Способы лечения множественной миеломы и индуцированной миеломой резорбции костей с помощью антагонистов интегрина

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к лечению множественной миеломы и высвобождению факторов резорбции костей, приводящему к серьезным потерям костной ткани, что является основным побочным эффектом миеломы у человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антагонистам интегрина, таким как антагонисты интегринов, содержащих 4, которые ингибируют биологические эффекты такой адгезии, связанной с заселением костного мозга клетками множественной миеломы; их последующим интегринзависимым выживанием и интегринзависимым высвобождением из них факторов резорбции костей, приводящих к деструкции костей у пациентов, страдающих множественной миеломой. Предпосылки к созданию изобретения Множественная миелома является второй по распространенности гематологическим злокачественным новообразованием; ежегодно в США регистрируется 15000 новых случаев заболевания, а за год количество пациентов с миеломой составляет от 30000 до 40000 (Mundyand Bertolini, 1986). 80% этих пациентов страдают тяжелой остеолитической костной деструкцией, вызванной увеличением количества формирующихся остеокластов (ОСL) и их активности (Mundy and Bertolini, 1986). Эта костная деструкция может вызывать мучительные боли в костях, патологические переломы, сдавливание спинного мозга и угрожающую жизни гиперкальциемию. Поскольку множественную миелому нельзя излечить с помощью стандартной химиотерапии или трансплантации стволовых клеток (Attal et al., 1996), и в силу большой заболеваемости и потенциальной смертности,связанной с миеломным поражением костей,жизненно важной является стратегия лечения,которая обеспечивала бы контроль роста самой миеломы и, в частности, остеолитической костной деструкции, которая наблюдается у этих пациентов. Однако патологические механизмы, ответственные за повышенную активность остеокластов у пациентов с множественной миеломой,неизвестны (Mundy, 1998). Наблюдается несколько вариантов поражения костей. Иногда у пациентов развиваются дискретные остеолитические поражения, связанные с солитарными плазмоцитомами. У некоторых пациентов имеется диффузная остеопения, которая имитирует проявления остеопороза и которая происходит из-за того, что миеломные клетки диффузно распределяются в осевом скелете. У большинства пациентов имеются множественные дискретные литические поражения, которые формируются в прилегающих к гнездам миеломных клеток областях. Гиперкальциемия наблюдается как следствие деструкции костей приблизительно у одной трети пациентов на поздних стадиях заболевания. Редко бывают случаи отсутствия у 2 пациентов с миеломой литических поражений или утраты костной ткани и наличия повышенного новообразования костной ткани вокруг миеломных клеток. Эта редко встречающаяся патология известна под названием остеосклеротической миеломы. Остеолитические костные поражения являются наиболее распространенными скелетными проявлениями у пациентов с миеломой(Mundy, 1998). Несмотря на то, что точные молекулярные механизмы остаются неясными,наблюдения, проводившиеся более 15 лет, показали, что 1) механизм, с помощью которого при миеломе разрушается кость, реализуется остеокластами, клетками, которые в норме осуществляют резорбцию кости; 2) при миеломе остеокласты скапливаются на поверхностях резорбции кости, прилегающих к скоплениям миеломных клеток, и, как представляется, механизм,посредством которого при миеломе происходит стимуляция остеокластов, является локальным; 3) уже много лет известно, что культуры человеческих миеломных клеток in vitro вырабатывают несколько факторов, активирующих остеокласты, включая лимфотоксин- (LT-), интерлейкин-1 (IL-1), белок, родственный паратиреоидному гормону (РТНrР), и интерлейкин-6(IL-6); 4) гиперкальциемия время от времени наблюдается приблизительно у одной трети пациентов с миеломой в ходе заболевания. Гиперкальциемия всегда связана с выраженным повышением резорбции костей и часто - с нарушением клубочковой фильтрации; 5) повышение резорбции костей остеокластами при миеломе обычно связано с выраженным нарушением функции остеобластов. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови понижается или находится в пределах нормальных значений, в отличие от пациентов с другими типами остеолитических костных заболеваний, а сканирование с использованием радионуклидов не показывает признаков повышенного поглощения, что указывает на нарушение ответа остеобластов на увеличение резорбции костей. Несмотря на то, что в стимуляции активности остеокластов у пациентов с множественной миеломой участвуют различные перечисленные медиаторы, сообщения о факторах, вырабатываемых миеломными клетками, не являются постоянными, и некоторые исследования не пришли к определенным выводам из-за наличия других типов контаминирующих клеток,включая клетки стромы и макрофаги, в популяции клеток множественной миеломы. IL-6 является главным фактором роста миеломы, который усиливает рост нескольких линий миеломных клеток и вновь выделенных от пациентов миеломных клеток (Bataille et al., 1989). Выработка IL-6 может быть выявлена приблизительно в 40% вновь выделенных миеломных клеток с помощью ПЦР, но только у 1 из 150 изучавшихся пациентов была показана поддающаяся 3 выявлению методами иммуноцитохимии илиELISA выработка IL-6 (Epstein, 1992). Рецепторы IL-6 были обнаружены только в 6 из 13 образцов от пациентов с множественной миеломой(Bataille et al., 1992). Кроме того, имеются сообщения о том, что зрелые миеломные клетки демонстрируют минимальный пролиферативный ответ на IL-6. Интерлейкин-11 (IL-11) оказывает IL-6-подобное действие на плазмоциты,однако, до настоящего времени еще никто не показал, что миеломные клетки вырабатываютIL-11. Bataille и соавторы (1995) показали, что перфузия антител против IL-6 5 пациентам с рефракторной миеломой уменьшала размеры нагрузки миеломными клетками только у 2 из этих пациентов. IL-1 является чрезвычайно мощным костнорезорбирующим агентом, который индуцирует гиперкальциемию у экспериментальных животных при отсутствии почечной недостаточности (Воусе et al., 1989). Напротив,гиперкальциемия редко наблюдается у пациентов с миеломой, не имеющих почечной недостаточности. Более важно, что в миеломных клетках высокой очистки IL-1 не выявляется, и очень редко можно выявить выработку TNF-,что наводит на мысль о том, что источником IL1 и TNF- могут быть контаминирующие типы клеток, такие как макрофаги (Epstein, 1992). Подобно этому, LT- вырабатывается большинством линий человеческих миеломных клеток(Bataille, et al., 1995), но, как оказалось, не вырабатывается миеломными клетками in vivo (Alsina et al., 1996). Помимо IL-1, TNF-, LT- иIL-6, миеломные клетки вырабатывают усеченную форму M-CSF, которая является биологически активной, однако, M-CSF не вызывает гиперкальциемии и не индуцирует образование остеокластов в культурах костного мозга человека (MacDonald et al., 1986). Таким образом, роль любого из этих факторов в остеолитических костных заболеваниях у пациентов с миеломой не была ясно показанаin vivo, поэтому известные цитокины не являются полностью ответственными за резорбцию костей, которая наблюдается у этих пациентов. Роль адгезионных взаимодействий молекул при миеломном костном заболеванииAnderson и соавторы были первой исследовательской группой, которая продемонстрировала важность адгезионных взаимодействий миеломных клеток и клеток микроокружения костного мозга как для роста миеломных клеток, так и для развития остеолитического костного заболевания. Клетки множественной миеломы экспрессируют адгезивные молекулы клеточной поверхности, CD29 (VLA-4), LFA-1 иCD44 (Chauhan et al., 1995). Эти авторы выдвинули предположение о том, что миеломные клетки локализуются в костном мозге посредством адгезионных взаимодействий белков внеклеточного матрикса и клеток стромы костного 4 мозга. Они показали также, что адгезия клеток множественной миеломы к стромальным клеткам запускается секрецией IL-6 как нормальными, так и полученными из костного мозга при множественной миеломе стромальными клетками, и увеличивает IL-6-опосредованный рост опухолевых клеток. Однако антитела противIL-6 стромальными клетками костного мозга в ответ на миеломные клетки, что наводит на мысль о том, что взаимодействие другого лиганда с рецептором запускает секрецию IL-6 стромальными клетками костного мозга, связывающимися с миеломными клетками. Простая идентификация возможного пути адгезии не обязательно означает, что этот путь является важным. В этом случае ни один из вовлеченных путей не играет роли в выработке IL-6.Vanderkerken et al. (1997) также изучали фенотипический адгезионный профиль мышиных клеток 5 Т 2 и 5 Т 33 миеломных клеток на модели мышиной миеломы. Эти исследователи показали, что эти клеточные линии экспрессируют VLA-4, VLA-5, LFA-1 и CD44, и высказали предположение о том, что эти адгезионные взаимодействия могут быть важными для миеломных клеток в отношении их связывания со стромальными клетками костного мозга. Тем не менее, несмотря на множество многообещающих лабораторных данных, фундаментальные механизмы, лежащие в основе повышения деструкции костей остеокластами при миеломе in vivo, остаются неясными. Это отражается в невозможности простого переноса данных по адгезионным взаимодействиям, полученным in vitro, на условия in vivo. Например,многие исследования in vitro связывают адгезию гемопоэтических стволовых клеток к строме костного мозга как с интегрином VLA-4, так и с интегрином LFA-1 (Papayannopoulou и Nakamoto, 1993). Эти полученные in vitro данные позволяют сделать прогноз о том, что любой из двух путей, будучи блокированным in vivo,приведет к периферизации гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга в периферическую кровь. Тем не менее, в исследовании на приматах, в то время как моноклональное антитело (mАb) против VLA-4 эффективно обеспечивало периферизацию стволовых клеток, моноклональное антитело против цепи 2 интегрина LFA-1 не оказывало действия, несмотря на увеличение содержания нейтрофилов,демонстрируя, таким образом, эффективностьmAb (Papayannopoulou and Nakamoto, 1993). Эти данные показывают, что результаты, полученные in vitro, фактически не были способны точно предсказать эффекты in vivo. Следует отметить, что роль интегринаVLA-4 изучалась на метастазах множественных опухолей, включая лейкозы, такие как лимфома; причем были получены противоречивые резуль 5 таты. Так, трансфекция человеческой цепи 4 в клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) приводила к появлению экспрессии VLA4 и придавала этим клеткам способность мигрировать в костный мозг in vivo, причем это явление ингибировалось с помощью mAb противVLA-4 (Matsuura et al., 1996). Напротив, трансфекция VLA-4 в клетки лимфомы ингибировала метастазы в печени, легких и почках и не оказывала эффекта на заселение и пролиферацию в костном мозге (Gosslar et al., 1996). Помимо этого, экспрессия VLA-4 на клетках мышиной меланомы с интенсивным метастазированием ингибировала формирование метастазов в легкиеin vivo (Qian et al., 1994) и не предрасполагала меланому к формированию метастазов в костный мозг. В целом, из исследований in vitro не понятно, каким образом можно надежно предсказать функционирование путей адгезии in vivo. Более того, даже когда проводились исследования in vivo, полученные данные были непостоянными. Одной из главных причин этих несовпадений, касающихся изучения множественной миеломы, является то, что существующие в настоящее время модели на экспериментальных животных плохо отражают заболевание у человека. В случае множественной миеломы человеческие и мышиные линии миеломных клеток,которые можно выращивать in vitro, редко связаны с деструкцией костей in vivo (Mundy,1998). Было бы весьма желательным индентифицировать соединения или антагонисты, которые ингибируют выработку этих костнорезорбирующих факторов, что