаляют охлаждающую баню, и оставляют перемешиваться реакционную смесь в течение 3 ч. Колбу охлаждают в бане с ледяной водой, в то время как по каплям добавляют 38 мл 0,5 молярного раствора HCl. Слой в ТГФ сохраняют, и водный слой промывают два раза этилацетатом (75 мл). Слои в ТГФ и этилацетате объединяют, сушат приблизительно над 20 г безводного сульфата натрия и переносят в колбу емкостью 250 мл. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, получая неочищенное соединение 6. Добавляют этанол (30 мл) и магнитную мешалку. Содержимое перемешивают, в то время как медленно добавляют раствор 8,0 гNaOH в 30 мл деионизированной воды. Колбу снабжают обратным холодильником и помещают в атмосферу аргона. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи, затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют деионизированную воду (60 мл), и смесь экстрагируют два раза(порциями по 25 мл) смесью этилацетата и гексана (2:1). Водный слой подкисляют концентрированнойHCl до pH 2, затем экстрагируют три раза этилацетатом (порциями по 75 мл). Органические слои сушат над безводным Na2SO4, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, получая 10 г продукта 7 (выход 39%). Этот продукт используют без дополнительной очистки. 1H ЯМР (CDCl3):1,38 (6H, с), 1,87-1,93 (2H, м), 2,08 (1H, с), 2,51-2,57 (2H, м). 4-Метил-4-(метилдитио)пентановая кислота (8). Раствор меркаптопентановой кислоты 7 (6,0 мл,40 ммоль) растворяют в 50 мл деионизированной воды в колбе емкостью 250 мл. Этот раствор перемешивают магнитной мешалкой, в то время как добавляют к кислоте карбонат натрия (6,4 г, 60 ммоль) со скоростью, которая не будет приводить к избыточному вспениванию. Колбу снабжают капельной воронкой на 100 мл, в которую заливают раствор метилового эфира метантиолсульфокислоты (7,5 г,60 ммоль), растворенного в 30 мл перегнанного в стекле 100%-го этанола. Колбу охлаждают в бане с ле- 30