позволит остановить прогрессирующую деструкцию костей и улучшить качество жизни пациентов с миеломой. Краткое описание существа изобретения Авторы настоящего изобретения использовали недавно разработанную мышиную модель множественной миеломы, в которой у мышей развивается тяжелый остеолиз со всеми основными признаками заболевания человека (Garrett 1997). Используя указанную клеточную линию и модель авторы установили, что ингибирование пути 4 интегрин/лиганд 4 интегрина invivo приводит к снижению способности клеток множественной миеломы к пролиферации и/или выживанию. Авторы показали, что прикрепление клеток миеломы к стромальным клеткам костного мозга через посредство взаимодействия VLA-4/VCAM-1 требуется для повышения активности, стимулирующей резорбцию кости остеокластами в микроокружении кости in vitro. Авторы полагают, что это взаимодействие является принципиально важным для заселения миеломных клеток в костный мозг, их последующего выживания и роста, и, в конечном итоге, для прогрессирования остеолиза, вызванного миеломой. Авторы проверили это в эксперимен 004270 6 тах на животных и установили, что in vivo антагонист интегрина VLA-4, содержащего субъединицу 4, в высокой степени ингибирует выработку антитела подтипа IgG2b. Этот изотип представляет собой тот же изотип, который продуцирует клеточная линия 5TGM1, и является точным заменителем для ряда миеломных клеток в костном мозге в любое время. Так,блокада пути VLA-4 высокой степени ингибирует выработку IgG2b, и, косвенно, уровень миеломной нагрузки. Одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения множественной миеломы, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей антагонист взаимодействия между интегрином, имеющим субъединицу 4(например, VLA-4), и лигандом для этого интегрина (например, VCAM-1). Этот антагонист может представлять собой агент, связывающий 4 интегрин, или агент, связывающий лиганд 4 интегрина. Предпочтительными агентами являются гомологи aнти-VLA-4 или анти-47 антител (человеческое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело и их фрагменты); гомологи анти-VCAM-1 антител (человеческое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело и их фрагменты); и низкомолекулярный ингибитор взаимодействий интегринов, содержащих субъединицу 4, с их лигандами. Эту композицию можно вводить в дозе приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела. В частности, предпочтительные агенты могут являться антагонистами взаимодействия; а) как VLA-4, так и 47 вместе с их соответствующими 4 лигандами; или b) только VLA-4 с его 4 лигандом; или с) только 47 с его 4 лигандом. Другим аспектом настоящего изобретения является способ ингибирования резорбции костей, связанной с опухолями костного мозга,включающий введение млекопитающему,имеющему указанные опухоли, антагониста взаимодействия между интегрином, содержащим субъединицу 4, таким как VLA-4, и лигандом для этого интегрина, содержащего субъединицу 4, таким как VCAM-1, в количестве,эффективном для обеспечения ингибирования резорбции кости. Этот антагонист может представлять собой агент, связывающий 4 интегрин, такой как агент, связывающий VLA-4, или агент, связывающий лиганд 4 интегрина, такой как агент, связывающий VCAM-1. Предпочтительными агентами являются гомологи антиVLА-4 или анти-47 антител (человеческое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело и их фрагменты); гомологи антиVCAM-1 антител (человеческое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело и их фрагменты); и низкомолекулярный ингибитор взаимодействия интегринов, содержащих 7 субъединицу 4, с их соответствующими 4 лигандами (например, взаимодействия VCAM1/VLA-4). Этот антагонист можно вводить в дозе приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела. Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения субъекта, имеющего заболевание, которое характеризуется наличием остеокластогенеза, включающий введение указанному субъекту антагониста взаимодействия между интегрином, содержащим субъединицу 4, и лигандом для этого интегрина,содержащего субъединицу 4, в количестве,достаточном для подавления остеокластогенеза. Этот антагонист также может представлять собой агент, связывающий 4, или агент, связывающий лиганд 4. Предпочтительными агентами являются гомологи анти-VLА-4 или анти 47 антител (человеческое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело и их фрагменты); гомологи анти-VCAM-1 антител(человеческое антитело, химерное антитело,гуманизированное антитело и их фрагменты); и низкомолекулярный ингибитор взаимодействия интегринов, содержащих субъединицу 4, с их соответствующими 4 лигандами (например,взаимодействия VCAM-1/VLA-4). Эту композицию можно вводить в дозе приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела. Если не указано иное, все источники включаются в настоящее описание в качестве ссылок. Краткое описание фигур Фиг. 1 - влияние нейтрализующих антител на образование TRAP-положительных многоядерных ОС-подобных клеток в совместных культурах клеток 5TGM1 и клеток костного мозга. Смесь клеток 5TGM1 (1103) и клеток костного мозга (1106) в суспензии засевали на 48 луночные культуральные планшеты и культивировали в присутствии или отсутствии 10 мкг/мл анти-VCAM-1 антитела (VCAM-1 Ab),анти-41 антитела (411 Ab), анти-ICAM-1 антитела (ICAM-1 Аb) или IgG крысы в качестве контроля. Через 6 дней культивирования культуры фиксировали и подсчитывали количество TRAP-положительных многоядерных ОСподобных клеток (TRAP(+) MNC). Как VCAM-1TRAP(+) MNC, в то время как ICAM-1 Ab не имело эффекта. Данные представлены как среднееС.О. (n=3).= достоверное отличие от контрольного IgG. Фиг. 2 - влияние кондиционированных посредством 5TGM1 и ST2 сред на резорбцию кости в органных культурах длинных костей плодов крысы. Кондиционированные среды (48 ч), полученные посредством культивирования толькоST2, только 5TGM1 и совместных культур ST2 и 5TGM1, изучали на предмет костнорезорби 004270 8 рующей активности в органных культурах длинных костей плодов крысы, меченых 45 кальцием. Меченые длинные кости плодов крысы культивировали в присутствии кондиционированных сред (40% об./об.) или контрольной среды в течение 120 ч. Данные представлены как процент возрастания высвобождения кальция по сравнению с контрольной средой. Высвобождение из кондиционированной стромальными клетками ST2 среды показано незакрашенным столбиком. Высвобождение из 5TGM1 показано заштрихованным столбиком. Высвобождение из кондиционированной совместной культурой 5TGM1 и ST2 среды показано закрашенным столбиком. Данные представлены как среднееС.О. (n=4).= достоверное отличие от ST2 в отдельности.= достоверное отличие от 5TGM1 в отдельности. Фиг. 3 - влияние рекомбинантного растворимого VCAM-1 (sVCAM-1) на приобретение остеокластогенной активности клетками 5TGM1. Кондиционированную среду собирали изпод клеток 5TGM1, культивированных в присутствии или отсутствии sVCAM-1 (от 110-8 до 110-7 моль) в течение 24 ч. Остеокластогенную активность этих кондиционированных сред изучали на культурах костного мозга мыши. Клетки костного мозга (1106/нa лунку) засевали на 48-луночные планшеты и культивировали в присутствии кондиционированных сред (заштрихованные столбики) или контрольной среды (IMDM), содержавших одни и те же концентрации sVCAM-1 (незаштририхованные столбики). Через 6 дней культивирования культуры фиксировали и подсчитывали количествоTRAP-положительных многоядерных ОСподобных клеток (TRAP(+) MNC). Кондиционированная среда из-под клеток 5TGM1, обработанных 110-7 M sVCAM-1, повышали образование TRAP(+) MNC. Данные представлены как среднееС.О. (n=3).= достоверное отличие от контролей. Фиг. 4 - влияние mAb PS2 против VLA-4 на подъем IgG2b в сыворотке крови мышей,несущих 5TGM1. Мышам инъецировали 1105 клеток 5TGM1, которые колонизировали костный мозг. Мышей разделяли на две группы по три, одна из которых служила контролем, а вторая получала на 8, 11, 14, 17 и 20 дни 80 мкг mAb PS/2 (приблизительно 4 мг/кг). Уровни IgG2b, изотипа антитела, вырабатываемого миеломными клетками 5TGM1, измеряли еженедельно с 1 по 6 неделю. Воздействие mAb в высокой степени ингибировало выработку IgG2b, что является показателем ингибирования выживания и роста миеломных клеток in vivo. Фиг. 5 - влияние mAb M/K-2.7 против 9 Мышам инъецировали клетки 5TGM1, как описано для фиг. 4. Мышей разделяли на группы по четыре или пять животных, одна из которых служила контролем (незакрашенный квадрат), вторая/третья группы получали профилактически 80 мкг (незакрашенные ромбики) и 160 мкг mAb (незакрашенные кружки) (приблизительно от 4 до 8 мг/кг), четвертая группа получала в терапевтических целях 160 мкг mАb(треугольники). Определяли уровни IgG2b, изотипа антитела, вырабатываемого миеломными клетками 5TGM1. Воздействие mAb в высокой степени ингибировало выработку IgG2b, что является показателем ингибирования выживания и роста миеломных клеток in vivo. Фиг. 6 - Влияние анти-4 антитела на выживание мышей с множественной миеломой. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к лечению, направленному, среди прочего, на профилактику множественной миеломы. Более конкретно, способы по настоящему изобретению относятся к применению антагонистов взаимодействия между интегрином, содержащим субъединицу 4, и лигандом для этого интегрина, с целью лечения множественной миеломы. Термин "множественная миелома" означает медицинское состояние индивидуума, имеющего неопластическое заболевание плазматических клеток, с неопластическим клоном, представляющим от пациента к пациенту клетки на различных стадиях цикла дифференцировки плазматических клеток (Mundy, 1998). 41 интегрин представляет собой расположенный на поверхности клетки рецептор дляVCAM-1, фибронектина и, возможно, других молекул, которые связываются или каким-либо другим образом взаимодействуют с 41 интегрином. С этой точки зрения, такие молекулы,которые связываются или каким-либо другим образом взаимодействуют с интегрином, содержащим субъединицу 4, по отдельности и вместе, называют "лигандом (лигандами) 4". Термин "41 интегрин" ("VLA-4" или "41" или"41 интегрин", используемые взаимозаменяемым образом) в настоящем описании, относится, таким образом, к полипептидам, которые способны связываться с VCAM-1 и членами белков внеклеточного матрикса, а более конкретно к фибронектину или его гомологам или фрагментам, хотя специалистам будет понятно,что и другие лиганды для VLA-4 могут существовать и могут быть изучены с помощью обычных методик. Тем не менее известно, что субъединица 4 будет ассоциировать и с другими субъединицами, кроме 1, поэтому можно определить термин "4 интегрин" как те интегрины, чья субъединица 4 ассоциируется с одной или более -субъединицами. Еще одним примером "4 интегрина" является 47 (R. Lobb andM. Hemler, 1994). Используемый в настоящем описании термин "4 интегрин (интегрины)" обозначает VLA-4, а также интегрины, которые содержат 1-, 7- или любую другую субъединицу. Как обсуждается в настоящем описании,антагонисты, используемые в способах по настоящему изобретению, не ограничиваются определенным типом или структурой молекулы,поэтому для целей настоящего изобретения любой агент, способный связываться с любым интегрином, содержащим субъединицу 4, таким как VLA-4 на поверхности клеток, несущихVLA-4/ и/или 47 интегрин на поверхности клеток, несущих 47 [см. Lobb and Hemler,J.Clin.Invest., 94: 1722-1728 (1994)], и/или их соответствующими 4 лигандами, такими какMadCAM, и который эффективно блокирует или покрывает VLA-4 (или 47) или VCAM-1 (илиMadCAM) (т.е. "агент, связывающий 4 интегрин" и "агент, связывающий лиганд 4 интегрина", соответственно), рассматривается как эквивалент антагонистов, используемых в примерах,приведенных в настоящем описании."Антагонист" интегрина включает любое соединение, которое ингибирует связывание 4 интегрина (интегринов) с лигандом и/или рецептором 4 интегрина. Антитело против интегрина или белки, содержащие гомологи антитела (обсуждаются ниже), а также другие молекулы, такие как растворимые формы лигандных белков для интегринов, являются пригодными для этих целей. Растворимые формы лигандных белков для 4 интегринов включают растворимые VCAM-1 или коллагеновые пептиды,VCAM-1 слитые белки или бифункциональныеVCAM-1/Ig слитые белки. Например, растворимая форма лиганда 4 интегрина или его фрагмента могут вводиться для связывания с интегрином и предпочтительно конкурировать за сайт связывания с интегрином на клетках, что приводит, таким образом, к эффектам, сходным с эффектами при введении антагонистов, таких как анти-4 интегрин (например, 47 антитела и/или VLA-4 антитела). В частности, растворимые мутанты 4 интегрина, которые связываются с лигандом 4 интегрина, но не вызывают интегринзависимой сигнализации, также включены в объем настоящего изобретения. Такие мутанты могут действовать как конкурентные ингибиторы белка интегрина дикого типа и считаются "антагонистами". Другими антагонистами, используемыми в способах по настоящему изобретению, являются "малые молекулы", как описано ниже. В настоящее изобретение включены способы, использующие агент, который является антагонистом действия более одного 4 интегрина, такой как одиночная малая молекула или 11 гомолог антитела, который является антагонистом нескольких 4 интегринов, таких как VLA4 и 47, или другие комбинации 4 интегринов. Также в объем настоящего изобретения включены способы, использующие комбинацию различных молекул таким образом, что их объединенная активность противостоит действию более одного 4 интегрина, такие как способы,при которых используется несколько малых молекул или гомологов антител, которые в совокупности являются антагонистами 4 интегринов VLA-4 и 47 или других комбинаций интегринов. Как обсуждается в настоящем описании,определенные антагонисты интегрина могут быть слиты или каким-либо другим образом конъюгированы, например, с гомологом антитела, таким как иммуноглобулин или его фрагмент, и не ограничиваются определенным типом или структурой интегрина или лиганда или другой молекулы. Таким образом, для целей настоящего изобретения любой агент, способный образовывать слитый белок (как определено ниже) и способный связываться с лигандами 4 интегрина, а также который эффективно блокирует или покрывает 47 и/или VLA-4 интегрин, рассматривается как эквивалент антагонистов, используемых в примерах, приведенных в настоящем описании. Для целей настоящего изобретения термин"антагонист взаимодействия лиганд 4 интегрина/4 интегрин" относится к агенту, например, полипептиду или другой молекуле, который может ингибировать или блокировать лиганд 4 (например, VCAM-1) и/или 4 интегрин(например, 47 или VLA-4)-опосредованное связывание или который может каким-либо другим образом моделировать функцию 4 лиганда и/или 4 интегрина, например, путем ингибирования или блокирования трансдукции сигнала 4 интегрина, опосредованного лигандом 4, или трансдукции сигнала лиганда 4,опосредованного лигандом 4, и который является эффективным для лечения множественной миеломы, предпочтительно таким же образом,как антитела против 4 интегрина. Конкретно, антагонист взаимодействияVCAM-1/VLA-4 представляет собой агент, который обладает одним или более следующих свойств: (1) он покрывает или связывается с(например, миеломной клетки) со специфичностью, достаточной для ингибирования взаимодействия лиганд VLA-4/VLA-4, например,взаимодействия VCAM-1/VLA-4 между стромальными клетками кости и миеломными клетками; (2) он покрывает или связывается с VLA-4 на поверхности клетки, несущей VLA-4 (например, миеломной клетки) со специфичностью,достаточной для модифицирования, а предпочтительно для ингибирования трансдукции сиг 004270 12 нала, опосредованного VLA-4, например, сигнализации, опосредованной VLA-4/VCAM-1; (3) он покрывает или связывается с лигандом VLA4 (например, VCAM-1) на стромальных клетках кости со специфичностью, достаточной для ингибирования взаимодействия VLA-4/VCAM-1;(4) он покрывает или связывается с лигандомVLA-4 (например, VCAM-1) на стромальных клетках кости со специфичностью, достаточной для модифицирования, а предпочтительно для ингибирования трансдукции сигнала VLA-4,опосредованного лигандом VLA-4, например,сигнализации VLA-4, опосредованной VCAM-1. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антагонист обладает одним или обоими свойствами 1 и 2. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антагонист обладает одним или обоими свойствами 3 и 4. Кроме того, пациенту можно вводить более одного антагониста, например, агент, который связывается с VLA-4, можно комбинировать с агентом, который связывается с VCAM-1. Например, пригодными являются антитела или гомологи антител (обсуждаются ниже), а также растворимые формы натуральных связывающих белков для VLA-4 и VCAM-1. Растворимые формы натуральных связывающих белков для VLA-4 включают растворимые VCAM-1 пептиды, VCAM-1 слитые белки, бифункциональные VCAM-1/Ig слитые белки, фибронектин, фибронектин, имеющий альтернативно сплайсированный соединительный сегмент, не относящийся к III типу, и пептиды фибронектина, содержащие аминокислотную последовательность EILDV или сходную консервативно замещенную аминокислотную последовательность. Растворимые формы натуральных связывающих белков для VCAM-1 включают растворимые VLA-4 пептиды, VLA-4 слитые белки,бифункциональные VLA-4/Ig слитые белки и т.п. Используемый в настоящем описании термин "растворимый VLA-4 пептид" или "растворимый VCAM-1 пептид" представляет собойVLA-4 или VCAM-1 полипептид, неспособный закрепляться на мембране. Такие растворимые полипептиды включают, например, VLA-4 иVCAM полипептиды, у которых отсутствует часть мембранного спэннинг-домена, достаточная для закрепления полипептида, или которые модифицированы таким образом, что мембранный спэннинг-домен не функционирует. Эти связывающие агенты могут действовать путем конкуренции со связывающим белком для VLA4, расположенным на поверхности клетки, или каким-либо другим образом изменяя функциюVLA-4. Например, растворимую форму VCAM1 (см., например, Osborn et al., 1989, Cell,59:1203-1211) или его фрагмента можно вводить с целью связывания с VLA-4 и предпочтительно конкуренции за сайт связывания VLA-4 на миеломных клетках, что приводит к эффектам, 13 сходным с эффектами после введения антагонистов, таких как малые молекулы или анти-VLА 4 антитела. В другом примере VCAM-1 или его фрагмент, который способен связываться с VLA-4 на поверхности миеломных клеток, несущих VLA4, например, фрагмент, содержащий два Nконцевых домена VCAM-1, может быть слит со вторым пептидом, например, пептидом, который повышает растворимость или продолжительность жизни in vivo части VCAM-1. Второй пептид может представлять собой фрагмент растворимого пептида, предпочтительно человеческого пептида, более предпочтительно белка плазмы крови, или член суперсемейства иммуноглобулинов. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения второй пептид представляет собой IgG или его часть или фрагмент, например, константный участок тяжелой цепи человеческого IgG1, и включает, в наименьшем шарнирном участке,домены СН 2 и СН 3. Другие антагонисты, пригодные для способов по настоящему изобретению, включают,но не ограничивают, агенты, которые имитируют действие пептидов (органические молекулы,называемые "малыми молекулами"), способные прерывать взаимодействие 4 интегрин/лиганд 4 интегрина посредством, например, блокирования VLA-4 путем связывания рецепторовVLA-4 на поверхности клеток или блокирования VCAM-1 путем связывания рецепторовVCAM-1 на поверхности клеток. Эти "малые молекулы" сами могут быть малыми пептидами или более тяжелыми, содержащими пептиды органическими соединениями или органическими соединениями непептидной природы. Термин "малая молекула", как определяется настоящим описанием, не включает в себя антитело или гомолог антитела. Несмотря на то, что молекулярная масса таких "малых молекул" обычно составляет менее 2000, авторы настоящего изобретения не намерены использовать это число в качестве абсолютной верхней границы молекулярной массы. Например, могут использоваться малые молекулы, такие как олигосахариды, которые имитируют домен связывания лиганда VLA-4 и подходят к рецепторному домену VLA-4. (См.(1990), J.K. Scott and. G.P. Smith, 1990, Science,249: 386-390, а также патент США 4833092(Geysen), включенные в настоящее описание в качестве ссылок). Наоборот, могут использоваться малые молекулы, которые имитируют домен связывания лиганда VCAM-1 и подходят к рецепторному домену VCAM-1. Примеры других малых молекул, пригодных для настоящего изобретения, можно найти у Komoriya et al. ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion(23), pp. 15075-79 (1991. Эти авторы идентифицировали минимальную активную аминокислотную последовательность, необходимую для связывания с VLA-4, и синтезировали ряд перекрывающих пептидов, основанных на аминокислотной последовательности участка CS-1(VLA-4-связывающий домен) конкретных видов фибронектина. Они идентифицировали пептид,состоящий из 8 аминокислот, Glu-Ile-Leu-AspVal-Pro-Ser-Thr, a также два более коротких перекрывающих пентапептида, Glu-Ile-Leu-AspVal и Leu-Asp-Val-Pro-Ser, которые обладают ингибирующей активностью в отношении фибронектин-зависимой клеточной адгезии. Некоторые более длинные пептиды, содержащие последовательность LDV, как было показано впоследствии, обладают активностью in vivoInvest., 94, pp.655-62 (1994. Описан также циклический пентапептид, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (в котором ТРrо обозначает 4-тиопролин), который может ингибировать адгезию как VLA-4, так иNowlin et al., "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesion",J. Biol. Chem., 268(27), pp.20352-59 (1993); и РСТ публикацию PCT/US 91/04862). Этот пентапептид был основан на трипептидной последовательности Arg-Gly-Asp из FN, которая известна как распространенный код в распознающем сайте нескольких белков внеклеточного матрикса. Примеры других малых молекулингибиторов VLA-4 приводятся, например, Adams et al. "Cell Adhesion Inhibitors", PCT US 97/13013, где описываются линейные пептидильные соединения, содержащие -аминокислоты, которые обладают свойством ингибировать адгезию клеток. Международные патентные заявки WO 94/15958 и WO 92/00995 описывают циклические пептидные и пептидомиметические соединения, обладающие свойством ингибировать адгезию клеток. Международные патентные заявки WO 93/08823 и WO 92/08464 описывают соединения, содержащие гуанидинил, мочевину и тиомочевину, обладающие свойством ингибировать адгезию клеток. Патент США 5260277 описывает соединения,содержащие гуанидинил, обладающие свойством модулировать адгезию клеток. Такие миметические агенты, представляющие собой малые молекулы, могут быть получены путем синтеза множества пептидов,полупептидных соединений или непептидных 15 соединений, органических соединений, а затем путем скрининга этих соединений на предмет их способности ингибировать взаимодействие 4 интегрин/лиганд 4 интегрина. См. основные сведения в патенте США 4833092, ScottA Source of Specific Protein Binding Molecules",Science, 249, pp. 40407 (1990. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения агент,который используется в способе по настоящему изобретению для связывания, включая блокирование или покрывание, 4 интегрина клеточной поверхности и/или лиганда 4 интегрина, представляет собой анти-VLА-4 и/или анти-47 моноклональное антитело или гомолог антитела. Предпочтительные антитела и гомологи для лечения, в частности для лечения человека,включают гомологи человеческих антител, гомологи гуманизированных антител, гомологи химерных антител, фрагменты антител Fab, Fab',F(ab')2 и F(v), а также мономеры или димеры тяжелых или легких цепей антител или их смеси. Моноклональные антитела против VLA-4 являются предпочтительным связывающим агентом в способе по настоящему изобретению. Используемый в настоящем описании термин "гомолог антитела" включает интактные антитела, состоящие из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, соединенных посредством дисульфидных связей. Термин "гомолог антитела" охватывает также белок, включая один или более полипептидов, выбранных из легких цепей иммуноглобулина, тяжелых цепей иммуноглобулина и их антигенсвязывающих фрагментов, которые способны связываться с одним или более антигеном. Полипептиды-компоненты гомолога антитела, составленного из более чем одного полипептида, могут, необязательно,иметь поперечные связи в форме дисульфидных мостиков или другого вида ковалентных связей. Соответственно, таким образом, "гомологи антител" включают интактные иммуноглобулины типов IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (a также их подтипы), в которых легкие цепи иммуноглобулина могут быть типов каппа или лямбда."Гомологи антител" также включают части интактных антител, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, например,фрагмент Fab, фрагменты Fab', фрагментыF(ab')2, фрагменты F(v), мономеры или димеры тяжелых цепей, мономеры или димеры легких цепей, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и т.п. Таким образом, антигенсвязывающие фрагменты, а также димерные или тримерные полипептиды полной длины,полученные из описанных выше антител, пригодны для целей настоящего изобретения. 16 Используемый в настоящем описании термин "гомолог гуманизированного антитела" представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена, замещены соответствующими аминокислотами из легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающих, не являющихся человеком. Используемый в настоящем описании термин "гомолог химерного антитела" представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в котором весь или часть шарнирного участка и константных участков легкой цепи, тяжелой цепи иммуноглобулина или обеих, замещены на соответствующие участки из легкой цепи или тяжелой цепи другого иммуноглобулина. Другой особенностью настоящего изобретения является вариант химерной молекулы, которая включает (1) часть, нацеленную на VLA-4, например часть VCAM-1, способную связываться с антигеном (т.е. VLA-4) на поверхности миеломных клеток, несущих VLA-4; (2) необязательно второй пептид, например повышающий растворимость или продолжительность жизни части, нацеленной на VLA-4, in vivo, например,член суперсемейства иммуноглобулинов или его фрагмент, например, часть или фрагментIgG, например, константный участок тяжелой цепи человеческого IgG1, например, шарнирные участки СН 2 и СН 3; и часть, представляющую собой токсин. Часть, нацеленная на VLA-4, может представлять собой любой встречающийся в естественных условиях лиганд VLA-4 или его фрагмент, например, пептид VCAM-1, или подобную консервативно замещенную аминокислотную последовательность. Предпочтительной нацеленной частью является растворимый фрагмент VCAM-1, например, N-концевые домены 1 и 2 молекулы VCAM-1. Химерная молекула может использоваться для лечения субъекта, например, человека, имеющего риск заболевания, например, множественной миеломы, которое характеризуется наличием миеломных клеток, несущих VLA-4, и предпочтительно активированный VLA-4. Используемый в настоящем описании термин "гомолог человеческого антитела" представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в котором все аминокислоты легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина получены из человеческого источника. Способы получения гомологов анти-VLA-4 антител Технология получения гомологов моноклональных антител хорошо известна. Вкратце,иммортализированную клеточную линию(обычно миеломных клеток) сливают с лимфо 17 цитами (обычно спленоцитами) от млекопитающего, иммунизированного цельными клетками, экспрессирующими данный антиген, например, VLA-4, и супернатанты культур полученных гибридомных клеток подвергают скринингу на предмет антител против указанного антигена. Общую информацию см. в Kohler etal., 1975, Nature, 265:295-297. Иммунизацию можно осуществлять с помощью обычных методик. Стандартная доза и схема иммунизации зависят от вида млекопитающего, которое иммунизируют, его иммунного статуса, веса тела млекопитающего и т.п. Обычно у иммунизированных животных берут кровь, и сыворотка от каждого образца крови исследуется на предмет конкретных антител с использованием подходящих методик скрининга. Например, анти-VLА-4 антитела можно идентифицировать путем иммунопреципитации клеточных лизатов VLA-4-экспрессирующих клеток, меченых 125I. (См. Sanchez-Madrid et al.,1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 и Hemler etal., 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Анти-VLА-4 антитела можно также идентифицировать проточной цитометрией, например, путем измерения флюоресцентного окрашивания клеток Ramos, инкубированных с антителом,распознающим VLA-4 (см. Elices et al., 1990,Cell, 60: 577-584). Лимфоциты, которые используются для получения гибридомных клеток,обычно выделяют от иммунизированных млекопитающих, сыворотка крови которых показала положительные результаты на наличие антиVLА-4 антител по результатам таких скрининговых исследований. Обычно иммортализированную клеточную линию (например, линию миеломных клеток) получают от того же вида млекопитающих, что и лимфоциты. Предпочтительными иммортализированными клеточными линиями являются мышиные миеломные клеточные линии, которые являются чувствительными к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("НАТ-среда"). Обычно НАТчувствительные мышиные миеломные клетки сливают с мышиными спленоцитами с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 ("PEG 1500"). Полученные слитые гибридомные клетки затем подвергают селекции с использованием среды HAT, которая убивает неслитые и непродуктивно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты погибают, спустя несколько дней, поскольку они не были трансформированы). Гибридомы, вырабатывающие желаемое антитело, выявляют путем скрининга супернатантов гибридомных культур. Например, гибридомы, полученные с целью выработки анти-VLA-4 антител, можно подвергать скринингу путем исследования супернатанта гибридомной культуры на секретируемые антитела, обладающие способностью связываться с клеточной линией, экспрессирующей рекомби 004270 18 нантную 4-субъединицу (см. Elices et al., выше). Для получения гомологов анти-VLА-4 антител, которые представляют собой интактные иммуноглобулины, гибридомные клетки, которые показали положительные результаты при подобных скрининговых исследованиях, культивировали в питательной среде при условиях и в течение такого времени, которые достаточны для того, чтобы гибридомные клетки секретировали моноклональные антитела в культуральную среду. Методики культивирования тканей и культуральные среды, пригодные для культивирования гибридомных клеток, хорошо известны. Кондиционированный супернатант гибридомной культуры можно собирать и, необязательно,затем выделять из него анти-VLА-4 антитела с помощью хорошо известных способов. Альтернативно, желаемое антитело можно получить путем инъецирования гибридомных клеток в перитонеальную полость неиммунизированной мыши. Гибридомные клетки пролиферируют в перитонеальной полости, секретируя антитела, которые накапливаются в асцитной жидкости. Антитела можно собирать путем извлечения асцитной жидкости из перитонеальной полости с помощью шприца. Несколько мышиных анти-VLА-4 моноклональных антител были описаны ранее. (См.,например, Sanchez-Madrid et al., 1986, выше;Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245). Эти антиVLА-4 моноклональные антитела, такие как HP 1/2 и другие анти-VLА-4 антитела (например,НР 2/1, НР 2/4, L25, Р 4 С 2, P4G9), способные распознавать Р-цепь VLA-4, будут пригодны для использования в способах лечения по настоящему изобретению. Анти-VLА-4 антитела, которые будут распознавать эпитопы цепи 4VCAM-1 и фибронектина (т.е. антитела, которые могут связываться с VLA-4 в сайте, участвующем в распознавании лиганда и блокировании VCAM-1 и связывании фибронектина), являются предпочтительными. Такие антитела определят как В-эпитоп-специфичные антитела(В 1 или В 2) (Pulido et al., 1991, выше) и также представляют собой анти-VLА-4 антитела по настоящему изобретению. Полностью человеческие гомологи моноклональных антител против VLA-4 представляют собой другой предпочтительный связывающий агент, который может блокировать или покрывать VLA-4 антигены в способе по настоящему изобретению. В интактной форме они могут быть получены с помощью праймированныхBoerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Альтернативно они могут быть получены путем репертуарного клонирования, как описано Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 19 88:2432-2436, или Huang and Stollar, 1991, J.their use"), которые описывают получение человеческих моноклональных антител из человеческих В-клеток. Согласно этому способу человеческие В-клетки, продуцирующие антитела,иммортализируются путем инфекции вирусом Эпштейна-Барра или его производным, которое экспрессирует ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барра (EBNA2). Функцию EBNA2, которая требуется для иммортализации, впоследствии пресекают, что приводит к возрастанию выработки антител. Еще в одном способе получения полностью человеческих антител, патенте США 5789650 (4 августа 1998 г., "Transgenic nonhuman animals for producing heterologous antibodies"), описываются трансгенные животные(не человек), способные вырабатывать гетерологичные антитела, и трансгенные животные(не человек), имеющие инактивированные гены эндогенных иммуноглобулинов. Гены эндогенных иммуноглобулинов подавлены античувствительными полинуклеотидами и/или антисывороткой против эндогенных иммуноглобулинов. Гетерологичные антитела кодируются генами иммуноглобулинов, которые в норме отсутствуют в геноме данного вида животных, не являющихся человеком. Один или более трансгенов, содержащих последовательности переаранжированных тяжелых цепей гетерологичных иммуноглобулинов человека, интродуцируют животному, не являющемуся человеком,формируя, таким образом, трансгенное животное, способное функционально реаранжировать трансгенные иммуноглобулиновые последовательности и продуцировать спектр антител различных изотипов, кодируемых генами человеческого иммуноглобулина. Такие гетерологичные человеческие антитела продуцируются Вклетками, которые затем иммортализируют,например, путем сливания с иммортазилированной клеточной линией, такой как миелома,или путем манипулирования с такими Вклетками с использованием других методик,увековечивающих клеточную линию, способную вырабатывать моноклональный гетерологичный гомолог полностью человеческого антитела. Для выделения высокоаффинных антител,которые можно разрабатывать как лекарственное средство для человека, можно использовать также большие библиотеки выделенных фагов неиммунизированного человека с помощью стандартной фаговой методики (Vaughan et al.,1996). Еще одним предпочтительным связывающим агентом, который может блокировать или покрывать VLA-4 антигены в способе по настоящему изобретению, является гуманизированный рекомбинантный гомолог антитела, об 004270 20 ладающий анти-VLА-4 специфичностью. В продолжение ранних методик получения химерных антител в ЕР 0230400 (Winter et al.) был описан новый подход, при котором антитела изменяют посредством замещения их гипервариабельных участков (CDR) одного вида на таковые другого вида. Этот способ можно использовать, например, для замещения CDR из доменов вариабельного участка тяжелой и легкой цепи человеческого Ig альтернативными CDR из доменов мышиных вариабельных участков. Эти измененные вариабельные участки Ig можно затем комбинировать с константными участками человеческого Ig для создания антител, которые являются полностью человеческими, за исключением замещенных мышиных CDR. Можно прогнозировать, что такие CDRзамещенные антитела с меньшей степенью вероятности будут вызывать иммунный ответ у человека по сравнению с химерными антителами, поскольку CDR-замещенные антитела содержат значительно меньше компонентов нечеловеческого происхождения. Эта методика получения гуманизированных моноклональных антител посредством "трансплантации" CDR называется "решейпингом". (Riechmann et al.,1988, Nature, 332, 323-327; Verhoeyen et al.,1988, Science, 239, 1534-1536). Обычно гипервариабельные участки(CDR) мышиного антитела трансплантируют в соответствующие участки человеческого антитела, поскольку именно CDR (три в тяжелых цепях антител, три в легких цепях антител) являются теми участками мышиного антитела,которые связываются со специфичным антигеном. Трансплантация CDR достигается путем методик генной инженерии, в то время как последовательности ДНК CDR определяются путем клонирования генных сегментов вариабельного (V) участка мышиных тяжелых и легких цепей, а затем переносятся в соответствующие человеческиеV-участки путем сайтнаправленного мутагенеза. На финальной стадии этого процесса добавляют генные сегменты человеческого константного участка желаемого изотипа (обычно гамма I для СН и каппа - дляCL) и гуманизированные гены тяжелой и легкой цепей коэкспрессируются клетками млекопитающих с выработкой растворимого гуманизированного антитела. Перенос этих CDR в человеческое антитело придает этому антителу антигенсвязывающие свойства оригинального мышиного антитела. Шесть CDR в мышином антителе структурно собираются на каркасном участке V-участка. Причиной, по которой трансплантация CDR проходит успешно, является то, что каркасные участки между мышиным и человеческим антителами могут иметь весьма сходное пространственное строение со сходными точками присоединения CDR таким образом, что CDR могут быть взаимозаменяемыми. Такие гуманизиро 21 ванные гомологи антител можно получить, как описано у Jones et al., 1986, Nature, 321, 522-525;Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86,3833. Тем не менее, определенные аминокислоты внутри каркасных участков, как полагают,взаимодействуют с CDR и влияют на антигенсвязывающую аффинность в целом. Прямой перенос CDR из мышиного антитела для получения рекомбинантного гуманизированного антитела без каких бы то ни было модификаций каркасов человеческих V-участков часто приводит к частичной или полной утрате связывающей аффинности. В ряде случаев представляется принципиально важным изменение остатков в каркасных участках акцепторного антитела с целью получения связывающей активности.(Protein Design Labs) описывают получение гуманизированного антитела, которое содержит модифицированные остатки в каркасных участках акцепторного антитела, путем комбинирования CDR мышиного mAb (анти-Тас) с каркасными и константными участками человеческого иммуноглобулина. Они продемонстрировали одно решение проблемы утраты связывающей аффинности, которая часто является результатом прямого переноса CDR без каких бы то ни было модификаций остатков каркасов человеческих V-участков; их решение проблемы включает два ключевых этапа. Сначала каркасы человеческих V-участков выбирают посредством компьютерного анализа на предмет оптимальной гомологичности белковой последовательности каркасу V-участка оригинального мышиного антитела, в данном случае анти-ТАС мАb. На втором этапе моделируют третичную структуру мышиного V-участка на компьютере с целью визуализации аминокислотных остатков каркаса, которые, вероятно, будут взаимодействовать с мышиными CDR, и эти мышиные аминокислотные остатки затем накладывают на гомологичный человеческий каркас. См. также ProteinDesign Labs - патент США 5693762. Можно использовать также другой подход(Tempest et al., 1991, Biotechnology, 9, 266-271) и использовать в качестве стандарта каркасы Vучастка, полученные из NEWM и REI тяжелой и легкой цепи, соответственно, для трансплантации CDR без радикальной интродукции мышиных остатков. Преимуществом подхода, предложенного Tempest et al. для построения гуманизированных антител на основе NEWM и REI,является то, что пространственные структуры вариабельных участков NEWM и REI известны благодаря рентгеновской кристаллографии и,таким образом, можно смоделировать специфичные взаимодействия между CDR и каркасными остатками V-участка. 22 Независимо от избранного подхода, примеры исходных гуманизированных гомологов антител, полученных к настоящему моменту,показали, что это не является простым процессом. Однако даже зная, что такие изменения каркаса могут быть необходимы, невозможно предсказать на основе имеющихся уже данных,какие остатки каркаса нужно будет изменить,если вообще нужно, чтобы получить функциональные гуманизированные рекомбинантные антитела с желаемой специфичностью. Таким образом, результаты указывают, что изменения,необходимые для сохранения специфичности и/или аффинности, в большинстве своем уникальны для данного антитела и не могут быть предсказаны на основе гуманизации другого антитела. Предпочтительные антагонисты, пригодные для настоящего изобретения, включают химерные рекомбинантные и гуманизированные рекомбинантные гомологи антител (т.е. интактные иммуноглобулины и их части) с Вэпитопной специфичностью, которые были получены и описаны в одновременно рассматриваемой патентной заявке США 08/004798,поданной 12 января 1993 г., РСТ публикации US 94/00266, поданной 7 января 1994 г. Исходным материалом для получения химерных (мышиный V - человеческий С) и гуманизированных гомологов анти-VLА-4 антитела может быть мышиное моноклональное анти-VLА-4 антитело, как было описано ранее, коммерчески доступное моноклональное анти-VLА-4 антитело(например, НР 2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine), или моноклональное анти-VLА-4 антитело, полученное согласно настоящему изобретению. Например, вариабельные участки тяжелой и легкой цепей анти-VLА-4 антителаHP1/2 клонируют, секвенируют и экспрессируют в комбинации с константными участками тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина. Такое HP1/2 антитело по специфичности и эффективности сходно с мышиным HP1/2 антителом и может быть пригодным для способов лечения по настоящему изобретению. Другие предпочтительные гуманизированные гомологи анти-VLA-4 антитела описаны(27 июля 1995 г.). Эти гуманизированные антиVLA-4 антитела включают гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь. Гуманизированная легкая цепь включает гипервариабельные участки (CDR1, CDR2 иCDR3), имеющие аминокислотные последовательности из соответствующих гипервариабельных участков легкой цепи мышиного иммуноглобулина 21-6 и каркас вариабельного участка из каркасной последовательности вариабельного участка человеческой легкой цепи каппа, за исключением того случая, когда по крайней мере одна аминокислотная позиция занята той же аминокислотой, которая представлена на экви 23 валентной позиции каркаса вариабельного участка легкой цепи мышиного иммуноглобулина 21.6. Гуманизированная тяжелая цепь включает гипервариабельные участки (CDR1, CDR2 иCDR3), имеющие аминокислотные последовательности из соответствующих гипервариабельных участков тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина 21-6 и каркас вариабельного участка из каркасной последовательности вариабельного участка человеческой тяжелой цепи, за исключением того случая, когда по крайней мере одна аминокислотная позиция занята той же аминокислотой, которая представлена на эквивалентной позиции каркаса вариабельного участка тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина 21-6. Терапевтическое применение В этом способе согласно первому аспекту настоящего изобретения VLA-4-связывающие агенты, например слитые формы VCAM и гомологи анти-VLА-4 антитела, предпочтительно вводят парентерально. Используемый в настоящем описании термин "парентеральный" включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, внутрисиновиальную,интрастернальную, подоболочечную, внутрипеченочную, интракраниальную инъекцию или инфузию, а также методику введения непосредственно в область поражения.VLA-4-связывающие агенты предпочтительно вводят в форме стерильной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, который может представлять собой любой из многочисленных хорошо известных носителей, таких как вода,физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстроза, глицерин, этанол и т.п. или их комбинации. Соединения по настоящему изобретению могут применяться в форме фармацевтически приемлемых солей, полученных с неорганическими или органическими кислотами и основаниями. Среди таких кислых солей включены следующие: ацетат, адипинат, альгинат, аспартат, бензоат,бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат,камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гесканоат, гидрохлорид,гидробромид,гидроиодид,2 гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат,оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3 фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат,сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Основные соли включают соль аммония,соли щелочных металлов, такие как натриевая и калиевая соли, соли щелочно-земельных металлов, такие как кальциевая и магниевая соли,соли с органическими основаниями, такие как соли с бициклогексиламином, N-метил-Dглюкамином, трис(гидроксиметил)метиламином 24 и соли с аминокислотами, такими как аргинин,лизин и т.п. Также основные азотсодержащие группы могут быть превращены в четвертичные основания с помощью таких агентов, как низшие алкилгалогениды, таких как метил-, этил-,пропил- и бутилхлориды, бромиды и иодиды; диалкил сульфаты, такие как диметил-, диэтил-,дибутил- и диамилсульфаты; длинноцепочечные галогениды, такие как децил-, лаурил-, миристил- и стеарилхлориды, бромиды и иодиды; аралкилгалогениды, такие как бензил- и этоксифенилбромиды, и прочие. Таким образом, получают водо- или жирорастворимые или диспергируемые продукты. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают любое из соединений по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые производные вместе с любым фармацевтически приемлемым носителем. Используемый в настоящем описании термин "носитель" включает приемлемые адъюванты и наполнители. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают, но не ограничивают, ионообменные соединения, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, неполные глицериды смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода,соли или электролиты, такие как протаминсульфат, вторичный кислый фосфат натрия,вторичный кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния,трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, полиэтилен-полиоксипропилен блок-полимеры, полиэтиленгликоль и ланолин. Согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного препарата для инъекций, например,в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Эту суспензию можно составлять согласно известным способам с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может представлять собой также стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например,в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Приемлемые наполнители и растворители, которые можно использовать, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Помимо этого, стерильные жирные масла традиционно используются в качестве растворителя или суспензионной среды. Для этой цели можно использовать любое нераздражающее жирное 25 масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные,пригодны для изготовления препаратов для инъекций как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных формах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующий агент, такой как Ph.Helv. или подобный спирт. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, в частности антагонисты взаимодействия VLA-4/VCAM-1, представляющие собой малые молекулы, можно вводить парентерально или перорально. При пероральном введении их можно вводить в виде любой лекарственной формы для перорального введения, включая, но не ограничивая, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального введения носители, которые широко используются, включают лактозу и кукурузный крахмал. Обычно добавляют также смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул пригодные разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального приема требуются водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. Если это желательно, можно добавлять также определенные подсластители, отдушки или красители. Можно использовать также пластыри для местного чрескожного введения. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно также вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции через аэрозольное устройство, ингалятор сухого порошка или ингалятор с отмеренной дозой. Такие композиции изготавливают с помощью хорошо известных технологий изготовления фармацевтических композиций, а также их можно изготовить в виде растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, ускорителей всасывания для повышения биодоступности, фторуглеводородов и/или других обычных солюбилизирующих или диспергирующих агентов. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, могут также включать дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из кортикостероидов, противовоспалительных агентов, иммунодепрессантов, антиметаболитов и иммуномодуляторов. Конкретные соединения каждого из этих классов можно выбрать в перечне под соответствующими заголовками в 26 сание которого включено в настоящее описании в качестве ссылки. В эту группу также включены такие соединения как теофиллин, сульфалазин и аминосалицилаты (противовоспалительные агенты); циклоспорин, FK-506 и рапамицин(иммунодепрессанты); циклофосфамид и метотрексат (антиметаболиты); стероиды (для ингаляции, перорального или местного применения) и интерфероны (иммуномодуляторы). Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материаламиносителями для изготовления лекарственной формы в виде дозированных единиц, будет варьировать в зависимости от пациента и особенно от способа введения. Следует понимать,однако, что конкретная дозировка и схема лечения для каждого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, включая активность конкретного использующегося соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол,характер питания, время введения, скорость выделения, лекарственное сочетание и мнение лечащего врача, а также тяжесть конкретного заболевания, по поводу которого проводится лечение. Количество активного ингредиента может также зависеть от терапевтического или профилактического агента, если таковой имеется, совместно с которым этот ингредиент вводят. Доза и частота введения соединений по настоящему изобретению, эффективные для профилактики, подавления или ингибирования клеточной адгезии, будут зависеть от ряда факторов, таких как природа ингибитора, вес пациента, цель лечения, природа патологии, по поводу которой проводится лечение, конкретная используемая фармацевтическая композиция, а также мнение лечащего врача. Уровни доз от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг веса тела в день активного ингредиента, являются пригодными. Наиболее предпочтительноVLA-4-связывающий агент, если он представляет собой антитело или производное антитела,вводят в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг веса тела в день и с интервалами в 114 дней. Для связывающих агентов, не являющихся антителами или представляющих собой малые молекулы, пределы доз должны предпочтительно заключаться между молярными эквивалентными количествами по отношению к этим количествам антитела. Предпочтительно композицию антитела вводят в количестве, эффективном для создания уровня антитела в плазме крови по меньшей мере 1 мг/мл. Оптимизацию дозировок можно определить путем введения связывающих агентов с последующей оценкой покрывания VLA-4-положительных 27 клеток агентом в зависимости от времени после введения данной дозы in vivo. Миеломные клетки, содержащиеся в образце периферической крови индивидуума (или клеток костного мозга), следует исследовать на наличие агента in vitro (или ex vivo) с использованием второго реагента для выявления введенного агента. Например, это может быть антитело, меченое флюорохромом, специфичное в отношении введенного агента, количество которого затем измеряется с помощью стандартногоFACS анализа (с помощью клеточного сортера с возбуждением флюоресценции). Альтернативно, наличие введенного агента может быть выявлено in vitro (или ex vivo) no неспособности или пониженной способности клеток индивидуума связываться с тем же агентом, который сам был помечен (например, флюорохромом). Предпочтительная дозировка должна обеспечивать выявляемое покрытие подавляющего большинства VLA-4-положительных клеток. Предпочтительно покрытие сохраняется в случае использования гомолога антитела на период времени 1-14 дней. Модели на экспериментальных животных Подробно описана модель на экспериментальных животных (Garrett, 1997). Вкратце, Radlet al. (1988) описали модель миеломы на мышах,которая возникала спонтанно у старых мышейC57BL/KaLwRij. Это состояние наблюдалось приблизительно у 1 из 200 животных по мере их старения и приводило к возникновению моноклональной гаммапатии с некоторыми признаками человеческого заболевания (Radl, 1988). Для разработки более совершенной и более воспроизводимой модели на экспериментальных животных авторы настоящего изобретения основали и субклонировали клеточную линию из этой мышиной миеломы, названную 5TGM1, и установили, что она вызывает поражения у мышей, характерные для человеческой миеломы,такие как тяжелый остеолиз и вовлечение некостных органов, включая печень и почки (Garrett,1997). У мышей, которым инокулировали культивированные клетки, с высокой степенью прогностической точности и воспроизводимости развивалось заболевание, которое включало появление моноклональной гаммапатии и костных поражений, обнаруживаемых при рентгенологическом исследовании. Помимо этого, у некоторых из мышей развивалась гиперкальциемия, а костные поражения характеризовались повышенной активностью остеокластов. Таким образом, на основании гистологического исследования пораженных органов у мышей,несущих 5TGM1, и повышенных сывороточных уровней IgG2b, 5TGM1, определили как мышиную миелому, которая точно повторяет главные признаки человеческого заболевания. Следующие примеры предназначены для дальнейшего освещения некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего 28 изобретения и не предназначены для какого бы то ни было его ограничения. В следующих примерах необходимые рестрикционные ферменты,плазмиды и другие реагенты и материалы могут быть получены из коммерческих источников и клонированы, сшивание и другие методики в отношении рекомбинантной ДНК могут быть выполнены с помощью хорошо известных способов. Пример 1. Материалы и методы. Миеломные клетки 5TGM1. Миеломные клетки 5TGM1 первоначально были получены из миеломы, которая возникала спонтанно у старых мышей C57BL/KaLwRij(Garrett, 1997; Vanderkerken, 1997). Клетки выращивали на модифицированной по способуIsocove среде Дульбекко (IMDM, Life Technologies Inc., Gaitherburg, MD) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Summit, Fortvitro, описанных ниже, использовали клетки 5TGM1 между 25 и 30 пассажами. Антитела, растворимый VCAM-1. Нейтрализующие антитела против мышиного VCAM-1 (М/К-2.7), интегрин VLA-4 (PS/2) и молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1,YN1/1.7) были любезно предоставлены Dr. Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, Japan). Рекомбинантный растворимый VCAM-1(Lobb et al., 1991), содержащий 7 внеклеточных доменов человеческого VCAM-1, был подаренDr. Roy Lobb, Biogen Inc., Cambridge, MA. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (RT-PCR). Используя RT-PCR, авторы настоящего изобретения подтвердили экспрессию VCAM-1 и 4 интегрина стромальными клетками костного мозга и 5TGM1 соответственно. Всю РНК получали из 5TGM1, первичной культуры стромальных клеток костного мозга и клеточной линии стромальных клеток костного мозга ST2(RIKEN Cell Bank, Tsucuba, Japan) с помощью методики одноэтапного выделения РНК с использованием реагента TRIzol (GIBCO). 3 мкг РНК инкубировали с 50 нг произвольного гексамера при 70 С в течение 10 мин и охлаждали на льду, затем конвертировали в первую цепь кДНК с использованием обратной транскриптазы (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) в соответствии с инструкциями производителя. Для проведения ПЦР использовали следующие праймеры: мышиный VCAM-1 5'-праймеp; 5'-OH-GCTGCGTGC-3'-ОН [SEQ ID NO: 4]. ПЦР (PCR) осуществляли в течение 30 циклов, состоявших из 1 мин при 94 С, 1 мин при 55 С и 2 мин при 72 С. Реакционная смесь ПЦР (всего 50 мкл) содержала 10 мкл. Первая цепь кДНК, 50 мМ KСl, 10 мМ Трис-НСl (рН 8,3), 2 мМ MgCl2, дезокси-NTP смесь (0,2 мМ каждый), пара праймеров (0,15 мкмоль каждого) и 2 ЕД Taq ДНК-полимеразы (Perkin-Elmer,Branchburg, NJ). Продукты ПЦР разделяли на 2,5% агарозном геле, содержавшем этидия бромид, и визуализировали при ультрафиолетовом свете. Размеры фрагментов подтверждали с использованием стандартных маркеров молекулярной массы. Прикрепление клеток 5TGM1 на стромальные клетки костного мозга. Для экспериментов по гетеротипичной клеточной адгезии клетки ST2 (5104/лyнкa) засевали на 48-луночные культуральные планшеты (Costar, Cambridge, MA) и культивировали в течение 48 ч в среде МЕМ с 10% FBS до полного слияния. Клетки 5TGM1 (5106) метили путем инкубации с 10 микроКи [метил 3 Н]тимидином (New England Nuclear) в течение 24 ч при 37 С в культуральной среде. После образования монослоя ST2 его инкубировали с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA,Sigma, St.Louis, МО) в среде МЕМ без сыворотки в течение 1 ч и на этот монослой засевали клетки 5TGM1, меченые тритием. Эту систему инкубировали в отсутствии или при наличии антител к VCAM-1 или 41 интегрину при 37 С в течение 1 ч. Неприкрепившиеся клетки удаляли путем отмывания монослоя 5% трихлоруксусной кислотой дважды и PBS дважды, а прикрепившиеся клетки солюбилизировали в 300 мкл 0,25 мМ NaOH, нейтрализованного тем же объемом 0,25 мМ НСl, и радиоактивность определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Изучение формирования остеокластов в совместной культуре клеток 5TGM1 и костного мозга мыши. Клетки костного мозга мыши получали от 5-недельных самцов мышей C57BL, как было описано ранее (Yoneda, 1993). Бедренные и большеберцовые кости рассекали в асептических условиях и отсекали оба конца. Клетки костного мозга вымывали, собирали и инкубировали в среде МЕМ с содержанием 10% FBS(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) при 37 С в течение 2 ч. Собирали неприкрепившиеся клетки, содержащие гемопоэтические предшественники остеокластов и стромальные клетки. Костномозговые клетки (1106) и клетки 5TGM1 (1103) в 300 мкл культуральной среды засевали на 48-луночные культуральные план 004270 30 шеты (0 день). На 2 день 300 мкл свежей культуральной среды осторожно добавляли в каждую лунку, а на 4 день 300 мкл использованной среды заменяли тем же объемом свежей среды. На 6 день культуры фиксировали и окрашивали на предмет выявления тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP) с помощью коммерческих наборов (Sigma). TRAP-положительные многоядерные клетки, имеющие более 3 ядер,определяли как остеокластподобные (ОСподобные) клетки и подсчитывали вручную под микроскопом. Для подтверждения того, что эти ОС-подобные клетки обладают способностью резорбировать кость, клетки 5TGM1 и клетки костного мозга совместно культивировали на тонких срезах дентина кита одинакового качества размером 5 х 5 мм и образовавшиеся на этих срезах дентина участки резорбции исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии как описано (Yoneda 1992). В некоторых экспериментах совместное культивирование миеломных клеток 5TGM1 и клеток костного мозга осуществляли с использованием чрезлуночных вставок (Becton Dickinson Labware) для предотвращения прямого контакта между клетками этих двух типов (2106,24-луночные планшеты, Costar). Клетки костного мозга засевали на нижние камеры, а миеломные клетки 5TGM1 (2103) затем засевали на нижние (прямой контакт) или на верхние (контакт отсутствует) камеры. Органные культуры длинных костей плодов крысы, меченых 45 Са. Кондиционированные среды, полученные посредством культивирования 5TGM1, изучали на предмет костнорезорбирующей активности в органных культурах длинных костей плодов крысы, меченых 45 Са, как описано ранее(Mbalaviele 1995). Беременным крысам инъецировали 250 мкКи 45 Са (New England Nuclear) на 18 день беременности. Тела лучевых и локтевых костей получали от 19-дневных плодов путем микродиссекции и предварительно культивировали в течение 24 ч в среде BCJ (Sigma) с содержанием 0,1% BSA между воздушной и водной фазами на решетках сита из нержавеющей стали. Кости затем культивировали в присутствии кондиционированной среды (50% об./об.) или в контрольной среде в течение 120 ч. Среды меняли 1 раз в 48 ч. В конце культивирования кости инкубировали в ледяной 5% трихлоруксусной кислоте в течение 2 ч и определяли радиоактивность 45 Са с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Резорбцию кости оценивали как процент 45 Са, высвобожденного в среду, согласно расчету: Совместная культура миеломных клеток 5TGM1 и клеток клеточной линии мышиных стромальных клеток ST2.(410 ) засевали вместе на 60-мм культуральные чашки (Beckton Dickinson) в среду IMDM с 10%FBS и культивировали в течение ночи, дважды отмывали не содержавшей сыворотки средойIMDM и инкубировали в 5 мл не содержавшей сыворотки среды IMDM. Спустя 48 ч собирали кондиционированную среду и хранили ее при-70 С до использования. Влияние mAb PS2 против VLA-4 на подъем IgG2b в сыворотке крови мышей, несущих 5TGM1. Мышам инъецировали 1105 клеток 5TGM1, которые колонизировали костный мозг. Мышей разделяли на две группы по три, одна из которых служила контролем, а вторая получала дважды в неделю, начиная с 8 дня, по 80 мкгmAb PS/2 (4 мг/кг). Уровни IgG2b, изотипа антитела, вырабатываемого миеломными клетками 5TGM1, измеряли еженедельно с 1 по 6 неделю. Результаты Экспрессия VCAM-1, VLA-4 и влияние антител против VCAM-1 и VLA-4 на прикрепление 5TGM1 к монослоям ST2. Используя RT-PCR, авторы настоящего изобретения подтвердили экспрессию VCAM-1 и интегрина VLA-4 стромальными клетками костного мозга и миеломными клетками соответственно. Как и ожидалось, и линия стромальных клеток ST2, и первичные стромальные клетки костного мозга экспрессировали VCAM1, в то время как 5TGM1 не делали этого. Напротив, миеломные клетки 5TGM1 экспрессировали интегрин VLA-4, в то время как стромальные клетки - нет (данные не представлены). Помимо этого, и анти-VCAM-1 антитело (10 мкг/мл), и VLA-4 антитело (10 мкг/мл) частично(50-80%) ингибировали прикрепление клеток 5TGM1 к монослоям ST2, что свидетельствует о том, что VCAM-1 и интегрин VLA-4, экспрессируемые этими клетками, являются биологически функциональными и что эти антитела обладают нейтрализующей активностью (данные не представлены). Формирование ОС-подобных клеток в совместной культуре миеломных клеток 5TGM1 и клеток костного мозга мыши. На 6 день совместного культивирования клеток 5TGM1 и клеток костного мозга мыши сформировались многочисленныеTRAPположительные многоядерные остеокластподобные (ОС-подобные) клетки. Эти ОСподобные клетки демонстрировали образование участков резорбции кости на срезах дентина,показывая, что эти клетки способны резорбировать кость и обладают фенотипом остеокластов. В экспериментах с использованием чрезлуночных вставок формирование ОС-подобных клеток наблюдалось при культивировании клеток 5TGM1 в прямом контакте с клетками костного 6 32 мозга. Напротив, наблюдалось только малое число ОС-подобных клеток, сформировавшихся при отделении клеток 5TGM1 от клеток костного мозга с помощью чрезлуночной перегородки. Таким образом, клетки 5TGM1 индуцируют формирование остеокластов в смешанных костномозговых культурах, и эта индукция требует прямого контакта клеток. Влияние антител против VCAM-1 и интегрина VLA-4 на формирование ОС-подобных клеток в совместной культуре клеток 5TGM1 и клеток костного мозга. Как анти-VCAM-1 антитело (VCAM-1 Аb,10 мкг/мл), так и антиинтегрин VLA-4 антитела(41 Аb, 10 мкг/мл) резко ингибирует формирование ОС-подобных клеток. Напротив, mAb против ICAM-1, другой молекулы адгезии на стромальные клетки костного мозга, участвующая во взаимодействии стромальных и миеломных клеток, не оказывает влияния на формирование ОС-подобных клеток (фиг. 1). Чтобы определить, является ли это ингибирование с помощью VCAM-1 и VLA-4 mАb специфичным в отношении индуцированного 5TGM1 формирования ОС-подобных клеток и происходит не из-за наличия цитотоксичности,изучали влияние этих антител на формирование ОС-подобных клеток,индуцированное 1,25(ОН)2D3, широко применяющимся стимулятором остеокластогенеза в культурах клеток костного мозга мыши (Takahashi, 1988). НиVCAM-1 Ab, ни VLA-4 mAb не ингибировали формирование ОС-подобных клеток, индуцированное витамином D3, который сам по себе не оказывал влияния на экспрессию VCAM-1 стромальными клетками (данные не представлены). Влияние кондиционированной посредством совместного культивирования 5TGM1 иST2 среды на резорбцию кости. Кондиционированная среда, полученная посредством совместного культивирования клеток 5TGM1 и клеток ST2, показала выраженное увеличение резорбции кости в экспериментах на органных культурах длинных костей плодов крысы (фиг. 2), в то время как кондиционированная среда, полученная посредством культивирования клеток 5TGM1, вызывала лишь небольшое увеличение по сравнению с контрольной средой. Кондиционированная среда, полученная посредством культивирования клетокST2, не показала увеличения резорбции кости. Таким образом, прямой клеточный контакт через посредство VCAM-1 и VLA-4 индуцирует формирование остеокластподобных клеток и выработку костнорезорбирующих факторов inVCAM-1 (sVCAM-1) на приобретение костнорезорбирующей и остеокластогенной активности клетками 5TGM1. 33 Кондиционированная среда из-под клеток 5TGM1, обработанных растворимой рекомбинантной формой VCAM-1 (sVCAM-1), увеличивала резорбцию кости на длинных костях плода крысы дозозависимым образом, в то время как кондиционированная среда из-под необработанных клеток 5TGM1 только слегка увеличивала резорбцию кости. Растворимый VCAM-1 сам по себе не оказывал влияния на резорбцию кости(данные не представлены). В культуральной системе костного мозга крысы кондиционированная среда из-под клеток 5TGM1, обработанных sVCAM-1, показала возрастание активности формирования ОС-подобных клеток, в то время как кондиционированная среда из-под необработанных клеток 5TGM1 показала лишь небольшую активность формирования ОСподобных клеток (фиг. 3). Экспрессия мРНК Rank лиганда стромальными клетками костного мозга (ST2), культивированными в присутствии и отсутствии клеток мышиной миеломы. Поскольку Rank лиганд, как представляется, является важным медиатором формирования ОСL и может являться конечным общим путем для влияние остеокластогенных цитокинов на формирование OCL, авторы настоящего изобретения изучали экспрессию Rank лиганда клетками 5TGM1 и ST2, как по отдельности, так и в совместной культуре. Они установили, что совместная культура клеток 5TGM1 и ST2 индуцирует мРНК Rank лиганда в клетках ST2. Помимо этого, в то время как клетки 5TGM1 не экспрессируют Rank лиганд, они начинают его экспрессировать после обработки sVCAM-1 (не показано). И, наконец, кондиционированная среда из-под клеток 5TGM1, обработанныхsVCAM-1, индуцировала мРНК Rank лиганда в клетках ST2, что наводит на мысль о том, что путь VCAM-1/VLA-4 продуцирует цитокин в миеломных клетках, который усиливает экспрессию Rank лиганда стромальными клетками костного мозга (данные не представлены). Суммируя, можно заключить, что авторы настоящего изобретения показали, что клетки 5TGM1 по отдельности продуцируют пограничное количество активности, которая стимулирует формирование ОС-подобных клеток и резорбцию кости. Однако в случае, когда миеломные клетки 5TGM1 культивируют совместно с клетками костного мозга, содержащими гемопоэтические клетки-предшественники остеокластов и стромальные клетки, они прочно прикрепляются к стромальным клеткам и увеличивают формирование ОС-подобных клеток. В совместных культурах, в которых предотвращали контакт клеток 5TGM1 и стромальных клеток,формирования ОС-подобных клеток не наблюдалось. Более того, в органных культурах длинных костей плодов крысы кондиционированная среда, полученная при совместном культивировании миеломных клеток 5TGM1 и стромаль 004270 34 ных клеток костного мозга ST2, повышала костнорезорбирующую активность по сравнению с кондиционированной средой, полученной при культивировании клеток ST2 или 5TGM1 по отдельности. Эти данные согласуются с точкой зрения о том, что для возникновения остеокласт-стимулирующей и костнорезорбирующей активности требуется прямой контакт клеток 5TGM1 со стромальными клетками костного мозга. Авторы затем установили, что молекулы клеточной адгезии участвуют в прямом взаимодействии между клетками 5TGM1 и стромальными клетками костного мозга, которое необходимо для появления остеокластогенной активности. Данные, полученные авторами, указывают на то, что VCAM-1 и интегрин VLA-4 играют роль в этом межклеточном взаимодействии,поскольку нейтрализующие антитела против этих двух адгезионных молекул выраженно уменьшают формирование ОС-подобных клеток в этих совместных культурах. ВзаимодействиеVCAM-1/интегрин VLA-4 отвечает за межклеточную коммуникацию стромальных клеток костного мозга и миеломных клеток 5TGM1,которая приводит к увеличению продукции остеокластогенной и костнорезорбирующей активности. И, наконец, эта костнорезорбирующая активность появляется частично благодаря индукции Rank лиганда. Пример 2. Эксперименты in vivo. Исследования, проведенные авторами invivo, наводят на мысль о том, что взаимодействие между VLA-4 на миеломных клетках сVCAM-1 на стромальных клетках костного мозга может играть ключевую роль в индукции костнорезорбирующей активности миеломой. Авторы осуществили ключевой этап проверки этой гипотезы in vivo с использованием модели на экспериментальных животных, которая точно отражает заболевание у человека. А. В этом эксперименте мышам инъецировали 1105 миеломных клеток 5TGM1, которые колонизовали костный мозг. Мышей разделяли на две группы по три, одна из которых служила контролем, а вторая получала дважды в неделю,начиная с 8 дня, mAb PS/2. Уровни IgG2b, изотипа антитела, вырабатываемого миеломными клетками 5TGM1, измеряли еженедельно с 1 по 6 неделю. Лечение mАb в дозе 80 мкг на инъекцию (приблизительно 4 мг/кг) дважды в неделю в высокой степени ингибировало выработкуIgG2b, что является показателем достоверного ингибирования выживания и роста миеломных клеток in vivo (фиг. 4). Помимо этого, у леченных таким образом мышей частота параплегии снижалась (у всех 3 нелеченных животных на 42 день наблюдалась параплегия, в то время как параплегия наблюдалась только у одного из леченных животных). У двух леченных животных,у которых не наблюдалась параплегия, также было снижение веса селезенки и печени, кото 35 рый также коррелирует с опухолевой нагрузкой. И, наконец, у леченных животных наблюдалось сокращение площади опухоли в большеберцовых и бедренных костях по результатам гистологического исследования (от 6,711,74 до 0,050,08 мм 2). Эффекта от этого лечения в отношении уровней кальция в сыворотке крови не было (данные не представлены). В. В параллельном эксперименте лечение 40 мкг PS/2 дважды в неделю не влияло на уровни IgG2b (не показано). Эти данные свидетельствуют о том, что mAb PS/2 против VLA-4 в высокой степени дозозависимым образом ингибируют рост прижившихся миеломных клеток. С. В других экспериментах in vivo 18 мышам SCID инъецировали миеломные клетки 5TGM1 на 0 день. Четыре мыши получали PBS; 4 мыши получали профилактическую схему с использованием mAb M/K-2.7, реактивного в отношении мышиного VCAM-1, в дозе 80 мкг(приблизительно 4 мг/кг) раз в три дня, начиная с -1 дня (т.е. -1, 2, 5, 8 и 11 дни). В параллельном эксперименте по той же схеме пять мышей получали 160 мкг mAb M/K-2.7. Помимо этого,пять мышей получали 160 мкг mАb M/K-2.7,начиная с 8 дня (т.е. 8, 11, 14, 17 и 20 дни) по терапевтической схеме. Сыворотку брали от всех мышей на 21, 28 и 35 день, а животных подвергали рентгенологическому исследованию, затем умерщвляли на 35 день и проводили гистологическое исследование. Все три экспериментальные группы показали снижение уровней сывороточного IgG2b, что является показателем уменьшения миеломной нагрузки (фиг. 5). Достоверный эффект наблюдался также в отношении веса селезенки в экспериментах по профилактической схеме с использованием низких доз по сравнению с контролем (0,230,14 г у контролей против 0,080,04 у леченных животных). В группе профилактической схемы с использованием высоких доз у 4 из 5 животных наблюдалось отчетливое снижение веса селезенки, однако, общая величина не была достоверной, поскольку у одного животного вес селезенки оказался большим (данные не представлены).D. Можно провести исследование для изучения того, улучшает ли эффективность первоначальная высокая болюсная доза антагониста 4 интегрина с последующей поддерживающей дозой. Миеломные клетки уже адаптировались в компартменте костного мозга, а их тесное VLA4-зависимое взаимодействие с VCAM-1 необходимо ингибировать. Помимо этого, предположительно, чем больше количество адаптировавшихся миеломных клеток, тем выше начальная доза, которая требуется для вымывания клеток в периферический кровоток. Таким образом, было выполнено более обширное исследование с анти-VLА-4 антителом PS/2. Двадцати восьми мышам SCID инъецировали миеломные клетки 5TGM1 на 0 день. 36 9 мышей не получали лечения; 9 мышей получали парный по изотипу контроль IgG mAb; 10 мышей получали mAb PS/2 против 4 интегрина. Использовалась также другая терапевтическая схема, при которой мыши получали высокую дозу mАb (200 мкг) на 4, 5 и 6 день, а затем поддерживающую дозу 80 мкг (приблизительно 4 мг/кг) раз в три дня, начиная с 8 дня. Наблюдалось статистически значимое снижение сывороточного IgG2b при сравнении леченной группы как с не леченной, так и с контрольной группой, леченной IgG, на 3 и 4 неделе (данные не представлены). Важно, что при сравнении леченной группы как с не леченной,так и с контрольной группой, леченной IgG,наблюдалось отчетливое влияние на выживание(фиг. 6). Пример 3. Другие эксперименты in vivo. На основе информации, впервые представленной в настоящем описании, специалисты в данной области могут легко подтвердить и расширить важность 4 интегринов и их лигандов при множественной миеломе, с использованием описанной модели на мышах. Следующие серии экспериментов также находятся в пределах компетенции специалистов в данной области, основаны на настоящем описании, и служат исключительно целям иллюстрации, а не ограничения, представляемой работы. 1). Ответ на дозу mAb PS/2 для определения оптимальной поддерживающей дозы для введения два раза в неделю. 80 мкг демонстрируют хорошую эффективность, а 40 мкг не оказывают эффекта. Исследователь изучает более высокие дозы вплоть до 20 мг/кг, чтобы определить оптимальную дозу. 2). Пациенты представляют заболевание различных степеней тяжести в связи с возрастанием опухолевой нагрузки. Исследователь изучает эффективность mAb PS/2, которые вводятся в различное время после установления заболевания, т.е. сравнивает начало лечения от 8 дня(см., например, фиг. 4) до начала через две, три,четыре и пять недель после инокуляции, чтобы установить, насколько поздно можно дать mAb для того, чтобы добиться некоторого облегчения симптомов. 3). Изучаются эффекты mAb MK-2 против мышиного VCAM-1 с использованием тех же параметров, которые описаны выше (дозирование, время дозирования) для mAb против VLA4. Можно предсказать, что для достижения эффективности потребуются похожие уровни доз. 4). Изучаются дополнительные маркеры прогрессирования миеломы, включая опухолевую нагрузку в костном мозге и экстрамедуллярных областях, количественное определение костных поражений методом радиографического анализа костей скелета путем гистоморфометрии; измерение скорости резорбции костей, 37 путем оценки коллагеновых поперечных связей в плазме крови; измерение содержания моноклонального белка в плазме крови; измерение гиперкальциемии, если она имеет место, и изучение смертности. 5). Множественную миелому в настоящее время стандартными схемами химиотерапии лечат неэффективно. Изучаются дополнительные или синергические эффекты mАb при оптимальном дозировании в сочетании с назначением как до, так и после химиотерапевтических схем. 6). Изучается с использованием протоколов и результатов, описанных выше, способность малой молекулы-ингибитора 4 интегрина, обладающей избирательностью по отношению к одному конкретному 4 интегрину или в отношении нескольких 4 интегринов, в отдельности или способность комбинаций таких ингибиторов имитировать эффекты mАb и блокировать прогрессирование миеломы. Малые молекулы-ингибиторы доставляются парентерально или перорально, в дозе, варьируемой от 0,1 до 30 мг/кг, 1 или 2 раза в день или 2 или 3 раза в неделю. Дополнительная литература 1. Alsina М., Воусе В., Devlin R., AndersonInvest., 91: 2791-2795, 1993. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения множественной миеломы, включающий введение индивидууму композиции, содержащей терапевтически эффек 004270 40 тивное количество агента, связывающего 4 интегрин. 2. Способ лечения множественной миеломы, включающий введение индивидууму композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, связывающего лиганд 4 интегрина. 3. Способ по п.1, где агент, связывающий 4 интегрин, выбирают из группы, состоящей из а) антитела или его антигенсвязывающего производного или фрагмента, который является антагонистом взаимодействия как 47 интегрина (VLA-4), так и 47 интегрина и их соответствующих 4 лигандов; b) антитела или его антигенсвязывающего производного или фрагмента, который является антагонистом взаимодействия 47 интегрина (VLA-4) и его 4 лиганда; и с) антитела или его антигенсвязывающего производного или фрагмента, который является антагонистом взаимодействия 47 интегрина и его 4 лиганда. 4. Способ по п.3, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 5. Способ по п.2, где агент, связывающий лиганд 4 интегрина, представляет собой антитело против молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) или его антигенсвязывающее производное или фрагмент. 6. Способ по п.5, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 7. Способ по п.1 или 2, где агентом является малая молекула с молекулярным весом менее чем 2000. 8. Способ по п.1 или 2, где композицию вводят в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела. 9. Способ ингибирования резорбции костей, связанной с опухолями костного мозга, где указанный способ включает введение млекопитающему, имеющему указанные опухоли, композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, связывающего 4 интегрин. 10. Способ по п.9, где агент, связывающий 4 интегрин, представляет собой анти-VLА-4 антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент или анти-47 антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент. 11. Способ по п.10, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизи 41 рованного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 12. Способ ингибирования резорбции костей, связанной с опухолями костного мозга, где указанный способ включает введение млекопитающему, имеющему указанные опухоли, композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, связывающего лиганд 4 интегрина. 13. Способ по п.12, где агент, связывающий лиганд 4 интегрина, представляет собой антитело против молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) или его антигенсвязывающее производное или фрагмент. 14. Способ по п.13, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 15. Способ по п.9 или 12, где агентом является малая молекула с молекулярным весом менее чем 2000. 16. Способ по п.9 или 12, где композицию вводят в дозе, обеспечивающей от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг на основе веса тела индивидуума. 17. Способ по п.15, где малую молекулу вводят в количестве, эффективном для обеспечения дозы малой молекулы от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг веса тела. 18. Способ лечения субъекта, имеющего заболевание, характеризующееся наличием остеокластогенеза, где указанный способ включает введение субъекту композиции, содержащей агент, связывающий 4 интегрин, в количестве,эффективном для подавления остеокластогенеза. 19. Способ по п.18, где агент, связывающий 4 интегрин, представляет собой антиVLА-4 антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент или агент, связывающий анти-47. 20. Способ по п.19, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 21. Способ по пп.1, 9 или 18, где агент,связывающий 4 интегрин, представляет собой анти-VLА-4 антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент. 22. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой антитело HP1/2. 23. Способ по п.21, где aнти-VLA-4 антитело представляет собой антитело НР 2/1. 24. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой антитело НР 2/4. 25. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой антитело L25. 42 26. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой антитело Р 4 С 2. 27. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой антитело P4G9. 28. Способ по п.21, где анти-VLА-4 антитело представляет собой гуманизированноеaнти-VLA-4 антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь, при этом как легкая цепь, так и тяжелая цепь содержат гипервариабельные участки(CDR1, CDR2 и СDR3) из мышиного aнти-VLA4 антитела 21-6. 29. Способ по п.28, где (а) гуманизированная легкая цепь содержит каркас вариабельного участка из каркасной последовательности вариабельного участка человеческой легкой цепи каппа, где по крайней мере одна аминокислотная позиция занята той же аминокислотой, которая представлена на эквивалентной позиции каркаса вариабельного участка легкой цепи мышиного иммуноглобулина 21.6, и (b) гуманизированная тяжелая цепь включает каркас вариабельного участка из каркасной последовательности вариабельного участка человеческой тяжелой цепи, когда по крайней мере одна аминокислотная позиция занята той же аминокислотой, которая представлена на эквивалентной позиции каркаса вариабельного участка тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина 21.6. 30. Способ лечения субъекта, имеющего заболевание, характеризующееся наличием остеокластогенеза, где указанный способ включает введение субъекту композиции, содержащей агент, связывающий лиганд 4 интегрина, в количестве, эффективном для подавления остеокластогенеза. 31. Способ по п.30, где агент, связывающий лиганд 4 интегрина, представляет собой антитело против молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1) или его антигенсвязывающее производное или фрагмент. 32. Способ по п.31, где антитело или его антигенсвязывающее производное или фрагмент выбирают из группы, состоящей из человеческого антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела и их антигенсвязывающих фрагментов. 33. Способ по п.18 или 30, где агент является малой молекулой с молекулярным весом менее чем 2000. 34. Способ по п.18 или 30, где композицию вводят в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела. 35. Способ по п.33, где малую молекулу вводят в количестве, эффективном для обеспечения дозы малой молекулы от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса тела.